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A ystem for Rapid DNA Sequencing withi~~~~~~~~~

F1uoresce t C h a i n - Te r , m i n a t i n gD i d e o x y i c w l e o t i d e s

J AM E SM. P ROB E R , *GEORGEL .T R A I N O R ,RUDYJ . DAM,FRANK W.HOBBS,CHAR . L E SW. R O B E RT S O N ,ROBERTJ . Z A GU R S K Y,ANTHONYJ . C O C U Z Z A ,

MAR A . JENSEN,KiRKBAUMEISTER

ADNA s e q u e n c i n gs ys t e m b a s e do n t h eu s eo f a n o v e ls e to f f o u rc h a i n - t e r m i n a t i n gd i d e o x y n u c l e o t i d e s ,e a c hc a r r y -i n ga d i f f e r e n tc h e m i c a l l yt u n e ds u c c i n y l f l u o r e s c e i nd y ed i s t g u i s h e db y i t s f l u o r e s c e n tem i s s i o ni s d e s c r i b e d .Av i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u er e v e r s et r a n s c r i p t a s ei su s e di namo d i f i e dd i d e o x yDNAs e q u e n c i n gp r o t o c o lt op r o d u c ea c om p l e t es e to f f l u o r e s c e n c e - t a g g e df r a g m e n t si n o n er e a c t i o nm i x t u r e .T h e s eDNA f r a g m e n t sa r er e s o l v e db yp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i si no n es e q u e n c i n gW 4 n ea n d a r e i d e n t i f i e db y a f l u o r e s c n c ed e t e c t i o ns y t e ms p e c i f i c a l l ym a t c h e dt o t h eem i s s i o nc h a r a c t e r i s t i c so f t h i sd y es e t .A s c a n n i n gs y s t e ma l l o w sm u l t i p l es a m p l e st o b er u n s i m u l t a n e o u s l ya n dc o m p u t e r - b a s e da u t o m a t i cb a s es e q u e n c ei d e n t i f i c a t i o n st ob e m a d e .T h es e q u e n c ea q a l y -s i so f M13 p h a g eDNA m a d ew i t h t h i ss y s t e mi s d e -s c r i b e d .

T E DEVELOPMENT OF SEQUENCINGMETHODS FOR DETER-m i n i n gt h eo r d e ro f n u c l e o t i d eb a s e si n d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d( D N A )h a s l edt or a p i da d v a n c e si no u ru n d e r s t a n d i n g

o f t h eo r g a n i z a t i o na n d p r o c e s s i n go f i n f o r m a t i o ni n b i o l o g i c a ls y s t e m s .Two m e t h o d sa r ea v a i l a b l ef o rDNA s e q u e n c i n g :t h ec h e m i c a ld e g r a d a t i o nm e t h o do fAM g x a ma n dG i l b e r t( 1 ) , ,a n d t h ed i d e o x yc h a i nt e r m i n a t i o nm e t h o do f S a n g e r( 2 ) .Tr a d i t i o n a l l y,e a c ha p p r o a c ha f f o r d sf o u rs e t so f r a d i o i s o t o p i c a l l yl a b e l e df r a g m e n t sw h i c ha r er e s o l v e da c c o r d i n gt ot h e i rl e n g t h sb yg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d t h er e s u l t i n ga u t o r a d i o g r a p h jp a t t e r ni s u s e d t o o b t a i nt h eDNAs e q u e n c e .T h eMa x am - G i l b e r ta n dS a n g e rt e c h n i q u e s ,w h i c ha r ec o n c e p t u -

a l l ye l e g a n ta n d e f f i c a c i o u s ,a r ei n p r a c t i c et i m e - c o n s u m i n ga n dl a b o r - i n t e n s i v e ,p a r t l yb e c a u s eas i n& l er a d i o i s o t o p i cr e p o r t e ri su s e df o rd e t e c t i o n .U s i n go n e r e p o r t e rt oa n a l y z e 'e a c ho f t h ef o u rb a s e sr e q u i r e sf o u rs e p a r a t er e a c t i o n sa n d f o u rg e ll a n e s .T h er e s u l t i n ga u t o r a d i o g r a p h i c p a tt e r ns ,o b t a i n e da f t e ra d e l a yf o re x p o s u r ea n dd e v e l o p m e n t ,g r ec om p l e xa n dr e q u i r es k i l l e di n t e r p r e t a t i o na n dd a t at r a n s c r i p t i o n .T h e s ed e f i c i e n c i e sc a nb e c o r r e c t e db ys w i t c h i n gf r o ma r a d i o i s o -

t o p i ct oa f l u o r e s c e n tr e p o r t e r .Wed e s c r i b eh e r ea s y s t e mf o rDNAs e q u e n c i n gi n w h i c hf o u rc h em i c a l l yr e l a t e d ,y e td i s t i n g u i s h a b l e ,f l u o r e s c e n c e - t a g g e dd i d e o x y n u c l e o t i d e sa r eu s e dt o l a b e lDNA b y amo d i f i e dS a n g e rp r o t o c o lw i t h a s u i t a b l ec h a i n - e x t e n d i n gDNA

3 3 6

p o l ym e r a s e .T h e f l u o r e s c e n ts e q u e n c i n gf r a g m e n t sa r e r e s o l vt emnpo r a l l yr a t h e rt h a ns p a t i a l l yi n a s i n g l el a n eb y c o n v e n t ip o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r op h o r es i s .A n a l y s i so f t h ef l u o r e s c e n te m i ss i o no f e a c hf r a g m e n tp e r m i t su s t o i d e n t i f yt h e t e r m i n a tn u c l e o t i d ca n da s s i g nt h es e q u e n c ed i r e c t l yi n r e a lt i m e . 'F l u Q r e s c e n tt a g s .Weh a v ed e v c l o p e da f a m i l yo ff l u o r e s cn td y ew i t h l a r g e l yo v e r l a p p i n gy e td i s t i n c te m i s s i o nb a n d s .T h e s ed y ea r e 9 - ( c a r b , o x y e t h y l ) - 3 - h y d r o x y - 6 - o x o - 6 H -o r s u c c i nf lu o r es c e i n s ( S F - x x x ,w h e r ex x xr e f e r st o t h ee m i s s i o nm a x i m u mi nn a n o m e t e r s )( F i g .I A ) .T h e ya r er e a d i l yp r e p a r e df r o ms u c c i na n h y d r i d ea n da na p p r o p r i a t e l ys u b s t i t u t e dr e s o r c i n o lb yam o d i f it i o no f t h ep r o c e d u r ec i t e df o rt he p a r e n td y e ,S F - 5 0 5( 3 ) .T h ef l u o r e s c e n tf o r m so f t h e s ed y e sa r et h ed i a n i o n s ,w h i c hp r e d om i n ai n a q u e o u ss o l u t i o na b o v epH 7 . T h ed i a n i o no f S F - 5 0 5a b s o rm a x i m a l l ya t4 8 6n m ,aw a v e l e n g t ht h a ti sw e l ls u i t e df o re x c i t a t ib y a n a rg oni o nl a s e ro p e r a t i n ga t 4 8 8n im .T h i ss p e c i e ss h o w sa na b s o r p t i o nc o e f f i c i e n to f 7 2 , 6 0 0M - 1c m - 'a t t h emaximuma n df l u o r e s c e sw i t h a n em i s s i o nmaximuma t 5 0 5nm w i t ha q u a n t uy i e l dc o m p a r a b l et ot h a to f f l u o r e s c e i n .T h ec a r b o x y l i ca c i df u n c t i oa l i t y 'i s n o t e s s e n t i a lf o rf l u o r e s c e n c ea n d i s u s e dh e r ef o rc o v a l ea t t a c h m e n tt ot h en u c l e o t i d e sb ym e a n s o fs t a n d a r dm e t h o d o l oT h ew a v e l e n g t h so f t h ea b s o r p t i o na n de m i s s i o nm a x i m ai n t h e

s u c c i n y l f l u o r e s c e i ns y s t e ma r et u n e db y c h a n g i n gt h es u b s t i t u e- R 1a n d- R 2 .T h ea b s o r p t i o ns p e c t r af o rt h ef o u rd y e sw h e r e- R Ia n d-R2 a r e- H Io r -M e a r es h o w ni nF i g .LB .C l o s es p a c i n go f t h ea b s o r p t i o nm a x i m ar e s u l t si n e f f i c i e n te x c i t a t i o no f a l ld y e sb y t h es i n g l ee m i s s i o nl i n eo f t h ea r g o ni o n l a s e r .( T h ea b s o r p t i o nc o e f fc i e n t sa t4 8 8nm o f t h et w om o s td i s p a r a t ed y e s ,S F - 5 0 5a n dSF -5 2 6 ,d i f f e ro n l yb y a f a c t o ro f 2 . )T h e . es u c c i n y l f l u o r e sc a r rt h es a m ec h a r g ea n d a r en e a r l yi d e n t i c a li n s i z e ,mn i i m i z i na n yd i f f e r e n t i a lp e r t u r b a t i o no f t h ee l e c t r o p h o r e p cmob i l i t i e so f t h eDNAf r a g m e n t st o w h i c ht h e ya r e a t t a c h e d .We o b s e r v en od i f f e r e n c e si n t h er e l a t i v emo b i l i t i e sa m i n gi d e n t i c a lDNA f r a gnm e n t st a g g e dw i t ha n yo f t h ef o u rd y e s .L a b e l i n gs t a t e g y .D i d e o x ys e q u e n c i n gi n v o l v e st h et e m p l a

d i r e c t e d ,e n z y m a t i ce x t e n s i o no f a s h o r to l i g o n u c l e o t i d ep r i m e ri nt h ep r e s e n c eo f c h a i n - t e r m i n a t i n gd i d e o x y r i b o n u c l e o t it r i p h op h a t e s( d d N T P ' s ) .A n e s t e ds e to f DNA f r a g m e n t si s p r o d u c

J . M. P r o b e r ,R . J .D am ,a n dC .W. R o b e r t s o na r e w i t h t h eEng i n e e r i n gP h y sL a b o r a t o r y ;G. L .T r a i n o r ,F .W . H o b b s ,R . 1 .Z a g u r s k y ,A .J . C o c u z a ,a n d K.B a um e i s t e ra r ew i t ht h eC e n t r a lR e s c a r c ha n dD e v e l o p m e n tD e p a r t m e n t( c o n t r i b un u m b e r4 5 4 3 ) ;a n dM .A. J e n s e ni sw i t ht h eM e d i c a lP r o d u c t sD e p a r t m e n t ,a l lo f t h eE .I . d u P o n td e N em o u r s& C o m p a n y( I n c . ) ,Wi l m i n g t o n ,DE 1 9 8 9 8 .* T owhomc o r re s p o n d en c e s h o ul db ea d d r e s s F d .

S C I F N C E ,VOL. 2 3 8

I

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h a v i n gp r i m e r - d e f i n e d5 ' e n d sa n dv a r i a b l e3 ' e n d sd e t e r m i n e db yt h ep o s i t i o n so f i n c o r p o r a t i o no f a g i v e n b a s e( a s d d NM P ) .R a d i o i s o t o p i cl a b e li s g e n e r a l l yi n c o r p o r a t e db y i n c l u d i n g[ a -3 2 P ] d N T Po r [ a - 3 5 S ] d N T Pi n t h e r e a c t i o nm i x t u r es u c h t h a ti n t e m a ln u c l e o t i d e si n t h en e w l ys y n t h e s i z e dp o r t i o n so f t h ef r a g -m e n t sa r e a b e l e d .T l h ea n a l o g o u si n c o r p o r a t i o no f f l u o r e s c e n c e - t a g g e dn u c l e o t i d e s

m a yb e d i f f i c u l tt o a c h i e v ee n z ym a t i c a l l y ,a n dm a ya d v e r s e l ya f f e c tt h ec r u c i a lr e l a t i o nb e t w e e nc h a i nl e n g t ha n de l e c t r o p h o r e t i cmo b i l -i t y ,w h i c hi se s s e n t i a lf o ra c c t r a t es e q u e n c ed e t e r n n i n a t i o n .Weh a v e

c h o s e ni n s t e ad t oi n c o r p o r a t ea s in gl ef l u o r e s c e n tt a gb y l a b e l i n gc h a i n - t e r m i n a t i n gd i d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s .T h i sl a b e l i n ga p p r o a c ho f f e r ss e v e r a la d v a h t a g e s .G e n e r a t i o no f a l lf o u rs e t so fDNAs e q u e n c i n gf r a g m e n t sc a n b e c a m r e do u t s i m u l t a n e o u s l yi n as i n g l er e a c t i o ns i n c eo n l yt h et e r m i n a t i n gn u d e o t i d ec a r r i e st h et a g .I na d d i t i o n ,m a n yp o l y m e r a s ep a u s i n ga r t i f a c t sa r ee l i m i n a t e ds i n c eo n l yt h o s ef r a g m e n t sr e s u l t i n gf r o mb o n af i d et e r m i n a t i o ne v e n t sc a r r ya f l u o r e s c e n tt a g .T h es e to f f o u rf l u or e s c en c e - ta g g e d c h a i n - t e r m i na t i n g r e a ge n t swe

h a v ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e di s s h o w ni n F i g .2 A . T h e s ea r ed d N T P ' st owhkhs u c c i n y l f l u o r e s c e i nh a sb e e na t t a c h e dv i aa l i n k e rt ot h eh e t e r o c y c i cb a s e .( T h e s er e a g e n t sa r ed e s i g n a t e dN - r x nw h e r eN r e f e r st o t h ed d N T Pa r d rn r e f e r st o t h eS F - r npo r t i o n . )T h el i n k e ri sa t t a c h e dt o t h e5 p o s i t i o ni nt h ep y r i n i d i n e sa n dt o t h e7p o s i t i o ni n t h e7 - d e a z a p u n r n e s .T h e7 - d e a z a p u r i n e sw e r eu s e d t of a c i l i t a t es t a b l el i n k e ra r ma t t a c h m e n ta t t h a ts i t e .C o u p l i n go f t h ed y e st ot h en u c l e o t i d e sw a sf o u n dt oi n f l u e n c eb o t ht h ew a v e l e n g t h so ft h ea b s o r p t i o na n de m i s s i o nm a x i m aa n dt h e i rr e l a t i v ef l u o r e s -c e n c ey i e l d s .T h ed y e sa n db a s e sw e r et h e r e f or e p a i r e df o rm a x i m u md i s t i n g u i s h a b i l i t ya n df o rb a l a n c e dn e tf l u o r e s c e n c es e n s i t i v i t i e s .T h es y n t h e t i cs c h e m ed e v i s e df o rt h e s er e a g e n t si sh i g h i l yc o n v e r -

g e t ta n dg e n e r a l .T h ep r e p a r a t i o no f T- 5 2 6i s i l l u s t r a t i v e .5 - I o d o -2 ' , 3 ' - d i d e o x y u r i d i n ew a s c o l u p l e dt o N - t r i f l u o r o a c e t y l p r o p a r g y l -a m i n eu n d e rp a l l a d i um ( 0 )c a t a l y s i si nd i m e t h y l f o r m a m i d e( 4 ) .T h er e s u l t i n gd e r i v a t i z e dn u c l e o s i d ew a sc o n v e r t e dt oi t s5 ' - t r i p h o s p h a t e( 5 )a n dd e a c y l a t e dt oa f f o r d5 - ( 3 - am i n o - 1 - p r o p y n y l ) - 2 ' , 3 ' - d i d e o x y -u r i d i n et r i p h o s p h a t e .T h i s a m i n ew a sc o u p l e dw i t ha n O - a c e t y l -p r o t e c t e df o r mo f t h eS 1 P - 5 2 6 - s a r c o s i n ec o n j u g a t ea n dd e p r o t e c t e dt oa f f o r dT- 5 2 6 .T h ef l u o r e s c e n c e - t a g g e dc h a i n - t e r m i n a t o r sa r ea c c e p t e da sa l t e r -n a t i v es u b s t r a t e sb y a v i a nmy e l o b l a s t o s i sv i r u s( AMV )r e v e r s et r a n s c r i p t a s ew i t he f f i c i e n c i e sc o m p a r a b l et ot h a to f t h ec o r r e s p o n d -

A

i n gu n s u b s t i t u t e dd d N T P ' s .A c om p a r i s o no f t h es e q u e n c i n gl a d d ep r o d u i c e du s i n gt h ed d N T P ' sa n dt h e i rf l u or e s c en t c o u n t ei ss h o w ni nF i g .3 .T h ef i d e l i t yo f t e r m i n a t o ri n c o r p o r a t i o ni sm a i n -t a i n e d .C om p a r i s o no f l a n e s4 a n d5 ,c o n t a i n i n gd d C T Pa h dC - 5 1 9r e s p e c t i v e l y,s h o w st h a tt h e f l u o r e s c e n c e - t a g g e df r a g m e n t sr u na p p r o x i m a t e l y2 b a s e ss l o w e rt h a nt h e i ru n t a g g e dc o u n t e r p a r t s .T h i sm o b i l i t ys h i f ti s c o n s i s t e n tf o ra l lf o u rs e t so f f l u o r e s c e n c e -f r a g r n e n t s ,a l l o w i n gt h es e q u e n c el a d d e ft o b e r e a da n dq u a l i f y it h i ss e to f r e a g e n t sf o rs i n g l e - l a n eDNA s e q u e n c i n g .T h e s et e r m i nt o r sa r ea l s os u b s t r a t e sf o rm o d i f i e dT7DNAp o l y m e r a s e( 6 ) .T h e y

a r en o t ,h ow e v e r ,s u b s t r a t e sf o rt h eK l e n o wf r a g n e n to f DNAp o l ym e r a s eI f r o mE s c h e r w h i ac o l i .F l u o r c s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e m .L a b e l e dDNAf r a gm e n t s ,p r o -

d u c e db y t h ee n z y m a t i cc h a i ne x t e n s i o nr e a c t i o n s ,a r es e p a r a t e db yp o l y a c r y l a n i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ,d e t e c t e d ,a n di d e n t i f i e da st h e ym i g r a t ep a s tt h e f l uo r es c e nc ed e t e c t i o ns y s t e mi l l u s t r a t e di nF i g .4 .H I i g hs i g n a l - t o - n o i s er a t i oi s a c h i e v e di n t h i s s y s t e m t h r o ue f f i c i e n te x c i t a t i o n ,o p t i c a lf i l t e r i n g ,a n dl i g h tc o l l e c t i o n .S t r o n ge x c i t a t i o ni s o b t a i n e dw i t h a l a s e rs o u r c et h a tp r o v i d

m o s to fi t so u t p u te n e r g ya t a s i n g l ew a v e l e n g t ha n db ym a t c ht h ed y ea b s o r b a n c e st o t h a tw a v e l e n g t h .F l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ni se n h a n c e da p p r o x i m a t e l yf o u r f o l db y d e p o s i t i n ga m i r r o ro n t h eo u t s i d es u r f a c eo f t h eg l a s sg e ls u p p o r tp l a t ef u r i t h e s ta w a yf r o mt h el a s e r .T h ee x c i t a t i o nb e a mi s t h e r e b yr e t u r n e dt h r o u g ht h eg e l ,i ne f f e c td o u b l i n gt h ee x c i t a t i o np a t h l e n g t h ,a n d t h ef l u o r e s c eh e a d e da w a yf r o mt h ed e t e c t o r si s a l s or e t u r n ed , i n c re a st h ea m o u n to f c o l l e c t e dl i g h t .I n a d d i t i o nt o t h ed e s i r e df l u o r e s c e n c ef r o t nt h ed y e - l a b e

DNA,l i g h te m a n a t i n gf r o mt h ee x c i t a t i o nr e g i o ni n d u d e ss c a t t e rl a e rr a d i a t i o n ,Raman s c a t t e r i n g ,a n d f l u o r e s c e n c ef r o mo t h es o u r c e s .O p t i c a lf i l t e r i n ga n do t h e rm e a n sa r eu s e dt o r e d u c et h e su n d e s i r e ds i g n a l s .S e c o n d a r yl a s e rl i n e sa r er e m o v e dw i t ha n a r r o w -b a n di n t e r f e r e n c ef i l t e rp l a c e da t t h es o u r c e .T h er e f l e c t e dc o m p on e n to f t h e4 8 8 - n ml a s e rl i g h ti s e l i m i n a t e db y t h em i r r o r ,w h i c hp r o v i d e sa r e t u r np a t hf o rt h eb e a mo u t o f t h ed e t e c t o r s 'f i e l do fv i e w.S c a t t e r e dl i g h ti s r e m o v e db y a f i l t e rs t a c kc o n s i s t i n go f a ni n t e r f e r e n c ef i l t e r ,a f i b e r - o p t i cf a c ep l a t e ,a n d a c o l o r e dg l a sa b s o r b i n gf i l t e r .T h ei n t e r f e r e n c ef i l t e ri sd e s i g n e dt o s t r o n g l yr e j e ct h ee x c i t a t i o nl i g h t ,p a s st h ed y ee m i s s i o nr e g i o n ,a n dr e j e c tRamans c a t t e r i n ga n d f l u o r e s c e n c ea b o v e 5 6 0 n m . A t h i g ha n g l e so fi n c i d e n c e ,t h e f i l t e rp a s s b a n di s s h i f t e dt o w a r dt h e e x c i t a t iw a v e l e n g t h ,t h u si n c r e a s i n gb a c k g r o u n dl e v e l sa n da s s o c i a t e dn o i s e

B

R I R1HO 0 0

R 2 < R 2

C O O H

. 8

S F - 5 0 5 :S F - 5 1 2 :S F - 5 1 9 :S F - 5 2 6 :

R i =R 2 =HR t = HR 2 = C H 3

R j = C H 3R 2 =HR 1 = R 2 = C H 3

U . 6z4

20 . 44 1

. 2

o '4 0 0

F i g .1. S u c c i n y f l u o r e s c e i nd y e s .( A )C h e m i c a ls t r u c t u r e o f t h ef o u rd y e su s e dt o l a b e ld i d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e sf o rus e a s c h a i n - t e r m i n a t o r sinmo d i f i e dd i d e o x yDNA sequencing p r o t o c o l s .( B )N o r m a l i z e da b s o r p t i o ns p e c t r ao f t h ed y e ss h o w ni n( A ) .Ab s o r p t i o nc o e f f i c i e n ta t t h emaximum f o r

1 6 OCrOBER I 9 8 7

DYES

4 4 0 4 8 0

WAVELENGTH( n m )

5 2 0 5 6 0

S F - 5 0 5i s 7 2 , 6 0 0M - 1c m - ' .Sp e c t r aw e r em e a s u r e di npH 8 . 2 ,5 0 mMa q u e o u st r i s -HC Ib u f f e r .T h eo t h e rd y e sh a v ec o e f f i c i e n t sw i t h i n1 0p e r c eo ft h i sv a l u e .Ve r t i c a lb a r( l a s e r )i n d i c a t e st h ep o s i t i o no f t h ea r g o ni o nl a s el i n ea t4 8 8nm i i s e df o rf l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o n .

RESEARCHARTICLES 3 3 7

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T h u sa f i b e r - o p t i cf a ce p l a tew i t he x t r a m u r a la b s o r b e ri se m p l o y e da sa n a p er t u re t or e s t r i c te n t r a n c e a n g l e so n t h ef i l t e r .T h i se l e m e n ta b s o r b si n c i d e n tr a y so u t s i d e t h ea c c e p t a n c ea n g l eo f t h ef i b e r ,i nt h i sc a s ea b o u t2 2 d e g r e e s .T h i sa p e r t u r ea p p e a r so v e ra n yp o i n to fe x c i t a t i o na c r o s st h eg e l .T h ed y e st h a tw e u s e da r ed i s t i n g u i s h e db y s m a l ld i f f e r e n c e si n

t h e i ra b s o r p t i o na n de m i s s i o ns p e c t r a .C l o s es p a c i n go f t h es p e c t r af a c i l i t a t e se f f i c i e n te x c i t a t i o na n ds i m u l t a n e o u sd e t e c t i o n .T h i sc o n -t r a s t sw i t ht h eu s eo f l a r ge d i f fe r en c e si ne m i s s i o ns p e c t r at h a to n ew o u l di n t u i t i v e l ys e l e c tt of a c i l i t a t ed i s c r im i n a t i o n .F i g u r e2 Bs h o w s

t h e e m i s s i o ns p e c t r ao f t h e f l u or e s ce n c e - t a g ge dc h a i n - t e r m i n a t o r st h a to c c u ri n ap o l y a c r y l a m i d eg e l .I n o u r s y s t e m ,t w op h o t o m u l t i -p l i e rt u b ed e t e c t o r s ,e a c h w i t h a d i f f e r e n tf i l t e rs t a c k ,v i e wt h ef l u o r e s c e n c es i m u l t a n e o u s l y ;o n e c o l l e c t sl i g h ta t t h el o w -w a v e -l e n g t hs i d eo f t h ee m i s s i o nb a n d sa n dt h eo t h e rc o l l e c t sl i g h ta t t h eh i g hwa v e l e n g t hs i d e .W h e n ,f o re x a m p l e ,G - 5 0 5 - t e r m i n a t e df r a g -m e n t sp a s st h ed e t e c t o r s ,o n ed e t e c t o rr e g i s t e r sa l a rg e s i g na lr e l a t i v et o t h eo t h e r ;w h e nT- 5 2 6 - t e r m i n a t e df r a g m e n t sp a s s ,t h er e v e r s eo c c u r s ,T h e A - 5 1 2 -a n dC - 5 1 9 - t e r m i n a t e df r a g m e n t sg i v es p e c i f i cd e t e c t o rs i g n a lr a t i o sl y i n gb e t w e e nt h e s et w oe x t r e m e s .T h er a t i oo fb a s e l i n e - c o r r e c t e dp e a ki n t e n s i t i e si s u s e dt o d e t e r m i n et h eb a s ea s s i g nm e n t .T h i sm e t h o dp r o v i d e sv e r ye f f i c i e n tl i g h tc o l l e c t i o na n do b v i a t e st h en e e df o rm o r er e f i n e ds p e c t r a la n a l y s i s .T h es c a n n i n gm e c h a n i s ms h o w ni n F ig .4 d i r e c t st h el a s e rb e a mt o

t h eg e lt h r o u g ha p e r i s c o p em o u n t e do n t h es h a f to f a s t e p p e rm o t o r .B ys t e p p i n gt h ep e r i s c o p e ,a n yp o i n ti nt h ed e t e c t i o nr e g i o nc a nb ea c c e s s e d .T h ed e t e c t o r ss p a nt h ef i u lw i d t ho f a g e ls ot h a tf l u o t e s c e n c ei s c o l l e c t e da n d a n a l y z e df r o mw h e r e v e rt h el a s e ri sp o i n t e d .D i r e c t i n go n l yt h el a s e rb e a m ,r a t h e rt h a na n yo f t h em a j o ro p t i c a le l e m e n t s ,r e s u l t si n a l o w - n o i s es c a n n i n gs y s t e mt h a ti sm e c h a n i c a l l ys i m p l ea n ds t a b l e .D a t ap r o c e s s i n ga n d a n a l y s i s .P r o c e s s i n go f t h er a wd e t e c t o r

d a t aa n ds u b s e q u e n tn u d c e o t i d eb a s ea s s i g n m e n ti sa c c o m p l i s h e di ns e v e r a ls t e p s .D i g i t i z e ds i g n a l sf r o mb o t hd e t e c t o r sa r es u b j e c t e dt oap e a k - f i n d i n ga l g o r i t h mt od e t e r m i n et h et i m ep o s i t i o n so f t h eDNAb a n d s .O n c et h eDNA p e a k sa r el o c a t e d ,t h er a t i o so f b a s e l i n e -c o r r e c t e dp e a ki n t e n s i t i e sa r ec a l c u l a t e da l o n gw i t h a s t a t i s t i c a lc a l c u l a t i o no f t h ec e r t a i n t yo f t h o s er a t i o s .T h e 1 5 p e r c e n tm o s tc e r t a i nr a t i o sa r ed i s p l a y e da s a h i s t o g r a mi n F i g .5 . T h e s ef a l ln a t u r a l l yi n t oc l u s t e r sc e n t e r e da b o u tf o u rv a l u e s ,e a c hd e f i n i n go n eo ft h eb a s e s .T h e s er e f e r e n c ev a l u e sc a nd i f f e rs l i g h t l yf r o ml a n et o

l a n ed u et og e o m e t r i c a le f f e c t so f t h ew a v e l e n g t hs e l e c t i o nf i l t e r s .Toa l l o wf o r t h e s ev a r i a t i o n s ,t h er e f e r e n c ev a l u e sa r ed e t e r m ii n d e p e n d e n t l yf o re a c hl a n e .T h ef o u rr e f e r e n c ev a l u e sc o r r e s p o n dt op e a k si n t h eh i s t o g r a

M e a s u r e m e n to f s c a t t e ra b o u t t h e r e f e r e n ce v a l ue sa l l o w st h ed e t e r m i n a t i o no f b o u n d a r i e sw h i c ha r eu s e d f o rb a s e a s s i g nWhenDNA p e a k sa r en o l o n g e rr e s o l v a b l eo r w h e nt h e i ra m p l i t uf a l l sb e l o wt h ei n h e r e n tn o i s el e v e lo f t h ed e t e c t i o n s y s t en of u r t h e rb a s e sa r ea s s i g n e d .I n t h ec u r r e n ts y s t em ,t h i su s u a l l yo c c u rb e t w e e n3 0 0 t o 4 0 0 b a s e sf r o mt h e3 ' t e r m i n u so f t h ep r i m e

D e c o n v o l u t i o n ,p r e d i c t i v em o d e l i n g ,a n dd i g i t a ls i g n a lp r o c e s sa r eb e i n gi n v e s t i g a t e dt o e x t e n dt h er e a d a b l es e q u e n c er a n g e .Nu c l e o t i d es e q u e n c ed e t e r m i n a t i o n .Raw d e t e c t o rd a t ao b -

t a i n e df r o mt h e n u c l eo t i d es e q u e n c eo f t h ep h a g eM 1 3 m p 1 8d u r i na 6 - h o u rr u na r es h o w ni nF i g .6 .Amo d i f i e d ,t w o - s t a g ed i d e oc h a i n t e r m in a t i o np r o t o c o l( 6 )w a s u s e dt o g e n e r a t et h eDNAf r a gm e n t sf o rf l u o r e s c e n c e - b a s e ds e q u e n c ea n a l y s i s .T h ed a t as h o w nc o r r e s p o n dt o b a s e s3 t o 2 3 4f r o mt h e3 ' t e rmn i n u so f t h ep r i m eR e f e r e n c ev a l u e sf o rt h i ss e q u e n c i n gr u n a r ee s t a b l i s h e di nF i g .5 ,w h i c hi l l u s t r a t e st h ep r i n c i p l e sd i s c u s s e da b o v ef o rb a s ea s s i g n mR e g i o n so f t h es e q u e n c ea r es h o w ni ng r e a t e rd e t a i li nF i g .7 .I m p r v e m e n t si n s e q u e n c i n g .A s i l l u s t r a t e db y r e c e n td i s c u

s i o n so f h u m a ng e n o m es e q u e n c i n g ,l a r g e - s c a l es e q u e n c i n gp r o j e cw o u l dr e q u i r em a s s i v er e s o u r c e sw i t h c u r r e n tt e c h n o l o g y( 7 ) .P r o g r a m so f i n t e r m e d i a t es c o p e ,c r u c i a li nf u n d am e n t a lr e s e a r c ha swe l la s i n t h ed e v e l o p m e n to f DNA p r o b e s ,c l i n i c a lr e a g e n t s ,a n du s e f u lg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e do r g a n i s m s ,a r el i k e w i s el i m i t e db y t h es p e e da n de a s eo f DNA s e q u e n c i n g .E f f o r t st o i m p r o v et h et e c h n o l o g yo f r a d i o i s o t o p i cs e q u e n c

h a v eb e e nr e v i e w e d( 8 ) .I no n ee x a m p l e ,a t e c h n i q u eo f c o n t i n uDNA b l o t t i n gd u r i n ge l e c t r o p h o r e s i si s d e s c r i b e di n w h i c ht h eDNAf r a g m e n t sr e s u l t i n gf r o mc o n v e n t i o n a ld i d e o x y s e q ua r es e p a r a t e db y e l e c t r o p h o r e s i sa n d a l l o w e dt o e l u t ef r o m t h eb o t t om o ft h eg e lo n t oa m o v i n gm e m b r a n e( 9 ) .T h em e m b r a n ei ss u b s e qu en t ly e x p o s e dt o f i lma n dt h er e s u l t i n ga u t o r a d i o g rb a n dp a t t e r n sa r ei n t e r p r e t e di nt h en o r m a lf a s h i o n .T h i st e c h n i qo f f e r ss o m ea d v a n t a g e si nr e a d a b i l i t yo f t h eb a n dp a t t e r n sa n di nt h ep o t e n t i a lf o ra d e g r e eo f a u t o m a t i o ni ns e q u e n c ea n a l y s i s .H o w e v e rt h e i n he r e n td i s a d v a n t a g e so f u s i n gi s o t o p i c a l l yl a b e l e dr e p o r t e r si nt h et r a d i t i o n a lm a n n e rr e m a i na n dw i l ll i m i tt h e u l t i m a t eu t i l i yo ft h i sa p p r o a c h .A n e w e rm e t h o dw i t hp o t e n t i a lf o rg e n o m i cs e q u e n

A BC H , CH , C H 3 CM,

. 0 0 0 - o N0 0

T- 5 2 6 - C - 5 1 9CH , CH ,H O N H 2

0 1 4 0 0 I - y N% NHNH - 4 E t 3NH4HO9P, 0 0 Z3H O , P 0 N 3 PN

0Aig. .l u o r e s c e n c e - t a g g o dc h a i n - t e r n i i n a n n gents. (A ) C h e n i i c a li r U c

( A. 0 0 0

* 00 0

AiCH , CM , A - 5 1 2 'G-505

0 1-~~~N~~ NH , 0 IN' N., 0

C M , 0 CMH4 E ( , N H, N - ~ ~ ~ - N " ' 4 E t " NH -

F i g .2 .F l u o r e s c e n c e - t a g g dc h a i n - t e r i n t i g r e a g n t s .( A )C h e m i i c a ls t r u c -t u r e so f t h er e a g e n t si e d i nm o d i f i e dd i d e o x yr e a c t i o n sf o rDNA s e q u e n c -i n g .( B )N o r m i a i z e df l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r ao f t h er e a g e n t s ,m e a s u r e di n a n 8 p e r c e n tw / vp o l y a c r y l a m i d eg e l( 1 9 : 1w /wa c r y l am i d e : b i s )t n d e re l e c t r o p h o r e s i sc o n d i t i o h ss i m i l a rt o t h o s eo f F i g .6 .T h ee x c i t a t i o nw a v e -l e n g t hw a s 4 8 8 n m .T h ea b s o l u t eem i s s i o ni n t e n s i t yv a l u e so f t h ef o u r

3 3 8

WAVELENGTH( nm )

c om p o u n d sv a r i e dr e l a t i v et o e a c ho t h e rb y l e s st h a n a f a c t o ro f 2 .S u p e r i m p o s e do n t h eem i s s i o ns p e c t r aa r et r a n sm i s s i o nf u n c t i o n so f t h ei n t e r f e r e n c ef i l t e r su s e di n t h ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e m( F i g .4 ) .T h en u d e o t i d eb a s ea s s i g nm e n tf o re a c hb a n di s a c h i e v e db yme a s u r i nt h er e l a t i v ef l u o r e s c e n c es i g n a li n t w od e t e c t o r sw i t hs p e c t r a lr e s p o n s e sd e f i np r i m n a r i l yb y t h e s ef i l t e rf u n c t i o n s .

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i n ge m p l o y i n gr a d i oa c t i v e l y l a b e l e dp r o b e sh a sa l s ob e e nd e s c r i b e d( 1 0 ) .T h i st e c h n i q u em a ya d d r e s s t h ep r o b l e mo f l o wt h r o u g h p u tb ye n a b l i n gm u l t i p l es e q u e n c e st o b e r e a df r o ma s i n g l eg e l .T h em e t h o dd o e s r e du c et h ea m o u n to f g e lp r e p a r a t i o na n de l e c t r o p h o -r e s i sr e q u i r e df o ra g i v en s e q u e n c i n gt a s k ;h ow e v e r ,s e q u e n c ed a t aa r es t i l lo b t a i n e df r o ma u t o r a d i o g r a p h sw h i c hm u s tb e a n a l y z e da n dt r a n s c r i b e di ns e p a r a t es t e p s .A d v a n c e si nf l u o r e s c e n ts e q u e n c i n gh a v ea l s ob e e nr e p o r t e d .T h e

s y n t h e s i so f o l i g o n u c l e o t i d e sl a b e l e da t 5 'e n d sw i t h f l u o r e s c e n tl a b e l sa n du s e f u lf o rd i d e o x y s e q u e n c i n g( 1 1 ) ,a n ds e v e r a ls y s t e m s

b a s e do n f l u o r e s c e n tp r i m e rt e c h n o l o g y( 1 2 - 1 4 ) ,h a v eb e e nd e -s c r i b e d .T h e s es y s t e m ss u c c e s s f u l l yr e d u c eo r e l i m i n a t ea n u m b e ro ft h ed e f i c i e n c i e so f t h ec u r r e n tr a d i o i s o t o pe t e c h n o l o g y .H o w e v e r ,

~ ~C ' i

T e r m i n a t o r t < C) u

Lane 1 2 3 4 5 6 7 8

65 T G -GGG_60 C

GC l t

55 G G T

5O0T GA _ 0 - - 0 0 - - 0 E 0A A L 7 0 3 $ aG 0 E

40 A 00 - 0 0T _0X

35C G C__ 5 5

45A G

G -T

G T _

3 C dt5, m ; L =

T

T

25 A G* ; 0- $

A

G0 TG

0T

GA

c2 0 T 4 WD*- ,f- X ,F i g .3 . C om p a r i s o no f e l e c t r o p h o r e t i cmob i l i t i e so f DNA s e q u e n c i n gf r a g m e n t st e r m i n a t e dw i t hd d N T P ' sa n d w i thf l u o r e s c e n c e - t a g g e dc h a i n -t e r m i n a t o r s .T h ed i d e o x ym e t h o do f S a n g e r( 2 )w a s u s e d t o s e q u e n c ear e g i o no fM1 3m p l 8 .A 1 7 - b po l i g o n u c l e o t i d ec o r r e s p o n d i n gt o t h e( - 4 0 )r e g i o no f t h et e m p l a t ew a se n d - l a b e l e dw i t h[ - y - 3 2 P ] AT Pa n dp o l y n u c l e o t i d ek i n a s e .E a c hr e a c t i o nm i x t u r ec o n t a i n e dt e m p l a t e( 0 . 1, u g ) ,e n d - l a b e l e dp r i m e r( 2 . 5n g ,a n n e a l e db yh e a t i n gt o9 5 Cf o r2 m i n u t e sa n ds l o w l yc o o l e dt o r o o mt e m p e r a t u r e ) ,6 0mM t r i s - H C Ia t p H8 . 5 ,7 . 5mM Mg C I 2 ,7 5mMN a C l ,0 . 5mM d i t h i o t h r e i t o l ,AMV r e v e r s et r a n s c r i p t a s e( N EN ,2 0 un i t s ) ,a n dn u c l e o t i d e sa t t h ef o l l ow i n gc o n c e n t r a t i o n s :l a n e1 ,2 . 5pMd dGTP,1 2

jM d G T P,2 . 5pM d AT P,5 0 pM d C I T a n d d l T P ; l a n e2 , 0 . 2 5pMd d AT P,2 . 5pMd AT P,5 0 pMd G T P,dCWU ,a n dd T T P ;l a n e3 ,3 . 0pMd d l T P,1 2 pM dMTP,2 . 5p , Md AT P,5 0 pMd C I Pa n dd G T P ;l a n e4 , 2 . 5pMd d C T P,1 2 pMd C T P,2 . 5pMd AT P,5 0pMdGTPa n dd T T P ;l a n e5 ,a si nl a n e4 e x c e p td dC I T Ph a sb e e nr e p l a c e dw i t h5 . 0pMC - 5 1 9 ;l a n e6 ,a si nl a n e3 e x c e p td d T T Ph a sb e e nr e p l a c e dw i t h6 . 0pMT- 5 2 6 ;l a n e7 ,a si nl a n e2 e x c e p td d AT Ph a sb e e nr e p l a c e dw i t h2 . 0pMA - 51 2 ;l a n e8 ,a si nl a n e1 e x c e p tddGTPh a sb e e n r e p l a c e dw i t h 8 . 0pM G - 5 0 5 .T h e p r i m e re x t e n s i o n sw e r ec a r r i e do u t a t 4 2 Cf o r1 0 m i n u t e s ,a n d t h e nu n l a b e l e dd N T P ' s( 1 0 0p . M )w e r ea d d e da n dt h er e a c t i o np r o c e e d e df o r1 0m i n u t e sa t4 2 C .T h er e a c t i o n sw e r es t o p p e db yd i l u t i n gt o 6 0p e r c e n t( v / v )f o r m am i d ea n dd e n a t u r e da t6 5 Cf o r1 0m i n u t e s .A p o r t i o no f e a c hs a m p l e( 1 / 8 )w a sl o a d e do n t oa n 8 p e r c e n t ( w /v )p o l y a c r y l am i d eg e lc o n t a i n i n gu r e a( 8M)a n dTBEb u f f e r( 1 0 0mM t r i s - H C I ,8 3 mM b o r i ca c i d ,1 mM N a 2 E D TA ,pH8 . 1 ) .T h ee l e c t r o p h o r e s i sw a sc a r r i e do u t a t 1 6 0 0v o l t s .

t h e d i s a d v a n t a g eso f p r i m e rl a b e l i n gr e m a i n .I n a d d i t i o nt o t h ep o l y m e r a s e p a u s i n gp r o b l e mn o t e dp r e v i o u s l y ,t h eu s e o f l a b e l ep r i m e r sr e q u i r e st h a to l i g o n u c l e o t i d e sb e c u s t o ms y n t h e s i z e da n dp u r i f i e df o re a c hs e to fs e q u e n c i n gr e a c t i o n s .T h i sr e s t r i c t st h eu s eo fs e q u e n c i n gs t r a t e g i e sw h i c he m p l o ym u l t i p l ep r i m i n gs i t e so r d i f f ee n tc l o n i n gv e c t o r s .

F i g .4 . F l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e m .S c h e m a t i cd r a w i n go f t h eo p t i cs y s t e mu s e df o rs c a n n i n ge x c i t a t i o na n d f o rm e a s u r i n gf l u o r e s c e n c ef r o mmu l t i p l es e q u e n c i n gl a n e si na n e l e c t r o p h o r e s i sg e l .L i g h tf r o mt h ea r g o ni o nl a s e ri sf i l t e r e dt o i s o l a t et h e4 8 8 - n me m i s s i o nl i n e .T h eb e a mi sd e f l e c t e db ya m i r r o ri n t ot h es c a n n i n go p t i c sw h i c ha r em o u n t e do n t h es h a f to f ad i g i t a l l yc o n t r o l l e ds t e p p e rmo t o r .A l e n sf o c u s e st h eb e a mi n t oa s p o ti nt h ep l a n eo f t h eg e l .A s e c o n dm i r r o rd i r e c t st h eb e a mt o a p o s i t i o no n t h es c a nl i n ed e f i n e db y t h er o t a t i o n a lp o s i t i o no f t h em o t o rs h a f t .S e q u e n c io fmu l t i p l es a m p l e si sa c h i e v e db yd i r e c t i n gt h eb e a ms e q u e n t i a l l yt oe a c ho f t h es e q u e n c i n gl a n e so n t h eg e l .Upon e n t e r i n gt h eg e l ,t h eb e a me x c i t ef l u o r e s c e n c ei nt h et e r m i n a t o r - l a b e l e dDNA.F l u o r e s c e n c ei sd e t e c t e db yt w oe l o n g a t e d ,s t a t i o n a r yp h o t omu l t i p l i e rt u b e s(PMTA a n dPMTB )w h i c hs p a nt h ew i d t ho f t h eg e l .I nf r o n to f e a c hPM T,a f i l t e rs t a c ki sp l a c e dw i t ho n e o f t h ec o m p l e m e n t a r yt r an s m is s i on f un c t i on s( F i g .2 B ) .B a s e l i nc o r r e c t e dr a t i o so f s i g n a l si nt h ePMTsa r eu s e dt oi d e n t i f yt h el a b e l e dDNAf r a g m e n t sc u r r e n t l yi n t h ee x c i t a t i o nr e g i on .E x c i t a t i o ne f f i c i e n c ya n df l u o r e s c e n c ec o l l e c t i o na r ei n c r e a s e db y t h em i r r o r e do u t e r s u r f a c eo f t h eg la s s p l a t ei n t h ee l e c tr o p ho r es i s g e la s s e m b l y .

- T >- C - - A 4 G -

Z D n Ut I I

- 2 . 3 0 - 1 . 5 6 - 0 . 8 7 - 0 . 2 6Ln ( R )

F i g .5 .H i s t o g r a mo f t h e1 5p e r c e n tm o s tc e r t a i n r a t io so f b a s e l i n e - c o r rp e a ki n t e n s i t i e so fd e t e c t o rA t od e t e c t o rB f o rt h er u n s h o w ni nF i g .6 .T h en a t u r a ll o g a r i t h mo f t h er a t i oi s u s e dt o e n h a n c ev i s u a lp r e s e n t a t i o nT h er a t i o sd u s t e ra b o u tf o u rr e f e r e n c ev a l u e sc o r r e s p o n d i n gt o t h ef o u rb a s e sa ss h ow n .T h ei n t e r v a l su s e dt oa s s i g nt h eb a s ei d e n t i t yo f e a c hp e a ka r e s h o w na b o v et h eh i s t o g r a m .D a t aa c q u i s i t i o na n d a n a l y s i sw e r ep e r f o r m e db yaH ew l e t t - P a c k a r d9 0 0 0Mo d e l5 0 0c om p u t e r .

RESEARCHARTICLES 3 3 96 OC rOBER1 9 8 7

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T h eu s eo f f l u o r e s c e n c e - l a b e l e dc h a i n - t e r m i n a t o r sf o rDNA s e -q u e n c i n g ,o n t h eo t h e rh a n d ,o ff er s s e ve ra ld i s t i n c ta d v a n t a g e s .L a b e l e dc h a i nt e r m i n a t o r sa f f o r dc o m p l e t ef l e x i b i l i t yo f s e q u e n c i n gs t r a t e g ya n dc h o i c eo f v e c t o r sa n da l l o wt h es e q u e n c i n gr e a c t i o n st ot a k ep l a c ei no n ev e s s e l .I nt h i sm e t h o d ,o n l yt r u ed i d e o x yt e r m i n a -t i o n sr e s u l ti nd e t e c t a b l ef l u o r e s c e n tb a n d s .C h a i ns y n t h e s i sa r t i f a c t sm a ys t i l lo c c u r ,b u t t h e yw i l ln ot b ed e t e c t e ds i n c et h e s ep r o d u c t sa r en o t f l u o r e s c e n t .T h i sr e s u l t si n s i m p l i f i e de l u t i o np a t t e r n sa n df a c i l i t a t e sd a t aa n a l y s i s .Weh a v es u c c e e d e di nu s i n gf l u o r e s c e n c e - t a g g e dc h a i n - t e r m i n a t -

i n gr e a g e n t sf o rDNA s e q u e n c i n g .S t r u c t u r a l l y,e a c ho f t h ef o u rr e a g e n t sd e s c r i b e dh e r e( F i g .2 A )c o n s i s t so f a s u c c i n y l f l u o r e s c e i na t t a c h e dt o a d i d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t et h r o u g ha n o v e la c e t y l e n i cl i n k e r .T h el i n k e ri sb o t hs t e r i c a l l yc o m p a c ta n ds y n t h e t i -c a l l ya c c e s s i b l ef o ra l lf o u rb a s e s .T h e l i n k e ri s a t t a c h e dt o t h e5p o s i t i o no f t h ep y r i m i d i n e sa n dt h e7 p o s i t i o no f t h e 7 - d e a z a p u r i n e s .T h e s ep o s i t i o n sh a v eb e e nr e p o r t e di n s o m ec a s e st ob ea c c e p t a b l ef o ra t t a c h i n gs u b s t i t u e n t st o c h a i n - p r o p a g a t i n gs u b s t r a t e s( t h a ti s ,d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s )f o rDNA p o l y m e r a s e s( 1 5 ,1 6 ) .T h ec h a i n - t e r m i n a t o r sr e p o r t e d h e r ea r ei n c o r p o r a t e db y b o t hAMVr e v e r s et r a n s c r i p t a s ea n dm o d i f i e dT7 DNA p o l y m e r a s e( 6 ) ,b u tt h e ya r en o t a c c e p t e db yt h eK l e n o wf r a g m e n to fDNA p o l y m e r a s eIf r o mE s c h e r i c h i ac o l i .T h er e a s o n sf o rt h ei n a b i l i t yo f t h es e t e r m i n a -t o r st o s e r v ea s s u b s t r a t e sf o r t h eK l e n o wf r a g m e n ta r e n o tu n d e r s t o o d .F l u o r e s c e n tr e p o r t e r sh a v et h ep o t e n t i a lf o ri m p a r t i n gd i f f e r e n t i a lm o b i l i t ys h i f t st o t h eDNA f r a g m e n t s ,t h u sc o m p l i c a t i n gt h e i re l e c t r o p h o r e t i ce l u t i o np a t t e ma n ds u b s e q u e n tb a s ea s s i g nm e n t s .I nt h es y s t e m s p r ev i o us l yd e s c r i b e de m p l o y i n gm o r et h a no n er e p o r t e r ,t h i se f f e c ti s a g g r a v a t e db y t h eu s e o f s t r u c t u r a l l yd i s s i m i l a rd y e s

3 8 7nM E ,M I N .

F i g .6 .D e t e c t i o no f f l uo r es c e n t t e r m i n a to r - l a b e le dDNAf r a g m e n t sf r o mar e g i o no fM I 3 m t 1 8 .Su mo f t h ed e t e c t o ro u t p u t sf o rPMTA a n dPMTB ( i na r b i t r a r yu n i t so f f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y )v e r s u st i m ea r es h o w nf o ra 6 - h o u rs e q u e n c i n gr u n .T h ef r a g m e n t sw e r eg e n e r a t e di n a t w o - s t a g er e a c t i o n .I no n er e a c t i o nt u b ew e r ea d d e d3 1 Lgo fM 1 3 m p 1 8s i n g l e - s t r a n d e dDNA a n d6 0 n go fp r i m e r( 1 7b p ) .T h i sm i x t u r ew a sh e a t e da t9 5 Cf o r2 m i n u t e sa n dt h e np l a c e do n i c ef o r5m i n u t e st o a n n e a l .I n t hep r i m e re x t e n s i o nr e a c t i o n ,2 5 0p m o le a c ho f d AT P,d C T P,d T T P,a n dc ' d G T Pw e r ea dd ed a n dt h er e a c t i o ni n c u b a t e da t 4 2 Cf o r1 2 m in u t e si n t h e

p r e s e n c eo f 6 0 MM t r i s -

HC I , p H8 . 3 ,7 . 5mMMgC I 2 ,7 5mM NaC l ,0 . 5mM d i t h i o t h r e i t o l ,a n d1 7u n i t so fAMV r e v e r s et r a n s c r i p t a s e .T h ee x t e n s i o nr e a c t i o nw a ss t o p p e db yt h ea d d i t i o no f a m i x t u r ec o n t a i n i n g1 0 0p m o lo f G - 5 0 5 ,8 0 0p m o lo f A-5 1 2 ,2 0 0p m o lo f C - 5 1 9 ,a n d 8 0 0p m o lo fT- 5 2 6a n dt h e ni n c u b a t e df o ra na d d i t i o n a l3 0m i n u t e sa t4 2 C .U n i n c o r p o r a t e df l u o r e s c e n tt e r m i n a t o r sw e r er e m o v e db yg e lf i l t r a t i o nu s i n ga S e p h a d e xG - 2 5s p i nc o l u m n( 5 't o3 'I n c . ) .T h ee f f l u e n tw a sd r i e du n d e rv a c u u m ,w a s h e dw i t h7 0p e r c e n te t h a n o l ,d r i e da g a i n ,a n dr e s u s p e n d e di n5 p lo f 9 0p e r c e n tf o r m a m i d ec o n t a i n i n g1 1mMN a 2 E D TA .T h es a m p l ew a st h e n h e a t e dt o6 5 0 Cf o r7 m i n u t e sa n dl o a d e do n t oa n 8 p e r c e n tw /vp o l y a c r y l a m i d eg e l( 1 9 :1 a c r y l a m i d e :b i s ,2 0cmb y4 0cm b y0 . 3mm ) c o n t a i n i n g7Mu r e a ,1 0 0mM t r i s - H C I ,pH 8 . 3 ,8 3 mMb o r i ca c i d ,a n d1 1mM N a 2 E D TA .T h eg e lw a se l e c t r o p ho r e s e df o ra b o u t6h o u r sa t 2 7w a t t so f c o n s t a n tp ow e r .Ma r k e r sa t t o p s h o wt h el o c a t i o n so fb a n d sc o r r e s p o n d i n gt o t h eb a s e s .

( 1 2 ) .P e r t u rb a t i o n s t o t hel i n k e ra r ms t r u c t u r ea n ds o f t w a r ea l g or i t h m sw e r eu s e d t o r e c o n s t r u c tt h ec o rr e c t e l u t i ono r d e ro f t h ef r a g m e n t s( 1 2 ) .S i n c e t h ed y e sr e p o r t e dh e r eb e l o n gt o a s i n g lf a m i l yw i t h o n l ym i n o rs u b s t i t u e n td i f f e r e n c e so n t h es u c c i n yf l u o r e s c e i nmo i e t i e s ,t h e y i m p a r tn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a lm o b i l is h i f t st o t h eDNA f r a g m e n t sa n d t h ec o r r e c te l u t i o no r d e ri so b s e r v e di n t h er a wd a t a .A f u n d a m e n t a lc r i t e r i o nf o ra n e f f e c t i v es e q u e n c i n gs y s t e mi s

a c c u r a c y .Ac c u r a c yi nd e t e c t i o na n dd a t aa n a l y s i sd e r i v e sp r i m a rf r o mh i g hs e n s i t i v i t yt o t h er e p o r t e r ,a n di ns y s t e m su s i n gm u l t i pr e p o r t e r s ,t h ea b i l i t yt o d i s c r i m i n a t eo n e l a b e lf r o ma n o t h e r .Ad i d e o x ys e q u e n c i n gs y s t e mm u s tb e c a p a b l eo f d e t e c t i n g1 0 - 1 5t o1 0 - 1 6m o lo f DNA p e rb a n d( 1 2 ) .F o r a g i v e nn u m b e ro f r e p o r tmo l e c u l e s ,t h em e a s u r e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sd e t e r m i n e db y t h ei n c i d e n tl a s e rp ow e r ,t h eo p t i c a lp r o p e r t i e so f t h er e p o r t e r ,a n dt h ee f f i c i e n c yo f t h e d e t ec t i ons y s t e m .T h i ss i g n a li s s u p e r i m p o s e do n ab a c k g r o u n do f Raman a n d e l a s t i cs c a t t e r i n ga r i s i n gf r o m t h ei n t e r a c t i o no f t h el a s e rb e a mw i t ht h eg e lm a t r i xa n dt h eg l a s sp l a t eo f t h e e l e c t r o p h o r e s i sa s s e m b l y .Va r i a t i o ni n t h i s b a c k g r o u nd e t e r m i n e st he i n h e r en tn o i s ei nt h et o t a ls i g n a lo b s e r v e d .D e p e n di n go n l a n eg e o m e t r y ,g e lt h i c k n e s s ,a n do t h e rf a c t o r s ,o u r s y s t e mi sc a p a b l eo f d e t e c t i n g ,i nr e a lt i m e ,b e t w e e n1 0 - 1 8a n d1 0 - 1m o lo fs u c c i n y i f l u o r e s c e i nr e p o r t e ru n d e rs e q u e n c i n gc o n d i t i o n s .P r e v i o ul y r e p o r t e ds e n s i t i v i t i e sf o rf l u o r e s c e n c e - b a s e ds e q u e n c i n gs y s t e ma r e3 x 1 0 1 - 8m o l( 1 4 )a n df r o m1 0 i - 7t o 5 x 1 0 - ' 7m o l( 1 2 ) .P o s s i b l ee rr or s i ns e q u e n c i n gi n c l u d em i s i d e n t i f y i n ga d e t e c tb a s e ,i n s e r t i n ga b a s e ,o r f a i l i n gt o d e t ec ta b a s ea ta l l .To e l i m i n ai n s e r t i o n sa n dd e l e t i o n s ,a d v a n t a g ec a nb e t a k e no f t h eu n i f o r ml o c at e m p o r a ls p a c i n go f t h eDNA b a n d sa st h e yp a s st h ed e t e c t o r s( 9 ) .T h ep r e d i c t i o no f p e a kp o s i t i o n sr e s u l t si ns i m p l i f i e dd e t e c t i o na n d

363. 7 T ime (min) 380 .3

F i g .7 .S e q u e n c eo fM13 1 p 8s h o w i n gb a s ea s s i g nm e n t s .( To p )R e g i o no ft h es e q u e n c ef r o mb a s e2 0 t o b a s e4 0 .E a c hd e t e c t o r ' so u t p u t( i na r b i t r af l u o r e s c e n c ei n t e ns i t y u n i ts )i sp l o t t e da sa f u n c t i o no f t i m e .S c a l ef a c t o r sf o rt h ef l u o r e s c e n c ea r es h o w ni n d e p e n d e n t l yf o r t h et w od e t e c t o r s .D e t e c t o rA,s o l i dl i n e ,l e f ts c a l e ;d e t e c t o rB ,d a s h e dl i n e ,r i g h ts c a l e .( B o t t o m )R e g i o no ft h es e q u e n c ef r o mb a s e2 1 9t o b a s e2 3 4 . S im i l a rd a t aw e r eo b t a i n e df r omb a s e3 t o b a s e2 3 4 .

SCIENCE,VOL. 2 3 84 - 0

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i d e n t i f i c a t i o no f l o w - i n t e n s i t yp e a k s .T h e v a r i a t i o no f d e t e c t o rs i g n a l sa c r o s sa b a n dh e l p s t oi d e n t i f yp e a k sw h i c ha r en o t f u l l yr e s o l v e d .T h en u c l e o t i d es e q u e n c eo f t h eM13mpl8r e g i o ns h o w ni nF i g .6

w a sd e t e r m i n e db y c om p u t e ra l g o r i t h m sf r o mb a s e3 t o b a s e2 3 4w i t hn ow r o n gb a s ea s s i g n i m e n t sa n dn om i s s i n go r e x t r ab a s e s .P e a ki n t e n s i t yv a r i a t i o n sr e s u l tf r o ms e q u e n c e - d e p e n d e n td i f f e r e n c e si nr a t e so f b a s ei n c o r p o r a t i o na n dt e r m i n a t i o n .T h i sd i s t r i b u t i o ni sa l s oi f f e c t e db y r e l a t i v ec o n c e n t r a t i o n so f d N T P ' si n t h e e x t en s i o nr e a c t i o na n do f t h e t e r m i n a t o r si nt h ef i n a lc h a i nt e r m i n a t i o ns t e p ,a s

we l la sb y r e a c t i o nt i m e sa n dc o n d i t i o n s .M o r es e q u e n c i n ge x p e r i -e n c ei s r e q u i r e dt o d e t e r m i n et h ei n h e r e n ta c c u r a c yi nb a s ea s s i g n -m e n t ,b u tw e a r ee n c o u r a g e db y t h ea b s e n c eo f e r r o r sf o rp e a k sa b o v ea mn i u imu ti n t e n s i t yt h r e s h o l df o rd i s c r i m i n a t i o n .I n p r a c t i c et h e r ea r e r e g i o n so f DNA w h i c ha r ed i f f i c u l tt o

s e q u e n c ed u e t o a b e r r a t i o n si n e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t yc a u s e db ys e c o n d a i ys t r u c t u r e( 1 7 ) .T h e d a t aa n a l y s i ss y s t e ma l l o w st h el o c a t i o na n de x t e n to f s u c hr e g i o n st ob e i d e n t i f i e ds ot h a tf l a n k i n gs e q u e n c e sr e m a i ni n f r a m e .2 ' - D e o x y - 7 - d e a z a g u a n o s i n et r i p h o s -p h a t eh a sb e e nu s e d( c 7 dGTP )i np l a c eo f dGTPt om i n i m i z et h e s ee f f e c t s .A s i m i l a rt e c h n i q u eh a sb e e n u se di n f l u o r e s c e n tp r i m e r -b a s e ds e q u e n c i n g( 1 8 ) .F o r t h er u n o f F i g . 6 ,t w or e g i o n so f GCo v e r l a pw e r ea s s i g n e db y i n s p e c t i o n .A f u n d a m e n t a lm e a s u r eo f t h eu t i l i t yo f a n a u t o m a t e ds e q u e n c e ri s

r a wt h r o u g h p u t ,d e f i n e da st h es e q u e n c i n gr a t ep e rl a n et i m e st h en u m b e ro f l a n e sp e ri n s t r u m e n t .I no u rs y s t e m1 2 l an es a rep r a c t i c a l .A f t e ra n i n i t i a lp e r i o do f e l e c t r o p h o r e s i sd u r i n gw h i c ht h ef i r s tDNAb a n d sr e a c ht h ed e t e c t o r ,t h es e q u e n c e ri s c a p a b l eo f d e t e r m i n i n ga p p r o x i m a t e l y5 0 b a s e sp e rh o u rp e rl a n e .A f i l l l yl o a d e dg e lt h u sy ie ld s at h r o u g h p u to f a b o u t6 0 0b a s e s p e rh o u r .I ns u mm a r y ,we h a v er e p o r t e da d v a n c e si nc h e m i s t r ya n di n s t r u -

me n t a t i o nf o rf l u o r es c e n t l a b e l i n ga n dd e t e c t i o no fDNA f r a g m e n t s ,

a n dh a v ed e s c r i b e da r a p i dDNA s e q u e n c i n gs y t e mb a s e do n t h eu s eo f f l u o r e s c e n tc h a i nt e r m i n a t o r s .F u r t h e ri m p r o v e m e n t si n t h ep e r f o r m a n c eo f t h i ss y s t e m ,a sw e l la s t h ee m e r g e n c eo f o t h ea p p l i c a t i o n sr e q u i r i n gs e n s i t i v eDNA d e t e c t i o n ,a r et h es u b j e c t so fc u r re n t s t ud y .

REFERENCESAND NOTES

1 . A .M Maxama n dW. G i l b e r t ,P r o c .N a t i .Ac a d .S c i .U .S .A . 7 4 ,5 6 0 ( 1 9 7 7Me t h o d sE n z ym o l .6 5 ,4 9 9( 1 9 8 0 ) .

2 . F . S a n g e r ,S .N i c k l e n ,A. R . C o u l s o n ,P r o c .N a t ! .A c a d .S c i .U . S . A .7 4 ,5 4 6 3( 1 9 7 7 ) .

3 . S .B i g g sa n dF .G. P o p e ,J . C h e m .S o c .( L o n d o n )1 2 3 ,2 9 3 4( 1 9 2 3 ) .4 . F o rd e t a i l so n s i m i l a rc o u p l i n g ss e e :M .J . R o b i n sa n dP .J .Ba r r , J .O t y .C h e m .4 8 ,1 8 5 4( 1 9 8 3 ) .

5 . J .L .R u t ha n dY. - C .C h e n g ,Mo l .P h a r m a c o l .2 0 ,4 1 5 ( 1 9 8 1 ) .6 . S .T a bo r a n dC . C .R i c h a r d s o n ,P r o c .Na t ! .A c a d .S c i .U . S . A .8 4 ,4 7 6 7( 1 9 8 7 )7 . L .R o b e r t s ,S c i e n c2 3 7 ,3 5 8( 1 9 8 7 ) ;i b i d . ,p .4 8 6 .8 . W. J .M a r t i na n dR . W. D a v i e s ,B i oTe c c n o l gw4 , 8 9 0( 1 9 8 6 ) .9 . S .B e c ka n dF .M . P o h l ,E M R O J .3 ,2 9 0 5( 1 9 8 4 ) .1 0 .G. M .C h u r c ha n dW. Gi l b e r t ,P r o c .N a t I .Ac a d .S c i .U . S . A .8 1 ,1 9 9 1( 1 9 8 4 ) .1 1 .L .M .Sm i t h ,S .F u n g ,M .W. Hu n k a p i l l e r ,T .J .Hu n k a p i l l e r ,L .E .Ho o d ,Nu d e i c

A c i d sR e s .1 3 ,2 3 9 9( 1 9 8 5 ) .1 2 .L .M . Sm i t h ,J . Z .S a n d e r s ,R . J .Ka i s e r ,P .H u g h e s ,C .Dod d ,C .R . C o n n e l ,C .

He i n e r ,S .B .H . K e n t ,L .E .H o o d ,N a t u r c( L o n d o n )3 2 1 ,6 7 4 ( 1 9 8 6 ) .1 3 .W .A n s o r g e ,B .S .S p r o a t ,J .S t e g e m a n n ,C .S c h w a g e r , J .B i o c h em .B i o p h y s .Me t h o

1 3 ,3 1 5( 1 9 8 6 ) .1 4 .W .A n s o r g e ,B .S p r o a t ,J .S t e g e m a n ,C .S c h w a g e r ,M. Z e n k e ,N u d e i c A c i d s R1 5 ,

4 5 9 3( 1 9 8 7 ) .1 5 .R . M . K .Da l e ,D . C .L i v i n g s t o n ,D . C .Wa r d ,P r o c .Na t ! .Ac a d .S c i .U . S . A .7 0 ,

2 2 3 8( 1 9 7 3 ) .

1 6 .P .R . L a n g e r ,A . A .Wa l d r o p ,a n dD . C .Wa r d ,i b i d .7 8 ,6 6 3 3( 1 9 8 1 ) .1 7 .N . L .B r o w n ,Me t h o d sM i c r o b i o l .1 7 ,2 5 9( 1 9 8 4 ) ;N . S .Amb a r t s u m y a na n dA.M.M a z o ,F E B SL e t t .1 1 4 ,2 6 5( 1 9 8 0 ) ;S .M i z u s a w ae ta l . ,Nu c e i c A c i d sR e s .1 4 ,1 3 1 9( 1 9 8 6 ) .

1 8 .C . C o nn e l le ta l . ,B i o t e c n i q u e s5 ,3 4 2 ( 1 9 8 7 ) .1 9 .Wet h a n kt . R . A d am s ,J . B .C l e m e n s ,D . E .C o p e ,G. C .E mm e t t ,a n dR . K .

Ma r t i nf or t e c hn i c ala s s i s t a n c ea n d o u r c o l l e a g u e sf o rs u p p o r tt h a tm a d et h i sr e s e a r c hp r o g r a mp o s s i b l e .Wee s p e c i a l l ya c k n o w l e d g et h ee n c o u r a g e m e np r o v ie d b yM .L .P e a r s o n ,F . F .H u p p e ,a n dC . T .S c i a n c e .

4 S e p t e m b e r1 9 8 7 ;a c c e p t e d2 5 S e p t e m b e r1 9 8 7

AAAS-Newcomb C l e v e l a n d P r i z eTo Be Awarded f o r an A r t i c l eor a Report P u b l i s h e di nS c i e n c e

T h e AAAS-NewcombC l e v e l a n dP r i z ei s a w a r d e dt o t h ea u t h o ro f a n o u t s t a n d i n gp a p e rp u b l i s h e di nS c i e n c e .T h ev a l u eo ft h ep r i z ei sS 5 0 0 0 ;t h ew i n n e ra l s or e c e i v e sa b r o n z em e d a l .T h ec u r r e n tc o m p e t i t i o np e r i o db e g a nw i t ht h e5 J u n e1 9 8 7i s s u ea n de n d sw v i t ht h ei s s u eo f 2 7Ma y1 9 8 8 .R e p o r t sa n dA r t i c l e st h a ti n c l u d eo r i g i n a lr e s e a r c hd a t a ,t h e o -

r i e s ,o r s y n t h e s e sa n d a r ef u n d a m e n t a lc o n t r i b u t i o n st o b a s i ck n o x v l e d g eo r t e c h n i c a la c h i e v em e n t so f f a r - r e a c h i n gc o n s e -q u e n c ea r ee l i g i b l ef o rc o n s i d e r a t i o no f t h ep r i z e .T h ep a p e rm u s tb ea f i r s t - t im ep u b l i c a t i o no f t h e a u t ho r ' sow n wo r k .R e f e r e n c et op e r t i n e n te a r l i e rw o r kb y t h ea u t h o rma y b e i n c l u d e dt o g i v ep e r s p e c t i v e .T h r o u g h o u tt h ec om p e t i t i o np e r i o d ,r e a d e r sa r e i n v i t e dt o

n o m i n a t ep a p e r sa p p e a r i n gi n t h eR e p o r t so r A r t i c l e ss e c t i o n s .N om i n a t i o n sm u s t b e t y p e d ,a n d t h e f o l l o w i n gi n f o r m a t i o np r o v i d e d :t h et i t l eo f t h ep a p e r ,i s s u ei nw h i c hi t w a sp u b l i s h e da u t h o r ' sn a m e ,a n da b r i e fs t a t e m e n to f j u s t i f i c a t i o nf o rn o m i n a -t i o n .N om i n a t i o n ss h o u l db e s u b m i t t e dt ot h eAAAS-NewcombC l e v e l a n dP r i z e ,AAA S ,Room 9 2 4 , 1 3 3 3 H S t r e e t ,NW,Wa s h i n g t o n ,DC2 0 0 0 5 ,a n dm u s tb e r e c e i v e do n o r b e f o r e3 0J u n e1 9 8 8 .F i n a ls e l ec t i o n w i l lr e s tw i t ha p a n e lo f d i s t i n g u i s hs c i e n t i s t sa p p o i n t e db yt h ee d i t o ro f S c i e n c e .T h e a w a r dw i l lb e p r e s e n t e da t a c e r e m o n yp r e c e d i n gt h e

P r e s i d e n t ' sP u b l i cL e c t u r ea t t h e1 9 8 9AAASa n n u a lm e e t i n gt ob e h e l di n S a n F r a n c i s c o .I n c a s e so f mu l t i p l ea u t h o r s h i p ,t h ep r i z e- w i l lb e d i v i d e de q u a l l yb e t w e e no r a m o n gt h ea u t h o r s .

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