Departamento de bioquimica

Secuenciación del ADN

Alumno: Francisco Muñoz Maestre

¿Qué es una secuencia de ADN?Una secuencia de ADN tiene factor biológico En que consiste la secuenciación del ADN¿Por qué se llego a secuenciar el ADN?Métodos de secuenciación del ADNCuriosidadesBibliografía

índice

Sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula de ADN. Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN.

las secuencias se presentan pegadas unas a las otras como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izq. a derecha.

Para que pueda llamarse secuencia tiene que haber una sucesión de al menos 4 nucleótidos

¿Qué es una secuencia de ADN?

una secuencia puede tener sentido o anti sentido, y ser tanto codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden contener “ADN no codificante”.◦ Secuencia de ADN codificante: región del ADN que transcribirá en ARN y

este a su vez se traducirá a una proteína (Exones).◦ Secuencia de ADN no codificante: región del ADN que no se transcribirá

ni se traducirá a una proteína (La mayor parte se encuentra entre los genes en el cromosoma o se encuentran dentro de los genes, intrones).

Las secuencias pueden derivarse de material biológico de descarte a través del proceso de secuenciación del ADN.

Una secuencia de ADN tiene factor biológico

Determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales , así como en campos aplicados, como la investigación de los embriones o la investigación forense.

¿Por qué se llego a secuenciar el ADN?

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora.

Métodos de secuenciación del ADN

método enzimático de terminación de cadena

Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido. Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.

Métodos de secuenciación del ADN

Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de autoradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la autoradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5' 3'.

Métodos de secuenciación del ADN

Los instrumentos modernos automáticos de secuenciación del ADN (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar más de 384 muestras marcadas por fluorescencia de una sola vez y llevar a cabo 24 ciclos de secuenciación al día. No obstante, los secuenciadores automáticos de ADN llevan a cabo solamente separación del ADN basada en el tamaño (por electroforesis capilar), detección y registro de la coloración fluorescente, y los datos resultantes se dan como cromatogramas que registran los picos de fluorescencia. Se efectúan por separado las reacciones de secuenciación mediante una termocicladora, lavado y resuspensión en una solución tamponada antes de pasar las muestras al secuenciador.

Métodos de secuenciación del ADNAutomatización y preparación de las muestras

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas.

En resumen, el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. Para visualizar los fragmentos generados en cada reacción, se hace una autoradiografía del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia.

Ventajas: utilización directa del ADN Desventajas: complejidad técnica, uso extensivo de productos peligrosos

Métodos de secuenciación del ADN

Secuenciación de Maxam-Gilbert

La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN en tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) que tiene lugar en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus dNTPs. Inicialmente, esta metodología se empleaba para monitorizar de forma continua la actividad de la ADN-polimerasa. Este método requiere de la preparación de una molécula monocatenaria de ADN a la cual se hibrida un pequeño cebador. A medida que la reacción transcurra, se irá sintetizando la cadena complementaria e iremos obteniendo una serie de picos de señal en el pirograma que nos permitirán determinar la secuencia.

Métodos de secuenciación del ADN

Pirosecuenciación

Secuenciación de alto rendimiento

La elevada demanda de secuenciación de bajo coste ha dado lugar a las distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Se pretende que las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento disminuyan los costes de secuenciación de las bibliotecas de ADN más allá de lo que se puede hacer con el método corriente del terminador marcado basado en la separación del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos métodos de alto rendimiento usan métodos que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles o millones de secuencias a la vez.

Métodos de secuenciación del ADN

El método tSMS (siglas en Inglés de True Single-Molecule Sequencing) de Helicos es uno de los más modernos comercializados hoy día para la secuenciación. A diferencia de sus predecesores, no lleva a cabo ningún tipo de amplificación de la muestra, sino que es capaz de secuenciar a partir de una única molécula monocatenaria de ADN.

La ventaja radica en la secuenciación simultanea de millones de fragmentos distintos de ADN y que podemos seguir a tiempo real gracias a las imágenes captadas. Un software analiza dichas imágenes y reconstruye las secuencias de cada fragmento, las cuales deben ser ensambladas posteriormente por programas informáticos.

Métodos de secuenciación del ADN

Secuenciación de una única molécula de ADN

2007 Por primera vez se secuencia un grupo de especies estrechamente relacionadas. Se secuencian 12 Drosofílidos (mosca de la fruta), haciendo despegar la era de la filogenómica. En ese mismo año Craig Venter publica su genoma diploide completo: el primer genoma humano en ser completamente secuenciado

En octubre de 2006, la Fundación Premio X estableció el Premio Arconte X (Archon X Prize), que premia con 10 millones de dólares al "primer equipo que pueda construir un dispositivo y utilizarlo para secuenciar 100 genomas humanos en 10 días o menos, con una exactitud no menor a un error por cada 100.000 bases secuenciadas, con secuencias que cubran correctamente al menos el 98% del genoma, y a un coste no mayor de 10.000 $ por genoma

Curiosidades

http://es.wikipedia.org/wiki/Secuencia_de_ADN http://es.wikipedia.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_de_ADN http://www.genome.gov/GlossaryS/index.cfm?id=137 http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuenc

ia.htm

Bibliografía

Muchas gracias por vuestra atención

Gracias por …

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