seleÇÃo e caracterizaÇÃo de peptÍdeos recombinantes … · 2016. 6. 23. · imunogênicas, e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA

SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES

LIGANTES A ANTICORPOS MONOCLONAIS REATIVOS A PROTEÍNAS DE

Anaplasma marginale

Vanessa Rodrigues Borges da Cunha

Orientador: Dr. Malcon Antônio Manfredi Brandeburgo

Co-Orientador: Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho

UBERLÂNDIA – MG

2008






Anaplasma marginale

Aluna: Vanessa Rodrigues Borges da Cunha

Orientador: Dr. Malcon Antônio Manfredi Brandeburgo

Co-Orientador: Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Uberlândia como parte dos

requisitos para obtenção do Título de

Mestre em Genética e Bioquímica (Área

Genética)

UBERLÂNDIA – MG

2008

iii






Anaplasma marginale

Aluna: Vanessa Rodrigues Borges da Cunha

COMISSÃO EXAMINADORA

Presidente: Dr. Malcon Antônio Manfredi Brandeburgo (Orientador)

Examinadores: _________________________________________________

_________________________________________________

_________________________________________________

Data da defesa: _________/_________/_________

As sugestões da Comissão Examinadora e as normas PGGB para o formato da

Dissertação foram contempladas.

______________________________

Dr. Malcon Antônio Manfredi Brandeburgo

iv

Dedico este trabalho aos meus pais,

Iraci e Mário, fonte de inspiração e

exemplo de esforço e dedicação, e ao

meu marido Walter, companheiro de

todos os momentos, sua sabedoria e

paciência têm me inspirado a tentar ser

o melhor que eu posso.

v

Agradecimentos

Agradeço a Deus por nos guiar pelos caminhos mais difíceis e por sempre estar

presente ao nosso lado.

Aos meus pais Iraci e Mário e meus irmãos Fernanda e Marcos, que sempre me

acompanharam, incentivaram e com muito amor torceram pelo meu sucesso.

Ao meu marido, Walter, pelo amor, incentivo, paciência e dedicação, o que sem

dúvida possibilitou meu crescimento pessoal e profissional.

Ao meu orientador Dr. Malcon Antônio Manfredi Brandeburgo pela oportunidade.

Ao Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho pela oportunidade de realizar esse trabalho sob

sua orientação, pelo estímulo, otimismo, compreensão.

Aos amigos Rafael, Carlos Prudêncio, Fausto, Rone, Carlos Ueira, que me

auxiliaram na realização deste trabalho.

À amiga Fabiana que trabalhou firmemente na realização deste trabalho

demonstrando uma disposição ímpar.

Ao Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza e ao Dr. Carlos Henrique Marchiori por

aceitarem participar desta banca examinadora.

Aos amigos dos laboratórios de Genética que sempre contribuíram para o

esclarecimento de dúvidas que surgiram neste período.

À Direção, Professores e Funcionários do Instituto de Genética e Bioquímica e à

Universidade Federal de Uberlândia pelo apoio.

Ao instituto de Genética e Bioquímica pela disponibilidade da infra-estrutura

utilizada.

vi

Sumário

Lista de abreviatura ........................................................................................ viii

Lista de aminoácidos ...................................................................................... x

Lista de tabelas .............................................................................................. xi

Lista de figuras ............................................................................................... xii

Apresentação ................................................................................................. 1

Fundamentação teórica .................................................................................. 3

Anaplasmose bovina............................................................................ 4

Anaplasma marginale .......................................................................... 4

Distribuição do Anaplasma marginale ................................................. 5

Transmissão do Anaplasma marginale ................................................ 6

Ciclo evolutivo do Anaplasma marginale ............................................. 7

Controle da anaplasmose .................................................................... 8

Proteínas de membrana de Anaplasma marginale .............................. 9

MSP1 ........................................................................................ 10

MSP2 ........................................................................................ 11

Resposta imune contra Anaplasma marginale .................................... 11

Phage Display ...................................................................................... 13

Referências bibliográficas .................................................................... 17

Capítulo único

Resumo ............................................................................................... 31

Abstract ................................................................................................ 32

Introdução ............................................................................................ 33

Material e Métodos

Anticorpos monoclonais ................................................................ 34

Seleção de peptídeos

Bipanning em solução ............................................................... 34

Titulações ................................................................................. 36

Extração de DNA de Fagos ........................................................... 36

Seqüenciamento de DNA .............................................................. 37

Análise dos dados por Bioinformática ........................................... 38

Phage ELISA ................................................................................. 38

vii

Resultados

Seleção de Peptídeos – Biopanning e titulações ................................. 40

Extração de DNA e seqüenciamento dos clones dos fagos ................ 41

Análise de dados por bioinformática .................................................... 42

Phage ELISA ....................................................................................... 51

Discussão ....................................................................................................... 53

Conclusão ...................................................................................................... 57

Referências bibliográficas .............................................................................. 58

viii

Lista de Abreviaturas

°C Graus Celsius

µg Microgramas

µl Microlitros

µm Micrometro

BSA Soro albumina bovina

DNA Ácido Desorribonucleico

DO Densidade otica

EDTA Etileno diamino tetra acetato

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

g Grama

IgG Imunoglobulina G

IPTG Isopropil α-D-tiogalactosise

kDa Quilodaltom

kg quilograma

l Litro

LB Meio de cultura Luria-Bertania

M Molar

M13KE Vetor de clonagem de bacteriófagos filamentosos

M13mp19 Vetor de clonagem de bacteriófagos filamentosos

mg miligrama

ml mililitro

mM milimolar

MSP major surface proteins

MSP1a major surface proteins 1a

MSP1b major surface proteins 1b

MSP2 major surface proteins 2




ng Nanogramas

p/v Peso por volume

ix

pb Par de base

PBS Tampão fosfato de sódio

PBST Tampão fosfato de sódio com tween 20

PCR Reação em cadeia da polimerase

PEG Polietilenoglicol

PEG Polietileno glicol

pfu Unidades formadoras de colônias

pH Potencial Hidrogenionico

Ph.D Bibliotecas de Phage display New England Biolabs

Ph.D- 12mer Biblioteca contendo 12 peptídeos randômicos

pIII

Proteína III capsídica menor de bacteriófagos

filamentosos

pIX

Proteína IX capsídica menor de bacteriófagos

filamentosos

pVI

Proteína VI capsídica maior de bacteriófagos

filamentosos

pVII

Proteína VII capsídica menor de bacteriófagos

filamentosos

pVIII

Proteína VIII capsídica menor de bacteriófagos

filamentosos

RELIC Receptor ligants Contents

rpm Rotações por minuto

TBS Tampão Tris-NaCl

TBST Tampão Trifosfato de sódio com Tween 20

UFU Universidade Federal de Uberlândia

X-gal 5-Bromo-4-cloro-3indolil- α-D-galactosideo

x

Lista de aminoácidos

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Asparagina Asn N

Ácido aspártico Asp D

Cisteína Cis C

Ácido glutâmico Glu E

Glutamina Gln Q

Glicina Gly G

Histidina His H

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Fenilalanina Fen F

Prolina Pro P

Serina Ser S

Treonina Thr T

Triptofano Trp W

Tirosina Tyr Y

Valina Val V

xi

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes a anticorpos monoclonais

anti-MSP1 e anti-MSP2 para Anaplasma. Título obtido (pfu) no processo de

seleção dos fagos por imunoafinidade. ................................................................ 41

Tabela 2 – Freqüência dos aminoácidos individuais dos peptídeos expressos nos

fagos selecionados pelos anticorpos anti-MSP1 e anti-MSP2; e a freqüência

esperada dos aminoácidos na construção da biblioteca realizada pelo AADIV ... 43

Tabela 3 – Seqüências de aminoácidos dos clones selecionados, freqüência

observada, freqüência esperada, amplificação dos peptídeos e grau de

informação............................................................................................................ 46

Tabela 4: Alinhamento linear das seqüências de aminoácidos dos peptídeos

selecionados por afinidade realizado pelo MOTIF 2. ........................................... 47

xii

Lista de Figuras

Figura 1 – Anaplasma marginale em eritrócitos circulantes. Fonte: Kessler et al,

2002. .................................................................................................................... 5

Figura 2 – Modelo de resposta imune celular e humoral contra Anaplasma

marginale. (BROWN et al. 1998a) ........................................................................ 12

Figura 3 – Vetor M13KE (Tang et al., 2002) ........................................................ 14

Figura 4 – Esquema representativo de um bacteriófago filamentoso ilustrando as

proteínas do capsídeo viral: pIX, pVII, pVIII, pVI e pIII (ARAP, 2005). ................. 15

Figura 5 – A – Arquitetura do Fago M13KE; B – Esquema do Ciclo de Seleção

por Afinidade (Adaptado de Smothers, J. F., 2002). ............................................ 16

Figura 6 – Exemplo de placa de titulação. As colônias azuis representam as

bactérias infectadas com os fagos M13 carreadores do gene da β-galactosidase.

............................................................................................................................. 40

Figura 7 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% de 12 amostras de DNA extraído

de fagos (1-12) aleatoriamente escolhidos e de 200ng de DNA controle (C) com

7249pb. ............................................................................................................... 41

Figura 8 – Freqüências observadas e esperadas de cada um dos 20 aminoácidos

para os peptídeos expressos nos fagos selecionados pelos anticorpos anti-MSP1

e anti-MSP2, conforme o programa AADIV, Relic.. .............................................. 42

Figura 9 – Gráfico construído pelo programa DIVAA que ilustra a diversidade de

sucessão dos aminoácidos em cada posição nos peptídeos. .............................. 44

Figura 10 – Proteína MSP1a de Anaplasma marginale, com destaque para o

domínio STSSxL dentro da região repetitiva de 28-29 aminoácidos (rico em

serina) que ocorre em cinco blocos repetidos. ..................................................... 49

Figura 11 – Alinhamento dos 49 peptídeos recombinantes selecionados por

Phage Display ao domínio protéico STSSxL em seqüência parcial de dois motivos

repetidos da proteína MSP1a (com 28 ou 29 aminoácidos) de Anaplasma

marginale. No motivo consenso final, as letras em vermelho indicam todos os

aminoácidos que foram alinhados com a seqüência original (em azul) ............... 50

xiii

Figura 12 – Placas de Elisa mostrando a reatividade dos clones contra o

anticorpo anti-MSP1a. .......................................................................................... 51

Figura 13 – Gráfico representativo das leituras a 492nm do ensaio de ELISA

mostrando a reatividade dos clones de fagos capturados por anticorpo anti-MSP1

e anti-MSP2 para Anaplasma marginale. ............................................................. 52

1

APRESENTAÇÃO

2

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale, é

uma doença de grande importância econômica que é transmitida

principalmente por carrapatos. A rickettsia infecta eritrócitos bovinos, causando

severa anemia associada à anorexia, febre, diminuição no ganho de peso e

produção de leite, e morte nos casos severos em animais não tratados

(ZAUGG et al., 1985).

O controle da anaplasmose é realizado por quimioterapia, controle de

vetores e imunização, sendo esse último mais eficiente (PALMER, 1989).

A membrana externa de A. marginale é capaz de induzir reposta imune

protetora contra desafio homólogo e parcialmente protetora contra desafio

heterólogo (TEBELE et al., 1991). Nela foram identificadas seis proteínas

principais de superfície - MSPs (PALMER & MCGUIRE, 1984; TEBELE et al.,

1991), as quais têm sido alvo de estudos para o desenvolvimento de

imunógenos contra a anaplasmose. Destas proteínas, MSP1a e MSP2 têm

demonstrado maior potencial como imunógenos, protegendo os animais contra

desafio com isolados virulentos homólogos e heterólogos de A. marginale,

apesar das múltiplas isoformas da primeira proteína e variabilidade do gene

que codifica a segunda.

A tecnologia de phage display tem apresentado um grande impacto na

Imunologia, Biologia Celular, descoberta de medicamentos e de fármacos em

geral. Esta técnica permite a obtenção de diferentes peptídeos ou proteínas

imunogênicas, e tem sido utilizada para revelar os diversos tipos de interações

que existem entre antígeno–anticorpo, caracterizando epítopos reconhecidos

por anticorpos.

O presente trabalho teve como objetivo identificar peptídeos ligantes à

anticorpos monoclonais reativos a proteínas de Anaplasma marginale a partir

de bibliotecas de peptídeos recombinantes por meio da tecnologia Phage

Display.

3

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

4

Anaplasmose bovina

Anaplasmose bovina é uma doença causada por uma rickettsia intra-

eritrocitária obrigatória, do gênero Anaplasma (RISTIC, 1968), que infecta

eritrócitos de bovinos, bubalinos, ovinos e caprinos, além de uma variedade de

ruminantes silvestres (WANDURAGALA & RISTIC, 1993). Duas espécies

acometem o bovino: Anaplasma marginale (THEILER, 1910), rickettsia

responsável pela doença malígna, com ampla distribuição geográfica

(KESSLER et al., 1992) e A. centrale (THEILER, 1911), agente da

anaplasmose pouco patogênica para bovinos, com baixa distribuição

(KESSLER et al., 1992).

A enfermidade é caracterizada por febre elevada, palidez de mucosas,

icterícia marcada, desidratação, perda de apetite, coprostase e fezes

ressequidas; a anemia é decorrente da massiva hemocaterese; pode ocorrer

ainda, aborto, esterilidade, queda de produção (TOKARNIA & DOBEREINER,

1962; KESSLER et al., 1992) e eventualmente morte (DREHER et al., 2005;

KOCAN et al., 2004).

A anaplasmose é uma doença economicamente importante em muitas

regiões tropicais e subtropicais do mundo, por determinar perdas econômicas

devido à mortalidade, redução do peso e da produção de leite e custos com

tratamentos (KOCAN et al., 2003).

Anaplasma marginale

Anaplasma marginale é uma rickettsia intraeritrocitária obrigatória que

causa anaplasmose em bovinos e outros ruminantes (PALMER et al., 1999).

Esse patógeno é classificado dentro da ordem Rickettsiales e tem sido

reorganizado na família Anaplasmataceae (KOCAN et al., 2004).

A espécie mais patogênica e de maior importância para os bovinos é a

A. marginale (VIDOTTO & MARANA, 2001). Essa rickettsia é visualizada em

microscopia ótica como pequenos pontos escuros, de localização periférica,

variando entre 0,1µm a 0,8µm de diâmetro (FARIAS, 1995) (Figura 1).

5

Distribuição do Anaplasma marginale

Anaplasma marginale está amplamente distribuída nas regiões tropicais,

subtropicais e temperadas do mundo (PALMER, et al., 1989). É considerada

endêmica em vários países das Américas Central e do Sul, com exceção as

áreas de deserto e de elevadas altitudes como os Andes (GUGLIELMONE,

1995). Nos Estados Unidos, A. marginale é enzoótica em vários estados do

sudeste, ao longo da costa do Atlântico, e estados da região oeste (KOCAN et

al., 2003). A bactéria já foi relatada também em países europeus às margens

do Mediterrâneo (KOCAN et al. 2000), Oriente Médio (RAPJUT et al., 2005;

MOLAD et al., 2006) e Ásia (LIU et al., 2005), além do continente africano

(THEILER, 1910), onde foi inicialmente descrita. Bovinos infectados por A.

marginale têm sido encontrados na Áustria (BAUMGARTNER et al., 1992),

Itália (CRINGOLI et al. 2002), Espanha (FUENTE et al., 2004), Portugal

(CAEIRO, 1999) e alguns países do leste europeu (KOCAN et al. 2003). Na

América do Sul, o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é apontado

como o único vetor biológico de A. marginale (AGUIRRE et al., 1994), o que

torna a distribuição da bactéria nestas áreas diretamente associada à

distribuição do vetor.

No Brasil, a situação epidemiológica da anaplasmose bovina, na maioria

das regiões, é de estabilidade endêmica (ARAÚJO et al., 1998). Mas, estudos

soroepidemiológicos da anaplasmose têm revelado variações na prevalência,

com áreas de instabilidade endêmica (PAYNE & OSÓRIO, 1990), onde os

Figura 1 – Anaplasma marginale em eritrócitos circulantes. Fonte: Kessler et al, 2002.

6

fatores ecológicos e climáticos não favorecem o desenvolvimento de R.

microplus e de dípteros hematófagos, transmissores de A. marginale (SOUZA

et al., 2000) e com situação de estabilidade em outras áreas (MADRUGA et al.,

1983; RIBEIRO et al.,1984).

Cada vez mais casos de anaplasmose têm sido observados em regiões

de clima temperado, como o norte da Europa (HOFMANN-LEHMANN et al.,

2004) e Canadá (DONKERSGOED et al., 2004).

Transmissão do Anaplasma marginale

A transmissão do Anaplasma marginale pode ser biológica, mecânica ou

transplacentária. A transmissão biológica é realizada pelos carrapatos. Mais de

20 espécies de ixodídeos com capacidade de transmitir a rickettsia para

bovinos já foram descritos (EWING, 1981). A. marginale é transmitida pelo

carrapato Dermacentor sp. em regiões temperadas como na América do Norte

e por Boophilus sp. e outros gêneros nas outras regiões geográficas (KOCAN

et al., 1992, RIBEIRO & LIMA, 1996). Sabe-se que os carrapatos são capazes

de transmitir patógenos de forma transovariana, transestadial e intraestadial,

porém a transmissão transovariana de A. marginale não tem sido confirmada

(STICH et al., 1989, RIBEIRO & LIMA, 1996, KOCAN et al, 2000, RUIZ et al,

2005). No Brasil, o carrapato Boophilus microplus é o único vetor biológico

conhecido de A. marginale (RIBEIRO & LIMA, 1996).

A transmissão mecânica de A. marginale freqüentemente ocorre via

instrumentos contaminados com sangue infectado, tais como agulhas,

instrumentos de castração, colocação de brincos, descorna e tatuagem

(POTGIETER et al., 1987; FOIL, 1989; KOCAN et al., 2003). A transmissão

mecânica por dípteros hematófagos, principalmente os dos gêneros Tabanus e

Stomoxys é uma realidade (POTGIETER et al., 1987; FOIL, 1989), embora

ainda seja contestada por alguns pesquisadores (KESSLER, 2001). Essa forma

de transmissão tem sua importância epidemiológica enfatizada quando, em

áreas consideradas livres de carrapatos vetores, casos clínicos de

anaplasmose bovina são registrados (GUGLIELMONE, 1995; HOFMANN-

LEHMANN et al., 2004).

7

A transmissão transplacentária tem sido notificada com certa freqüência

(RIBEIRO et al., 1995). Na maioria dos casos, os fetos apresentaram infecção

congênita quando as mães foram infectadas durante a gestação (KESSLER,

2001). Entretanto, também pode ocorrer em vacas portadoras crônicas

(NORTON et al., 1983).

Ciclo evolutivo do Anaplasma marginale

O desenvolvimento de A. marginale em carrapatos é complexo e

coordenado pelo ciclo de alimentação do artrópode (KOCAN et al., 2003). Os

eritrócitos infectados ingeridos durante o repasto sangüíneo do carrapato são a

fonte de infecção para suas células intestinais. Após o desenvolvimento de A.

marginale no intestino, muitos outros tecidos do carrapato são infectados,

incluindo as glândulas salivares, a partir das quais a rickettsia é transmitida

para os vertebrados durante a alimentação do carrapato (KOCAN et al., 1985;

KOCAN et al., 1992; GE et al., 1996). De forma semelhante ao que acontece

no hospedeiro vertebrado, A. marginale se desenvolve em vacúolos formados

pela invaginação da membrana celular das células dos vetores, a primeira

forma vista na colônia é a reticulada (vegetativa), que se divide por fissão

binária, formando grandes colônias que podem conter centenas de organismos.

Esta forma evolui para a forma denominada “corpos densos”, que é a forma

infectante e é capaz de sobreviver por um curto período de tempo no meio

extracelular (KOCAN et al., 2003).

Em bovinos, os eritrócitos são as únicas células infectadas por A.

marginale. Os corpúsculos iniciais, adquiridos biológica ou mecanicamente pelo

hospedeiro susceptível, após atingirem a corrente sanguínea aderem-se aos

eritrócitos, provavelmente por meio de moléculas adesivas de membrana como

a MSP1a (FUENTE et al., 2001a), e em seguida promovem a invaginação da

membrana eritrocítica até seu total englobamento. No interior dos vacúolos

formados pela membrana celular, os corpúsculos iniciais sofrem sucessivas

fissões binárias até atingirem um número de quatro a oito novos corpúsculos. O

vacúolo contendo os novos corpúsculos desloca-se em direção a periferia do

eritrócito, até a fusão do mesmo com a membrana celular, quando os novos

8

corpúsculos iniciais de A. marginale são liberados para infectar novos

eritrócitos (RISTIC & WATRACH, 1963).

Controle da anaplasmose

As estratégias de controle da anaplasmose variam com a localização

geográfica e têm sido focadas não só no controle de infecções agudas, mas

também na diminuição da população de bovinos cronicamente infectados, por

meio da redução das populações de vetores, utilizando acaricidas e antibióticos

ou por vacinação (ERIKS et al, 1993; KOCAN et al, 2000). O controle de

artrópodes não é prático em muitas áreas e protege apenas parcialmente

contra a transmissão de A. marginale, uma vez que esta rickettsia possui

outras vias de transmissão (KOCAN et al, 2000).

O grande paradoxo no controle da anaplasmose bovina são os animais

persistentemente infectados. Estes, apesar de possuírem uma sólida

imunidade contra o desenvolvimento da doença clínica, representam o principal

reservatório de infecção para animais susceptíveis, por meio da transmissão

mecânica e biológica, e contribuem para a difusão da anaplasmose. Bovinos

infectados com baixos níveis de rickettsemia são muitas vezes difíceis de

serem detectados por meio de distensões sanguíneas coradas. Além disso,

bovinos que são tratados com tetraciclinas, que reduz a rickettsemia e

subseqüentemente os títulos de anticorpos, podem mostrar-se sorologicamente

negativos para A. marginale (KOCAN et al. 2000). De acordo com COETZEE et

al. (2006) foi testada a eficiência da enrofloxacina contra A. marginale em

bezerros experimentalmente infectados. Cerca de 12 dias após a administração

de 12,5 mg/Kg da droga, observou-se uma redução no percentual de eritrócitos

parasitados de 39,13%. No entanto, esse regime de tratamento não foi capaz

de promover a eliminação total da rickettsia.

O controle de vetores, principalmente carrapatos, por meio da utilização

de acaricidas, requer altos investimentos e, segundo alguns pesquisadores, o

seu uso prolongado torna a população bovina suscetível quando a utilização é

interrompida ou quando ocorre resistência dos carrapatos aos acaricidas. Além

disso, o impacto ambiental causado por parte dos acaricidas deve ser

considerado (MOLLOY et al., 1999).

9

Com relação às vacinas vivas, existe o risco de causar manifestações

clínicas de anaplasmose em bovinos adultos, particularmente em vacas

prenhes, enquanto que os antígenos mortos podem causar isoeritrólise

neonatal, devido à sensibilização de vacas para grupos sangüíneos (ROGERS

et al., 1988). Ademais, ambos os sistemas de vacinação constituem fontes

potenciais de contaminação do animal imunizado com microrganismos

veiculados pelo sangue (KESSLER & SCHENK, 1998).

Segundo Kessler et al (2002), as pesquisas voltadas para o

desenvolvimento de vacinas mais eficazes e seguras contra A. marginale estão

focalizadas nas proteínas de membrana dos corpúsculos iniciais. A inoculação

de bovinos com membrana externa dessa rickettsia resultou em proteção de

70%.

Proteínas de membrana de Anaplasma marginale

Seis proteínas principais de superfície [major surface proteins – MSPs:

MSP1a (105kDa), MSP1b (100kDa), MSP2 (36kDa), MSP3 (86kDa), MSP4

(31kDa) e MSP5 (19kDa)] foram inicialmente identificadas em A. marginale

derivado de eritrócitos bovinos e de tecido de carrapatos (BARBET et al., 1987;

OBERLE et al., 1988; BOWIE et al., 2002).

MSP1a, MSP4 e MSP5 são codificadas por um único gene e não variam

antigenicamente durante a multiplicação da rickettsia (VISSER et al., 1992;

BOWIE et al., 2002; MOLAD et al., 2004). A conservação destas proteínas é

importante para definir os epítopos comuns e específicos que podem ser

usados para o desenvolvimento de testes sorodiagnósticos e vacinas para

anaplasmose (BARBET et al, 1999; KANO et al, 2002). Já as proteínas MSP1b,

MSP2 e MSP3 são codificadas por famílias multigênicas e podem variar

antigenicamente durante os ciclos de rickettsemia persistentes (ALLEMAN &

BARBET, 1996; FRENCH et al, 1999; BOWIE et al, 2002) inclusive em isolados

brasileiros (KANO et al, 2002).

Proteínas principais de superfície de A. marginale (MSPs)

desempenham importante papel no desenvolvimento da resposta imune de

animais infectados (PALMER & MCGUIRE, 1984). Destas proteínas, MSP1a e

MSP2 têm demonstrado maior potencial como imunógenos, protegendo os

10

animais contra desafio com isolados virulentos homólogos e heterólogos de A.

marginale, apesar das múltiplas isoformas da primeira proteína e variabilidade

do gene que codifica a segunda (ARAÚJO et al., 2003).

Algumas proteínas de membrana, não associadas a nenhuma

superfamília, também foram descritas em A. marginale (VIRB3, VIRB9 e OMA

87) (BRAYTON et al., 2005; LOPEZ et al., 2005; BRAYTON et al., 2006).

MSP1

A MSP1 é um complexo de duas proteínas, com massas moleculares de

105 e 100 kDa, denominadas MSP1a e MSP1b, respectivamente (BARBET et

al., 1987, OBERLE et al., 1988). Uma única proteína MSP1a está ligada

covalentemente, por pontes dissulfeto, a proteínas MSP1b (VIDOTTO et al.,

1994).

A MSP1a é codificada por um único gene (MSP1a), porém possui

marcante variação de tamanho entre os diferentes isolados de A. marginale (46

a 105 kDa), como verificado em isolados brasileiros desta rickettsia (KANO et

al., 2002, OLIVEIRA et al., 2003). Isso resulta da presença de um número

variável de blocos repetitivos de 28 a 29 aminoácidos, ricos em serina, na

região amino (N) terminal (OBERLE et al., 1988, ALLRED et al., 1990). Essa

região contém um epítopo sensível à neutralização conservado entre os

isolados (ALLRED et al., 1990), incluindo brasileiros (KANO et al., 2002,

OLIVEIRA et al. 2003).

Sabe-se que MSP1a e MSP1b atuam como adesinas (MCGAREY et

al.1994), estando envolvidas no processo de invasão dos corpúsculos iniciais

de A. marginale à membrana dos eritrócitos do hospedeiro. Verificou-se

também que a MSP1a é uma adesina para células de carrapato (FUENTE et al.

2001a), influenciando na transmissão de A. marginale por esse artrópode.

Carrapatos Dermacentor variabilis foram capazes de transmitir o isolado de

Oklahoma dessa rickettsia, porém não transmitiram o isolado da Flórida

(FUENTE et al., 2001b). Nesse estudo, constatou-se ainda que a MSP1 do

isolado da Flórida de A. marginale não foi capaz de mediar aderência às

células intestinais dos carrapatos, inibindo, portanto, a posterior infecção da

glândula salivar e transmissão para os bovinos.

11

Anticorpos contra MSP1, MSP1a ou MSP1b inibem a ligação de A.

marginale aos eritrócitos, o que sugere que os mesmos desenvolvem uma

atividade neutralizante da invasão da rickettsia às células do hospedeiro

(MCGAREY & ALLRED 1994, MCGAREY et al. ,1994).

A classe de anticorpo predominantemente direcionada contra a MSP1 é

a IgG (BROWN et al. 2001b). Na MSP1a, são reconhecidos epítopos na região

carboxi (C) terminal e na região N terminal (BROWN et al. 2001b). Essa última

região contém o epítopo B EASTS(S/Q)ASTSS sensível à neutralização

(PALMER et al, 1987; ALLRED et al. 1990). Acredita-se que esses motivos

sejam sítios para uma forma distinta de glicosilação (MCBRIDE et al. 2000)

ligada a resíduos O, o que explicaria o fato de que, para um determinado

isolado, a massa molecular da MSP1, separada em géis de poliacrilamida, é

maior do que o esperado, por meio da análise de sua seqüência (ALLRED et

al. 1990).

MSP2

A MSP2 é uma proteína imunodominante de superfície, codificada por

uma família de genes polimórficos (PALMER et al, 1994a). Ocorre com

monômeros ou multímeros, ligados por pontes dissulfeto (VIDOTTO et al,

1994). A análise dos diversos transcritos que codificam a MSP2 mostraram

uma região central hipervariável única flanqueada por regiões N e C terminais

altamente conservadas (FRENCH et al, 1999).

Durante cada ciclo de rickettsemia, ocorre emergência de A. marginale

expressando variantes distintas de MSP2, as quais contêm epítopos

imunogênicos que induzem anticorpos específicos durante a infecção

persistente da rickettsia (FRENCH et al, 1999).

Resposta imune contra Anaplasma marginale

Possivelmente, anticorpos contra MSPs funcionam como opsoninas,

facilitando a fagocitose e a eliminação de A. marginale por macrófagos

(CANTOR et al. 1993). Outra possível função dos anticorpos seria o bloqueio

da invasão de eritrócitos pela rickettsia. Anticorpos contra MSP1 bloqueiam a

12

aglutinação de eritrócitos de bovinos por corpúsculos iniciais de A. marginale

(MCGAREY & ALLRED, 1994).

Apesar da importância dos anticorpos na imunidade contra A. marginale,

é pouco provável que, isoladamente, os mesmos sejam capazes de proteger os

bovinos contra a anaplasmose (BROWN et al., 2001b), uma vez que a

inoculação de soro de animais imunes em bovinos susceptíveis não protege

contra desafio com A. marginale (GALE et al., 1992). Dessa forma, evidencia-

se a importância das repostas celulares, as quais envolvem a participação de

linfócitos T auxiliadores (CD4+), produtores de interferon-gama (IFN-γ)

(BROWN et al. 1998). Essa citocina ativa macrófagos, aumentando a produção

de óxido nítrico (NO), substância que têm ação tóxica sobre rickettsias;

estimulando a expressão de receptores de Fc e a fusão de fagossomos e

lisossomos (BROWN et al. 1998) (Figura 2). Além disso, demonstrou-se que,

em bovinos, o IFN-γ atua sobre linfócitos B, estimulando a produção de IgG2

(ESTES et al. 1994). Esse isotipo apresenta maior capacidade de promover

fagocitose por meio de opsonização do que a IgG1 (MCGUIRE et al. 1979),

estando provavelmente envolvido no processo de neutralização da

infectividade de corpúsculos iniciais de A. marginale mediada por anticorpos

(TUO et al. 2000).

Figura 2 – Modelo de resposta imune celular e humoral contra Anaplasma marginale. a. Linfócitos T auxiliadores

(CD4+), estimulados por antígenos de A. marginale, produzem interferon-gama (IFN-γ),o qual atua sobre macrófagos

e linfócitos B. b. Sobre macrófagos, o IFN-γ estimula a expressão de receptores de Fc, facilitando a fagocitose de A.

marginale. c. Atua também aumentando a fusão fagossomo-lisossomo e a produção de óxido nítrico, resultando na

destuição intracelular de A. marginale. d. O IFN-γ estimula a produção de IgG2 por linfócitos B. Esse isotipo tem

importante função na opsonização de A. marginale para a fagocitose. (BROWN et al. 1998a).

13

Phage Display

Bibliotecas de peptídeos têm sido selecionadas com o intuito de produzir

motivos protéicos capazes de mimetizar epítopos de anticorpos produzidos em

doenças. Os anticorpos reconhecem motivos de peptídeos baseados somente

em três ou quatro resíduos conservados. Por esse motivo, é possível a

determinação da região de uma proteína que está sendo reconhecida por um

anticorpo utilizando-se Phage Display (SCOTT et al 1990). Biblioteca de

peptídeos sintéticos apresentados em fagos é uma ferramenta importante para

identificar os sítios ligantes de moléculas biológicas de interesse. É um método

de seleção no qual uma biblioteca de peptídeos ou proteínas é expressa no

exterior da partícula viral, enquanto o material genético codificante para cada

peptídeo encontra-se no genoma viral (AZZAZY & HIGHSMITH, 2002).

A tecnologia Phage Display foi desenvolvida por Smith, em 1985, e

permite a seleção de peptídeos ou proteínas com propriedades específicas de

ligação a alvos de interesse. A tecnologia é baseada no princípio de que

polipeptídeos podem ser expressos na superfície de bacteriófagos filamentosos

pela inserção de um segmento de DNA codificante no genoma dos mesmos, de

modo que o peptídeo ou proteína expressado fique exposto na superfície da

partícula viral fusionado a uma proteína endógena.

Smith (1985) foi o pioneiro em conseguir a expressão da enzima de

restrição EcoRI como uma fusão da proteína três (pIII) do capsídeo do fago.

Tipicamente, utiliza-se o bacteriófago M13, um vírus bacteriófago filamentoso

que parasita bactérias gram-negativas que por sua vez apresentam pilus F. O

vírus utiliza maquinária de replicação, transcrição e tradução da bactéria para

se reproduzir. Este bacteriófago não provoca lise na célula hospedeira, mas

induz um estado no qual a célula infectada origina e libera partículas virais,

causando uma queda na taxa de reprodução bacteriana (AZZAZY &

HIGHSMITH, 2002).

O vetor M13KE, derivado do vetor de fagos m13mp19 possui uma rápida

propagação e não necessita de seleção por antibiótico ou superinfecção por

fago helper. Além disto, o gene lacZ, presente neste vetor, facilita a distinção

entre colônias bacterianas infectadas com fagos de bibliotecas (colônias azuis)

e colônias não infectadas ou infectadas com fagos selvagens (colônias

14

brancas) (MESSING et al., 1977; MESSING, 1983). O vetor M13KE (Figura 3)

permite a construção e propagação de bibliotecas de phage display pelo uso de

técnicas padronizadas para fagos M13. Para pequenos insertos, a biblioteca

pode ser amplificada repetidamente com pouca perda de seqüências e

diversidade (BARBAS et al., 2001).

Anticorpos monoclonais utilizados na tecnologia Phage Display têm sido

direcionados contra uma série de proteínas, muitas vezes consistindo em

glicoproteínas imunodominantes de superfície de patógenos, como vírus,

bactérias e protozoários, envolvidos nas mais diferentes patologias humanas e

animais, como alergias, doenças auto-imunes, doenças infecto-contagiosas e

outras. A seleção de peptídeos por meio de anticorpos monoclonais serve a

muitos propósitos, sendo o mais comum deles a identificação e mapeamento

de epítopos. A localização inequívoca de epítopos envolve a identificação de

homologia entre o peptídeo selecionado e o antígeno natural. O mapeamento

de epítopos pode produzir, também, informações que ajudem no

esclarecimento da organização estrutural do antígeno e suas relações

estruturais e funcionais (DEROO & MULLER, 2001).

A partícula de fago (Figura 4) é formada por uma fita simples de DNA

envolta por uma capa protéica constituída por cinco proteínas (pIII, pVI, pVII,

pVIII e pIX). Destas cinco proteínas existem aproximadamente 2800 cópias da

pVIII e cinco cópias da pIII. Neste sistema, o gene codificador do peptídeo ou

Figura 3 – Vetor M13KE (Tang et al., 2002).

15

proteína de interesse é geralmente fusionado a um dos genes destas duas

proteínas da capa protéica do fago (PHIZICKY & FIELDS, 1995; BRÍGIDO &

MARANHÃO, 2002).

Figura 4 - Esquema representativo de um bacteriófago filamentoso ilustrando as proteínas do capsídeo viral: pIX, pVII,

pVIII, pVI e pIII (ARAP, 2005).

A apresentação do peptídeo pelo fago é possível, pois, nesse sistema,

seqüências aleatórias de DNA são introduzidas no gene que codifica a proteína

do capsídeo do fago (camada externa e protetora). Desta forma, seqüências

aleatórias de peptídeos fundidas à proteína do capsídeo (pIII ou pVIII,

dependendo do sistema a ser empregado) são geradas durante a produção da

partícula viral (SMITH, 1985). No fim do processo, bilhões de bacteriófagos são

gerados, cada um deles apresentando um peptídeo diferente. Esta coleção de

partículas virais recebe o nome de biblioteca apresentadora de peptídeos.

Estas bibliotecas são, então, incubadas com as moléculas alvo do estudo

(receptores purificados, células expressando seus receptores de superfície,

anticorpos, entre outros). Este processo denominado biopanning (Figura 5), ou

simplesmente panning, permite selecionar os fagos ligantes, expressando os

peptídeos que mimetizam ligantes naturais destas moléculas (BARBAS et al.,

2001).

16

Figura 5 – A – Arquitetura do Fago M13KE; B – Esquema do Ciclo de Seleção por Afinidade (Adaptado de SMOTHERS, J. F., 2002).

Várias aplicações das bibliotecas de peptídeos randômicos expostos em

fagos têm sido realizadas com sucesso, tais como mapeamento de epítopos

(JEFFERIES, 1998), desenvolvimento de vacinas (IRVING et al., 2001),

identificação de substratos de proteínas quinases/ligantes de SH2 (KAY et al.,

2001), e identificação de peptídeos miméticos de ligantes não peptídeos

(OLDENBURG, 1992). As vantagens da utilização da técnica são: a habilidade

de selecionar ligantes de alta afinidade, a possibilidade de produzir proteínas

solúveis, o baixo custo, o fácil manuseio e a rapidez (SMITH & PETRENKO,

1997). Uma particular aplicação é a identificação de novos peptídeos bioativos

pela seleção contra receptores de superfícies celulares imobilizados ou em

células intactas (SILVA, et al., 2002). Phage display pode ser utilizado também

in vivo para identificar peptídeos que se ligam em órgãos específicos. Neste

caso, a biblioteca de fagos é injetada por via intravenosa, geralmente em

roedores, e após o período de incubação os órgãos de interesse são

removidos, homogeneizados e mantidos em suspensão com E. coli (RAJOTTE

et al., 1998).

17

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30

CAPÍTULO ÚNICO



Anaplasma marginale

31

RESUMO

Anaplasmose bovina é uma infecção causada por Anaplasma marginale

e A. centrale. A espécie mais patogênica e de maior importância para bovinos é

a A. marginale e está amplamente distribuída nas regiões tropicais,

subtropicais e temperada do mundo. A. marginale é uma rickettsia intra-

eritrocitária de ruminantes susceptíveis, transmitido biológica e mecanicamente

por carrapatos e insetos hematófagos. O carrapato Rhipicephalus (Boophilus)

microplus é o principal transmissor de A. marginale no Brasil. A forma

congênita de transmissão em bovinos pode ocorrer, ocasionando a

anaplasmose neonatal. A membrana externa do A. marginale inclui seis

proteínas principais de superfície (MSPs) bem caracterizadas, designadas de

MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 e MSP5 e desempenham papel

importante no desenvolvimento da resposta imune de animais infectados. Para

o desenvolvimento deste estudo, foi utilizada a técnica de Phage Display para

identificar peptídeos ligantes a anticorpos monoclonais reativos a proteínas de

Anaplasma marginale a partir de bibliotecas de peptídeos recombinantes por

meio da tecnologia Phage Display. Para seleção dos peptídeos foi realizado

uma seleção subtrativa utilizando uma biblioteca de peptídeos com 12

aminoácidos randômicos, Ph.D.-12, expressa na superfície do fago filamentoso

M13 concomitantemente contra os anticorpos anti-MSP1a e anti-MSP2. Após

quatro ciclos de seleção e validação por ELISA, o conjunto de peptídeos

selecionados apresentou ser unicamente reconhecido pelo anticorpo anti-

MSP1. Análises de bioinformática identificaram 45 peptídeos, que

apresentaram o motivo proteico consenso STxS, representado em 78% dos

fagos seqüenciados. Devido aos múltiplos sítios repetidos encontrados na

proteína MSP1, o motivo proteíco STSSxL pode ser um importante alvo

biológico, com potencial utilização em ensaios diagnósticos e vacinais para o

controle de Anaplasma marginale.

Palavras chave: Anaplasma marginale, MSP1, Phage Display

32

ABSTRACT

Bovine anaplasmosis is caused by Anaplasma marginale and A.

centrale. The most pathogenic and important species for cattle production is A.

marginale, and is widely distributed in tropical, subtropical and temperate

regions of the world. A. marginale is an intra-erythrocyte rickettsia of susceptible

ruminants, biological and mechanically transmitted by ticks and hematophagous

insects. The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of A.

marginale in Brazil. The congenital form of transmission in cattle may occur,

causing the neonatal anaplasmosis. The outer membrane of A. marginale

includes six well characterized major surface proteins, MSP1a, MSP1b, MSP2,

MSP3, MSP4 and MSP5, which play important role in the development of the

immune response of infected animals. In this study, we have used the Phage

Display technology to identify specific peptides that were immunoreactive to

monoclonal antibodies anti-A. marginale proteins. Peptide selection was

performed using a subtractive selection of a peptide library with 12 random

amino acids, Ph.D.-12, expressed on the surface of the M13 filamentous phage

concurrently against the anti-MSP1a and anti-MSP2. After four rounds of

selection and validation by ELISA, the selected peptides have recognized only

the anti-MSP1. Analysis of bioinformatics identified 45 peptides, which showed

the protein consensus sequence STxS that was represented in 78% of selected

phages. Due to the multiple motif repeats found in MSP1 protein, the STSSxL

motif may become an important biological target, with potential use in diagnostic

tests and vaccine for the control of Anaplasma marginale.

Key-words: Anaplasma marginale, MSP1, Phage Display.

33

INTRODUÇÃO

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale, é

uma doença de grande importância econômica que é transmitida

principalmente por carrapatos. A rickettsia infecta eritrócitos bovinos, causando

severa anemia associada à anorexia, febre, diminuição no ganho de peso e

produção de leite, e morte nos casos severos em animais não tratados

(ZAUGG et al., 1985).

O controle da anaplasmose é realizado por quimioterapia, controle de

vetores e imunização, sendo esse último mais eficiente (PALMER, 1989).

A membrana externa de A. marginale é capaz de induzir reposta imune

protetora contra desafio homólogo e parcialmente protetora contra desafio

heterólogo (TEBELE et al., 1991). Nela foram identificadas seis proteínas

principais de superfície - MSPs (PALMER & MCGUIRE, 1984; TEBELE et al.,

1991), as quais têm sido alvo de estudos para o desenvolvimento de

imunógenos contra a anaplasmose. Destas proteínas, MSP1a e MSP2 têm

demonstrado maior potencial como imunógenos, protegendo os animais contra

desafio com isolados virulentos homólogos e heterólogos de A. marginale,

apesar das múltiplas isoformas da primeira proteína e variabilidade do gene

que codifica a segunda.

A tecnologia de phage display tem apresentado um grande impacto na

Imunologia, Biologia Celular, descoberta de medicamentos e de fármacos em

geral. Esta técnica permite a obtenção de diferentes peptídeos ou proteínas

imunogênicas, e tem sido utilizada para revelar os diversos tipos de interações

que existem entre antígeno–anticorpo, caracterizando epítopos reconhecidos

por anticorpos.

O presente trabalho teve como objetivo identificar peptídeos ligantes à

anticorpos monoclonais reativos a proteínas de Anaplasma marginale a partir

de bibliotecas de peptídeos recombinantes por meio da tecnologia Phage

Display.

34

MATERIAIS E MÉTODOS

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Os anticorpos monoclonais 15D2 (MSP1) do isotipo IgG3 e O50A2

(MSP2) do isotipo IgG1, ligantes às proteínas de superfície de Anaplasma

marginale, foram adquiridos na empresa Veterinary Medical Research &

Development, VMRD, Inc. (PO Box 502, Pullman, WA 99163 USA,

www.vmrd.com).

SELEÇÃO DE PEPTÍDEOS

Biopanning em Solução

A seleção de peptídeos sintéticos reativos aos anticorpos acima

descritos foi realizada utilizando uma biblioteca randômica de peptídeos de 12

aminoácidos (“Ph.D. – 12mer – New England Biolabs”), seguindo-se, com

algumas modificações, as recomendações do fabricante.

A biblioteca é composta por doze peptídeos randômicos seguidos por

uma curta seqüência espaçadora Gly-Gly-Gly fusionada à região N - terminal

da proteína capsídica menor (Proteína III) de bacteriófagos M13 filamentosos.

A biblioteca consistia de 2,8 x 10¹¹ clones independentes, os quais representam

as 1.9 x 109 possíveis combinações contidas nos 12 resíduos de aminoácidos.

Todas as cinco cópias da Proteína III capsídica dos fagos contêm peptídeos

randômicos aminoterminais (NOREN & NOREN, 2001).

A seleção foi realizada em solução, sendo utilizado como substrato 50µL

de proteína G agarose em 50% de solução aquosa (Recombinant Protein G

Agarose – InvitrogenTM), lavados por ressuspensão em microtubo com 1 mL de

TBS-T (TRIS – HCl 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM; Tween 20 0,1%). Após

centrifugação a 4000 rpm por 1 minuto em centrífuga refrigerada à 4ºC, o

sobrenadante foi cuidadosamente retirado e descartado. Em seguida, a resina

foi bloqueada por uma hora em solução de bloqueio (NaHCO3 0,1 M, pH 8,6;

BSA 5 mg/mL; NaN3 0,02%) a 8ºC, sendo misturada de 15 em 15 minutos.

Após a incubação, a mesma foi lavada por quatro vezes, conforme descrito

anteriormente, para então receber a mistura de 300ng dos anticorpos

35

monoclonais MSP1 e MSP2, seguido pela adição de 2,0 x 1011 partículas virais

em um volume final de 200 µL de TBS-T 0,1%, previamente incubados à

temperatura ambiente por 20 minutos.

A mistura resina/anticorpo/fago foi agitada vagarosamente por 3 vezes

durante os 15 minutos de incubação a temperatura ambiente e em seguida

lavada por 10 vezes com 1 mL de TBS-T 0,1%, preparando-a para a eluição

dos fagos ligantes feita com 1 mL de tampão de eluição (Glicina – HCl 0,2M,

pH 2,2; 1 mg/mL de BSA) por 10 minutos à temperatura ambiente. Esta

solução foi então centrifugada por 1 minuto a 4.000 rpm e o eluato transferido

para um novo microtubo, onde foi imediatamente neutralizado com 150 µL de

TRIS-HCl 1 M, pH 9,1.

Após a neutralização do eluato, uma amostra de 10 µL do mesmo foi

titulada e o volume restante utilizado na reamplificação dos fagos em 30 mL de

meio de cultura de E. coli (ER2738) contendo tetraciclina e em fase inicial de

crescimento bacteriano (OD600 ≤ 0,3). A cultura foi incubada por 6 horas em

agitador com temperatura e rotação controladas a 37ºC e 210 rpm, antes dos

procedimentos de precipitação e titulação dos fagos.

A precipitação dos fagos iniciou-se pela centrifugação da cultura por 10

minutos e 4.000 rpm, afim de extrair as células bacterianas. Após o descarte

destas células, a cultura foi novamente centrifugada e extraídas as células

residuais. O sobrenadante foi transferido a um novo tubo, onde foi adicionado

20% do volume de PEG-NaCl (20% p/v de polietileno glicol – 8000 e NaCl

2,5M). A mistura permaneceu em repouso por 12 horas a 8ºC e posteriormente

foi centrifugada por 15 minutos a 14.000 rpm e 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e a amostra foi novamente centrifugada, agora por 2 minutos, a fim

de ser possível a retirada do sobrenadante residual. O “pellet” foi diluído em

200 µL de TBS 1X e os fagos foram posteriormente titulados.

Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram

utilizados no segundo ciclo em número de partículas de 2,0 x 1011 e assim

subseqüentemente por mais 3 ciclos, sendo que cada ciclo envolveu os

procedimentos de seleção, titulação do eluato, reamplificação e titulação dos

fagos reamplificados. A partir do segundo ciclo, a estringência do tampão de

36

lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5%, utilizando-se, então, 0,5% de

Tween-20 nas lavagens.

Titulações

Para todas as titulações de fagos foram utilizados 10 µL de solução

contendo os fagos, diluídos em 90 µL de meio de cultura LB. As diluições

seqüenciais (101 a 104 para eluatos não amplificados e 108 a 1011 para fagos

amplificados e purificados) foram incubadas por 5 minutos com 200 µL de E.

coli (ER2738) em fase de crescimento inicial e plaqueadas em meio de cultura

LB sólido contendo IPTG (0,5 mM) e X-Gal (40 µg/mL) juntamente com 3 mL

de Agarose Top (10g de Bacto-Triptona, 5g de Extrato de Levedura, 5g de

NaCl e 1g de MgCl2.6H2O por litro de água).

As placas foram então incubadas em estufa por 18 horas a 37ºC e as

colônias azuis (resultantes da quebra do substrato X-Gal pela enzima β-

galactosidase) foram contadas para a obtenção dos títulos de entrada e saída

de partículas de fago, através da multiplicação do número de colônia azuis pelo

fator de diluição, para todos os ciclos de seleção.

Extração de DNA de Fagos

Para a extração do DNA dos fagos, colônias isoladas de uma placa

oriunda do 3º ciclo do biopanning foram transferidas para poços de 2mL de

placas de cultura tipo deepwell, contendo 1mL de cultura de ER2738 em fase

early-log (OD600 ~ 0,3); a cada poço foi adicionada apenas uma colônia de fago.

A placa foi vedada com um adesivo próprio e incubada a 37ºC, por 24 horas,

sob vigorosa agitação (250rpm).

Para isolar os fagos das bactérias, as placas foram centrifugadas a

3700rpm, a 20ºC, durante 10 minutos. Apenas 800µL do sobrenadante da

centrifugação foram transferidos para novas placas e incubados a temperatura

ambiente por 10 minutos com 350µL de PEG/NaCl. Após o período de

incubação, as placas foram centrifugadas a 3700rpm, a 20ºC durante 40

minutos para precipitação dos fagos. Em seguida, o sobrenadante foi

37

descartado e 100µL de Tampão Iodeto (10mM de Tris-HCl pH 8,0, 1mM de

EDTA e 4M de NaI) foi adicionado ao precipitado de fagos.

As placas foram agitadas vigorosamente e, em seguida, 250µL de etanol

absoluto foi acrescentado. Após uma incubação de 10 minutos, a temperatura

ambiente, as placas foram centrifugadas 3700rpm, 20ºC, 10 minutos e o

sobrenadante descartado. O precipitado de fagos foi lavado com 500µL de

etanol 70% e recentrifugado. Finalmente, o precipitado remanescente foi

diluído em 20µl de água ultrapura. A qualidade do DNA fita simples foi

verificada pela corrida eletroforética em gel de agarose 0,8% corado com

solução de brometo de etídeo e leitura espectrofotométrica (260nm e 280nm),

respectivamente.

Seqüenciamento de DNA

Na reação de sequenciamento foram utilizados 500ng de DNA molde,

5pmol do primer -96 gIII (5’- OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG -3’ - Biolabs)

e Premix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit. – Amersham Biosciences).

A reação de 35 ciclos foi realizada em um termociclador de placas

(MasterCycler - Eppendorf) nas seguintes condições: desnaturação (a 95ºC por

20 segundos), anelamento do primer (a 58ºC por 15 segundos) e extensão (a

60ºC por um minuto). O DNA seqüenciado foi precipitado com 1µL de acetato

de amônio e etanol, homogeneizando a placa com leves batimentos. Então,

foram acrescentados 27,5µL de etanol absoluto, em seguida, a placa foi

centrifugada por 45 minutos, a 4000rpm e o sobrenadante descartado.

Adicionou-se 150µL de etanol 70% ao DNA precipitado e centrifugou-se

por 10 minutos, a 4000rpm. A solução de etanol foi descartada, a placa

permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta posição foi pulsada a

800rpm, durante um segundo. A placa foi coberta por um papel alumínio

durante cinco minutos para evaporar o etanol remanescente. Os precipitados

resultantes foram ressuspendidos no tampão de diluição (DYEnamic ET Dye

Terminator Cycle Kit – Amersham Biosciences).

A leitura do sequenciamento foi realizada em um seqüenciador

automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences) no laboratório de

Genética Molecular (UFU).

38

Análise dos Dados por Bioinformática

A tradução das seqüências de aminoácidos obtidas no seqüenciamento

foi realizada pelo programa DNA2PRO12. Este programa é designado para a

tradução de seqüências de insertos tanto de bibliotecas da New England

Biolabs (Ph.D.-12TM ou Ph.D.-C7CTM) quanto de outras bibliotecas de interesse

que contiverem as seqüências inicial e final do vetor. O programa

automaticamente localiza a posição do inserto, traduz o mesmo e indica

qualquer erro possível na seqüência, tais como códons inesperados ou erros

na seqüência próxima (http://relic.bio.anl.gov/dna2pro12.aspx).

DIVAA (http://relic.bio.anl.gov/divaa.aspx) foi utilizado para o cálculo da

diversidade e derivação padrão dos aminoácidos em cada posição nos

peptídeos. O cálculo da freqüência, diversidade de aminoácidos dentro da

população de peptídeos foi realizado pelo programa AADIV

(http://relic.bio.anl.gov/aafreqs3.aspx).

As homologias de cada peptídeo, individualmente ou não, com proteínas

de Anaplasma marginale foram testadas utilizando-se o programa MATCH

(http://relic.bio.anl.gov/match.aspx). O programa MATCH foi usado para parear

uma seqüência específica de proteína de A. marginale com todas as

seqüências peptídicas selecionadas.

Phage ELISA

Para quantificação da reatividade dos clones aos anticorpos foi realizado

o ensaio de ELISA onde placas de microtitulação foram sensibilizadas, com os

anticorpos anti-MSP1 e anti-MSP2, para todas as amostras, com 1µg/poço de

cada anticorpo diluído em tampão carbonato 100mM (8,3g NAHCO3, dissolvido

em 1L de água, autoclavado) pH 8,5 por 1 hora a temperatura ambiente.

Decorrido o tempo de incubação as placas foram bloqueadas com 150µL de

BSA a 1% overnight a 4ºC.

As placas foram lavadas por três vezes com PBST (0,1% de Tween 20)

e incubadas por 2 horas a temperatura ambiente com 100µL/poço de cultura

dos fagos selecionados, do fago selvagem (fago que não expressa nenhuma

proteína exógena) e de meio de cultura sem fago, para controle das reações.

39

Posteriormente as placas foram lavadas cinco vezes e incubadas com

anti-M13 conjugado com peroxidase diluído 1:5000 em PBST 0,1%, durante 1

hora a temperatura ambiente, lavadas novamente por cinco vezes e a ligação

antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina

(OPD) a 1mg/mL. A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 4N.

A reatividade foi obtida em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus, Flow

Laboratories, USA) pela leitura a 492nm.

O índice ELISA (IE) para os clones testados foi calculado realizando a

divisão das leituras das densidades óticas (DO) das amostras pelo valor de

cutoff. O valor cutoff foi calculado segundo a fórmula: cutoff = média das DOs

do fago selvagem + 2X desvio padrão. Os IEs maiores que 1 foram

considerados positivos e os IEs menores que 1 foram considerados negativos.

40

RESULTADOS

Seleção de Peptídeos - Biopanning e Titulações

Os procedimentos de titulação dos fagos foram eficientes em todos os 3

ciclos de seleção realizados, as colônias de bactérias apresentaram coloração

azulada, demonstrando a quebra do substrato X-Gal e a expressão do gene da

β-galactosidase pelas bactérias ER2738, como mostrado na Figura 6. Não

foram observados, nas titulações, colônias transparentes resultado da ausência

de bactérias não infectadas ou infectadas com fagos selvagens (não

carreadores do gene lac Z).

A contagem do número de colônias azuis foi realizada em placas com

aproximadamente 100 colônias. Após a contagem e multiplicação pelo devido

valor de diluição, foram obtidos os títulos de entrada e saída para cada ciclo.

Figura 6 – Exemplo de placa de titulação. As colônias azuis representam as bactérias infectadas com

os fagos M13 carreadores do gene da β-galactosidase.

41

Tabela 1 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes a anticorpos monoclonais anti-MSP1 e anti-MSP2

para Anaplasma. Título obtido (pfu) no processo de seleção dos fagos por imunoafinidade.

Ciclos

Número de partículas de fagos

Entrada Saída

1º Ciclo de seleção 2x1010 1,7x103



A quantidade de fagos selecionados durante os três ciclos de seleção foi

estimada pela titulação dos eluatos amplificado e não amplificado de cada ciclo

(Tabela 1). Os títulos de entrada dos fagos no “biopanning” foram sempre

maiores que os títulos de saída, pois os fagos com maior afinidade a proteínas

anti-MSP1 e anti-MSP2 ficam ligados a elas por interação peptídeo/anticorpo e

o restante dos fagos com baixa ou sem afinidade foi removido durante as

lavagens. Nas amplificações ocorre o inverso, indicando a eficiência do

processo.

Extração de DNA e Seqüenciamento dos Clones de Fagos

O DNA extraído dos fagos foi submetido à eletroforese em gel de

agarose 0,8%, para verificar sua qualidade e estimar sua quantidade,

comparando a intensidade das bandas das amostras com a intensidade da

banda do DNA padrão, o qual continha uma massa de 200ng (Figura 7). Em

seguida o DNA foi seqüenciado e analisado.

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 7 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% de 12 amostras de DNA extraído de fagos (1-12)

aleatoriamente escolhidos e de 200ng de DNA controle (C) com 7249pb.

42

Dos 96 clones seqüenciados, 52 apresentaram seqüências válidas (sem

erros de sequenciamento), onde foram identificadas 49 seqüências diferentes e

as demais ocorrendo repedidas vezes.

ANÁLISE DE DADOS POR BIOINFORMÁTICA

Após a tradução das seqüências de DNA pelo programa DNA2PRO12, o

cálculo da freqüência de cada aminoácido nos peptídeos seqüenciados foi

realizado pelo programa AADIV.

A Figura 8 e a Tabela 2 apresentam a comparação entre a freqüência

dos vinte aminoácidos presentes nos peptídeos ligantes e a freqüência

esperada dos aminoácidos na biblioteca original. Mais uma vez, observa-se

que a seleção foi eficiente principalmente pelos aminoácidos Cisteína, Glicina,

Lisina e Arginina que foram selecionados negativamente apresentando

freqüência bem abaixo do esperado, e pela seleção positiva dos aminoácidos

Asparagina, Serina e Treonina, os quais apresentaram uma freqüência bem

elevada em relação à esperada sugerindo que esses aminoácidos estão

envolvidos na maioria das interações peptídeo-anticorpo.

Figura 8 – Freqüências observadas e esperadas de cada um dos 20 aminoácidos para os peptídeos

expressos nos fagos selecionados pelos anticorpos anti-MSP1 e anti-MSP2, conforme o programa

AADIV, Relic.

43

Tabela 2 – Freqüência dos aminoácidos individuais dos peptídeos expressos nos fagos selecionados

pelos anticorpos anti-MSP1 e anti-MSP2; e a freqüência esperada dos aminoácidos na construção da

biblioteca realizada pelo AADIV.

DIVAA é uma medida quantitativa de diversidade de sucessão dos

aminoácidos, e gera hipóteses relativas à contribuição de resíduos individuais

para as relações funcionais e evolutivas entre proteínas. A Figura 9 apresenta

um gráfico gerado pelo programa DIVAA que calcula a diversidade de

aminoácidos em cada uma das 12 posições nos peptídeos e a derivação

padrão, mostrando as posições onde ocorreu a maior diversidade de

aminoácidos, o gráfico mostra que nas posições 1, 2 e 3 houve a maior

diversidade de aminoácidos enquanto que as diversidade nas posições 7, 8, 9

e 10 foram reduzidas, ficando abaixo de 0,2.

Aminoácido 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total Freqüência

A (Alanina) 3 4 5 3 8 5 2 3 7 3 1 4 48 0,0816

C (Cisteína) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0000

D (Aspartato) 1 3 0 1 1 0 0 0 0 1 3 2 12 0,0200

E (Glutamato) 2 2 0 2 2 0 0 0 1 0 1 0 10 0,0170

F (Fenilalanina) 6 0 0 2 2 2 3 1 4 5 6 3 34 0,0578

G (Glicina) 3 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 8 0,0136

H (Histidina) 4 2 2 5 4 1 1 0 0 0 1 2 22 0,0374

I (Isoluecina) 1 2 1 3 0 1 0 1 1 1 1 1 13 0,0221

K (Lisina) 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0,0068

L (Leucina) 4 3 4 3 0 2 1 3 2 5 9 22 58 0,0986

M (Metionina) 5 0 4 2 2 1 0 0 0 0 1 0 15 0,0255

N (Asparagina) 3 7 6 7 3 4 3 1 1 1 2 1 39 0,0663

P (Prolina) 0 7 4 1 5 2 3 0 0 2 6 2 32 0,0544

Q (Glutamina) 4 1 2 1 4 0 1 1 0 0 1 1 16 0,0272

R (Arginina) 0 2 3 1 0 2 0 0 1 0 2 0 11 0,0187

S (Serina) 3 5 8 5 13 18 26 16 21 26 10 3 153 0,2602

T (Treonina) 4 3 3 10 2 7 9 21 7 2 1 4 73 0,1241

V (Valina) 1 2 1 1 1 1 0 1 1 1 2 2 14 0,0238

W (Triptofano) 1 1 2 0 0 0 0 0 1 0 0 1 6 0,0102

Y (Tirosina) 2 6 3 1 1 3 0 1 1 1 1 0 20 0,0340

Diversidade 6/50 7/52 8/52 10/53 13/54 18/55 26/56 21/57 21/58 28/59 10/60 22/61

CONSENSO F N/P S T S S S T S S S L 588

44

Figura 9 – Gráfico construído pelo programa DIVAA que ilustra a diversidade de sucessão dos

aminoácidos em cada posição nos peptídeos.

Existem diversos parâmetros que indicam o sucesso de seleção de cada

peptídeo. Na Tabela 3 são apresentados os seguintes parâmetros: seqüências

de aminoácidos obtidas, freqüência dos peptídeos selecionados (FO),

freqüência esperada desses peptídeos na biblioteca original (FE), amplificação

dos peptídeos decorrentes do processo de seleção em relação à freqüência

esperada dos peptídeos da biblioteca original (FO/FE), grau de informação de

cada peptídeo (I(m)) e número provável de clones independentes dentro da

biblioteca (λ). Estes parâmetros são obtidos mediante cálculos a partir das

freqüências dos aminoácidos para cada posição no clone, a freqüência

esperada é calculada pela multiplicação das freqüências de todos os

aminoácidos observados, tabela que é apresentada pelo fabricante para cada

tipo de biblioteca de fagos. Todos os outros parâmetros são fórmulas que se

originam desta FE, conforme apresentadas na publicação de Rodi et al.,

(2002). Ao analisar a tabela, deve-se relacionar todos os dados de cada

peptídeo selecionado, assim um peptídeo que apresenta um baixo valor de FE

45

e λ, e alto valor para I(m) e FO/FE possui uma baixa probabilidade de ser

selecionado, a menos que a seleção seja de fato específica. Ao observar os

clones 4, 5, 40 e 45, por exemplo, veremos que eles possuem os maiores

valores para I(m) e FO/FE, e os menores para FE e λ, mas mesmo assim foram

selecionados durante o biopanning, o que comprova mais uma vez a eficiência

da seleção.

Para identificar um motivo consenso entre os 49 clones selecionados,

analisou-se a freqüência dos aminoácidos observados em cada posição da

seqüência peptídica formada, de 1 a 12 aminoácidos (Tabela 2). Para efeito de

estabelecer o motivo consenso observou-se a maior freqüência em cada

posição, e aquelas freqüências que eram inferiores à menor freqüência

observada na posição 7 (9/56) não foram consideradas para compor o motivo

central, considerando então somente aquelas posições com ≥10 observações

do mesmo aminoácido, que originou o motivo TSSSTSSSL. Se ainda for

considerado apenas aquelas posições com freqüência acima de 35%, o motivo

consenso seria STSSxL.

Motivos protéicos comuns também foram identificados por meio do

alinhamento dos clones, após a terceira seleção no experimento (Tabela 4).

Dois grupos de aminoácidos foram gerados, sendo o primeiro grupo constituído

pelo motivo STxS e o segundo grupo pelo motivo TSS. Nestes dois casos, o

motivo consenso foi considerado quando ocorreu quatro ou mais vezes nos

clones distintos. Contudo, pode-se considerar ainda dois outros motivos

semelhantes e muito freqüentes, STSS e STAS, sendo que o primeiro se

repete duas vezes dentro da seqüência consenso geral entre todos os clones

(Tabela 2).

46

Clone Peptídeo Freqüência Observada

(FO)

Freqüência Randômica*

(FE)

Amplificação** (FO/FE)

I(m)*** λ****

1 YNSTASFSTPHL 2/52 1,86 x 10-13 1,05 x 1011 29,3 3,73 x 10-4

2 HTMTSASTSSLL 1/52 6,77 x 10-13 2,89 x 1010 28 1,35 x 10-3

3 QYAPSTNSYLLL 1/52 1,18 x 10-12 1,65 x 1010 27,5 2,37 x 10-3

4 INPIHNSTASFT 1/52 4,59 x 10-21 4,26 x 1018 46,8 9,18 x 10-12

5 FVPFASTSSNLA 1/52 4,17 x 10-19 4,69 x 1016 42,3 8,35 x 10-10

6 VYANQASTASRL 1/52 2,37 x 10-13 8,26 x 1010 29,1 4,74 x 10-4

7 HSTEAASTSSFA 1/52 1,16 x 10-14 1,67 x 1012 32,1 2,33 x 10-5

8 FASDMRPSTSSF 1/52 1,88 x 10-14 1,03 x 1012 31,6 3,77 x 10-5

9 FNSTSSLLTSSP 1/52 6,91 x 10-17 2,83 x 1014 37,2 1,38 x 10-7

10 LESRYFPVITPT 1/52 1,25 x 10-14 1,56 x 1012 32 2,50 x 10-5

11 FNNTNSTSSFVS 1/52 8,85 x 10-16 2,21 x 1013 34,7 1,77 x 10-6

12 QWNTSSFAVYDP 1/52 6,49 x 10-16 3,01 x 1013 35 1,29 x 10-6

13 LEYHQVTLRDVL 1/52 3,23 x 10-13 6,06 x 1010 28,8 6,46 x 10-4

14 ESAAPYSTNSFA 1/52 5,26 x 10-12 3,72 x 109 26 1,05 x 10-2

15 HLASSSTSSSLG 2/52 1,29 x 10-15 1,51 x 1013 34,3 2,59 x 10-6

16 FNRLPYSTSSSL 1/52 1,87 x 10-14 1,04 x 1012 31,6 3,74 x 10-5

17 NDRNSLNTTSFL 152 2,42 x 10-14 8,08 x1011 31,4 4,85 x 10-5

18 ASQMVSTSSFND 2/52 2,83 x 10-13 6,90 x 1010 28,9 5,67 x 10-4

19 HVMSPHPQSTLL 1/52 2,14 x 10-17 9,13 x 1014 38,4 4,29 x 10-8

20 TPVNEAQNTASF 1/52 3,22 x 10-16 6,07 x 1013 35,7 6,45 x 10-7

21 GTWNNTSSLLLN 1/52 8,53 x 10-13 2,29 x 1010 27,8 1,70 x 10-3

22 MHMTHSSTASYL 1/52 9,93 x 10-14 1,97 x 1011 29,9 1,98 x 10-4

23 SALNSTSSFSSH 1/52 7,95 x 10-13 2,46 x 1010 27,9 1,59 x 10-3

24 MRAVSTSSFPAL 1/52 3,68 x 10-13 5,32 x 1010 28,6 7,36 x 10-4

25 KLSLHNTSSVLT 1/52 1,26 x 10-17 1,55 x 1015 38,9 2,52 x 10-8

Clone Peptídeo Freqüência Observada

(FO)

Freqüência Randômica*

(FE)

Amplificação** (FO/FE)

I(m)*** λ****

26 ANLHHPSTSSQL 1/52 9,93 x 10-14 1,97 x 1011 29,9 1,98 x 10-4

27 DQRMASTASFSS 1/52 1,89 x 10-15 1,03 x 1013 33,9 3,78 x 10-6

28 QYSTSSSLGISI 1/52 9,64 x 10-14 2,03 x 1011 30 1,92 x 10-4

29 NRYTTSHILSPV 1/52 7,58 x10-14 2,58 x 1011 30,2 1,51 x 10-4

30 GDKHSTSSFLIT 1/52 1,53 x 10-11 1,27 x 109 24,9 3,06 x 10-2

31 TSNSTASFSSPA 1/52 4,02 x 10-13 4,86 x 1010 28,5 8,05 x 10-4

32 MDMAQLSTSSNL 1/52 3,24 x 10-11 6,03 x 108 24,2 6,49 x 10-2

33 NYHHQIAYALLD 1/52 2,42 x 10-14 8,08 x 1011 31,4 4,85 x 10-5

34 TPYSMSSTASRL 1/52 3,98 x 10-16 4,92 x 1013 35,5 7,96 x 10-7

35 GYSFENSTSSPL 1/52 4,78 x 10-14 4,09 x 1011 30,7 9,57 x 10-5

36 KPLLASSTSSTL 1/52 1,15 x 10-13 1,69 x 1011 29,8 2,30 x 10-4

37 WALAPSTASFLS 1/52 5,73 x 10-14 3,42 x 1011 30,5 1,14 x 10-4

38 TLTYAPSTSSPL 1/52 1,78 x 10-15 1,09 x 1013 34 3,56 x 10-6

39 MYHNNTSSWLGV 1/52 2,59 x 10-13 7,55 x 1010 29 5,19 x 10-4

40 SPPEFSNSTASF 1/52 3,73 x 10-18 5,25 x 1015 40,1 7,46 x 10-9

41 MHISDMSTSSML 1/52 1,47 x 10-11 1,32 x 109 24,9 2,94 x 10-2

42 YTQNSTASFGPW 1/52 6,36 x 10-12 3,07 x 109 25,8 1,27 x 10-2

43 SPNTSSFTEADL 1/52 3,92 x 10-14 5,00 x 1011 30,9 7,84 x 10-5

44 FINHASSTSSSL 1/52 6,19 x 10-13 3,16 x 1010 28,1 1,23 x 10-3

45 LAPIGNSTTSFL 1/52 5,46 x 10-19 3,58 x 1016 42,1 1,09 x 10-9

46 EISKAFSTSSFH 1/52 7,56 x 10-13 2,59 x 1010 27,9 1,51 x 10-3

47 APNQFRSTASEL 1/52 1,76 x 10-14 1,11 x 1012 31,7 3,52 x 10-5

48 QNWTSSTSSFSQ 1/52 1,63 x 10-17 1,19 x 1015 38,7 3,27 x 10-8

49 LPTIPYSTASDL 1/52 4,38 x 10-15 4,46 x 1012 33,1 8,77 x 10-6

*Probabilidade de seqüência randômica = freqüência esperada na biblioteca (FE) **Amplificação = freqüência observada/freqüência esperada ***I(m) = grau de informação = -In (probabilidade de seqüência randômica) ****λ = número provável de clones independentes na biblioteca = complexidade x FE, onde complexidade da biblioteca (2,7 x 109 - Ph.D.-12).

Tabela 3 – Seqüências de aminoácidos dos clones selecionados, freqüência observada, freqüência esperada, amplificação dos peptídeos e grau de informação.

47

Motivo Alinhamento

YNSTASFSTPHL

STxS* HTMTSASTSSLL

QYAPSTNSYLLL

37 peptídeos

com este

motivo.

INPIHNSTASFT

FVPFASTSSNLA

VYANQASTASRL

HSTEAASTSSFA

FASDMRPSTSSF

FNSTSSLLTSSP

FNNTNSTSSFVS

ESAAPYSTNSFA

HLASSSTSSSLG

FNRLPYSTSSSL

ASQMVSTSSFND

MHMTHSSTASYL

SALNSTSSFSSH

MRAVSTSSFPAL

ANLHHPSTSSQL

DQRMASTASFSS

QYSTSSSLGISI

GDKHSTSSFLIT

TSNSTASFSSPA

MDMAQLSTSSNL

TPYSMSSTASRL

GYSFENSTSSPL

KPLLASSTSSTL

WALAPSTASFLS

TLTYAPSTSSPL

SPPEFSNSTASF

MHISDMSTSSML

YTQNSTASFGPW

FINHASSTSSSL

LAPIGNSTTSFL

EISKAFSTSSFH

APNQFRSTASEL

QNWTSSTSSFSQ

LPTIPYSTASDL

TSS

29 peptídeos

com este

motivo.

HTMTSASTSSLL

FVPFASTSSNLA

HSTEAASTSSFA

FASDMRPSTSSF

FNSTSSLLTSSP

NSTSSLLTSSP

FNNTNSTSSFVS

QWNTSSFAVYDP

HLASSSTSSSLG

FNRLPYSTSSSL

Tabela 4: Alinhamento linear das seqüências de aminoácidos dos peptídeos selecionados por

afinidade realizado pelo MOTIF 2.

48

*Letras em negrito denotam resíduos conservados.

A seqüência original da proteína MSP1a de A. marginale apresenta

cinco repetições de 28 a 29 aminoácidos na extremidade NH2-terminal da

molécula. Um domínio consenso STSSxL encontrado ao final de cada

repetição, que funciona como epítopo ativo reconhecido pelo anticorpo

monoclonal anti-MSP1a, foi identificado pela maior freqüência de aminoácidos

nos clones selecionados (Figura 10).

ASQMVSTSSFND

GTWNNTSSLLLN

SALNSTSSFSSH

MRAVSTSSFPAL

KLSLHNTSSVLT

ANLHHPSTSSQL

QYSTSSSLGISI

GDKHSTSSFLIT

MDMAQLSTSSNL

GYSFENSTSSPL

KPLLASSTSSTL

TLTYAPSTSSPL

MYHNNTSSWLGV

MHISDMSTSSML

SPNTSSFTEADL

FINHASSTSSSL

EISKAFSTSSFH

QNWTSSTSSFSQ

QNWTSSTSSFSQ

49

Figura 10 – Proteína MSP1a de Anaplasma marginale, com destaque para o domínio STSSxL dentro da

região repetitiva de 28-29 aminoácidos (rico em serina) que ocorre em cinco blocos repetidos.

Neste estudo, epítopos potenciais (miméticos ou com homologia

perfeita) são apresentados a partir de similaridades significativas entre os

peptídeos e a seqüência protéica da MSP1a. Foram identificadas similaridades

entre 46 dos 49 clones selecionados com a proteína de membrana MSP1a

(Figura 11). Dentre os 28 ou 29 aminoácidos da seqüência repetitiva da

proteína MSP1a, 14 aminoácidos foram identificados por alinhamento com a

sequência original, que provavelmente formam os resíduos críticos do epítopo

na molécula, caracterizados em negrito como a seguir:

DSSSASGQQQESSVSSQSEASTSSQLGA. Dentre os resíduos críticos, o

domínio mais freqüente entre todos os 46 clones foi o STSSxL, conforme

identificado pela análise de bioinformática.

(0-69) MSAEYVSTQSD|DSSSASGQQQESSVSSQSEASTSSQLGA|DSSSAGGQQQESSVSSQSDQASTSSQLGA| (70-681) DSSSAGGQQQESSVSSQSDQASTSSQLGA|DSSSAGGQQQESSVSSQSDQASTSSQLGA|DSSSAGGQQQE

SSVSSQSDQASTSSQLGT|DWRQEMRSKVASVEYMLAARALISVGVYAAQGEIARSRGCAPLRVAEVEEIV

KDGLVRSHFHDSGLSLGSIRLVLMQVGDKLGLQGLKIGEGYATYLAQAFADSVVVAADVQSSGACSASLDS

AIANVETSWSLHGGLVSKGFDRDTKVERGDLEAFVDFMFGGVSYNDGNASAARSVLETLAGHVDALGISYN

QLDKLDADTLYSVVSFSAGSAIDRGAVSDAADKFRVMMFGGAPAGQEKTAEPEHEAATPSASSVPSTVHGK

VVDAVDRAKEAAKQAYAGVRKRYVAKPSDTTTQLVVAITALLITAFAICACLEPRLIGASGPLIWGCLALV

ALLPLLGMAVHTAVSASSQKKAAGGAQRVAAQERSRELSRARQEDQQKLHVPAILTGLSVLVFIAAVVACI

AVDARRGTWQGSICFLAAFVLFAISAAVVMATRDQSLAEECDSKCATARTAQAVPGGQQQPRATEGVVSGG

GQEGGAGVPGTSVPSAESGAVPPATIMVSVDPQLVATLGAGVAQAAA

50

Figura 11 – Alinhamento dos 49 peptídeos recombinantes selecionados por Phage Display ao domínio

protéico STSSxL em seqüência parcial de dois motivos repetidos da proteína MSP1a (com 28 ou 29 aminoácidos) de Anaplasma marginale. No motivo consenso final, as letras em vermelho indicam todos os aminoácidos que foram alinhados com a seqüência original (em azul).

DSSSASGQQQESSVSSQSEASTSSQLGA (28 AA) DSSSAGGQQQESSVSSQSDQASTSSQLGA (29 AA) Clone 1 YNSTASFSTPHL Clone 2 HTMTSASTSSLL Clone 3 QYAPSTNSYLLL Clone 4 INPIHNSTASFT Clone 5 FVPFASTSSNLA Clone 6 VYANQASTASRL Clone 7 HSTEAASTSSFA Clone 8 FASDMRPSTSSF Clone 9 FNSTSSLLTSSP Clone 11 FNNTNSTSSFVS Clone 12 QWNTSSFAVYDP Clone 14 ESAAPYSTNSFA Clone 15 HLASSSTSSSLG Clone 16 FNRLPYSTSSSL Clone 17 NDRNSLNTTSFL Clone 18 ASQMVSTSSFND Clone 19 HVMSPHPQSTLL Clone 20 TPVNEAQNTASF Clone 21 GTWNNTSSLLLN Clone 22 MHMTHSSTASYL Clone 23 SALNSTSSFSSH Clone 24 MRAVSTSSFPAL Clone 25 KLSLHNTSSVLT Clone 26 ANLHHPSTSSQL Clone 27 DQRMASTASFSS Clone 28 QYSTSSSLGISI Clone 29 NRYTTSHILSPV Clone 30 GDKHSTSSFLIT Clone 31 TSNSTASFSSPA Clone 32 MDMAQLSTSSNL Clone 34 TPYSMSSTASRL Clone 35 GYSFENSTSSPL Clone 36 KPLLASSTSSTL Clone 37 WALAPSTASFLS Clone 38 TLTYAPSTSSPL Clone 39 MYHNNTSSWLGV Clone 40 SPPEFSNSTASF Clone 41 MHISDMSTSSML Clone 42 YTQNSTASFGPW Clone 43 SPNTSSFTEADL Clone 44 FINHASSTSSSL Clone 45 LAPIGNSTTSFL Clone 46 EISKAFSTSSFH Clone 47 APNQFRSTASEL Clone 48 QNWTSSTSSFSQ Clone 48 QNWTSSTSSFSQ Clone 49 LPTIPYSTASDL DSSSASGQQQESSVSSQSEASTSSQLGA (Homologia entre 14 resíduos entre os 28/29 aminoácidos da repetição peptídica) Clones Sem Alinhamento: Clone 10 LESRYFDVITPT Clone 13 LEYHQVTLRDVL Clone 33 NYHHQIAYALLD

51

Phage ELISA

Para confirmar a eficiência de seleção, os fagos foram submetidos a

ensaios de ELISA para quantificação da reatividade ao alvo. Para a

normalização da quantidade de partículas virais entre os clones a serem

testados, placas de microtitulação foram sensibilizadas com os anticorpos anti-

MSP1a e MSP2 na concentração de 1 µg por poço. Utilizou-se o fago selvagem

como controle negativo de reação (Figura 12).

Figura 12 – Placas de Elisa mostrando a reatividade dos clones contra o anticorpo anti-MSP1a.

A Figura 13 apresenta um gráfico representativo da reatividade dos

clones selecionados aos anticorpos anti-MSP1 e anti-MSP2, o cutoff foi

calculado somando-se a média das leituras das réplicas do fago selvagem

(controle negativo) mais duas vezes o desvio padrão. Observa-se que apenas

os clones 6, 16, 26 e 40 não apresentaram razões dos índices ELISA maiores

que 1, ou seja, não foram significativos; enquanto que os outros 45 peptídeos

apresentaram IE maior que 1,0, inclusive para os três clones que não foram

alinhados na seqüência da proteína MSP1a.

52

Figura 13 – Gráfico representativo das leituras a 492nm do ensaio de ELISA mostrando a reatividade dos clones de fagos capturados por anticorpo anti-

MSP1 e anti-MSP2 para Anaplasma marginale.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

Clones

Índ

ece

EL

ISA

MSP1 MSP2

53

DISCUSSÃO

Este trabalho se propôs identificar peptídeos ligantes a anticorpos

monoclonais reativos a proteínas de Anaplasma marginale a partir de bibliotecas

de peptídeos recombinantes por meio da tecnologia Phage Display. Foram

identificados peptídeos, os quais apresentaram homologias significativas com

seqüências da proteína MSP1a. A seleção dos fagos ligantes aos anticorpos anti-

MSP1 e anti-MSP2 foi realizada com uma biblioteca de peptídeos expressos em

fagos M13 com 12 resíduos randômicos.

Durante os ciclos de seleção houve um enriquecimento do número de

fagos, já esperado pelo fato de que, a cada ciclo, clones/fagos com determinadas

seqüências foram retidos para subseqüente eluição e amplificação no ciclo

seguinte (Tabela 1). Os títulos dos fagos na entrada do biopanning foram sempre

maiores que os títulos de saída, pois os fagos com maior afinidade aos anticorpos

imobilizados na placa ficam ligados a estes pela interação com o parátopo, e o

restante dos fagos com baixa ou sem afinidade aos anticorpos são lavados

(removidos). Fagos com baixa afinidade pelos anticorpos podem ficar aderidos

diretamente à placa, não interagindo com os anticorpos, ou ainda permanecerem

suspensos na solução (não ligados), assim após as sucessivas lavagens muitos

destes fagos não específicos são excluídos (FRESCHI, 2006). Isto leva a redução

nos títulos após as etapas do biopanning. Os títulos do 1º, 2º e 3º ciclos de

seleção (1,7 x 103, 2,1 x 104, 3,8 x 104) evidenciam a ocorrência de uma seleção

específica dos fagos.

Após a avaliação preliminar dos clones e sequenciamento, foi constatada a

ausência de cisteína, e o aminoácido arginina apresentou-se com uma freqüência

abaixo da freqüência esperada na biblioteca original (Tabela 2) Sabe-se que os

aminoácidos arginina e cisteína nas seqüências de peptídeos randômicos atuam

na secreção da Proteína III e podem interferir na infectividade dos fagos.

Conseqüentemente, clones com peptídeos contendo estes aminoácidos podem

ser menos freqüentes durante a seleção. (NOREN, 2001).

A proteína MSP1a é codificada por um único gene (MSP1a), porém possui

marcante variação de tamanho entre os diferentes isolados de A. marginale (46 a

54

105 kDa), como verificado em isolados brasileiros desta rickettsia (KANO et al.,

2002, OLIVEIRA et al., 2003). Isso resulta da presença de um número variável de

blocos repetitivos de 28 a 29 aminoácidos, ricos em serina, na região amino (N)

terminal (OBERLE et al. 1988, ALLRED et al., 1990). Essa região contém um

epítopo sensível à neutralização conservado entre os isolados (ALLRED et al.

1990), incluindo brasileiros (KANO et al. 2002, OLIVEIRA et al. 2003).

O fato das bibliotecas serem de peptídeos randômicos permite que vários

clones possam compartilhar os mesmos motivos, mas com resíduos em posições

diferentes do peptídeo, fazendo com que certos aminoácidos sejam mais

freqüentes após a seleção e sequenciamento. Assim, a alta freqüência desses

aminoácidos nas referidas posições do peptídeo recombinante, pode indicar um

provável motivo não apresentado nos clones selecionados, mas descoberto pela

combinação de várias seqüências (SANTOS, 2006).

A presença dos motivos protéicos pode ser relacionada com a seleção a

favor do ligante, pela indicação de que estes aminoácidos poderiam ser cruciais

para o reconhecimento dos peptídeos pelo parátopo (CORTESE et al.,1995). Os

motivos STxS e TSS são constituídos por peptídeos representados mais de uma

vez e também representados em 78% e 59% dos fagos seqüenciados. Os

aminoácidos presentes no motivo (S e T) foram acima da freqüência esperada

quando comparados na tabela 2 e figura 8, especialmente para a serina,

apresentando freqüência superior frente a treonina, e estando presente nos 2

grupos de seqüências consenso. Além disso, os aminoácidos serina e treonina,

por serem altamente hidrofílicos indicam estar constituídos em epítopos ou

mimetopos selecionados (MANOUTCHARIAN et al., 1999).

Quando se considera apenas as posições dos aminoácidos mais

freqüentes (>35%), o motivo consenso é o STSSxL, exatamente a seqüência

encontrada na molécula original da MSP1a, com cinco repetições (Figura 11).

Quando se considera o motivo consenso STSSxL e sua variação, STASxL,

os clones 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 41, 44, 48 e 49 foram os que apresentaram

os maiores índices ELISAs, exceto para o clone 16, que apresentou índice abaixo

de 1 (não significativo), provavelmente devido ao efeito dos aminoácidos

adjacentes ao motivo protéico na extremidade anterior (N-terminal), uma vez que

a maioria dos clones apresentou o domínio na porção COOH-terminal.

55

A seqüência repetitiva DSSSASGQQQESSVSSQSEASTSSQLGA

apresentou 14 aminoácidos (em negrito) críticos que formam o epítopo da

molécula MSP1a. Dentre os resíduos críticos alinhados nos 49 clones

selecionados, o domínio mais freqüente, STSSxL, foi observado em 23 clones,

semelhante ao descrito para o epítopo B, EASTS(S/Q)ASTSS, sensível à

neutralização (PALMER et al, 1987; ALLRED et al. 1990). Nesta investigação os

resíduos EASTSS foram identificados corretamente pelo alinhamento dos clones

com a sequência repetitiva, mas nenhum clone apresentou a identidade perfeita,

sendo que apenas quatro clones apresentaram o motivo ASTSS ou QASTxS. É

importante enfatizar que, diferentemente do apresentado na literatura, o domínio

mais freqüente e mais reativo, conforme os resultados sorológicos, foi o STSSxL.

Diante do reconhecimento de novos domínios dentro da seqüência repetitiva, e da

alta freqüência do domínio STSSxL, sugere-se que o epítopo desta proteína seja

mais complexo e maior do aquele publicado, e que maior avidez e afinidade de

peptídeos deve-se levar em conta o novo domínio aqui definido.

No ensaio de ELISA foram testadas a reatividade dos 49 clones

selecionados contra os anticorpos anti-MSP1 e anti-MSP2 separados. Não houve

reatividade contra o anticorpo anti-MSP2, provavelmente devido à competição

com o anticorpo imunodominante anti-MSP1a que também possui alta avidez pelo

domínio repetitivo da molécula. Contudo, é possível ter ocorrido problemas na

viabilidade do anticorpo anti-MSP2, uma vez que este não fora testado contra

soros positivos. Já o teste com os clones contra o anticorpo anti-MSP1, somente

os clones 6, 16, 26 e 40 apresentaram razões dos índices ELISA menores que 1,

ou seja, não foram significativos; enquanto que os outros 45 peptídeos

apresentaram IE maior que 1,0, o que pode evidenciar a imunorreatividade

específica a proteína MSP1a do Anaplasma marginale. Tais resultados podem ser

justificados pelo fato das proteínas MSP1a, MSP4 e MSP5 serem codificadas por

um único gene não variando antigenicamente durante a multiplicação da rickettsia

(VISSER et al, 1992; BOWIE et al, 2002; MOLAD et al, 2004). A conservação

destas proteínas é importante para definir os epítopos comuns e específicos que

podem ser usados para o desenvolvimento de testes sorodiagnósticos e vacinas

para anaplasmose (BARBET et al, 1999; KANO et al, 2002). Já as proteínas

MSP1b, MSP2 e MSP3 são codificadas por famílias multigênicas e podem variar

56

antigenicamente durante os ciclos de rickettsemia persistentes (ALLEMAN &

BARBET, 1996; FRENCH et al, 1999; BOWIE et al., 2002) inclusive em isolados

brasileiros (KANO et al, 2002).

A originalidade deste trabalho foi realizar uma seleção específica de

peptídeos recombinantes por phage display contra o anticorpo monoclonal anti-

MSP1a de Anaplasma marginale, identificando prováveis peptídeos

recombinantes miméticos com potencial uso em diagnósticos e em vacinas.

Estudos adicionais sobre a especificidade e a sensibilidade dos peptídeos

obtidos neste estudo estão sendo realizados. Desta forma, testes preliminares de

imunizações com os peptídeos fusionados nos fagos são imprescindíveis para a

determinação da produção de resposta imune cruzada dos peptídeos contra as

proteínas do Anaplasma marginale para a obtenção de peptídeos candidatos a

vacinas.

57

CONCLUSÃO

A análise de peptídeos ligantes à anticorpos monoclonais reativos a

proteínas de Anaplasma marginale selecionados a partir de bibliotecas de

peptídeos recombinantes por Phage Display revelaram que:

• Não foi possível obter e, portanto selecionar clones contra o anticorpo anti-

MSP2, provalvelmente por problemas de viabilidade do anticorpo ou por

competição com o anti-MSP1a, que provavelmente apresentou maior avidez e

afinidade durante a seleção.

• Os peptídeos obtidos contra o anticorpo monoclonal anti-MSP1a

apresentaram alinhamentos significativos com a proteína de Anaplasma

marginale e foram altamente reativos contra o anticorpo, sendo caracterizado

como domínio principal a seqüência STSSxL.

• Definiu-se, por meio de alinhamentos e reatividade nos ensaios ELISA,

novos resíduos críticos dentro da seqüência repetitiva da proteína MSP-1a, que

provavavelmente compõem o epítopo reativo, com a seqüência caracterizada

parcialmente em negrito como: DSSSASGQQQESSVSSQSEASTSSQLGA.

• Embora estudos adicionais sejam necessários para determinar a

efetividade dos peptídeos obtidos, os resultados poderiam colaborar na definição

de seqüências antigênicas que mimetizam epítopos naturais do Anaplasma

marginale.

58

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