seminario de histología 1ua de histología, embriología ... · seminario de histología 1ua de...
TRANSCRIPT
Seminario de Histología1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética
Microscopía
¿Qué es la histología?
• Objeto de estudio
• Instrumento
• Metodología
Unidades de medida que se utilizarán en el curso:
1 mm = 1000 µm ( µm : micrómetro)1 µm = 1000 nm ( nm : nanómetro)1nm = 10 Å ( Å : Angstrom )
Luz blanca
➢Ondas electromagnéticas
➢Distintas longitudes de onda
➢Se desvía en su trayecto al pasar por medios de distinto índice de refracción
➢ Al pasar por compuestos coloreados son absorbidos determinados rayos
El microscopio óptico se basa en la utilización de la luz visible
NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA MATERIA
Microfotografía electrónica de un soma neuronal, 15.000X
NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA MATERIAAnatómico
Tisular
Subcelular
Tisular Celular
Microscopios
Mucosa olfatoria humana
H y E x 540
Ganglio linfático,
corteza profunda, H y E
x 400.
Microscopía óptica y electrónica
PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
Microscopio trinocular, con cámara de video/fotográfica
Indice de refracción (IR) de un medio:
Relación entre la velocidad de la luz en un determinado medio EJ : vidrio) y la velocidad de la luz en el vacío.
AIRE
VIDRIO
REFRACCIÓN A TRAVÉS DE UNA LÁMINA DE VIDRIO DE CARAS PARALELAS
VIDRIO
AIRE
REFRACCIÓN A TRAVÉS DE UNA LENTE BICONVEXA
Marcha de rayos
Punto focalobjeto
Lente biconvexa
Punto focal
Imagen
Distancia Focal
objeto
Centro de la lente
Lado de la lente donde se ubica el objeto
Lado de la lente donde se forma la imagen
Eje óptico
Formación de la imagen en el microscopio
Imagen resultante: mayor, virtual e invertida
Hepatocitos observados con el MO. Técnica de H&E.
Epitelio intestinal observado con el MO. Técnica de coloración H&E.
LÍmite de resolución
Poder de resolución
Aumento
CONCEPTOS IMPORTANTES
Límite de Resolución
Mínima Distancia que debe existir entre 2 puntos para servistos como separados
Poder Resolutivo
Capacidad de un Sistema Óptico para ver Detalles
LR OJO 0.25 mm
LR MO 0.25 um
LR ME 0.2 nm
LR < PR
LÍMITE DE RESOLUCIÓN
λ . 0.61
LR = -----------------------------
AN
( n . Sen α )
LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ
APERTURA NUMÉRICA
Indice de Refracciòn del Medio
Semiangulo de Incidencia de la luz
0.61 X λn x senαLR =
¿Cómo se puede mejorar el Poder Resolutivo del MO?Se logra un mayor PR si se obtiene un menor LR. Para ello:
1) λ : Utilizando filtro azul
se aproxima λ
a los 400 nm
Este rayo no contribuyea formar la imagen
Objetivo
Objetivo
α
2) n
Utilizando aceite de inmersión n =1.52
El rayo entra dentro de la lente objetivo y contribuye en la formación de la imagen
Aire n=1
α
α
Objetivo
Preparado
α
SEMIÁNGULO DE INCIDENCIA
λ . 0.61
LR = -----------------------------
AN
( n . Sen α )
BLANCA 500 nm
AZUL 400 nm
UV 200 nm
AIRE n=1
H2O n= 1.33
ACEITE n=1.52
Este rayo no contribuye
a formar la imagen
Objetivo
Objetivo
α
Aceite de inmersión n =1.52
El rayo entra dentro de la lente
objetivo y contribuye en la formación
de la imagen
Aire n=1
α
α
Cálculo del aumento
• El aumento o magnificación se obtiene multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular.
• Ejemplos:
• Ocular y objetivo seco débil.: 10X multiplico por 10X= 100X.
• Ocular y objetivo seco fuerte: 10X multiplico por 40X= 400X.
• Ocular y objetivo de inmersión: 10X multiplico por 100X= 1000X.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS
Tipos de microscopios ópticos según iluminación: Fundamentos y utilidades
• Campo claro Campo oscuro
• Luz polarizada
• Contraste de fase
• Contraste diferencial de interferencia
• Epifluorescencia
• Confocal
• Por excitación de dos fotones
Microscopio de campo oscuro• Se ilumina el objeto de forma oblicua usando un condensador especial. Sólo la
luz que impacta oblicuamente al objeto entra al objetivo.
• Empleo de objetivos de baja AN (<1.1)
Borrelia
Cultivo celular
-El objeto se ve brillante sobre fondo oscuro.
-Se ven contornos o bordes, no la estructura interna.
-Se ven objetos que con campo claro no se ven por falta de contraste.
-Pueden distinguirse, aunque no resolverse, estructuras que no se distinguen con el MO de campo claro.
-Pueden visualizarse células vivas.
Microscopio de contraste de fase
Convierte la diferencia de fase en diferencia de intensidad
Diafragma anular y placa de fase en el objetivo (anillo transparente).
Imagen intermedia formada por interferencia de todos los rayos
Ventaja: estudio de células vivas. Permite estudios dinámicos.
Microscopio de contraste de fase
Fibroblasto en cultivo
Campo claro Contraste de fase
Interferencia diferencial Campo oscuro
Microscopio de luz polarizada
Luz polarizada
Polarizador y analizador
Prismas de espato de Islandia o Nicol, Discos polaroid- Cuerpos isotrópicos o monorrefringentes- Cuerpos anisótropos o birrefringentes
rayo ordinariorayo extraordinario (polarizado)
Cristales de imidazolato observados con microspio de luz polarizada
Microscopio de interferencia diferencial (DIC)
- Se hacen visibles las diferencias de velocidad que sufren los rayos luminosos al atravesar un objetotransparente (diferencias de fase) : como diferencias de intensidad o de coloración.
- Aspecto de relieve.
- Utiliza luz blanca polarizada.
- Ventajas: las del microscopio de contraste de fase y se puedecuantificar el espesor del corte y cambios en el índice de refracción
Propiedades de la fluorescencia
Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga.
Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro.
La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.
Microscopio de epifluorescencia
Microscopio de epifluorescencia
Inmunofluorescencia con fluorocromos de distintos colores
Mitosis: marcación de microtúbulos, cromosomas y filamentos de actinaCélulas marcadas con distintos anticuerpos
Microscopio confocal (invertido)
Permite observar una célula o tejido vivo en diferentes planos focales.
Se observa el plano que está situado en el punto de foco del sistema óptico eliminando, de forma óptica a través de un diafragma o "pinhole", la luz proveniente de los planos que están fuera de foco.
Visión tridimensional del elemento estudiado
Microscopio de epifluorescencia Microscopio confocal
Microscopio por excitación de dos fotones
Microscopia Electrónica
Microscopio electrónico de transmisión del Instituto de Biología Celular y Neurociencias Prof E. De Robertis. 1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética.
Microscopio electrónico de transmisión vs. microscopio óptico
Lente objetivo
Lente ocular
Diafragma
Fuente
Microfotografía electrónica de un hepatocitonúcleonucleoloREGmitocondiasUltraestructura: Microscopía electrónica
Microscopio electrónico de barrido
Macrófago activadoEspermatozoides sobre membrana pelúcida
(coloración agregada)
Glomérulo RenalMicroscopio de campo claro
Microscopio confocal
Microscopio electrónico de Transmisión Microscopio electrónico de Barrido