(sequencing based...
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DNAタイピング結果解析
SBT(Sanger,NGS)法(Sequencing Based Typing)
HLA研究所⼩島 裕⼈
HP掲載⽤
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NGS(Next Generation Sequencing) 2 施設Sanger法 6 施設
参加施設数
検査方法NGS
Sanger法
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Sanger法
NGS検査対象領域
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施設結果報告(Sanger法)
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施設結果報告(Sanger法)
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施設結果報告(NGS)
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施設結果報告(NGS)
※ NGS は2施設、別法のため評価せず。
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結果相違の原因(Sanger法)
1. Ambiguityの見落とし2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定3. Codon 86 のAmbiguity4. 表記ミス5. 第3区域のAmbiguity 判定ミス
1. 最新アリル抜け2. Forward, Reverse の片方で判定(領域の端)3. 新規アリル
【要改善】 → 必ず対策が必要
【要確認】 → できれば対策が必要
【その他】
1. 検査対象領域外のAmbiguity
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【要改善】 1. Ambiguityの見落とし
A*24:03 抜け
A*24:03, A*24:07 抜け
【対策】 ダブルチェックなど
H2901: A座
区別できない
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【要改善】 1. Ambiguityの見落とし
【対策】 ダブルチェックなど
H2903: C座
C*06:04 抜け
区別できない
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【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定
2施設(29D24, 29D61)で、挿入/欠失多型を区別できていなかった。
例) H2901の場合: C座, DQB1座
C*12:84N ・・・ C*12:02に対して1塩基挿入DQB1*03:197Q ・・・ DQB1*03:01 に対して6塩基欠失
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【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定
H2902, H2903, H2904 において区別できていない挿入/欠失多型は次のとおり。
H2902: A座, B座, C座, DQB1座
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【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定
H2903: A座, B座
H2904: A座, DRB1座
これらの施設は、解析ソフト「uTYPE」であったが、同じく「uTYPE」を用いている他の2施設では、挿入/欠失多型を区別できていた。 → 設定の問題?
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【対策】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定 (uTYPE)
0*が付いているときはその上でダブルクリックすると…
コメントがでてくる。確認後“はい”をクリックするとNull Alleleが候補から外れます。
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【要改善】 3. Codon 86 のAmbiguity
H2901 DRB1座
2施設(29D24, 29D61)で、Codon 86 のAmbiguity を区別できていなかった。
区別できる
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【要改善】 3. Codon 86 のAmbiguity H2904 DRB1座
Codon 86 primer を使用しているが、区別できていない。→ 解析ソフト設定の問題?
区別できる
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【対策】 3. Codon 86 のAmbiguity (uTYPE)
ここを選ぶとCodon86を適応した解析結果が表れる
Codon 86 primer 使用の場合は、Filter ボタンを押すことで反映される。
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Codon 86 プライマー: Codon 86 GTG相補的プライマー
H2902
GKK GGT
H2901
増幅しない。
Codon 67 Codon 86 Codon 86
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【補足】 Codon 86 Ambiguity の重要性について
なぜ、Ambiguityが起きるのか?
→ 遺伝子が似ている組み合わせを区別できない。
Allele 1Allele 2
Allele 3Allele 4
多型部分の判定結果
(Allele1 とAllele3)、(Allele2 とAllele4)の配列が似ている。
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同一抗原内アリル多型は、配列が類似している。
(日本人頻度0.1%以上のDR座アリルを対象)
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1アミノ酸(1コドン)が異なる組み合わせ
日本人頻度0.1%以上では、codon 86 が異なる組み合わせのみが、複数(4種類)存在する。
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Allele 1Allele 2
Allele 3Allele 4
多型部分の判定結果
Allele 1Allele 3
Allele 2Allele 4
1箇所のみが異なる組み合わせが、2種類以上
日本人頻度0.1%以上では、codon 86のみ
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【参考】 なぜ、codon 86 のみが異なる多型が多いか。
<HLA-ClassⅡ分子を上からみた図>
86番アミノ酸抗原ペプチド
86番目のアミノ酸位置は、T細胞認識に重要な部分であると考えられている。
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【要改善】 4. 表記ミス
H2901 B座
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【要改善】 4. 表記ミス
H2902 DPB1座
H2904 DPB1座
【対策】 ダブルチェックなど
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【要改善】 5. 第3区域のAmbiguity 判定ミス
H2901 DRB1座 (できれば区別)
H2903 DRB1座
区別できない!
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【要確認】 1. 最新アリル抜け
例) H2901の場合: DRB1座
(IMGT登録)バージョン 3.27, 2017/01/20
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【要確認】 1. 最新アリル抜け
H2902: A座, C座, DRB1座
H2902, H2903, H2904 における最新アリルは次のとおり。
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【要確認】 1. 最新アリル抜け
H2903: A座, DRB1座, DQB1座
(H2904: なし)
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【要確認】 2. Forward, Reverse の片方で判定(領域の端)
H2901 DRB1座
H2902 DRB1座
H2904 DRB1座
片方のプライマーからの情報では確定しない施設があった。
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【要確認】 3. 新規アリル
H2904 DQB1座
Sanger法では確定することは困難。場合によっては、クローニングや他法(SSP法、NGS)によって確認する必要もある。
※undefined (29D61)DQB1*05:03/06:01 493(C>T), DQB1*05:09/06:56 MM0(exon3 未登録) 補足
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補足 Exon 3 が未登録のアリル候補について(uTYPE)
H2904 DQ座Codon 133(変異部分)
Exon 3 未登録のアリルは、赤塗で表示され、候補に含まれる。
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【その他】 1. 検査対象領域外のAmbiguity
H2902 DRB1座
H2903 DPB1座
検査対象領域によって、Ambiguity が異なっていた。
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まとめ
NGSは、2施設でキットが異なり、施設間評価は
できなかった。
Sanger法は、各施設に技術的問題は考えられず、
判定時のミスに注意をする必要がある。他法よりも正確な
データが得られる一方で、多くの情報量を判断に用いるこ
とが多いため、ソフトウェアの使用方法やcodon 86 にみ
られるようなHLAの特徴を知っておくとよい。