Pomen encimov in encimskih reakcij v biotehnologiji in

medicini; spreminjanje molekul, biosinteza zdravil.

Sintezna in biološka zdravila

asist. dr. Katja Kristan

Vsebina

• Zdravilo

• Sintezna zdravila

– Racionalno načrtovanje

– Rešetanje visokih zmogljivosti

– Virtualno rešetanje

– Mimetiki

– Naključja, klinična opažanja

• Biološka zdravila

Vir: Statistični urad RS

Slovenija: 15,7 milijonov receptov (2009)

Zdravilo Zdravilo = zdravilna učinkovina + pomožne snovi

Kako učinkovina deluje?

1. Veže se na encim in prepreči njegovo delovanje

(INHIBITORJI)

2. Veže se na receptor in sproži isti biološki odziv kot

endogena molekula (AGONISTI)

3. Veže se na receptor in ne sproži biološkega odziva

(ANTAGONISTI)

4. Sama učinkovina je protein.

Bolezen

Identifikacija in validacija

biološke tarče (2-5 let) Razvoj metod ter

odkritje „zadetkov“

(„hit discovery“)

Pot do novega zdravila

Spojina vodnica

in optimizacija do

končne spojine –

učinkovine (2-5 let)

Predklinične študije

(varnost, toksičnost,

biološka aktivnost) 1-3 leta

Klinične študije

(zdravi prostovoljci, bolniki)

2-10 let

Razvoj

formulacije

(zdravila)

Regulatorni

postopki,

odobritev zdravila

(FDA, posamezne

države, EMEA (2-3

leta))

1. „Racionalno“ načrtovanje

Vir naravne spojine

- listi koke (Erythroxylon coca) 16.st., 1856 izolacija

kokaina (lokalni anestetik)

- kininovec (Cinchona succirubra) (kinin) 17.stoletje

- skorja vrbe (Salix) 1899 acetilsalicilna kislina

- vrtni mak (Papaver somniferum) 16.st., 1804 izolacija

morfina iz opija (analgetik)

- volčja češnja (Atropa Belladonna)

Egipčani, Rimljani, 1831 izolacija

atropina (očesno ozadje)

- Kitajska medicina

- Itd.

1. „Racionalno“ načrtovanje

Načrtovanje na osnovi znane strukture (endogenega) liganda.

morfin fenazocin, 4x močnejši,

ni odvisnosti,

halucinogen

nalorfin

Brez učinka, brez stranskih

učinkov – za predoziranje

morfina in heroina.

metadon

2x močnejši, manj

stranskih učinkov

levorfanol

(5x močnejši)

Opoidni

analgetiki

Str. učinki:

evforija,

pomiritev,

depresija

dihanja,

zaprtje,

odvisnost,

toleranca

heroin

N

OH

Me

Me

OMe

tramadol

srednje močni analgetik

2. Rešetanje visokih zmogljivosti (high-throughput screening (HTS))

• „Screening“ = rešetanje = naključno testiranje (v 90-ih)

• Robotsko podprto iskanje novih spojin vodnic

• Pogoj: zadostna količina

proteina (tarče) in knjižnica

spojin

• Robot z biokemijskimi

metodami preveri aktivnost

spojin na določeni tarči

LabAutoPedia: Automated Storage and Retrieval Systems

2. Rešetanje visokih zmogljivosti

HTS ni prinesel željenih rezultatov (spojine predvsem niso

imele ugodnih lastnosti – absorpcija, distribucija, metabolizem,

eliminacija).

Lipinski je raziskal, katere lastnosti definirajo zdravilne

učinkovine (l. 1997).

S sodelavci je analiziral več kot 2000 znanih učinkovin.

S pomočjo rezultatov so sestavili preprosta pravila, ki veljajo

za večino učinkovin (MW, topnost v vodi in lipidih, št. H-vezi, itd).

3. Virtualno rešetanje

Nadomestek visoko zmogljivega rešetanja.

Zakaj ga sploh potrebujemo?

Knjižnica spojin farmacevtskega podjetja

lahko vsebuje tudi nekaj milijonov spojin,

sam HTS je drag in časovno zahteven.

Računsko nezahtevno (1000000 spojin v nekaj urah na

povprečnem računalniku)

Omogoča pripravo boljših knjižnic spojin za HTS (obogatitev

knjižnic).

S pomočjo virtualnega rešetanja izločimo spojine, ki skoraj

gotovo niso aktivne.

Rezultat je knjižnica spojin skrčena iz nekaj milijonov na nekaj

1000 spojin, katere lahko potem testiramo v laboratoriju.

3. Virtualno rešetanje

Več oblik:

Filtriranje s pomočjo

osnovnih deskriptorjev (MW, topnost v vodi in lipidih,

ploščina polarne površine,...)

2D rešetanje na osnovi

podobnosti

3D rešetanje na osnovi

podobnosti

Strukturno podprto

virtualno rešetanje

(sidranje)

2D in 3D rešetanje na osnovi podobnosti liganda

Glavni namen – najti spojine, ki so podobe izhodni

spojini ob predpostavki, da imajo spojine s podobno

strukturo podobno aktivnost

Izhodna spojina (predloga): inhibitor, substrat,

agonist, antagonist

Uporabimo, če ni znana struktura tarče na katero

deluje spojina oz. če hočemo dodatno obogatiti

knjižnico za HTS

Strukturno podprto virtualno rešetanje – sidranje (docking)

Glavni pogoj: znana 3D struktura tarče

Tarča: biološka molekula, ki je udeležena

pri nekem patološkem procesu (encim,

receptor, DNA, …)

Poleg 3D strukture tarče, moramo tudi

vedeti, kje na tarči je aktivno mesto

(programu moramo običajno povedati, kje

je aktivno mesto)

3D strukturo dobimo s pomočjo rentgenske kristalografije,

NMR ali homolognega modeliranja.

Večina znanstvenikov jih objavi v Protein Data Bank:

www.pdb.org

Sidranje Ko program postavi spojino v aktivno

mesto, cenilna funkcija oceni vezavno

energijo glede na različne prispevke

(Van der Waalsove interakcije, H-vezi, Elektrostatske interakcije, itd)

Program rangira spojine od tiste, ki ima najboljšo izračunano

vezavno energijo, do tiste, ki ima najslabšo.

Samo najboljše spojine nato potestiramo še in vitro, ne vseh iz

knjižnice.

Prednosti: cena, čas.

Slabosti: Programi delajo napake in slabo predvidijo vezavo oz.

ocenijo vezavno energijo.

Glavni namen sidranja je, da dobimo obogateno knjižnico,

nikakor pa ne moremo pričakovati, da bodo vse spojine aktivne

tudi in vitro

Povzetek

4. Mimetiki

Mimetik (Slovenski medicinski slovar):

- kar vzpodbuja kako funkcijo in pri tem

posnema naravno (agonistično) snov

Peptidomimetik:

- spojina, ki posnema strukturo peptida in

izzove enak biološki odziv kot peptid

Teprotid

- brazilski gad (Bothrops jararaca)

- 1970 več peptidov izoliranih iz

kačjega strupa

- nanopeptid teprotid zniža krvni

tlak

H2N–Glu–Trp–Pro–Arg–Pro–Gln–Ile–Pro–Pro–COOH

1973: znan mehanizem delovanja:

Angiotenzin I (dekapeptid)

Angiotenzin II (oktapeptid)

(zoži žile, poviša se krvni tlak)

angiotenzin-konvertaza

Teprotid se veže na

angiotenzin-konvertazo

in inhibira delovanje

encima!

Načrt:

1. Najprej so postopoma skrajševali nanopeptid.

2. Dobili so aktivni dipeptid Pro-Pro (spojina vodnica).

3. Naredili so spojine, ki so dipeptidu strukturno podobne, NISO pa

peptidi.

Rezultat: ACE-inhibitorji za znižanje povišanega krvnega tlaka (ACE: angiotensin converting enzyme)

enalapril

Glikomimetiki

- posnemajo strukturo sladkornega skeleta.

Primer: - inhibitorji glikozidaz v črevesju

- oseltamivir (Tamiflu)

Mimetiki nukleotidov/nukleinskih kislin

- posnemajo nukleotide in zavirajo sintezo nukleinske kisline

Primeri: inhibitorji DNA-polimeraze, reverzne transkriptaze

5. Naključja, klinična opažanja

Okritje penicilina

• Fleming je opazil inhibicijo bakterijske rasti (Staphylococcus)

na mestu, kjer je bila petrijevka kontaminirana z plesnijo

(Penicillium notatum) (1928).

• Penicilin – beta-laktamski antibiotik (mimetik dipeptida D-Ala-

D-Ala)

Sildenafil

• Sildenafil razvit za zdravljenje hipertenzije in angine pektoris.

• Klinična študija je pokazala nizko aktivnost za zdravljenje

angine pektoris.

• Prostovoljci poročajo o stranskem učinku – povečani erektilni

funkciji.

• FDA izda dovoljenje za uporabo sildenafila za zdravljenje

erektilne disfunkcije (1998)

• Inhibitor cGMP-fosfodiesteraze tip 5

• Zdravilo

• Sintezna zdravila

– Racionalno načrtovanje

– Rešetanje visokih zmogljivosti

– Virtualno rešetanje

– Peptidomimetiki

– Naključja, klinična opažanja

• Biološka zdravila

II. Biološka zdravila

Pod izraz “Biološka zdravila” lahko uvrščamo:

1. Zdravila, pridobljena z izolacijo iz rastlin ali živali (alkaloidi, flavonoidi, kri in krvni proizvodi, živalski in človeški hormoni, antibiotiki, steroidi, cepiva)

2. Biološka zdravila, pridobljena s sintezo: sintezni peptidi (kalcitonin, oksitocin, vazopresin, itd)

3. Rekombinantna biološka zdravila (biotehnološka zdravila):

rekombinantni proteini, rekombinantna monoklonska protitelesa (končnica mab) in rekombinantna cepiva

4. Genske učinkovine: terapevtski geni, vstavljeni v vektor za vnos v organizem s pomočjo virusnega ali nevirusnega vnosa

Preširok pojem??

Rekombinacija:

- Vključevanje delov DNA ali genov enega organizma v genom

drugega organizma.

- Produkt vstavljenega gena je rekombinantni protein.

„GloFish“ – v genom je vstavljen

gen za fluorescentne proteine. Plazmid = krožna ali linearna dvovijačna DNA

Rekombinantna biološka zdravila (biotehnološka zdravila)

Večino sodobnih bioloških zdravil uvrščamo med rekombinantna

biološka zdravila, ki jim pravimo tudi biotehnološka zdravila.

Sem sodijo:

rekombinantna monklonska protitelesa (infliksimab

(zdravljenje revmatidni artritis), rituksimab (zdravljenje

limfoma), ...)

rekombinantne učinkovine (inzulin, epoetini, filgrastim,

somatropin, ...)

rekombinantna cepiva (hepatitis B)

protitelesa

rastni hormon

protitelesa

dejavnik rasti

granulocitne vrste

protitelesa

epoetini

interferoni

Celica (bakterijska, kvasovke, sesalska) in vektor (plazmid)

+

Celična linija

Transfekcija Celična kultura Filtracija, čiščenje

Učinkovina v mediju

Učinkovina Zdravilo

Formulacija/polnjenje

Razvoj celične linije in izbira ustreznega rastnega

medija za rast celic

Rast v bioreaktorju

(5-10 litrov; 100-200

litrov;

2500 litrov)

Čiščenje

Preverjanje ustreznosti produkta

Prizvodnja rekombinantnih zdravil

FILGRASTIM ERITROPOETIN

Št aminokislin 175 193

MW 18,6 kD 18,5 kD

glikozilacija ne 1x O-glikozilacija

3x N-glikozilacija

Celice E. coli CHO

E. Coli – (Escherichia coli) gram negativne enterobakterije

CHO – (Chinese Hamster Ovary) ovarijske celice kitajskega hrčka

Ostale celice oz celične linije:

- Drosophila S2: celice vinske mušice

- S. cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae): kvasovka

- BHK (Baby Hamster Kidney): ledvične celice hrčkovega mladiča

- Sp2/0 (mouse mieloma cell line): mišje mielomske celice

Preveri se: koncentracija, agregati, razgradni produkti, pravilno

zvitje, glikanska analiza, mikrobiološka kontrola, bakterijski

edotoksini, virusi, nukleinske kisline, ...

Metode: CD (cirkularni dihroizem), NMR (nuklearna magnetna

resonanca), X-žarkovna analiza, SDS-PAGE (SDS-

poliakrilamidna elektroforeza), glikansko mapiranje, Western blot

analiza, ELISA (encimski imunski test), masna spektrometrija, itd.

Določitev strukture in čistote bioloških molekul

Imunogenost

Biološka zdravila so proteini ali glikoproteini in lahko v organizmu

izzovejo imunski odgovor (tudi do 40 % ljudi ima protitelesa proti

posameznim rekombinantnim proteinom).

• Je hormon, glikoprotein.

• Sladkorne komponente podaljšajo njegovo delovanje, niso ključne za aktivnost.

Primer: eritropoetin (EPO)

N-glikozilacija

Asn-24

Asn-38

Asn83

O-glikozilacija

Ser-126

Disulfidne vezi:

2x

Število izoform:14

• Uravnava nastajanje in zorenje eritrocitov.

• Nastaja v ledvicah (85–90 %) in v jetrih.

• Koncentracija eritropoetina v krvi se poveča ob hipoksiji (krvavitve, zmanjšan pretok krvi skozi ledvica, zmanjšani afiniteti hemoglobina do kisika, višja nadmorska višina, pri kronični obstrukcijski pljučni bolezni, nekatere srčne bolezni)

• Znižana koncentracija eritorpoetina v krvi: kronična odpoved ledvic, avtoimune bolezni, kemoterapija, infekcije, AIDS...

• Povišana koncentracija: tumor, ledvične ciste, kronična višinska bolezen, ...

• 1977: Miyake s sodelavci je izoliral 10 mg čistega EPO iz 2550 litrov urina.

Epoetin

• Epoetin = rekombinantni eritropoetin

• Obstajajo različne kombinacije glikozilacije, uvedena so tudi

nova glikozilacijska mesta, zato obstajajo na trgu različni

pripravki: epoetin alfa, epoetin beta, epoetin delta, epoetin

omega, epoetin zeta, ...

• Dodatna glikozilacijska mesta podaljšajo t1/2 (tudi na 20h).

• Ker jemanje poveča celokupno koncentracijo hemoglobina, se

poveča dostava kisika tkivom => zloraba v športu.

Slika: IEF (izoelektrično fokusiranje) analiza EPO gliko-izoform; a:

komercialni naravni EPO (urinski), b: Neorecormon, c: Eprex, d: urin

kontrolne osebe, e,f: urin pacienti na terapiji z Neorecorminom, g,h: urin

kolesarjev.

Doping kontrola

• Visoka molekulska masa.

• Kompleksna 3D struktura.

• Proizvedeni so v celicah.

Povzetek: Značilnosti biotehnoloških zdravil

Aspirin hGH EPO mAb

180 Da 22 kDa 34 kDa 150 kDa

Da (dalton) = 1 g/mol

mAb (monoclonal antibody

hGh (human growth hormone)

Sintezno

zdravilo

• So pogosto heterogene molekule.

• Zelo težko se jih ovrednoti v celoti s fizikalno-kemičnimi

analitičnimi metodami in določi njihovo biološko delovanje.

• So lahko imunogeni.

• Njihova proizvodnja je zapletena. ($ £ €)

• Ponovljivost njihovega proizvodnega procesa je odvisna od

biološke aktivnosti in hišnih standardov.

Biološko zdravilo različnih proizvajalcev ima lahko različne lastnosti,

mora pa biti zdravilo vedno učinkovito in varno!

Govorimo o bio-podobnih (biosimilars) in bio-boljših (biobetters) zdravilih.

Struktura proteina je odvisna od procesa proizvodnje!

Vsebina

• Zdravilo

• Sintezna zdravila

– Racionalno načrtovanje

– Rešetanje visokih zmogljivosti

– Virtualno rešetanje

– Mimetiki

– Naključja, klinična opažanja

• Biološka zdravila – rekombinantna (biotehnološka)

zdravila

Vprašanja ?

Pomen proteinov v medicinski diagnostiki in pri zdravljenju

www.medindia.net/Patients/patientinfo/tumor

Tumorski označevalci so različni proteini

Zdravila ciljajo različne proteine

Encimi so tudi zdravila

Približno 10% genov ali njihovih produktov lahko predstavlja tarče za zdravila

A.L. Hopkins, C.R. Groom. The druggable genome. Nature Reviews Drug Discovery, September 2002

Zbirka človeških proteinov, ki vežejo spojine vodnice, imenujeno “genom, ki ga lahko

zdravimo” (“druggable” genome).

“Genom, ki ga lahko zdravimo”

Funkcionalni razredi makromolekul kot tarč za zdravila

A.L. Hopkins, C.R. Groom. The druggable genome. Nature Reviews Drug Discovery, September 2002

Večina tarč predstavljajo proteini, med proteini pa encimi.

Zdravila ciljajo tudi DNA

Proteini, vključeni

v biosignaliziranje

Cisplatin – prva generacija kemoterapevtikov – zavira

prepisovanje DNA

- Ključ za izboljšanje odkrivanja zdravil je v organizaciji verige funkcijskih raziskav

- Informacije se morajo pretakati iz osnovnih raziskav analize genoma, proteinov, metabolitov,

kemijskih spojin, itd., do stopnje kliničnih raziskav in sprostitve zdravila na trg.

- Združevanje tako različnih področjih naravoslovnih in matematično-informatičnih znanosti

predstavlja še vedno velik izziv.

- Potrebni so mostovi, ki pomagajo raziskovalcem enega področja pri komunikaciji z drugimi

raziskovalci interdisciplinarnih skupin. V TO VERIGO MORAJO BITI VKLJUČENI TUDI

ZDRAVNIKI !!

Obstoječi izzivi razvoja zdravil

www.ncrisproteins.org/

Problem terapije: individualnost posameznikovega genoma; interakcije

med zdravili

European Perspectives in Personalised Medicine Brussels, Belgium 12-13 May 2011

- Le 30 – 60% terapij je uspešnih

ZAKAJ??

Ni le ene Alzheimerjeve bolezni, enega raka na prsih,enega revmatoidnega artritisa,

enega AIDS, itd……..

To spoznanje le počasi prihaja v zavest in bo v prihodnjem desetletju pomembno

vplivalo na razvoj medicine.

Vstopamo v medicino po-genomskega obdobja, kjer moramo upoštevati

individualnost posameznikovega genoma.

Encimi v medicinski praksi

Encimi kot tarča zdravil

Encimi kot diagnostični indikatorji (označevalci, markerji)

- zmanjšana aktivnost holinesteraz pri zastrupitvi z organofosfati (pesticidi, bojni strupi...)

- ala-transaminaza (ALT) in asp-transaminaza (AST)– razpad jeter (ciroza, rak...)

- alkalna fosfataza v krvi – kostne in jetrne bolezni

- kisla fosfataza v krvi – rak prostate

- specifični srčni encimi (LDH, CPK, AST) – infarkt

- lipaza in amilaza – pankreatitis

- Etc., etc…………..

Encimi kot zdravila

- streptokinaza, aktivator plazminogena za razgradnjo strdkov v krvi

- Asparaginaza razgrajuje Asp, ki ga nujno rabi ‘levkemično tkivo’ za rast

- Dodajanje encimov zaradi pomanjkanja (genske napake, itd.)

- Etc.

Zakaj so encimi lahko diagnostični indikatorji?

mitochondrijska AST 1 h

LDH-5 (M4) 12 h

CK 18 h

citoplazemska AST 1 dni

ALT 2 dni

LDH-1 (H4) 5 dni

Razpolovne dobe izoencimov

Časovni potek encimske aktivnosti po infarktu

Določanje kreatinske kinaze (CK), ala- in asp-transaminaz (ALT, AST) in laktatne

dehidrogenaze (LH) v serumu po infarktu

tehnična kontrola

normalni vzorec

infarkt

Obolenje jeter

infarkt

2 dni po infarktu

1 dan po infarktu

Zastoj srca, poškodba

CK

vzorec

pro2services.com/.

Reakcija kreatinske kinaze CK reakcija laktat dehidrogenaze LDH

Določanja izoencimov kreatin kinaz (CK) in laktat dehidrogenaz

(LDH) v serumu z elektroforezo

Izoencimi (izocimi)

- Katalizirajo isto reakcijo, a se razlikujejo v aminokislinskem zaporedju.

- So značilni način uravnavanja v različnih tkivih in razvojnih stanjih.

- Pogosto so oligomerni proteini, sestavljeni iz različnih polipeptidnih verig.

- Imajo drugačne kinetične parametre in odgovarjajo na različne signale.

- Primer I: laktat-dehidrogenaza

H izocim LDH je izražen v srcu. M izocim je izražen v mišici. H – aerobni pogoji; M –

anaerobni pogoji.

H in M imata 75% aminokislin enakih (75% identičnost)

CK1 (BB) je pogosta v možganih in gladkih mišicah (je praktično no v serumu)

CK2 (MB) je pogosta v srčni mišici in nekaterih skeletnih mišicah (je praktično no v serumu)

CK3 (MM) je pogosta v skeletnih mišicah in srčni mišici (predstavlja skorajda 100% serumske CK)

Primer II izoencima je kreatin kinaza

Reakcija kreatinske kinaze CK – regenerira ATP v progasti mišici

Kot zdravila se uporabljajo:

- tkivni plazminogenski aktivator tPA (serinska proteinaza)

- streptokinaza (SK), and

- urokinaza (UK).

•Streptokinaza je hemolitični encim bakterije iz rodu Streptococcus

• Je aktivator plazminogena in sodeluje v razgradnji strdkov v krvi

•--------------------------------------------------

•Medicinska uporaba - razgradnja krvnih strdkov, npr. pri akutnem miokardnem infarktu

•Stranski učinki – notranje krvavitve zaradi proteolize.

razgradni produkti

Encimi kot zdravila: trombolitična (fibrinolitična) sredstva

Terapija kroničnih vnetij – inhibicija proteolitičnih encimov z

anti-proteinazami

Druge pomembne skupine proteinov (ki niso encimi) in se

uporabljajo v zdravljenju

Lehninger, 2008

Razredi bioloških zdravil

Zdravljenje raka z biološkimi zdravili– zgodba o Herceptinu

- Gen HER2 kodira receptor človeškega epidermalnega rastnega faktorja EGFR

(receptor s tirozinkinazno aktovnostjo)

- HER2 je človeški onkogen, ki je prekomerno izražen pri cca 25% rakov na prsih.

- Herceptin je eno od prvih bioloških zdravil (Ulrich Axel, Max Planck inštitut).

Trastuzumab (komercialno ime Herceptin) je monoklonsko protitelo, ki

reagira z HER2 receptorjem. Zelo drago zdravilo.

Pomen laboratorijskega testiranja: le ženske, ki imajo povečano izražanje tega onkogena

je smiselno zdraviti s Herceptinom (določevanje s qPCR)

Herceptin: Cena zdravljenja: nekaj 10 000 eur/pacientko…………

Mehanizem delovanja Herceptina

Roche Diagnostics

Herceptin se veže na HER2 receptor. S tem prepreči, da bi se na HER2 vezal

epidermalni rastni faktor EGF. Zato ne pride do prenosa signala, ki ga posreduje EGF –

celice se ne delijo.

Encimi v terapiji

Dodajanje encimov v krvni obtok – intravenska uporaba

Zdravljenje pomanjkanja encimov zaradi genetskih okvar:

Problem predstavlja tudi imunogenost dodanih encimov……

Pomen proteinov v medicinski praksi - povzetek

- Pomembne tarče številnih zdravil. Pomembnejši razredi so se GPCR, kinaze, jedrni

receptorji….Pristopi funkcijske genomike pomembno prispevajo k razvoju novih učinkovin.

- So lahko diagnostični indikatorji (označevalci, markerji) – za njihovo detekcijo v telesnih

tekočinah so na voljo diagnostični kompleti.

- Encimi in drugi proteini so vse pomembnejši kot zdravila (biološka zdravila)

Poleg proteinov je lahko tarča terapij tudi DNA.

Prihodnost:

Osebna medicina, kjer bomo na podlagi podatkov o posameznikovem genomu (ali delu

genoma) lahko natančneje opredelili diagnozo,

boljše napovedali prognozo obolenja kot tudi

uspeh zdravljenja.