síntesis quimio-enzimática de nucleósidos naturales y modificados · 2018-07-13 ·...

Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : [email protected]

Tesis de Posgrado

Síntesis quimio-enzimática deSíntesis quimio-enzimática denucleósidos naturales y modificadosnucleósidos naturales y modificados

Taverna Porro, Marisa Lía

2010

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor de laUniversidad de Buenos Aires en el área de Química Orgánicade la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Taverna Porro, Marisa Lía. (2010). Síntesis quimio-enzimática de nucleósidos naturales ymodificados. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_4590_TavernaPorro.pdf

Cita tipo Chicago:

Taverna Porro, Marisa Lía. "Síntesis quimio-enzimática de nucleósidos naturales ymodificados". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 2010. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_4590_TavernaPorro.pdf

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Orgánica

SÍNTESIS QUIMlO-ENZIMÁTICA DE NUCLEÓSIDOSNA'I'URALESv MODIFICADOS

Tesis presentada para optar por el título de Doctor dela Universidad de Buenos Aires enel área de Química Orgánica

Lic.Marisa LíaTaverna Porro

79581;Director de tesis: Dr.Javier MontserratDirector asistente: Dr.Adolfo Iribarren

Consejero de estudios: Dr. Gerardo Burton

Lugarde trabajo: Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y BiologiaMolecular(INGEBI), CONICET-UBA

Buenos Aires, 2010

Losabajo firmantes

Certificamos:

Que la Licenciada Marisa Lía Taverna Porro, ha realizado bajo nuestradirección, el trabajo que con el título: "Síntesis quimio-enzimática denucleósidos naturales y modificados", presenta en esta memoria y queconstituye su Tesis para optarpor el título de Doctor de la Universidad deBuenos Aires en el área de Química Orgánica

Y para que conste a los efectos oportunos, presentamos a la Universidad de Buenos Aires lamencionada Tesis, firmando el presente certificado

wirDr.Javier Montserrat Dr. Adolfo Iribarren

fl mifamifia y amigos

OOOOOOOOOCOOOOCÓOO...OOOOÓOOOOOOOOOO00.00.00....01

WWWNWMWYWEste trabajo de tesis presenta una estrategia versátil y económica para Ia síntesis de

nucleósidos tanto naturales como modificados partiendo de azúcares naturales. La

aproximación quimio-enzimática de Ia sintesis de nucleósidos que se exploró, se encuentra

resumida en la Figura 1.

HO\| o Hzogpml o OH H0\I o HO\| Bo H a °Cl? .__. , .l sintesis I ¿H x 0P03H2 OHo“ x quirnioenzirnática OH x

X e Y: H. OH.B: bases purinicas o pirimidínicas.

,__¡

Figura 1. Obtención quimio-enzimática de nucleósidos naturales y modificados.

En primer lugar, se desarrolló una estrategia general de obtención de furanosas-S

fosfato utilizando un esquema de protección química y desprotección selectiva con lipasas,

combinado con una fosforilación química. De esta forma se sintetizaron D-ribosa 5-fosfato, 2

desoxi-D-ribosa 5-fosfato y D-arabinosa 5-fosfato.

Luego se exploró Ia reacción de glicosidación enzimática de nucleósidos mediante el

acoplamiento de nucleósido fosforilasas (NPs)con la fosfopentomutasa (PPM). Esta última, al no

ser una enzima comercial, debió ser sobreexpresada y purificada, y su actividad debió ser

optimizada para ser utilizada en las reacciones de síntesis de nucleósidos. De esta forma se han

obtenido con altos rendimientos (70-100%) los nucleósidos: adenosina, inosina, 6

mercaptopurin ribonucleósido, 1,2,4-triazoI-3-carboxamida ribonucleósido (Rivabirina),timidina,

2'-desoxiuridina, S-fluoro-2'—desoxiuridina y 5-bromo-2'-desoxiuridina. Asimismo se han

obtenido diversos nucleósidos con moderados rendimientos (30-50%),tales como la guanosina,

2-amino-6-cloro-purin ribonucleósido, 2-fluoroadenosina e hipoxantín arabinonucleósido.

Finalmente se han obtenido con escaso rendimiento (10-30%)los siguientes nucleósidos: adenín

arabinonucleósido, 6-mercaptopurín arabinonucleósido, 1,2,4-triazol-3-carboxamida

arabinonucleósido, 2'-desoxiinosina y 2-amino-6-cloro-purin 2'-desoxirribonucleósido.

Luego se llevó a cabo la inmovilización de Ia enzima sobreexpresada PPM, y la co

inmovilizacion del sistema enzimático acoplado (PPM-NP).

Por último, se realizó un estudio computacional para desarrollar una propuesta estructural

de la PPM de E. coli y determinar aproximadamente el sitio activo de la misma y el modo de

unión de los Iigandos.

OOO...O00.000,.OOOOOOOÓOOOOOOOOOCOOOOOÓOOOOOOOOOOJ

WMWGMWNWWThis thesis presents a versatile and economic strategy for the synthesis of natural and

modified nucleosides, using natural sugars as starting materials. The used chemoenzymatic

approach is summarized in Figure 1.

HO\I H203P0\| HO\I HO\I Bo OH o OH o B o

I l l ' I OPO H ’' 3 2

OH x mamas“ OH x OH x

x . .OH.B: pinmidine or purine bases.

Figure 1. Schematic representation of the used strategy

ln first place, a general strategy for the preparation of furanoses 5-phosphate was

developed by means of a selective protection-deprotection scheme using lipases, combined

with chemical phosphorylation. Thus, D-ribose S-phosphate, 2-deoxy-D-ribose 5-phosphate and

D-arabinose S-phosphate were synthesized.

Then, the enzymatic synthesis of nucleosides was explored by coupling nucleoside

phosphorylases (NPs) and phosphopentomutase (PPM). The latter, not being commercially

available, had to be overexpressed and purified, and its activity optimized, in order to be used in

nucleoside synthesis reactions.

ln this way, the following nucleosides were obtained in high yields (70-100 %):

adenosine, inosine, 6-mercaptopurine ribonucleoside, 1,2,4-triazoI-3-carboxamide

ribonucleoside, thymidine, 2'-deoxyuridine, 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 5-bromo-2'

deoxyuridine. Also, several nucleosides were obtained with moderate yields (30-50%), such as:

guanosine, 2-amino-6-chloropurine ribonucleoside, 2-fluoroadenosine and hypoxanthine

arabinonucleoside. Finally,adenine arabinonucleoside, 6-mercaptopurine arabinonucleoside, 1

1,2,4-triazol-3-carboxamide arabinonucleoside, 2'-deoxyinosine and 2-amino-6-chloropurine 2'

deoxyribonucleoside, were obtained with low yields (10-30%).

Then, the immobilization of the overexpressed PPM, and the co-immobilization of the

coupled enzyme system (PPM-NP)was achieved.

Finally, a computational study directed to explore PPM's structure, the approximate

determination of its active site and binding mode of the ligands was accomplished.

AWExtraño momento es este en el que tengo que resumir todos estos años de tesis. Debo

agradecer de forma expresa a todos los que han aportado algo a su realización (y son muchos)

pero hay que reconocer que no podría citar a todos y cada uno de ellos. Por eso me anticipo en

pedir disculpas a todos aquellos a los que no citare en el siguiente texto.

Primero debo agradecer a mi núcleo familiar en el que también incluyo a amigos que se

han convertido en hermanos con el tiempo. Especialmente a mis padres sin los cuales hoy no

podría ser quien soy. Siempre han apoyado cada una de mis decisiones. Su apoyo fue, es y será

simplemente invaluable en mi vida. Papa: con tus libros, escritos, relatos y con nuestras eternas

disquisiciones filosóficas has despertado en mi el espíritu científico y mi carácter explorador, de lo

cual te estaré eternamente agradecida.

Por supuesto debo agradecerle a mi director, el Dr. Javier Montserrat, así como a mi co

director, el Dr. Adolfo Iribarren, por haber confiado en mi persona, siempre, por su paciencia y

guía en este camino largo, hermoso y a veces tortuoso que es la realización de una tesis.

Un agradecimiento especial al Dr. Rodrigo Pontiggia y la próxima Dra. Laura Robaldo, mis

compinches del laboratorio, por la colaboración, paciencia, apoyo brindados desde siempre y

sobre todo por esa gran amistad que me brindaron, por escucharme y aconsejarme siempre.

Así también a todo el personal del INGEBI,tanto becarios como doctores, dirección,

recepción y demás, ya que dentro de los ámbitos que a cada uno le competen me han ayudado

sin restricciones. Especialmente al Dr. Diego Weigner, Dr. Leon Beauvier y el Dr. Claudio Pereira,

sin cuyos ap0rtes no habría salido airosa de mi incursión por la desconocida área de la biología

molecular.

A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de Ia UBA,por formarme y seguir haciéndolo.

Por su gente, muchos de los cuales hoy puedo llamar amigos.

A todo el grupo de la Dra. Anna Tramontano de la Universidad de la Sapienza, Roma, que

me recibieron con los brazos abiertos para asesorarme en el campo dela biología computacional.

AIDr. Jobbaggy, por su ayuda en el campo de los materiales.

A mis eternos amigos de toda la vida, Vale, Sole y Mati, que más que amigos son

hermanos, por su incondicional apoyo y animo en cada momento de mi vida. A Ceci, Sil, María,

Mar, Diego, Juan, Eze, Maries, Aleli (y sus hermosos amigos los cuales poco a poco voy

considerando mios), Ser, Sophie, Agus y muchísimos más amigos que son mi cable a tierra, por mi

alegria que se las debo, por ayudarme a crecer y madurar como persona, ayudándome en todas

las circunstancias posibles. Especialmente a vos sil, que me has tolerado Iarguísimos fines de

semana en tu hogar leyendo y releyendo estas páginas.

Por último, al CONICETy al SECYT,sin cuya financiación no habria podido llevar a cabo este

trabajo.

Gracias a todos,

Abreviaturas y símbolos

2AA

2Al

2AU

2-Br-U

2-F-A

2-PGA

3D

3-PGA

5-F-U

6-CI-2-NH2-pu6-SH-Pu

A

A-5-P

ACZO

ACN

AcO

AcOEt

ADN

ADP

anh.

aprox.ARA-A

ARA-C

ARA-TI

ARA-U

ARN

ARNÍ

aromat.

AspATP

BDDDP

Bn

BSA

c.c.d

CAL-B


2'-amino-2'-desoxiadenosina2'-amino-2'-desoxiinosina2'-am¡no-2'—desoxiuridina5-bromouracilo2-fluoroadenina

2-fosfogliceratotridimensional

3-fosfogliceratoS-fluorouracilo

6-cloro-2-amino purina6-mercapto purinaadenosinaarabinosa S-fosfatoanhídrido acéticoacetonitriloacetiloacetato de etiloácido desoxirríbonucleicoadenosina 5'-difosfato

anhidro/aaproximadamenteadenín arabinósidocitidín arabinósido

6-mercaptoinosín-arabinósidouridín arabinósidoácido ribonucleicoácido ribonucleico de interferenciaaromático

ácido aspárticoadenosina 5'-trifosfato2-terbuti|imino-2-dietilam¡no-1,3-dimetilperhidro-1,3,2diazafosforinabencilo

bis(trimetiIIsiIíl)acetamidacromatografía en capa delgadaIipasa de Candida antártica BIipasa de candida rugosacisteinadobletedoble doblete2',3'-didesoxiadenosina


DDI

DDU

DERA

DMAP

DMSO

DMSO-dsdR-l-PdR-S-P

DÏT

E. coli

EDC

EDTA

equiv.EtOH

PPM

2',3'-didesoxiinosina2',3'-didesoxiuridina2-desoxirribosa S-fosfato aldolasa

4-dimetilaminopiridinadimetilformamidadimetilsulfóxido

dimetilsulfóxidoperdeuterado2-desoxirribosa 1-fosfato2-desoxirribosa S-fosfato

1,4-ditiotreitolEscherichia coli

1-[3-(dimetilamino)propil]-3-eti|carbodiimidaácido etilendiamintetracéticoequivalentesetanolfuranosa 1-fosfatofuranosa 5-fosfato

ácido glutamicohora/shipoxantinahistidina

cromatografía líquida de alta resoluciónhidrógenos2,3-bifofosgliceratomutasa independienteisopropilidenisopropil-B-D-1-tiogalactopiranósidolisina

multipletemetanol deuteradometanol

ácido morfolino propano sulfónicopeso molecular (masa relativa)nucleósido fosforilasaácido nitriloacético

electroforesis en geles de poliacrilamidapares de basesbuffer fosfato salino

reacción en cadena de la polimerasaprotein data bankpolietilenglicolfenilo

fosfato inorgánicolipasa de higadohígado de cerdopurín nucleósido fosforilasafosfopentomutasa

OOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOÓOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOJ


ppmp-TsClPVA

Py.

PyNP

R-l-PR-5-P

Rf

RMN

RMSD

TEOS

THEOS

THF

ThrTMOS

TMS-Tf

TP

Tris

U.V.

UP

X-GAL

partes por millóncloruro de p-toluensulfoniloalcohol polivinílicopiridinapirimidín nucleósido fosforilasacuartetoribosa 1-fosfatoribosa S-fosfatorelación de frente

resonancia magnética nucleardesviación cuadrática media

singuletesingulete anchododecilsulfato sódicoseflnatripleteterbutilhidroperóxido1,2,4-triazoI-3-carboxamidatrietilaminatetraetiI-orto-silicato

tetra(2-hidroxietil)—orto-silicatotetrahidrofuranotreoninatetrametilortosilicatotriflato de trimetilsililotimidín fosforilasa

ÍI ¡aíu ¡)(:l;dl y" I L 1

ultravioletauridín fosforilasa

5-bromo-4-cloro-3-indolil- B-D-galactopiranósido

ÍNDICE

1. lNTRODUCCIÓN

1.1- Nucleósidos naturales y modificados. Generalidades y aplicaciones

1.1.1- Generalidades

1.1.2- Aplicaciones de los nucleósidos naturales y modificados

1.2- Síntesis química clásica de nucleósidos naturales y modificados

1.2.1- Formación del enlace glicosídico

1.2.1.1- Control de la configuración anomérica en las reacciones de glicosidación

1.2.1.2- Estrategias para la sintesis estéreo y regioselectiva de

2 '-desoxirribonucleósidos

1.2.2- Desventajas de la síntesis química clásica

1.3- Síntesis quimio-enzimática de nucleósidos modificados

1.3.1- Biotransformaciones

1.3.1.1- Generalidades de las biotransformacíones

1.3.1.2- Enzimas utilizadas en procesos biocatalíticos

1.3.1.3- Las ventajas de las reacciones biocatalizadas contra la síntesis química clásica

1.3.2- Estrategia propuesta para Ia sintesis quimio-enzimática de nucleósidos

naturales y modificados.

1.3.3- Parte l: Síntesis quimio-enzimática de furanosas S-fosfato.

1.3.3.1- Enzimas utilizadas en la reacción de acetilación-desacetilación de

azúcares: Lipasas

1.3.3.2- Antecedentes del uso de hidrolasas en las reacciones de protección

desprotección de azúcares

1.3.4- Parte Il:Síntesis enzimática de nucleósidos modificados

1.3.4.1- Generalidades

1.3.4.2- Nucleósido fosforilasas (NPs)

1.3.4.2.1- Antecedentes del uso de NPs en la síntesis de nucleósidos.

1.3.4.3- Fosfopentomutasas (PPMs).

1.3.4.3.1-Antecedentes del uso de PPMs en la síntesis de nucleósidos

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1.4- introducción de sobreexpresión de proteínas

1.4.1- Selección del tipo de construcción génica y célula huésped

1.5- lnmovilizacíón de Enzimas


1.5.2- Métodos de inmovilización

1.5.3- Selección del método de inmovilización

1.5.4- Atrapamiento de enzimas por tecnologia sol-gel

1.5.4.1- Definicióny características del proceso sol-gel

1.5.4.2- Atrapamiento de bíomoléculas vía el proceso sol-gel de silíca

1.5.4.3- Sol-gelbasados en un temp/ado (direct-template-assembly)

1.5.4.4- Antecedentes del atrapamiento de enzimas utilizandosistemas sol-gel

de sílica

1.6- Modelización de proteínas

1.6.1- Métodos de modelización de proteínas

1.6.2- Modelado por homologia

1.6.2.1- Búsqueda de templados

1.6.2.2- Correcto alineamiento secuencia templado- secuencia target

1.6.2.3- Construcción y evaluación del modelo

1.6.2.4- Refinamiento del modelo obtenido

1.6.3- Evaluación de la interacción proteina-ligando

1.6.3.1- Experimentos de acoplamiento molecular utilizando AUTODOCK

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1- Materiales

2.1.1- Reactivos

2.1.2- Cromatografía y material para purificación

2.1.3- Enzimas

2.1.4- Sistemas de vectores

2.1.5- Buffers y medio de cultivo

2.2- Consideraciones generales

2.3- Metodología

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2.3.1- Obtención de los productos triacetilados

2.3.1.1- Sintesis de meti/ 2,3,5-tri-O-acetil-D/L-pentofuranósidos

2.3.1.2- Síntesis de butil 2,3,5-tri-O-acetil-D/L-pentofuranósidos

2.3.1.3- Síntesis de 3,5-di-O-acetil-1,2-O-¡sopropiliden-a-D-xilofuranósido

2.3.2- Reacciones enzimáticas de desacetilación

2.3.2.1- Reacciones de desacetilación enzimática utilizando CRL

2.3.2.2- Reacciones de desacetilación enzimática utilizando tejido vegetal

2.3.3- Sintesis del precursor del 3-amino-3-desoxi-D-ribofuranosa S-fofatoy/o 3-azido3-desoxi-D-ribofuranosa S-fofato

2.3.4- Síntesis de las furanosas 5-fosfato

2.3.4.1- Síntesis de D-ribosa S-fosfato

2.3.4.2- Síntesis de D-arabínosa 5-fosfato

2.3.4.3- Síntesis de 2-desoxi-D-ribosa S-fosfato

2.3.4- Sobreexpresión dela enzima PPM de Escherichia coli

2.3.4.1- Obtención de la secuencia de la PPMy diseño del cebador

2.3.4.2- Amplificación del gen de la PPM mediante PCR

2.3.4.3- Electroforesisen geles de agarosa

2.3.4.4- Digestión de ADNcon enzimas de restricción

2.3.4.5- Construcción del p/ásmído PPM en el vector de expresión pGEM-T

2.3.4. 6- Ligación de fragmentos de ADN

2.3.4. 7- Construcción del plásmido PPM en el vector de expresión pRSET-A

2.3.4.8- Extracción y purificación del plásmido. Secuenciación

2.3.4.9- Transformación del vector de expresión en Ecoli. competentes

2.3.4.10-Crecimiento de las células e inducción de la expresión de la PPM

2.3.5- Purificacióny concentración dela enzima recombinante

2.3.5.1- Purificación de la proteína recombinante con resinas de Ni-NTA

2.3.5.2- Electroforesis en geles de po/iacrilamida

2.3.5.3- Diálisisy concentración de la enzima purificada

2.3.6- Ensayos de actividad

2.3.7- Procedimiento general para Ia sintesis de diversos nucleósidos naturales

y de nucleósidos modificados

2.3. 7.1- Sintesis enzimática de nucleósidos

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2.3.7.2- Cromatografía líquida de alta presión

2.3.8- Inmovilización enzimática

2.3.8.1- Inmovilización en geles de sílice-PVA

2.3.8.2- Inmovilización en geles de sílice-quitosano

2.3.9- Elucidación estructural y funcional dela enzima PPM

2.3.9.1- Modelado por homología

2.3.9.2- Determinación del sitio de unión a sustrato

2.3.9.3- Determinación del modo de unión

3- SÍNTESlS DE FURANOSAS S-FOSFATO

3.1- Objetivos y resumen

3.2- Esquema general de la síntesis de furanosas 5-fosfato

3.3- Resultados y discusión

3.3.1- Síntesis de alquil furanósidos acetilados

3.3.2- Síntesis quimio-enzimática de furanosas diacetiladas - reacci0nes

enzimáticas de desacetilación

3.3.2.1- Reacciones de hidrólisis enzimática de los meti/ 2,3,5-tri-O-acetil

D/L-pentofuranósidos utilizando CRL

3.3.2.2-Reacciones de hidrolisis enzimática de los metil 2,3,5-tri-O-acetil

D/L-pentofuranósídos utilizando tejido vegetal

3.3.2.3-Reacciones de hidro/¡sisenzimática de los buti/ 2,3,5-tri- O-acetil

D-pentofuranósidos utilizando tejido vegetal

3.3.2.4- Reacciones de hidrólisisenzimática dela 3,5-di-O-acetil-1,2-0-¡sopropiliden

a-D-xilofuranosa utilizando diversas fuentes enzimáticas

3.3.3- Síntesis del precursor del 3-amino- y 3-azido3-desoxi-D-ribofuranosa

5-fofato utilizando la 3,5-di-O-acetiI-1,2-O-isopropiIiden-a-D-xilofuranosa

3.3.3.1- Análisis restrosintétíco

3.3.3.2- Síntesis del 3-azido-3-desoxi—1,2-O-¡sopropiliden-a-D-ribofuranosa5-difeníl

fosfato

3.3.4- Síntesis de furanosas S-fosfato

3.3.4.1- Síntesis de D-ribosa S-fosfato

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146

3.3.4.2- Síntesis de D-arabinosa S-fosfato 153

3.3.4.3- Síntesis de 2-desoxí-D-ribosa S-fosfato 155

3.4- Conclusiones 159

4. SOBREEXPRESION, PURIFICACION Y ENSAYOS DE ACTIVIDAD DE LA PPM DE E.

CL”

4.1- Objetivos y resumen 161

4.2- Resultados y discusión 161

4.2.1- Selección del sistema de expresión 161

4.2.2- Clonado del gen dela PPM de E. coli K-12en el vector pRSET-A 163

4.2.3- Transformación del plásmido pRSET-A-PPMen E. coli BL21(DE3)pLysS 165

4.2.4- Expresión y purificación de la proteína recombinante PPM de E. coli 166

4.2.5- Optimización de Ia actividad dela PPM 172


5- SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE NUCLEÓSIDOS NATURALES Y NUCLEÓSIDOSMODIFICADOS


5.2- Resultados y discusiones 181

5.2.1- Esquema general de Ia síntesis enzimática de nucleósidos 181

5.2.2- Sintesis enzimática de ribonucleósidos 182

5.2.3- Síntesis enzimática de desoxírribonucleósidos 185

5.2.4- Sintesis enzimática de arabinonucleósidos 189


6- INMOVILIZACION DE LA PPM Y CO-INMOVILIZAClÓN DE LA PPM Y PNP



6.2.1- Selección de la técnica de inmovilización 193

6.2.2- Inmovilizaciónen compuestos híbridos de quitosano-sílica mediante la

tecnología sol-gel 199

6.2.2.1- Obtención y caracterización del precursor THEOS 200

6.2.2.2- Inmovilización dela PPM: Efecto de la concentración de THEOSy quitosano

en la inmovilizaciónpor sol-gel 201

6.2.2.3- Co-¡nmovi/¡zaciónde las enzimas PPM y PNP en sol-geles híbridos de

quitosano y sílica 205


7- ESTUDIO ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PPM DE E. coli



7.2.1- Elucidaciónestructural dela PPM: Modelado por homologia 210

7.2.2- Localizacióndel sitio de unión al sustrato 216

7.2.3- Determinación del modo de unión 220

7.2.3.1- Estudios preliminares en sistemas conocidos 222

7.2.3.2- Experimentos de docking - selección de las condiciones experimenta/es 224

7.2.3.3- Experimentos de docking evaluando como ligando las furanosas S-fosfato 227

7.2.3.4- Experimentos de docking evaluando las a-D-furanosas 1-fosfato. 228

7.2.4- Una explicación experimental 230


8- RESUMEN DE RESULTADOSl CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

8.1- Resumen de resultados 233

8.2- Conclusiones y perspectivas 234

1 Capítqu 1. Introducción y objetivos

Cagítulo 1

Introducción y objetivos

1.1- Nucleósidos naturales y modificados- Generalidades y aglicaciones


Los nucleósidos son las subunidades del ADNo ARNy consisten en una base nitrogenada

unida a una pentosa, por medio de un enlace glicosidico con configuración [3entre el carbono

anomérico del azúcar y un nitrógeno de Ia base (N1 en las pirimidinas y N9 en las purinas). Las

bases naturales que forman parte de estos nucleósidos son Ia adenina, timina, guanina, citosina y

el uracilo, mientras que las pentosas son la D-ribosa (ARN)y la D-desoxirribosa (ADN)(Figura 1.1).

O

o < .I AN /H N NHZ

I Á guanina ÁH o H0 l ll

B

uracilo \ o / citosinaNH: o

N \ OH R I

(ÍN /' \ NH2 I Áu N N o

adenina H

o

OH o

H0 H0 . .limlna

o OH OH

OH H

2-desoxiD-ribosa D-ribosa

Figura 1.1. Nucleósidos naturales


Los análogos de nucleósidos son compuestos en los cuales se ha modificado una de las

partes integrantes de la molécula. Estas modificaciones pueden introducirse tanto en la base

nitrogenada, como en el azúcar correspondiente o en ambos. Las modificaciones en la base, en

general, son sustituciones en la misma, en cambio, se pueden hallar una enorme diversidad de

modificaciones en el azúcar, como ser por ejemplo, aperturas de ciclo (nucleósidos acíclicos),

homólogos superiores e inferiores, sustituciones isostéricas, eliminación o sustitución de hidroxilo

en la posición C2’y C3', transposiciones dela base a C2' o a C3', entre muchas otras.

Esta similitud estructural con los nucleósidos naturales, es la que los hace capaces de

alterar el funcionamiento de los ácidos nucleicos o de bloquear determinados procesos esenciales

para su replicación. Elamplio rango de actividadesbiológicas de estos análogos de nucleósidos los

hace los principales blancos y los candidatos más prometedores para desarrollar terapias

antiviralesy antineoplásicas“.

1.1.2- Aplicacionesde los nucleósidos naturales y modificados

o Antivirales

Las drogas antivirales son una clase de medicamento utilizado para el tratamiento de

infecciones virales. Eldesarrollo de este tipo de compuestos ha sido históricamente lento. Larazón

de esto radica, paradójicamente, en la simplicidad de los virus. Los virus son agentes infecciosos

sub-microscópicos constituidos por material genético (ADNo ARN)que se encuentra recubierto

por una cápside proteica. Esta estructura puede estar, a su vez, rodeada por la envoltura vírica,

una capa Iipídica con diferentes proteínas conjugadas, dependiendo del virus. Estas entidades

biológicas son parásitos intracelulares estrictos y sólo pueden replicarse apropiándose de la

maquinaria metabólica de la célula infectada, para así producir nuevas partículas virales. Debido a

que su ciclo replicativo esta altamente ligado a la célula que infecta, es difícil afectar la replicación

viral sin alterar las funciones celulares. Así mismo, no se disponen de modelos animales

adecuados, complicando de esta manera su evaluación.

Losprimeros antivirales se desarrollaron en los años sesenta por métodos de ensayo y error,

pero poco se conocía de su mecanismo de acción y de los blancos virales. Con el advenimiento de

¡Alastain A.; Word Drug Therapy, 1999, 340, 12552Perigaud. C.; Gosselin, G.; Imbach, 1.; Nucleosides Nucleotides, 1992, 11, 903

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOJ

3 Capítulo 1. Introducción y objetivos

Ia biología molecular, Ia elucidación en los años ochenta de las secuencias genéticas de los virus y

con los avances en el conocimiento de sus ciclos replicativos, ha sido posible el desarrollo de

antivirales específicos y racionalmente diseñados.

- Etapas afectadas por las drogas antivirales en el ciclo replicativo del virus

Para comprender como actúan los antivirales y cuáles son los blancos posibles de acción,

se debe conocer Ia estructura y el ciclo replicativo del virus en estudio. Estos ciclos difieren en

detalles específicos dependiendo de Ia especie de virus, pero todos comparten un patrón general.

Un agente antiviral ideal afecta la replicación en un sitio específico y esencial del ciclo replicativo

sin afectar el metabolismo celular normal. A continuación se resume en la Figura 1.2 las etapas

generales del ciclo viral.l

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(3’" ¿m l_°¡Acumllame W u. ymqu

¡am o «una: (III-IMme: El ¡ncwannaGllflnw

Figura 1.2. Ciclo replicativo del virus

o Adsorción

o Penetración

o Desnudamiento o liberación del genoma viral

o Replicación viral

o Síntesis y procesamiento de proteinas virales

o Ensamblaje


o Liberación

Losanálogos de nucleósidos actúan principalmente en Ia etapa de replicación viral. Ésta es la

fase sintética del ciclo replicativo del virus. Existendiferencias en esta etapa de acuerdo al material

genético que constituye el núcleo del virus. En el caso de virus de ADN, se transcriben los ARNm

específicos del ADNviral. Luego se utiliza la maquinaria celular para traducir el ARNmy sintetizar

así todas las macromoléculas necesarias para generar una nueva progenie viral. Enel caso de virus

de ARN, el mismo material genético actúa como molde para la síntesis de su hebra

complementaria. Por último, los retrovirus sintetizan Ia doble cadena de ADN a partir del ARN

viral.

Losantivirales interfieren en Ia etapa de replicación del genoma viral:

Í Virus ARN:los blancos apropiados en este caso son el ARNviral, la ARNpolimerasa

y/o el complejo replicativo. Loscompuestos que actúan a este nivel son: ribavirina

(análogo de nucleósido) y moléculas de ARNcomplementario (antisentido).

v/ Virus ADN:Los blancos más vulnerables son la fuente de desoxirribonucleótidos y

las enzimas virales, sobre los que actúan los análogos de nucleósidos. Estos

compuestos pueden actuar: Como terminadores de cadena, incorporándose al

genoma viral, inhibiendo la elongación de la cadena de ADN; como inhibidores

irreversibles de la polimerasa viral; o actuar a ambos niveles. En este grupo se

encuentran los antivirales más efectivos en Ia clínica.También existen compuestos

inhibidores de las polimerasas virales no análogos de nucleósidos.

Los análogos de nucleósidos son los fármacos más utilizados en terapia antiviral. De los

antivirales aprobados por la FDA(Federal and Drug Administration), más del 50 % pertenecen a

esta clase de compuestos (Tabla 1.1).

S Capítulo 1. Introducción y objetivos

Tabla 1.1. Listado de antivirales aprobados por la FDAhasta el año 2007.

Sólo a manera de ejemplo, en la actualidad aciclovir y ganciclovir son los compuestos

usados clínicamente para el tratamiento del virus del herpes. Zidovudine, didanosine, zalcitabine,

lamuvidine, stavudine y abacavir (Figura 1.3), en combinaciones con algunos antivirales no


análogos de nucleósídos, son los más utilizados en los tratamientos anti HIV, y Iamivudine,

adefovir, entecavir y telbivudine son los antivirales aprobados para el tratamiento de Ia Hepatits B.pPN

N \N ""2 o o

</ I A N/ N NH

N N m, I I M1 </ I Áo N A HO N N/ miH) N O

s/J o °\JHONGHO

OH

Abacavir Lamuvidina Stavudina Ganciclovir

N:

Didanosina Zidovudina Aciclovír Zalcitabina

Figura 1.3. Nucleósidos modificados comerciales

Pese al crecimiento del desarrollo de los antivirales a lo largo de los años, esta área es muy

activa, continuándose con el desarrollo de nuevos agentes quimoterapéuticos. Eldescubrimiento

de la adquisición de resistencia y los efectos colaterales inespecíficos, por ejemplo, su

citotoxicidada, ha sido uno de los motivos fundamentales para Ia búsqueda de agentes antivirales

más efectivos, más selectivos y no tóxicos.

o Antineoplásico

Los agentes antineoplásicos son drogas que inhiben o combaten el desarrollo de tumores.

Existen varias clases de estos agentes: Agentes alquilantes, antimetabolitos, intercalantes,

inhibidores de la topoisomerasa II,generadores de radicales libres, entre otros.


Los análogos de nucleósidos pertenecen a la clase de los antimetabolitos. Por su similitud

estructural con los metabolitos o nucleósidos naturales pueden interferir en la producción de

ADN,lo que conlleva a un arresto en la división celular y en el crecimiento de tumores. Debido a

que la velocidad de replicación es mayor en células tumorales, Ia inhibición de la división celular

daña en mayor medida estas células.

Sus mecanismos de acción incluyen:

- Activación de la apoptósis por activación de caspasas, activación de receptores de muerte

celular, y activación mitocondrial. Asimismo, la incorporación de análogos de nucleósidos

en el ADN celular causa la ruptura de la hebra de ADN en fase S (sintética),

desencadenando la apoptósis.

- Inhibición de las enzimas involucradas en la generación de nucleótidos purínicos y

pirimidinicos.

Como ejemplo del uso de análogos de nucleósidos en terapia antineoplásica, se pueden citar

los siguientes:

Análogos purínicos

-F|udarabina: Es un análogo arabinósido fosforilado de la adenosina, sustituido en la posición 2 de

la base por un fluor (Figura 1.4). Inhibe la sintesis de ADN interfiriendo con enzimas como la

ribonucleótido reductasa y IaADNpolimerasa, entre otras.

-C|adribina: Es un análogo de la desoxiadenosina, en el cual la base se encuentra sustituida en la

posición 2 por un cloro (Figura 1.4). Posee efectos inmunosupresores. Inhibe la

adenosindeaminasa, lo cual interfiere con la habilidad dela célula de procesar ADN.

Análogos pirimidinicos

-Floxuridina: Es un análogo pirimidinico, en el cual Ia base se encuentra sustituida en la posición 5

por un fluor (Figura 1.4). Laforma activa es la base fluorada que es liberada enzimáticamente en el

cuerpo. Este compuesto actúa de diversas maneras, pero principalmente actúa como inhibidor de

3Balint, G., Pharmacology & therapeutícs, 2001, 89, 17-27


la timidilato sintetasa. Esta inhibición bloquea la sintesis de timidina, compuesto requerido para la

replicación del ADN.

-Citarabina (ARA-C): Es un análogo modificado en el azúcar, en el cual la ribosa ha sido

reemplazada por arabinosa (Figura 1.4). Este compuesto daña el ADNen su fase sintética. A su

vez, inhibe tanto la ADNcomo Ia ARNpolimerasas y la enzima nucleótído reductasa, necesarias

para la síntesis de ADN.NH,

o N \N N \

I_ N N/ F “o N N/ Clo °\0H o

OH OH

Fludarabina Cladribina

° NH,

F

I m | \”no N/Ko "o N o

o O\OH

o“ OH

Floxuridina Citarabina

Figura 1.4. Análogos de nucleósidos utilizados en terapia antineoplásica

o Oligonlucleótidos modificados

Los oligonucleótidos son oligómeros constituidos por monómeros nucleosídicos unidos entre

si por puentes fosfodiéster, constituyendo así, pequeños fragmentos de ADNo ARN.

Losoligonucleótidos modificados, son análogos de los correspondientes naturales, en los

cuales los nucleótídos constituyentes se encuentran modificados en el azúcar, en la base, o en el

grupo fosfato.

Estas modificaciones otorgan ventajas con respecto a sus contrapartes naturales, entre las

cuales se encuentra incrementada la estabilidad en fluidos biológicos, al no ser estos sustratos de

las enzimas celulares denominadas nucleasas que degradan los ácidos nucleicos naturales. Entre

OOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOQOOO...OOOOOOOOOO'

OOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOÓOOOÓOOOOOOCOOOOOÓ.Ó...’..Ó.*

9 Capitulo 1. Introducción y objetivos

sus variados usos en la clinica así como en Ia investigación, se pueden encontrar ejemplos del

empleo de oligonucleótidos modificados en terapia antisentido, formando parte de ribozimas y/o

desoxirribozimas y en ARNde interferencia y aptámeros"5'°.

Eluso de oligonucleótidos en eI campo de Ia terapéutica ofrece varias ventajas con respecto a

las drogas tradicionales. En primer lugar precisa de menor concentración para producir el mismo

efecto terapéutico, debido a que se logra atacar una enfermedad a nivel genético, mientras que

las drogas tradicionales están dirigidas a proteinas que se encuentran en gran número de copias.

En segundo lugar esta estrategia ofrece un enfoque general, ya que se parte del mismo tipo de

compuestos químicos (nucleótidos) para Ia producción de fármacos contra diversas

enfermedades. Finalmente, son moléculas de gran especificidad, ya que las secuencias son en

general unívocas para cada blanco especifico.

Í Terapia antisentido.

Esta terapia consiste en Ia inhibición de Ia expresión de un gen específico a nivel del ARN. En

este caso, el oligonucleótido se une por complementariedad al ARNmblanco, bloqueando de esta

forma Ia expresión de proteínas codificadas por este ácido nucleico. Asi mismo puede también

activar la enzima ARNasa H intracelular, cuya actividad consiste en degradar moléculas de ARN

(que se encuentran hibridizados al correspondiente ADNcomplementario). En 1978 Zamenick y

Stephenson7 ilustraron por primera vez esta estrategia, en la cual demostraron la inhibición del

virus sarcoma de Rous en un sistema celular.

Un ejemplo de este tipo de compuestos aplicados a terapia antisentido aprobado por la FDA,

es el caso de la droga comercial Fomivirsen (comercializada bajo el nombre de vitravene) utilizada

para el tratamiento de retinitis inducida por citomegalovirus en pacientes con SIDA.

Actualmente un sinnúmero de drogas antisentido están siendo investigadas en el tratamiento

de diversos tipos de cáncer, diabetes, esclerosis, distrofia muscular y enfermedades con

componentes inflamatorios, como el asma y la artritis.

4 Kagiyama, A., Curr. Opín. Mol. Then, 2001, 2, 2535 Iribarren A.; Sproat, B.; Neuner, P, Sulston , I.; Ryder, U.; Lamond , A.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 77476 Rosenbohm, W.; Bíoorganic Medicina! Chem., 2004, 12, 23857Zamenick, P; Stephenson, M.;. Proc. Narl. Acad. Sci. USA.,197B, 75, 280


Í Ribozimasydesoxirribozimas

Lasribozimas y desoxirribozimas son moléculas de ARNo ADNrespectivamente, con actividad

catalítica‘. La principal actividad de estas moléculas es la de hidrolizar enlaces fosfato

internucleotídicos de sustratos de ARN. Nuevamente, en este caso, las ventajas de introducir

modificaciones en algunos de sus monómeros son análogas a las observadas en el uso de

oligonucleótidos modificados y tiene como objeto aumentar su estabilidad biológica.

Algunas ribozimas pueden desempeñar un rol importante como agentes terapéuticosg, como

biosensoresm, y para aplicaciones en genómica funcional y descubrimientos de genes. Existen

actualmente ribozimas en estudio clínico, para su uso contra el virus HIV“, para diversos tipos de

tumores (ANGIOZYMEH),para el virus de la hepatitis C (HEPTAZYMEH),entre otras.

v’ Aptámeros

Los aptámeros son moléculas oligonucleotídicas cortas que presentan una alta afinidad por

proteinas, péptidos o moléculas orgánicas pequeñas", en una forma conceptualmente similar a

los anticuerpos monoclonales. Su mecanismo de acción se basa en el bloqueo mediante

interferencia física, debido a unión específica ligando-aptámero. Laventaja con respecto al uso de

anticuerpos es que estas moléculas pueden ser obtenidas utilizando métodos de evolución

molecular in-vitro, sin tener que pasar por un sistema animal.

Aligual que las ribozimas o los oligonucleótidos antisentido, son susceptibles a Ia degradación

por nucleasas en el medio intra y extra-celular. Por lo que su modificación puede proveerlos de

una resistencia notable a la degradación. Existeya un fármaco de aptámeros en el mercado para el

tratamiento de Ia degeneración macular asociada a la edad (MACUGEN‘S).

' Looney, D.; Yu, M.; Ribozyme protocols, Humana Press 1999, 74, 4699Christoffersen, R.;Marr, 1.;J. Med. Chem., 1995, 3B, 2023m Breake, R.; Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13, 31“ Ridgen, 1.; Ely,J.; Macpherson, 1.; Gerlach, W; Sun, L.;Symonds, G.; Curr. Issues Mol. Biol., 2000, 2, 61” u.s. Patent 6,346,398la Foster, G.; Semin. Liver Dis., 2004, 24, 97u ver por ejemplo: a) Ellington A.; Szostak, 1.; Nature, 1990, 346, 818, b) Tuerk, C.; Gold, L; Science, 1990, 249, SOS¡5Ng, E.; Shima, D.; Calias, P.,.M; Cunningham, E.; Guyer, D.; Adamis, A.; Nat. Rev. Drug Discov, 2006; 5,123

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OOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0...?

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JÏñfiïmg Capítulo1. Introduccióny objetivos

Í ARNde interferencia

El ARN de interferencia (ARNi)es una molécula doble cadena de ARNcorta que suprime la

expresión de genes homólogos específicos mediante mecanismos de interferencia por ARN. El

ARNi es uno de los métodos más específicos en Ia ablación de genes, ya que diferencia la

secuencia blanco específica de otras posibles secuencias blanco correspondientes a otros ARNm.

Así mismo, es más eficiente que otras terapias ya que al ser moléculas cortas de ARN(alrededor

de unos 20 nucleótidos) pasan inadvertidas por la respuesta inflamatoria. La terapia de ARNi

puede aplicarse a enfermedades genéticas, autoinmunes, tumorales y virales. En este último caso

ya ha habido avances debido a que se encontró un ARNique bloquea la expresión de un oncogen

conllevando al incremento dela sobrevida en pacientes con leucemia“.

1.2- Sintesis guÍmica clásica de nucleósidos naturales y modificados.

Los nucleósidos naturales y modificados pueden obtenerse por métodos de síntesis

química clásica y/o por medio de reacciones biocatalizadas.

Lasíntesis química de nucleósidos se puede dividir en tres grandes aproximaciones. Una es

la glicosidación directa de bases purinicas y pirimidínicas naturales y/o modificadas y sus derivados

(1); la segunda es la construcción de anillos purínicos y pirimidínicos, a partir de precursores N

glicosilados (2), la tercera es la modificación química de un nucleósido natural. Éstas se ilustran por

su análisis retrosintético en la Figura 1.5.

(1)—La desconexión A- identifica la formación del enlace glicosídico mediante Ia unión del azúcar a

la base preformada. En la práctica, esta etapa hace uso de desplazamientos de buenos grupos

salientes en la posición 1 de un monosacárido p0r medio de un nitrógeno nucleofílico de la base

heterocíclica.

(2)- Ladoble desconexión B-identifica el proceso de construcción de la base heterociclica sobre un

enlace glicosídico preformado en el carbohidrato. Otra aproximación de este tipo se muestra

como una doble desconexión C, que indica la formación de una base purinica sobre un nucleósido

imidazólico preformado.

Capítqu 1. Introduccióny objetivos

0

l( i L (A) Ho o x /N NHN NH= < I Aabrí/J o * a N/ NH:

\ï:’-¡_Ll N4 NH? H OHMN (A)o (H)

O

\ H0 o NH; "fY// NH

OH OH Q + Cz I "A

¿I * z=<NÏ

NH,

Flgura 1.5. Análisisretrosintético de la slntesis tradicional de nucleósidos.

Con la idea de circunscribír los antecedentes al objeto de esta tesis, se concentrará la

discusión en la próxima sección sobre Ia formación del enlace glicosídico.

1.2.1- Formación del enlace gllcosldico

En la síntesis de nucleósidos por glicosidación directa, se pueden producir varios

regioisómeros y estereoisómeros, por lo que el mayor desafío en estas reacciones implica el

control regio (glicosidación en el N-1 en la caso de las pirimidinas y en el N-9 para las purinas) y

estereoquímico (formación de nucleósidos con la configuración B).

Los métodos que se describirán a continuación, en general, se refieren a la síntesis de

ribonucleósidos. Aunque estos se pueden extender a la síntesis de 2'-desoxirríbonucleósidos,

generalmente brindan selectividades pobres durante la formación del enlace glicosídico. Existen

modificaciones de estas metodologías específicas para la síntesis de estos últimos, las cuales serán

brevemente descriptas a continuación.

“’ Frechtel, G.; Bioquímia., 2005, 30, 99-100

13 Capitqu 1. Introducción y objetivos

Entre los diversos métodos quimicos para la directa glicosidación se pueden citar:

- Bases de sales de metales pesados:

Fischer y Helferich17y Koenings y Knorr’s introdujeron por primera vez el uso de sales de

metales pesados de purinas (inicialmente Ag(l))para Catalizarel desplazamiento nucleofilico de un

halógeno en el C-1 de un azúcar protegido. En una posterior modificación, Davol y Lowry19

utilizaron sales de Hg(ll)para mejorar los rendimientos de reacción. Esta sintesis permite obtener

en general el nucleósido con la regioselectividad deseada y en muchos casos con la

estereselectividad indicada (el motivo se discutirá más adelante en este capítulo), tanto en purinas

como en pirimidinas. Esta sintesis presenta la desventaja de partir tanto de bases como de

azúcares protegidos, y en algunos casos de producir mezclas complejas de productos con distinta

regio y estereoselectividad. Otras desventajas que pueden citarse son la pobre solubilidad de los

derivados de mercurio y la inestabilidad de los derivados halogenados de los azúcares. Asimismo

no es un método adecuado para la sintesis de nucleósidos con actividad biológica, debido a la

potencial presencia de trazas de mercurio en el producto final.

En un ejemplo tipico", la base cloromercurio-G-benzamidopurina reacciona con el cloruro

o bromuro de 2,3,5-tri-0-acetil-D-ribofuranosa para dar el nucleósido protegido, a partir del cual,

por medio de la remoción de los grupos protectores, se obtiene el nucleósido deseado(en este

caso, adenosina). (Figura 1.6) maz un,

N \ N \

una: </ I N </ I NAso AJO N 2 N0 N 2N \ N N

o N l o Il o

BI' </ I J _> _>N /ou ou: I N 0A: OA:

HqCI

Figura 1.6. Uso de sales de metales pesados de las bases heterocíclicas para la síntesis de nucleósidos, (i)

xileno, 120 °C; (ii) NHglMeOH

"Fischer, 5.; Helferich, B. Chem. 3er., 1914, 47, 21o¡a Koenigs, w.; Knorr, E. Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1901, 34, 957’9 Davoll, 1.; Lowy, a. A. J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 1650


- Reacciones de fusión para Ia síntesis de nucleósidos:

Debido a la inestabilidad de los derivados halogenados de los azúcares se modificó la reacción

de síntesis, generando el halógeno reactivo ¡n situ por medio de la reacción de 1-acetoxiazúcares

con ácidos de Lewis tales como TiCl4y SnCI.. Esta modificación llevó a los procesos de fusión,

método introducido inicialmente por Sato et al“. Por calentamiento de un azúcar acetilado y una

base tanto purínica como pirimidínica en presencia del catalizador ácido a presión reducida, se

obtuvieron los productos de condensación (luego de su fusión). Esta reacción generalmente

genera mezclas anoméricas, que habitualmente pueden separarse por cromatografía en columna

de sílica gel.

Este método funciona mejor para purinas que contienen grupos atractores de electrones, de

bajo punto de fusión.

- Elmétodo de Hilbert Johnson (de cuaternización):

Hilbert y Johnson notaron que las pirimidinas sustituidas eran suficientemente nucleofilicas

para la reacción directa con los azúcares halogenados sin la necesidad del agregado de

catalizadores electrofílicos. Es así que este método involucra la alquilación de una 2

alcoxipirimidina con un azúcar halogenado". El producto inicial es una sal cuaternaria que a

temperaturas elevadas elimina un haluro de alquilo para dar el producto de condensación (Figura

1.7).oa

_o

I \N oa CI NH,/ \N NN Aoa I I Lo 0/ \

BIO A) 81 N‘) °_CHZCH’ alo N NH:o l O J __ O

CI——> CI" _"_.>\4OBz OBz OBz OB:OE: 081

Figura 1.7. Método de cuaternización para la síntesis de nucleósidos, (i) CH3CN,10°C; (ii) NH3,MeOH

2°Ulbricht, T.; Ang. Chem. Int. Ed., 2003, 1, 476n Sato, T.; Shimadate, T.; Ishido, Y.Nippon Kagaku Zasshi., 1960, 81, 1440zzHilbert, G.; Johnson, T.; J. Am. Chem. Soc., 1930, 52, 4489

COCOCOOOOOOOOOOOOOOOOQOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓÓOOOOOO‘


Estas condensaciones frecuentemente ofrecen mezclas anoméricas aunque el uso de HgCIz

aumenta la proporción del anómero B.

- Glicosidación de Vorbruggen :

El método de Hilbert-Johnson ha evolucionado, siendo una de estas mejoras el uso de bases

persililadas. Este método es particularmente útil cuando está presente un grupo u-aciloxi en la

posición 2 del donor glicosídico,produciendo B-nucleósidosde forma estereocontrolada, debido al

efecto anquimérico del mismo.

Las bases sililadas ofrecen tres ventajas: (1) son de fácil preparación, (2) reaccionan

fácilmente con azúcares en solución homogénea, debido a su incrementada solubilidad y

nucleofílicidad y (3) dan productos intermediarios que pueden ser fácilmente convertidos en las

bases modificadas correspondientes. Como catalizadores ácidos, los primeros utilizados fueron los

óxidos mercúricos y ácidos de Lewis, que han sido sustituidos por el uso de siliI-éteres, entre los

cuales se pueden citar: triflato de trimetilsililo, nonaflato de trimetilsililo y/o perclorato de

trimetilsililo. Lafigura 1.8 muestra un ejemplo de este tipo de procedimientos. La base sililada se

sintetiza, en general, inmediatamente antes de la reacción de glicosidación, por calentamiento

bajo reflujo con una mezcla de hexametildisiloxano y cloruro de trimetilsililo. Alternativamente se

puede utilizar bis(trimetilsilil)acetamida (BSA).Labase sililada reacciona subsiguientemente con el

azúcar peracetilado, que es ¡nsitu convertido al halogenuro o al triflato c0rrespondiente utilizando

un acido de Lewis (usualmente, TMS-Tfo SnCl4).

Esta metodología se denominó procedimiento de Vorbruggen23 en honor a su principal

impulsor. Como se mencionaba antes, el control de la estereoquímica en Ia serie de los

ribonucleósidos se logra por asistencia anquimérica. La regioselectividad depende de la captura

del intermediario ion oxonio por el nitrógeno más nucleofílico de Ia base, y consecuentemente se

pueden formar una mezcla de regioisómeros.

1’Ver por ejemplo: a) Vorbrüggen, H.; Ruh-Pohlenz, C. Organic Reactions., 2000, 55, 1,b) Vorbrüggen, H.; Acc. Chem.Res., 1995, 28, 509 ,c) Vorbrüggen, H.; Acta Biochim. PoI., 1996, 43, 25


NH2

BzO

o \N

NH;- HNTMS o“ I ÁOBz OBz alo\ N 0N ¡ \N ii o—— I —‘/ I“

a o N ows oa: oa:

Figura 1.8. Ejemplo del método basado en bases sililadas para Ia síntesis de nucleósidos. (i) (Me;Si)zNAc;(ii)

CF3503SÍM63; H20

1.2.1.1- Control de la “ " 1 - “¡as e de .. .J .1

En el caso de la glicosidación de azúcares con grupos acilo dirigidos hacia la cara a, la

eliminación del grupo saliente en Ia posición 1 del azúcar, genera un carbocatión que es

"capturado" por el oxigeno carbonílico del grupo acilo adyacente. Este intermediario bicíclico es

preferencialmente atacado por la base nucleofílica, por Ia cara opuesta del anillo furanósico al

sustituyente en la posición 2" (Figura 1.9). Por lo que, para la síntesis de nucleósidos ribósidos se

obtiene el anómero B, para los arabinósidos se obtiene el anómero a, y en el caso de los

desoxirribonucleósidos, no está presente dicha asistencia, obteniéndose ambos anómeros. Un

método alternativo para el control de la estereoselectividad involucra el uso de intermediarios de

oxazolidinas. Éste en un método estereoespecífico con aplicaciones más generales, pudiéndose

obtener mediante este tipo de metodologías B-arabinonucleósidos.

'RO 'RO f) 'RO < ‘ROH aoñ e o o

a, llgCl \ H o

on" oYo on- oYo on" o oa' o oR YR R R

Figura 1.9. Bases mecanísticas del control anquimérico. R=alquilo o arilo; R'=acetilo, bencilo,

trimetilsililo; B: base heterociclica (como sal de mercurio o sililada)

OOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOl


1.2.1.2-' ‘ ‘ ' parala síntesis estéreov ' 4' de 2' J ' 'L ' ‘ "

Como se ha mencionado anteriormente, la ausencia de un sustituyente acetiloxi en la posición

2 en los desoxirribósidos, produce mezclas anoméricas en diferentes proporciones.

Una de las metodologías de glicosidación utilizadas para la obtención de los mismos con la

configuración B, denominada el método de la sal de sodio, utiliza una sal de sodio de una base

formada ¡n situ y un a-haloazúcar como donor glicosídico. Para la síntesis de los 2'

desoxirribonucleósidos, Ia formación estereoespecífica del isómero-B requiere de vías SNZcon

exclusión de Ia anomerizacíón del a-cloroazucar. Este método no siempre conlleva a reacciones

estéreo ni regioespecificaszs. Esta falta de selectividad en la reacciones de síntesis de 2'

desoxirribonucleosidos se presume que son debido a diferentes velocidades inducidas por los

sustituyentes de la base, efectos estéricos y anomerizacíón del u-cloroazucar27

Otro método de glicosidación aprovecha la asistencia anquimérica de sustituyentes en Ia

posición tres del resto del carbohidrato. El grupo 3-a-hidroxilo en un 2-desoxiazúcar puede ser

utilizado para agregar una nueva función, que puede participar en las reacciones de glicosidación.

Esta estrategia asume que un grupo 3-O-director puede bloquear la cara a del azúcar y, por Io

tanto, llevaría a la formación de B-nucleósidos, estereoselectivamente. Se han ensayado diversos

grupos funcionales como directores en Ia reacción de glicosidación, como por ejemplo: 3-0-(2

metilsulfinil) etil, 3-C-metoxitiocarbonilmetil, 3-0-a-(N-benzoi|)carbamoil, 3-O-u-tiocarbamil, entre

otros. A continuación se muestra en la Figura 1.10 un ejemplo de este tipo de asistencias

anquiméricas de 3-a-sustituyentesn.

I M'I

W ano W N/KO0 O

OA: L ..—. —.O O 0 0/ —\_ /

S S\ \Figura 1.10. Asistencia anquimérica de 3-a-sustituyentes. (i) TMSOTf,CHZCIZ;(ii) Timina(TMS)2

u Blackburn, M.; Gait, M.; Nucleic acids in Chemistry and biology, oxford university press, 199626Kazimierczuk, Z.; Cottam, H. B.; Revankar, G. R.; Robins, R. K.J. Am. Chem. Soc, 1984, 106, 6379Z7Revankar; G.; Robins, R.; Nucleosides, Nucleotides and Nucleic acids, 1989, 8, 709n Lavallee, 1.; Just, G.; Terrahedron Lett., 1991, 32, 3469-3472


Alternativamente, la habilidad de controlar la regioselectívidad en la síntesis de

ribonucleósidos ha llevado a numerosos métodos para la preparación de 2'

desoxirribonucleósidos, por medio de reacciones de 2'-desoxigenación radicalarias, subsiguientes

al paso de glicosidación. EImétodo más utilizado involucra una reducción de Barton de derivados

2'-tiocarbonatos”.

1.2.3- Desventaias de la síntesis guímica clásica

Como corolario general de la sección precedente donde se describió la síntesis química de

nucleósidos naturales y/o modificados por glicosidación, se pueden mencionar las siguientes

limitacionesgenerales de esta metodología:

o rendimientos insatisfactorios,

o estéreo selectividad parcial con respecto a la posición anomérica, especialmente para los

2'-desoxirribonucleósidos,

o regioselectividad parcial,

o necesidad de utilizar reacciones de protección/desprotección con grupos químicos Iábiles,

o posibles dificultades en la separación de mezclas complejas.

Se han planteado estrategias alternativas para Ia preparación de nucleósidos y sus análogos,

que están basadas en el uso de reacciones catalizadas por enzimas o por microorganismos, que

pueden ayudar a solucionar los problemas antes citados.

Esta aproximación presenta una serie de ventajas c0n respecto a la sintesis química

tradicional, que serán discutidas en detalle más adelante en este capítulo.

29Takamatsu' 5.; Katayama'S.; Hirose' N.; Naito. M.; lzawa, K.; Tetrahedron Lerr, 2001, 42, 7605-7608

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓ0.0000000000000000000ÓOOOOOOO*


1.3- Síntesis guimio-enzimática de nucleósidos modificados

1.3.1- Biotransformaciones

1.3.1.1-" "J J de las“ ‘ ' '

Se denomina biotransformación a todo aquel proceso en el que se utiliza como catalizador

un microorganismo, tejido o bien una enzima aislada para Ia conversión de un sustrato en un

producto.

El estado fisico de estos biocatalizadores, así como la elección acerca de utilizar enzimas

aisladas, microorganismos o tejidos depende del tipo de reacción a realizar, de Ia necesidad o no

de co-factores y de la escala en que se va a desarrollar Ia biocatálisis. Lapresente tesis se centrará

exclusivamente en Ia utilización de enzimas aisladas y en un caso particular, en el uso de tejidos

vegetales, como biocatalizadores.

1.3.1.2- Enzimas utilizadas en grocgsgs biocatalítlcos

Lagran mayoría de las enzimas empleadas en las biotransformaciones se utilizan en forma

cruda y son accesibles a bajo costo, dado que los crudos suelen ser más estables y más

económicos que las enzimas purificadas. En los últimos años, el desarrollo de las técnicas de

sobreexpresión y purificación de proteinas ha provocado un aumento en la utilización de enzimas

purificadas en dichas estrategias.

Lasenzimas se obtienen mayoritariamente de fuentes microbianas”. Así, un gran número

de biocatalizadores se consiguen de bacterias u hongos por procesos de fermentación. Otra fuente

muy importante de enzimas son ciertos órganosi de mamíferos, como hígado o riñón. Sólo un

pequeño porcentaje de enzimas se obtienen a partir de vegetales.

En la actualidad, se conocen más de 4000 enzimas, pero esta cantidad representa un

porcentaje muy pequeño de las que existen en la naturaleza. Alrededor de un 10 % de esta

cantidad han sido investigadas y son accesibles comercialmente, lo que da una idea del grado de

desarrollo que aún es posible en este campo.

3°White, J.; White, D.; Source Book of enzymes, CRCPress, Boca Raton, 1997


Lasenzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción de transferencia, el grupo dador y

el grupo aceptor, reconociéndose seis grupos principales con sus respectivas subclases, que se

citan a continuación:

1. Oxidoreductasas: catalizan reacciones de oxido-reducción, es decir la transferencia de

átomos de hidrógeno o electrones de un sustrato a otro.

2. Transferasas: catalizan Ia transferencia de grupos funcionales (distintos de hidrógeno)

de un sustrato a otro.

3. Hidrolasas: catalizan reacciones de hidrólisis.

4. Liasas:catalizan reacciones de ruptura (por vias no hidrolíticas) o formación de enlaces

de un sustrato.

5. lsomerasas: catalizan la interconversión de isómeros estructurales, de posición u

ópticos, de una a otra forma.

6. Ligasas:catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleósido

trisfosfato.

1.3.1.3- Lasventaias de las reacciones blogtalizgdas ggntra la síntesis guímica clásica

Eluso de biocatalizadores para Ia síntesis de productos, conlleva a una serie de ventajas y

desventajas, con respecto a la síntesis química clásica.

Ventaias

o La principal ventaja es la mayor selectividad. Las reacciones enzimáticas, por Io general,

son altamente regio, estéreo y quimio selectivas. Esta selectividad facilita Ia síntesis,

obteniéndose en general, los isómeros deseados, sin el uso de complejos y tediosos pasos

de protección y desprotección. Asimismo, Ia obtención preferencial de un único isómero,

facilita los procesos de purificación.

o Las enzimas son medioambientalmente "amigables". En primera medida las enzimas

trabajan en condiciones suaves de pH, temperatura y presión. Generalmente son activas a

temperatura ambiente, presión atmosférica y pH neutro o cercano a Ia neutralidad. Estas

condiciones minimizan la generación de subproductos por reacciones colaterales, lo que


conlleva a un aumento de la conversión y facilita, a su vez, los procesos de recuperación

de productos. Asimismo, las condiciones de trabajo implican un bajo consumo energético,

y por lo general son síntesis de bajo costo y con emisión de gases poco contaminantes. En

último lugar, son catalizadores biodegradables.

o Las enzimas son catalizadores muy eficientes. En general, se logran mayores velocidades a

concentraciones más bajas de catalizador con respecto a la catálisis inorgánica. Si

consideramos las condiciones de su uso (T,presión) su eficacia es aún mayor.

o Lasenzimas pueden catalizar un amplio espectro de reacciones.

Desventaias

o Las enzimas requieren parámetros operacionales muy estrechos. En general no toleran

pHs, temperaturas o presiones extremas, los cuales son necesarios, en algunos casos,

como por ejemplo para la solubilización de sustratos.

o Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuosos. Se dificulta así, la síntesis

de productos orgánicos poco solubles en dichos medios.

o Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibición. Dicha inhibición puede ser debida al

sustrato o al producto formado. En el caso de inhibición por sustrato, se debe mantener

la concentración del mismo baja, lo cual dificulta en gran medida el escalado de

reacciones. En el caso de inhibición por producto, se debe retirar el producto a medida

que se forma, lo cual encarece el escalado de la reacciones.

o Las enzimas pueden requerir cofactores, necesarios de regenerar. Algunos cofactores,

como por ejemplo el ATP, son de precios elevados, lo cual encarece la síntesis del

producto.

Si bien la biocatálisis es un área de gran utilidad para la sintesis quimica, las desventajas antes

mencionadas ponen de manifiesto que no suplantará la síntesis quimica tradicional, sino más bien,

se transformará en una herramienta más, dentro del arsenal sintético de la química orgánica.


1.3.2- Estrategia propuesta gara la síntesis guimio-enzimática de nucleósidos naturales

¡[o nucleósidos modificados.

En el particular caso de síntesis de nucleósidos, debido a los inconvenientes descriptos

para su síntesis quimica clásica (manipulación de múltiples grupos funcionales, baja regio y

estereoespecificidad, rendimientos poco satisfactorios y procesos complejos de purificación de

isómeros) se han desarrollado estrategias biotecnológicas o quimio-enzimáticas, aprovechando la

elevada regio, quimio y estéreoselectividad de las enzimas, junto con las ventajas adicionales

antes descriptas.

Una enzima muy estudiada en la síntesis de nucleósidos es la nucleósido fosforilasa (NP,

E.C.2.4.2.), que cataliza la fosforólisis reversible de ribo y desoxirribonucleósidos, obteniéndose u

D-ribosa- o u-D-desoxiribosa 1-fosfato y la base como productos“. En algunos casos, la adición de

otra base resulta en la formación de un nuevo nucleósido, esta es la denominada reacción de

transglicosidación. El resultado final de las transglicosidaciones catalizadas con NPs es la

transferencia del residuo ribosídico o desoxirribosidico de un nucleósido a diversas bases naturales

o análogas, a través del intermediario furanosa 1-fosfato (F-1-P)(F¡gura 1.11). Estas

bioconversiones son absolutamente regio y estéreoselectivas lo que implica que el azúcar es

correctamente transferido a los átomos N-1 y N-7 (para purinas y pirimidinas respectivamente) y

se forma únicamente el isómero B. Se han empleado este tipo de enzimas para la síntesis de

nucleósidos modificados tanto en la base como en el azúcar o bien modificada en ambos residuos.

Ejemplosde este tipo de metodologías sintéticas se detallará más adelante en este capítulo.

Se han empleado generalmente dos procedimientos básicos para llevar a cabo las

glicosidaciones en presencia de NPs:

a) Aislamiento de la F-1-P formada y su subsiguiente uso como donor glicosídico en Ia

reacción de acoplamiento a la base aceptora32

b) Intercambio de una base por otra, en procedimientos one-pot en presencia de cantidades

cataliticas de fosfato inorgánico (Figura 1.11).

Este último procedimiento se prefiere por su simplicidad operacional, aunque se

encuentra limitado debido a que en algunas ocasiones, la base liberada a partir del donor

glicosídico puede unirse más fuertemente a la enzima que la base aceptora, resultando en una

3' Lewkowicz, E; Iribarren, A.; Curr. Org. Chem., 2006, 10, 119731Anderson, 1.; Cottam, H.; Larson, 5.; Dee Nord, L; Revankar, G.; Robins, R.;J. Heterocyclic Chem., 1990, 27, 439

IOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0...4


inhibición competitiva. El problema de la inhibición puede resolverse mediante el uso de un

sistema enzimático acoplado.

Se ha demostrado que In vivo, Ia fosforólisis se encuentra altamente favorecida sobre la

síntesis, debido al acoplamiento de las NPs con enzimas de otros caminos metabólicos. Sin

embargo, se ha reportado que en el caso de las purín nucleósido fosforilasas (PNPs), el equilibrio

termodinámico se encuentra desplazado hacia la síntesis de nucleósidos, mientras que, para las

pirimidín nucleósidos fosforilasas (PyNPs), esta favorecido el paso fosforolitico”. Por lo que,

generalmente, las reacciones de trasnglicosidación enzimática utilizando NPsse realizan mediante

el acoplamiento de una pirimidín nucleósido fosforilasa con una purín nucleósido fosforilasa,

utilizando un nucleósido pirimidinico como donor glicosídico y una base purínica como aceptor34.

(Figura 1.11).

Estas biotransformaciones han sido llevadas a cabo empleando las enzimas purificadas en

solución (o inmovilizadas) o bien empleando células enteras de microorganismos que contienen

altos porcentajes de las enzimas requeridas”. Se ha encontrado que las NPs aceptan un amplio

rango de análogos de nucleósidos como sustratos con modificaciones tanto en Ia base como en el

componente glicosídico.

HO H0 HOB1 BZ

+_ Oil/O‘\OH OH E1 OH OH OH E2 OH OH

B1: base pirimidlnica; E1: pirimidín nucleósido fosforilasaBZ: base purínica; E2: purln nucleósido fosforilasa

Figura 1.11. Esquema de la transglicosidación en la síntesis de nucleósidos

En particular, la síntesis de nucleósidos modificados en el azúcar ha sido llevada a cabo por

el uso de donores glicosídicos modificados. Ésta es la principal limitación de la metodología, donde

además de encontrar las enzimas capaces de aceptar dicho donor glicosídico no natural, se debe

disponer del nucleósido donor del azúcar, con Ia modificación deseada.

3‘ Rideout, J.;, Krenitsky, T.; Koszalka, G.; Cohn, N.; Chao, E.; Elion, G.; Latter, V.; Williams, R.; J. Med. Chem, 1982, 25,1040

38ver por ejemplo a)Utagawa et al. Agric. Biol. Chem , 1985, 49, 2339; b)Utagawa, T.; J. Molec. Catálisis B: Enzymatic,1999, 6, 215, 222, c) Citticeli, G. et aI., Nucleosídes Nucleotídes, 1999, 18, 1135


Debido principalmente a Ia limitación de la síntesis de nucleósidos modificados en el azúcar

se han evaluado nuevas rutas de preparación. Una alternativa es la síntesis de nucleósidos

partiendo directamente del intermediario F-1-P para la reacción de acoplamiento; es decir el

donor glicosídico ya no es un nucleósido sino un azúcar fosforilado. La desventaja de esta

aproximación está dada por la dificultad en la preparación de Ia F-1-Py por su pobre estabilidad en

las condiciones de reacción”.

Una alternativa para este problema involucra el acoplamiento de las enzimas

anteriormente citadas (NPs)con otra enzima denominada fosfopentomutasa (PPM, E.C.5.4.2.7.).

Esta enzima cataliza la transferencia estereoselectiva de un grupo fosfato entre los hidroxilos de

las posiciones 5 y 1 de la ribosa, desoxirribosa y análogos (Figura 1.12). Esta aproximación tiene Ia

ventaja de utilizar furanosas S-fosfato (F-S-P)como materiales de partida. Éstos azucares fosfato

son más sencillos de preparar y son más estables que los correspondientes u-F-I-P. La F-1-P es

generada in situ a partir de la F-S-P, Ia cual es sustrato de Ia NP para la posterior reacción de

acoplamiento con la base. Existen pocos ejemplos sintéticos que utilizan esta ruta alternativa,

centrándose éstos únicamente en Iasintesis de desoxirribonucleósidos, detallados a continuación.

El objetivo general de este trabajo de tesis ha sido generar una estrategia versátil y

económica para la síntesis tanto de nucleósidos naturales como de nucleósidos modificados

partiendo de los azúcares naturales. Laaproximación quimioenzimática de síntesis de nucleósidos

que se decidió explorar en este trabajo de tesis se encuentra resumida en la Figura 1.12

H203P0 HO C HO1 o 1 a

7 :ojr OH :Ïr o“ T :oj; B Fo:| Sintesis | - I H . .OH x 0 o-anzn W“ ¿H X°P°3 1 Biooaiz ou xum 'rnab‘ca OH X

H0

Figura 1.12 Obtención quimio-enzimática de nucleósidos y/o nucleósidos modificados.

39ver por ejemplo a) Otto, J.; Werkman C.; Arch. Biochem. Biophys., 1957, 69, 264, b) Doskocil, 1.; Holy, A.; Collect Czech.Chem. Commun., 1997, 42, 370


Esta aproximación puede separarse en dos partes:

Parte I:Síntesis guimio-ezimática de furanosas 5-fosfato.

La hipótesis básica de Ia estrategia enzimática utilizando Ias enzimas PPM y NPs está

asociada a la disponibilidad de las correspondientes F-S-P como materiales de partida. La

obtención enzimática de estos compuestos implica la utilización de agentes donores de grupos

fosfato caros como por ejemplo ATP o fosfoenolpiruvato. La preparación química de estas

moléculas en general presenta dificultades asociadas al esquema de protección-desprotección de

los grupos hidroxilos de la furanosa.

En este sentido presentaremos el desarrollo de una estrategia general de obtención de

furanosas 5-fosfato utilizando un esquema de protección química y desprotección selectiva con

Iipasas combinado con una fosforilación química.

Lasenzimas utilizadas para el esquema de protección-desprotección selectiva fueron:

o Lipasa de Candida antártica (CAL-B)

o Lipasa de Candida rugosa (CRL)

o Hidrolasas de tejido vegetal (porciones de banana)

Parte II:Síntesis enzimática de nucleósidos partiendo de furanosas 5-fosfato y una base [natural omodificada)

Con las F-S-P en mano, se exploró la reacción de síntesis enzimática de nucleósidos

mediante el acoplamiento de las NPs con la PPM; para lo cual se utilizaron las siguientes enzimas:

o Nucleósidofosforilasas:

- Purin nucleósido fosforilasa de origen bacteriano

- Timidín nucleósido fostriIasa de E. Coli.

o Fosfopentomutasa de Eco/i

1.3.3- Parte I:Síntesis guimío-ezimática de furanosas S-fosfato.

Laobtención de furanosas con Ia posición S libre a partir de los azúcares correspondientes

es un paso fundamental en Ia obtención de furanosas S-fosfato. Asimismo, la obtención selectiva

de furanósidos con otras posiciones libres puede ser útil para Ia síntesis de sintones en Ia

preparación de diversos análogos de azúcares, que pueden ser utilizados para diversas


aplicaciones sintéticas. En particular, una vez modificada la posición libre, este análogo puede ser

fosforilado en la posición 5 y posteriormente utilizado como posible sustrato de la PPM/NP en la

síntesis de nucleósidos modificados en el azúcar. Lapreparación de estas furanosas con un único

hidroxilo libre requiere de numerosos pasos si se desean obtener mediante métodos clásicos de

sintesis quimica como consecuencia de Ia presencia de varios grupos hidroxilos libres de similar

reactividad“.

Aunque existen varias técnicas químicas disponibles para proteger o liberar grupos

hidroxilos en carbohidratos“, los métodos enzimáticos ofrecen una alternativa económica y

ambientalmente amigable, presentando una notable regioselectividad“.

La accesibilidad comercial y versatilidad sintética de muchas enzimas hidroliticas ha

estimulado el estudio de reacciones de protección-desprotección de azúcares, especialmente

reacciones de acilación-desacilación de monosacáridos.

1.3.3.1- Enzimas utilizad s en la r ccl a til n-de cetilación de azúcares:

Ligasas

Las Iipasas (triacilglicerol hidrolasas E.C.3.1.1.3.) son enzimas que catalizan Ia hidrólisis de

aceites y grasas con la subsiguiente formación de ácidos grasos libres, digliceroles, monogliceroles

y glicerol. Estos biocatalizadores se distribuyen en animales, plantas y microorganismos como

enzimas digestivas que facilitan el transporte, la deposición y la movilización de las grasas.

Además, juegan un papel fundamental en el metabolismo intracelular de lípidos y en el

funcionamiento de membranas biológicas“.

Las lipasas son utilizadas como fármacos en desórdenes digestivos y enfermedades del

páncreas. Se emplean también como aditivos de detergentes y como catalizadores en la industria

oleoquimica y alimentaria, sin olvidar su función como catalizadores en sintesis orgánica.

Presentan un elevado potencial sintético en contraste con otras enzimas, ya que no

requieren de cofactores y son capaces de aceptar una amplia variedad de sustratos. Asi, las Iipasas

.0 Garg, R.; Gupta, 5.; Gao, H.; Babu, M.; Debnath, A.; Hansch, C.; Chem. Rev., 1999, 99, 3525u Ver por ejemplo lshido, H.; Sakairi, N.; Sekiya, M.; Nakazaki, N.; Carbohydr. Res., 1981, 97, 51u Kadereit, D.; Waldman, H.; Chem. Rev., 2001, 101, 3367u Schimid, R.; Verger, R.;Angew. Chem. Int. Ed., 1998, 37, 1608

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0.004


pueden acomodar ésteres alifáticos, aromáticos, bicíclicos e incluso ésteres de compuestos

organometálicos, entre otros“.

Una gran variedad de estos biocatalizadores son producidos por bacterias u hongos y son

excretados como enzimas extracelulares, por lo que su producción a gran escala es un proceso

relativamente sencillo, Io que los convierte en biocatalizadores económicos.

La mayoría de las Iipasas existen en los organismos en forma de dos isoenzimas (A y B),

que generalmente presentan variaciones en la enantioselectivididad de las reacciones que

catalizan. Laspreparaciones de las Iipasas crudas contienen las dos isoenzimas, salvo en el caso de

la Iipasa de Candida antártíca, donde se han conseguido separar a través de procesos de ingeniería

genética. Sólo unas pocas Iipasas han conseguido aíslarse de mamíferos.

Una característica fundamental de las Iipasas, que las diferencia de otras hidrolasas y las

convierte en las enzimas con mayor potencial sintético, es Ia interacción que presenta con los

sustratos. La catálisis en medio acuoso con Iipasas presenta muy baja actividad c0n sustratos

hidrosolubles, pero cuando la concentración del sustrato es tan alta que sobrepasa el límite de

solubilidad formando una segunda fase lipofílica,se produce un gran incremento en Ia actividad de

la misma. Esta propiedad se conoce como activación ínterfacial‘s. Esto es debido a que estas

enzimas contienen una "tapa" que consiste en un loop superficial de la proteína que cubre el sitio

activo y se aleja del mismo al estar en contacto con la interfase“. El hecho de que las Iipasas

durante la catálisis estén expuestas a una fase Iipídicademuestra que son capaces de trabajar en

entornos hidrofóbicos manteniendo su actividad. Por ello, es posible reemplazar el nucleófilo

natural de las Iipasas (agua) por una gran variedad de nucleófilos orgánicos como alcoholes,

aminas, tioles, etc.

Las Iipasas son capaces de catalizar la esterificación selectiva entre ácidos y alcoholes.

También intervienen en reacciones de transesterificación, procesos en los que se produce un

intercambio de radicales acilo entre un éster y un ácido, un éster y otro éster o un éster y un

alcohol (alcohólisis), entre otras.

Independientemente de las diferencias de tamaño, secuencia de péptidos, sustratos,

activadores, inhibidores y otras propiedades, las Iipasas que han conseguido ser elucidadas hasta

la fecha adoptan la misma estructura, conocida como el pliegue de a/B hidrolasa, que consta de

una serie de hebras paralelas Brodeadas por hélices a. Una secuencia de aminoácidos aparece en

“ Gandhi, N.; J. Amer. Oil Chem. Soc., 1997, 74, 621-634‘5Verger, R; Trends. Biotechnol. 1997, 15, 32-38


todas las Iipasas, el pentapéptido GIi-X-Ser-Y-Gli(donde X e Y son residuos variables). La

conservación de esta serina y Ia pérdida de actividad que se produce cuando se modifica o

reemplaza, indica que este aminoácido es crucial para Ia catálisis. Además de Ia serina catalítica, el

centro activo de las Iipasas consta de Histidina (His)y de otro aminoácido que puede ser ácido

aspártico (Asp)o glutámico (Glu).Estos tres residuos forman la triada catalítica47que se encuentra

en una cavidad conocida como hueco hidrofóbico de Ia enzima.

Lipasade Candida antártica

Es una de las lipasas más versátiles empleadas en el campo de las biotransformaciones.

Existen dos isoenzimas de esta Iipasa, la forma A y la B. La especificidad de sustrato entre estas

isoenzimas presenta grandes diferencias, la correspondiente CAL-Bes muy activa frente a una gran

variedad de sustratos no naturales mientras que Ia CAL-Atiene una menor versatilidad. Asimismo

la isoenzima Bes menos termotolerante que la correspondiente forma A“.

La enzima CAL-Bno presenta activación interfacial y es muy poco activa frente a

triglicéridos de cadena larga. Ésta se presenta en diferentes preparados comerciales que difieren

en el soporte sobre el que se incorpora Ia enzima. Elpreparado comercial empleado en esta tesis

es el comercializado por Novo Nordisk como "novozym 435" donde la enzima está soportada en

una resina de nombre comercial "Lewatit E”. Una de las ventajas de este preparado es que es más

estable térmicamente que la enzima nativa“.

Ligasade Candida rugasa

Se ha elucidado la estructura de la Iipasa de Candida rugosa, mostrando que posee un

hueco hidrofóbico y presenta activación interfacial. A su vez, se ha determinado la presencia de

tres isoformas mayoritarias en el preparado comercializado por Sigma (utilizado en esta tesis)

denominadas LipAy LipB,LipC,probablemente difieren en el grado de glicosidación”.

‘° Jaeger, K.;Dijkstra, 3.; Reetz, M., Annu. Rev. Microbiol. 1999. 53, 315‘7 Brady, L.;Brzozowski, A.; Derewenda, E.; Dodson, D.; Tolley, 5.; Turkenburg, 1.; Christiansen, L.; Huge-Jensen, 8.;Norskov, L.;Thim, L.; Menge, U.; Nature, 1990, 343, 767.3 Kira,0.; Chistensen, M.; Org. Proc. Res. And Devel., 2002, 6, 446‘9Arroyo, M.; Sánchez-Montero J.; Sinisterra.; J. Enzym. Microb. Techno/., 1999, 24, 35°Lopez, N.; Pernas, M.; Pastrana, L; Sanchez, A.; Valero, F.; Rúa, M.; Biotechnol. Prog., 2004, 20, 65

0......OOOOOOOOOOOOOO00.000.00.00...0..OOOOOOOOOO*


Existen pocos estudios en los cuales se haya determinado distinta reactividad entre las

distintas isoformas de la Iipasa comercial de CRLde Sigma. En un estudio publicado por Shaw y

ChangSlse observó la existencia de diferentes actividades enzimáticas de las isoformas separadas,

con respecto a la variación de la longitud de la cadena del grupo acilo del éster hidrolizado. Se

observó que triacilglicéridos cortos, medios y largos eran preferidos como sustratos para la LipB,

LipC,LipA,respectivamente. Las tres isoformas tienen una actividad óptima a 35-40°C y pH 7-8.

Aunque estas isoformas presenten diferencias tanto en la reactividad como en la selectividad, en

las reacciones biocatalizadas de esta propuesta se utilizó el preparado comercial que contiene la

mezcla de las mismas.

1.3.3.2- ‘ ‘ J ‘ del uso de “J ' en las de acetilación

desacetilación de azúcares

La accesibilidad y la versatilidad de las enzimas hidrolíticas ha estimulado el estudio de

reacciones de acetilación-desacetilación de azúcares, especialmente en anillos piranósicos52

utilizando lipasas como biocatalizadores. Como un ejemplo, la desacetilación enzimática de la a

glucopiranosa peracetilada utilizando como biocatalizador la enzima Iipasa de Candida rugosa

(CRL) a pH ácidos, proporcionó el producto monodesacetilado en la posición 6,

regioselectivamente y con alto rendimiento, mientras que el isómero B dio el producto

desacetilado en la posición 1 con bajo rendimiento. Por otro lado, la hidrólisis de las metil

glucopiranosas acetiladas dió para ambos anómeros ensayados el producto desacetilado en la

posición 6 en menores tiempos de reacción”.

Los monosacáridos furanósicos no han sido tan estudiados como sus contrapartes

piranósicas. En este sentido, Wong y colaboradores“ desarrollaron reacciones de acetilación

desacetilación regioselectiva utilizando la CRL comercial como biocatalizador. Estos ensayos

mostraron una absoluta regioselectividad hacia la 5-desacetilación para el caso de metil 2,3,5-tri

O-acetil-a,B-D-ribofuranósidos y metil 2,3,5-tri-0-acetiI-a-D-arabinofuranósidos. Más

5‘Shaw, 1;. Chang, c.; Biotechnology Letters, 1939, 11, 77951Ver por ejemploza) Hennen, J.; Sweers, H.; Wang, Y.;Wong, C.; J. Org. Chem., 1988, 53, 4939, c) Horrobin, T.; Hao, C.;Crout, D.,'J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1998, 1, 106953Terreni, M.; Salvetti, M.; Linati, L; Fernández-Lafuente, R.; Fernández-Lorente, G.; Bastida, A.; Guisan, J.; Carbohydr.Res. 2002, 337, 16155‘ Hennen, J.; Sweers, H.; Wang, Y.;Wong, C.; J. Org. Chem.,1988, 53, 4939


recientemente se aplicaron las mismas condiciones al 1,2,3,5-tetra-O-acetiI-B-D-ribofuranosido“,

obteniéndose el correspondiente producto desacetilado en la posición primaria, o sea en el C-S,

con un 80 % de rendimiento. Por otra parte, Kimy colaboradoresS7 reportaron en una publicación

reciente, que el grupo acetilo en la posición 2 del metil 2,3,5,tri-0-acetil-a-D-arabinofuranósido

era regioselectivamente hidrolizado con elevados rendimientos utilizando Ia esterasa comercial de

hígado de cerdo y la de Rhizopus oryzae.

Asu vez, nuestro grupo ha reportado” que Ia desacetilación enzimática del metil 2,3,5-tri

O-acetiI-u-D-ribofuranósido utilizando CAL-B,fue totalmente regioselectiva, obteniéndose el metil

2,3-tri-0-acetiI-a-D-ribofuranósido con elevados rendimientos. La desacetilación del

correspondiente anómero B no fue regioselectiva, obteniéndose diversos productos de

desacetilación. Por último, en otra publicación del grupoS9 se reportó Ia preparación

diastereoselectiva del metil 3-O-acetiI-2-desoxi-u-D-ribofuranósido, 1,3-di-0-acetiI-u-D

ribofuranósido y 1,2,3-tri-O-acetil-u-D-arabinofuranósido a partir de mezclas anoméricas de los

correspondientes compuestos S-acetilados, a través de reacciones de alcohólisis enzimática

catalizada por CAL-B.

Relacionado al uso de hidrolasas de origen vegetal, si bien no existen antecedentes

utilizando sustratos derivados de carbohidratos, se ha reportado la hidrólisis de 1-acetoxi-2

metilciclohexeno utilizando raíces de zanahoria como biocatalizador“. Dado que se conoce que

ciertas frutas presentan actividad hidrolítica“, se decidió explorar en esta propuesta de tesis

doctoral, el uso de tejidos vegetales, en particular porciones de banana, como biocatalizadores en

la hidrólisis de alquil tri-0-acetilribo-, arabino- y xilofuranósidos. A nuestro leal entender, no

existen reportes de hidrólisis regioselectivas utilizando tejido vegetal.

5‘Chien, 7.; Chern, 1.; Carbohydr. Res., 2004, 339, 121557Jun,5.; Moon, M.; Lee, 5.; Cheong, C.; Kim, K.; Tetrahedron Lett., 2005, 46ss Iñigo, S.; Taverna Porro, M.; Monserrat, 1.; Iglesias, L; Iribarren, A., J. mol. Cat. B, 2005, 35, 705’Gudiño, E.; Iribarren, A.; Iglesias, L.; Tetrahedron: Assym., 2009, 20, 806°Bruni, R.; Fantin, G.; Medici, A.; Pedrini, P.; Saccheti, G.; Tetrahedron Let't., 2002, 43, 3377“Bailey, M.; .l.Am. Chem. Soc, 1912, 36, 1706

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOI

.00...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOO0.0000ÉOOOOO*

Capítulo1. Introducciónyobjetivos

1.3.4- Parte II:Sintesis enzimática de nucleósidos modificados

1.3.4.1-generalidades

Labiosíntesis de nucleósidos y/o nucleótidos, compuestos vitales para todos los procesos

bioquímicos, puede proceder a través de dos caminos: 1) síntesis de novo, en la cual participan

una variedad de aminoácidos y otros precursores, y 2) ruta de salvataje, en la que nucleósidos y

bases preexistentes son utilizados como precursores en la producción de nuevos nucleósidos y/o

nucleótidos. Enesta última, los productos secundarios actúan como fuentes de carbono, nitrógeno

y energía, via la conversión de los intermediarios ribo o desoxirribosídicos, los cuales pueden

ingresar a la ruta de las pentosas fosfato y glicólisis (Figura 1.13) .

Glucosa-64’

l Pl . Nucloóoldofi =Ruta¿http-nou Nucleosido fosforilasasto F A, o

(nm. oxkhvva) . . .I N-desoxmbosullransierasas

Rlb 7T n-s-P *—o R-1-P I eauoATP AD? A"

dR-t-P ——, aR-s-PAIP/ ADP

PRPP /_fi ,,_, deb/

Qslopentomub‘_r f/Figura 1.13. Biosíntesis de nucleósidos por la ruta de salvataje.

1.3.4.2-Nucleósigg fgfgrilgsas

La ruptura del enlace glicosídico en la ruta de salvataje es catalizado por las enzimas

denominadas nucleósido fosforilasas (NPs)mediante un mecanismo fosforolítico. Lasenzimas NPs

son indispensables en el metabolismo de nucleósidos y/o nucleótidos, ya que controlan los niveles

celulares de los mismos y de las bases libres catalizando su interconversión. Estas enzimas actúan

mediante la fosforólísis de nucleósidos purínicos y pirimidínicos, proceso en el cual la unión

glicosídica C-N es escindida, generándose la base libre y F-1-P. El descubrimiento de las enzimas

responsables de esta ruptura ha sido atribuido a Levene y Medigreceanu“. Posteriormente, en

61Levene, P.; Medigresceanu, F.; J. Biol. Chem., 1911, 9, 65

Capítulo 1. Introducción y objetivos

1924, se publicaron las propiedades generales y los métodos de purificación de las NPs,

demostrándose que Ia ruptura enzimática del enlace glicosídco podía ser realizada por dos tipos

de enzimas, una específica para purinas (PNP) y otra para pirimidinas (PyNP)53.En 1945, Kalckar“

demostró que uno de los productos de la fosforólisis era Ia R-1-P. De esta forma, se planteó un

mecanismo en el cual el fosfato inorgánico atacaba a la posición 1'del azúcar por la cara opuesta a

la base, obteniéndose el isómero a-R-1-P.

Posteriores estudios sobre la PyNP sugirieron la presencia de dos PyNP: una especifica

para timidina (timidín fosforilasa, TP), no activa sobre la uridína, y otra para uridina°5(uridín

fosforilasa, UP), no activa para la timidina.

A pesar de la baja homología en la secuencia entre las NPs de distintos orígenes, estudios

estructurales demuestran que estas enzimas podrían dividirse en dos grandes familias según el

plegamiento que presentan:

o NP-1: Presentan una estructura cuaternaria trimérica o hexamérica y aceptan

como sustratos nucleósidos purínicos y algunos pírimidínicos. A esta familia

pertenecen las enzimas PNPy UP.

o NP-2: Presentan una estructura cuaternaria dimérica y aceptan timidina y uridina.

Aesta familia pertenecen las enzimas TP.

Se han descubierto otras enzimas que rompen el enlace glicosídico, como por ejemplo las

nucleósido hidrolasas (E.C. 3.2.2.), las nucleósido desoxirribosil transferasas (E.C. 2.4.2.) y las

fosforribosil transferasas (E.C.2.2.4.). En la próxima sección sólo se describirán las NPs ya que son

las que han sido utilizadas en esta tesis.

PurÍn nucle sido fosforil PNP

Se han identificado PNPs con distintas especificidades y en algunas instancias han sido

purificadas de un amplio rango de organismos. Se pueden clasificar en dos grandes categorias“,

según presentan diferencias en su estructura cuaternaria, su peso molecular y las especificidades

con respecto a los sustratos, entre otras propiedades.

" Levene, P.; Weber, I.;J. Biol. Chem., 1924, 60, 707"‘ Kalckar, H.; .I. Biol. Chem., 1945, 153, 723

55Ver por ejemplo a) Friedkin, .; Roberts, 0.; J. Biol. Chem., 1954, 207, 245 , b) Paege, L; Schlenk, F.; Arch. Biochem.Biophys., 1952, ao, 42

ÓÓÓOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOCQOOOOOOOOOOOOOOOOOG


o PNPde bajo peso molecular:

- Son homotrímeros (MP’80-100 kDa).

- Específicos para la catálisis de 6-oxo purinas y sus nucleósidos; y algunos

análogos. Precisan para la actividad purinas sustituidas con un grupo 6

ceto o algún grupo con propiedades electrónicas similares (ej. S), un

protón en el N-1 y sólo toleran sustituyentes donores de protones en el C

2.

- Han sido aisladas de mamíferos y de algunos microorganismos tales como

Bacíllusstearotermophí/us y CeIIqumonas.

o PNPde alto peso molecular

- Son homohexámeros (Mr‘110-160 kDa).

- Poseen una menor especificidad que las de bajo peso molecular aceptando

como sustratos tanto a G-oxopurinas como a 6-aminopurinas y sus

nucleósidos.

- Son las encontradas generalmente en microorganismos.

Con respecto a la especificidad de las PNP de ambas clases, se puede resumir que las de

bajo peso molecular exhiben una especificidad más estricta para la base y una menor especificidad

para el azúcar que las correspondientes de alto peso molecular.

En esta tesis se ha trabajado con la enzima PNP comercializada por Sigma, cuyo origen es

descripto como "bacteriana" sin aclarar la cepa correspondiente (Sigma se niega a divulgar el

origen de Ia misma). Ésta ha sido asumida en muchos trabajos como de E. coli. (PNP de alto peso

molecular). Sin embargo, Bzowska et al.fio han sugerido otro origen basándose en las

especificidades por los sustratos y su peso molecular, indicando que se trataría posiblemente de la

PNP de Cellulomonas (PNPde bajo peso molecular).

La enzima PNP de Cellulomonas ha sido cristalizada y su estructura dilucidada por

cristalografía de rayos X, revelando que al menos en su forma de cristal, esta enzima se presenta

como un homotrímero y es un miembro de Ia clase de PNPde bajo peso molecular". Asimismo, se

ha demostrado que la reacción de fosforólisis de adenosina no es detectable, mientras que la

66Bzowska, A.; Kulikowska, E.; Shugar, D.; Pharmacol. Ther., 2000, 88, 349


adenina sí es sustrato de la reacción inversa, pero con una menor velocidad que con la

hipoxantina“.

Esta enzima tiene un pH óptimo de trabajo en el rango de 6-8.5, pero posee una

excepcional estabilidad a pHs más básicos, siendo estable a pH=11 por una hora. Adicionalmente,

a diferencia de muchas PNPs de bajo peso molecular, es excepcionalmente termoestable", no

perdiendo actividad hasta 60 °C.

Timidín fosforilasas (TPsl

Hasta el día de hoy, todas las enzimas TPs aisladas y caracterizadas son dímeros, con una

masa molecular en el rango de 80-110 KDa.Laestructura detallada de la TP de E.coli obtenida por

cristalografía de rayos X fue presentada por primera vez en 1990”. Ésta mostró que cada

subunidad contiene un amplio dominio aB, y un dominio más pequeño a, entre los cuales se

encuentra el sitio activo. Éste consta de dos sitios de unión a sustrato, en uno se une el nucleósido

y en el segundo el fosfato. Se concluyó que la discriminación entre diversos nucleósidos se asocia a

efectos estéricos“.

Laenzima TP de E. coli es específica, con respecto a los azúcares, para la 2-desoxirribosa 1

fosfato, mientras que la especificidad por las bases pirimidínicas es menos estricta, siendo

sustratos de la misma las bases naturales timina y uracilo. Se ha reportado que el sustituyente de

la posición 5 del anillo pirimidínico puede ser intercambiado por hidrógeno, metilo o amino con

efectos despreciables en los valores de actividad". En el caso de la sintesis de nucleósidos

utilizando bases tipo 5-halogenouracilo, se determinó que disminuye significativamente la

actividad en comparación con la utilización de timina". Este efecto se debe al reemplazo en la

posición 5 por un sustituyente voluminoso, dificultando estéricamente la unión de Ia base

modificada al centro activo de la TP. Sin embargo otros sustituyentes en Ia posición 5 del uracilo

pueden no ser sustratos dela misma, como ocurre en el caso de los grupos 5-tio y 5-hidroxímetilo.

67Tebbe, J.; Bzowska, A.; Wielgus-kutowska, 8.; Zazimierczuk, 2.; Schroder, W.; Shugar, D.; Saenger, W.; Koellner, G; J.Mol. Biol., 1999, 294, 123968Hennen, W.; Wong, C.; J. Org. Chem., 1989, 54: 46926°Wielgus-Kutowska, 8.; Tebbe, j.; Schroder, W.; Shugar, D.; Saenger, W.; Koellner, G, Bzowska, A.; Adv. Exp. Med. Biol.,1998, 431, 2597°Walter, M.; Cook, w.; Cole, L; Short, s.; Koszalka, G.; krenitsky, r; Ealick, s.; J. Biol. Chem., 1990, 265, 14016n a) Razzel, E.; Khorana, H.; Bíochim. Et Biophys. Acta, 1958, 28, 562, b) Razzel, E.; Casshyap, P.; J. Biol. Chem., 1964, 239,1789

n Panova, N.; Alexeev, C.; Kusmichov, A.; Shchevelva, E.; Gavryshov, K.; Polyakov, A.; Kritzyn, A.; Esipov, R.; Miroshnikov,A,; Bíochemistry , 2007, 72, 21


La sustitución del oxígeno de la base en la posición 2 del uracilo y timina por azufre ha

demostrado tener poco efecto en la actividad, mientras que la sustitución de ambos oxígenos

(posiciones 2 y 4) por azufre abolió completamente la actividad. De forma similar, la sustitución de

la posición 2 por un grupo amino proporcionó sustratos inactivos para la enzima. Las

modificaciones en la posición 6, como en el caso del 6-metiluracilo, 5,6-dimetiluracilo, 6-azauracilo

y 6-azatimina, también produjeron inactividad enzimática.

Con respecto a las sustituciones en el esqueleto desoxirribosídico, se ha mostrado que la

ribo-, la arabino-, y la xilofuranosiltimina no eran sustratos. Además fueron inactivos varios

desoxinucleósidos sustituidos en la posición 5’. Esto sugirió que la sustitución sobre los carbonos

en las posiciones 2',3' y 5' estaba involucrada en la unión de los sustratos al sitio activo de la

enzima.

1.3.4.2.1-Antecedentes gel usg de NP; en la síntesis gg nucleósidos.

A continuación se describirán algunos ejemplos representativos de síntesis biocatalizadas

de diversos nucleósidos tanto naturales como modificados utilizando NPscomo biocatalizadores.

Donarvicodin Bm nunca,“

n R143mm lGuanouru / N // N N

"W " I >CI>©D>I'dewlquanoml \1,3vdidosmpm \ ï N T T

R R R

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mmm". (gym-ammovna) m I \Z'demngunnounl “w” Á

N

‘I 4- I.

¡danos-nl '2' [mo 3' /NWÁOamoxlmdl <

R: desqnimhou o “bon

Figura 1.14. Síntesis enzimática de nucleósidos modificados en la base


Mikhaiiopulo et al.73utilizaron células de E. coli como bíocatalizador de las reacciones de

transglicosidación, utilizando como donores glicosídicos guanosina o 2'-desoxiguanosina y como

bases aceptoras 1-, 3-desaza y 1,3-didesazapurinas, para la síntesis de diversos desazapurín

nucleósidos(Figura 1.14). Por otro lado, Kalininchenkoet al." utilizaron una suspensión del mismo

biocatalizador, generada por el agregado de glutaraldehido, para Ia síntesis del anti-herpético

brivudína ((E)-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuridina) utilizando 2'-desoxiguanosina o timidina como

donor glicosídico y (fl-S-(Z-bromovinil) uracilo como aceptor. (Figura 1.14). En un ejemplo de

obtención de ribavirina, 424 cepas bacterianas fueron examinadas, siendo el Bacíllusmegateríum

AJ 3284 el identificado como el mejor candidato para la transferencia del resto ribosa de la

adenosina al resto 1,2,4-triazoI-3-carboxamida7s(Figura 1.14).

....... --- paloqulm—> DIMM-fl)

ddU

“¿p “¿QQ“¿en ' ÏXLÉÏZXÏQOÉ

“l ¡MA Ara-A Ar'l-Tl ¡AA ZAI

ou

Figura 1.15. Síntesis enzimática de nucleósidos modificados en el azúcar.

7’Zaitseva, G.; Kvasyuk, E.; Vaaks, E.; Barai, V.; , Bokut, 5.; Zinchenko, A.; Mikhailopulo, I.; Nucleosides Nucleotídes, 1994,13, 8197‘ Kalinichenko, E.; Barai, V.; Bokut, S.; Romanova, V.; Zinchenko, A.; Hermann, G.; Mikhailopulo, l.; Biotechnol. Len,1989, 11, 621


La síntesis de nucleósidos modificados en el azúcar ha sido llevada a cabo por el uso de

donores glicosídcos modificados“. De esta forma, Utagawa et al.77han obtenido arabino-, 2'

amino-2'—desoxi-y 2',3'-didesoxinuc|eósidos con buenos rendimientos. La estrategia sintética

empleada se resume en la Figura 1.15. Ésta consiste en Ia síntesis química de los donores

glicosídicos modificados partiendo de uridina (2'-amino-2'-desoxiuridina (2AU),uridín-arabinósido

(Ara-U)y 2',3'-didesoxiuridina (ddU), Figura 1.15), para luego generar el análogo nucleosídico por

medio de reacciones de tranglicosidación enzimática. De esta forma, se obtuvieron los siguientes

nucleósidos modificados: 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 2’,3'-didesoxiadenosina (ddA), adenín

arabinósido (Ara-A), 6-mercaptoinosín arabinósido (Ara-TI), 2'-amino-2'-desoxiadenosina (ZAA),

2'-am¡no-2'—desoxíínosina (2AI)(Figura 1.15). Otra estrategia utilizada en la síntesis de nucleósidos

tanto naturales como modificados, especialmente en el resto glicosídico, consiste en la sintesis

química de u-2-desoxirribósidos 1-fosfato y su conversión enzimática a desoxinucleósidos. La

síntesis estereoselectiva del azúcar fosfato fue llevada cabo por la aplicación de una

transformación asimétrica inducida por cristalización (Figura 1.16). Araki et al." han obtenido,

utilizando esta metodología, los desoxinucleósidos naturales 2'-desoxiadenosina, 2'

desoxiguanosina, 2'-desoxiinosina y timidina y el antiviral, 2',3'-didesoxi-3'-fluoroguanosina

(Figura 1.16).

R0 H R0 xauu-NH: R0 2 K‘ R0 Go n "30.. "nuiN 0 K0" 0 Gunmna o——> —> —>

cl u) L(¿Hu H_ OPOSH2 0P032- PNPF F F F

R—unn; R ' “"13!

Figura 1.16. Estrategia quimio-enzimatica empleada en la síntesis del antiviral 2',3'-didesoxi-3'

fluoroguanosina

Por último las NPs han sido utilizadas en la síntesis de nucleósidos modificados tanto en la

base como en el azúcar mediante la utilización de un azúcar modificado como donor glicosídico y

bases modificadas como aceptores. Así, Chae et al.79sintetizaron 2',5'-didesoxi-6-tioguanosina y

75Shirae, H.; Yokozeki, K.; and Kubota, K.; Agric. Biol. Chem., 1991, 55, 6057 Ver por ejemplo a) Morisawa, H.; Utagawa, T.; Miyoshi, T.; Yoshinaga, F.; Yamazaki, A.; Mitsugi, K. Tetrahedron Lett.,1980, 21, 479 , b)Utagawa, T.; Morisawa, H.; Yoshinaga, F.; Yamazaki, A.; Mitsugi, K.; Hirose, Y.;Agric. Biol. Chem., 1985,49, 1053n Utagawa, T.; Journal of molecular catalysis B:Enzymatic, 1999, 6, 2157°Komatsu, H.; Awano, H.; Ishibashi, H.; Oikawa, T.; Ikeda, I.; Araki, T.; Nucleic Acids 5ym.p 5er., 2003, 3, 10179Burns, C.; Koszalka, G.; Krenitsky, T.; Chem. Abstr., 1994, 120, 29465


5'-desoxi-6-tioguanosina utilizando 2',5'—didesoxitimídina y 5'-desoxiadenosina como donores

glicosidicosy 6-tioguanina como base aceptora, entre otros nucleósidos doblemente modificados.

Por otra parte, nuestro grupo ha utilizado células enteras para la síntesis enzimática de

diversos nucleósidos modificados. De esta manera se han obtenido con altos rendimientos

diversos 2,6-diaminopurín ribonucleósidos, -2'-desoxíribonuc|eósidos, -2',3'

didesoxiribonucleósidos y -arabinonucleósidos partiendo de uridina, timidina, 2',3'

dídesoxiuridina o 1-B-arabinofuranosil uracilo respectivamente, y la base 2,6-diaminopurina,

utilizando diversos microorganismos como fuentes de NPs”. Asimismo, se ha preparado el

nucleósido 9-B-D-arabinofuranosil guanina mediante el uso combinado de dos células enteras

como biocatalizador“. En este caso, se llevo a cabo la síntesis del 2,6-diaminopurín

arabinonucleósido mediante las citadas reacciones de transglicosidación, para luego llevar a cabo

una desaminación enzimática utilizando Arthrobacter oxydans como biocatalizador. Por último se

han obtenido benzimidazol ribo- y 2'-desoxinucleósidos partiendo de los nucleósidos pirimidínicos,

[82uridina y timidina y benzimidazo , entro otros ejemplos de síntesis de nucleósidos llevados a

cabo por nuestro grupo.

1.3.4.3- Fogogentomutasa (PPM).

La PPM cataliza Ia transferencia estereoselectiva de un grupo fosfato entre los hidroxilos

de las posiciones 5 y 1 de la ribosa y la desoxirribosa y análogos, tanto en microorganismos como

en células de mamíferos. En 1951 Klenow y Abrams83 reportaron la conversión de R-1-P a R-S-P

por una enzima de hígado de rata. AI mismo tiempo Manson y Lampen“ demostraron una

reacción análoga que involucraba desoxirribofosfatos en timo de ternera. La actividad

fosfopentomutasa en E. coli fue demostrada en 195235, pero fue Hammer-Jespersen86 quien

purificó y evaluó las diversas propiedades de ésta PPM. En ese trabajo se determinó que la

relación de la actividad de la enzima cuando se utilizaba R-1-P o desoxirribosa 1-fosfato (dR-l-P)

como sustratos era aproximadamente de 1:2, no siendo la glucosa-l-fosfato sustrato. Además, se

m Medici, R.; Lewkowicz, E.; Iribarren, A.; Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 39, 40al Medici, R.; Lewkowicz, E.; Iribarren, A.; Bioorganic And Medicina! Chemistry Letters, 2009, 19, 4210al Bentacor, L.;Trelles, J.; Nobile, M.; Lewkowicz, E.; Iribarren, A.; Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2004, 29,3

“3Abrams, A.; Klenow, H.; Arch. Biochem. Biophys., 1951, 34, 285‘ Manson, L.; Lampen, 1.: .l. Biol. Chem., 1951, 191, 9585Hoffmann,C.; Lampen, J.;J. Biol. Chem., 1952, 198, 88585Hammer-jespersen, K.;Petersen, A.; Eur. J. Biochem., 1970, 17, 397


demostró que la PPM presenta un requerimiento absoluto de metales divalentes para su

actividad. EICo‘z y el Mn‘2 tuvieron eI mismo efecto como activadores siendo la actividad siete

veces menor en presencia de Niz'. Otros metales divalentes exhibieron un efecto inhibitorio

presentando entre un 95-98% de inhibición en presencia de Cu‘z,Cd‘2y Zn‘2y entre un 50-70 % en

presencia de Ca‘2y Mg‘z. El sulfato y fosfato resultaron, asimismo, ser inhibidores observándose

un 85 % y un 95 % de inhibición respectivamente, con concentraciones SO mM de estas sales.

Otros tipos de cofactores evaluados fueron los glicósidos difosfato. En este sentido, se

compararon los efectos activadores de Ia ribosa-1,5-difosfato, la desoxirribosa-1,S-difosfato y la

glucosa-1,6-difosfato. Losdos primeros estimularOn la actividad diez veces mientas que el último

Io hizo sólo tres veces. Finalmente estos autores estudiaron la curva de actividad en función del pH

encontrando el pHóptimo alrededor de ocho.

Estudios posteriores demostraron que la PPMera una metaloproteina monomérica de 407

aminoácidos (Mr “ 45 kDa),con dos cationes metálicos divalentes por unidad.

Desafortunadamente, la estructura de Ia PPM de E. coli no ha sido resuelta, por lo que no

se cuenta con un modelo estructural de Ia misma. Si fue realizado un análisis de Ia conservación

aminoacídica en las secuencias de diversas familias de enzimas”. En ese trabajo se encontró que

las secuencias de las enzimas pertenecientes a Ia familia de las PPMs muestran similitudes

significativas con secuencias de fosfatasas alcalinas y con otras familias de enzimas, tales como las

sulfatasas, y diversas transferasas e hidrolasas, que actúan sobre sustratos similares

(carbohidratos fosforilados). Estas similitudes incluyen una elevada conservación de los residuos

del sitio de unión a metal de sus centros activos, y mecanismos catalíticos similares. Estos

hallazgos sugirieron a los autores que estas familias de proteínas pertenecían a una superfamilia

de enzimas, denominada superfamilia de Ia fosfatasa alcalina.

1.3.4.3.1-Antecedentes del uso de la PPM en lg síntesis de ngcleósidos.

LaPPM fue originalmente sobreexpresada por Valentin-Hansen et al."Bpero fue Wong89el

primero en comparar las actividades relativas de conversión de D-pentosas S-fosfatos a a

pentosas 1-fosfato usando un ensayo enzimático acoplando la PPM sobreexpresada con NPs. En

ese trabajo, se estableció que Ia PPM de Eco/i aceptaba como sustratos desoxirribosa S-fosfato

a7Galperin, M.; Bairoch, A.; Koonin, E.; Protein Science, 1998, 7, 1829m Valentin-Hansen, P.; Hammer, K.;Lo Larsen, J.; Svendsen, I.; Nucleic acids Res, 1984, 12, 5211


(dR-S-P), R-S-P y arabinosa 5-fosfato (A-S-P) pero no 2,3-didesoxirribosa S-fosfato.

Lamentablemente, los autores no informaron los rendimientos en las reacciones de síntesis de

nucleósidos ni sus actividades absolutas. Para el caso particular de desoxinucleósidos ha sido

reportado el uso sintético de la PPM de E. coli por Ouerkerk et al”, quienes llevaron adelante la

preparación de timidina y 2'-desoxiuridina marcada con 15Ny 13C.En esa publicación se reporta en

primer lugar, la sintesis por métodos químicos clásicos del sustrato de la PPM marcado, la dR-S-P.

Este sustrato es agregado entonces al sistema enzimático acoplado (PPM + TP), obteniéndose los

nucleósidos marcados con elevados rendimientos. En este mismo sentido, el grupo de Shímuzu91

desarrolló una síntesis microbiana "one-pot” de 2'desoxirribonucleósidos mediante el

acoplamiento de tres enzimas: la enzima 2-desoxirribosa 5-fosfato aldolasa (DERA),que produce

reversiblemente desoxirribosa 5-fosfato á partir de acetaladehido y gliceraldéhido 3-fosfato, la

PPM de E. coli y la enzima PNP. Laestrategia empleada se muestra en la figura 1.17.o

lll ° JLJrHo/ï\° H . “ac H OH ° OH

OH DERA

OH OH

PPM

HO a H0o B o

<—- op NP IIOH OH °_ï\on

OH

Figura 1.17. Preparación enzimática de desoxinucleósidos

Se han sobreexpresado PPMs de otras fuentes microbianas, como por ejemplo la PPM de

Bacíllus stearothermophí/us” . Esta enzima se utilizó para Ia síntesis de adenosina y análogos

acoplada con la PNP, utilizando como sustratos R-S-P; dR-S-P, A-5-P y 2,3-didesoxirribosa S

fosfato. Los cuatro azúcares fosfato fueron activos, observándose actividades relativas

porcentuales de 100, 156, 9 y 12 respectivamente. Otra PPM aislada fue la del microorganismo

‘9 Barbas lll, c.; Wong, c.; Bioorg. Chem., 1991, 19, 2619°Ouerkerk, N.; Steenweng, M.; Raap, 1.; J. Org. Chem., 2002, 67, 14809' Ogawa, J.; Saito, K.;Sakai, T.; Horinouchi, N.; Kawano, T.; Matsumoto, 5.; Sasaki, M.; Mikami, Y.;Shimizu, S.; Biosc.Biotechnol. Biochem., 2003, 67, 9339' Hamamoto, T.; Noguchi, T; Midorikawa, Y.;Biosci. Biotechnol. Biochem., 1993, 62, 1103


hipertermofílico Thermococcus kadkaraensís. Los autores sólo ensayaron la actividad con ribo y

desoxirribofosfatos, pero Iaenzima demostró ser activa a una temperatura de 90 °C”.

1.4- Introduccion a la sobreexpresión de proteínas

Laexpresión de proteínas recombinantes, desde el punto de vista biotecnológico, plantea

como principal objetivo Ia obtención de un alto contenido de la proteína de interés por unidad de

biomasa“. Enforma sintética, el proceso de sobreexpresión de proteínas recombinantes consta de

los siguientes pasos (Figura 1.18): en primer lugar se debe insertar el gen que codifica para la

proteína de interés en una construcción génica adecuada (vector de expresión). Ésta es

transfectada en una célula huésped competente. Luego, una vez alcanzada una biomasa

apreciable se induce Ia transcripción del gen en cuestión. Por último, se purifica la proteína

recombinante.

EIechón del vectorAplicaciónu objetivos experimentales con la proteina expresadaInformaciónconocida dela proteina.Selección dela estrategia de clonado: solubilidad/localizaciónsubcelularlfusión a tags/regulación de la expresión.

Preparación del Inserta de DNAplásmido y/o PCRlcorte con ERlpurificación

ILClonadodel Inserta dentro del vector

Ligación/transforrnaciónen huespedfidentificación.De clones positivos/verificacióndel producto clonado por secuenciación.

Preparación del vectorcodeconpnu . . .. _.¿

Transformacióndentro del huesped para expresión.

Inducclóny optlmlzaclón de la expreslón de la protelna de Interésanálisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica.

LD Scale-up ¡:9 Purfflcalóndela protelnay anállslsfunclonal

Figura 1.18. Diseño de una estrategia para la expresión de proteínas

93Rashid, N.; Imanaka, H.; Fukui, T.; Atomi, H.; Imanaka, T.; J. Bacteriol., 2004, 186, 4185


1.4.1. Selección del tigo de construcción génica y célula huésped

El rendimiento de Ia proteína recombinante respecto a la biomasa está determinado

principalmente por el tipo de construcción genética (vector de expresión) y por Ia capacidad

biosintética de Ia célula huésped, por lo que hallar el sistema de expresión de proteínas que

permita obtener grandes cantidades de la proteina recombinante, es básico, y de vital importancia

para cualquier estudio cuyo objetivo esté orientado hacia la producción biotecnológica. En este

sentido, se utiliza la ingeniería genética para lograr la correcta expresión a altos niveles de un gen

clonado en un microorganismo huésped. Sin embargo, la clonación directa (sin manipulación

adicional) de un gen en un vector no suele asegurar la correcta expresión del mismo, por esta

razón se deben seleccionar vectores especializados, y a menudo, incluir modificaciones de interés

con el objeto de que se pueda correctamente transcribir y traducirse en el microorganismo

huésped. Dentro de los aspectos que deben tenerse en cuenta c0n este fin, se pueden citar la

localización celular de Ia proteína a expresar (se pueden añadir señales de procesamiento post

transduccional adecuadas en la construcción genética para dirigir a la proteina), Ia estabilidad de Ia

proteína en la célula huésped y el número de copias del gen clonado, entro otros. En el proceso de

selección del sistema de expresión adecuado para la proteína de interés, se deben analizar

específicamente estos parámetros.

Concerniente a Ia selección de células huésped, se han utilizado de diversos orígenes,

tanto procariotas como eucariotas, siendo las primeras las más estudiadas. Eneste sentido, uno de

los microorganismos más utilizados es la bacteria Escherichia coli. Su uso radica en la gran

disponibilidad de herramientas de genética molecular, el gran número de cepas y mutantes, el

extenso conocimiento sobre su fisiología, vectores de expresión, estabilidad y plegamiento de

proteínas, estabilidad genética de las construcciones y por último, los efectos de la producción de

proteínas recombinantes sobre la célula.

Las proteinas recombinantes expresadas pueden ser tanto heterólogas (de un origen

diverso al huésped) u homólogas (del mismo origen). Laproducción de proteinas heterólogas en E.

coli es un proceso dinámico complejo que involucra muchos retos. Para el caso de proteínas

homólogas, el panorama se presenta con menores dificultades. En este trabajo se ha

sobreexpresado una proteína homóloga, la enzima fosfopentomutasa de E. coli. Sin embargo, Ia

9‘ Kramer, W.; Elmecker G.; Weik, R.; Mattanovich, D.; Bayer, K,Recombinant DNABiotechnology: The integration ofBiologicaland Engineering sciences, 1996, 323

1,4

lv¡Ï

.1

,4. Capítulo1. Introduccióny objetivos

expresión de proteínas homólogas puede conllevar a ciertos problemas como ser los de estrés

metabólico. Éstos se deben a la expresión en grandes cantidades de una proteína que se traduce

en un incremento de la actividad de proteasas, plegamientos inadecuados de proteínas y

formación de cuerpos de inclusión, todos los cuales pueden afectar la concentración final de la

proteína recombinante y el crecimiento celular.

A continuación se resumen los elementos genéticos que debe poseer un vector de expresión

en E. Coli:

Un promotor eficiente, para producir altos niveles de ARNm

Cercano al promotor, una región que al transcribirse suministre el sitio de unión al

ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Delgarno.

Luego del gen a clonar, una secuencia que funcione como terminador de la transcripción.

Si se requiere, una proteína de fusión (ésta puede facilitar el proceso de purificación,

protegerla ante Ia proteólisis o incrementar la solubilidad y la estabilidad de la proteína).

dP/“geerIof/webPP/vectordb/bact vectors/La dirección http://www “NHL L

corresponde a una base de datos de los diferentes vectores de expresión comerciales

disponibles actualmente para E. coli. Cada uno de estos sistemas tiene caracteristicas

particulares, tanto en el diseño del vector, como del hospedador. Elsistema utilizado en esta

tesis se denomina pRSET-A.(Figura 1.19)

¡mimi

Figura 1.19. Mapa del vector pRSET

Elvector pRSET.Aes útil para la expresión de altos niveles de proteínas procariotas controlada

por el promotor fuerte del bacteriófago T7. Laexpresión es inducida por Ia producción de la ARN

polimerasa en células de E. coli 8L21(DE3)pLysS.Estas células pueden también producir la lisozima

T7 con el objeto de reducir Ia expresión basal de los genes de interés. Este vector posee una


secuencia que codifica para una cola de seis histidinas en la posición N-terminal. Esta secuencia

tiene como objeto facilitar la posterior purificacióndela proteína recombinante por cromatografía

de afinidad. Asimismo, posee un sitio de hidrólisis de la proteasa enteroquinasa, con el objeto de

remover, en caso que fuera necesario, las histidinas añadidas a la proteína de interés.

1.5- Inmovilización de Enzimas

1.5.1- Generalidades.

A pesar de las claras ventajas del empleo de enzimas como catalizadores en procesos

industriales, existen un número de problemas prácticos en el uso de las mismas. En primer lugar,

la mayoría de los biocatalizadores no son estables en las condiciones de trabajo, lo cual resulta en

una vida media operacional de la enzima más corta. Asimismo, a diferencia de los catalizadores

químicos convencionales de fase heterogénea, la mayor parte de las enzimas actúan en fase

homogénea, por lo que son muy difícilmente recuperables en su forma activa a partir de las

mezclas de reacción para un posterior reuso. Es entonces que la inmovilización enzimática, al

transformar a las enzimas en un catalizador heterogéneo, es una metodología muy efectiva para

superar estas limitaciones.

Se puede definir entonces la inmovilización enzimática, como un proceso en el que se

confina o localiza al biocatalizador en una región definida del espacio, para dar lugar a formas

insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente”.

PosteriOrmente esta definición se ha ampliado al de un proceso por el cual se restringen, completa

o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su

unión a un soporte, tal que se pueda reutilizar.96

Se pueden destacar tres aspectos interesantes incluidosen la definición:

"Confinados o localizados": para cumplir con esta condición es necesario formar una fase sólida

dispersa, macroscópica, de alta densidad y catalíticamente activa, dentro de, o en contacto con,

un medio reactivo líquido libre de biocatalizador. Lascaracteristicas de la fase sólida son tales que

951er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA,1971.9°Taylor, R. Protein Immobilization:fundamenta/s and applications, Marcel Dekker, New York,1991

OOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOO0.0...’...OO0.0.000.00.1


el transporte de reactivos hacia y desde el biocatalizador está gobernado por difusión

exclusivamente.

"Retención de la actividad catalítica": los tratamientos a los que son sometidas las enzimas libres

que serán inmovilizadas afectan en cierto grado su actividad. Si bien es deseable, no es necesario

que se retenga el 100% de la actividad del biocatalizador libre, pero, para mantener la viabilidad

del proceso, en general es deseable no tener valores de actividad inferiores al 25% de la actividad

de la enzima libre. La inmovilización, entonces, debe tratar de ser realizada en condiciones tales

que la pérdida de actividad sea reducida.

"Uso repetido y continuo": surge inmediatamente que la gran ventaja del uso de biocatalizadores

inmovilizadas; se relaciona con la fácil separación del catalizador del medio de reacción sin pérdida

de actividad, y por consecuencia directa, con su reutilización.

Como se ha citado previamente el uso de los biocatalizadores inmovilizados ha introducido

diversas ventajas con respecto a los mismos en solución o libres. Éstas se pueden resumir:

1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima inmovilizada, por lo que en

comparación con las enzimas libres en solución son más robustas y más resistentes a cambios

bruscos en el entorno

2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimática por la capacidad de reutilización

(sistema enzimático heterogéneo)

3.- Se aumenta Ia facilidad de recuperación y purificación de los productos

4.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseños de procesos (configuración de reactores)

Sin embargo el confinamiento de los biocatalizadores presenta ciertos inconvenientes”,

entre los cuales se pueden mencionar:

1.- Generalmente, se observa una disminución de Ia actividad del biocatalizador durante el

proceso de inmovilización. Esto se origina posiblemente por la alteración de la conformación de la

enzima respecto a su estado nativo


2.- La gran heterogeneidad del sistema biocatalizador-soporte, donde pueden existir distintas

fracciones de un mismo biocatalizador inmovilizado con una notable diferencia de carga

enzimática

3- El aumento de los problemas difusionales, estos disminuyen la actividad aparente del

biocatalizador inmovilizadoprincipalmente por limitaciones de transferencia de masa

1.5.2- Métodos de inmovilizaclón

Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es

necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que dependerá del tipo de actividad

catalítica de interés. Existen una variedad de métodos por los cuales se puede localizar o confinar

un biocatalizador, desde la unión covalente de los mismos a un soporte o carrier, hasta su

atrapamiento físico, sin embargo pueden ser clasificados en términos generales de la siguiente

manera‘38(Figura 1.20):

o Unión covalente a matrices derivatizadas, insolubles en agua

o Entrecruzamiento intermolecular de moléculas de enzima, utilizando agentes

polifuncionales

o Adsorción de los biocatalizadores sobre matrices insolubles en agua

o Atrapamiento de los biocatalizadores dentro de polímeros insolubles en agua

o Encapsulacióndentro de membranas semi-permeables

97Arroyo, M.; Ars. Pharmaceutica, 1998, 39, 23

P.W. Carr and LD. Bowers, "Immabilízed Enzymes ¡n Analytical and ClinicalChemistry. Fundamentals andApplications", Wiley, New York, 1980.


l Adsordón J [UnionCovueme]oC::: cro

o 35:; °vaaa “oGelopolirnero Micelasreversas Entrenimiento

Encapsuladón::::i:Fibrahueca reactores de

membrana

Co-entreauumlento

= Biocatalizador (enzima o célula entera)

=carrier o soporte

Figura 1.20. Tipos de inmovilización.

Own/vu =surfactante

1.5.3- " ' " del métodode' "' "

Los requerimientos necesarios para la construcción de un eficiente complejo bioinmovilizado

incluyen:

o Alta densidad de biomoléculas inmovilizados

o Alta actividad

o Prolongada estabilidad bajo condiciones potencialmente adversas

o Buena accesibilidad de los analitos

o Tiempos de respuesta rápidos

o Resistencia a la lixiviacióny/o desorción

A pesar de la elevada cantidad de inf0rmación sobre las técnicas de inmovilización

enzimática, el desarrollo de un biocatalizador inmovilizado robusto que satisfaga los

requerimientos de los procesos biocataliticos modernos, todavía depende de experimentos

laboriosos de prueba y error. No existe un método universal y válido para todos los sistemas. Se


requiere una solución específica para cada aplicación individual. No obstante la información

disponible en la actualidad permite hacer algunas generalizaciones sobre los diferentes métodos

de inmovilización (Tabla 1.2)” y así poder racionalizar en alguna medida Ia selección de Ia

metodología más adecuada.

Unión

Encapsulación Atrapamiento Entrecruzamiento Adsorción covalente

Preparación Intermedia Sencilla Intermedia Sencilla Dificil

Fuerza de unión Débil Media DébiI-media Débil-media Fuerte

regeneración delsoporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil

actividad enzimática Media-alta Baja Baja Media Alta

Costo del proceso Medio-alto Medio Medio Bajo Alto

Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta

Validez General General Limitada General LimitadaResistenciamicrobiana SÍ SÍ Sí Si Sí

Tabla 1.2. Comparación de los diferentes métodos de inmovilización

En general, los métodos de dificil preparación y de mayor costo proporcionan

biocatalizadores más estables y duraderos, mientras que los métodos más sencillos como el

atrapamiento o la adsorción, donde la interacción con el biocatalizador es débil, originan

derivados inmovilizadosque presentan mayor pérdida de actividad.

1.5.4- Atragamiento de enzimas por tecnologia sol-gel

1.5.4.1-" " ' " v " del proceso sol-gel.

El sol-gel es una ruta química que inicia con la síntesis de una suspensión coloídal de

partículas sólidas o cúmulos en un liquido (sol), formada a partir de la hidrólisis de un precursor

9°Working party of Immobilized Biocatalysts. Enzyme Mícrob. Technol., 1983, 5, 304


organometálico; y la hidrólisis y condensación de este sol para formar un gel, o sea, un sólido

consistente de al menos dos fases, donde una fase sólida forma una red rígida e interconectada

con poros que atrapa e inmovilizauna fase liquida“.

Una característica muy importante que presenta este proceso es que se puede trabajar a

temperaturas muy bajas obteniendo materiales puros con un alto grado de homogeneidad.

Elproceso sol-gel se esquematiza en Iafigura 1.21.

8888888 oooooooo ‘Epgooooooo d?

Punlculn mnormu su lle

m Enpondón Ennchk\\ \\ dd¡Olmo con¡olmosPollch do Xorogol

l calentamientokm un”al“

Pdlculduna ifln/ la]"'00" ¡«ogol

Cortmlco domo

Figura 1.21. Esquema del proceso sol-gel

Los desencadenantes de la transición sol-gel son las reacciones de hidrólisis y

condensación de alcóxidos metálicos que ocurren simultáneamente. En general, un aumento del

pH, inicia los eventos de condensación y separación de fase. Lasreacciones involucradas son:

Hidrólisis: Si(0R)4+n HZO—> S¡(OH),.(OR).,.fl+ n ROH(n =1 a 4)

Condensación: "'Si-OH+ H0-Si"'—> '“Si-O-Si"'+HZO

"'Si-OR' + HO-Si"'————> "'SÍ-O-SÍ‘"+ R'-OH

Una vez formado el hidrogel, éste es envejecido por un período de tiempo para permitir Ia

terminación de las reacciones de condensación y Ia maduración del entramado poroso. Este

entrecruzamíento produce un encogimiento del hidrogel por la contracción del entramado poroso

y la consecuente expulsión de agua por sinéresis. Finalmente este hidrogel es secado,

consolidando la estructura con colapso de poros y mayor encogimiento (xerogel). Se requiere en

"'° Brinker. 1.;Scherer, G.; Sol GelScience, Academic Press mc, 1990. ISBN042-1349705


esta etapa un secado controlado (ej: vía Iiofilización) para evitar el colapso extremo de la

estructura con la consiguiente perdida de porosidad y viabilidad de la biomolécula. EIagregado de

aditivos para el control del secado o el uso de precursores del tipo gliceroxisilanos puede

sustancialmente reducir el colapso de poros y acelerar el proceso de secado, obteniéndose altos

niveles de actividad de la biomolécula. Es importante señalar que la rehidratación de los xerogeles

resulta en una considerable expansión del entramado poroso.

1.5.4.2- Atra ami nto de bi molécula ví el roceso sol- el ¡lic

El procedimiento de atrapamiento de biomoléculas debe ser conducidos a pHs,

condiciones redox y temperaturas biocompatibles, así como se deben minimizar el uso de

solventes y especies orgánicas reactivas. Por lo que el atrapamiento de biomoléculas vía procesos

sol-gel se ha basado en la química del SiOz,debido al carácter mayoritariamente inerte de esta

matriz. Los precursores más utilizados han sido el TEOS (tetraetilortosilicato) y TMOS

(tetrametilortosilicato).

Esta tecnología ofrece algunas ventajas únicas para la inmovilización de especies

biológicas

o La polimerización sol-gel ofrece la única ruta conocida hasta hoy, para incorporar

biomoléculas Iábiles en materiales cerámicos fisicoquímicamente robustos para formar

verdaderos nanocompuestos.

o Laflexibilidad intrínseca de los polímeros sol-gel basados en la química de sílice puede ser

aprovechada para efectuar el atrapamiento en un rango diverso de materiales inorgánicos

u orgánicos-inorgánicos híbridos, pudiéndose incluir aditivos poliméricos así como

modificadores redox.

o Pueden ser materiales ópticamente transparentes, haciéndoles ideales para el desarrollo

de sensores. La adición de modificadores redox permite asimismo la construcción de

dispositivos electroquímicos.

o Se pueden utilizar métodos convencionales de fabricación para formar bioencapsulados

como monolitos, nano-, micro- y macropartículas, fibras, y diversos films, con una

distribución y tamaño de poro controlable.

Aún no se conoce con exactitud el mecanismo de atrapamiento y retención de biomoléculas.

Las investigaciones sugieren que el bioatrapamiento deriva de la internalización física dentro de


las partículas del sol-gel y/o interacciones fuertes entre la proteína y las superficies del gel,

suficientes para impedir el Iixiviado,permitiendo, sin embargo, la retención de la movilidad global

dela biomolécula.

Un problema que puede aparecer en ciertos casos, es la disrupción de la estructura del sitio

activo provocada por interacciones electrostáticas con la matriz aniónica de sílica, lo que suele

producir una disminución dela actividad biológica dela biomolécula.

Existen diversos tipos de matrices de inmovilización via la tecnología sol-gel, entre los cuales

se incluyen sol-gel inorgánicos, sol-gel de silicatos modificados orgánicamente, IPN(red polimérica

interpenetrada), sol-gel reforzados, sol-geles basados en templados, etc. Se discutirá en este

capitqu el último, ya que fue el utilizado en este trabajo.

1.5.4.3- Sol-gel basados en un‘ ' ‘ (direct ‘ ' ‘ “ ‘

Lossol-geles pueden ser moldeados con estructuras directoras y agentes formadores de

poro, incluyendo polioles, hidroxiácidos, PEG, surfactantes y co-polímeros. Estos compuestos

forman microemulsiones, fases cristalinas vesiculares o líquidas, macroemulsiones, espumas o

agregados, y, de esta forma dirigen la formación del sol-gel o Ia separación de fases durante la

gelificación modificando la estructura del sol-gel. Es así posible obtener entonces los materiales

ordenados, macro- o meso- porosos, por remoción de los templados luego del envejecimiento del

gel.

‘°’,utilizando un proceso deEn este trabajo se ha utilizado hielo como templado

tratamiento denominado "Ice Segregation Induced Self Assembly' (ISISA).Éste es un templado

económico, no requiere procesos extremos para su remoción sino procesos biocompatibles y poco

contaminantes. El procesamiento por Ia metodología de ISISAinvolucra la exposición de un gel

acuoso a temperaturas del orden del nitrógeno líquido. La rápida formación de hielo (en forma

hexagonal) causa que cada soluto originalmente disperso en el gel acuoso sea segregado de la fase

acuosa, dando lugar a ensamblados jerárquicos caracterizados por "vallas" de materia encerradas

en áreas vacías, siendo estas áreas las que ocupaba el hielo previamente a ser removido p0r

diversas metodologías, como ser la Iiofilizaciónm.

m Nishihara, H.; Mukai, S.; Fujii,Y.;Tago, T.; Masuda, T.; Tamon, H.; .I.Mater. Chem., 2006, 16, 3231m Gutierrez, M.; jobággy, M.; Rapun, N.; Ferrer, M.; Del Monte, F.;Adv. Mater., 2006, 18, 1137


Con el objeto de preservar Ia actividad enzimática y mejorar las propiedades mecánicas del

biocatalizador inmovilizado se puede:

1.5.4.4- Anteceden es el atra rnl n e nzim

Añadir aditivos (por ejemplo polímeros): éstos pueden condensar con los grupos silanoles

resultando en la formación de enlaces Si-O-polímero, favoreciendo la formación de una

red polimérica interpenetrada que puede aumentar Ia resistencia del material, haciéndolo

menos quebradizo. Asimismo, puede preservar la actividad enzimática impidiendo la

desnaturalización de la enzima por su interacción con los grupos silanoles de la superficie.

También puede actuar como crioprotector"M

Utilizar precursores modificados biocompatibles: éstos al ser hidrolizados liberan grupos

biocompatibles disminuyendo la desnaturalización proteica (en el caso de utilizar TEOS

como precursor, se libera alcohol etílico). Asimismo,pueden ser disueltos directamente en

agua y condensan a pH neutros, eliminando Ia necesidad de alteraciones abruptas en el pH

durante el procesamiento del gel‘”. Estos materiales de partida, asimismo, generan

materiales con menor grado de encogimiento, menor diámetro de poro y propiedades

mecánicas mejores que los materiales basados en TEOS‘“.

lllz nd sistemas sol- el de sílica

Elproceso sol-gel, como una ruta para la formación de compuestos vítreos inorgánicos ha sido

ampliamente conocido por más de un siglo, sin embargo el primer reporte en el cual se

demostraba el uso de materiales derivados de silicatos para el atrapamiento de enzimas recién se

publicó en los años 50, cuando Dickey105mostró que diversas enzimas (tales como la ureasa,

catalasa, adenilato desaminasa y citocromo C) podían ser atrapadas con parcial retención de su

actividad biológica, en matrices derivadas de estos materiales. A pesar de los trabajos citados

previamente, el avance crucial en Ia bioencapsulación o atrapamiento vía sol-gel, fue dado por el

esfuerzo pionero de Avniry colaboradores“, quienes a principios de Ia década del 90 publicaron

un reporte describiendo el atrapamiento de proteínas dentro de derivados de silicatos formados

por el uso de alcoxisilanos simples (TMOS y TEOS) usando la metodología sol-gel. Los trabajos

iniciales en esta área fueron restringidos al atrapamiento de hidrolasas modelos tales como la

1:: Chery, H.; Tameki, R.; .1.Am. Chem. Soc., zooo, 122, 10063losBrandhuber, D.; Torma, V.; Raab, C.; Peterlik, H.; Kulak, A.; Husing, N. Chem. Mat., 2005, 17, 4262

Dickey, F.; J.Phys. Chem., 1955, 58, 695meBraun, 5,; Rappoport, S.;Zusman, R;Avnic, D.; Ottolenghi, M.; Mater. Letter, 1990, 10, 1

S3 Capítqu 1. Introducción y objetivos

tripsina y la fosfatasa ácida, pero poco fue investigado acerca de las aplicaciones sintéticas. Retz y

colaboradores‘07 fueron los primeros que establecieron las utilidades prácticas de los

biocatalizadores basados en la tecnologia sol-gel con sus estudios acerca del atrapamiento de

Iipasas en compuestos basados en silanos modificados orgánicamente (ormosil). Estos

biocatalizadores han sido utilizados para catalizar reacciones de hidrólisis regio-, quimio- y

enantioselectiva, reacciones de esterificación y transesterificación de ácidos carboxílicos, alcoholes

y ésteres y Ia acetilación de aminas en medio acuoso y orgánico. Además de hidrolasas se han

inmovilizado en este tipo de materiales proteasas, glicosidasas, fosfatasas alcalinas, fosfolipasas y

péptidos, glicosidos,oligosacaridosy lípidosbioactivos, entre otros“

Laflexibilidad y el poder del atrapamiento sol-gel se demuestra fehacientemente con su

aplicación a la preparación de biocatalizadores multienzimáticos. Por Io que se ha demostrado que

la co-inmovilizacion o co-atrapamiento de enzimas que catalizan reacciones consecutivas puede

llevar a un aumento de la eficiencia catalitica y productiva, presumiblemente debido a la

proximidad de los centros cataliticos, resultando en una eficiente transferencia de los

intermediarios de Ia reacción entre las enzimas, aumentando efectivamente su concentración

localm.

Se han reportado trabajos que se basan en Ia química del sol-gel para el atrapamiento de

enzimas, utilizando polímeros como aditivos, utilizando el proceso de ISISApara Ia obtención de110materiales altamente organizados . Un ejemplo es la inmovilización de una Iipasa (Iipasa de

higado de cerdo, PLE)utilizando PVAcomo aditivo.

1.6- Modelización de proteínas

La forma ideal de obtener información estructural para una proteina dada es determinar la

estructura por cristalografía de rayos Xo espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN).

Sinembargo, existen una serie de problemas:

m Ver por ejemplo: a) Reetz, M.; Adv. Marer., 1997, 9, 943, b) Reetz, M.; Wenkel, R.;Avnic, D.; Síntesis, 2000, S, 781, c)Reetz, M.; Zanta, a.; Vijayakrishnan, K.;Schimassek, K.;J. Mol. Cat. A, 1998, 134, 251m Ver por ejemplo: a) Kuncava, C.; Shel, M.; J. Sol Gel Sci. Technol., 1997, 8,667, b) Pierre, A.; Buisson, P.; J. mol. Cata].B, 2001, 11, 639, c) Han, A.; Foglia, T.; Shen, 5.; Biotechnol. AppI. Biochem., 2000, 37, 179‘°" Liu,s.; Sun, Y.;Bíosensors & bioelectronícs; 2007, 22, 905m Gutierrez, M.; jobággy, M.; Rapun, N.; Ferrer, M.; Del Monte, F.;Adv. Mater., 2006, 18, 1137


o Algunas proteínas no pueden ser cristalizadas fácilmente. Se encuentran a menudo

dificultades en Ia purificación de Ia cantidad suficiente de proteína, obtención de

cristales para la difracción de rayos Xy otros aspectos técnicos.

o Lacristalografía puede tardar desde varios meses a varios años para resolver/analizar

la estructura de una proteína simple.

o La resonancia magnética nuclear es, en promedio, más rápida que la cristalografía

pero no puede aplicarse hoy en día a proteínas con un gran número de residuos.

o Algunas proteínas que se obtienen son demasiado grandes para el análisis RMNy no

pueden ser cristalizadas para aplicarla difracción de rayos X1“.

Dado que determinados residuos presentan una mayor frecuencia relativa de aparición en

las estructuras secundarias y que Ia información necesaria para el correcto plegado de una

proteína parece estar contenida en su estructura primaria, uno de los grandes retos de Ia

bioinformática es Ia predicción de Iaestructura terciaria de las proteínas.

1.6.1- Métodos de modelización de proteínas

La predicción de la estructura a partir de Ia secuencia de aminoácidos resulta dificil,

fundamentalmente debido a las interacciones de largo alcance que estabilizan las estructuras

secundaria y terciaria. Para intentar resolver este problema se han diseñado tres aproximaciones:

o Modelado por homología

o Threading o reconocimiento de plegamiento

o Métodos ab initío’”

En la modelización por homología, la construcción del modelo tridimensional de la proteína de

estructura desconocida se basa en una o más proteínas relacionadas de estructura conocida

(templados). Losmétodos de reconocimiento de plegamiento o threading se basan en el hecho de

que las proteínas generalmente adoptan plegamientos similares a pesar de que no haya una

similitud significativa de secuencia o funcional. Los métodos ab ¡nitío predicen Ia estructura 3D a

partir únicamente de su secuencia, lo que equivale a conocer el mecanismo de plegamiento de las

m Krieger, E.; Nabuurs, S.; Vriend, G.; Homology modelling. Structural Bioinformatía. Edit. Philip E. Bourne y HelgeWeissig, by Wiley- Liss, Inc. 2003“1 Fiser, A.; Sali, A; Protein Science, zooo, 9, 1753


proteínas. Parten de Ia conformación extendida de un péptido, reducen los grados de libertad de

la proteína, mediante los denominados "modelos de complejidad reducida" (reduced comp/exity

mode/s) y utilizan funciones energéticas, normalmente derivadas a partir de bases de datos

(knowledge-based) para evaluar cada una de las geometrías obtenidas.

En el presente trabajo se ha utilizado el método de modelado por homología para la

predicción de Ia estructura tridimensional dela PPMde E.coli.

1.6.2- Modelado por homología.

El modelado por homología utiliza estructuras determinadas experimentalmente

(templados) para predecir la conformación de otra proteína (target) que tiene una secuencia de

aminoácidos similar al templado. Esta aproximación a la modelización de proteínas es posible

debido a que pequeños cambios en Ia secuencia de una proteína usualmente resulta en un

pequeño cambio en su estructura tridimensional. Se asume, de esta forma, que la estructura se

conserva en mayor medida que Ia secuencia, de modo que si la proteína que se quiere modelar

presenta más de un 30% de identidad con una proteina de estructura conocida, ambas proteínas

pueden considerarse estructuralmente semejantes.

Las condiciones necesarias entonces para construir un correcto modelo de la proteína

target basada en esta metodología son que la similitud entre la secuencia target y eI/los

templado/s sea elevada y que las secuencias puedan ser correctamente alineadas.

La modelización por homologia es el único método que actualmente puede proporcionar

modelos con un error en la desviación cuadrática media (RMSD)respecto al experimental inferior

a 2 Ám.

Enresumen, la modelización por homología se basa en dos grandes observaciones“:

o La estructura de una proteína está únicamente determinada por su secuencia de

aminoácidos. Conocer Ia secuencia debería ser suficiente, al menos en teoría, para

obtener la estructura.

o Durante la evolución, Ia estructura es más estable y cambia más lentamente que Ia

secuencia asociada, con lo que secuencias similares adoptan prácticamente idénticas

"a Sanchez, R.; Sali, A.. Current Opinion in Structural Biology, 1997, 7, 206“‘ Kinch, L.; Grishin, N.; Curr. Opin. Strucl’. BioI., 2002, 12, 400


estructuras, y secuencias relacionadas distantes en el tiempo todavía se pliegan en

estructuras similares.

Para llevar a cabo esta metodología se siguen usualmente los siguientes cuatro pasos115

(Figura 1.22):

1. Búsqueda y selección de templados

2. Correcto alineamiento secuencia templado- secuencia target.

3. Construcción y evaluación del modelo.

4. Refinamiento del modelo obtenido.

Figura 1.22. Modelado por homología.

Cada uno de estos pasos se describe a continuación.

1.6.2.1- Búsgueda de tgmglados

La modelización por homología comienza con la búsqueda de estructuras de proteínas

conocidas en una base de datos, típicamente el Protein Data Bank (PDB)“‘usando Ia secuencia de

la proteina que se desea modelar como referencia. Las secuencias en la base de datos se

comparan con la de referencia con el objeto de evaluar el grado de similitud existente entre

“5 Jones, D.; A Practical Guide to Protein Structure Prediction. Edit. por Webster, D.; Ed. Humana Press lnc.,Totowa, NJ,2

“6 Berstein, F.; Koetzle, T.; williams, G.; Meyer, E.; Brice, M.; Rodgers, J..; Kennard, 0; Shimanouchi, T.; Tasumi, M. J.Mol. Biol. 1977, 112, 535

S7 Capítulo 1. Introducción y objetivos

secuencias. Existen diversos métodos para Ia comparación seCUencia - secuencia, así como

muchos servidores de buscadores en base de datos. En este trabajo se utilizó el servidor

denominado HHpred server (Homology detection & structure predictíon by HMM-HMM

“7. Elprocedimiento de búsqueda que emplea el servidor se describe resumidamentecomparison)

a continuación: en primer lugar, se construye un alineamiento de secuencias homólogas a Ia

secuencia depositada de la proteína target, por medio de iteraciones múltiples de búsquedas en el

PSI-BLASTcontra una base de datos no redundante depositada en el sitio de NCBI.Se predice

asimismo la estructura secundaria de Ia proteína. En el paso siguiente, se genera un perfil de

modelo oculto de Markov (HMM profiles, describen una familia o patrón de secuencias) a partir

del alineamiento múltiple que incluye la información acerca de la estructura secundaria predicha.

El modelo de Markov se compara luego, con cada HMM en la base de datos seleccionada

(comparación de HMM-HMM).Se ha reportado que el uso de esta metodologia, ofrece resultados

o alineamientos en menor tiempo, más sensibles (en particular en la búsqueda de homólogos

remotos) y más precisos que las metodologías más sencillas de comparación de pares de

residuosm.

Una vez obtenida la lista de los posibles templados, se selecciona/n eI/los más apropiado/s,

para realizar el modelado. Loscriterios para seleccionar el/Ios templado/s óptimo/s son:

o Secuencias de mayor porcentaje de similitud con la secuencia target (mayor porcentaje de

residuos idénticos y menor número de huecos, gaps, en el alineamiento).

o Otros factores que incluyen: ser el templado más cercano a la familia de la secuencia

target, similitud en el entorno del templado con respecto al del target que precisa ser

modelado (solvente, pH, Iigandos, etc.), calidad dela estructura experimental.

1.6.2.2-Correcto " ' ‘ ' ‘ ' J ' target.

Este paso, en el que se establecen equivalencias estructurales y/o secuenciales entre la

secuencia target y el templado es el más importante. Elalineamiento es relativamente simple de

obtener cuando Ia identidad de la secuencia target-templado está por encima del 40% con

métodos de alineamiento secuencia-secuencia automáticos estándares. Elcorrecto alineamiento

de secuencias influirá gravemente en la precisión del modelo obtenido. Altas identidades de

“7 Sóding, 1.; Biegert, A.; Lupas; A.; Nucleic Acids Research, zoos, 33; w244-w24a“a SódingJ. Bioínformatics, zoos, 21, 951-960


secuencias (2 70%) generan modelos de alta precisión, con desviaciones (RMSD)de la estructura

nativa menores de 1 Á. Pobres identidades de secuencias (< 35 %) indica generalmente que el

alineamiento presenta huecos y alto porcentaje de residuos no alineados, por lo que se obtienen,

en general, modelos pobres con RMSDmayores a 3A. Identidades de secuencias intermedias (35%

-70%) generaran modelos con RMSDintermedios a los valores citados previamente, como se

muestra de forma aproximada en la figura 1.23.

Proteínas homologasr I Ie r\

1.9 r \. i1.6 - \ 1.4 - “

.. 1.2 - \\ .5 l _ ‘\ _D \\g 9.a — a\ .a: a 6 _ \\ ..

G.4- \\9.a

e l l l Le za ae se se ¡ao

%identidad

Figura 1.23. Representación de la variación en los valores de RMSDcon el porcentaje de similitud entresecuencias.

1.6.2.34“ " v ' ” del model;

Una vez construido el alineamiento target-templado, se pueden utilizar diferentes métodos

para la construcción del modelo 3Ddela proteína target.

o El método original es el montaje de cuerpo rigido o rígid-body assembly'”. Este método

construye el modelo a partir de pequeñas regiones del core, de loops y de cadenas

laterales, obtenidas al desagrupar y observar estructuras relacionadas.

o Otra familia de métodos se basa en las posiciones aproximadas de átomos conservados de

los templados para calcular las coordenadas de otros átomos12°.

o EItercer grupo de métodos, el cual modela por satisfacción de restricciones espaciales, usa

tanto distancias como técnicas de optimización para satisfacer restricciones espaciales

obtenidas del alineamiento de la secuencia target con las estructuras del templado. Estos

1‘9Blundell,T.;Sibanda, B.;Sternberg, M.; Thornton, 1.; Nature, 1931, 326, 347”° Levitt, M.;. J. Mol. Biol. 1992, 226, 507

L:. r,

¿sk Capítqu1. Introducciónyobjetivos

métodos son implementados por programas como Modellerm. Este programa fue el

utilizado en esta tesis para generar el modelo aproximado.

Después de la construcción del modelo, es importante comprobar Ia presencia de errores. Se

pueden llevar a cabo dos tipos de validacionesm:

o Evaluación interna de la consistencia del modelo, la cual comprueba si el modelo satisface

las restricciones usadas para calcularlo.

o Evaluación externa, la cual se refiere a información que no ha sido usada en el cálculo del

modelo.

Para la evaluación se utilizó la versión en linea del programa Verify3D. Este programa analiza la

compatibilidad de un modelo atómico (3D) con su propia secuencia de aminoácidos (ID). Se le

asigna a cada residuo una clase estructural sobre la base de su ubicación y entorno (alfa, beta,

giro, polares, no polares, etc.). Se utiliza una colección de estructuras correctas como referencias

para obtener un score o puntuación para cada uno de los 20 aminoácidos en cada clase

estructural. Laspuntuaciones se grafican, mostrando la fiabilidad del modelo atómico obtenido.

Asimismo se ha utilizado como criterio de validación el gráfico de Ramachandran (Figura 1.24),

en éste se grafican los valores de los ángulos Psi-Phi para todos los aminoácidos. Idealmente se

espera que al menos el 90% de los aminoácidos se encuentren en las regiones "más favorables"

que se observan comúnmente en las proteínas.

A- B

n- (dm-u)

Figura 1.24. A- Esquema del enlace peptídico mostrando los ángulos que lo definen. B- gráfico de

Ramachandran: lndican las zonas de dispersión aceptables para los valores de los ángulos de torsión

m Sali, A.; Blundell, 1.; J. Mol. Biol. 1993, 234, 779m Lüthy, R.; Bowie, J.; Eisenberg, D.; Nature, 1992, 356, 83

_ (.5,. ¿.5 Capítqu 1. Introducción y objetivos

1.6.2.4- Refinamiento del modelo obtenido.

La última parte del modelado por homología puede consistir en un número diverso de

pasos, según sea la precisión del modelo obtenido y el requerido (o sea, como se ha explicado con

anterioridad del porcentaje de similitud y número de huecos encontrados entre la secuencia

target y la del templado). Más allá de los pasos comunes de refinamiento por optimización de

geometría molecular y dinámica molecular (que se detallarán a continuación), en el caso de

metaloproteínas se añade la necesidad de incorporar los metales al modelo obtenido.

Optimización de geometría o minimización de energia.

Existen dos grandes áreas en química computacional para eI desarrollo de modelos

moleculares: las técnicas de Mecánica Molecular (modelos clásicos) y las de Mecánica Cuántica

(modelos cuánticos).

Esta parte de la modelización molecular de la proteína se desarrolló mediante el uso de

técnicas de mecánica molecular. La mecánica molecular considera los átomos como bolas unidas

por resortes (representando los enlaces entre átomos) según los criterios de la física clásica. A

pesar de reducir la precisión en la descripción de los sistemas, los métodos de mecánica molecular

permiten abordar satisfactoriamente problemas a una escala de tamaño o de tiempo de

simulación mayor que los que se basan en Ia mecánica cuántica

Para definir el sistema en Mecánica Molecular, se utilizan los denominados campos de

fuerza o force flelds‘”. Loscampos de fuerza están caracterizados por un conjunto de ecuaciones

que definen como varía la energia potencial de la molécula con las posiciones de los átomos que la

componen. Este campo de fuerzas requiere la utilización de parámetros como constantes de

fuerzas, longitudes de enlace, etc. Loselectrones no son tratados explícitamente en este tipo de

métodos. Losefectos electrónicos se incluyen implícitamente a través de estos parámetros.

Existe una gran diversidad de campos de fuerza según se apliquen a diferentes aspectos de la

química bioorgánica. Así, se pueden diferenciar campos de fuerza dirigidos a moléculas pequeñas

m Hermans, J.; Berendsen, H.;Van Gunsteren, W.; Postma, J.; Biopolimers, 1984, 23, 1

0...0.0000000000000000000000000000000000000000000'


y medianas (MM2, MM3, MM4, TRIPOS, MMFF94) y a macromoléculas (AMBER124,CHARMM"5,

GROMOSm, OPLSm).

En este proyecto se ha trabajado con el force field AMBERpara la optimización de la geometría

de Ia proteína en estudio y dinámica molecular. AMBERfue originalmente parametrizado para un

número limitado de sistemas orgánicos, como pequeñas moléculas o polímeros, y ha sido utilizado

ampliamente para proteínas y ácidos nucleicos. AMBERutiliza una representación united atom, lo

cual implica que los hidrógenos no polares no son representados explícitamente, pero se tienen en

cuenta en la descripción de los átomos pesados a los que están unidos. Elloresulta en una rapidez

adicional significativa en cálculos basados en AMBERen comparación a otros campos.

La optimización de Ia geometría de un sistema molecular consiste en localizar la estructura

molecular con menor energía. Losmétodos habituales de optimización de geometría se basan'en

el cálculo de las derivadas de la energía con respecto a los grados de libertad geométricos. Los

métodos derivativos se diferencian entre los de orden uno y orden dos. Los métodos derivativos

de orden uno son los basados en el gradiente de energía, los cuales buscan desplazar el sistema en

una dirección que conduzca a un valor menor de energía. Estos métodos presentan el

inconveniente de tender a conducir el sistema hacia mínimos de energia próximos a la posición de

partida (mínimos locales), los cuales no tienen por qué coincidir con el mínimo global

correspondiente a la geometría óptima que se pretende hallar.

Dinámica Molecular

La dinámica molecular es una disciplina particular del modelado molecular que explora el

movimiento de las moléculas. Utiliza soluciones numéricas de la ecuación de movimiento de

Newton, sobre un modelo que representa un sistema molecular, para simular el movimiento

atómico y así obtener inf0rmación acerca de las propiedades dependientes del tiempo de dicho

sistema.

Para definir, pues, la superficie de energía potencial dejando que el sistema evolucione a

lo largo del tiempo, se empieza con una conformación de partida químicamente plausible

(conformación de menor energía obtenida por la optimización geométrica del modelo) y se

m Cornell, W.; Cieplak, P.; Bayly, C.; Gould, I.; Merz, K.; Ferguson, J.; Spellmeyer, D.; Fox, T.; Caldwell, 1.; Kollman, P.; J.Am. Chem. Soc, 1995, 117, 5179"S Brooks, B; Bruccoleri, R.;Olafson, B.; States, D.; Swaminathan, S; Karplus, M.; J. Comput. Chem., 1983, 4, 187m Hermans, J.; Berendsen, H.;Van Gunsteren, W.; Postma, 1.; Biopolymers, 1984, 23, 1513


calculan las cargas parciales. Se calculan las fuerzas que actúan mediante la integración de las

ecuaciones de Newton, se deja que el sistema evolucione a lo largo del tiempo, con lo que

cambian las posiciones de los átomos, se calcula la energia de la nueva conformación y se vuelven

a calcular las fuerzas, volviendo a integrar las ecuaciones de Newton, repitiendo asi el ciclo a lo

largo del tiempo. Cuanto más tiempo pase más cambios se podrán calcular, lo cual implica mayor

número de conformaciones exploradas y mejor descripción del sistema.

Losestudios de dinámica molecular permiten la exploración conformacional más eficiente

que los métodos anteriormente citados. Esto es, se exploran las geometrías posibles del sistema

de una manera más exhaustiva que mediante los métodos de optimización de geometría basados

en el gradiente.

1.6.3- Evaluación de la interacci n Pr t ín -L¡ ando

Enfunción de la información experimental de la que se disponga, la predicción de la unión

proteína-Iigando puede ser más o menos costosa. Si se dispone de la proteína cristalizada,

frecuentemente es posible encontrar complejos ligando-receptor cristalizados, los cuales permiten

estudiar Ia posición de distintos Iigandos en el sitio activo de la proteína. Por otra parte, si se

disponen de datos biológicos que informen sobre las interacciones entre ligando-proteína (como

experimentos de mutagénesis dirigida),se puede deducir también el modo de unión del ligando al

sitio activo. Con estas informaciones, se puede realizar un acoplamiento manual entre ligando y

receptor mediante programas de modelización molecular para obtener asi modelos que expliquen

en lo posible los datos experimentales. Sin embargo, si no se disponen de datos experimentales,

existen métodos automáticos para explorar las posibles uniones entre Iigando y proteína. Son los

m, los cuales realizan unadenominados programas de acoplamiento molecular o docking

exploración de todas las posibles posiciones relativas Iigando-proteína, evaluando la interacción

intermolecular entre ambos. Como resultado de esta exploración, se obtienen una serie de

posibles conformaciones para Ia unión Iigando-proteína. Cada una de estas soluciones se evalúa

mediante una función de puntuación o scoríng. En Ia forma más general del docking no se

disponen de datos bioquímicos adicionales, pero disponer de información complementaria facilita

el problema del dockíng considerablemente.

117

118Damm, W.; Frontera, A.; Tirado-Rives, J.; Jorgensen, W. L; J. Comput. Chem., 1997, 18, 1955Halperin, I.; Ma, 6.; Wolfson, H.; Nussinov, R.; Proteins: Structure, Function and Genetics, 2002, 47, 409


Básicamente son esenciales tres pasos para una buena predicción del complejo

proteína/Iigando: definición de la estructura de Ia molécula target, localización del sitio de unión y

determinación del modo de unión. Idealmente la estructura de la molécula target debería estar

determinada experimentalmente, aunque algunas aplicaciones de dockíng utilizan proteínas129

| . El segundo paso, Iamodeladas, si éstas no se pueden obtener de manera experimenta

localización del sitio de unión, puede ser llevado a cabo computacionalmente (por software

específicos para dicha tarea), y a su vez, por comparación con las regiones aminoacídicas

conservadas en diversos miembros de la familia de Ia proteína en estudio y de proteínas

relacionadas. Eltercer paso, es Ia "típica" aplicación de los algoritmos de docking: dado el sitio de

unión de una molécula, determinar el modo de unión a un Iigando.

Existen tres pasos claves en el docking: representación del sistema, búsqueda

conformacional y ranking de las soluciones potenciales.

El docking simula esencialmente la interacción con las superficies de la proteína. Dicha

superficie se puede describir mediante modelos matemáticos, como descriptores, o mediante una

grilla de afinidad o grid. Además, la proteína puede tratarse de manera estática o dinámica

(proteina flexible o rígida). La mayoría de las aproximaciones consideran la proteína casi

totalmente rígida o con flexibilidad parcial en las cadenas laterales y permiten flexibilidad al

Iigando.

Un algoritmo de búsqueda riguroso podría muestrear todos los modos de unión entre dos

moléculas. Sin embargo, esto es impráctico debido al gran tamaño del espacio conformacional.

Consecuentemente, sólo una pequeña parte del mismo puede ser muestreado, por lo que se debe

establecer un compromiso entre el coste computacional y Ia cantidad de espacio conformacional

examinado.

Entre los algoritmos de búsqueda más utilizados se pueden nombrar: SA,que es el método

original de Monte Carlo; GA,el algoritmo genético tradicional darwiniano; LS,de búsqueda local; y

GA-LSque es un algoritmo genético híbrido con búsqueda local. ElGA-LStambién se conoce como

algoritmo genético lamarckiano o LGA.

Los métodos de docking iniciales se basaban en el principio de Ia llave y cerradura, Io que

llevó a utilizar sólo criterios geométricos al evaluar el grado de complementariedad estérica entre

Iigando y sitio de unión. Sinembargo, pronto la complementariedad química se empezó a tener en

"9 Hetényi, c.; Van der Spoel, 0;. Prat. Sci., 2002, 11, 11729

64 Capítulo 1. lntroducción y objetivos

cuenta en las aproximaciones de dockíng para reducir el número de falsos positivos obtenidos

mediante los criterios de forma únicamente. Por lo que se introdujeron las funciones de

puntuación o scoríng, basadas en campos de fuerza o force fields de mecánica molecular para

estimar la interacción proteína-Iigando. Las funciones de scoríng son un componente

imprescindible de los algoritmos de docking, se utilizan mayoritariamente para predecir la afinidad

de unión entre ligando y proteína de manera aproximada, ya que las funciones usadas para

describir la química y fisica de la unión de un Iigando a su sitio de unión están incompletas

todavíam. No predice los valores absolutos de la energía libre de unión, sino que predice de

manera aproximada el orden relativo en cuanto a afinidad de las moléculas doqueadas. Las

funciones de scoríng se pueden agrupar en tres clases: funciones basadas en campos de fuerza o

force-field based, funciones basadas en el conocimiento o knowledge-based y funciones empíricas

de evaluación o empírica! scoríng functions.

Se han desarrollado un amplio número de programas que realizan experimentos de

acoplamiento molecular, como por ejemplo FlexX, DOCK,GOLD,AutoDOCK y GLIDEque difieren

en los algoritmos de búsqueda implementados así como en las funciones de scoríng.

Enesta tesis se utilizó el programa autodock 4.0.

1.6.3.1- ' ' ‘ de ' ' ' ' utilizando autodock.

Autodock 4.0 utiliza dinámica molecular para la predicción de la unión de un ligando

flexible a un sitio de unión de una proteína rígida. Para una máxima exactitud de predicción asi

como de un tiempo de cálculo computacional razonable, utiliza el campo de fuerza AMBER,en

conjunto con funciones empíricas de evaluación (denominadas Docked energy)m. Las funciones

de scoríng empíricas o empírica! scoríng functions estiman la energía libre de unión sumando

términos de interacción derivados de parámetros estructurales obtenidos de manera empírica. Se

obtienen ajustando la función de scoríng a constantes experimentales de un conjunto de prueba

de complejos proteina-ligando. La función de scoríng tipica consiste en cinco contribuciones, las

cuales representan enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas y lipofílicas, y la pérdida de

¡3°Ajay, w.; Murcko, M.;J. Med. Chem,. 1995, 38, 4953m Morris, 6.; Goodsell, D.; Huey, R.;Olson, A;.J. Computer-Aíded Molecular Design, 1996, 10, 293


entropía externa y configuracional en la unión. Por último se eligió para las simulaciones, el

algoritmo de búsqueda GA-LS,ya que ha sido reportado como el más robusto y eficientem.

Los componentes individuales del programa son AutoTors, AutoGrid, y AutoDock.

AutoTors define cuáles enlaces en el ligando son flexibles, afectando de esta forma los grados de133

libertad del ligando . Por lo que, en general, ligandos grandes con muchos ángulos de torsión son

demasiado complejos de analizar. AutoGrid pre-calcula una grilla de energias de interacción 3D

basado en la proteina, utilizando el campo de fuerzas AMBER.Esta puede ser seleccionada

manualmente conociendo de antemano el sitio de unión al Iigando. De las dimensiones dela grilla

dependerá el tiempo de cálculo requerido para la simulación.

Luego de completar la grilla, Autodock comienza la simulación. El programa Autodock

devuelve dos evaluaciones: la energía de dockíng o Docked energy (la cual incluye las

interacciones intermoleculares ligando-proteína e intramoleculares del ligando) y la energía de

unión o Bindingenergy (la cual incluye la energía intermolecular ligando-proteína y la energía libre

debida a las t0rsiones del ligando). Estos resultados se muestran en forma de gráficos de energía

(eje X) contra conformaciones posibles (eje Y) llamados clusters. Se registran en formas de

columnas donde se acoplan en una misma columna conformaciones con energía y posiciones

similares.

El experimento de acoplamiento molecular llevado a cabo en esta tesis presenta dos

desafíos. El primero, es el uso de un modelo generado por modelado por homología. Estos

modelos, en general, presentan menores precisiones que los obtenidos a través de

determinaciones estructurales por cristalografía de rayos X o RMN. El segundo refiere a las

dificultades inherentes al docking de ligandos en estructuras de metaloprotei’nas. En el primer

caso, se han publicado un gran número de estudios del uso de modelos de proteínas generados

por esta metodología para realizar experimentos de docking’“. Concerniente a modelos obtenidos

por modelado por homología con similitudes de secuencias entre 30% y 50% (de moderada

precisión) se ha reportado que estos modelos pueden ser utilizados directamente para los

experimentos de dockíng de pequeñas moléculas si son construidos y refinados mediante

m Brooijmans, N.; Kuntz, l.;. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2003 ;32, 335m Goodsell, D.; Morris, G.; Olson, A.; J. Mal. Rea, 1996, 9, 1

m a) Sinding, K.; Soren Bak, T.; Olsen, E.; Imberty, A.; Breton, C; Lindberg Moller, B.; Plant Physiol, 2005, 139, 664, b)Iorga, 8.; Herlem, 0.; Barre', E.; Guillou, C.; J. Mol. ModeI., 2006, 12, 366, c) Radestock, S.; Weil, T.; Renner, S.; J. Chem.Inf. Model., 2008, 48, 1104, e) Schafferhans, A.; Klebe, G.; J. Mol. BíaI., 2001, 307, 407


simulaciones de dinámica molecular, o si se considera, en los experimentos, Ia flexibilidad de la

proteina‘”.

En el segundo caso, el docking de moléculas en sitios activos que contengan uno o más

metales es muy desafiante debido a las múltiples geometrías posibles de coordinación y asimismo

debido a la falta de parámetros de campos de fuerza suficientemente precisos para las

interacciones ligando-metalm. Con respecto al tratamiento de la coordinación del metal, se sabe

que los programas actuales que realizan experimentos de docking son deficientes en este

particular caso. En estudios anteriores se ha comparado el desempeño de diversos programas de

docking, mediante experimentos de acoplamiento molecular de sustratos llevados a cabo sobre

sitios activos de metaloproteínas. El resultado de estos estudios mostró que el programa

AUTODOCKuera el más confiable para este tipo de experimentosm.

1.7 Resumen de obietivos

EI objetivo general de este trabajo de tesis ha sido generar una estrategia versátil y

económica para la sintesis tanto de nucleósidos naturales como de nucleósidos modificados

partiendo de los azúcares naturales. Laaproximación quimioenzimática de sintesis de nucleósidos

que decidimos explorar se encuentra resumida en la Figura 1.12.

La hipótesis básica de Ia estrategia enzimática utilizando las enzimas PPM y NPs está

asociada a Ia disponibilidad de las correspondientes furanosas 5-fosfato como materiales de

partida. Por lo que se planteó una estrategia quimio-enzimática para Ia obtención de estos

compuestos, que comprende en primer lugar un esquema quimioenzimático de protección

desprotección selectivo, seguido de una fosforilación química (Figura 1.26). Tomando como base

trabajos previos, en el presente trabajo de tesis se decidió encarar el estudio de reacciones de

acetilación química de diversas furanosas y su posterior desacetilación enzimática, con el objeto

de obtener las mismas con la posición primaria libre. Se utilizaron diversas fuentes enzimáticas

(Iipasas e hidrolasas vegetales) con el objeto de extender el conocimiento relacionado a la

regioselectividad de los biocatalizadores en las reacciones de desacetilación.

"5 Krovat, E.; Steindl T.; Langer, T.; Current Computer-Aided Drug Design , 2005,1, 93136Ver por eiemplo: a). Hu, X.; Balaz, S.; Shelver .W.;. J. Mol. Graph. Model., 2004, 22, 293, b). lrwin, J.; Raushel, F.;Shoichet, B.;Bioochemisrry , 2005, 44, 12316m Chen, D.; Menche, G.; Power, T.; Sower, L.; Peterson, 1.; Schein, C.; PROTEINS:Structure, Function, and Bíoinformatics,2007, 67, 593


ou

H0 HO HOÜP‘Oo HO o

OH 1) Protección de 1. 2. 3 y 5 OR a) Foslorilación OH—> —————>2) Desprotección de 5

OH X OAc Y

lx: OH. H IY: OAc. HI

4)Desprolecciónde1.2y3

Figura 1.26. Esquema general de la síntesis de furanosas 5-fosfato.

Una vez obtenidas las furanosas regioselectivamente con la posición 5 libre, se proyectó

estudiar diversas reacciones de fosforilación química con el objeto de obtener las

correspondientes furanosas 5-fosfato.

o Obtención enzimática de nucleósidos partiendo de furanosas S-fosfato y bases

Con las furanosas S-fosfato en mano, se decidió explorar la reacción de sintesis enzimática

de nucleósidos mediante el acoplamiento de las enzimas NPs con la PPM (Figura 1.27).

Para la consecución de este objetivo, y debido a que la PPM de E. coli no es una enzima

comercial, se planteó, en primer medida, sobreexpresar la misma en un sistema adecuado,

mediante la aplicación de metodologías usuales de biologia molecular. Esto se realizó bajo la

supervisión el Dr. Claudio Pereira y el Lic.Leon Beauvier. Una vez halladas las mejores condiciones

para la expresión enzimática, se planteó la optimización de las condiciones de reacción para

evaluar su impacto en la cinética y los rendimientos de las reacciones de sintesis de nucleósidos.

9'0:p0 HO H0HO E E2 B

o 1 , 0 o o B 0|l ' —__>OH‘ 3 o-P’ ‘—X OH X \0H OH X

E1:loslopenlornulasa, E1: nucleósido losforilasa. B: Base.

Figura 1.27. Síntesis enzimática de nucleósidos

Por último, con el objeto de demostrar el alcance de la estrategia quimio-enzimática

planteada, se sintetizaron tanto nucleósidos naturales como modificados, utilizando como

biocatalizador el sistema enzimático acoplado formado por la enzima recombinante PPM y


nucleósido fosforilasas (NPs) comerciales, partiendo de pentosas S-fosfato y bases purinicas y

pirimidínicas (Figura 1.27).

- lnmovilización eficiente de la PPM y co-inmovilización del sistema enzimática

acoplado (PPM-NP)

Con el objeto de abordar futuros estudios de escalado de la reacción, se propuso llevar a

cabo la inmovilización de la PPM y co-inmovilización del sistema enzimática acoplado (PPM-NP)

para de esta forma aprovechar las ventajas descriptas anteriormente concernientes a

inmovilización de enzimas, como ser el aumento en Ia estabilidad de Ia/s enzima, y Ia posibilidad

de re-utilización del biocatalizador inmovilizado. Para lograr este objetivo, se han analizado

diversas metodologías de inmovilización,así como diversos soportes. Parte de este desarrollo se

realizó con la colaboración del Dr. Matias Jobbajy.

o Estudio estructural y funcional de Ia enzima PPM recombinante

Por último, se planteó la elucidación estructural de la enzima recombinante expresada en

nuestro laboratorio (PPM de E. coli), Ia determinación del sitio activo de la misma y el modo de

unión de los ligandos. Esto se llevó a cabo con el objeto de:

o Comprender el mecanismo biológico fundamental de Ia enzima PPM y los modos de unión

de los ligandos al sitio activo de la enzima.

o Proyectar un diseño racional de mutantes, con el objeto de aumentar la estabilidad de la

enzima, ampliar su perfil de pH y la especificidad de los sustratos S-fosfato. Esto último

permitiría la síntesis biocatalizada de nuevos nucleósidos modificados en el azúcar.

o La predicción de las propiedades físico-químicas de la enzima. Esto posibilitará, en un

futuro, evaluar Ia distribución de cargas y los residuos expuestos al solvente, permitiendo

una selección más racional dela metodología de inmovilización.

El estudio estructural y funcional de la PPM fue realizado con la supervisión de la Dra. Anna

Tramontano.

69 Capítulo 2 - Parte experimental

M92

Parte experimental

2.1- Materiales

2.1.1- Reactivos

Acetato de etilo J.T.BakerAcetonitrilo J.T.BakerÁcido acético MerckÁcido Bórico Merck

Ácido clorhídrico MerckÁcido etilendiaminotetracético GIBCOBRLÁcido fosfórico J.T.Baker

Ácido p-toluensulfónico monohidratoÁcido sulfúrico

ICN Biomedicals

MerckAcrilamida GIBCO BRL

Adenina Pharma WaldhofAdenosina Pharma Waldhof

Agar GIBCO BRL

Agarosa GIBCO BRL

Agua deuterada AldrichAlcohol isoamilico MerckAlcohol n-butilico J.T.Baker

Alcohol polivinilico Sigma

2-Amino-6-cloro-9-(b-D-ribofuranosiI) purina Sigma-AldrichAmoníaco Merck

Ampicilina Sigma-AldrichAnhídrido acético J.T.Baker

L-arabinosa SigmaArabinofuranosil adenina Sigma-AldrichArgón AGAAzul de bromofenol SIGMABenzofenona RiedeI-de-HaénBicarbonato de sodio MallinckrodtBisulfito de sodio J.T.BakerBorohidruro de sodio Aldrich

S-Bromo-4-cloro-3-¡ndolil-B-D-galactopiranosido Sigma-Aldrich5-Bromo-2'-desoxiuridina Sigma-AldrichCarbonato de potasio AnedraCarbonato de sodio Mallinckrodt

Cloranfenicol Sigma-Aldrich6-CIoro-2-aminopurina, Sigma-Aldrich


CloroformoCloroformodeuteradoCloruro de 4-4'—dimetoxitritiloCloruro de bario

Cloruro de manganesoCloruro de mesitileno

Cloruro de p-toluensulfoniloCloruro de sodioD-Arabinosa

1,4-Diazabiciclo[2,2,2]octano2'-Desoxiuridina

Dibencil N,N-diisopropilfosforamiditaDibenzo-lB-corona-GDiclorometanoDifenilclorofosfato

4-DimetilaminopiridinaDimetilformamidaDimetilsulfóxidoDimetilsulfóxidodeuteradoEDC

Etanol absolutoÉter etílico

EtilenglicolFenol5-Fluoro-2'-desox¡uridina

2-FluoropurinaS-FluorotiminaS-FluroruraciloGlicerol

Glucosa-2.6-difosfatoGlutaraldehidoGuaninaGuanosina

Hidróxido de paladioHidróxido de sodioHidruro de calcio

Hidruro de potasioHipoxantina1H-ImidazollnosinaIPTG

IsopropanolMarcador de PMde proteínasB-Mercaptoetanol6-Mercapto purina6-Merca ptopurin-9-B-D-ribofuranósidoMetanolN,N'-Metilenbisacri|amidaN,N-Diisopropiletilamina

MerckAIdrich

ICNBiomedicals

AnedraAnedraAIdrich

ICN

AIdrich

Sigma-AIdrich

Sigma-Ald rich

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrichAIdrich

J.T.Baker

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrichJ.T.BakerJ.T.BakerAIdrich

Sigma-AIdrichMerckMerck

Sigma-Aid richJ.T.Baker

Sigma-AIdrichSigma-AIdrich

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrichMerck

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrichSigma-AIdrichSigma-AIdrichSigma-AIdrichMerckAIdrich

Aldrich

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrichSigma-AIdrichJ.T.BakerAIdrich

Sigma-Aid rich

Sigma-AIdrich

Sigma-AIdrichJ.T.Baker

GIBCO BRL

AIdrich

71 Capítqu 2 - Parte experimental

NitrógenoOxicloruro de fósforoPentóxido de fósforoPersulfato de amonioPiridina

QuitosanoD-ribosa

1-(B-D-ribofuranosil)-1H-1,2,4-triazoI-3-carboxamidaSulfato de sodio anhidro

Ter butil hidroperóxidoTerbutilhidropiranoTetraetilen-ono-silicatoTetrahidrofurano1H-TetrazolTimidinaTiminaTolueno

1,2,4-Triazol-3-carbozamidaTrietilamina

Tris [u‘ 1' ‘ l . A." I A

Uracilo

UreaUridinaXileno

D-xilosa

Yodo

' hldwcloruro

2.1.2- Cromatografia y material gara gurificación

Columna HPLC Apollo C18 5u 150mmx4.6mm

Placas de aluminio de silica gel 60F25.

Resina Dowex X2-200

Silicagel 60F, grano 200-300

Columna Ni-NTA

2.1.3- Enzimas

T4 DNA Iigasa

EcoRI

Hindlll

Pstl

Purin nucleósido fosforilasa (origen bacteriano)

AGA

Sigma-AldrichMerckGIBCO BRL

J.T.Baker

Sigma-AldrichSigma-Aldrich

Sigma-AldrichJ.T.Baker

Sigma-Aldrich

Sigma-Aldrich


Sigma-Aldrich

Sigma-Aldrich


Sigma-AldrichPharma WaldhofGIBCO BRL

Sigma-AldrichGIBCO BRL

Sigma-AldrichSigma

Sigma-AldrichMerck

Alltech

Merck

Bio-Rad

Merck

QIAGEN

GIBCO BRL

Biotech

Amersham Pharmacia

Amersham Pharmacia

Sigma-Aldrich

72 Capitulo 2 - Parte experimental

Timidin fosforilasa (Eco/I)

EnterokinaseMaxTM

2.1.4- Sistemas de vectores

pRSET-A

pGEM-TEasy

2.1.5- Buffers y medio de cultivo

-Buffer PCR

Taq 1X PCReasy (pH 8.3) KCI500 mM

-Buffers utilizados en electroforesis en gel de agarosa

Tris base 40 mM

Ácido acético 20 mM 1

TAE 1X, pH= 8.1

Buffer de carga

-Buffer de ligado rápido

(T4 DNA ligasa) pH = 7.8

EDTAlmM

Sigma-Aldrich

QIAGEN

Invitrogen

Promega

Tris-HCI 100 mM

MgCIz 15 mM

Glicerol 30% (v/v)

Azul de Bromofenol 0.25 % (p/v)

Xilen Ciano IFF0.25 % (p/v)

Tris-Cl 60 mM

MgCIZ 20 mM

DTI' 20 mM

ATP 2 mM

PEG 10% (Mr 8000)

-Buffers utilizados en la purificación dela enzima recombinante por cromatofia de afinidad (NI

NTA, QIAGEN)

Buffer de lisis (pH = 8.0) NaH2P04 50 mM

NaCI 0.5 M

1-H imidazol 0.01 M

OOOOOOOOOOOOOOOOOO...00.000.00.00...0.0.0.0.000001

73 Capitqu 2 - Parte experimental

Buffer de lavado (pH = 8.0) NaH2PO4 50 mM

NaCI 0.5 M

1-Himidazol0.02 M

Buffer de elución (pH = 8.0) NaH2PO4 45 mM

NaCI 0.45 M

1-H imidazol 0.5 M

-Buffers utilizados en electroforesis en gel de poliacrilamida

Buffer de migración Tris-HCI 25 mM

Glicina 200 mM

SDS0.1% (p/v)

Buffer de carga SDS 10% (p/v)

B-mercaptoetanol 10 mM

Glicerol 20 % (v/v)

Tris-HCI, pH 6.8 0.2 M

Azul de bromofenol 0.05% (p/v)

-Medio de cultivo

LB(líquido, pH = 7.0) Extracto de levadura 0.5% (p/v)

Peptona 1%(p/v)

NaCl 1% (p/v)

LB(sólido, pH = 7.0) Idem medio líquido + agar 0.75% (p/v)

2.2- Consideraciones generales

Las purificaciones de los productos orgánicos fueron realizadas utilizando

cromatografía en columna de silicagel 60 grano 200-300. El análisis y seguimiento de las

reacciones fue llevado a cabo por cromatografía en capa delgada (c.c.d.) utilizando placas de

aluminio recubiertas con silicagel comerciales (60F254).Los componentes fueron localizados

por medio de carbonización con ácido sulfúrico diluído y calor, o con luz UVa 254 nm. También

se utilizó yodo como revelador en los casos en que fuera necesario.


Lasevaporaciones fueron llevadas a cabo en un evaporador rotatorio marca Büchicon

una trampa de frio -100 9Cutilizando una bomba de vacío.

Los solventes fueron secados en atmósfera de Nitrógeno. El THFfue reflujado sobre

sódio metálico utilzando benzofenona como indicador de humedad. La DMFfue secada por

calentamiento con hidruro de calcio y luego destilada a presión reducida. Latrietilamina (TEA)

y la piridina (Py) fueron secadas por calentamiento a reflujo con hidruro de calcio y destilados

a presión atmosférica.

Los reactivos sensibles a la humedad fueron transferidos w'a jeringa bajo presión

positiva de nitrógeno o argón. Las reacciones fueron llevadas a cabo bajo presión positiva de

nitrógeno.

Lasestructuras fueron determinadas utilizando resonancia magnética nuclear de 1H13C

y 31P en un equipo Bruker de 500 MHz o de 200 MHz. Los espectros fueron realizados

utilizando CDCI3,DMSO-ds, Dzo (estándares internos ver Tabla 2.1) y H3PO.como estándar

externo. Los desplazamientos químicos citados como multipletes están referidos al centro

aproximado de Ia señal.

Compuesto de Compuesto de Compuesto de

internoestándar externo

Tabla 2.1. Sistemas de referencia utilizados en Rersonancia Magnetica Nuclear

Todas las reacciones enzimáticas fueron llevadas adelante en un agitador orbital marca

Ferca con control de temperatura y cuenta revoluciones.

Losrendimientos de las reacciones fueron calculados luego del paso de purificación.

Elseguimiento de las reacciones biocatalizadas fue llevado a cabo utilizando un equipo

de HPLCGILSON(modulo manométrico 805, mezclador dinámico 8113, bombas 305 y 306,

detector UV modelo 116). En las primeras reacciones se utilizó un integrador Shimadzu,

Chromatopac C-R6A.Luego se adquirio un conversor de datos analógicos conectado a una

computadora personal.


2.3- Metodología

' ‘ 'J diacetilados - Obtención de los2.3.1- Síntesis uimioenzimática de

productos triacetilados

2.3.1.1- Síntesis de metil 2 3 S-tri-O-ace il-D L- en ofuranósidos

Procedimiento general para la síntesis de metil 2,3,5-tri-0-acetiI-D-pentofuranósidos

A una solución de 1 g de la furanosa correspondiente (6.66 mmol) en 23 ml de MEOH

absoluto se agregaron 0.086 ml de HZSO.(c) y CuSO4anh. (1.1 g, 0.007 mmol). Esta solución se

calentó a 50 °C por aprox. 24 hs. Luego, Ia mezcla enfriada, fue neutralizada con 0.4 g de

NaHCO3.Las sales insolubles fueron removidas por filtración y el filtrado fue concentrado bajo

presión reducida hasta obtener un aceite. El mismo fue evaporado dos veces a presión

reducida de Py anh. y posteriormente se disolvió en este mismo solvente (35ml). Luego se

agregó a Ia solución, anhídrido acético (5.8 ml, 0.061 mmol) previamente destilado y

cantidades catalíticas de DMAP.La mezcla se dejo a temperatura ambiente bajo agitación,

aprox. 6 h, y fue posteriormente concentrada bajo presión reducida a sequedad. La misma se

purificó en una columna de sílica gel, utilizando mezclas de Hexano: AcOEtcomo eluyente.

De esta forma se obtuvieron los siguientes compuestos:

Metil 2,3,5-tri-O-acetiI-oL-D-.'L ‘ ' '4 (1a) v metil 2,3,5-tri-O-acetiI-B-D-ribofuranósido

(lb):

AcO AcO

OMe Mr: 2900 O

Rf:0.45 (a), 0.59 (B) en Hexano/AcOEt 1:1

Rendimiento: 50% ((3),13% (a)OMe

ACO OAC AcO OAC

1b 1a

Anomero fi

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.06 (s, 3H, -CH3), 2.09 (s, 3H, -CH3), 2.11 (s, 3H, -CH3),

3.40 (s, 3H, -OCH3),4.11 (dd, Jl = 5.8 Hz, 12: 11.8 Hz, 1H, H-S'), 4.30 (m, 1H, H-4), 4.36 (dd, Jl =

3.9 Hz, Jz = 11.8 Hz, 1H, H-5), 4.90 (d, 11= 0.8 Hz, 1H, H-1), 5.23 (dd, Jl = 0.8 Hz, Jz = 4.8 Hz, 1H,

H-2), 5.32 (dd, J¡= 4.9 Hz, Jl: 6.8 Hz, 1H, H-3).


Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHZ): 6 20.34 (-CH3), 20.42 (-CH3), 20.61 (-CH3), 55.11 (OCHg),

64.29 (C-S),71.44 (C-2), 74.54 (C-3), 78.47 (C-4), 106.14 (C-l), 169.47 (CO), 169.51 (CO), 170.46

(CO).

Anomero a

Espectro de 1H RMN (C|3CD, 500 MHz): 8 2.09 (s, 3H, -CH3), 2.11 (s, 3H, -CH3), 2.12 (s, 3H, -CH3),

3.45 (s, 3H, -OCH3),4.21 (dd, 11: 4.2 Hz, 1,: 11.8 Hz, 1H, H-S'), 4.27 (rn, 1H, H-4), 4.36 (dd, J1=

3.1 Hz, J; = 11.8 Hz, 1H, H-S), 4.98 (dd, 11= 4.4 Hz, J; = 7.3 Hz, 1H, H-Z), 5.12 (d, 11= 4.4 Hz, 1H,

H-1), 5.17 (dd, Jl: 3.7 Hz, Jz= 7.4 Hz, 1H, H-3).

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 19.52 (-CH3), 20.18 (-CH3), 20.61 (-CH3), 55.03 (OCH3),

63.02 (C-S), 69.41, 70.35 (C-Z, C-3), 78.97 (C-4), 101.15 (C-1), 169.29 (CO), 169.82 (CO), 169.95

(CO).

Mr: 290

0 QMe Rf: 0.48 en Hexano/AcOEt 1:1

Rendimiento: 53%

Acc (c118Zzl)‘

Espectro de 1HRMN (CI3CD,500 MHz) (azfl 2:1): 5 2.09 (s, 3H, -CH3-a), 2.10 (s, 3H, -CH3a), 2.11

(s, 1.5H, -CH3|3), 2.12 (s, 1.5H, -CH3B), 2.13 (s, 1.5H, -CH;B), 2.18 (s, 3H, -CH3a), 3.38 (s, 3H,

CHga), 3.40 (s, 1.5H, -CH;B), 4.09-4.14 (m, 0.5 H, H-SB), 4.154.19 (rn, 0.5 H, H-SB), 4.21-4.26

(m, 2 H, H-Su), 438-443 (m, 1.5 H, H-4-a,B), 4.94 (s, 1 H, H-la), 4.99 (dd, J 1= 1.4 Hz, J 2=4.6

Hz, 1 H, H-3u), 5.03 (d, J= 1,4 Hz, 1 H, H-2a), 5.05 (dd, J 1: 4.5 HZ,J z= 6.9 Hz, 0.5 H, H-ZB), 5.10

(d, J = 4.5 Hz, 0.5 H, H-1I3),5.32 (dd, J ¡= 4.9 Hz,.|¡= 6.9 Hz, 0.5 H, H-3B).

Espectro de 13c RMN (CI3CD,125 MHz): 6 19.68 (-CH3), 19.35 (-CH3), 19.88 (-CH3), 19.9o (-CH3),

20.02 (-CH3),53.56 (OCH3a), 54.08 (OCHgfi), 62.28 (C-Sa), 64.19 (C-SB), 74.89(C-3[3), 75.93 (C

ZB), 76.41 (C-3a), 77.66 (C-4B), 79.48 (C-Za), 80.39 (C-4a), 100.19 (C-IB), 105.85 (C-la),

169.23 (c0), 169.75 (c0), 169.82 (c0), 170.14 (c0), 170.19 (c0).

'La relación de anómeros se calculó por medio de las ¡ntegraciones de las señales correspondientes al H-l en el

espectro de RMN lH

OOOOOOOOOOOOOOOO.0.00.0....ÓOICOOOOOOOOCOOOOOOOOO4


Mr: 290

Rf:0.57 en Hexano/AcOEt 1:1.°A° 0Me

Rendimiento: 45 %

(a:B 1:1)

Espectro de lH RMN (CI3CD,500 MHz): 6 1.95 (s, 3 H, -CH,), 1.96 (s, 6 H, -CH,), 1.91 (s, 3 H,

CH,), 1.98 (s, 3H, -CH3), 1.99 (s, 3H, -CH3), 3.21 (sa, 6 H, OCH3), 4.00 (dd, J, = 4.3 Hz, J2= 11.9 Hz,

1 H, H-sd), 407-415 (m, 3H, H-sd,(5),434-437 (m, 1 H, H-4d), 445-449 (m, 1 H, H-4(3),4.76

(s, 1 H, H-1(3), 4.88 (dd, J, = 4.5 Hz, J2= 6.3 Hz, 1 H, H-Za), 4.95 (sa, 1 H, H-2(3) no se vé eIJ 1,4?,

5.02 (d, J, = 4.5 Hz, 1 H, H-la), 5.22 (dd, J,= 1.4 Hz, J2= 6.1 Hz ,1 H, H-3B), 5.39 (t, J, = 6.32 Hz, 1

H, H-3a).

Espectro de 13c RMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.43(-CH,), 20.51(-CH,), 20.53 (-CH,), 20.60 (-CH3),

20.67 (-CH,), 20.72 (-CH3),55.29 (OCHgg),55.45 (OCH3d, 61.76 (C-Sa), 63.01 (c-sB), 73.28(C

3a), 74.56(c-2d), 74.84(c-3(3), 76.02(C-4a), 73.o3(c-2(J), 30.7o (04(4), 99.80 (c-1d), 106.95 (c

13), 169.36 (c0), 169.70 (c0), 170.10 (c0), 170.13 (c0), 171.35 (c0), 170.43 (c0)

Metil2,3,S-tri-O-acetil-a,B-L- L' ‘ anósidofl);

Mr: 290

Rf:0.48 en Hexano/AcOEt 1:1.

Rendimiento: 54 %

(¡1:8 2:1).

AcO

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz) (u:B 2:1): 8 2.03 (s, 1.5 H, -CH3B), 2.04 (s, 1.5 H, -CH38),

2.05 (s, 3 H, -CH3a), 2.06 (s, 1.5 H, -CH3B),2.07 (s, 3H, CH3a), 2.08 (s, 3H, -CH3a), 3.33 (s, 1.5 H,

CHafl),3.35 (s, 3 H, CH3a), 4.04-4.19 (m, 3 H, H-Sa,B), 433-438 (m, 1.5 H, H-4a,B), 4.90 (s, 1 H,

H-la), 4.97 (dd, J ,= 1.5 Hz, J 2: 4.6 Hz, 1 H, H-3a), 5.03 (dd, J ,= 4.5 Hz, J 2: 6.7 Hz, 0.5 H, H-ZB),

5.04 (sa, 1 H, H-Za), 5.04 (d, J = 4.5 Hz, 0.5 H, H-IB), 5.32 (dd, J ,= 5.1 Hz, J 2: 6.7 Hz, 0.5 H, H

3B).

Espectro de 13c RMN (CI3CD,125 MHz): 8 19.11 (-CH,), 19.27 (-CH3), 19.3o (-CH3), 19.31 (-CH3),

19.33 (-CH3), 53.48 (OCHg-a), 54.01 (OCH3-B),62.24 (C-Sa), 64.14 (C-SB), 74.86 (C-3B), 75.90


(c-zfi), 76.38 (C-3a), 77.62 (C-4B), 79.46 (C-Za), 80.36 (C-4a), 100.16 (c-1B), 105.82 (C-la),

168.46 (c0), 168.49 (c0), 168.56 (c0), 168.60 (c0), 168.88 (c0), 168.92 (c0).

Procedimiento general para la sintesis de butil 2,3,5-triO-acetil-D-pentofuranósidos

Lasíntesis de los butil 2,3,5-tri-O-acetiI-D-pentofuranósidos es análoga a la síntesis de

metil 2,3,S-tri-O-acetiI-D/L-pentofuranósidos (2.3.1.1), utilizando en este caso butanol en lugar

de metanol.

Deesta forma se obtuvieron los siguientes compuestos:

Anomero 6 (Sb)

AcO /\/\ Mr:332oo Rf:0.54 en Hexano/AcOEt 3:1.

Rendimiento: 47 %

OAc OAc

Espectro de lH RMN (CI3CD,500 MHz): 6: 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H, -CH3(But)), 1.28-1.36 (m, 2H,

CH; (But)), 1.48-1.52 (m, 2H, -CH¡ (But)), 2.02 (s, 3H, -CH3), 2.06 (s, 3H, -CH3),2.08 (s, 3H, -CH3),

333-338 (m, 1H, CH; (But)), 3.66-3.70 (m, 1H, CHz(But)), 4.07 (dd, Jl: 5.9 Hz, J2= 11.4 Hz, 1H,

H-5'), 4.234.27 (m, 1H, H-4), 4.26 (dd, J1= 3.8 Hz, Jz= 11.4 Hz, 1H, H-S), 4.95 (d, J¡= 0.7 Hz, 1H,

H-1), 5.19 (dd, Jl: 0.7 HZ,Jz= 4.8 Hz, 1H, H-2), 5.29 (dd, Jl: 4.8 Hz, Jz= 6.8 Hz, 1H, H-3).

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 8 13.81 (-CH3 (But)), 19.24 (-CH2(But)), 20.54 (-CH3),

20.62 (-CH3),20.79 (-CH3),31.48 (CH; (But)), 64.82 (C-S), 68.03 (OCH2(But)), 71.70 (C-2), 74.81

(C-3), 78.27 (C-4), 105.25 (C-l), 169.59 (CO), 169.71 (CO), 170.55 (CO).

Anomero a (Sal

AcO

o Mr: 332


OW Rendimiento:16%OAcOAc


Espectro de 1HRMN (cuco, 500 MHz): 6: 0.86 (t, J = 7.4 Hz, 3H, -CH3(But)), 127-134 (m, 2H,

CH2(But)), 1.49-1.53 (m, 2H, -CH2(But)), 2.04 (s, 3H, -CH3), 2.05 (s, 3H, -CH3), 2.06 (s, 3H, -CH3),

3.41-3.45 (m, 1H, CH2(But)), ass-3.70 (m, 1H, CH2(But)), 4.14 (dd, Jl: 4.2 Hz, J2= 11.9 Hz, 1H,

H-5'), 4.20-4.22 (m, 1H, H-4), 4.29 (dd, J1= 3.o Hz, Jz= 11.9 Hz, 1H, H-5), 4.90 (dd, J1= 4.4 Hz, J1

= 7.2 Hz, 1H, H-2), 5.09 (dd, Jl = 4.2 Hz, J2= 7.2 Hz, 1H, H-3), 5.13 (d, J = 4.4 Hz,1H,H-1).

Espectro de 13c RMN (CI-(CD,125 MHz): 5 13.77 (-CH3 (But)), 19.45 (-CH2(But)), 20.51 (-CH3),

20.70 (-CH3),20.77 (-CH3),31.48 (CH2(But)), 63.44 (c-5), 68.25 (OCH2(But)),69.68, 70.76 (c-2,c

3), 78.76 (c-4), 100.43 (c-1), 169.93 (c0), 170.41 (c0), 17o.59(c0).

Mr: 332


Rendimiento: 56 % (azfl 5:1)

OAc

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz) (azB 5:1): 6 0.84 (t, J = 7.4 Hz, 0.6 H, -CH3(But)B) 0.87 (t, J

= 7.3 Hz, 3H, -CH3(But)a), 1.25-1.36 (rn, 2.4 H, -CH2 (But)a,[3), 1.46-1.SS (m, 2.4 H, -CH2

(But)a,|3), 2.02 (s, 3H, -CH3), 2.04 (s, 3.6 H, -CH3),2.04 (s, 3.6H, -CH3),3.36-3.44 (m, 1.2 H, OCH;

(But)a,B), 3.61-3.59 (rn, 1.2 H, OCH2 (But)a,B), 4.12 (dd, J 1= 7.7 Hz, J z= 11.4 Hz, 0.2 H, (+53),

4.14-4.19 (rn, 2.2 H, H-Su,H-4a,B), 4.34 (dd, J 1=4.4 Hz, J 2= 11.4 Hz, 0.2 H, H-SB), 4.36 (dd, J 1=

5.5 Hz, J 2: 14.0 Hz, 1 H, H-Sa), 4.904.92 (m, 1 H, H-3a), 4.93 (dd, J = 4.5, J = 6.6 Hz , 0.2 H, H

2(3), 4.96 (s, 1 H, H-lu), 5.01 (dd, J 1=0.4 Hz, J 2= 1.6 Hz ,1 H, H-2a), 5.20 (d, J = 4.5 Hz, 0.2 H, H

lB), 5.28 (dd, J 1=4.5 Hz, J 2: 6.6 Hz, 0.2 H, H-3B).

Espectro de 13C RMN (CI3CD, 125 MHz): 6 13.69 (-CH3 (But)), 13.74 (-CH3 (But)), 19.11 (

CH¡(But)), 19.17 (-CH2(But)), 20.47 (-CH3), 20.66 (-CH3), 20.71 (-CH3), 20.73 (-CH3), 20.88 (-CH3),

31.33 (CH; (But)), 31.37 (CH; (But)), 60.25 (C-Sa), 63.32 (C-SB), 67.25(OCH¡(But)),

69.16(0CH2(But)), 76.04 (C-3B), 77.04 (C-ZB), 77.21 (C-2a), 78.58 (C-4B), 80.12 (C-Za), 81.29

(C-4a), 100.60 (C-lB), 105.51 (C-la), 169.60 (CO), 170.01 (CO), 170.02 (CO), 170.30 (C0),

170.33 (CO), 170.05 (CO).


Mr: 332


Rendimiento: 40 %

OAc (¿1:8 1:1.3).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 8 0.84 (m, 6.9 H, -CH3(But)), 1.35-1.23 (m, 4.6 H, -CH¡

(But)), 1.51-1.43 (m, 4.6 H, -CH2(But)), 2.00 (s, 3.9 H, -CH3), 2.01 (s, 3H, -CH3), 2.02 (s, 3H, -CH3),

2.02 (s, 3H, -CH3),2.03 (s, 3.9 H, -CH3),2.03 (s, 3.9H, -CH3),3.31-3.37 (m, 2.3 H, CH; (But)), 3.62

368 (m, 2.3 H, CH2(But)), 4.05 (dd, J1= 4.4 Hz, J2= 12.0 Hz, 1 H, H-Sa), 4.21-4.12 (rn, 3.6 H, H

Sa,[3), 4394.42 (m, 1H, H-4a), 4.484.52 (m, 1.3 H, H-4B), 4.88 (dd, Jl = 4.5 Hz, Jz= 5.8 Hz, 1H,

H-Za), 4.89 (s, 1.3 H, H-lB), 5.02 (d, J¡= 1.5 Hz, 1.3 H, H-ZB),5.19 (d, J¡= 4.5 Hz, 1H, H-la), 5.25

(dd, J] = 1.5 Hz, 12: 6.0 Hz ,1.3 H, H-3B), 5.46 (t, Jl: 6.1 Hz, 1H, H-3a).

Espectro de 13C RMN (CI3CD, 125 MHz): 6 13.59 (-CH3 (But)), 13.77 (-CH3 (But)), 19.11 (

CH2(But)), 19.18 (-CH2(But)), 20.48 (-CH3), 20.58 (-CH3), 20.60 (-CH3), 20.71 (-CH3), 20.75 (-CH3),

20.79 (-CH3),30.97(CH2 (But)), 31.43 (CH; (But)), 61.88 (C-SB), 63.19 (C-Sa), 67.81, 68.27(-0CH2

(But)a,B), 73.27, 74.81, 76.61 (C-Za, C-3a, C-4a), 77.94, 79.46, 80.73(C-2[3, C-3B,C-4B), 98.98

(C-la), 105.85 (C-IB), 169.42 (C0), 169.76 (CO), 170.17 (CO), 171.21 (CO), 170.43 (C0), 170.51

(C0).

12-O-¡so ro iliden-o-D-xilofuranosa 8:

HO

Mr: 190

Rf: 0.44 en AcOEt

Rendimiento: 63 %

Se añadió a una solución de 1 g de xilosa (6.66 mmol) en 20 mI de acetona

previamente destilada, 0.2 ml de HzSO. (c) y CuSO. anh. (2 g, 0.0127 mmol). Esta solución se

agitó a temperatura ambiente por 48 h. La reacción se siguió por c.c.d., y se mantuvo la

agitación hasta desaparición del material de partida. Luego, la mezcla de reacción fue


neutralizada con 1 mI de NaOH 1 M y 0.4 g de NaHC03_Las sales insolubles fueron removidas

por filtración y el filtrado fue concentrado bajo presión reducida a un aceite obteniéndose, de

esta forma, Ia 1,2;3,5-di-O-isopropiliden-a-D-xilofuranosa. Posteriormente se disolvió el crudo

de reacción en MeOH y se añadió 8 ml de una solución acuosa de HCl2 % v/v. Esta solución se

mantuvo bajo agitación por 24 h a temperatura ambiente. Una vez concluida la reacción

(c.c.d), se neutralizó la solución con TEAy se evaporó a presión reducida. El compuesto (8) se

purificó en una columna de sílica gel, obteniéndose la xilosa protegida, con un 63 % de

rendimiento (0.8 g)

Espectro de 1HRMN (MeOD, soo MHz): 6 1.31 (s, 3H, -CH3(iPr)), 1.47 (s, 3H, CH3(iPr)), 3.77 (dd,

J1= 6.2 Hz, 12: 11.5 Hz, 1H, H-5), 3.82 (dd, J,= 4.3 Hz, J2= 11.5 Hz, 1H, H-5), 4.15-4.19 (m, 2H, H

4,3), 4.47 (d, J1= 3.6 Hz, 1H, H-1), 5.89 (d,J =3.6 Hz,1H,H-2).

Espectro de 13c RMN (MeOD, 125 MHz): ó 25.48 (-CH3(iPr)), 27.06 (-CH3(iPr)), 60.83 (c-5),

75.57, 82.13, 86.56 (c-2, c-3, c-4), 105.96 (c-1), 112.48 (C(iPr)).

3.5-di-O-acetiI-1.2-O ' ' a D ' ‘ EL:

AcO

oOAc Mr: 274

o Rf: 0.47 en Hexano: AcOEt 1:1

o Rendimiento: 87 %

La 1,2-O-isopropiliden-u-D-xilofuranosa (0.8 g, 4.2 mmol) se disolvió en Py. anh.

(30ml). Luego, se agregó a la solución, anhídrido acético previamente destilado (4.4 mI, 33

mmol) y cantidades catalíticas de DMAP. La mezcla se dejó a temperatura ambiente con

agitación toda Ia noche y fue, posteriormente concentrada bajo presión reducida a sequedad.

Elcompuesto 9 se purificó por cromatografía en columna de sílica gel, obteniéndose la

xilosa diacetildada, con un 87 % de rendimiento (1 g).

Espectro de ¡H RMN (cuco, 500 MHz): 8 1.08 (s, 3H, -CH3(iPr)), 1.27 (s, 3H, CH3(iPr)), 1.82 (s,

3H, -CH3), 1.86 (s, 3H, -CH3), 3.92 (dd, Jl = 7.1 Hz, J2= 11.6 Hz, 1H, H-S), 4.04 (dd, J1= 5.o Hz, 12:

11.6 Hz 1H, H-S), 4.20-4.23 (m, 1H, H-4), 4.30 (d, J = 3.7 Hz, 1H, H-l), 5.00 (d, J = 3.1 Hz, 1H, H

3), 5.70 (d,J =3.7 Hz,1H,H-2).


Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 19.85 (-CH3(AcO)), 19.93 (-CH3 (AcO)), 25.50 (-CH3

(iPr)), 25.98 (-CH3(ÍPr)),60.68 (C-S), 75.43 (C-3), 76.12 (C-2), 82.74(C-4), 104.28 (C-l), 111.42

(C(iPr)), 168.84 (CO), 169.68 (CO).

MMProcedimiento general para la desacetilación enzimática utilizando CRL

Una solución del furanósido acetilado (1 g) en DMF (11 ml) se mezcló con buffer

fosfato de sodio 0.1 M pH 7 (110 ml) y luego se añadió Ia CRLa la mezcla de reacción. La

mezcla se agito a 37 °Ccon agitación orbital de 200 rpm y la reacción se siguió por c.c.d, hasta

conversión máxima. La mezcla de reacción se extrajo con AcOEt (3x130ml). Se secó la fase

orgánica con NazSO4anhidro y se evaporó a sequedad. Elresiduo resultante fue purificado por

cromatografía en columna de sílica gel.


Me Mr: 248

Rf:0.24 en Hexano/AcOEt 1:1

Rendimiento: 75%

AcO OAc

Espectro de ‘H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 1.87 (s, 3H, -CH3), 1.92 (s, 3H, -CH3), 3.23 (s, 3H, -CH3),

3.46 (dd, J1= 4.8 Hz, J2= 11.9 Hz, 1H, H-S'), 3.57 (dd, Jl: 3.6 Hz, Jz= 11.9 Hz,1H,H-5),4.00-4.12

(m, 1H, H-4), 4.73 (d, 11= 1.4 Hz, 1H, H-1), 5.02 (dd, Jl: 1.4 Hz, 12: 5.2 Hz, 1H, H-2), 5.12 (t, J =

5.6 Hz,1H,H-3).

Espectro de 13c RMN (cuco, 125 MHz): 6 20.00 (-CH,), 54.99 (OCHg),62.52 (c—5),71.01 (c-2),

74.54 (c-3), 81.59 (c-4), 105.84 (c-1), 169.28 (c0), 169.56 (c0).


Mr: 248

Rf: 0.25 en Hexano: AcOEt 6:4

Rendimiento: 80 %

Espectro de lH RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.15 (s, 3H, -CH3), 2.15 (s, 3H, -CH3), 3.46 (s, 3H,

OCH3), 3.82 (dd, J1 = 3.3 Hz, Jz = 12.0 Hz, 1H, H-S'), 3.87 (dd, J1 = 3.2 Hz, J2 = 12.0 Hz, 1H, H-5),

4.15 (rn, 1H, H-4), 4.97 (dd, Jl = 4.4 Hz, J2= 7.4 Hz, 1H, H-2), 5.15 (d, J = 4.4 Hz, 1H, H-1), 5.21

(dd, J1= 3.5 Hz, 12: 7.4 Hz, 1H, H-3).

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.62(-CH3), 20.93(-CH3), 55.59 (OCH3), 62.33 (C-5),

70.02 (C-Z),71.22 (C-3), 82.40 (C-4), 101.62 (C-1), 170.01 (CO), 170.82(CO).

Mr: 248

° 0Me Rf: 0.21 en Hexano/AcOEt 1:1

Rendimiento: 70%

AcO (c128 2:1)

Espectro de lH RMN (CI3CD,500 MHz) (a:|3 2:1): 8 2.10 (s, 3 H, -CH3a), 2.10 (s, 1.5H, -CH3B),

2.11 (s, 3 H, -CH3a), 2.12 (s, 1.5 H, -CH3B),3.40 (s, 3H, -CH;a), 3.41 (s, 1.5 H, -CH3(3), 3.77-3.82

(m, 2 H, H-Sa,B), 3.90 (dd, J 1: 4.1 Hz, J 2: 12.0 Hz, 1 H, H-Sa), 4.03 (q, J= 4.8 Hz, 0.5 H, H-4B),

4.094.12 (m, 1 H, H4u), 4.92 (s, 1 H, H-la), 4.03 (dd, J 1: 1.6 Hz, J 2: 5.3 Hz, 1 H, H-3a), 5.07

(dd, J l= 4.6 Hz, J z: 6.6 Hz, 0.5 H, H-ZB), 5.09 (d, J = 1.6 Hz, 1 H, H-Za), 5.11 (d, J = 4.6 Hz, 0.5 H,

H-IB), 5.34 (dd, J 1: 4.8 Hz, J 2: 6.6 Hz, 0.5 H, H-3B).

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.00 (-CH3), 54.69 (OCH3B),55.67 (OCHga), 61.84 (C

SB), 63.98 (C-Sa), 76.99 (C-Za), 77.06 (C-ZB),77.16 (C-3a), 81.55 (C-3B), 82.09 (C-4a), 82.81

(C-4B),100.74 (C-la), 106.49 (C-IB), 169.28 (CO), 169.56 (C0).


Metil2,5-di-0-acetiI-a.B-D " ‘ ' " (12):

AcO

oM :

OH OMe r 248


Rendimiento: S4 %OAc

(azfl 3:2)

La desacetilación del metil 2,3,S-tri-O-acetiI-a,B-D-xi|ofuranósido, utilizando CRLcomo

biocatalizador, dio el metil 2,5-di-O-acetiI-u,B-D-xiIofuranósidos como mezcla anomérica, con

un rendimiento de 54 %. (ozfi 3:2). En este caso se pudieron separar cromatográficamente

pequeñas fracciones de los anómeros puros, para asi faciltar la asignación espectroscópica,

que se presentará por separado.

Anómero 6

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 8 2.06 (s, 3H, -CH3), 2.08 (s, 3H, -CH3), 3.40 (s, 3H,

0CH3), 4.18 (m, 1 H, H-3), 4.23 (dd, J¡ = 6.9 Hz, Jz = 11.4 Hz, 1H, H-S), 4.38-4.41 (m, 1H, H-4),

4.44 (dd, J¡= 4.5 Hz, Jl: 11.4 Hz, 1H, H-S), 4.91 (s, 1 H, H-1), 4.99 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-2).

Espectro de 13‘CRMN (CI3CD,125 MHz): 8 20.72 (-CH3), 20.91 (-CH3), 55.45 (OCHg), 63.68 (C-S),

74.25 (C-3),80.93, 81.97 (C-2,C-4), 106.49 (C-1), 169.88 (C0), 170.86 (C0)

Anómero a

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.08 (s, 3H, -CH3), 2.12 (s, 3H, -CH3), 3.38 (s, 3 H,

0CH3),4.17 (dd, J1= 5.8 Hz,J¡= 12.0 Hz, 1H, H-S), 4.30433 (m, 1H, H-4), 4.45 (dd, Jl: 4.1 Hz, J,

= 12.0 Hz, 1H, H-5), 4.48 (dd, J, = 5.5 Hz, J; = 6.6 Hz, 1H, H-3), 4.85 (dd, J, = 4.4 Hz, 12= 5.5 Hz,

1H, H-2), 5.07 (d, Jl: 4.4 Hz, 1H, (+1)

Espectro de 13c RMN (cuco, 125 MHz): 8 20.72 (-CH3),20.95 (-CH3),55.61 (0CH3), 62.86 (c-5),

73.73 (c-3), 75.57 (c-2), 30.72 (c-4), 100.41 (c-1), 171.17 (c0), 171.45 (c0)

Metil 2,3-di-O-acetiI-CLB-L L' ‘ ‘ 'J (13):

O

° OMe Mr: 243

Rf:0.20 en Hexano: AcOEt 6:4

H0 Rendimiento: 50 %OAc

(c1235:1)

IOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0...1

.0OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO00.000.000...OOOOOOOOOOI


Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz) ((1235:1): 6 2.06 (s, 3 H, -CH3a), 2.07(s, 0.6 H, -CH3[3),

2.07 (s, 3 H, CHaoL),2.08 (s, 0.6 H,-CH3B), 3.37 (5,3 H, CH30L),3.38 (s, 0.6 H, CH3B), 3.70 (dd, J 1=

5.0 Hz, J 2= 11.8 Hz, 0.2 H, H-SB) 3.75-3.79 (m, 1.2 H, H-Sa,B), 3.85 (dd, J 1=3.5 Hz, J 2= 12.0 Hz,

1 H, H-Sa), 3.99-4.00 (m, 0.2 H, H-4B),4.054.09 (m, 1 H, H-4a), 4.88 (s, 1 H, H-la), 4.99 (dd,J

1: 0.6 Hz, J 2: 1.7 Hz, J 3: 5.3 Hz, 1 H, H-3a), 5.03 (dd, J 1= 4.6 Hz, J 2: 6.6 Hz, 0.2 H, H-ZB), 5.06

(dd, J1= 0.4 Hz, J 2: 1.7 Hz, 1 H, H-2a), 5.08 (d, J = 4.6 Hz, 0.2 H, H-IB), 5.31 (dd, J 1: 4.8 Hz, J 2:

6.6 Hz, 0.2 H, H-3B).

Espectro de 13c RMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.41 (-CH3), 20.57 (-CH3), 20.63 (-CH3), 20.65 (-CH3),

54.65 (OCH3G),55.58 (OCHaB),61.76 (C-Sa), 64.02 (C-SB), 75.77 (C-3B), 77.02 (C-3a), 77.10(C

ZB), 81.62 (C-Za), 81.98 (C-4B), 82.83 (C-4a), 100.79 (C-IB), 106.51 (C-la), 169.73 (CO),

170.25 (CO), 170.44 (CO), 170.75 (CO).

5-O-acetil-1 2-0-¡50 ro iliden-a-D-xilofuranosa 26:

0“ Mr: 232


o Rendimiento: 95 %

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 8 1.33 (s, 3H, -CH3(¡Pr)), 1.51 (s, 3H, CH3(iPr)), 2.12 (s,

3H, -CH3),4.14 (sa, lH, H-3), 4.18 (dd, Jl = 5.4 Hz, J2 = 11.5 Hz, 1H, H-S), 428-425 (m, 1H, H-4),

4.51 (dd, J1 = 7.0 Hz, J2 = 11.5 HZ, 1H, H-S), 4.56 (d, J = 3.6 Hz, 1H, H-1), 5.93 (d, J =3.6 Hz, 1H,

H-2).

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.87 (-CH3(AcO)), 26.17 (-CH3(iPr)), 26.78 (-CH3(iPr)),

61.22 (C-5), 74.52 (C-3), 78.29 (C-2), 85.06 (C-4), 104.74 (C-1), 111.89 (C(¡Pr)), 171.94 (C0).


sagientuml como biocatalizadgr

Procedimiento general para la desacetilación enzimática utilizando tejido vegetal (trozos de

banana)

Se cortaron cubos de banana ecuatoriana Musa sapientum, variedad Cavendish, con

un coeficiente de maduración de aproximadamente 1.80,1accesible en comercios. Estos cubos

de menos de 1 cm3, fueron lavados sucesivamente con una solución acuosa 1 % en NaCIO,

agua destilada, etanol, agua destilada nuevamente y una solución de buffer fosfato 100 mM,

pH=7. Para Ia reacción de desacetilación, se tomaron 10 g de los cubos de banana pre tratados

y se los resuspendió en 10 ml de buffer fosfato 100 mM (pH=7). Separadamente, el sustrato

(0.3 mmol) se disolvió en 1 mI de DMF o AcOEt, dependiendo del experimento. La reacción

comenzó con el mezclado de Ia solución y la suspensión de banana, y la mezcla de reacción se

agitó en un agitador recíproco (379€, 200 rpm) hasta conversión máxima a producto. Una vez

concluida Ia reacción, la mezcla fue centrifugada (5 min, 3000 rpm) y el sobrenadante se

extrajo con AcOEt, se secó con Na2504(s) anhidro, y finalmente, se filtró y concentró por

evaporación del solvente a presión reducida. Lasmezclas crudas de reacción fueron estudiadas

mediante análisis por RMNy luego se purificaron por cromatografía en columna de sílice gel

utilizando mezclas de hexano: AcOEt como solvente de elución. Se realizaron, asimismo,

experimentos de control de hidrólisis en ausencia de biocatalizadores, recuperando en todos

los casos la cantidad inicialde producto acetilado.


Metil 2 3-di-0-acetiI-a-D-ribofuranósido 10a :

La desacetilación utilizando trozos de banana como biocatalizador, del metil 2,3,S-tri

O-acetiI-a-D-ribofuranósido dio como único producto el metil 2,3-di-O-acetiI-a-D

ribofuranósido, con un rendimiento de aproximadamente 99%. Las asignaciones espectrales

son idénticas al producto 10a, obtenido por desacetilación enzimática utilizando Ia CRL.

‘ Bailey, M.; J. Am. Chem. Soc., 1912, 36, 1706

DOÓOOOOOOOOOOOOOÓOOOOÓOOOOOOOÓOOOOOOOOQ0...0000001


Metil 2 3-di-O-acetil- -D-ribofuranósido 10b metil 2 5-di-O-acetil- -D-ribofuranóside 14bmetil 3 5-di-O-acetil- -D-r¡bofuranósido 15h:

Ladesacetilación utilizando trozos de banana como biocatalizador del metil 2,3,5-tri-O

acetiI-B-D-ribofuranósido dio los tres posibles productos de desacetilación de forma

equimolar, con un rendimiento global de 59%. Los productos obtenidos no pudieron

separarse, obteniéndose como una mezcla luego de la purificación por cromatografía en

columna.

Metil35-di-O-acetiI-a -D-arabinofuranósido 17a 17h:

0 Mr: 248

o CME Rf: 0.22 en Hexano: AcOEt 1:1

Rendimiento: 30 %

AcO

La desacetilación utilizando trozos de banana como biocatalizador a conversiones

bajas, del metil 2,3,5-tri-O-acetil-u,B-D-arabinofuranósido dio como producto mayoritario el

metil 3,5-di-O-acetiI-u,B-D-arabinofuranósido, con un rendimiento de aproximadamente 30%.

A mayores conversiones se obtuvieron mezclas de este producto junto con varios productos

monodesacetilados del anómero a.

Espectro de 1HRMN (CI3CD,500 MHz): 8 2.09 (s, 3H, -CH3), 2.10 (s, 3H, -CH3), 2.11 (s, 3H, -CH3),

2.12 (s, 3H, -CH3), 3.40 (s, 3H, -OCH3), 3.47 (s, 3H, -OCH3),4.09-4.12 (m, 1 H, H-4u), 4.12 (sa, 1

H, H-2a), 4.17 (dd, Jl = 7.1 Hz, J; = 11.5 Hz, 1H, H-SB), 4.23-428 (m, 3 H, H-4,-ZB,-5u), 4.35 (dd,

J1= 4.0 Hz, J; = 11.4 Hz, 1H, H-5a), 4.37 (dd, Jl = 4.0 Hz, Jz= 11.5 Hz, 1H, H-5I3),4.66 (dd, J] = 2.4

Hz, Jz = 6.1 Hz, 1H, H-3u), 4.89 (d, J = 4.6 Hz, 1H, H-IB), 4.91 (s, 1 H, H-la), 5.05 (dd, J1= 5.1 Hz,

Jz= 6.2 Hz, 1H, H-3B).

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHZ): 6 20.78 (-CH3), 20.76 (-CH3), 20.85 (-CH3), 20.89 (-CH3),

55.14 (OCHga), 55.56 (OCH3I3),63.32 (C-Sa), 65.43 (C-SB), 76.57 (C-ZB), 78.92 (C-Za), 79.28 (C

38), 79.41 (C-4B),81.05 (C-3a), 81.22 (C-4a), 102.40 (C-lB),108.95 (C-lu) 170.63 (CO), 170.69

(CO),170.95 (CO), 171.79(CO).


Metil3 S-di-O-acetil- -D-xilofuranósido 19 Metil2S-di-O-acetil-o-D-xilofuranósido 18:

AcO AcO

OMe

18 OAC 19OH

Ladesacetilación utilizando trozos de banana como biocatalizador del metil 2,3,S-tri-O

acetil-o,B-D-xi|ofuranósido produjo una mezcla de los siguientes productos: metil 3,5-di-0

acetil-B-D-xiIofuranósido y metil 2,5-di-O-acetiI-a-D-xilofuranósido, con un rendimiento global

de aproximadamente 43%. ((1235.33.8). Se pudieron separar cromatograficamente pequeñas

porciones de los isómeros puros, facilitándose de esta manera la asignación espectroscópica.

Metil3 S-di-O-acetil- -D-xi|ofuranósido 19 :

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.08 (s, 3H, -CH3), 2.10 (s, 3H, -CH3), 3.40 (s, 3H,

OCH3), 4.16 (m, 1 H, H-2), 4.20 (dd, Jl = 7.3 Hz, Jz = 11.6 Hz, 1H, H-5), 4.32 (dd, J¡ = 4.7 Hz, Jz =

11.6 Hz, 1H, H-5), 4.574.61 (rn, 1H, H-4), 4.87 (d, J = 1.4 Hz, 1 H, H-1), 5.06 (dd, J¡ = 2.3 Hz, Jz =

6.2 Hz, 1H, H-3),

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.71 (-CH3), 20.78 (-CH3), 55.53 (OCHg), 63.33 (C-S),

77.34 (C-3), 78.78 (C-Z),80.11 (C-4), 109.20 (C-1), 170.75 (CO), 171.10 (CO)

Metil 3 S-di-O-acetil- -D-xilofuranósido 18 :

Las asignaciones espectrales del metil 2,5-di-O-acetil-a-D-xiIofuranósido son idénticas

al producto obtenido por desacetilación enzimática del metil 2,3,5-tri-0-acetil-D-xilofuranósido

(anómero a, compuesto 12) utilizando la enzima comercial CRL.

Butil 3,5-di-O-acetil-B-D " ‘ ' " (22) v butil 2.5-di-O-acetil-o-D-xilofuranósido (21):

Ladesacetilación utilizando trozos de banana como biocatalizador del metil 2,3,5-tri-O

acetiI-a,B-D-xilofuranósido dio una mezcla de los productos: butil 3,5-di-0-acetiI-B-D

xilofuranósido y butil 2,5-di-O-acetiI-a-D-xilofuranósido con un rendimiento global de 72%. Los

isómeros no pudieron separarse completamente por métodos cromatográficos, obteniéndose

el anomero B puro en gran proporción (32 %).


Mr: 290


Rendimiento: 32 %

OH

Espectro de lH RMN (CI3CD,500 MHz): 6 0.93 (t, J = 7.25 Hz, 3H, -CH3(But)), 1.41-1.33 (m, 2H,

CH2(But)), 159-153 (m, 2H, -CH2(But)), 2.09 (s, 3H, -CH3), 2.10 (s, 3H, -CH3), 3.42 (dt, 11= 6.6

Hz, J, = 9.5 Hz, 1H, CH2 (But)), 3.73 (dt, 1,: 5.9 Hz, Jz = 9.4 Hz, 1H, CH2 (But)), 4.17 (d, J1 = 2.18

Hz, 1H, (+2), 4.20 (dd, 1,: 7.9 Hz,J2= 115 Hz, 1H, H-S), 4.32 (dd, Jl: 45 Hz,J2= 115 Hz,1H,H

5), 459-356 (rn, 1H, H-4), 4.91 (d, 11= 1.4 Hz, 1H, H-1), 5.05 (dd, J¡ = 2.2 Hz, iz: 6.1 Hz, 1H, H

3).

Espectro de 13c RMN (CI3CD,125 MHz): 6 13.47 (-CH3 (But)), 19.11 (-CH2(But)), 20.67 (-CH3),

20.77 (-CH3),3154 (CH2(But)), 63.40 (c-5), 67.96 (OCH2(But)),77,22 (c-3), 78.88 (c-2), 80.06

(c-4), 107.92 (c-1), 170.73 (c0), 171.14 (c0).

Butil 2.5-di-0-acetil-a-D " ‘ 'sido (21):

AcO

o Mr: 290

Rf: 0.28 en Hexano: Ac0E8:30/\/\OAc

Rendimiento: 40 % (a y [3)

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 0.89 (t, J = 7.4 Hz, 3H, -CH3(But)), 130-139 (m, 2H,

CH2(But)), 1.49-1.56 (m, 2H, -CH2(But)), 2.09 (s, 3H, -CH3), 2.12 (s, 3H, -CH3), 3.38-3.46 (m, 1H,

CH2(But)), 359-373 (m, 1H, CH; (But)), 4.16 (dd, J1= 5.7 Hz, J2= 12.0 Hz, 1H, H-5), 4.29-434

(rn, 1H, H-3), 4.47 (dd, 11= 4.4 Hz, Jz= 12.0 Hz, 1H, H-5), 4534.49 (m, 1H, H-4),4.79 (dd, J1= 4.7

Hz,Jl: 5.2 Hz, 1H, H-2),5.19 (d, Jl: 45 Hz,1H,H-1),

Espectro de 13c RMN (CI3CD,125 MHz): 6 13.80 (-CH3 (But)), 19.18 (-CH2(But)), 20.72 (-CH3),

21.01 (-CH3),31.52 (CH2(But)), 62.86 (c-5), 68.93 (0CH2(But)), 73.80 (c-3), 75.43 (c-2), 80.72(C

4), 99.45 (c-1), 171.16 (c0), 171.34 (c0)


5-0-acetil-12-O-iso ro iIiden-a-D-xilofuranosa 26:

Ladesacetilación utilizando trozos de banana como biocatalizador, del 3,5-di-0-acetil

1,2-O-isopropiIiden-a-D-xilofuranosa dio como único producto el S-O-acetiI-1,2-O

isopropiliden-u-D-xilofuranosa, con un rendimiento del 87%. Las asignaciones espectrales son

idénticas al producto 26, obtenido por desacetilación enzimática utilizando la enzima

comercial CRL.(8.3.2.1)

AcO O=S=o Mr:386

/ O Rf:0.4 Hexano: AcOEt 8:3

Rendimiento: 69 %o

o

A una solución de 5-0-acetiI-1,2-0-isopropiliden-a-D-xilofuranosa (26, 0.49 g, 2.16

mmol) en 1 mI de THFanh., se añadió 0.08 ml de Py. (9.72 mmol) y 1.2 equivalents de la base

fuerte, BDDDP(0.07 g). Esta solución se enfrió a 0 °C y se añadió cloruro de p-toluensulfonilo

(p-TsCI, 0.16 g, 8.64 mmol). La reacción se siguió por c.cd. Luego de 5 h de reacción, Ia

solución se neutralizó mediante el agregado de 1 mI de HCI5%. Finalmente, la mezcla de

reacción neutralizada se disolvió en diclorometano (9 ml) y se extrajo secuencialmente como

se cita a continuación: 5% HCI(3 x 10 ml), S % NaHCO; (3 x 10 ml) y agua destilada (3 x 10 ml).

El extracto se secó con Na2504 (sólido) y evaporó a sequedad. El residuo resultante fue

purificado por cromatografía en columna de sílica gel (Hexano: AcOEt 8:3). Se obtuvo así, el

producto 28a (0.57 g, 69%de rendimiento).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 8 1.31 (s, 3H, -CH3(iPr)), 1.49 (s, 3H, CH3(iPr)), 1.97 (s,

3H, -CH3), 2.47 (s, 3H, CH3(Bn)), 4.06 (dd, J¡ = 5.5 Hz, Jz= 11.5 Hz, 1H, H-5), 4.15 (dd, J¡ = 6.8 Hz,

Jz= 11.5 Hz, 1H, H-5), 4.40-4.43 (m, 1H, H-4), 4.73 (d, J = 3.6 Hz, 1H, H-1), 4.86 (d, J = 2.7 Hz, 1H,


H-3), 5.95 (d, J =3.6 Hz, 1H, H-2), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2 H, aromat), 7.82 (d, J = 8.2 Hz, 2 H,

aromat)

Espectro de 13CRMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.59 (-CH3(AcO)), 26.15 (-CH3(iPr)), 26.53 -CH3(iPr)),

60.92 (C-S), 76.46 (C-3), 81.49 (C-2), 83.10 (C-4), 104.81 (C-1), 112.53 (C(iPr)), 127.92, 130.07 ,

145.56 (aromat.), 170.24 (CO).

S-O-acetiI-3-0' " " " " 1,2-0' "'J a D " ‘ (28_bl

N Mr:362

o=s=o Rf:0.33 Hexano:AcOEt8:3AcO

o Rendimiento: 70 %

O

O

Se enfrió una solución de 5-0-acetil-1,2-0-isopropiliden-a-D-xilofuranosa (26, 0.275 g,

1.18 mmol) en 6 ml de CHzClzy 0.17 ml de Py. (20.54 mmol) a -35 °C. Una vez alcanzada la

temperatura se añadió SO¡CI2(0.12 ml, 1.52 mmol), y se dejó avanzar la reacción por 0.5 hs.

Luego se añadió 1H-imidazol (0.76 g, 10.60 mmol), y se elevó la temperatura de reacción a T.

amb. La reacción se siguió por c.c.d., hasta desaparición del reactivo de partida (16 h). La

mezcla de reacción se disolvió en diclorometano (10 ml) y se extrajo de NaHCOa y agua,

secuencialmente. Elextracto se secó con NazSO.y evaporó a sequedad. El residuo resultante

fue purificado por cromatografía en columna de sílica gel (Hexano: AcOET1:1). Se obtuvo así,

el producto 28h (0.30 g, 70 % de rendimiento).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 8 1.24 (s, 3H, -CH3(iPr)), 1.43 (s, 3H, CH3(¡Pr)), 1.96 (s,

3H, -CH3),3.98 (dd, Jl = 6.8 Hz, Jl: 11.4 Hz, 1H, H-5), 4.24 (dd, Jl: 6.1 Hz, J2= 11.4 Hz 1H, H-S),

4.33-4.41 (m, 1H, H-4), 4.49 (d, J = 3.7 Hz, 1H, H-1), 4.88 (d, J = 2.8 Hz, 1H, H-3), 5.91 (d, J =3.7

Hz, 1H, H-2), 7.16 (sa, 1 H, aromat), 7.35 (sa, 1 H, aromat), 7.988(s, 1 H, aromat).

Espectro de 13C RMN (CI3CD, 125 MHz): 6 20.52 (-CH3 (AcO)), 26.33 (-CH3 (iPr)), 26.87 (

CH3(iPr)), 59.73 (C-S), 75.87 (C-3), 82.28 (C-2), 85.66 (C-4), 104.62 (C-1), 112.97 (C(iPr)),

117.87, 131.70 , 136.93 (aromat), 170.09 (CO).


AcO

Mr: 257

o Rf:0.6 Hexano: AcOEt 1:1

N3 0 Rendimiento: 43 %

A una solución del 5-0-acetil-3-0-imidazoilsulfonil-1,2-0-isopropiliden-a-D

xilofuranosa (28h, 0.3g, 0.83 mmol) en DMF (18 ml), se agregaron 15 equiv. de azida sódica

(0.80 g, 12.45 mmol), y se calentó a 70 °C por 3 días. La mezcla de reacción se evaporó a

presión reducida, el residuo se disolvió en diclorometano (10 ml) y se extrajo con agua. El

extracto se secó con NazSO.y se evaporó a sequedad. Elresiduo resultante fue purificado por

cromatografía en columna de sílica gel, obteniéndose así, el producto 29 (0.095 g, 43% de

rendimiento).

Espectro de 1H RMN (cuco, 500 MHz): 5 1.29 (s, 3H, -CH3(iPr)), 1.50 (s, 3H, CH3(iPr)), 2.02 (s,

3H, -CH3), 3.23 (dd, Jl = 4.2 Hz, J2= 9.5 Hz, 1H, H-3), 3.93 (dd, J, = 4.9 Hz, Jz = 12.0 Hz, 1H, H-S),

4.164.19 (m, 1H, H-4), 4.32 (dd, Jl = 2.8 Hz, J, = 12.0 Hz, 1H, H-S), 4.67 (ta, J = 4.1 Hz, 1H, H-2),

5.74 (d,J =3.6 Hz, 1H,H-1).

Espectro de 13c RMN (cuco, 125 MHz): 5 20.7o (-CH3 (Ac0)), 26.32 (-CH3 (¡Pr)), 26.37 (

CH3(iPr)),61.19 (c-5), 62.48 (c-3), 75.43 (c-2), 79.37 (c-4), 104.16 (c-1), 113.29 (C(¡Pr)),170.09

(c0).

Mr: 215

Rf: 0.48 Hexano: AcOEt 1:1

Rendimiento: 100 %

Se disolvió el S-O-acetiI-3-azido-3-desoxi-1,2-0-isopropiliden-a-D-ribofuranosa (29,

0.095 g, 0.35 mmol ) en 1.2 ml de MeOH, y se añadió a esta solución 0.06 g de K2C03,

agitándose la mezcla a temperatura ambiente por 8 h. hasta determinar su finalización por

c.c.d. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida, se disolvió en diclorometano (10


mi) y se extrajo con agua. El extracto se secó con NaZSO.y se evaporó a sequedad. El residuo

resultante fue purificado por cromatografía en columna de sílica gel (Hexano: AcOEt 1:1),

obteniéndose así, el producto 30 (0.075 g, 100%).

Espectro de 1HRMN (cuco, 500 MHz): 6 1.31 (s, 3H, -CH3(iPr)), 1.51 (s, 3H, CH3(iPr),3.50 (dd, i1

= 4.2 Hz, Jz = 9.7 Hz, 1H, H-3), 3.64 (dd, 1,: 2.8 Hz, J; = 12.7 Hz, 1H, (+5), 3.92 (dd, J1= 2.2 Hz, J,

= 12.7 Hz, 1H, H-S), 4.os-4.oa (m, 1H, (+4), 4.69 (ta, J = 4.1 Hz, 1H, H-2), 5.75 (d,J =3.6 Hz, 1H,

H-1).

Espectro de 1"c RMN (cuco, 125 MHz): ó 26.32 (-CH3(iPr)), 26.54 (-CH3(iPr)),59.35 (c-5), 60.10

(c-3), 78.18 (c-2), 30.13 (c-4), 104.60 (c-1), 113.20 (C(iPr)).

3-azido-3-desoxi-1,2-O-isopropiIiden-a-D-ribofuranosa S-difenilfosfato (331

O||

O//P\ Mr:447o O

o Rf:0.78 Hexano: AcOEt 8:3

Rendimiento: 68 %

N30

El compuesto 30 seco (0.075 g, 0.35 mmol) fue disuelto en diclorometano (1.5 ml) y

TEA (0,1 ml, 0.70 mmol) y la solución se enfrió a -10 °C. A esta solución se le añadió, con

agitación, el reactivo fosforilante difenil clorofosfato (0.18 ml, 1.23 mmol). Se agitó esta

solución por 8 h a temperatura ambiente, hasta desaparición del sustrato. Luegose añadió a la

solución, diclorometano (10 ml) y se extrajo secuencialmente como se cita a continuación: HCI

0.5 M (3 x 10 ml), NaHCO; 5 % (3 x 10 ml) y agua destilada (3 x 20 ml). El extracto se secó con

NaISO.y se evaporó a sequedad. Elfosfato 33 fue purificado por cromatografía en columna de

sílica gel (Hexano: AcOEt 1:1), para así obtener el producto puro con un 68 % de rendimiento (

0.11 g).

Espectro de lH RMN (CI3CD,500 MHZ): 6 1.35 (s, 3H, -CH3(¡Pr)), 1.55 (s, 3H, CH3(iPr), 3.49 (dd, JI

= 4.6 Hz, Jz = 9.6 Hz, 1H, H-3), 4.19 (dq, Jl = 2.4 Hz, Jz = 9.6 Hz, 1H, H-4), 4.35 (ddd, Jl = 3.2 Hz, Jz

= 7.7 Hz, 13: 11.8, 1H, H-S), 4.60 (ddd, Jl = 2.3 Hz, Jl: 6.6 HZ,13= 11.8, 1H, H-S), 4.67 (d, J = 4.1

Hz, 1H, H-2), 5.70 (d, J =3.5 Hz, 1H, H-l), 7.18-7.24 (m, 6 H, aromat.) , 733-736 (m, 4 H,

aromat.)


Espectro de 13CRMN (C'3CD, 125 MHZ): 5 26.36 (-CH3(¡Pr)), 26.41 (-CH3(iPr)), 59.85 (C-3), 66.01

(d, J = 5.98 Hz, C-S), 76,40 (d,J = 7.40 Hz, C-4), 79.80 (C-Z), 104,10 (C-1), 113.55 (C(¡PI')),120.00

(d, J = 4.92 Hz), 120.05 (d, J =4.95 Hz), 125.46 , 129.77 (aromat.)

2.3.4- Síntesis de las furanosas S-fosfato

2.3.4.1- Singgsisde ríbosa 5-fosfatg

Metil 2,3,5-tri-O-acetiI-fi-D-ribofuranósido (1h)

La síntesis se encuentra descripta anteriormente en la sección de síntesis de metil

2,3,5-tri-O-acetiI-D/L-pentofuranósidos (8.3.1.1), así como las asignaciones espectrales y los

rendimientos correspondientes. Se utilizó solo el anomero B para asi facilitar las posteriores

asignaciones espectrales.

Metil 2 3-di-O-acetil- -D-ribofuranósido 10h :

Las asignaciones espectrales así como el rendimiento de Ia reacción se describen

anteriormente en la sección de síntesis quimioenzimática de furanosas diacetiladas —

reacciones enzimáticas de desacetilación utilizando CRL(8.3.2.1)

alfi-D-ribosa 5-fosfato (sal disódica) (34):

o

“KL.“3° o Mr: 274

Rf:0.3 NHJisopropanoI/HZO 9:9:2

Rendimiento: 63%

OH OH

En un balón bajo atmósfera de N2se cargaron ACN(1.5 ml) y POCI; (0.4 mI 4.25 mmol),

enfriándose la mezcla con un baño refrigerante de hielo/NaCI(s), agregándose, luego, Py

(0.23ml, 2.83 mmol) a la solución. Posteriormente, se adicionó gota a gota, una solución del

compuesto metil 2,3-di-O-acetiI-B-D-ribofuranósido 2a (0.70 g, 2.83 mmol) en ACN(1.5 ml) a Ia

solución enfriada, a una velocidad tal que la temperatura de reacción no excediera los 0°C. La

mezcla de reacción fue agitada por 2 hs a 0°C. Luego, la mezcla fue volcada sobre 11.5 ml de

0......00.000....OOOOOOOOOOOOOOOO...OOOÓOOOOOOOOOG


agua destilada fría y calentada en un baño de agua a 70 °C por 1 h, para así, hidrolizar los

grupos protectores. Lasolución fue enfriada en un baño de hielo, el pH se ajustó a 5 con NaOH

10 N, y fueron añadidos 3 ml de una solución saturada de BaClz. Los sólidos precipitados

fueron separados por centrifugación y descartados (Ba;(PO.)2). Se enfrió nuevamente el

sobrenadante en un baño de hielo y el pH se ajustó a 7.5. Luego, se agregó lentamente etanol

(1.5 volumenes) a Ia solución con agitación. Se centrifugó y se recuperó el sólido precipitado.

Éste se lavó con etanol. Se obtuvieron 0.79 g (2.16 mmol) de Ia sal de bario.

El sólido resultante, fue disuelto en 6 ml de agua destilada y pasado por una resina de

intercambio iónico, Dowex X2-200 (H’), eluyendo con agua destilada. Las fracciones ácidas

fueron recolectadas y neutralizadas con una solución 10 N de NaOH. Elagua fue removida por

liofilizaciónpara así obtener el producto 34 con un rendimiento del 63% (0.492 g).

Espectro de 1HRMN (Dzo, 500 MHz): 6 3.80 (m, 3 H), 3.88 (m, 1.5 H), 4.03 (m, 2.5 H), 4.14 (m,

1 H), 4.18 (m,0.5 H), 5.19 (m, 1H), 5.35 (m, 0.5 H).

Espectro de 13cRMN (CI3CD,125 MHz): 6 64.62 (c-5), 65.48 (c-5), 71.15, 71.61, 76.22 (c-2,c-3),

82.68 (c-4), 82.79 (c-4), 97.07(C-1a), 102.o1(c-1)3).

Espectro de 31PNMR (c¡,co, 202.4 MHz): 6 4.34

2.3.4.2- Síntesis de arabinosa S-fosfato

Metil 2.3.5-tri-O-acetil-a,B-D L' ‘ ' " (2)

La síntesis se encuentra descripta anteriormente en la sección de síntesis de metil

2,3,5-tri-O-acetiI-D/L-pentofuranósidos (8.3.1.1), así como las asignaciones espectrales y los

rendimientos correspondientes.

Metil 2,3-di-O-acetiI-a.B-D-ar L' ‘ ' '4 (11):

Las asignaciones espectrales así como el rendimiento de la reacción se describen

anteriormente en la sección de síntesis quimioenzimática de furanosas diacetiladas

reacciones enzimáticas de desacetilación utilizando CRL(2.3.2.1).


Metil2,3-di-0-acetil-a,B-D L“ ‘ S-dibencilfosfatol39):

iiBnO\PO

BnO/o Mr: 480

Rf: 0.51 en HexanozAcOEt 1:1

Rendimiento: 79 %

A60 (¡1:6 1:1)

El compuesto 11 seco (0.78 g, 3.15 mmol) fue disuelto bajo atmósfera de N2en THF

anhidro (38 ml). A esta solución se le añadió, con agitación, 1H-tetrazol (1.97 g, 28.35 mmol) y

se agitó hasta disolución del mismo. Luego, fue agregada la dibencil N,N

diisopropilfosforamidita (1.05 ml, 3.15 mmol) gota a gota y la mezcla fue agitada 20 minutos a

temperatura ambiente. Posteriormente, para la oxidación de la fosforamidita, se enfrío la

mezcla de reacción a -40 °Cen un baño de hielo seco en acetona y se le añadió una solución

del reactivo oxidante terbutil hidroperóxido (TBHP)en decano (6M, 1.05 ml, 6.3 mmol). Se

agitó esta solución por 2 horas a temperatura ambiente, hasta desaparición del sustrato.

Finalmente, se detuvo Ia reacción con una solución 10 % de NaH503 (6 ml), y se evaporó a

sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (20 ml) y se extrajo secuencialmente como

se cita a continuación: 10% NaHSOa(3 x 20 ml), 5 % NaHCO; (3 x 20 ml) y agua destilada (3 x 20

ml). Elextracto se secó con NaZSO.anhidro y se evaporó a sequedad. El fosfato bencilado fue

purificado por cromatografía en columna de sílica gel (Hexano:AcOEt2:1), para así obtener el

producto puro con un 79 % de rendimiento (39, 1.2 g).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,soo MHz): 5 2.01 (s, 3H, -CH3), 2.04 (s, 3H, -CH3), 2.05 (s, 3H, -CH3),

2.07 (s, 3H, -CH3),3.32 (s, 3H, -0CH3), 3.35 (s, 3H, -OCH,), 4.12-4.33 (m, 6 H), 4.39 (m, 1 H), 4.99

(dd, J1=1.4 Hz, Jz= 4.a Hz, 1 H), sos-5.09 (m, 11H), 5.23 (dd, J =4.3 Hz, J =6.7 Hz, 1 H), 7.32 (s,

20 H, aromat.).

Espectro de 13c RMN (cuco, 125 MHz): 6 20.44 (-CH3),20.49 (-CH3),20.57 (-CH3), 20.32 (-CH3),

54.79 (-OCH3),55.32 (-0CH3), 66.37 (d, J= 5.4 Hz, c-5), 68.67 (d, J= 5.4 Hz, -CH2(Bn),69.31 (d, J:

5.4 Hz, -CH¡(Bn)),75.46, 76.76, 77.50, 80.92 (d, 1:7.2 Hz, c-4), 81.21, 83.06 (d, 1:7.2 Hz, c-4),

1o1.11(c-1[5), 106.69 (c-1o), 127.85, 127.89, 128.48, 135.64, 135.74 (d, J: 7.2 Hz) (aromat.),

169.61(CO), 169.80(C0), 17o.o1(c0), 170.08(CO).

Espectro de “P RMN(cuco, 202.4 MHz):8 -1.33.


a,fi-D-arabinosa S-fosfato (sal disódica) [40):

0

Na0\\ll hAr:274P0

NaO/ Rf:0.33NH3/isopropanol/H209:9:20

o OH Rendimiento: 68%

OH

Una solución del compuesto 39 (1.2 g , 2.5 mmol) en 40 mI de AcOEt fue hidrogenada

con 400 mg del catalizador, Pd(OH)¡,a temperatura ambiente y presión atmosférica, hasta

conversión total del sustrato, seguido por c.c.d. Luego de 12 hs, se añadió agua destilada y Ia

mezcla de reacción fue filtrada, y evaporada bajo presión reducida. Posteriormente, se añadió

una solución de HCI 1.5 M (40ml), y la mezcla se mantuvo con agitación a 70 °C por 2 hs.

Luego, fue enfriada en un baño de hielo y el pH ajustado a 5 con una solución 10 N de NaOH. A

Ia solución enfriada se le añadieron 3 ml de una solución saturada de BaCIz.Los sólidos

precipitados fueron separados por centrifugación. Elsobrenadante fue enfriado nuevamente

en un baño de hielo y el pH se ajusto a 7,5. Se añadió, luego, lentamente etanol (1.5

volúmenes) a Ia solución bajo agitación. Lamezcla fue centrifugada y lavada con etanol

EIsólido resultante, fue disuelto en 6 mI de agua destilada y pasado por una resina de

intercambio iónico, Dowex X2-200 (H‘) eluyendo con agua destilada. Las fracciones acidas


Iiofilizaciónpara así obtener el producto 40 con un rendimiento del 68% (0.45 g).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 8 3.86-3.96 (m, 5 H), 4.02 (dd, Jl =2.8 Hz, Jz = 4.3 Hz, 1

H), 4.08-4.10 (m, 2 H), 4.11-4.16 (m, 1 H), 4.19 (rn, 1 H), 5.26 (d, J=2.8 Hz, 1 H), 5.27 (d. J=4.3

Hz,1H).

Espectro de 13CRMN (CI3CD, 125 MHz): 63.68 (cl, J= 3.63 Hz, C-S), 64.82 (d, J= 3.63 Hz, C-S),

74.19, 75.59, 76.04, 80.43 (d, J=7.27 Hz, C-4), 81.23, 82.20 (d, J=7.27 Hz, C-4), 95.22 (C-lB),

101.03(C-10),.

Espectro de 31PRMN (CI3CD,202.4 MHz ): 6 3.10.


2.3.4.3- Síntesis de 2-desoxirribgsa á-fosfato

léLS-Tri-O-acetiI-2-desoxi-c1,l3-D-.'L l (41)

AGO Mr: 259

o Rf:0.51 en Hexano/AcoEt 1;1

Rendimiento:90%

(c123 1:1)

AcO

A una solución agitada de 2-desoxi-a,B-D-ribosa (0.4 g, 2.98 mmol) en THF(22.5 ml), se

añadió anhídrido acético (1 ml, 10.43 mmol), seguido por la adición del biocatalizador

Novozyme 435 (CALB,0.6 g), y se continuó bajo agitación orbital a 45 °C por 2 h, hasta que se

verificó conversión completa a producto por c.c.d. La mezcla fue posteriormente filtrada y el

solvente fue evaporado bajo presión reducida. Luego, a la mezcla cruda de reacción, se añadió

anhídrido acético (7.5 mI, 80 mmol) y Py (1.5ml, 18.6 mmol), y se continuó agitando toda la

noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción fue volcada sobre agua destilada (20

ml) y extraída con diclorometano. La fase orgánica fue posteriormente lavada con agua

destilada y secada con NazSO. anh. y finalmente evaporada. Luego de la purificación por

columna de sílica gel (Hexano/AcOEt 2:1), el producto 1,3,S-tri-O-acetiI-a,B-D-2

desoxirribofuranósido fue obtenido como un aceite incoloro (0.70 g, 90%).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 2.04 (s, 3H, -CH3), 2.06 (s, 3H, -CH3), 2.07 (s, 3H, -CH3),

2.08 (s, 3 H, -CH3), 2.10 (s, 13 H, -CH3), 2.12 (s, 3H, -CH3), 2.18 (m, 1 H, H-a), 2.34 (dt, 11:5.2 Hz,

J,=14.4 Hz, 1 H, H-ZB), 2.47-2.49 (m, 2 H, H-2a,B), 4.154.19 (m, 3 H, H-Su, SB, SB), 427-432

(m, 2 H, H4a, So), 4.42 (q, J=3.3 Hz, 1 H, H-4B), 5.14 (m, 1 H, H-3B), 5.23 (ddd, 11:7.2 Hz, 12:5.2

Hz, J3=2.8 Hz, 1 H, H-3a), 6.38 (d, J = 5.2 Hz, 1H, H-IB), 6.40 (dd, J 1: 2.4 Hz, J z: 5.7 Hz, 1 H, H

1a).

Espectro de 13c RMN (cuco, 125 MHz): 5 20.57 (-CH3),20.57 (-CH3),20.69 (-CH3),20.77 (-CH3),

20.86 (-CH3),21.03 (-CH3),38.01 (c-2), 38.13 (c-2), 63.51 (c-5), 64.00 (c-5), 73.58 (c-3), 73.80

(C-3), 82.55 (C-4), 83.01 (C-4), 97.96 (C-1), 98.13 (C-1), 169.77 (CO), 170.04 (CO), 170.32 (C0),

170.36 (CO), 170.55 (CO).


o Mr: 218

OAC Rf: 0.38 en Hexano/AcOEt 1:2

Rendimiento:91%

AcO (GZB0.911)

Siguiendo un protocolo descripto anteriormentez, se realizó la reacción de alcohólisis

enzimática añadiendo la enzima CALB (0.81 g, 0.3 g/mmol producto) a una suspensión de

1,3,S-tri-O-acetil-a,B-D-Z-desoxirribofuranósido (0.7 g, 2.69 mmol) en etanol (18.4 ml, 323

mmol) y la mezcla resultante fue agitada por 5 h bajo agitación orbital a 37 °C hasta que se

verificó la conversión total a producto mediante c.c.d. Luego, la mezcla fue filtrada y

evaporada a sequedad. El residuo resultante fue purificado por cromatografía en columna de

silica gel (Hexano/AcOEt 1:2) para dar, así, el producto 42 (0.54 g, rendimiento 91%).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.07 (s, 2.7H, -CH3), 2.08 (s, 2.7H, -CH3), 2.09 (s, 3 H,

CH3), 2.11 (s, 3 H, -CH3), 2.17 (m, 1 H, H-ZB), 2.35 (dt, 11:5.4 Hz, Jz=14.6 Hz, 0.9 H, H-Za), 2.53

2.47 (m, 1.9 H, H-Zu, (3),3.70 (dd, J 1: 4.5 Hz, J z: 11.9 Hz, 0.9 H, H-So), 3.78-3.75 (m, 1.9 H, H

Su, SB), 3.82 (dd, J 1: 3.2 Hz, J 2: 11.9 Hz, 1 H, SB), 4.20 (dd, dd, J1=4.5 Hz, 12:9.1 Hz, 0.9 H, H

4a), 4.27 (dd, J1=3.2 Hz, J2=7.7 Hz, 1 H, H-4B), 5.18 (ddd, J1=1.3 Hz, J2=4.5 Hz, J3=7.7 Hz, 1 H, H

3B), 5.29 (ddd, J1=3.6 Hz, J2=7.3 Hz, J3=9.1 Hz, 0.9 H, H-3a), 6.37 (d, J = 5.4 Hz, 1H, H-IB), 6.40

(dd, J 1: 2.2 Hz, J z: 5.4 Hz, 1 H, H-la).

Espectro deuC RMN (CI3CD,125 MHz): 6 20.77 (-CH3), 20.87 (-CH3), 21.12 (-CH3), 38.42, (C-2),

62.12 (C-S), 62.98 (C-S), 73.59 (C-3), 73.88 (C-3), 85.79 (C-4), 86.06 (C-4), 98.08 (C-l), 98.26 (C

1), 169.93 (CO), 170.43 (C0), 170.76 (CO), 170.95 (C0).

1,3-Di-0-acetil-2-desoxi-u,B-D-I'L ‘ 5-dibencilfosfato (43):

0B 0nxl,

BnO/o Mr: 438

OMG Rf: 0.35 en Hexano: AcOEt 7:3

Rendimiento:76%

AcO ((128 0.621)

2 Hennen W.; Sweers H.; Wang Y.;Wong (3.:l. Org. Chem., 1988, 53, 4939-4945.


El compuesto 42 seco (0.54 g, 2.47 mmol) fue disuelto bajo atmósfera de N2en THF

anh. (30 ml). A esta solución se le añadió, con agitación, 1H-tetrazol (1.55 g, 22.23 mmol )

hasta disolución del mismo. Luego, fue agregada la dibencil N,N-diisopropilfosforamidita (0.83

ml, 2.47 mmol) gota a gota y la mezcla fue agitada 15 minutos adicionlaes, a temperatura

ambiente. Posteriormente, para la oxidación de la fosforamidita, se enfrío la mezcla de

reacción a -40 °Cen un baño de hielo seco en acetona y se le añadió una solución del reactivo

oxidante TBHPen decano (6M, 0.83 ml, 4.94 mmol). Se agitó esta solución por 2 horas a

temperatura ambiente, hasta desaparición del sustrato. Finalmente, se detuvo la reacción con

una solución 10 % de NaHSO; (5 ml) y se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en

diclorometano (15 ml) y se extrajo secuencialmente como se cita a continuación: 10% NaHSO;

(3 x 10 ml), S % NaHCO; (3 x 10 ml) y agua destilada (3 x 10 ml). El extracto se secó con NaZSO.

anh. y evaporó a sequedad. Elfosfato bencilado fue purificado por cromatografía en columna

de sílica gel (Hexano: AcOEt 7:3), para así obtener el producto puro con un 76% de

rendimiento (43, 0.82 g)

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.04 (s, 1.8 H, -CH3), 2.06 (s, 3H, -CH3), 2.07 (s, 3 H, —

CH3), 2.09 (s, 1.8 H, -CH3), 2.19 (rn, 1 H, H-ZB), 2.30 (m, 1.6 H, H2a, (3), 2.41 (ddd, 11:2.4 Hz,

12:7.2 Hz, 1514.4 Hz, 0.6 H, H-Za), 4.084.19 (m, 3.2 H, 5a, (3),4.24 (q, 1:5.2 Hz, 0.6 H, H-4u),

4.32 (q, J=2.8 Hz, 1 H, H-4B), soc-5.15. (m, 6.4 H, -CH¡(Bn)), 5.03 (ddd, 11:1.4 Hz, 12:2.3 Hz,

13:52 Hz, 1 H, H-3B), 523-539 (m, 0.6 H, H-3u), 6.29 (d, J = 5.2 Hz, 1H, H-IB), 6.37 (dd, J 1=2.4

Hz, J z= 5.7 Hz, 0.6 H, H-lu), 7.35 (s, 16 H, arom.).

Espectro de 13c RMN (cuco, 125 MHz): 6 20.78 (-CH3), 20.83 (-CH3),21.03 (-CH3),21.13 (-CH3),

33.03 (c-2), 33.12 (c-2), 66.68 (d, J= 5.4 Hz, c-5) 69.29 (d, J= 5.4 Hz, -CH2(Bn)),69.33 (d, J: 5.4

Hz, -CH2(Bn)),73.51 (c-3), 73.60 (c-3), 83.02 (d, J=7.2 Hz,C-4), 83.96 (d, 1:7.2 Hz, c-4), 98.85 (c

1), 98.37 (c-1), 128.51, 128.46, 127.88, 135.57 (d, 1:5.4 Hz)(aromt.), 170.04 (c0), 170.20 (c0),

170.56 (c0), 170.32 (c0).

Espectro de 31PRMN (CI3CD,202.4 MHz): 8 -1.18 , -0.96.

\Llo Mr:258

NaO Rf:0.20NH3/¡sopropanol/H20 9:9:2

OH Rendimiento:72 %

OH


Una solución del compuesto 43 (0.82 g , 1.8 mmol) en 15 ml de AcOEtfue hidrogenada

con 200 mg del catalizador, Pd(OH)2,a temperatura ambiente y presión atmosférica hasta

conversión total del sustrato, seguido por c.c.d. Luego de 12 h se añadió agua destilada y la

mezcla de reacción fue filtrada, y evaporada bajo presión reducida. Posteriormente, se añadió

una solución de HCI1.5 M (17 ml), y Ia mezcla se mantuvo con agitación a 70 °C por 2 h. Luego,

fue enfriada en un baño de hielo y el pH ajustado a S con una solución 10 N de NaOH. A la

solución enfriada se le añadieron 3 ml de una solución saturada de BaCIz. Los sólidos

precipitados fueron separados por centrifugación. Elsobrenadante fue enfriado nuevamente

en un baño de hielo y el pH se ajusto a 7,5. Luego, se agregó lentamente etanol (1.5

volúmenes) a la solución bajo agitación. La mezcla fue centrifugada y lavada con etanol. El

sólido resultante, fue disuelto en 6 ml de agua destilada y pasado por una resina de

intercambio iónico, Dowex X2-200 (H') eluyendo con agua destilada. Las fracciones ácidas


liofilizaciónpara así obtener el producto 44 con un rendimiento del 72 % (0.34 g).

Espectro de 1H RMN (CI3CD,500 MHz): 6 2.o7-2.11 (m, 2.3 H, H-2), 2.34-2.41 (m, 2.3 H, H-2),

3.67-3.72 (m, 2.3 H), 3.74-3.77 (m, 2.3 H), 3.92-3.96 (m, 1 H),4.134.16 (rn, 1 H), 425-428 (m,

1.3 H), 4.38-4.42 (m, 1.3 H), 4.74 (sa, 4.6 H, OH), 5.49-5.53 (m, 2.3 H, H-1a,b).

Espectro de 31PRMN (CI3CD,202.4 MHz): 6 2.02, 3.59.

2.3.4- Sobreexgresión de la enzima PPM de Escherichia coli

2.3.4.1- flhfnnríón dela ' dela PPMy diseño del cebador.

La secuencia nucleotídica que codifica para la enzima PPM de E. Coli fue obtenida del

banco de genes GenBank en el sitio de la NCBI,www.NCBl.NLM.NIH.GOV(Número de acceso:

U14003), y se determinó el marco abierto de lectura (ORF) correspondiente. Luego, se

diseñaron los oligonucleótidos para ser utilizados como cebadores, utilizando el programa

"oligo 6.0 (Cambio S.R.L.)". Los oligonucleótidos seleccionados para Ia reacción de

amplificación fueron los siguientes:

Cebador directo (Forward primer) : S'ggatccATGAAACGTGCAÏTTATl'ATGG3'

Cebador reverso(Reverse primer): S'ggtaccCI I l I IGTGACATAACAAAGGC3'


2.3.4.2- Amplificación gel gen dg la PPM mediante PCR

El método denominado reacción en cadena de la polimerasa (PCR)se empleó para

amplificar el gen a ser clonado. Para Io mismo se empleó la enzima ADNpolimerasa Taq a una

concentración 2U/100ul. Se utilizó una concentración 2 mM de MgClz.Todas las reacciones se

realizaron con buffer Taq, 100 ng de cada cebador y 200 uM de dNTPs en un volumen final de

50 ul. Como templado se utilizó 500 ng de un lisado de E. Coli.

Lascondiciones de PCRfueron:

Paso Temp. °C Tiempo (min) CiclosDesnaturalización inicial 95 S 1

Desnaturalización 95 1 35

Anidado 55 1

Elongación 72 1

Elongación final 72 10 1

Final 4 ---- 1

Tras la reacción se comprobó Ia correcta amplificación de Ia secuencia de la PPM

mediante electroforesis en geles de agarosa. Su identidad fue confirmada por mapeo con

enzimas de restricción.

2.3.4.3- Electroforesis en geles de agarosa

Los geles de agarosa utilizados se prepararon con buffer TAE1X al 0.7-1.S % con 0.5

ug/ml de bromuro de etidio. Lascorridas electroforéticas se realizaron a 5-10 V/cm. Antes de

sembrar, las muestras se resuspendieron con el correspondiente volumen de buffer de

siembra. Losgeles fueron visualizados y fotografiados con el equipo Baby-Imager de Applied

Oncor.

2.3.4.4- Digestión de ADNcon enzimas ge restricción

Las enzimas utilizadas fueron de Amersham Pharmacia Biotech, Promega o GibcoBRL.

Se utilizaron S unidades de enzima por ug de ADN a digerir incubando en los buffers y

temperaturas sugeridas por el fabricante durante un minimo de 3 horas.


2.3.4.5- Construcción del ' ' ' ' PPM en el vector de expresión gGEM-TEasy

Para la correcta expresión de la proteína, se construyó en primera medida, un

plásmido utilizando el vector de expresión comercial denominado pGEM-TEasy. Este sistema

es conveniente para la clonación de productos amplificados por medio de PCR.Losfragmentos

obtenidos por PCRse clonaron en el vector pGem-T Easy utilizando para ello el kit pGem-T

Easy vector System I (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. El vector de

expresión se denominó pGEM-T-PPM.

Se determinó la identidad del gen mediante un mapeo con enzimas de restricción,

para lo cual se digirió el plásmido con Ia enzima de restricción EcoRl. Los productos de

digestión se resolvieron mediante electroforesis en geles de agarosa.

2.3.4.6- Ligaciónde fragmentos de ADN

Las Iigaciones se realizaron con una relación molar de insertozvector de 3:1 utilizando

50 ng de vector en un volumen final de 10 pl con 0.1 U de T4 ADN Iigasa. Las incubaciones

fueron a 16°Cdurante toda Ia noche o a temperatura ambiente por 3 horas.

2.3.4.7-f‘ ‘ " del “ 'J de " en el vector de expresión pRSET-A

Posteriormente se escindió del vector de clonado el inserto correspondiente al gen

que codifica para la PPM incubando el plásmido pGEM-T-PPMcon la enzima de restricción Eco

RI.Se purificó por geles de agarosa y se subclonó el gen de interés en el vector de expresión

PRSET-Autilizando el kit PRsSET-AvectorSystem (Stratagem).

Para determinar la correcta inserción del gen en el vector de expresión se mapeó con

enzimas de restricción. Para esto, se incubó el plásmido con las enzimas de restricción Hind III

y Pst l, obteniéndose los fragmentos esperados, los cuales se resolvieron por electroforesis en

geles de agarosa. EIplásmido obtenido se lo denominó pRSET-A-PPM.

2.3.4.8- Extracción y purificación del plásmido. Secuenciación

Para aislar el ADNplasmídico se obtuvo un cultivo denso de una colonia de la estirpe

portadora del plásmido en medio rico LBcon ampicilina a 37 °C. Se centrifugaron 5 mI del

cultivo en tubos de 45 ml a 10000 rpm durante 15 minutos y se eliminó el sobrenadante por

aspiración, dejando seco el sedimento bacteriano. Lascélulas se resuspendieron en 200 ul de

una solución de tris-sacarosa y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos.


Luego se adicionaron 300 pl de una solución de EDTA-triton-Lisozima, se invirtió el tubo

suavemente varias veces y se ¡ncubó durante 10 minutos a temperatura ambiente, para pasar

otros 10 minutos a 70 °C. El Iisado obtenido se centrifugó a 7000 g durante 30 minutos. Luego

se purificó el ADN mediante extracciones con mezlcas de fenol/cloroformo. Esto involucra

varios pasos de extracción siendo el primero la extracción de una solución acuosa del Iisado

con una mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y, posteriormente, con

cloroformo/alcohol isoamílico. Las fases acuosas y orgánicas se separaron por centrifugación

durante 5 minutos a 4 °Cy se recuperó la fase acuosa. Este procedimiento se repitió dos veces.

Luego se concentró el ADNmediante precipitación, para lo cual se añadió acetato sódico (pH

5,2) a una concentración final de 0.3M, se mezcló y se añadió un volumen de isopropanol (el

doble del volumen de la solución) y se agitó vigorosamente. EIprecipitado se lavó con etanol al

70% y se centrifugó. Se recuperó el sedimento y se secó el etanol remanente a temperatura

ambiente. Finalmente se resuspendió el ADNaislado en 100 ul de agua y se agitó para su

correcta disolución. ElADNfue secuenciado.

2.3.4.9-T ‘ " del vector de ' ’ en Ecoli ‘ ‘

La transformación involucró Ia introducción del plásmido recombinante PRSET-A-PPM

en células bacterianas. Para ello se utilizó, en primer lugar, la cepa de Escherichia coli DHS-a,

útil para su transformación con plásmidos recombinantes derivados del vector. Se utilizó para

la transformación, un cultivo de dicha cepa con bacterias competentes. Se llevó a cabo esta

transformación por el metodo de "Shock-Térmica”: Para Io cual, se incubaron bacterias de E

coli DH5-a competentes con el vector durante 15 minutos. Luego, se aplicó luego un golpe

térmico dejando a las bacterias 1.5 minutos a una temperatura de 42 °C. Posteriormente se

agregó 1 ml de medio LBy se dejó en estufa a 37 °C durante 30 minutos. Finalmente se

centrifugaron y se plaquearon las mismas, sobre una placa de petri con LB-agar,ampicilina y X

gal. Se analizaron las colonias por aparición del color azulado debido a la reacción

colorimétrica con X-gal.Luego se miniprepararon los plásmidos por el método de lisisalcalina y

se chequeó la presencia del inserto utilizando enzimas de restricción y analizando los

fragmentos por electroforesis en geles de agarosa.

Lasegunda etapa consistió en transformar con el plásmido PRSET-A-PPMla cepa de E.

coli BL21competente, siguiendo Ia metodología descripta anteriormente. Se plaquearon las

células trasnfectadas en medio LBsólido con ampicilina, se hicieron crecer en medio LBliquido

con ampicilina y finalmente se indujeron con IPTG,para verificar la correcta tranfeccion (se


describe, posteriormente en detalle, esta metodología). Se realizó asimismo, un control, sin

inducción.

2.3.4.10-1' ' ' ‘ delascélulas ' J e' J " dela " deIaPPM

Para Ia sobrexpresión de Ia enzima PPM-(HIS).-,,las células de E. Colí trasnfectadas

fueron crecidas en medio LBsólido situado en placas de petri, conteniendo los mismos, 100

ug/ml de ampicilina y 40 pg/ml de cloranfenicol, incubando las células toda la noche a 37 °C.

Se escogieron las colonias y se preincubaron en 5 mI de medio LB líquido con la misma

concentración de antibióticos que en el medio sólido, toda la noche a 37 °C.Luego, a 250 ml de

medio líquido junto con los antibióticos, se le añadieron 1 ml de las células preincubadas, y se

incubaron con agitación orbital a 37 °C, hasta que la densidad óptica de la solución celular

alcanzara el valor de 0.8, medido a 600 nm. Luego, se indujo la expresión proteica añadiendo

una solución acuosa del inductor isopropiI-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG), hasta una

concentración final de 1 mM, y se extendió la incubación por 4 horas adicionales. Los tiempos

de crecimiento e inducción fueron optimizados experimentalmente, comparando en geles de

poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) los perfiles de expresión.

Posteriormente, el medio se centrifugó (10000 rpm, 15 min, 4°C), y se resuspendió el pellet

celular en el buffer de lisis (50 mM NaHzPO4,300 mM NaCI).

2.3.5- Purificacióny concentración dela enzima recombinante

2.3.5.1- Purificación de la proteína recombinante con resina Ni-NTA

Las células se lisaron por sonicación. Elextracto celular fue centrifugado (10000 xg, 15

min, 4°C),y el sobrenadante fue sembrado en una columna de Ni-ácido nitriloace’tico-agarosa

(QIAGEN) equilibrada con el buffer de lisis. Se realizó Ia cromatografía de afinidad en

condiciones nativas, como se cita a continuación: el sobrenadante fue incubado con 4 ml en la

resina de Ni-NT-agarosa con agitación por dos horas. Esta solución fue cargada en una

columna de acrílico y la columna fue lavada 4 veces con el buffer de lavado. La proteína fue

eluida con 15 ml de buffer de elución. La purificación fue verificada por SDS-PAGE,y los

mismos fueron revelados por tinción con coomasie blue.


2.3.5.2- Electroforgsis en geles dg ggliggrilamigg

Se prepararon geles desnaturalizantes de poliacrilamida (0.1 % SDS).El gel constó de

dos partes, una superior o gel de empaquetamiento de 1 cm de longitud (4 % poliacrilamida) y

a continuación una inferior o gel de separación, de 5 cm de longitud (10% poliacrilamida). Las

muestras a ser analizadas se prepararon agregándoles los volúmenes correspondientes de

buffer de siembra y calentándolas por 3-5' a 100°C. Los marcadores de peso molecular

utilizados cubrían los rangos 6.5 a 83 kDa (Sigma). El gel se montó en la cubeta de

electroforesis y se añadió el buffer de migración 1X en la cámara interna y externa, hasta

cubrir el mismo. Eltiempo de corrida fue de 50 minutos, aplicando un campo eléctrico de 250

V.

2.3.5.3- Diálii concentra i nd I enzim urifi a a

Eleluido cromatográfico que contenía la proteína recombinante, fue dializado contra

buffer Tris 80 mM pH=8, EDTA15 mM y posteriormente dializado contra buffer Tris pH=8, 80

mM. Lasolución proteica fue concentrada utilizando polietilenglicol (PM 8000 Dalton). Luego,

se le añadió al concentrado proteico urea hasta una concentración final de 6M, y se dejó 2 h a

4°C con agitación mecánica. Finalmente, la solución con el desnaturalizante fue dializada

contra agua destilada, agregada lentamente por goteo, a la membrana de diálisis, para el

correcto plegamiento de la proteína y, por último, dializada contra buffer tris 80 mM pH=8,

EDTA0.2 mM y MnCIz1 mM (buffer de almacenamiento). En todos los casos la concentración

de la proteína fue determinada por el método de Bradford utilizando albumina bovina sérica

como estándar.

2.3.6- Ensayos de actividad

Para los ensayos de optimización de la actividad enzimática de la PPMsobreexpresada,

se midieron la cinética y el rendimiento de una reacción modelo. Para lo cual se determinó la

aparición del nucleósido adenosina, a partir de ribosa S-fosfato y la base adenina, en presencia

de una cantidad dada de la enzima sobreexpresada y la PNPcomercial. Se variaron para estos

ensayos las concentraciones de enzima, sustrato, MnCIz,glucosa-1,6-difosfato y el inhibidor

fosfato inorgánico, así como el pH y Ia temperatura de reacción.

Luego de encontrar las condiciones optimas los ensayos de actividad se realizaron

como se describe a continuación: se preincubó a 37°C un 1 ml de una mezcla de reacción que

107 Capitqu 2 - Parte experimental

contenía los siguientes reactivos (en concentraciones finales): adenina 6 mM, buffer Mops 100

mM (pH=7), MnClz1 mM, B-mercaptoetanol 200 mM, 0.03 mg de PPM y un exceso dela PNP.

La reacción se inició por la adición del sustrato, ribosa 5-fosfato (1 mM) y se cortó a diversos

tiempos, por la adición de una solución de HCI.Laaparición de la adenosina se siguió por HPLC.

¡1-4 A l2.3.7- F‘ J' ' general para la síntesis de diversos v modificados

2.3.7.1- Síntesis enzimática de nucleósidos

Para la síntesis de diversos nucleósidos naturales y/o modificados se agitó a 37 9C,con

agitación orbital de 200 rpm, una solución que contenía: 0.2 ml de una solución acuosa de |3

mercaptoetanol 1 M, 0.1 mI de una solución acuosa de MnCIz10 mM, 0.2 ml de una solución

acuosa de la base correspondiente 30 mM, 0.23 mI de buffer Tris pH=8, 0.43 M, 0.2 ml de Ia

solución de PPM (0.15 mg/ml) y 0.05 ml de la solución acuosa de PNP o TP según corresponda

(100 U/ml). La reacción se inició con la adición del azúcar S-fosfato (0.02 ml de una solución

acuosa de concentración 50 mM).

2.3.7.2- Cromatografía líguida de alta precisión (HPLC)

La aparición de nucleósidos fue determinada por HPLC,para lo cual se utilizó un

equipo Gilson equipado con una columna C-18 (150mm x 4 mm x 5 um) a un flujo de 1

mL/min. Eldetector UVse ajustó a la longitud de máxima absorción de cada nucleósido (Tabla

2.2) y la columna fue operada a temperatura ambiente. Todas las curvas de calibración fueron

realizadas con material de referencia comercial (Sigma-Aldrich) de conocida pureza y por Ia

metodología de estándar externo.


Ho\9

I 1:0: OH B o-———>

: x PPM,NP ; xHo Y Trio-Buffer H0 Y

o NH2 SH CI o

N NH NÏN N \N N \N NxHLNH/ I / I / I / / | 2

<N N) <N N) <N N) <N «¡‘qu <N'NH H H H H

Hlp A 6-SH-Pu 6-CI-2-NH2-Pu TCANH2 0 0 o o

(yfm (LNH ÏkNH F I NH BrfLNHN NA; H’ko H/ko H’go bli/goH H H H H

LF-Ad U 'l' S-F-U 5-Br-U

Candiciones de corrida:

Condición A: 0-5 min 4% MeOH/ 96 % buffer fosfato 25 mM pH=35-9 min 10 % MeOH/ 90 % buffer fosfato 25 mM pH=39-10 min 4 % MeOH/ 96 % buffer fosfato 25 mM pH=3Condición B: isocrática 10 % MeOH / 90 % buffer fosfato 25 mM pH=3Condición C: isocrática 100 % buffer fosfato 25 mM pH=3Condición D: isocrática 8 % MeOH / 90 % buffer fosfato 25 mM pH=3

Tabla 2.2. Condiciones de corrida de HPLC


2.3.8- lnmovilización enzimática

2.3.8.1- lnmovilización en geles de sílice-PVA

2.3.8.1.1- Preparación del sol-gel de sílice

El sol gel de sílice fue obtenido por el método de catálisis ácida en una sola etapa,

empleando TEOScomo precursor, para Io cual, se mezclaron 4 ml de TEOS, 1.25 ml de agua

hexadestilada y 36 ul of HCI (0.6 M), agitándose la solución vigorosamente por 30 min a

temperature ambiente. Finalmente, se obtuvo el sol-gel luego de remover el etanol de la

preparación diluida (se añadió 1 ml de agua por ml de gel obtenido) por evaporación a presión

reducida, hasta una pérdida de masa de 0.62 g, que corresponde a la cantidad estequiométrica

de etanol producido como subproducto de la reacción de hidrólisis.

2.3.8.1.2- Procedimiento general para Ia inmovilización de Ia enzima PPM en sol

geles de sílice-PVA

Se obtuvieron los hidrogeles de silice-PVA-PPMmezclando la cantidad apropiada del

sol-gel acuoso de sílice (10% en sílice), 0.2 ml de una solución de PPM en buffer tris 100 mM

(pH=8), agua destilada y la cantidad apropiada de una solución acuosa de PVA(10 % p/v). Se

llenaron, rápidamente, jeringas de 1 ml con Ia solución generada y luego se colocaron las

jeringas a 4°C por 2 h, para así permitir eI envejecimiento del hidrogel. Finalmente, los

hidrogeles envejecidos fueron unidireccionalmente congelados, introduciendo la jeringa a una

velocidad constante (5,9 mm/min) dentro de un baño de N2(I)mantenido a una temperatura

constante de 77 K (este procesamiento de los geles se denomina ISISA).Por último, las

muestras congeladas fueron liofilizadas.

2.3.8.1.3- Ejemplo de preparación de hidrogeles de sílice (1.6% p/p)-PVA(6.4%p/p)

PPM

Los hidrogeles fueron obtenidos mezclando 0.1 ml del sol gel de sílice, 0.06 ml de agua

destilada, 0.64 ml de una solución acuosa de PVA(10 % p/v) y 0.2 ml de la solución de PPM

(0.15 mg/ml) en buffer tris 100 mM (pH=8).


2.3.8.2- Inmovilizacióngn geles de síligeguitosano

en . 'I'2.3.8.2.1- Síntesis del monómera .e.ra(2 .'..'_'. ' , ‘ (THEOS)

OH .Si o/V Mr.272Pureza: 80 %

4

Se mezcló en un balón TEOS(10 ml, 44.7 mM) con etilenglicol recién destilado (10 ml,

179 mM). La mezcla de reacción se calentó a 150°C por 36 hs conectada a una columna de

destilación para así destilar el etanol producido como subproducto de la reacción. Se obtuvo el

producto deseado THEOS,junto con mezclas de productos de ciclación ¡ntramolecular, luego

de remover el etanol y los materiales de partida, por destilación a presión reducida, con una

pureza de aproximadamente 80%.

Espectro de RMN 1H 8 ppm: 4.80 (sa, 4H, OH), 3.98-3.88 (m, 6H, CH2(c)), 3.73-3.70 (m, 8H;

CHz(a)), 3.47-3.44 (m, 8H; CH2(a))

(a): acíclica, (b):cíclica

2.3.8.2.2- Procedimiento general para Ia inmovilización de Ia enzima PPM y Ia

coinmovilizacionde las enzimas PPM/PNP en sol-geles de sílice-quitosano

Para la inmovilización de la enzima PPM y para la co-inmovilización de las enzimas

PPM/PNP en sol-geles de sílice-quitosano, en primer lugar, se formó un solución homogénea

de las mezclas de PPM/quitosano o PPM/NP/quitosano, respectivamente, mezclando la

solución ácida de quitosano (2.5 % p/v) con 0.2 ml de la solución de PPM (0.15mg/ml) o con

0.2 ml de la solución de PPM (0.15mg/ml) y 0.025 ml de una solución de PNP (100 U/ml).

Luego se añadió a las mezclas homogéneas, el precursor sintetizado, THEOS.Posteriormente,

las soluciones se mantuvieron a 4°C por 2 h, para asi permitir el envejecimiento de los

hidrogeles. Finalmente, los hidrogeles envejecidos fueron unidireccionalmente congelados,

introduciéndolos dentro de un baño mantenido a una temperatura constante de 77 K. Por

último, las muestras congeladas fueron liofilizadas.


2.3.8.2.3- Ejemplo de preparación de hidrogeles de sílice (10%p/p)-quitosano (0.4%

p/pl-PPM

Los hidrogeles fueron obtenidos mezclando 41 pl del precursor THEOS,219 ul de

buffer tris 100 mM (pH :8), 80 ul de una solución acida de quitosano (2.5 % p/v) y 200 ul de la

solución de PPM (0.15 mg/ml) en buffer tris 100 mM (pH=8).

2.3.8.2.4- Ejemplo de preparación de hídrogeles de Sílice (10%p/p)-quitosano (0.4%

p/p)-PPM/PNP

Para Ia co-inmovilización de la PPM y PNP, se siguió el mismo procedimiento citado

previamente para la inmovilización de la enzima PPM en sol-geles de sílice-quitosano, pero

incorporando a la mezcla de reacción 200 ul de una solución de PPM (0.15 mg/ml) en buffer

tris 100 mM (pH=8) y 25 ul de una solución de PNP (100 U/ml), disminuyendo

proporcionalmente la cantidad de buffer añadido.

2.3.8.2.6- Co-inmovilizacíón de las enzimas PPM y PNP en sol geles de sílice

quitosano recubiertos de agar

Para la co-inmovilización de las enzimas PPM y PNP, se siguió el mismo procedimiento

descripto anteriormente para la preparación de hidrogeles.

Para el recubrimiento con agar, los geles liofilizadosfueron sumergidos varias veces en

una solución de agar 2,5 % p/v, mantenida a 60 °C en un baño de agua. Luego, fueron

sumergidos en aceite de girasol comercial y lavados varias veces, primero con hexano, y luego

con buffer Tris 100 mM (pH=8).


2.3.9- Elucidacion estructural y funcional de la enzima PPM

2.3.9.1- Modelado por homglogíg

Elmodelado por homologia aprovecha las similitudes de secuencias de aminoácidos y

las similitudes estructurales entre proteínas, construyendo una estructura tridimensional para

la secuencia incógnita, usando las estructuras tridimensionales conocidas de otras proteínas,

cuyas secuencias de aminoácidos guardan similitud con la secuencia incógnita.

Las etapas básicas del modelado se pueden resumir en las siguientes acciones:

identificar una o varias secuencias homólogas, luego, alinearlas correctamente y finalmente

generar el modelo de la proteína en cuestión para por último, validarlo.

Para el modelado de la enzima PPM por homologia primero se debió obtener la

secuencia aminoacídica de la enzima, del banco de datos depositado en el sitio UniProt y se

grabó en formato FASTA.El código de acceso directo a la secuencia es el POA6K6.Luego se

procedió a la búsqueda de las secuencias homólogas con estructuras tridimensionales

conocidas. La identificación de las proteínas homólogas y el alineamiento se obtuvo utilizando

el HHpred server (Homology detection & structure prediction by HMM-HMM comparison)3

aplicando los parámetros comunes, eligiendo las bases de datos de PDB y SCOP

(httpzlltnnlkit ‘ L" mm de/hhpredl. La búsqueda en la base de datos fue realizada con

el programa de HHsearch para la comparación de HMM-HMM.

Una vez obtenida la lista de los posibles templados, se seleccionó el más apropiado, o

sea, las secuencia con mayor porcentaje de identidad y menor número de omisiones (gaps). El

templado utilizado fue la estructura de rayos X de la fosfopentomutasa de Streptococcus

mutans (PDB2i09_A)que comparte un 43% de identidad con la PPM en estudio.

El programa MODELLER(versión 6v2), incluido en el sitio HHpred, fue utilizado para

construir el modelo tridimensional de la PPM. Como se esperaba, el esqueleto carbonado del

modelo generado y el templado se superponen correctamente (RMSD:0.49 calculado por el

programa swiss pdb viewer). También se compararon los gráficos de Ramachandran, (swiss

pdb viewer) como indicador de la validez del modelo.

La PPM es una metaloproteina, que contiene en su sitio activo un sitio de unión a

metales donde se ubican dos iones manganeso. Pertenece a una superfamilia de enzimas

denominada superfamilia de fosfatasas alcalinas. Essimilar estructural y funcionalmente a una

enzima perteneciente a la superfamilia denominada difosfogliceratomutasa independiente.

Éstas comparten el sitio de unión a metal. Elmodelo obtenido por homologia, no contenía los

3Sóding, J.; Biegert, A.; Lupas, A.; Nucleic Acids Research, 2005, 33; W244-W248


iones manganeso en su sitio activo, por lo que para obtener el modelo final, se precedió

incorporarlos. Para ello, en primer lugar se añadieron los metales manualmente, por

superposición de las estructuras de la PPM y IPGM.Para esto, se utilizó el programa swiss pdb

Viewer, optimizándose luego la geometría de la metaloproteína por dinámica molecular. Las

dinámicas moleculares se realizaron utilizando el campo de fuerzas AMBER(Asisted Model

Building with Energy Refinement), y la suite de programas utilizados para las simulaciones

denominado también AMBER.El programa preparatorio utilizado fue el LEaP, y el utilizado

para el cálculo energético fue el denominado SANDER.

Se evaluó la validez de la minimización por dinámica molecular comparando las

distancias metal residuo de unión a metal, y por superimposicion de las estructuras de la

proteína previa y posterior a la dinámica molecular generada.

2.3.9.2- Determinación del sitio de unión a sustrato

Un prerrequisito para el docking de pequeñas moléculas de ligando en proteínas es la

determinación del sitio donde dicho ligando interactúa con la proteína. Esta determinación se

realizó mediante diversas metodologías.

En primer lugar se explotaron las similitudes funcionales y estructurales que comparte

con Ia IPGM.Debido a que existe gran cantidad información estructural y funcional de la IPGM,

se puede inferir información de la enzima de interés.

Para verificar Ia validez de las comparaciones se realizó en primer lugar una

superposición estructural de diversas PPMs y de diversas lPGMs. Este análisis se realizó

utilizando el programa DALIhttp:¿¿ekhidna.biocenter. Helsinki. fi/da|i_server/. Asimismo se

realizó una superposición estructural de la PPM de E coli y de Ia IPGM ( PDB 1098), ambas

secuencias mostraron un alto grado de similitud, este análisis fue realizado por el programa

HHpred.

Además, se estudiaron los sitios de unión mediante métodos computacionales. Se

utilizó el programa denominado LIGSITE‘, http:/,' L 47 hinfer "'-"'°"‘°" de/cgi

bin¿index.php. LIGSITEes un programa desarrollado para la detección automática y rápida de

cavidades en la superficie de proteinas que pueden actuar como sitios de unión para pequeñas

moléculas de ligando. Para lo mismo se cargó el PDBde la PPM minimizada, y se obtuvieron

diversos PDBs,en los cuales se remarcaban los aminoácidos ubicados en los posibles sitios de

unión a ligando.

4 Hendlich, M.; Rippmann, F.; Barnickel, G.;Journal of Molecular Graphics and Model/ing, 1997, 15, 359-363


Finalmente, se estudió la conservación aminoacidica entre las secuencias de diversos

miembros de la familia de la fosfopentomutasa, utilizando el programa CLUSTWAL-W,

localizado en la URL http:¿¿www.ebi.ac.uleoolschustalelindex.html. Se eligió para el

estudio de alineación de secuencias, las secuencias de 88 fosfopentomutasas bacterianas de

diversas cepas de similar peso molecular, con menos de un 90% de redundancia entre las

secuencias.

2.3.9.3- Determinación del modo de unign

Para la determinación de los residuos del sitio activo de la enzima, se utilizó el

programa de reconocimiento molecular o docking, AUTODOCK5v 4.0.

2.3.9.3.1- Estudios preliminares en sistemas conocidos. Evaluación de la carga del

metal y de la eficiencia de los experimentos de reconocimiento molecular en

metaloproteínas utilizando el programa AUTODOCK

Para investigar Ia precisión del docking de sustratos pequeños a metaloproteínas y el

efecto de la carga formal del ¡ón manganeso, se realizó un estudio preliminar de

reconocimiento molecular de un sustrato con una metaloproteína del cual, su modo de unión,

fue determinado experimentalmente. Se eligió para estos experimentos la enzima IPGMy el

sustrato 2-fosfoglicerato (2PGA). La estructura cristalina de la proteína (PDB 1098) fue

colectada de Ia base de datos depositada en el RCSB PROTEIN DATABANK

(htt : www. db.or db home home.do ), así como el PDB del 2PGA. Se utilizaron las

herramientas AUTODOCKTOOLS‘,para añadir hidrógenos polares y cargas parciales tanto a Ia

proteína como al ligando utilizando las cargas de United Atom y Gasteiger, respectivamente.

Losparámetros de solvatación y los volúmenes fragmentales para la proteína fueron asignados

utilizando la herramienta ADDSOL(incluida en el paquete del programa de herramientas). Las

torsiones flexibles en el ligando fueron asignadas con el modulo de AUTOTORS,permitiéndose

la rotación libre de todos los ángulos diedros. La carga formal del manganeso fue añadida

manualmente en los archivos .pdbq generados por las herramientas del programa autodock.

Los campos de afinidad de la grillas fueron generados utilizando el programa auxiliar

AUTOGRID.Se utilizó el algoritmo genético GA-LShibrido para desarrollar los experimentos de

reconocimiento molecular, con los parámetros definidos por el programa. Para los iones

5 Pospisil, P.; Folkers, G.; FABADJ. Pharm. Sci., 2004, 29, 31-92

6Sanner, M.; Duncan, 8.; Carrillo, C.; Olson, A.; Pac. Symp. Biocomput., 1999, 401-4129


manganeso se usaron los potenciales del campo de fuerza de AMBER,definidos en el

programa AUTODOCK.

Para el proceso de docking el campo de la grilla fue definido como un cubo de 50 Á

centrado en el ligando, con los puntos de la grilla separados por 0.375 Á. Para el modelado de

los enlaces de hidrógeno y de las interacciones de Van der Waals, se utilizaron los parámetros

de Lennard-Jones 12-10 y 12-6, respectivamente. Las conformaciones resultantes del

experimento de docking fueron agrupadas en familias con modos de unión similar, con una

tolerancia entre grupos, de Ia desviación cuadrática media (RMSD) de 2 Á. La energía de

docking representó la suma de la energía intermolecular y de la energía interna del ligando

mientras que la energía libre de unión, la suma de la energía intermolecular y la energía libre

de torsión7. La eficiencia del experimento fue medida basada en la RMSD de los ligandos

obtenidos por el experimento de docking relativos al obtenido experimentalmente.» Se

calcularon, asimismo las distancias metal-fosfato y metal-proteína (programa swiss pdb

viewer).

2.3.9.3.2- Experimentos de reconocimiento molecular- selección de las condiciones

experimentales

Luego, se exploró el efecto de la carga del manganeso, en el experimento de

reconocimiento molecular de Ia ribosa S-fosfato por la PPM. El PDBdel sustrato fue extraido

de la base de datos depositada en el RCSBPROTEINDATABANK(Se encontró un archivo de un

complejo proteico de este sustrato y se extrajo del mismo utilizando el programa de swiss pdb

viewer). La conformación del sustrato así como su carga, fueron optimizadas utilizando el

servidor llamado Dundee PRODRGZen el URLwww.davacpc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg. EI

procedimiento seguido para realizar los experimentos de reconocimiento molecular fueron los

mismos que los descriptos para el experimento preliminar, detallados previamente, excepto

por la localización del centro de la grilla. En primer lugar se aplicó el procedimiento de docking

a toda la proteína blanco, sin la imposición de un sitio de unión. Esto se denomina

"reconocimiento molecular a ciegas” o "blind dock/ng”. Se realizó con el objeto de evaluar si el

sustrato se ubicaba, luego del experimento de reconocimiento molecular, en el sitio de unión

propuesto anteriormente. Para lo cual, se centró la grilla en la mitad de la proteína con los

puntos de la grilla separados por 1 Á. Elcampo de la grilla fue definido como un cubo de 50 Á

de lado. De esta forma se cubrió todo el espacio de Ia proteina.

7 Ewing, T.; Kuntz, I.; .I. Comput. Chem., 1997, 18, 1175-1189


Luego se realizó un experimento de reconocimiento molecular en el sitio activo

propuesto de la enzima. Esta vez, se centró Ia grilla en uno de los ¡ones manganeso, con los

puntos de la grilla separados por 0.375 Á. EIcampo de Ia grilla fue definido como un cubo de

50 Á de lado.

2.3.9.3.3- Experimentos de reconocimiento molecular evaluando como Iigando las

furanosas 5-fosfato.

Se realizaron experimentos de reconocimiento molecular, evaluando la afinidad y el

modo de unión de los Iigando conocidos para la PPM, desoxirribosa S-fosfato, ribosa S-fosfato

y arabinosa 5-fosfato al modelo de Ia proteína. Como no existe información acerca de Ia

conformación de los ligandos unidos a la proteína, se debieron realizar experimentos de

reconocimiento molecular con los anómeros a y B de las tres furanosas de interés, así como

con las formas acíclicas de los azucares en cuestión, con las condiciones óptimas halladas en el

paso anterior (carga formal del metal 2 y ubicando la grilla centrada en el metal).

2.3.9.3.4- Experimentos de reconocimiento molecular evaluando como Iigando las 8

D-furanosas 1-fosfato

Debido a la complejidad de los sustratos previamente estudiados y la falta de

información de la actividad de la PPM frente a los mismos, se decidió realizar los ensayos de

reconocimiento molecular con los ligandos furanosas 1-fosfato. Se sabe que el anómero que

reconoce la enzima para la reacción transferasa, es el anómero a y, además existe información

bibliográfica comparando Ia actividad de la enzima frente a diversas furanosas 1-fosfato.

Por este motivo se decidió realizar experimentos de reconocimiento molecular,

evaluando el modo de unión de: a-D-ribosa 1-fosfato (R-l-P), a-D-desoxirribosa 1-fosfato (D-1

P) y u-D-arabinosa 1-fosfato (A-1-P).EIprocedimiento seguido para estos experimentos fue el

mismo que el aplicado a las furanosas S-fosfato.

Asimismo,se realizaron experimentos de reconocimiento molecular, incrementando el

número de confórmeros obtenidos en el análisis, para poder realizar un análisis estadístico del

modo de unión de estos Iigandos. El número de confórmeros obtenidos fue de 100 por cada

experimento.

.0.00.00.000.00.00...00.000....00......0.0.0.0...

117 Capítulo 3 - Síntesis de furanosas S-fosfato

Capítulo 3

Síntesis de furanosas 5-fosfato

3.1- Obietivos y resumen

EIobjetivo de este capítulo es presentarla estrategia empleada para la síntesis de diversas

furanosas 5-fosfato, materiales de partida en la síntesis quimio-enzimática de nucleósidos, tanto

naturales como modificados, propuesta en esta tesis. El principal propósito fue desarrollar una

estrategia quimio-enzimática versátil para la síntesis de furanosas S-fosfato, partiendo de los

azúcares libres. Con este fin, se protegieron químicamente todas la funciones hidroxílicas de

diversas pentosas. Luego se procedió a la desprotección regioselectiva del grupo protector en la

posición S de las pentosas estudiadas mediante el uso de reacciones biocatalizadas. En la primer

parte de este capítulo se discutirá la protección química de las furanosas y luego el estudio de la

regioselectividad de las reacciones de desprotección utilizando diversas fuentes enzimáticas.

Una vez obtenidas las furanosas regioselectivamente desprotegidas, es decir, con la

posición 5 libre, se procedió a la obtención de las diversas furanosas S-fosfato, por lo que, en la

segunda parte de este capítulo se describirán diversas estrategias de fosforilación química.

Asimismo se discutirá es este capítulo, la obtención de otros sintones, utilizando las

furanosas desprotegidas en hidroxilos secundarios, como posibles precursores para la sintesis de

diversas furanosas S-fosfato.

3.2- Esguema general de la síntesis de furanosas 5-fosfato

A continuación se describe el esquema general de la síntesis quimio-enzimática de

diversas furanosas S-fosfato (Figura 3.1). El primer paso es la protección de todos las funciones

hidroxilo de la molécula del monosacárido. La protección del hidroxilo anomérico se realizó

mediante la condensación del monosacárido con un alcohol, formándose los metil o butil

pentofuranósidos correspondientes. Luego, se procedió a la protección de las demás funciones

hidroxílicas mediante reacciones de acetilación, obteniéndose los alquiI-furanósidos acetilados

correspondientes, según se muestra en la Figura 3.2.

118 Capitulo 3 —Sintesis de furanosas 5-fosfato

H0\ P00HO H0 / \H

1. Protección de 1, 2, 3 y 5 3. Fosforilación

2. Desprotección de 5 4. Desprolección de 1.2 y a

x, Y : H. OH X', Y' : H. om; R= Alquil

Figura 3.1. Esquema general de la síntesis de furanosas S-fosfato.

Una vez obtenidos estos productos, se ensayaron diversas estrategias de desacetilación

enzimática, utilizando dos enzimas comerciales, la Iipasa de Candida rugosa (CRL)y la Iipasa

inmovilizada de Candida antártíca B(CAL-B).Asimismo, se ensayaron reacciones de desacetilación

utilizando tejido vegetal (Musa sapientum) como biocatalizador (Figura 3.2). Una vez obtenidos los

metil 2,3-O-diacetil pentofuranósidos se ensayaron reacciones de fosforilación química, para

H0

Biocat.

\lï_°_?‘0R— En“X' Y' X' Y'

X', Y‘ : H, OAczR: Me, But

obtener finalmente las furanosas S-fosfato.

HOH

HO

RO

HQX Y CuSO4

AcO

OA02

x Y Py

X.Y:H.0H

Figura 3.2. Síntesis de furanosas con la posición S libre


3.3.1- Síntesis de alguil furanosidós acetilados

Como se muestra en la Figura 3.1, el primer paso de la estrategia planteada para Ia

obtención de furanosas 5-fosfato es la protección de las funciones hidroxilicas en las diversas

pentosas. En primera medida se comenzó con la protección del hidroxilo anomérico mediante una

glicosidación de Fischer‘. Esta reacción implica el tratamiento de carbohidratos desprotegidos con

alcoholes en presencia de un catalizador ácido. A pesar de ser el primer método de glicosidación,

l Ver por ejemplo: a) Fischer, E.; Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1893, 26, 2400, b) Fischer, E.; Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1895, 28,1145

119 Capitulo 3 - Síntesis de furanosas 5-fosfato

descripto en el año 1893, es muy útil para la sintesis de glicósidos con alcoholes simples, dado que

no requiere ningún tipo de protección en los hidroxilos del azúcar. Más aun, por medio de esta

reacción se pueden obtener predominantemente las formas alquil furanósidas. En general, Ia

reacción de Fischer transcurre de forma tal, que en etapas tempranas las formas furanósicas son

Ias predominantes (control cinético) mientras que en equilibrio las formas piranósicas son el

producto mayoritario (control termodinámico)2. Esto es debido a que Ia ciclación de anillos de

cinco miembros es más veloz que Ia análoga de seis miembros. Cuando Ia reacción está gobernada

por la cinética, se observaran los productos furanósicos que se equilibraran luego, a la mezcla de

equilibrio termodinámica. Esta equilibración involucra una expansión del anillo a las formas

piranósicas termodinámicamente más estables. Las preferencias conformacionales de las

aldopentosas están gobernadas por la minimización de la repulsión estérica, y por una mayor

estabilización anomérica. Por lo que si Ia reacción se termina en etapas tempranas, pueden

aislarse como productos mayoritarios, los glicósidos furanósicos.

Con el objetivo de sintetizar diversas furanosas 5-fosfato y asimismo poder estudiar la

regioselectividad de las reacciones de desacetilación en diversas furanosas acetiladas, se

sintetizaron los productos O-metilados derivados de Ia D-ribosa, D-arabinosa, D-xilosa, D

desoxirribosa, y L-arabinosa. Asimismo, con el propósito de extender los estudios de

regioselectividad en las reacciones de desacetilación, se sintetizaron los productos O-butilados

derivados de la D-ribosa, D-arabinosa y D-xilosa.

Las condiciones de reacción empleadas en todos los casos para las glicosidaciones de

Fischer fueron eI uso del mismo alcohol (metanol o butanol, según corresponda) como disolvente,

en presencia de cantidades cataliticas de acido sulfúrico como catalizador ácido, añadiéndose

cantidades equimolares de sulfato de cobre anhidro, para de esta forma capturar las moléculas de

agua liberadas por Ia reacción de glicosidación.

Para obtener una mayor proporción de las pentosas en Ia forma furanósica, se estudió Ia

reacción de Fischer en función del tiempo de reacción, aislando pequeñas alícuotas de productos

alquilados, y posteriormente analizándose los espectros de RMN de 1H y 13Cde los crudos de

reacción. En el caso de Ia reacción de glicosidación de Fischer realizada sobre Ia D-ribosa se

observó, a todos los tiempos de reacción analizados, Ia formación mayoritaria de metiI-a-D

ribofuranósido y metiI-B-D-ribofuranósido. Alevaluar la relación anomérica a distintos tiempos, se

observó que a tiempos cortos de reacción (3 h) se formó únicamente el producto B glicosidado,

1 Boons, G.; Hale, K.;Organic Synthesis with Carbohydrates, Wiley-Blackwell, 2000. ISBN:978-1-85075-913-3

'120 ï Capítulo 3 - Síntesis de furanosas 5-fosfato

mientras que al aumentar el tiempo de Ia reacción, se obtuvo como producto mayoritario Ia

mezcla de anómeros a y Ben la formas furanósicas, incrementándose la proporción del anómero

a en la mezcla con el tiempo de reacción. A tiempos prolongados (> 48 h) se observó la aparición,

en pequeña proporción, de los productos glicosidados en la forma piranósica. Para la D-arabinosa

se observó la completa conversión del sustrato a 3 horas de reacción, observándose los productos

mayoritarios en las formas furanósicas, con una pequeña proporción (menor al 5%) de los

análogos piranósicos. En el caso de la D-xilosa y L-arabinosa el tiempo de reacción fue crítico,

observándose a tiempos mayores a 3 h, una proporción elevada de los derivados en las formas

piranósicas.

Una vez confirmada la presencia de los anillos furanósicos, se continúo con la protección de los

demás hidroxilos libres. Esto se llevó adelante mediante reacciones de acetilación química,

utilizando anhídrido acético en piridina (Py), añadiendo cantidades catalíticas de 4

dimetilaminopiridina (DMAP),directamente sobre los crudos de reacción de las glicosidaciones. En

todos los casos, se pudieron purificar exitosamente por cromatografía en columna de silicagel, los

metil 2,3,S-tri-0-aceti|-D/L—pentofuranósidoscon rendimientos en un rango del 40-50%, calculados

a partir del azúcar libre (Tabla 3.1). En el caso del metil 2,3,5-tri-0-acetil-a,B-D-ríbofuranósido

(la,b; Figura 3.3), ambos anómeros se pudieron aislar por cromatografía en columna de sílica gel,

mientras que en el caso de los productos metil 2,3,5-tri-O-acetiI-a,B-D-arabinofuranósido (2,

Figura 3.3), metil 2,3,5-tri-O-acetil-a,B-D-xilofuranósido (3, Figura 3.3) y metil 2,3,5-tri-O-acetil

u,B-L-arabinofuranósido (4, Figura 3.3), se obtuvieron las mezclas de anómeros en distintas

proporciones según indica la tabla 3.1. En el caso del desoxirribósido, las formas furanósicas no se

pudieron aislar eficientemente de las piranósicas por métodos cromatográficos.

Utilizando Ia misma estrategia, se sintetizaron los butil furanósidos (Figura 3.3) con

rendimientos comparables a los metil furanósidos. Se observó una única diferencia entre los

productos obtenidos O-metilados y O-butilados, siendo ésta, la relación anomérica obtenida en la

reacción de butilación de la D-arabinosa, observándose una gran proporción del anómero a con

respecto al [3(Tabla 3.1).

IOO'OOOO‘OOOOOOOÓOOOQOOOOOOOOOOOOCOOOOOOO0.0.0.0...

0.00.0.0.0....OOOOOOOOÓOOOOÓOOOOOO...0.0.0.0.0...

121 Capítulo 3 —Síntesis de furanosas 5-fosfato

R! R1 R2 R27 R: R: R4 R4

1a H OMe H OAc H OAc CHZOAc H

1b OMe H H OAc H OAc CH20Ac H

2 ( H OMe) OAc H H OAc CHZOAc H

3 ( H OMe) H OAC OAc H CH20Ac H

4 ( H OMe) OAc H H OAc H CH20AC

5a H OBut H OAc H OAc CH10Ac H

5b OBm H H OAc H OAc CHZOAc H

6 ( H OBut) OAc H H OAc CH20Ac H

7 H OAc OAc H CHzOAc H( H OBul)

Figura 3.3. Alquil2,3,5-tri-O-acetiI-D/L-pentofuranósidos preparados

Wong y colaboradores3 estudiaron Ia regioselectividad de diversas reacciones de

desacetilación de metilfuranósidos, utilizando'la CRLcomo biocatalizador. En la reacción de

desacetilación del metil 2,3,S-tri-O-acetiI-u,B-D-xilofuranósido,estos autores obtuvieron los dos

anómeros desacetilados con distintas regioselectividades. En el caso del anómero B,obtuvieron el

producto desprotegido en la posición 3, mientras que en el caso del anómero a, observaron el

producto desacetilado en Ia posición S, no logrando aislar estos productos por métodos

Cromatográficos usuales, obteniendo la mezcla de los anómeros desacetilados en las distintas

posiciones del azúcar.

3 Hennen, w.; Sweers, H.; Wang, Y.;Wong, C.; J. Org. Chem., 1988, 53, 4939

m Capítqu 3 —Sintesis de furanosas 5-fosfato

Productos 0:5 rend(%)

Metil2.3.5-(ri-0-acetlI-a-D-rlboluranósido (1a) - 13

Meiil2,3,5-(¡1-0-3celll-BO-dbohrranósido (1h) - 50

Melil 2.3.54ri-O-aceliI-a,B-D—ard:inolurarrósido (2) 2:1 53

Melil2.3.54rl-O-acellI-a,B-D-xiloiumósldo (3) 1:1 45

Melii2.3.5Hrl-0-aceliI-a.B-L-arabinolwanósido (4) 2:1 54

Bulil 2.3.5-Tr1-O-acelil-a-D-rlboiwmósido (Sa) - 16

Bulil 2,3.5-Tr1-O-acelil-B-D-rlboll.|ra165ido(5h) ' - 47

Bulil2.3.5-Tr1-0-acelila.B-Dambinofi.rranósido (6) 5:1 56

Butil 2.3.5-Trl-0-aoelil-a.B-D-xiloíurmósido (7) 121.3 40

Tabla 3.1. Rendimientos y proporciones anoméricas de los alquil 2,3,5-tri-0-acetiI-a,[3

pentofuranósidos.

Con objeto de estudiar Ia reacción de desacetilación de los xilósidos únicamente con el

anómero a, se procedió a la síntesis de la 3,5-di-0-acetil-1,2-O-isopropiIiden-a-D-xilofuranosa (9,

Figura 3.4), para así estudiar la posibilidad de obtener el anómero a desacetilado en Ia posición 5

de forma pura. Para esto, se sintetizó, en primera instancia, el di-O-acetal triciclico 1,2;3,5-di-0

isopropiliden xilofuranosa partiendo de la D-xilosaen acetona y acido sulfúrico como catalizador

ácido de la reacción. Siendo ésta una reacción de condensación reversible, que libera agua como

subproducto, se le añadió CuSO.anh. para removerla del medio de reacción. Una característica

interesante de los azúcares protegidos por más de un acetal cíclico es la posibilidad de

experimentar hidrólisis selectiva. Siendo el grupo 1,2-O-isopropiliden más resistente a Ia hidrólisis

ácida, se logró obtener en condiciones ácidas suaves sobre el crudo de reacción, el producto 1,2

O-isopropiliden-u-D-xilofuranosa (8, Figura 3.4). Finalmente se acetilaron, utilizando anhídrido

acético en Py, las posiciones 3 y 5 de Ia xilofuranosa, obteniéndose Ia 3,5-di-O-acetiI-1,2-O

isopropiiiden-a-D-xilofuranosa (9, Figura 3.4), con un rendimiento del 55 %, calculado a partir de la

D-xilosa. Laestructura del compuesto se confirmó por análisis de los espectros de RMNde 1Hy 13C,

observándose un desplazamiento a campos menores de la señal correspondiente al H-3 del

producto 9 (de 4.19 ppm para el compuesto 8 a 5.00 ppm para el compuesto 9) indicando una de

las posiciones de acetilación.

0.0000IOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓ00.0...00.000....

123 Capítulo 3 —Sintesis de furanosas 5-fosfato

HO H0o AcO

0 Acelon \| 0 MeOH O Aczo 0H 0H_. 0/ _. H __. AcH' H' dil. o P1 oouso. °

OH o 0 0

a 9

Figura 3.4. Síntesis de la 3,5-di-0-acetiI-1,2-O-isopropiliden-a-D-xilofuranosa.

3.3.2 Síntesis uimio-enzimática de furanosas diacetiladas: reacciones enzimáticas de

desacetilación.

Luego de la obtención de los diversos furanósidos peracetilados, se procedió al análisis de

la regioselectividad de las reacciones de hidrólisis biocatalizadas utilizando enzimas de diversas

fuentes, con el objeto de obtener los azúcares con Ia posición 5 libre. El primer biocatalizador

estudiado fue la CRL.Se seleccionó este biocatalizador en base a estudios previos3 que mostraron

que la reacción de hidrólisisenzimática de diversos metilfuranósidos peracetilados, era totalmente

regioselectiva y se obtenían, en la mayoría de los sustratos estudiados, los productos

desacetilados en Ia posición 5. Otro factor tenido en cuenta para su selección fue la accesibilidad

comercial de este biocatalizador.

En segundo lugar, se decidió explorar la regioselectividad de las reacciones de hidrólisis enzimática

utilizando tejido vegetal, como biocatalizador. Se seleccionó con este fin, porciones de Musa

sapientum (banana) como fuente enzimática, debido a que se han reportado estudios que

demuestran la presencia de Iipasasy esterasas en dicho fruto‘.

Finalmente se analizó si existían diferencias en la regioselectividad de las reacciones de

hidrólisis enzimática, al llevarlas a cabo sobre los sustratos butil pentofuranósidos peracetilados en

lugar de los correspondientes metil derivados. Otro propósito particular de esta modificación, fue

estudiar si las mezclas de anómeros obtenidas como productos de desacetilación podían separarse

por métodos cromatográficos usuales.

‘ Bailey, M.;.I. Am. Chem. Soc., 1912, 34, 1706

124 Capitulo 3 - Sintesis de furanosas S-fosfato

gentofuranósidos utilizando Ia CRL.

En términos generales, las reacciones de hidrólisis utilizando la CRLse llevaron a cabo

disolviendo los sustratos peracetílados en DMF, diluyendo las soluciones posteriormente con

nueve volúmenes de buffer fosfato 0,1M (pH = 7), y finalmente añadiendo la enzima comercial CRL

a la mezcla de reacción y agitando orbitalmente a 37°C. De esta manera se obtuvieron reacciones

homogéneas que fueron monitoreadas por c.c.d. Cuando se observaron conversiones óptimas

(esto implicó como criterio tanto la máxima conversión por monitoreo de la desaparición del

sustrato de partida como la menor formación de productos didesacetilados), las mezclas de

reacción fueron extraídas con AcOEt,y el extracto orgánico obtenido de esta forma, fue secado y

evaporado a sequedad. Los productos fueron purificados finalmente por cromatografía en

columna de silica gel. Los compuestos así obtenidos fueron analizados por RMN de lH y 13Cy

posteriormente por experimentos de homodecoup/¡ng de 1H. Se determinó la posición de

desacetilación comparando los desplazamientos quimicos de las señales de lH-RMN de los

sustratos y de los productos. Asimismo existen algunos de estos productos asignados

espectroscópicamente en publicaciones previas, confirmando la asignación de las posiciones de

desacetilación propuestas.

R, R" R2 Rz' al R1 R. R.

10' H OMe H OAc H OAc CHzOH H

10h OMe H H OAc H OAc CHzOH H

11 ( H OMe) OAC H H OAC CH¡0H H

12 ( H OMe) H OAc OH H CHzoAc H

13 ( H OMe) OAc H H OAc H cmo H'Lospurint 'nüanh mczhú Inormrns “ SOromrurcnhs ¡ukme a dtnutlbc'nn.

Figura 3.5. Estructura de los productos de desacetilación utilizando CRLcomo biocatalizador.

125 ' Capítulo 3 —Síntesis de furanosas 5-fosfato

En primer lugar, se estudió la hidrólisis de los metil 2,3,5-tri-0-acetil-D/L

pentofuranósidos. La hidrólisis del anómero B del metil 2,3,5-tri-0-acetiI-D-ribofuranósido (1b,

Figura 3.6) fue regioselectiva para la posición primaria, observándose como único producto el

metil 2,3-di-O-acetil-B-D-ribofuranósido (10h, Figura 3.6) con un rendimiento del 75 % (Tabla 3.2).

En el caso del anómero a, la regioselectividad fue Ia misma que la observada para el anómero [3,

obteniéndose un único producto monodesacetilado, el metil 2,3-di-O-acetil-a-D-ribofuranósido

(10a, Figura 3.6) con un 80 % de rendimiento (Tabla 3.2). El análisis por RMN de los productos

desacetilados de ambos anómeros, mostró un fuerte desplazamiento a campos altos de las

señales correspondientes a los Hs-S,en concordancia con los datos espectroscópicos reportados

previamente para ambos productos’.(de 4.11 y 4.36 ppm, señales correspondientes a cada H-5en

el sustrato lb, a 3.46 y 3.57 ppm en el producto 10b y de 4.22 y 4.37 ppm señales

correspondientes a cada H-Sdel sustrato la a 3.82 y 3.87 ppm en el producto 103).

OAc Y OAc Y

1a,b X= H,Y=OAC2 X=OAC,Y=H

10a,b X= H. Y = OAc11 X = OAc. Y = H

Figura 3.6. Desacetilación enzimática de metil 2,3,5-tri-0-acetiI-D-ribo y D-arabinofuranósidos

La hidrólisis de la mezcla de anómeros del metil 2,3,5-tri-0-acetiI-a,B-D-arabinofuranósido

(2, Figura 3.6) también dio la regioselectividad deseada, obteniéndose la mezcla de ambos

anómeros desacetilados en la posición 5 (metil 2,3-di-0-acetiI-a,[3-D-arabinofuranósido, 11, Figura

3.6) con un rendimiento del 70 % (Tabla 3.2). La reacción de desacetilación del D-arabinósido

peracetilado fue estudiada previamente por Wong y colaboradores’, aunque únicamente

analizaron la desacetilación enzimática del anómero a utilizando la CRL,observando la misma

regioselectividad que la obtenida por la reacción de hidrólisis realizada en nuestro laboratorio,

razón por Ia cuál fue posible comparar las asignaciones espectroscópicas de ambos productos

obtenidos. Para determinar la posición de desacetilación del producto obtenido por hidrólisis del

anómero B, se analizaron los espectros de lH-RMN, en los cuales se observó un fuerte

desplazamiento a campos altos de las señales correspondientes a los Hs-S (de aprox. 4.14 y 4.20

ppm correspondientes a las señales de los H-S del sustrato ZBa 3.82 y 3.79 ppm en el producto

126 Capítulo 3 - Sintesis de furanosas 5-fosfato

118), obteniéndose entonces la misma regioselectividad que en el caso del anómero a. No fue

posible separar por métodos cromatografía en columna de silica gel esta mezcla de anómeros

desacetilados, pero pudo utilizarse como tal para la posterior reacción de fosforilación, ya que en

ambos anómeros se encuentra desprotegida la posición 5. En los tres casos descriptos, se

completó Ia reacción de hidrólisis, obteniendo conversiones aprox. cuantitativas. Losrendimientos

obtenidos menores al 100 % pueden ser atribuidos a pérdidas de masa en la extracción con

acetato de etilo de la mezcla de reacción, debido a la formación de una emulsión en la interfase y

a Ia solubilidad de los compuestos en la fase acuosa / DMF.

Tiempo deSustrato reacción (h) Rend. (%) Producto 043

Metil2,3,5-tri-O-acetiI-a-D-ribofuranósido (1a) 11 80 5-OH (10a) .

Metil2.3,5-tri-O-acetil-B-D-ribofuranósido (1b) 13 75 5-0H(10b) Meül 2,3.5-u'i-O -aoetil-a,B-D-arabinofuranósido (2) 10 70 5-OH (11) 2;1

Metil 2.3.5-tri-O-aoetiI-a.B-D-xilofuranósido (3) 15 54 3-OH (12) 1.5;1

Meu'l2,3.5-tn-O-aoetiI-u.B-L-arabinofuranósido (4) 15 50 5-OH (13) 4;1

Tabla 3.2 Desacetialción regioselectiva de metilfuranósidos peracetilados utilizando CRL.

La hidrólisis de la mezcla anomérica del metil 2,3,S-tri-O-acetiI-a,B-D-xilofuranósido (3,

Figura 3.7) dio como resultado dos productos en una relación de 1.5:1. Ambos productos fueron

parcialmente aislados por cromatografía en columna de sílica gel e identificados por

espectroscopia de RMN de 1H. En este caso, la regioselectividad observada no coincidió con la

obtenida en el caso de los ribósidos, obteniéndose los productos desacetilados en la posición 3

con un S4 % de rendimiento (Tabla 3.2). En el trabajo de Wong y colaboradores’, se reportó la

obtención del mismo producto desacetilado en la posición 3 en el caso del anómero B (metil 2,5

di-O-acetil-B-D-xilofuranósido (128, Figura 3.7), pero en cambio se informó que el producto

obtenido por la hidrólisis enzimática del anómero a era el desacetilado en la posición S, no

pudiendo aislar la mezcla anómerica por cromatografía en columna de silica gel. En el último caso,

los espectros de 1Hy 13Creportados en esta publicación, no coinciden con los obtenidos a partir

del producto aislado en la reacción de hidrólisis realizada en nuestro laboratorio. El producto

asignado y verificado por experimentos de homodecoupling de 1H,fue el producto desacetilado en

la posición 3, el metil 2,5-di-O-acetiI-a-D-xilofuranósido (12a, Figura 3.7). En este caso se observó

en el espectro de RMNde lH, un desplazamiento de la señal correspondiente al H-3 (de 5,49 ppm

para el sustrato triacetilado 3a. a 4.49 ppm para el producto de hidrólisis 12a).


AcO A00 AcO

Figura 3.7. Desacetilación enzimática de metil 2,3,5-tri-O-acetiI-D-xilofuranósido.

Por último, Ia hidrólisis utilizando la CRLcomo biocatalizador, de la mezcla de anómeros

metil 2,3,5-tri-O-acetil-a,B-L-arabinofuranósido (4, Figura 3.3), se produjo con la regioselectividad

deseada, obteniéndose el producto desacetilado en la posición 5 del azúcar, el metil 2,3-di-O

acetiI-a,B-L-arabinofuranósido (13, Figura 3.5) con un 50 % de rendimiento (Tabla 3.2). En

concordancia con los productos desacetilados en la posición 5, se observó en el RMN de 1H,un

desplazamiento a campos más altos de las señales correspondientes a dichos hidrógenos (se

observó un multiplete en el rango de 4,05-420 ppm correspondientes a los H-5 en el sustrato,

mientras que las señales correspondientes al H-Sen el producto desacetilado, se observaron en el

rango de 3.77-3.79 ppm).

En las dos últimas hidrólisis descriptas se obtuvieron rendimientos alrededor de 50 %,

debido a que no se pudieron completar ambas reacciones. A tiempo mayores a 15 horas

comenzaron a aparecer productos monoacetilados, por lo que se concluyeron las reacciones a

tiempos óptimos, en los cuales la conversión no fue cuantitativa. Se puede observar que en todos

los casos estudiados, el anómero a reacciona con mayor velocidad que el anómero B

correspondiente, en las reacciones de hidrólisis. Esta observación se pudo deducir, comparando la

relación anomérica en el producto desacetilado con respecto a la relación anomérica en el

material de partida. Asimismo se comprobó que el material de partida sin reaccionar, era el metil

B-pentofuranósido triacetilado.

128 Capitulo 3 —Síntesis de furanosas S-fosfato

gentofuranósidos utilizando ¡eiido vegetal (Mugasaglgntuml

Las reacciones de hidrólisis utilizando tejido vegetal, particularmente porciones de

banana, como fuente de Iipasas y esterasas, se llevaron a cabo primero disolviendo los sustratos

peracetilados tanto en DMFcomo en AcOEt, diluyendo las soluciones posteriormente con nueve

volúmenes de buffer fosfato 0,1M (pH=7), finalmente añadiendo las porciones de banana

pretratadas a la mezcla de reacción, y agitando a 37°Cen un agitador orbital. Se utilizó para estos

ensayos banana de origen ecuatoriano (Musa sapientum, variedad Cavendish). El pretratamietno

del biocatalizador implicó, en primer lugar, cortar la banana comercial en cubos con volúmenes

menores a 1 cm’, para luego lavarlos sucesivamente con una solución acuosa de Iavandina 1 %,

agua destilada, etanol y finalmente agua destilada nuevamente, para de esta forma eliminar

posibles microorganismos superficiales que pudiera contener el tejido vegetal. Finalmente se dejó

equilibrar las porciones de banana con el buffer de reacción. Antes de ser añadidas se cuantificó el

coeficiente de maduración“, que aproximadamente fue de 1,8 en todos los casos estudiados, ya

que el contenido de las distintas enzimas puede variar a lo largo del proceso de maduracións. Las

reacciones fueron monitoreadas por c.c.d., y cuando se observaron conversiones óptimas, las

mezclas de reacción fueron centrifugadas, y luego extraídas con AcOEt, el extracto orgánico

obtenido de esta forma, fue secado con NaZSO.anhidro, filtrado y evaporado a sequedad. Los

productos fueron purificados finalmente por cromatografía en columna de sílica gel y analizados

por RMN de lH y 13Cy por homodecoupling de lH. Se determinó la posición de desacetilación

comparando los desplazamientos quimicos de las señales de 1H-RMNde los sustratos y productos.

Paralelamente se llevaron a cabo experimentos blancos en ausencia del biocatalizador.

En primer lugar se estudió la reacción de hidrólisis del metíl 2,3,5-tri-0-acetiI-a-D

ribofuranósido (1a, Figura 3.8) utilizando porciones de banana pretratadas como biocatalizador.

Las reacciones fueron seguidas por c.c.d hasta desaparición completa del sustrato 1a. Se

exploraron dos condiciones experimentales: En primera instancia, se utilizó una mezcla de DMFy

buffer fosfato pH=7.0 como solventea, condición idéntica a la utilizada para las reacci0nes de

hidrólisis utilizando CRLcomo biocatalizador, descripta en la sección 3.3.2.1. El RMN de 1H del

crudo de reacción (Figura 3.9A) indicó la presencia de un único producto de hidrólisis (72 % de

rendimiento, solo un carbono anomérico), en el que se observó un fuerte desplazamiento a

campos altos de las señales correspondientes a los Hs-S, en concordancia con los datos

129 Capítulo 3 - Síntesis de furanosas 5-fosfato

espectroscópicos reportados previamente para el metil 2,3-di-O-acetiI-a-D-ribofuranósido (10a,

Figura 3.8). Posteriormente se modificaron las condiciones experimentales, utilizando como

solvente de reacción, la mezcla de AcOEt : buffer fosfato pH = 7.0, de forma de simplificar el

proceso de tratamiento de los productos. Eneste caso se observó la misma regioselectividad en la

reacción de hidrólisis, obteniéndose como único producto el metíl 2,3-di-0-acetiI-a-D

ribofuranósido (10a, Figura 3.8) esta vez con un rendimiento cuantitativo. La mejora en los

rendimientos de reacción puede ser atribuida a extracciones líquido-líquido más eficientes que las

correspondientes para el sistema de solventes DMF: buffer fosfato.

Banana

Solvente

153. b

Relación Molar Conv. Rend. tiempo dex Y Corn . Solvente 1o ; 14: 15 %" %° reacción ¡th

OCH3 H a DMFzPBS' 1 : o : o 100 72 11

OCH; H a AcOEtPBS 1 : 0 : 0 100 99 11

H OCHg b DMFzPBS 1: 1 z 1 83 43 13

H OCH; b AcOEtzPBS 1 : 1 : 1 85 54 12a PBS: Bufferfosfato pH = 7. b Conversion '/.: determime uh'iando el bdancn de masa de los productosaislados por cromatografia. c: Rendimiento '/.luego de la purificaciónpor cromatografia en colrnna de silicagel. (excepto por el compuesto 10a para el cual no fue nómada).

Figura 3.8. Reacción de desacetilación del metil 2,3,5-tri-O-acetil-a-D-ribósido y metil 2,3,S-tri-0-acetiI-B-Dribósido, utilizando trozos de banana como biocatalizador.

Cuando la reacción de hidrólisis fue llevada a cabo sobre el sustrato metil 2,3,5-tri-0

acetil-B-D-ribofuranósido (lb, Figura 3.8) se observó una desprotección no regioselectiva. En este

caso se obtuvo una mezcla equimolar de los tres posibles productos de monodesacetilación, el

metil 2,3-di-O-acetiI-B-D-ribofuranósído (10h, Figura 3.8), el metil 2,5-di-0-acetil-[3-D

ribofuranósido (14b, Figura 3.8) y el metil 3,5-di-0-acetil-B-D-ribofuranósido (15h, Figura 3.8). Este

resultado se confirmó espectroscópicamente (Figura 3.93) observándose un conjunto de tres

señales diferentes en el RMNde 1H,correspondientes a los tres Hs-l (4.86, 4.87 y 4.92 ppm) que

correlacionan con las tres señales anoméricas diferentes observadas en el RMN de 13C(105.86,

106.39 y 108.42 ppm). La mezcla de isómeros se observó como una única mancha en c.c.d con el

mismo Rfque el compuesta 10h , indicando el mismo grado de desacetilación.

130 i Capitulo 3 - Sintesis de furanosas S-fosfato

Aunque se ha reportado anteriormente que los sustratos la y 1b exhibían el mismo

comportamiento regioselectivo en las reacciones de hidrólisis utilizando CRL, los resultados

obtenidos en este caso sugieren que la estereoquímica del centro anomérico podria afectar la

selectividad de la reacción de desacetilación enzimática cuando se utilizan porciones de banana

como biocatalizador. Enconsonancia con estos resultados, se ha recientemente reportados que la

alcohólisis enzimática utilizando la CAL-Bmuestra un patrón de reconocimiento diferente hacia los

anómeros la y lb.

lI _

- nmW.—u

.__ -o ‘

l

¡ ¡ ¡ I - ' I I 'flano .I nao ¿no

".4", “n "’ "-(n) v’__—— _watch anule ¡1.qu '

- —m

P_ m

-m

Qmm) sm 450 oo ”. m

Figura 3.9. Espectros de RMNde lH del crudo de reacción de las hidrólisis enzimáticas utilizando banana

como biocatalizador: (A)partiendo del sustrato 1a, (B)partiendo del sustrato lb.

Con el objeto de explorar si el fenómeno de regioselectividad observado al utilizar

porciones de banana como biocatalizador era de carácter general, se estudió la reacción de

desacetilación utilizando este biocatalizador, de Ia mezcla anomérica de relación (1:8 de 2:1, del

sustrato metil 2,3,5-tri-O-acetil-a,B-D-arabinofuranósido (2, Figura 3.10). Las condiciones

experimentales ensayadas fueron las mismas que las empleadas para las reacciones análogas

realizadas sobre los sustratos ribosidicos (DMFzBufferfosfato pH=7, 379C). Se analizaron, en este

slñigo, 5.; Taverna-Porro, M.; Montserrat, 1.; Iglesias, L; Iribarren, A.; J. Mol. Cata]. B: Enzym., 2005, 35 70

131 ; Capítulo 3 - Síntesis de furanosas 5-fosfato

caso, las reacciones de desprotección a diversos grados de conversión. A conversiones del 45 %

(Figura 3.10) se obtuvieron sólo los productos diacetilados: metil 2,3-di-O-acetiI-u,B-D

arabinofuranósido (11, Figura 3.10), metil 2,5-di-O-acetiI-a,B-D-arabinofuranósido (16, Figura

3.10), y metil 3,S-di-O-acetil-a,B-D-arabinofuranósido (17, Figura 3.10), con un relación molar de

1:1:7. Elcomponente mayoritario fue asignado corno la mezcla de anómeros en relación azB 1:1.2

del producto desacetilación en Ia posición 2 del azúcar. La comparación de los RMN de Ia mezcla

cruda de reacción y los de la fracción aislada cromatográficamente, sugiere que no ocurrió

migración del grupo acetilo durante Ia purificación. En un experimento independiente cuando la

reacción alcanzó un 87 % de conversión (Figura 3.10), se aisló la mezcla de los tres posibles

productos de monodesacetilación, 11, 16 y 17, en una relación molar 2.6 : 2.1 15.3. En este caso, Ia

relación de anómeros del producto mayoritario se vio modificada, obteniéndose una relación azfi

de 1 : 0.04. Asimismo, se aisló una fracción de productos didesacetilados con un 45 % de

rendimiento, productos de desacetilaciones sucesivas del anómero B.Estos resultados contrastan

con el comportamiento del ribósido la en las reacciones de hidrólisis utilizando porciones de

banana como biocatalizador, que pudo ser convertido cuantitativamente al producto diacetilado

(103) sin posteriores y sucesivas desacetilaciones.

o\OAc OA: o?“ OP“ CCH:/ oc“: Banana 0‘ oc”, ocnJ /

Solvente + + +

“o AcO OH

2 11 16 17aAcO

o OH . .+ \ + productos didesacetilados

OC":A00

17b

Rend. Rend.Relación Molar Conv. Monodesacet. Didesacet tiempo de

Solvente 11:16:17(17a:17b "/oh %° .% mDMFsPBS' 1 : 1 : 7 (1 : 1.2) 45 25 0 10DMFzPBS 2.6: 2.1 :5.3 (1 : 0.04) 87 17 45 16

AcOEtzPBS 1 : 1 : 8 (1 : 1.1) 50 27 0 10AcOEtzPBS 1.7 : 2.8255 (1 10.18) 100 14 64 16

a PBS: Butler oslalo pH = 7. b Converslon fi: delerm'nac-o uliizando el baance de rmsa de los productosaislados por cromtogral'a. c: Randlmlonb ‘A'luego de la purificaciónpor cromatografía en columna de siica gel.

Figura 3.10. Reacción de desacetilación del metil 2,3,5-tri-O-acetiI-a,B-D-arabinósido, utilizando bananacomo biocatalizador.

132 Capítulo 3 —Sintesis de furanosas 5-fosfato

Cuando las condiciones de reacción se modificaron como se describió para el caso de los

ribósidos, utilizando la mezcla AcOEt : bufer fosfato pH 7.0 como solvente, la reacción de hidrólisis

utilizando porciones de banana como biocatalizador, dio resultados similares a los obtenidos

utilizando la mezcla DMF : buffer fosfato pH 7.0 (Figura 3.10). En ambos casos, cuando fue

incrementado el grado de conversión de la reacción, se vio aumentado el rendimiento de los

productos didesacetilados, principalmente por la hidrólisis del anómero [3 del compuesto 17,

cambio reflejado en la proporción de los anómeros de dicho compuesto con el grado de

canversión (Figura 3.10).

Cuando la reacción de hidrólisis utilizando banana como biocatalizador, se llevó a cabo

sobre el sustrato metil 2,3,5-tri-0-acetil-u,B-L-arabinofuranósido (4), se obtuvieron los tres

posibles productos de monodesacetilación en proporción equimolar, en todos los grados de

conversión ensayados, concluyéndose así, que la reacción no mostró regioselectividad cuando se

realizó sobre este sustrato.

Por otro lado, Ia reacción de hidrólisis llevada a cabo sobre el metil 2,3,5-tri-O-acetil-a,B-D

xilofuranósido (3, Figura 3.11) utilizando el mismo biocatalizador, mostró como en el caso de los

ribósidos, diferentes regioselectividades dependiendo de la configuración del C-1. Cuando se

sometió a hidrólisis enzimática dicho sustrato (3, c1264:1) utilizando como solvente de reacción, la

mezcla DMF : Buffer fosfato pH=7.0, se obtuvo una mezcla de productos que consistía en dos

compuestos diacetilados, que fueron asignados espectroscópicamente como: metil 2,5-di-O-acetil

u-D-xilofuranósido (18, Figura 3.11) y metil 3,5-di-O-acetil-B-D-xilofuranósido (19, Figura 3.11) en

una relación molar 5.3 : 3.8, junto con aproximadamente 10 % de otros productos de

didesacetilación (20, Figura 3.11). Cuando la misma reacción se llevó a cabo alcanzando mayores

grados de conversión (grado de conversión del 86 %, Figura 3.11), fueron aislados ambos

productos monodesacetilados (18 y 19, Figura 3.11) con menores rendimientos, lo cuál puede ser

atribuido a las subsiguientes reacciones de hidrólisis. AI ser imposible de separar por métodos

cromatográficos utilizando sílica gel esta mezcla anomérica de productos diacetilados en distintas

posiciones del azúcar, se ensayó la reacción de hidrólisis sobre un sustrato de mayor Iipofilicidad.

Con este objetivo se sintetizó el butil 2,3,S-tri-O-acetiI-u,B-D-xiIofuranósido, cuya reacción de

hidrólisis se describe en la próxima sección.


A00 AcO A00

0 OR 0 O OR O4 otros otros/°í° AC N5 o ' productos - productos

diacelilados monoaceüladosOR OR

OAc 0A: OH OAC

AcO

R=Me 3p Ja (1:4) 19 1a zoR=Bul 7p 1a (1:1) zz 21 23 24+25

H0

o

7a ———- 21 —- o“ 24OAc

Aeooam0

7p—- 22—- 25OH

Rend. Rend.Conv. Monodesacet. Didesacel.

sustrato R °/o % % 1B:19:2_0 21 : 22 : 23 : 24+25'

3 ((1.6) Me 65 42 0 5.3: 3.8: 1.1

3(u.B) Me 86 29 0 6.2:2.5:1.3 No.9) But 76 40 28 - 2.2 23.4 :0.2 :4.2

8 51 - 0.52: 0.84 : 0.04 : 8.67 a. Buta productcs moncaceülad ¡s cano um mezua de ana'neros.

Figura 3.11. Reacción de desacetilación del metil 2,3,5-tri-0-acetiI-u,B-D-xilósido y Butil 2,3,S-tri-0-acetila,B-D-xi|ósido, utilizando banana como biocatalizador.

entofuranósidos utilizando te'ido v e l r zos de banana

Con el objeto de separar la mezcla de anómeros obtenida en Ia reacción de hidrólisis

utilizando porciones de banana como biocatalizador del derivado xilósido, se planteó Ia síntesis de

sustratos más Iipofílicos, de forma de lograr aislar los citados epímeros, por métodos

cromatográficos sencillos. Con este fin, se sintetizaron los butil 2,3,5-tri-O-acetiI-a,|3-D

xilofuranósidos como se describe en Ia sección 3.3.3.1. En forma similar se prepararon los butil

derivados de la D-ribosa y de la D-arabinosa. Lahidrólisis enzimática de los derivados butilados de

Ia D-ribosa y D-arabinosa dio Ia misma regioselectividad que la obtenida para el caso de los metil

134 Capitulo 3 - Síntesis de furanosas S-fosfato

derivados, observándose que en el caso del butil 2,3,5-tri-O-acetil-B-D-ribofuranósido la mezcla

equimolar de los tres productos posibles de desacetilación y en el del butil 2,3,5-tri-O-acetil-a-D

ribofuranósido, el producto desacetilado en la posición 5. En el caso del butil 2,3,S-tri-O-acetil-a,B

D-arabinofuranósido se vio disminuida Ia regioselectividad de la reacción, observándose mezclas

de los productos de desacetilación cuasi equimolares, inclusive a grados de conversión pequeños.

Cuando la reacción de hidrólisis enzimática fue llevada a cabo sobre la mezcla anomérica

de los butil 2,3,5-di-O-acetiI-u,B-D-xilofuranósidos (7, Figura 3.11), se obtuvieron, luego de la

purificación, dos fracciones de productos diacetilados con un rendimiento total del 40 %, a un

grado de conversión del 76 %. La primera fracción estaba compuesta por los dos productos de

desacetilación: el butil 2,5-di-0-acetil-u-D-xilofuranósido (21, Flgura 3.11) y el butil 3,5-di-O-acetil

B-D-xilofuranósido (22, Figura 3.11) en una relación molar (1:8 de 2.2 : 3.4. La segunda fracción,

aislada cromatográficamente contenía únicamente el anómero B diacetilado en forma pura. La

obtención del anómero puro facilitó la asignación espectroscópica de las posiciones de

desacetilación por análisis de RMN (Figura 3.12). Para el compuesto 22 se observó un claro

desplazamiento en las señales de RMN de 1Hdel H-2 (de 5,6 ppm para el compuesto 7B a 4.55

ppm para el compuesto 22, circqu negro en la Figura 3.12), sugiriendo que la desprotección

ocurrió sobre dicha posición. Para el compuesto 21 se observó un desplazamiento en las señales

de RMN de 1H del H-3 (de 5.13 ppm en el compuesta 7a a 4.20 ppm en el compuesto 21)

indicando la posición del acetilo hidrolizado. Se analizó luego, la fracción de los productos

didesacetilados, cuando la conversión fue del 95 %, y el rendimiento de los productos

monoacetilados fue del 51 % (Figura 3.11). Por análisis de RMN (C-1: 107.34 y 98.83 ppm, H-1:

5.21 ppm (doblete) y 4.97 ppm (singulete)) fue posible establecer que la mezcla estaba compuesta

por ambos anómeros didesacetilados en una relación de 1 : 1 (Flgura 3.12). Basados en

experimentos de homodecoupling de Ia mezcla, se confirmó Ia identidad de ambos productos de

didesacetilación, determinando que dicha mezcla contenía el butil 2-O-acetil-u-D-xilofuranósido

(24, Figura 3.11) y el butil S-O-acetil-B-D-xiIofuranósido (25, Figura 3.11).


"¡:2 2’ 2¡Sii ¡:3l,

Ei'i’i:l'.l= :55

Figura 3.12 Espectro de RMNdelos productos de mono y di desacetilación obtenidos por la reacción dehidrólisis del butil 2,3,5-tri-0-acetiI-a,B-D-xilósido, utilizando banana como biocatalizador.

En el espectro de RMN de lH del compuesto 24 se observó un claro desplazamiento a

campos más altos (círculos blancos, Figura 3.12) en las señales de los H-3 y H-5 (desplazamientos

de 0.78 y 0.50 ppm respectivamente), mientras que en el espectro correspondiente del compuesto

25, el desplazamiento a campos mayores (circulo negro, Figura 3.12) fue asociado a los H-2 y H-3

(desplazamientos de 0.94 y 0.84 ppm, respectivamente).

136 Capítqu 3 - Síntesis de furanosas S-fosfato

xilofuranosautilizando divergs fuentes gnzlmáglgs.

Como se reportó en el trabajo publicado por Wong y colaboradores, que el anómero a del

metil xilósido peracetilado daba el producto desacetilado en Ia posición 5 del azúcar, sumada Ia

dificultad de aislar completamente los anómeros a y B monodesacetílados, productos de las

reacciones de hidrólisis con diversas fuentes enzimáticas, se procedió a estudiar las reacciones de

desacetilación del anómero a puro. Para esto se sintetizó Ia 3,5-di-0-acetiI-1,2-0-isopropiliden-a

D-xilofuranosa (9, Figura 3.13). Laformación del acetal cíclico precisa del hidroxilo anomérico en Ia

orientación a, Iográndose de esta forma preparar un derivado acetilado epiméricamente puro. Se

ensayaron las reacciones de hidrólisis utilizando los biocatalizadores estudiados previamente: la

CRLy porciones de banana. Por otra parte, se estudio la reacción de desacetilación con otra

enzima, CAL-B.Esta enzima ha sido utilizada anteriormente en nuestro laboratorio, ensayándose Ia

regioselectividad de Ia reacción de hidrólisis sobre los sustratos metil peracetilados, estudiados en

esta tesis‘.

Aco AcO

Biocatalizador oAc __. Ho Solvente o

0 09 26

Tiempo deSustrato Biocatalizador Solvente‘ Conv. %° Rend. Monodesact. %° reacción (h)

L DMF: PBS 100 95 109 CAL-B DMF : PBS 100 76 14

9 Banana DMF : PB_SJ 100 s7 1o'PBS:Bufierloslalou uuu-"vu" J J "' J " ' J J ' r J r ' r uuulrna

=Rond.Monodencot%-I a r " " r q n J I. a .

Figura 3.13. Reacción de desacetilación dela 3,5-di-0-acetiI-1,2o ' r c D " ' , utilizandodiversas fuentes enzimáticas como biocatalizadores.

6 Gudiño, E.; Iribarren, A.; Iglesias, L.; Tetrahedron:Asymm., 2009, 20, 1813


Las reacciones de hidrólisis utilizando los tres sistemas enzimáticos previamente

enumerados brindaron el mismo producto de desacetilación, el 5-O-acetil-1,2-O-isopropiliden-a

D-xilofuranosa (26,Figura 3.13). Luego de la purificación en columna de sílica gel se obtuvieron los

rendimientos indicados en Ia Figura 3.13. Los productos fueron asignados por RMN de 1Hy 13C,

observándose en todos los casos un desplazamiento a campos más altos de la señal de 1H

correspondiente al H-3 (de 5,01 ppm para el compuesto 9 a 4.13 ppm para el compuesto 26,

circqu azul en la Figura 3.14), indicando la posición de desacetilación en la reacciones de

hidrólisis. Se decidió, paralelamente, analizar por RMN los crudos de reacción, con el objeto de

estudiar si las condiciones ácidas de la columna de sílica gel utilizada para la purificación,

favorecían la migración del grupo acetilo con el fin de analizar si Ia regioselectividad observada en

todos los casos estudiados, se debía a un artefacto producido por la posterior purificación o si

reflejaba la regioselectividad de las enzimas estudiadas.

no á¡L__z,i_JuJL___e

Figura 3.14. Espectro de RMNde lH de A)3,5-di-0-acetil-1,2-0-isopropiIiden-a-D-xilofuranosa B)S-O-acetil1,2-0-isopropiliden-a-D-xilofuranosa

En todos los casos estudiados se observaron que los crudos de reacción consistían en una

mezcla de productos en distintas proporciones. En la reacción de hidrólisis del sustrato utilizando

CRLcomo biocatalizador Ia mezcla de productos se componía de Ia 5-0-acetiI-1,2-O-isopropi|iden

a-D-xilofuranosa (26, Figura 3.15), la 3-0-acetiI-1,2-O-isopropiliden-a-D-xilofuranosa (27, Figura

3.15) y el producto de partida sin reaccionar 3,5-di-O-acetil-1,2-0-isopropiIiden-u-D-xilofuranosa

(9, Figura 3.15) en una proporción 6.3 : 1 : 3. Elespectro de 13C-RMNdel crudo de reacción mostró

138 n Capítqu 3 - Síntesis de furanosas S-fosfato

tres señales correspondientes al C anomérico (104.86, 104.85 y 104.67 ppm) en las distintas

proporciones. En el espectro de lH-RMN,se observaron dos conjuntos de señales, a 5.25 y 5.21

ppm, correspondientes a los Hs-3 pertenecientes al producto de partida sin reaccionar (9) y al

producto desacetilado en la posición 5 (27). Por último se observo un conjunto de señales a 3.80 y

3.65 ppm pertenecientes a las señales de los Hs-S del producto desacetilado en dicha posición

(27), sumado a las señales antes descriptas para el compuesto 26. Para confirmar esta suposición

se evaluó la presencia de grupos acetilos, en Ia zona cercana a los 2 ppm, observándose cuatro

singuletes en dicha región, dos que integraban para la misma cantidad de hidrógenos, siendo los

acetilos del producto de partida sin reaccionar, y dos singuletes en distintas proporciones, que

serian los acetilos pertenecientes a los dos productos monodesacetilados.

Aco AoO H0 AcO

0 Bioalalizador o o oAc —. H + Ac + Ac

0+ 0+ 0 O9 26 21 9

Suslrato Biocatalizador Solvenle 26 : 27 : 9

9 CRL DMFzPBS 6.3: 1 :3

9 CAL-B DMF : PBS 1 :2.6 : 4.7

9 Banana DMFZPBS 7.9: 1 :2.7

Figura 3.15. Análisisde los crudos de reacción obtenidos por la reacción de desacetilación de Ia 3,5-di-0acetil-1,2-0-isopropiliden-a-D-xilofuranosa, utilizando diversas fuentes enzimáticas como biocatalizadores.

Elanálisis de los espectros de RMNdel crudo de la reacción de hidrólisis utilizando banana

como biocatalizador, indicó la presencia de los mismos componentes de la mezcla, los compuestos

26, 27 y 9 (Figura 3.15) en una relación 7.9 : 1 : 2.7, siguiendo el análisis de RMNdescripto para el

realizado al crudo de la reacción de hidrólisis utilizando CRLcomo biocatalizador. Por último se

analizó el espectro de RMNdel crudo de reacción de la reacción de desacetilación utilizando CAL-B

como biocatalizador, hallándose Ia misma composición que la determinada para los dos casos

anteriores. Sin embargo la relación de los productos obtenidos se vio modificada, encontrándose

una relación de los compuestos 26 : 27 : 9 de 1 : 2.6 : 4.7, siendo el producto mayoritario el

desprotegido en Ia posición 5.

139 Capítulo 3 —Sintesis de furanosas S-fosfato

Se puede concluir que las reacciones de hidrólisis con todos los biocatalizadores ensayados

no son regioselectivas cuando se realizan sobre el sustrato 3,5-di-O-aceti|-1,2-0-isopropiliden-a-D

xilofuranosa, obteniéndose luego de las mismas una mezcla de los dos posibles productos de

desacetilación en diversas proporciones. La obtención de un único producto, luego de la

purificación por cromatografía en columna de silica gel, pudo ser debido a la migración del grupo

acetilo dela posición 3 a la 5, favorecida en medio ácido.

desoxi-D-ribofuranosa 5-fosfato utilizandg el producto de la hidrólisis enzimáticg de la

3.S-di-O-acetil-l,2-O-isogrogiliden-a-D-xilofuranosa.

Con el objetivo de explorar los posibles usos de los productos obtenidos mediante las

reacciones de hidrólisis enzimática, en los cuales, no se obtuvo la desprotección del hidroxilo

primario, se planteó Ia síntesis de un sintón de fosfatos de furanosas modificadas en la posición 3

del anillo furanósico. Con este objetivo, se decidió utilizar el producto de hidrólisis de la 3,5-di-O

acetil-1,2-O-isopropiliden-u-D-xilofuranosa (9, Figura 3.13), la S-O-acetil-1,2-O-isopropiliden-S-O

acetiI-u-D-xilofuranosa (26, Figura 3.13). En esta sección se discutirá la síntesis de un posible

precursor de los compuestos 3-amino-3-desoxi-D-ribofuranosa S-fosfato y 3-azido-3-desoxi-D

ribofuranosa 5-fosfato. Estos productos son de interés farmacológico debido a que los 3-amino y

3-azido-3-desoxinucleósidos son conocidos inhibidores de diversas polimerasas e inhibidores de la

síntesis de proteínas.

3.3.3.1- Análisis retrosintético

El primer desafío en la sintesis de los azúcares 3-amino y 3-azido es la incorporación del

grupo nitrogenado con la configuración apropiada en la posición 3 del monosacárido. Uno de los

métodos más empleados para la introducción de los grupos funcionales azido y amino, es la

sustitución nucleofílica de un grupo saliente apropiado con nucleófilos que contengan nitrógeno.

Estas reacciones proceden con inversión de Ia configuración. Por lo que, si la reacción de

desplazamiento se realiza sobre la posición 3 de una xilosa, se pueden obtener los derivados D

ribosídicos(b-c, Figura 3.16).

7140 Capítulo 3 - Sintesis de furanosas 5-fosfato

O HO A00 AcO

O o OOH=> = 5 =>

R OH N3 0+ O\1 0+GS= grupo saliente

il El [:1 El

R: N3. NHz

Figura 3.16. Análisissintético para la obtención de los azucares S-fosfatos modificados en la posición 3

Como es ampliamente conocido, los factores que afectan las reacciones de

desplazamiento nucleofílico son: el solvente de reacción, Ia naturaleza del grupo saliente, el tipo

de nucleófilo y la estructura del sustrato. Estos factores se tuvieron en cuenta a Ia hora de decidir

las condiciones de reacción necesarias para el éxito de la reacción de desplazamiento.

Generalmente, para favorecer las reacciones de sustitución se utilizan solventes polares apróticos,

por lo que se seleccionó el solvente DMFpara dicha reacción. En nuestro caso se requiere obtener

un azido o amino derivado secundario. En general, los grupos salientes comúnmente utilizados

para las reacciones de desplazamiento de grupos secundarios son los tosilatos, mesilatos o

triflatos. Los dos primeros son de similar reactividad y pueden ser obtenidos de forma sencilla y

económica, mediante el tratamiento del alcohol con los correspondientes cloruros de sulfonilo.

Asimismo son de elevada estabilidad y de fácil manipulación. Los triflatos son de mayor

reactividad pero de elevado costo y más difíciles de manipular que los anteriores. Otro grupo

ampliamente utilizado es el imidazoilsulfonato, que comparte las propiedades de los mesilatos y

tosilatos, pero posee una reactividad superior, comparable al grupo saliente triflato.

Se decidió explorar las reacciones de desplazamiento nucleofílico, utilizando azida sódica

como nucleófilo y ensayando dos grupos salientes de creciente reactividad: el p-toluensulfonato y

el imidazoilsulfonato correspondiente. Se ensayaron ambos grupos teniendo en cuenta la

estructura del sustrato. Debido a la configuración del azúcar y a los sustituyentes que contiene el

mismo, el nucleófilo puede experimentar interacciones dipolares y estéricas desfavorables, por lo

que se podrían favorecer los procesos de B-eliminación en lugar de los de sustitución nucleofílica.

'141 Capítulo 3 - Síntesis de furanosas S-fosfato

Un grupo saliente mas reactivo permitiría llevar a cabo las reacciones de sustitución a menores

temperaturas, favoreciéndola sobre las correspondientes de B-eliminación.

Una vez obtenido Ia S-O-acetiI-3-azido-3-desoxi-1,2-O-isopropiliden-a-D-xilofuranosa se

planteó como paso siguiente Ia desprotección de la posición S del azúcar. Ésta puede llevarse a

cabo por hidrólisis selectiva en medio básico. Con la posición 5 libre, es posible sintetizar el

derivado 5-fosfato mediante reacciones de fosforilación química. Una vez obtenido el fosfato se

sugirió como último paso, Ia desprotección de todos los grupos protectores, para así poder

obtener el 3-azido-3-desoxi-D-ribosa 5-fosfato. Para obtener el 3-amino correspondiente, se

planeó Ia posibilidad de reducir el grupo azido al amino correspondiente con hidrógeno molecular

en presencia de un catalizador adecuado.

3.3.3.2- Sintesisdel 3-azido-3-desoxi-1.2C ' ' a 9-." ‘ 5

difenilfosfato l33|

En primer lugar se procedió a la síntesis de los sustratos modificados con el grupo saliente

en Ia posición 3. El primer sustrato sintetizado fue la S-O-acetil-1,2-O-isopropiliden-3-0-(p

toluensulfoniI)-a-D-xiIofuranosa (283, Figura 3.17). Para lo cual, se trató Ia S-O-acetil-1,2-O

isopropiliden-a-D-xiIofuranosa (10, Figura 3.17) con cloruro de p-toluensulfonilo (p-TsCl)en exceso

de Py. Esta reacción procedió con bajos rendimientos, inclusive a tiempos largos de reacción (72

h). Esto pudo deberse principalmente a dos motivos: el primero es la pérdida del tosilato por el

cloruro correspondiente. Se ha reportado en publicaciones previas, que el producto secundario

formado, Py‘HCI,puede actuar en las reacciones de tosilación a su vez como nucleófilo (Cl'),

disminuyendo el rendimiento de la reacción’. Otro motivo pudo ser Ia baja reactividad del alcohol

secundario. Para mejorar el rendimiento de Ia tosilación, se decidió activar el grupo hidroxilo

mediante el empleo de una base fuerte aprótica. La base empleada fue BDDDP.Además se

reemplazó el solvente Py, por THF.Se describen a continuación, las condiciones que brindaron el

mayor rendimiento del derivado tosilado: se disolvió la 5-0-acetil-1,2-0-isopropiliden-a-D

xilofuranosa en THF, y se añadió posteriormente Ia base BDDDP(1 equiv.) y Py (4 equiv.) bajo

atmosfera de nitrógeno. Luego se añadió el p-TsCI. La reacción se siguió por c.c.d.. Una vez

completada la reacción, se neutralizó la base con HCIdil. y se añadió cloruro de metileno. Luego de

7 Yoshida, Y.; Sakakura, Y.; Aso, N.; Okada, S.; Tanabe, Y.; Tetrahedron, 1999, SS, 2183


sucesivas extracciones y de la posterior purificación del producto, por cromatografía en columna

de silicagel, se obtuvo el producto tosilado con un 65 % de rendimiento.

Luegose procedió a sintetizar la 5-0-acetiI-3-O-(1'-imidazoilsulfonil)-1,2-O-isopropiliden-a

D-xilofuranosa (28h, Figura 3.17). En este caso se enfrió a -35 °C, una solución del sustrato 10

(Figura 3.17) en cloruro de metileno y Py. Posteriormente se añadió a la solución enfriada, cloruro

de sulfonilo permitiendo el avance de la reacción por 0.5 h. Luego se llevó la mezcla de reacción a

temperatura ambiente y se agregó 1H-imidazol. La reacción se siguió por c.c.d. Luego se extrajo y

purificó de forma análoga al derivado tosilado, obteniéndose el producto 28h con un 70 % de

rendimiento.

Una vez obtenidos los productos con los grupos salientes respectivos en la posición 3, se

procedió a ensayar la reacción de sustitución nucleofílica utilizando azida sódica como nucleófilo

(15 equiv), en DMFcon ambos sustratos (28a y 28b, Figura 3.17). Lastemperatura de reacción en

el caso del derivado de xilosa conteniendo el grupo saliente tosilato, (28a, Figura 3.17), fue de

120°C.Estas condiciones se seleccionaron en base a publicaciones previas, en las cuales se reportó

esta temperatura como la optima en sustratos similares”. La reacción se siguió por c.c.d (se

observó la desaparición del sustrato, por revelado de las placas con luz UVy con HzSO4en etanol,

en el caso de los diversos productos formados). A las 48 h de reacción se observó

aproximadamente un 50 % de conversión, apareciendo dos manchas de menor Rfen la placa de

c.c.d, con respecto al Rfdel material de partida, que no eran activas al UV.A las 72 h de reacción,

se observó prácticamente Ia desaparición de la mancha del material de partida. En cambio se

observó Ia aparición de tres manchas de menor Rfy una mancha en la línea de base. Se pudieron

aislar, por cromatografía en columna, las dos primeras manchas observadas en la c.c.d,

obteniéndose en la fracción de mayor Rf la 5-0-acetiI-3-azido-3-desoxi-1,2-0-isopropiliden-a-D

ribofuranosa (29, Figura 3.17) con un 8 % de rendimiento y se determino que la correspondiente

mancha de menor Rf,correspondía a la 3-azido-3-desoxi-1,2-0-isopropiliden-u-D-ribofuranosa (30,

Figura 3.17). Latercera mancha no se pudo aislar ni identificar, así como la mancha en la línea de

base debido al bajo rendimiento de Ia reacción, se sugiere que estas fracciones corresponden a

productos de degradación, debido a las altas temperaturas utilizadas para el avance de la reacción.

Asimismo, se realizó un blanco de reacción, en el cual se calentó por 3 dias, el compuesto 283 en

DMF, observándose la aparición de una mancha en Ia linea de base. Los productos fueron

asignados por RMN de 1H y laC. Asimismo, se verificó la asignación del RMN de lH por

° Nayak, u.; Whistler, Y.;J. Org. Chem, 1969, 34, 3319

143 Capitulo 3 - Síntesis de furanosas 5-fosfato

experimentos de homodecouplíng de 1H. En el caso del producto 29, se observó un fuerte

desplazamiento de la señal correspondiente al H-3 (de 4.86 ppm para el sustrato 283 a 3.28 ppm

para el producto 29) y la desaparición de las señales correspondientes al grupo tosilo (7.82 y 7.39

ppm). Las demás señales experimentaron pequeñas variaciones en sus desplazamientos. Los

espectros de RMNde 1Hy de 13Cdel producto 30, fueron marcadamente similares a los obtenidos

para el producto 29, observándose como única diferencia la desaparición en el RMN de 1H del

singulete a desplazamientos alrededor de 2 ppm, correspondiente al metilo del grupo acetilo.

Asimismo desparecieron en el RMN de 13Clas señales a 170 ppm y alrededor de 20 ppm,

correspondientes al C=0 y al metilo del grupo acetilo, respectivamente.

AcO

oH 1o

o

0%AcO

os

o

28aoso-pr/ o\)\ O-lmszabN34

15 equiv.A50

AcO 0

29 \ 310

HO AcO

30 29

Figura 3.17. Sintesis dela 5-O-acetil-3-azido-3-desoxi-1,2-0-isopropi|iden-a-D-ribofuranosa


Lascondiciones de reacción óptimas para la reacción de sustitución del derivado de xilosa

28h (Figura 3.17), conteniendo el mejor grupo saliente, imidazoilsulfonato, fueron similares a las

usadas para el caso del sustrato tosilado, pero pudiendo realizar la reacción a una temperatura

menor. En este caso la temperatura óptima fue de 70°C. A tiempos intermedios de reacción (24

48h, a porcentajes de conversión menor al 100 %), se observó Ia aparición de dos manchas de

menor Rf que el material de partida, una de las cuales coincidía con el producto 29 (Figura 3.17),

obtenido anteriormente. A 72 horas de reacción, se observó la completa desaparición de la

mancha correspondiente al material de partida, observándose en este caso, tres manchas de

menor Rf, que pudieron ser aisladas por cromatografía en columna de sílica gel y asignadas

espectroscópicamente Estos productos en orden decreciente de Rffueron: la S-O-acetil-S-desoxi

1,2-0-isopropiI¡den-a-D-eritro-pent-3-enofuranosa (33 % de rendimiento, 31, Figura 3.17), la 5-0

acetiI-3-azido-3-desoxi-1,2-O-isopropiliden-a-D-ribofuranosa (43 % de rendimiento, 29, Figura

3.17) y finalmente la 5-O-aceti|-1,2-O-isopropiliden-o-D-ribofuranosa (9 % de rendimiento, 32,

Figura 3.17). El primer y tercer producto citado, son el producto de la reacción de B-eliminación

(33, Figura 3.17) del grupo saliente, y el producto de hidrólisis (32, Figura 3.17). A mayores

tiempos de reacción, se observó Ia disminución del producto 29, y el aumento del 31 y 32, por lo

que se tomó 72 h. como tiempo de reacción óptimo. Más allá de la azida obtenida, el producto de

eliminación también puede ser un precursor interesante en la obtención de otros nucleósidos

modificados.

Como se mencionó anteriormente, una vez obtenido el derivado S-O-acetil-3-azido-3

desoxi-1,2-O-isopropiIiden-a-D-ribofuranosa (29, Figura 3.18) se procedió a la hidrólisis del grupo

acetilo en la posición S, utilizando K1CO3en metanol, obteniéndose el producto 3-azido-3-desoxi

1,2-0-isopropiIiden-a-D-ribofuranosa (30, Figura 3.18) con un 90 % de rendimiento, luego de la

purificación del mismo por cromatografía en columna de sílica gel. Los espectros de RMN

coinciden con los obtenidos anteriormente, para el producto secundario en la reacción de

sustitución con azida sódica del derivado tosilado (30). En este caso, se observó en el espectro de

RMNde lH, un desplazamiento de la señal correspondiente a los Hs-S (los dos dobletes a 4.32 y

4.01 ppm para el sustrato 29 se desplazaron a 3.91 y 3.65 ppm para el producto 30) y la

desaparición de las señales correspondientes al grupo acetilo (el singulete a 2.02 ppm en el

espectro de RMNde lH y las señales a 170.51 y 20.71 ppm, en el espectro de RMNde X3C).

Con el hidroxilo de la posición 5 libre, se procedió a fosforilar esta posición utilizando el

reactivo fosforilante, difenilclorofosfato, para Io cual se disolvió el sustrato (30, Figura 3.18) en


una solución de TEAen diclorometano, añadiendo luego el reactivo fosforílante. La reacción se

siguió por c.c.d., hasta desaparición del material de partida. La mezcla de reacción se extrajo y

purificó por cromatografía en columna de sílica gel, obteniéndose el 3-azido-3-desoxi-1,2-O

isopropiliden-a-D-ribofuranosa 5-difenilfosfato con un 68 % de rendimiento (33, Figura 3.18).

Resta concluir con las desprotecciones correspondientes de los grupos protectores

remanentes en Ia molécula, para así obtener los dos fosfatos anteriormente citados. Estas

reacciones no se llevaron a cabo por falta de tiempo, y asimismo porque no son sustratos

objetivos en esta tesis. Se sugieren, a continuación, posibles pasos a seguir, para la obtención de

los derivados 3-amino y 3 azido-3-desoxi-D-ribofuranosa S-fosfato.

En el caso de la obtención del derivado del 3-amino, se sugiere como posible primer paso

la desprotección del grupo protector en el grupo fosfato, la cual podría realizarse paralelamente a

la reducción del grupo azido al correspondiente grupo amino, por medio de reacciones de

hidrogenación catalíticas.

/PH0/\H0 o

N3 OH

OIlo/P\

AcO H0 0/ o0° cho; ° lI Ü °MeOH (Ph0)2PCl

O 0 O

N3 0% NJ 0% Eth N3 0%29 30 ¡wz/m 33

ii) H0 1

g ÍHo7\Ho °

oOH

NHz OH

Figura 3.18. Síntesis del difenil (3-azido-3-desoxi-1,2-0-isopropiliden-a-D-xilofuranosa) fosfato

146 Capitulo 3 - Sintesis de furanosas S-fosfato

Por último se sugiere la hidrólisis ácida del grupo isopropiliden. Esta reacción podria

llevarse a cabo con ácidos fuertes, en fase homogénea, así como en fase heterogénea, mediante el

uso de resinas de intercambio catiónico.

Enel caso de la obtención del derivado 3-azido, se plantea la reacción de desprotección de

los grupos fenilos, por métodos no reductivos (ej. NaOH/THF’, Bu.N‘F‘/THF/Py./H¡O’°, etc.). Una

vez desprotegido el grupo fosfato, restaría hidrolizar en medio ácido fuerte, el grupo isopropiliden,

como se citó con anterioridad, para así obtener el 3-azido-3-desoxi-D-ribofuranosa 5-fosfato.

3.3.4- Síntesis de furanosas S-fosfato

El esquema de la síntesis de las D-furanosas 5-fosfato, sustratos de la PPM, a partir del

azúcar libre, se detalla en la figura 3.1. Lascaracterísticas que se buscaron en el proceso sintético

planteado fueron: la versatilidad del mismo, es decir que fuera un esquema general aplicable a la

sintesis de diversas furanosas 5-fosfato, con el objeto que no dependiera de la estructura de Ia

pentosa, la escalabilidad y su viabilidad económica. Se estudió la sintesis de la D-ribosa S-fosfato

como modelo para la síntesis de diversas furanosas S-fosfato.

3.3.4.1- ¿intgsis dg D-ribgsa fi-fosfago

El esquema de la sintesis de la D-ribosa 5-fosfato, se detalla en la Figura 3.19. Los dos

primeros pasos del esquema sintético de la D-ribosa S-fosfato se describieron en las primeras

secciones de este capitulo. Estos incluyen la protección de carbono anomérico mediante

reacciones de glicosidación de Fischer, partiendo de la ribosa desprotegida. Con el objeto de

facilitar las asignaciones espectroscópicas de los productos subsiguientes, se decidió concluir la

reacción de glicosidación a tiempos cortos, aislando únicamente el anómero metilado con la

configuración B del carbono anomérico. Luego se procedió a proteger los demás hidroxilos del

azúcar por medio de una reacción de acetilacion química, obteniéndose el metil 2,3,5-tri-0-acetil

B-D-ribofuranósido (lb, Figura 3.19) con un 60 % de rendimiento calculado a partir de la D-ribosa

libre. Este producto se sometió a hidrólisis enzimática, utilizando la CRLcomo biocatalizador

obteniéndose de esta forma el azúcar con la posición 5 libre: metil 2,3-di-O-acetil-B-D

ribofuranósido (10h, Figura 3.19) con un 75 % de rendimiento.

9Nanteuil, G.; Benoist, A.; Rémond, 6.; Descombes, J.; Barou, V.;Verbeuren, T.; Tetrahedron Letters, 1995, 36, 1435

Ogilvie, K.; Beaucage, S.; Nucleic Acids Res; 1979, 7, 805


1b 10h

HO H0

AGO o OMe 0 OMeOH ¡lMGOH- Ho CRL

ii)AC20. Py DMF : PBS

0“ 0“ OAc OAc OAc OAc

1. OPCI,

E2. (Ph0)2P(0)Cl fizP3. (Bn0)¡PN(Ipr)¡I TBHP Hao/ \O

OOH

OH OH

34

Figura 3.19. Estrategia sintética propuesta para la obtención de D-ribosa S-fosfato.

Una vez obtenido el derivado D-ribosidico en la forma furanósica con el hidroxilo en la

posición S libre, se procedió a evaluar la estrategia de fosforilación química más adecuada. En

particular, las características de la reacción de fosforilación buscadas fueron: Ia simplicidad de Ia

reacción tanto para la obtención del derivado fosforilado como su posterior purificación (se

precisan para las reacciones posteriores de síntesis enzimática de nucleósidos, la obtención de

furanósidos 5-fosfato de elevada pureza, en primer medida con el objeto de obtener valores

precisos de cinética y rendimiento, y en segundo lugar debido a que pequeñas trazas de otros

fosfatos podrían inhibir dichas reacciones enzimáticas), elevados rendimientos de reacción, y de

bajos costos para Ia obtención de dichos sustratos.

La síntesis quimica de un fosfato monoéster puede realizarse a partir de un alcohol para

así brindar el fosfato directamente. Una de las formas de fosforilación directa más comúnmente

utilizadas, es mediante el uso de cloruro de fosforilo (POCI3).La reacción de un alcohol con dicho

reactivo, produce el fosfato tanto en su forma aniónica o como el correspondiente acido libre, y en

general se precisa del empleo de cromatografía de intercambio iónico para su purificación si el

fosfato es requerido con elevada pureza. Otra alternativa, puede ser la introducción en primera

instancia de un fosfato protegido en su forma de triéster mixto. Esta última aproximación conlleva

la ventaja de evitar en algunos casos, reacciones secundarias indeseadas, asi como la de proveer

un compuesto más sencillo de manipular y purificar. Los triésteres de fosfato son en general

neutros y pueden ser purificados por cromatografía en columna de sílicagel.


Laestrategia que hace uso de tríésteres mixtos es generalmente llevada a cabo utilizando

dos tipos de reactivos fosforilantes. El primer tipo contiene especies activadas de P(V), por

ejemplo (RO)2P(0)CI.Elsegundo tipo de reactivo contiene especies de P(ll|), que una vez acopladas

al alcohol, pueden ser oxidadas para así dar el fosfato deseado. En general los reactivos

fostriIantes derivados de P(I|l) son más reactivos pero tienen la desventaja de ser de elevado

costo. Por este motivo se decidieron explorar diversas estrategias de fosforilación, para evaluar

cuál era la indicada para la síntesis de cada una de las furanosas S-fosfato.

En primer lugar, se ensayaron reacciones de fosforilación, utilizando reactivos fosforilantes

del tipo P(V):Se estudiaron en este caso, dos posibles rutas sintéticas. La primera consistió en Ia

fosforilación directa del alcohol primario utilizando el reactivo fosforilante POCI; (reactivo

1.,Figura 3.19). La segunda fue la formación inicial de un fosfato triéster mixto, utilizando el

reactivo fosforilante difenilcloro fosfato ((PhO)¡P(O)Cl)(reactivo 2.,Flgura 3.19), que luego fue

desprotegido. Por último se estudió la reacción de fosforilación utilizando especies de P (III), la

dibencil N,N-diisopropil fosforamidita (reactivo 3., Figura 3.19).

La primera reacción de fosforilación estudiada fue la del, metil 2,3-di-O-acetil-B-D

ribofuranósido (10h, Figura 3.20), utilizando POCI;en Py, siguiendo la metodología descripta para

la fosforilación de metil 2,3-isopropiIiden-D-ribofuranósido“. Una vez concluida esta reacción, el

siguiente paso reportado fue el agregado de agua a la mezcla de reacción, con el objeto de

hidrolizar los enlaces P-CI. La hidrólisis del enlace P-CItiene como consecuencia la liberación de

HCI,y este medio ácido es el responsable de la hidrólisis del grupo protector acetilo tanto como

del grupo metilo del sustrato, obteniéndose finalmente la D-ribosa 5-fosfato totalmente

desprotegida.

n Levene, P.; Stiller, E.;Journal of Biological Chemistry, 1934, 104, 299


O

1o:: g 34Ho N307 \O

o OMe ¡lOPC'a.PY “3° oii) HZO (80 °C) OH

iii) Ba‘z

OAC CAC iv) intercambio iónioo (H‘aNa‘) OH OH

0

g

K/ CI/ o0

OMe

OAc ON:

Figura 3.20. Fosforilación quimica utilizando POCI;como reactivo fosforilante

Previo al estudio de la reacción de fosforilación con el metil 2,3-di-O-acetil-B-D

ribofuranósido (10h, Figura 3.20), se realizó un ensayo de las condiciones de reacción de hidrólisis

ácida de los grupos protectores acetilo y metilo del mismo. Para esto, se reprodujeron las

condiciones ácidas que se obtendrían por la liberación de HCIa partir de la hidrólisis del enlace P

Cldel oxicloruro de fósforo. Esto se logró añadiendo agua a la mezcla de reacción, que consistía en

el reactivo fosforilante POCI3disuelto en ACN/Py a 0°C, previo al agregado del sustrato 10h. De

esta forma el oxicloruro de fosforo es hidrolizado liberando HCl. Una vez hidrolizado el reactivo

fosforilante, se añadió el sustrato acetilado y se aumento la temperatura a 80 °C. La reacción de

hidrólisis se siguió por c.c.d., extrayendo fracciones a diversos tiempos. A medida que avanzó el

tiempo de reacción, se produjo una disminución en la intensidad de la mancha correspondiente al

sustrato ribofuranósido protegido y se incrementó la intensidad de la correspondiente a la ribosa.

A dos horas de reacción se observó la hidrólisis completa de los grupos protectores acetilo y

metilo, observándose una única mancha con el mismo Rfque la ribosa.

Habiendo confirmado que el medio ácido generado desprotegía las posiciones 1, 2 y 3, se

llevó adelante la reacción de fosforilación directa sobre el sustrato 10h (Figura 3.20). Para ello se

disolvió el oxicloruro de fósforo en ACN y se enfrió la solución a 0 °C. Luego se añadió Py a la

solución enfriada y finalmente una solución del sustrato acetilado 10h en ACN.Luego de dos h de

reacción, se añadió agua a la mezcla de reacción y se aumentó la temperatura de reacción a 80 °C,

continuándose el calentamiento por dos h. Una vez concluida Ia hidrólisis total de los grupos

protectores, se enfrió la solución y el pH se ajustó a cinco con NaOH y se añadió una solución


sobresaturada de BaClz.A pH = 5 precipitaron el fosfato de bario inorgánico producidos por la

hidrólisis del reactivo fosforilante remanente y permaneció en solución el fosfato orgánico. Se

centrifugó dicha solución, separándose el precipitado del sobrenadante. Se enfrió nuevamente el

sobrenadante y el pH se ajustó a 7.5. Finalmente se agregó EtOHa esta solución, promoviendo la

precipitación de la sal de bario de la D-ribosa S-fosfato. Debido a que Ia sal de bario es

parcialmente soluble en solución acuosa neutra, y que se desconoce el efecto del catión bario

sobre Ia actividad de la PPM, del cual dicho fosfato será sustrato, se decidió generar la sal sódica

de la D-ribosa-S fosfato (34, Figura 3.20) por medio de cromatografía de intercambio catiónico,

utilizando la resina Dowex X2-200 equilibrada con medio ácido. Se recolectaron las fracciones

ácidas y éstas, fueron neutralizadas con NaOH. Por último, la solución acuosa de la sal sódica de la

D-ribosa S-fosfato (34, Figura 3.20) fue Iiofilizada, obteniéndose un cristal de color blanquecino

con un 63 % de rendimiento. Este producto fue caracterizado por RMNde ‘H, 13Cy31P.

Con el objeto de aumentar el rendimiento del fosfato y también facilitar el proceso de

purificación, se ensayó la reacción de fosforilación utilizando difenilclorofosfato como reactivo

fosforilante. El metil 2,3-di-O-acetiI-B-D-ribofuranósido (10h, Figura 3.21) reaccionó rápidamente

con el difenilcloro fosfato y DMAPpara dar de esta forma el fosfato triéster, metil 2,3-di-0-acetil

B-D-ribofuranosa 5-difenilfosfato (35, Figura 3.21). Este compuesto fue estable y pudo ser

purificado por cromatografía en columna de sílica gel, obteniéndose un rendimiento del 70 %. Se

caracterizó por RMN de lH, 13Cy 3“P, observando en el espectro de RMN de 13C,dos dobletes

correspondientes a las señales del C-5 y C-4 con acoplamientos característicos C-P (los, = 5,9 Hzy

J“, = 8.2 Hz),verificando la formación del fosfato así como su posición. Asimismo se observó una

única señal en el espectro de 31Pa -12.22 ppm, correspondiente aI fósforo en el fosfato triester.

Una vez obtenido el metil 2,3-di-O-acetiI-B-D-ribofuranosa S-difenilfosfato puro (35, Figura

3.21), se procedió a la desprotección de los grupos fenilos del triéster de fosfato, por

hidrogenólisis (55 psi) sobre óxido de platino como catalizador. Lareacción se siguió por c.c.d. A48

h de reacción se observó la desaparición del material de partida activo al UV, sin embargo, se

observó la aparición dos manchas de menor Rf, una de las mismas activa al UV.EIcatalizador fue

removido y Ia mezcla de reacción neutralizada con TEA, y evaporada a presión reducida. Los

espectros de RMNdel producto de hidrogenólisis tanto de 13Ccomo de 1H,mostraron que dicho

producto consistía en una mezcla de dos compuestos, uno de los cuales fue identificado como el

producto de la desprotección total del grupo fosfato, el metil 2,3-di-O-acetil-B-D-ribofuranósil 5

00.0.0000....0.000000ÓOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0...

151 Capítulo 3 - Sintesis de furanosas S-fosfato

fosfato (36, Figura 3.21) y el segundo como el producto de la desprotección parcial del mismo, el

metil 2,3-di-O-acetil-B-D-ribofuranosa 5-fenilfosfato (37, Figura 3.21), en una relación 1: 0.6.

o

II;10b / 35H0 0M 00/ \0 OMe

o e fi o(PhO)2PCl

OAc OAc E'J" OAc OAc

i) H2 (55psi) / Pto2ii) H'

o o

¿a ll07\ 37 \ 36-o o ‘o o

o oOH + OH

OH OH OH OH

Figura 3.21. Fosforilación química utilizando difenil clorofosfato como reactivo fosforilante

Debido a las condiciones drásticas necesarias para la desprotección del grupo fosfato

(elevadas presiones de H2y el uso de un catalizador de elevado costo) y los tiempo largos de

reacción necesarios para la remoción total de ambos grupos fenilos (tiempos mayores a 48 horas),

se decidió modificar el grupo protector del fosfato por un grupo ma's sencillo de remover. Por Io

que se ensayó, la reacción de fosforilación de metil 2,3-di-O-acetil-B-D-ribofuranósido, utilizando

como reactivo fosforilante Ia dibencil N,N-diisopropilfosforamidita, mediante la aproximación

denominada método de las fosforamiditas. El mecanismo aceptado para dicha fosforilación es la

formación de un intermediario tetrazolilfosforamidita, que se produce por la reacción de una

fosforamidita con el acido débil, 1H-tetrazol. Luego se produce un ataque nucleofílico del hidroxilo

del azúcar al intermediario citado, produciendo el fosfito tríéster. La subsiguiente oxidación del

fosfito triéster, produce el correspondiente fosfato de interés.

Eltratamiento del 10h (Figura 3.22) con 1.1 equiv. del reactivo fosfitilante y 1H-tetrazol en

THF anhidro enfriados a -40 °C, produjo el intermediario fosfito, metil 2,3-di-0-acetiI-B-D

ribofuranosa S-dibencilfosfito. La reacción se siguió por c.c.d hasta desaparición del material de

partida. Luego se añadió el agente oxidante TBHP,al crudo de reacción y se llevó a temperatura

152 x Capítulo 3 —Síntesis de furanosas 5-fosfato

ambiente. Una vez concluida la oxidación del fósforo, se extrajo y purificó el metil 2,3-di-O-acetil

B-D-ribofuranosa 5-dibencilfosfato (38, Figura 3.22) por cromatografía en columna de silica gel,

obteniéndose un rendimiento del 64 %. Este producto fue caracterizado por RMNde 1H,13Cy“P,

observando en el espectro de RMNde “C dos dobletes correspondientes a las señales del C-Sy C

4 con acoplamientos característicos C-P (15., = 5,5 Hzy JC“ = 7.5 Hz), verificando la formación del

fosfato así como su posición. Asimismo se observó una única señal en el espectro de alP a -2.12

ppm, correspondiente al fósforo en el fosfato triéster.

10h o 33||Y O/P\

H0 Me ¡MON/N 0/ o 0Mo o | W- o °OBn

OAc OAc "Mmm OAc OAcTBHP

i) H2 (1 aim.) / Pd(0H)2ii) H'

o 0g llN307\ '07\

NaO o o '0 o oOH OH

iii) Ba’zo” 0“ iv)interan‘bio iónioo(H‘a Na‘) o“ o”

34

Figura 3.22. Fosforilación química utilizando la dibencil fosforamidita como reactivo fosforilante

Una vez obtenido el metil 2,3-di-O-acetiI-B-D-ribofuranosa S-dibencilfosfato puro (38,

Figura 3.22), se procedió a Ia desprotección de los grupos bencilos del triéster fosfato, por

hidrogenólisis a presión atmosférica sobre hidróxido de paladio/C como catalizador. Lareacción se

siguió por c.c.d. A 16 h de reacción se observó la desaparición de todas las manchas activas al U.V.

La mezcla de reacción se filtró, se le añadió HCI,y colocó en un baño a 80°C por dos horas, con el

objeto de hidrolizar los grupos protectores acetilo y metilo del sustrato. Lasolución conteniendo la

D-ribosa S-fosfato fue neutralizada y precipitada como sal de bario, mediante el agregado de una

solución saturada de BaClzyetanol. Se generó la sal disódica de forma análoga a la obtenida por el

método de fosforilación directa, mediante el uso de una resina catiónica, obteniéndose Ia sal

DOGC...0.0.0.0...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCO00.000....

0.0.0..0....0....OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOC0.0.0.0...l

153 Capitulo 3 - Sintesis de furanosas 5-fosfato

sódica de Ia D-ribosa 5-fosfato (34, Figura 3.22), con un rendimiento del 50 % calculado a partir del

sustrato 10h .

Comparando los tres métodos estudiados se puede concluir que para Ia obtención de la D

ribosa S-fosfato Ia estrategia más sencilla, económica y que ofrece mejor rendimiento es Ia

fosforilación directa con POCI3,obteniéndose el azúcar fosfato con elevada pureza.

3.3.4.2- Síntesis de D-arabinosa 5-fosfato.

Luego, se procedió a la síntesis D-arabinosa 5-fosfato siguiendo la estrategia sintética

determinada para Ia obtención de D-ribosa 5-fosfato, utilizando como reactivo fosforilante el

POCI3.

Losdos primeros pasos del esquema sintético de la D-arabinosa 5-fosfato, se describieron

previamente. Estos incluyen la protección de carbono anomérico mediante reacciones de

glicosidación de Fischer, partiendo de la arabinosa desprotegida. Luego se procedió a proteger los

demás hidroxilos del azúcar por medio de reacciones de acetilación quimica, obteniéndose la

mezcla anomérica del metil 2,3,5-tri-O-acetiI-a,B-D-arabinófuranosido (2, Figura 3.23) con un 53 %

de rendimiento. Este producto se sometió a hidrólisis enzimática, utilizando la CRL,obteniéndose

el azúcar con la posición 5 libre (metil 2,3-di-O-acetiI-a,B-D-arabinofuranósido, 11, Figura 3.23)

con un 70 % de rendimiento.

Luego se realizó la reacción de fosforilación directa con POCI3sobre el sustrato 11 (Figura

3.23), de forma análoga a la realizada para la fosforilación del sustrato 10b. La reacción se siguió

por c.c.d, mostrando un avance similar al obtenido para el análogo ribosídico. Sin embargo, fue

imposible separar el fosfato inorgánico del orgánico siguiendo el esquema de precipitación con

sales de bario llevado a cabo en el caso de la sintesis de la D-ribosa-S-fofato. En este caso, a pH =

5, se observó la formación de un precipitado gelatinoso, que debió ser centrifugado. Se realizó una

c.c.d a dicha fracción de precipitación, observándose Ia presencia de cantidades apreciables del

fosfato orgánico. Luego del ajuste del pH de la solución a 7.5 y del posterior agregado de etanol, se

obtuvieron pequeñas cantidades de la D-arabinosa 5-fosfato, obteniéndose un rendimiento

marcadamente inferior al observado para la obtención de D-ribosa S-fosfato.

Debido a que se requiere el azúcar fosfato de elevada pureza para las posteriores

reacciones enzimáticas ya que, como se discutió anteriormente, el fosfato inorgánico es inhibidor

de la PPM, se decidió explorar Ia segunda estrategia de fosforilación exitosa para la obtención del

1547 Capítqu 3 —Síntesis de furanosas S-fosfato

análogo ribosídico, la cual implicaba el uso de la díbencil N,N-diisopropilfosforamidita como

reactivo fosforilante. Para esto, se trató el metil 2,3-di-0-acetiI-u,B-D-arabinofuranósido (11,

Figura 3.23) de forma análoga al sustrato 10h, obteniéndose, luego de la purificación del producto

por cromatografía en columna de sílica gel, el metil 2,3-di-0-acetil- a,B-D-arabinofuranosa 5

dibencilfosfato (39, Figura 3.23) con un rendimiento del 79%. Elproducto se caracterizó por RMN

de lH, 13Cy alP, observándose las constantes de acoplamiento típicas (ZJWyElJH.)en el espectro de

13C,de las señales correspondientes a los C-Sy C-4, respectivamente. Asimismo se observó en el

espectro de 31P,dos señales, correspondientes al fósforo de ambos fosfatos anoméricos.

11

HO Aco H0

O . o 0OH .) MeOH. H. CRL M

ii)ACZO.Py °M°DMF : PBS o e

i) Opcg, Pyii) HZO (ao °Cliii) Ba'2

O

|I:I‘O7\o 0

0OH

OMe 39

0A; OH

i) Hz (1 aun.) I Pd(0H)24,

H

o iii)Ba" Baa(P04)2|| iv) intercambio iónioo

NaO

OH

Figura 3.23. Síntesis de D-arabinosa S-fosfato

Una vez obtenido el metil 2,3-di-O-acetiI-a,B-D-arabinofuranosa 5- dibencilfosfato puro

(39, Figura 3.23), se procedió a Ia desprotección de los grupos bencilos del fosfato triéster por

hidrogenólisis, como se citó previamente en el caso del análogo ribosídico. Luego de Ia


desprotección total del azúcar por medio de hidrólisis ácida, la D-arabinosa S-fosfato fue

precipitada como sal de barrio, aislada por centrifugación y transformada en la sal sódica

correspondiente por cromatografía de intercambio iónico, como se describió anteriormente. De

esta manera se obtuvo la sal sódica de la D-arabinosa 5-fosfato (40, Figura 3.23) de forma pura,

con un rendimiento del 68 %. Nuevamente fue caracterizado el producto por RMN de 1H,13Cy 31P.

Se observaron en el espectro de RMNde 13C,cuatro dobletes correspondientes a las señales del C

5 y C-4 con acoplamientos característicos C-P (dos dobletes con ¡ch = 3.6 Hzy dos dobletes con

31cm= 7.2 Hz, (ambos anómeros). Asimismo se observó una única señal en el espectro de 31Pa

3.10 ppm, correspondiente al fósforo del grupo fosfato. Por último, se observó la desaparición de

las señales correspondientes a los grupos protectores, tanto del azúcar como del grupo fosfato, en

todos los espectros de RMNanalizados, confirmando, de esta forma, la identidad del producto

obtenido.

3.3.4.3- Síntesis de 2-desoxi-D-ribosa 5403939.

En el caso de la síntesis de la D-desoxirribosa 5-fosfato se debió modificar el esquema

sintético previamente descripto para la síntesis de sus análogos D-ribósidos y D-arabinósidos,

debido a la imposibilidad de obtener, mediante las reacciones de glicosidación de Fischer, el

producto glicosidado únicamente en la forma furanósica. Encambio, se obtuvieron mediante estas

reacciones, una mezcla de productos metilados, tanto en Ia forma furanósica como piranósica,

imposibles de separar por cromatografía en columna de sílica gel. Se procedió luego a la

acetilación química de esta mezcla de confórmeros glicosidados, con el objeto de estudiar la

posible separación de las formas furanósicas peracetiladas de las piranósicas peracetiladas.

Nuevamente, no se pudieron aislar eficientemente ambos isómeros peracetilados por métodos de

cromatografía en columna de silicagel, obteniéndose sólo un pequeña fracción del producto metil

3,5-di-O-acetiI-D-a-desoxirribofuranosido puro, con un rendimiento del 18 %, calculado a partir del

azúcar libre.

Se decidió ensayar condiciones de reacción que favorecieran la ciclación del anillo en la

forma furanósica. Con respecto a esto, se describió en el año 1995 por Wengel y colaboradores12

la síntesis "one pot" asistida por enzimas del derivado triacilado de la 2-desoxi-D-ribofuranosa a

partir de Ia 2-desoxi-D-ribosa. En este estudio, se realizó la acilación regioselectiva catalizada pOr

1’Prasad, A.; Sorensen, M.; Paramar, V.; Wengel, 1.; Tetrahedron Ietters, 1995, 36, 6163

156 Capítqu 3 - Sintesis de furanosas S-fosfato

la CAL-Bde la 2-desoxi-D-ribosa, mediante el uso de anhídrido propiónico, obteniendo el derivado

5-0-monopropionilado. Con el agregado posterior de anhídrido acético y Py a la mezcla de

reacción, se obtuvo la correspondiente pentofuranosa per-O-acilada en cantidades cuantitivas a

partir del carbohidrato desprotegido.

En base a estos estudios previos, se decidió realizar la acetilación regioselectiva catalizada

por la CAL-Bde la 2-desoxi-D-ribosa mediante el empleo de anhídrido acético, con el objeto de

obtener la 5-0-acetil-2-desoxi-D-ribofuranosa, para luego proceder a la peracetiiación química del

resto de los hidroxilos del azúcar. Una vez obtenida la 1,3,5-tri-O-aceti|-2-desoxi-D-ribofuranosa,

se proyectó el posterior estudio de desacetilación enzimática, con el objeto de obtener el derivado

con el hidroxilo dela posición 5 libre.

Se utilizó CAL-Bpara la acetilación selectiva del hidroxilo primario de la 2-desoxi-D-ribosa

con anhídrido acético en THFanhidro. Luego se filtró el biocatalizador, y se añadió a la mezcla de

reacción anhídrido acético en py, obteniéndose la 1,3,5-tri-0-acetiI-2-desoxi-D-ribofuranosa (41,

Figura 3.24) con un rendimiento casi cuantitativo. La completa conversión enzimática de la

pentosa desprotegida en su intermediario monoacetilado, así como la conversión al producto final

triacetilado, fue monitoreada por c.c.d y sus estructuras confirmadas por sus espectros de RMN.

Se obtuvo el producto triacetilado, como su mezcla anomérica, en una relación a : B de 1 :1. Los

espectros de 13C-RMNdel 1,3,5-tri-0-acetil-2-desoxi-D-ribofuranosa, muestran dos señales

correspondientes a ambos carbonos anoméricos en la mezcla, y todas las señales a

desplazamientos típicos correspondientes al esqueleto furanósico. Se observó asimismo, en la

región de 170 ppm y 20 ppm, la presencia de 6 señales respectivamente, confirmando la presencia

de los tres grupos acetilos en la molécula. Por último se observó en el espectro de ¡H-RMN,dos

señales a desplazamientos de 6.40 y 6.38 ppm, correspondientes a los Hs-1.

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓCOOOOÓOOOO‘


41 42

H0 AcO HO

_ o oI) CALBIAC-¿O

o“ ii)Py./A020 o“ ElOH/CALB AOC

OH OAc OAc

BnO N

NÏ/ ‘]_ 1H-tetrazolOBn TBHP

o oII A!

Nao/¡P\0 0 / \oa0

i) H2(1 aim.) l Pd(0H)le 0OH ii) H' 24:

¡¡¡)I3a‘zOH iv) intercambio iónico (H' a Na') CAC

44 43

Figura 3.24. Síntesis de la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato

Una vez obtenido el derivado triacetilado de Ia 2-desoxi-D-ribosa, se procedió a estudiar la

reacción de hidrólisis enzimática. Como ha sido reportado previamente”, la acohólisis enzimática

catalizada por la enzima CAL-Bde metil ribósidos peracetilados, procede regioselectivamente,

obteniéndose principalmente los derivados desprotegidos en Ia posición 5. Por esto, se decidió

experimentar la regioselectividad de Ia reacción de alcohólisis enzimática, en las condiciones

descriptas por los autores, sobre el sustrato sintetizado, 1,3,S-tri-O-acetil-2-desoxi-D-ribofuranosa

(41, Figura 3.24). Se disolvió este sustrato (S) en etanol (E) en una relación E : S = 120 y se añadió

el biocatalizador. La reacción de desprotección se siguió por c.c.d. no pudiendo concluirse a

conversiones cuantitativas, debido a Ia aparición de productos de didesacetilación. La mezcla de

reacción fue purificada por cromatografía en columna de sílicagel, obteniéndose la 1,3-di-0-acetil

2-desoxi-D-ribofuranosa (42, Figura 3.24) con un 91 % de rendimiento y una relación anomérica a

: [3 de 0.9 1. EI material de partida sin reaccionar se identificó por medio de RMN,

determinándose que consistía únicamente en el anómero u sin reaccionar, mostrando estos

resultados, que ante Ia alcohólisis enzimática el anómero B es hidrolizado con mayor velocidad

que el anómero a, aunque ambos isómeros comparten Ia regioselectividad, siendo

enzimáticamente hidrolizados en la posición S. La regioselectividad de Ia reacción de alcohólisis

enzimática fue determinada por el análisis del producto de reacción por RMN de lH y 13C.El

13Iñigo, S.; Taverna Porro, M.; Monserrat, 1.; Iglesias, L; Iribarren, A., J. mol. Cat. B, 2005, 35, 70

158 Capítulo 3 —Síntesis de furanosas S-fosfato

análisis por RMN de‘H de los productos desacetilados de ambos anómeros, mostró un fuerte

desplazamiento a campos altos de las señales correspondientes a los Hs-S, (de señales a

desplazamientos entre 4.15 y 4.32 ppm correspondientes a los H-S en el sustrato 41, a señales

entre 3.70 y 3.82 ppm en el producto 42), mientras que las demás señales no se vieron afectadas

en gran medida. Asimismo se verificó el grado de desacetilación, observándose en ambos RMN,la

presencia de 4 grupos acetilos.

EIpaso siguiente fue la reacción de fosforilación del hidroxilo primario. Se decidió utilizar

el reactivo fosforilante dibencil N,N-diisopropilfosforamidita, debido a los resultados positivos

obtenidos previamente para la fosforilación del derivado D-arabinósido. Por Io que se trató Ia 1,3

di-O-acetiI-2-desoxi-D-ribofuranosa (42, Figura 3.24) de forma análoga al sustrato 10b,

obteniéndose, luego de la purificación del producto por cromatografía en columna de sílica gel, el

1,3-di-O-acetiI-2-desoxi-D-ribofuranosa 5- dibencilfosfato (43, Figura 3.24) con un rendimiento del

76%. EI producto se caracterizó por RMN de 1H, 13Cy “P, observándose las constantes de

acoplamiento típicas (21€.py 3JW.)en el espectro de 13C,de las señales correspondientes a los C-5 y

C-4, respectivamente. Asimismo se observó en el espectro de 31P,dos señales a -1.18 y -0.96 ppm,

correspondientes al fósforo de ambos fosfatos anoméricos.

Una vez obtenido el 1,3-di-O-acetiI-2-desoxi-D-ribofuranosa 5- dibencilfosfato puro (43,

Figura 3.24), se procedió a la desprotección de los grupos bencilos del fosfato triéster por

hidrogenólisis, como se citó previamente en el caso del análogo ribósido. Luego de la

desprotección total del azúcar fosfato por medio de hidrólisis ácida, la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato

fue precipitada como sal de bario, aislada por centrifugación y transformada en la sal sódica

correspondiente por cromatografía de intercambio iónico, como se describió anteriormente. De

esta manera se obtuvo la sal sódica de la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato (44, Figura 3.24) de forma

pura, con un rendimiento del 72 %. Nuevamente fue caracterizado el producto por RMNde 1H,13C

y 31P,observándose dos señales en el espectro de EuPa 2.02 y 3.59 ppm, correspondiente al

fósforo de los grupos fosfato de ambos anómeros. Por último, se observó Ia desaparición de las

señales correspondientes a los grupos protectores, tanto del azúcar como del grupo fosfato, en

todos los espectros de RMN analizados, confirmando de esta forma la identidad del producto

obtenido.

159 Capitulo 3 —Síntesis de furanosas 5-fosfato

3.3.5- Conclusiones

Se lograron obtener las furanosas 5-fosfato buscadas, materiales de partida en la síntesis

enzimática de nucleósidos, desarrollando una estrategia quimio-enzimática versátil para su

síntesis, partiendo de los azúcares libres.

Con este fin se discutió en la primer parte de este capítulo, la obtención química de las

furanosas protegidas. Luego se estudió la regioselectividad de las reacciones de desprotección

mediante reacciones de hidrólisis o alcohólisis biocatalizadas, utilizando diversas fuentes

enzimáticas. Luego se analizaron diversas estrategias sintéticas de fosforilación, seleccionando Ia

más apropiada para cada pentosa estudiada.

Por último se discutió Ia síntesis de 3-azido-3-desoxi-1,2-0-isopropiliden-a-D-xilofuranosa

5-fosfato, posible sintón para Ia obtención de 3-desoxi-3-amino y 3-desoxi-3-azido-D

ribofuranosas S-fosfato, poniendo de manifiesto la versatilidad sintética de la estrategia quimio

enzimática de obtención de las furanosas 5-fosfato.

.160 Capítqu 3 —Síntesis de furanosas 5-fosfato

.ÓÓÓÓCÓÓOÓÓÓOÓÓCOO....0.CCOOÓOOCÓÓÓÓO.ÓOOOOOÓÓOOO‘

161 Capítulo 4 - Sobreexpresión de la PPM

Capítulo 4

Sobreexpresión, purificación y ensayos de actividad de la PPMdeEscherichia Coli


Elobjetivo de este capítulo es la obtención de la PPM de E.coli de forma pura, mediante Ia

aplicación de metodologías usuales de biología molecular. La metodología empleada se detalla a

continuación:

Construcción de un vector plasmídico, en el cual se insertó el gen completo que codifica

para la PPM.

- Transformación de bacterias con dicho vector plasmídico.

- Selección de bacterias transformadas con el plásmido y determinación de las condiciones

óptimas para la expresión de la enzima.

- Purificación y concentración dela PPM.

Una vez halladas las mejores condiciones para la expresión enzimática, se optimizaron las

condiciones de reacción, evaluando la actividad de la PPM y el rendimiento de una reacción

modelo en función de diversos parámetros. Las variables estudiadas fueron: el pH y la

temperatura de la reacción, la concentración del agente reductor B-mercaptoetanol, la

concentración del metal divalente Mn‘z,esencial para la actividad enzimática, la concentración del

sustrato ribosa S-fosfato y del inhibidor fosfato inorgánico y finalmente la concentración del

cofactor glucosa-1,6-difosfato.


4.2.1- Selección del sistema de expresión

Basándonos en lo comentado previamente en Ia introducción, se optó por el vector de

expresión pRSET-Acomo sistema de expresión de la proteína PPM recombinante en células de E.

coli. Entre los diferentes motivos que justifican esta elección se pueden mencionar los siguientes:

Microorganismo huésped: el gen que se desea clonar es el dela PPM de E. coli K-12. Por Io

que se consideró adecuado seleccionar como microorganismo huésped otra cepa de esta misma

162 Capitulo 4 —Sobreexpresión de la PPM

bacteria, ya que esto permitiría eliminar algunas barreras de expresión al tratarse de una proteína

homóloga. Otras ventajas inherentes a este microorganismo incluyen la sencilla manipulación

microbiológica y genética y el amplio conocimiento en relación con los requerimientos y

estrategias de cultivo.

Expresión intracelular: la PPM es una enzima monomérica intracelular, lo cual facilita su

posterior purificación.

Regulación y niveles de expresión: Elplásmido pRSET-Acontiene un promotor fuerte para

la RNApolimerasa del bacteriófago 17 seguido de secuencias operadoras Iac, lo que permite

regular de manera eficaz la transcripción. La célula huésped posee múltiples copias de este

plásmido, el cual expresa de manera constitutiva el represor lac, asegurando altos niveles de la

proteina represora, la cual se une a las secuencias operadoras en pRSET-A e impide la

transcripción de Ia proteína recombinante cuando el sistema no está inducido. Si se sobreexpresa

Ia proteína de manera constitutiva o en grandes cantidades podría ser tóxica para las células en

crecimiento, obteniéndose una menor biomasa. Luego del crecimiento bacteriano, la adición al

medio de cultivo del inductor químico isopropiI-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG), induce la

expresión de Ia proteína recombinante al unirse a la proteína represora Iac, desplazándola del sitio

operador, permitiendo que la ARNpolimerasa del bacteriófago 17 transcriba las secuencias del

gen de interés.

Número de copias: El vector de expresión seleccionado es un vector que expresa Ia

proteína con alto número de copias. De esta forma se puede obtener la proteína en grandes

cantidades.

Otras características del vector: El vector pRSET-Aposee la secuencia 6xHis-tag, Ia cual

codifica para una cola de seis histidinas en la posición N-terminal. Esta secuencia tiene como

objetivo facilitar su posterior purificación por cromatografía de afinidad. Asimismo, posee un sitio

de hidrólisisde Ia proteasa enteroquinasa, con el objeto de remover, en caso que fuera necesario,

las histidinas añadidas a la proteína de interés. Se conoce que Ia incorporación de aminoácidos

adicionales a la proteína recombinante, puede afectar Iafuncionalidad dela proteina (interfiriendo

en su correcto plegamiento).

DOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOO<

1.... Capítulo 4 - Sobreexpresión de la PPM

4.2.2- Clonado del gen de la PPM de E. coli K-12en el vector pRSET-A

El gen deoB que codifica para la PPM de E. coli se clonó en el vector pRSET-Aa partir del

gen obtenido por métodos de amplificación molecular (PCR)A continuación se describen los pasos

que se siguieron para obtener el plásmido con el inserto deseado.

Para obtener el gen de interés, primero se buscó la secuencia nucleotídica que codificaba

para la PPM de E. coli a partir del banco de genes GenBank (número de acceso: U14003). Una vez

establecido el marco abierto de lectura a través de la secuencia nucleotídica, se diseñaron los

cebadores necesarios para la obtención del gen por medio de PCR.Esto se realizó con el programa

"oligo 6.0”, obteniéndose los siguientes oligonucleótidos:

Cebador directo (Forward primer) : S'ggatccATGAAACGTGCATlTATl’ATGG3'

Cebador reverso(Reverse primer): S'ggtaccCl I I l IGTGACATAACAAAGGC3'

Las letras en minúscula indican los sitios de restricción, el primero siendo el sitio de la

enzima BamHIy el segundo el correspondiente ala enzima KPnl.

Loscebadores diseñados fueron posteriormente sintetizados y utilizados en la reacción de

PCR, utilizando ADN de Eco/i como templado de la reacción. EI producto de amplificación se

analizó por medio de electroforesis en geles de agarosa, observándose una banda de

aproximadamente 1200 pb, correspondiente al tamaño esperado del gen de la PPM (dato no

mostrado). Elfragmento de ADNse purificó utilizando un kit comercial (Qiaex Il Gel Extraction Kit,

QIAGENGmbH) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Elfragmento purificado se clonó inicialmente en el plásmido pGEM-T(Promega), diseñado

para productos de PCR,mediante Ia unión de los residuos de adenina, añadidos por la Taq ADN

polimerasa durante la PCR,con los residuos de timidina insertados en el plásmido lineal. La nueva

construcción del gen PPM se denominó PGEM-T-PPM.Se determinó la identidad del gen mediante

un mapeo con enzimas de restricción, para lo cual se digirió el plásmido con EcoRIobteniéndose

un único producto de 1200 pb y la banda correspondiente al plásmido vacío (dato no mostrado).

Losclones que poseían el inserto correcto se re-amplificarOn en bacterias, se purificó el plásmido y

se confirmó Ia identidad del gen por secuenciación. (ver gráfico en el apéndice)

La traducción de secuencia obtenida corresponde a una proteína de 407 aminoácidos

cuya secuencia se observa en la Figura 4.1.

_ Capítulo4—SobreexpresióndeIaPPM

10 20 30 40 50 60

MKRAFIMVLD SFGIGATEDA ERFGDVGADT LGHIAEACAKGEADNGRKGP LNLPNLTRLG

79 s9 99 109 119 129LAKAHEGSTGFIPAGMDGNA EVIGAYAWAHemsssxorps GHWEIAGVPV LFEWGYFSDH

139 149 159 169 179 139

ensrpoeup KLVERANLPGnsucusse‘r VILDQLGEEHMKTGKPIFYTSADSVFQJAC

199 209 219 229 239 249

HEETFGLDKLYELCEIAREELTNGGYNIGR VIARPFIGDK AGNFQRTGNR HDLAVEPPAP

ZSQ 269 279 28g 299 309

TVLQKLVDEKHGQWSVGKI ADIYANCGIT KKVKATGLDALFDATIKEMK EAGDNTIVFT

319 329 339 349 359 369

urvorosswc; HRRDVAGYAAGLELFDRRLPELMSLLRDDDIULTADHGComwremm

379 339 399 409

REHIPVLVYG PKVKPGSLGH RETFADIGQT LAKYFGTSDM EYGKAMF

Figura 4.1. Secuencia de aminoácidos de la PPM de E. coli

Posteriormente se escindió por digestión el inserto correspondiente al gen que codifica

para la PPM, incubando el plásmido pGEM-T-PPMcon la enzima de restricción Eco RI. Se purificó

por geles de agarosa y se subclonó el gen de interés en el vector de expresión pRSET-A(Stratagen),

Elplásmido se denominó pRSET-A-PPM(Figura 4.2).

Flgura 4.2. Esquema del plásmido pRSET-A

165 Capítulo 4 —Sobreexpresión dela PPM

4.2.3- Transformación del plásmido gRSET-A-PPMen bacterias competentes E. coli

BL21 DE3 L sS

La transformación involucra la introducción del plásmido recombinante pRSET-A-PPMen

células bacterianas competentes. Para ello se transformó el plásmido correspondiente, en primer

lugar, en una cepa de E. coli, la cepa DHS-u, útil para su transformación con plásmidos

recombinantes utilizando la metodología de "shock térmico". Las bacterias transformadas se

sembraron en placas de Petri con medio LBsólido con ampicilina, X-gal e IPTG. Finalmente, se

¡ncubó la placa durante toda la noche a 379€. A continuación se analizaron las colonias por

aparición del color azulado debido a la reacción colorimétrica con X-gal, confirmando de esta

forma la inserción del gen en el vector de expresión. Luego, se aislaron los plásmidos por el

método de lisis alcalina (miniprep) y se chequeó la presencia del inserto utilizando enzimas de

restricción y analizando los fragmentos por electroforesis en geles de agarosa (Figura 4.3). En el

caso de la digestión con Ia enzima de restricción Hindlll, ésta hidroliza el plásmido en dos

posiciones, una de las cuales se encuentra en el gen clonado y la otra en el plásmido,

observándose dos bandas (>1000 pb Ia primera y aprox. 3000 pb la segunda). En cambio, en la

digestión del plásmido con la enzima de restricción Pstl, se observa una única banda de aprox.

4200 pb, debido a que existe solo un sitio de corte en el plásmido. Esta banda equivale a la suma

del gen (t 1200 pb) y del vector de expresión (13000 pb), confirmándose nuevamente la identidad

del gen en el vector de expresión.

Finalmente, se transformó con el plásmido pRSET-A-PPM,la cepa de E. coli BL21,siguiendo

la metodología descripta anteriormente. Para confirmar la correcta expresión de la PPM: en

primer lugar, se plaquearon las células transfectadas en medio LB sólido con

ampicilina/cloranfenicol, para luego escoger una colonia, la cual se hizo crecer en medio LBlíquido

con ampicilína/cloranfenicol y finalmente se indujo la expresión de la proteína recombinante con

IPTG.Asimismo se realizó un control sin inducción para utilizar como referencia. Las células se

sonicaron y se analizaron los sobrenadantes del Iisado por electroforesis en geles de poliacrilamida

en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE),observándose el aumento en la intensidad de la

banda de peso molecular 42 kDa en las columnas sembradas con el Iisado de las células inducidas

con respecto a las correspondientes sin inducir.

166 Capítulo 4 —Sobreexpresión de la PPM

40mm:

Joooph

m»1500»

“ph

Columna 1: Marcador de peso molecular.

Columna 2-6: Plásmido digerido con la enzima de restricción Hindlll.

Columna 8-12: Plásmido digerido con la enzima de restricción Pstl.

Columna 13: Marcador de peso molecular.

Figura 4.3. Electroforesis en gel de agarosa al 1% del vector pRSET-A-PPM.

4.2.4- Expresión y purificación de la proteína recombinante PPM de E. coli

Para la sobreexpresión en mayor escala de la PPM-(HIS)6,las bacterias transformadas

fueron crecidas en medio LBlíquido durante toda la noche a 37°C. Posteriormente se realizó una

dilución del cultivo 1:20 y una vez alcanzada la densidad óptica óptima (aprox. 0.5 OD), se indujo la

expresión proteica añadiendo al medio de cultivo IPTG.Una vez concluido el tiempo de inducción

se centrifugó y resuspendió en buffer, el pellet bacteriano. Luego se lisaron las bacterias por

sonicación, se centrifugó y evaluó, por medio de SDS-PAGE,los niveles de expresión de la proteína

recombinante y la localización subcelular. De esta manera se pudo confirmar que la enzima se

encontraba mayoritariamente en el sobrenadante, lo cual es una evidencia que su estructura no se

encuentra alterada y probablemente sea funcional.

A continuación se optimizaron la concentración del inductor y el tiempo de inducción para

obtener la mayor cantidad posible de proteína recombinante. En primer lugar, se realizó el ensayo

de inducción empleando concentraciones de IPTGde 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM durante 3 horas a

379€. Luego se realizó un ensayo extrayendo alícuotas del cultivo a diversos tiempos, a una


concentración de IPTGconstante (1 mM). Se compararon en cada caso, los perfiles de expresión

por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Las condiciones de inducción óptimas

establecidas fueron la adición de IPTG1 mM y 4 horas de incubación a 37 °C.

Para llevar a cabo Ia purificación de la PPM recombinante a partir de lisados crudos de E.

coli BL21 transformada, se utilizó un polímero de agar funcionalizado con NTA (ácido

nitriloacético) para Ia unión del ion Ni‘z. Esta tecnología permite purificar en un solo paso

proteínas que contengan una cola de histidinas. NTAes un quelante de iones metálicos como en el

caso del Ni‘z,ocupando 3 sitios de unión de la esfera de coordinación del ión, dejando tres sitios

libres para interactuar con los residuos de histidina, a través de los anillos imidazólicos que forman

parte de la estructura del aminoácido. Estos anillos se unen a los iones Ni'2 inmovilizados por los

grupos NTAde la matriz. El imidazol mismo también puede unirse a los iones níquel y, por un

mecanismo competitivo, puede llegar a desplazar los residuos de histidina de las proteínas. Abajas

concentraciones de imidazol se previenen las uniones inespecíficas y de baja afinidad de otras

proteínas (lavados), mientras que las que poseen la estructura 6xHistagse unen fuertemente. Por

lo que se puede eluir específicamente la proteina de interés modificando la concentración de

imidazol en el eluyente.

Se siguieron las indicaciones del fabricante (QIAGEN)para purificar la PPM utilizando la

resina de Ni‘z,aumentando la concentración de imizadol, en buffer fosfato y solución salina de

NaCI. La solución amortiguadora mantiene el pH en un valor óptimo para la unión de la cola de

histidina a la resina (pH = 8) y la solución salina es utilizada para prevenir la unión inespecifica de

proteínas cargadas negativamente. Paralelamente se ensayaron otras condiciones de elución. Las

nuevas condiciones se buscaron en base a diversos motivos: i) Elfosfato inorgánico es inhibidor de

la PPM, por lo que se decidió buscar como solvente de elución, otros tipos de soluciones

amortiguadoras, distintas al fosfato; ii) Ia estructura química del imidazol es similar a la de las

bases que forman parte de los nucleósidos. Siendo las últimas, sustratos de las nucleósido

fosforilasas (NPs) que se utilizaran para la síntesis de nucleósidos presentada en esta tesis, se

decidió eliminar el imidazol del solvente de elución debido a que se desconoce el efecto del mismo

en la actividad de las mismas. Las nuevas condiciones de elución de la columna Ni-NTA, se

seleccionaron explotando las propiedades químicas del aminoácido histidina. Éste es un

aminoácido básico, por lo que a pH neutro se encontrará desprovisto de carga, mientras que a pH

ácido, se formara el ácido conjugado del anillo imidazólico, de carga positiva. Por Io que a pH ácido

la proteína con la cola de histidinas, no será retenida por la columna y podrá ser eluída. El buffer

168 Capítulo 4 - Sobreexpresión dela PPM

de lavado utilizado en este protocolo alternativo fue Mops a pH = 7 en solución salina, y el buffer

utilizado para Ia elución de la proteína fue el buffer acético/acetato a pH = 4,5.

Para la purificación por cromatografía de afinidad, se procedió a pasar el lisado crudo

centrifugado a través de Ia columna Ni-NTA.El análisis por SDS-PAGEde las fracciones colectadas

variando la concentración de imidazol (Figura 4.4A-), reveló la presencia de Ia proteína de interés

(una única banda de aprox. 42 kDa, peso molecular concordante con el peso molecular de Ia PPM)

con un alto grado de pureza, no observándose dicha banda en las fracciones correspondientes a

los pasos de lavado de Ia columna. En cambio, los resultados de Ia purificación de Ia PPM por

cromatografía de afinidad, variando el pH de la solución amortiguadora, no fueron tan eficientes

comparados a los obtenidos mediante la primer metodología empleada. En este caso, el análisis

por SDS-PAGEreveló Ia presencia de Ia proteína de interés tanto en las fracciones colectadas

correspondientes a los pasos de lavado como en las correspondientes a los pasos de elución

(Figura 4.4B-), mostrando en todos los casos Ia presencia de otras proteínas, obteniéndose a la

proteína con bajo rendimiento y bajo grado de pureza. Esto puede deberse a la unión inespecífica

de otras proteínas a la resina, que en el caso de la elución con imidazol se evita añadiendo el

mismo en bajas concentraciones.

COOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0......OCOOOOOOOÓOOOCOOOO

169 , Capítulo 4 - Sobreexpresión dela PPM

A

ss kDa

sz kDa

41.5 km

32.6 kDa

25 ¡(Da

16.6 kon

G.6 ¡(De

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Columna 1: Lisado de E. cali transfectada con el plásmido pRSET-A-PPM.Columna 2: Fracción correspondiente al primer paso de lavado de la columna.Columna 3: Marcador de peso molecular.Columna 4-6: Fracciones correspondientes a los subsiguientes pasos de lavado de la columna.Columna 7-10: Fracciones correspondientes a los oasos de elución de la columna.

B

Columna 1 y S: Lisado de E. coli transfectada con el plásmido pRSET-A-PPM.Columna 2: Fraccióncorrespondiente al primer paso de lavado dela columna.Columna 3-4: Fracciones correspondientes a los subsiguientes pasos de lavado de la columna.Columna 68: Fraccionescerrespondientes a los pasos de elución de la columna.

Figura 4.4. Purificación de Ia proteína PPMrecombinante de E.coli mediante cromatografía de afinidad enresina de NTA-Niz'.¿ elución por imidazol. i elución por pH.

170. Capítulo 4 - Sobreexpresión dela PPM

Con estos resultados, se decidió que la estrategia más adecuada para la purificación de la

proteína recombinante utilizando cromatografía de afinidad, era la elucíón de la misma variando

las concentraciones de imidazol en el solvente de elución, ya que se obtiene la proteína PPM con

elevado grado de pureza y altos rendimientos. Ladesventaja de esta estrategia es que precisa un

paso posterior de eliminación del imidazol y de la solución amortiguadora, presentes en las

fracciones de elucíón junto con Ia proteína PPM recombinante.

Para la posterior eliminación del imidazol y de la solución amortiguadora de la fracción

pura se estudiaron dos alternativas: i) desalado por cromatografía de permeación de geles, y ii)

diálisis y concentración de la proteína. La primera alternativa estudiada se ensayó utilizando dos

resinas de exclusión Bio-Gel P-GDG(BIO-RAD)y Sephadex G-ZS (GE Healthcare). Ambas resinas son

apropiadas para el desalado de proteínas con un rango de fraccionamiento de 1000-6000. Las

fracciones eluidas se evaluaron al UV,no pudiéndose encontrar las condiciones óptimas para la

resolución de la fracción proteica de Ia imidazólica, co-eluyendo ambas fracciones. Este resultado

puede ser debido a la alta concentración de imidazol en Ia solución inicial, saturando de esta

forma la columna.

La segunda alternativa estudiada fue la diálisis, para Io cual se utilizó una membrana con

un valor de corte (cut om de 10 kDa. Este proceso permitió la remoción de las sustancias

inhibidoras de peso molecular pequeño (< 10 kDa), mientras que la proteína fue retenida dentro

de la membrana. La diálisis se realizó contra la solución de almacenamiento (buffer Tris pH = 8,

Mn‘2 1 mM, EDTA0.1 mM) y posteriormente para concentrar la solución proteica, se colocó la

membrana conteniendo la solución enzimática sobre escamas de polietilenglicol (PEG)de peso

molecular > 10 kDa, dejándola hasta obtener la concentración de la solución proteica deseada. La

concentración de la proteína en Ia solución se midió utilizando Ia metodología descripta por

Bradford. Se observó que a concentraciones superiores a 0.5 mg/ml, la proteina PPM precipitaba,

por lo que la concentración final de la proteína fue establecida en 0.3 mg/ml.

Para comprobar la actividad de la enzima recombinante obtenida, se acopló a la reacción

de migración del grupo fosfato, la reacción de glicosidación enzimática usando la PNP, utilizando

como modelo la conversión de ribosa S-fosfato a adenosina, como Io indica la Figura 4.5.

.00006000..1

\

QOÓOOOIOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOÓOOCOOOOO

COOOOOOOOOOOOOOOOUOOOOCOOOOOOOOOÓOOOOOO0.0.0.0...

171 Capitulo 4 —Sobreexpresión de Ia PPM

HO H0E B

ko? a #0? o 2 #0?—> I . _B_>H<— _¡|,,0<_____

OH Oi? OH O \0H OH OH4 6

E1:fosfopentomutasa.E2: purín nucleósido fosforilasaB: adenina.

9OjPo

HO

Figura 4.5. Síntesis de nucleósidos por glicosidación partiendo de furanosas S-fosfato.

La actividad enzimática observada fue por debajo de Io esperado, obteniéndose

rendimientos del 25 % a tiempos prolongados de reacción (5 días). Estos bajos rendimientos y

actividades de Ia PPMrecombinante se podrian deber a diversos factores, tales como:

o Efectos concernientes al pasaje de la proteina por la resina de cromatografía de

afinidad.

o Presencia de aminoácidos adicionales en la proteina (cola de histidina, etc), que

podrían interferir en el correcto plegamiento de la proteína

o Incorrecto plegamiento dela enzima luego de su expresión en grandes cantidades.

Se ensayó, en primer lugar, la reacción de hidrólisis de los aminoácidos adicionales de

histidina, utilizando Ia proteasa enteroquinasa, para de esta forma removerlos del esqueleto

proteico. Se exploraron diversas condiciones con el objeto de hidrolizar los mismos, sin éxito. Esto

podría deberse a que la cola de histidina en la conformación nativa de la PPM estuviera localizada

dentro del dominio proteico siendo, por lo tanto, inaccesible para la hidrólisis enzimática.

Paso U (umoI/min.‘mg prot.) rado de purificación Rend. % (h)

Diálisis simple’ 1.5 1 25 (120)

Diálisisdoble" 18.1 12 40 (70)

Diálisistriple‘“ 47.8 32 80 (SO)

‘Diálisissimple: eluido cromatográfico contra buffer de almacenamiento.

“ Diálisisdoble: eluido cromatogra’fico contra solución de EDTA10 mM, y buffer de almacenamiento.

’“ Diálisistriple: eluido cromatográfico contra solución EDTA10 mM, desnaturalización con urea 6M y diálisisprogresiva contra agua, y finalmente contra buffer de almacenamiento.

Tabla 4.1. Resultados dela purificación dela PPM.

172 Capítulo4 - Sobreexpresión dela PPM

Ensegundo lugar, se evaluó el efecto del pasaje de la proteína por la resina de afinidad en

la actividad enzimática. Debido a que Ia resina funciona como un agente quelante de metales, es

factible que la disminución de la actividad enzimática observada pudiera estar asociada a pérdidas

parciales del ión Mn'2 del centro activo de la enzima debido al reemplazo del mismo por el ión Ni'2

unido a Ia resina. La presencia de un ión divalente en el sitio activo de la PPM es esencial para

mantener su actividad catalítica. Se ha reportado que la actividad de la PPM es dependiente de la

identidad del metal divalente unido a la misma‘, siendo la actividad de la metaloproteína asociada

a Ni", 12 % de la actividad de la PPM asociada a Mn’z. Para evaluar este efecto, se dializó una

solución enzimática contra buffer Tris pH=8 y 10 mM de EDTAdurante toda una noche, para luego

realizar una nueva diálisis contra el buffer de almacenamiento. La actividad de la nueva solución

enzimática doblemente dializada se incrementó con respecto a Ia inicial (12 %), demostrando de

esta forma el intercambio del ion níquel del centro activo por el Mn‘z. Mediante Ia diálisis doble de

los eluidos de la columna de afinidad se logró obtener un rendimiento del 40% en un periodo

menor de tiempo (70 h, tabla 4.1) .

Aunque los resultados obtenidos mediante el intercambio de metales mostraron un

aumento en Ia actividad enzimática, el valor de Ia misma continuó siendo bajo. Esto puede

deberse al incorrecto plegamiento de una fracción de la proteína expresada y a Ia formación de

agregados proteicos, insolubles en solución acuosa. Por esta razón se realizó, luego de los pasos

descriptos anteriormente, Ia desnaturalización y solubilización de la proteína utilizando urea 6 M.

Posteriormente se llevó a cabo la renaturalizacion de Ia PPM, removiendo Ia urea lentamente por

diálisis, realizando finalmente una diálisis contra buffer de almacenamiento. Como se muestra en

Ia Tabla 4.1, la actividad enzimática se incrementó drásticamente en el proceso de

desnaturaI¡zación-renaturalización, confirmando de esta forma Ia hipótesis asociada a un

incorrecto plegamiento enzimático durante la sobreexpresión.

4.2.5- Optimización de la actividad de la PPM

Una vez optimizado el paso de purificación de la proteína recombinante, se continúo con

la evaluación de las condiciones de reacción que permitieran obtener los mejores resultados de

actividad enzimática y rendimiento para la reacción modelo estudiada, esto es, Ia conversión a

adenosina a partir de ribosa 5-fosfato y adenina, mediante el sistema enzimático acoplado (PPMy

1 Hammer-Jespersen, K.;Munch-Petersen, A.; Eur. .I.Biochem., 1970, 17, 397

¡CCOOOOOOÓOOOOOOOOOOOÓQOOOOOOOOOOCOOOOO000......Ol

173 Capitulo 4 - Sobreexpresión dela PPM

PNP) como biocatalizador. Con el objeto de determinar dichas condiciones, se estudió Ia

dependencia de la actividad enzimática y el rendimiento en función de los siguientes parámetros:

- pH.

Temperatura.

Concentración del covfactor glucosa-1,6- difosfato.

- Concentración del agente reductor B-mercaptoetanol.

Concentración del inhibidor fosfato inorgánico.

Concentración del Mn‘z.

i) Efecto del pH sobre el rendimiento y la actividad

Laactividad enzimática y el rendimiento de Ia reacción mostraron un pH óptimo alrededor

de 7 (Figura 4.6), para visualizar la actividad y el rendimiento con mayor claridad, estas

propiedades se indican como cantidades relativas para cada experimento, asignando al valor

máximo de cada experimento, el valor relativo del 100%. El cambio en las condiciones de pH en

una unidad, drásticamente redujo la actividad y el rendimiento, siendo este efecto más

importante cuando se incrementó el valor de pH. Ha sido reportado previamente1 que el valor de

pH óptimo para la PPM aislada de E. coli era de 8, mientras que para la PNP (presumiblemente de

Cel/ulomonas, el origen bacteriano de la enzima PNP comercializada por Sigma se discute en la

próxima sección) el pH óptimo reportado se encontró en el rango de pHs 7-82. Ladiferencia en el

pH óptimo reportado en este trabajo con respecto al reportado previamente podría ser originada

por diferencias en Ia secuencia aminoacídica de la enzima sobreexpresada, como ser el fragmento

de polihistidinas diseñado para la purificación dela misma por cromatografía de afinidad.

2Wielgus-Kutrowska, 8.; Bzowska, A.;Tebbe, J., Koellner, G.; Shugar, D.; Biochimica et Biophysica Acta , 2002, 1597, 320


—o— Act.re| --o-- Rend.reTl

Figura 4.6. Actividad de la PPMy rendimiento de la reacción de síntesis de adenosina relativos en funcióndel pH.

ii) Efecto de la concentración de B-mercaptoetanol sobre el rendimiento y Ia actividad

Elanálisis de la actividad y el rendimiento de la reacción variando las concentraciones de

B-mercaptoetanol, mostró que la actividad enzimática dela PPMposee un requerimiento absoluto

para esta sustancia, siendo totalmente inactiva en ausencia de la misma. Como se observa en Ia

Figura 4.7, Ia concentración de 200 mM maximiza la actividad de la enzima, así como el

rendimiento dela reacción modelo.

[B-mercaptoetanolllmM

—o— Act.rel --o-- Rend.re| I

Figura4.7. Actividaddela PPMy rendimiento dela reacción de sintesis de adenosina relativos en función deIa concentración de B.mercaptoetanol.

0.0...COOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO...0..0.0.0.0...


iii)Efecto de la concentración de la ribosa 5-fosfato.

Asimismo se analizó la influencia de Ia concentración del sustrato, ribosa S-fosfato.

Mientras que la actividad siguió un comportamiento típico de Michaelis-Menten en el rango de

concentraciones de sustrato estudiado (0-4 mM), el rendimiento alcanzó un máximo a la

concentración de sustrato de 1 mM y lentamente cayó al 80 % del rendimiento máximo, a

concentraciones de sustrato de 4 mM (Figura 4.8). Se calcularon los datos cinéticos mediante la

gráfica de Lineweaver-Burke, obteniéndose un valor de Km=3.4 mM y Vmax = 4.8 uM/min, ambos

para las condiciones no optimizadas de reacción.

l l l l

0 1 2 3 4

[Ribosa-S-fosfatol/mM

—o— Act.rel --o-- Rend.rel—[

Figura 4.8. Actividad de la PPM y rendimiento de la reacción de síntesis de adenosina relativos en función dela concentración de ribosa S-fosfato.

Por este motivo, se seleccionó 1 mM como concentración de sustrato en las condiciones

de trabajo. El efecto de la disminución en los rendimientos de la reacción con el aumento en la

concentración de sustrato se encuentra relacionado a la presencia del ión fosfato liberado como

subproducto de la reacción de glicosidación enzimática llevada a cabo por la PNP. Este efecto se

evaluará en la posterior sección.

iv) Efecto del fosfato inorgánico sobre el rendimiento y la actividad.

Con el objeto de examinar el efecto inhibitorio del fosfato inorgánico formado como

subproducto de Ia reacción de síntesis del adenosina, se estudió el impacto de la variación de la

concentración de fosfato inorgánico en la actividad enzimática y en el rendimiento de la reacción

(Figura 4.9). Se utilizó fosfato de sodio puro para el ensayo de inhibición y se observó que ambos

176 Capítqu 4 —Sobreexpresión dela PPM

parámetros fueron marcadamente afectados por esta variable. Se intentó precipitar

selectivamente el fosfato inorgánico en presencia de la ribosa 5-fosfato en el medio de reacción

mediante diversas metodologías, sin embargo, todos los esfuerzos resultaron ¡nfructuosos en

nuestras manos. Como se observa en Ia Figura 4.9, a concentraciones de fosfato inorgánico de 1

mM, la actividad enzimática decae a un 15 % de la correspondiente actividad medida en ausencia

de inhibidOr.Con estos resultados se puede explicar el origen de la disminución del rendimiento

de la reacción con el aumento en la concentración de sustrato.

[Na3P0J/rnM

+ Act.rel —-.-. Rend.re|

Figura4.9. Actividad dela PPMy rendimiento dela reacción de sintesis de adenosina relativos en

función de la concentración de fosfato inorgánico.

v) Efecto de la temperatura sobre el rendimiento y la actividad.

Posteriormente, se estudió la dependencia dela actividad enzimática y el rendimiento con

la temperatura, determinando que la temperatura de 459€ es una condición apropiada para

conducir estos experimentos en el rango de temperaturas estudiado (Figura 4.10). Las

temperaturas óptimas descriptas en bibliografía, para las enzimas en el sistema acoplado, son:

para Ia PPM de E. coli 45°C3y para la PNP 70°C (Ia actividad estudiada fue Ia de Ia fosforólisis de la

inosina, observándose que en el rango de temperaturas entre 20 - 70 °C, Ia actividad de dicha

reacción aumentaba exponencialmente con la temperatura, mientras que a temperaturas

mayores a 70 °C, la proteina se desnaturalizaba, disminuyendo así su actividadz). Considerando

3Hamamoto, T.; Noguchi, T.; Midorikawa, Y.;Bíosci. Bíotechnol. Biochem., 1998, 6, 1103

O0.00QMOOOOOOOOOOOOÓOÓOOOOOCOOOCOOOOOOÓOÓÓOOOOOOO‘


que se estudia la temperatura óptima de un sistema acoplado de enzimas, es lógico que dicha

temperatura, para Ia reacción estudiada en esta tesis, sea la de la PPM. No se pudo explicar el

descenso de la actividad a 37 °Ccon respecto a la temperatura de 30 °C.

1101009080706050

40 . u u u . .

25 30 35 40 45 50

T/‘C

[-o— Act.re| --o- Rend.relJ

Figura 4.10. Actividad de Ia PPMy rendimiento dela reacción de síntesis de adenosina relativos en

función de la temperatura.

vi) Efecto de la concentración glucosa-1,6-difosfato sobre el rendimiento y la actividad.

Elanálisis de la actividad y el rendimiento de la reacción variando las concentraciones del

co-factor, glucosa-1,6-difosfato, mostró un pequeño aumento en la actividad enzimática de la

PPM, obteniéndose idénticos rendimientos a diversas concentraciones del mismo. Esto puede

deberse a que la pequeña variación de la actividad con el co-factor añadido es despreciable frente

a este parámetro. Por Io cual la presencia del co-factor no afecta en gran medida la maximización

del rendimiento final.

En bibliografía se ha descripto que el agregado en las concentraciones óptimas (1.4 pm)

estimula la actividad, siendo ésta 3 veces en magnitud superior a la actividad medida en ausencia

del mismo‘,lo cual no concordó con lo observado en este trabajo. Laactividad de la enzima con el

agregado del co-factor en las concentraciones publicadas fue sólo 1.1 veces superior a Ia actividad

de la misma sin su agregado. Debido al elevado costo del co-factor y al efecto despreciable en la

4 Hamamoto, T.; Noguchi, T.; Midorikawa, Y.;Biosci. Biotechnol. Biochem., 1998, 6, 1103

' 178 Capítulo 4 —Sobreexpresión de la PPM

actividad así como en el rendimiento de Ia reacción se decidió no agregarlo al medio de reacción

en los subsiguientes ensayos.

vi) Efecto de la concentración de Mn‘zsobre el rendimiento y la actividad.

Por último, se realizaron ensayos en los cuales se modificó la concentración de Mn",

observándose que la misma no afectó los valores de actividad enzimática. Lo que se vio

modificado fue el rendimiento de Ia reacción, siendo mayor al incrementarse la concentración del

ión (0-1 mM). Estos resultados muestran que la concentración de Mn‘2presente en la solución de

almacenamiento de la enzima es suficiente para maximizar el parámetro de actividad. Una posible

explicación del aumento del rendimiento de la reacción con el incremento del ión divalente en el

medio de reacción puede ser la formación del par ¡ónico Mn’zHPO42',que abolíría el efecto

inhibitorio del fosfato inorgánico. Elvalor de actividad no se vio afectado por el ión divalente en

exceso, debido a que este parámetro se mide a través de los valores de velocidad inicial,en donde

la proporción de fosfato inorgánico formado como subproducto es muy pequeña. Esto explicaría el

rendimiento máximo observado a concentraciones de ribosa S-fosfato de 1 mM, con el agregado

de 1 mM de Mn‘z. En las siguientes secciones se describen ensayos en los cuales el aumento de la

concentración de este ión maximizael rendimiento a mayores concentraciones del sustrato

Podemos concluir que las condiciones óptimas para llevar a cabo la reacción son las

siguientes: pH 7, temperatura óptima de 459€, concentración de B-mercaptoetanol de 200 mM,

concentración del sustrato ribosa S-fosfato 1 mM y concentración de Mn"2 1 mM. Se obtuvo

mediante el uso de estas condiciones una actividad específica de 87 umol/min x mg prot, y un

rendimiento del 90 % (30 h).

4.3- Conclusiones

Se logró obtener con elevado rendimiento y alta pureza, la PPM de E. coli, utilizando

metodologías usuales de biología molecular.

Se evaluaron asimismo, los parámetros que optimizaran la actividad enzimática así como

el rendimiento de la reacción modelo de síntesis de nucleósidos que involucró la formación de

adenosina a partir de ribosa 5-fosfato y adenina, utilizando como biocatalizador el sistema

acoplado formado por la PPMsobreexpresada y la PNPcomercial.

179 Capítulo 4 —Sobreexpresión de la PPM

De esta forma se determinó que la utilización de cromatografía de afinidad de metales

inmovilizados con resinas de tipo NTApara la purificación de Ia enzima sobreexpresada es una

estrategia adecuada, a diferentes escalas, para la obtención de proteínas recombinantes con un

alto grado de pureza en un solo paso de purificación. La diálisis contra una solución concentrada

del agente quelante EDTA,permitió incrementar la actividad específica de Ia PPM, a través de un

mecanismo de intercambio de iones metálicos en el centro activo de Ia enzima. El proceso de

desnaturalización-renaturalización permitió solubilizar Ia enzima y proporcionó un medio para el

correcto plegamiento de la proteína, aumentando asimismo la actividad específica.

Por último se determinaron las condiciones experimentales óptimas de la reacción,

evaluando de forma independiente las posibles variables que afectan Ia actividad enzimática del

sistema acoplado y el rendimiento dela reacción.

180 Capítulo 4 - Sobreexpresión de la PPM

181 Capítulo S —Síntesis quimioenzimática de nucleósidos

Capítulo 5

Síntesis quimio-enzimática de nucleósidos naturales y modificados


Este capítulo tiene como objetivo demostrar el alcance de la estrategia quimio-enzíma’tica

de síntesis de nucleósidos tanto naturales como modificados, utilizando como biocatalizador el

sistema enzimático acoplado formado por la enzima recombinante PPM, obtenida como se

describió en el capítulo 4, y nucleósido fosforilasas (NPs) comerciales, partiendo de pentosas 5

fosfato (capítulo 3) y bases purínicas y pirimidínicas.

Mediante esta metodología se sintetizaron, nucleósidos naturales, tales como la

adenosina, inosina, guanosina, timidina y 2'-desoxiuridina, partiendo de ribosa 5-fosfato y/o 2

desoxirribosa S-fosfato, según corresponde, y las bases naturales adenina, hipoxantina, guanina,

timina y uracilo, respectivamente.

Asimismo, con el objeto de enfatizar la versatilidad del método en la obtención de

nucleósidos modificados, se utilizó esta metodología para la preparación de análogos de

nucleósidos, modificados tanto en la base como en el esqueleto azucarado del mismo. Por lo que

se prepararon nucleósidos de arabinosa (modificados en el azúcar), así como nucleósidos de ribosa

y 2-desoxirribosa, utilizando las bases modificadas purínicas: 6-mercapto purina, 6-cloro-2

aminopurina, 2-fluoroadenina y 1,2,4-triazol-3-carboxamida, y las bases modificadas pirimidínicas:

5-fluorouracilo y 5-bromouracilo.


5.2.1- Esguema general de la síntesis enzimática de nucleósidos

A continuación se describe el esquema general de la síntesis enzimática de nucleósidos. El

primer paso consiste en Ia migración regio y estereoselectiva del 5-fosfato a la posición a-1 de Ia

pentosa. La pentosa 1-fosfato generada en este paso, es sustrato de otra enzima, la nucleósido

fosforilasa. Este tipo de enzimas catalizan la reacción reversible de glicosidación de ribo y 2

desoxirribosa 1-fosfato en presencia de bases, para generar así, el nucleósido y fosfato inorgánico.

182 Capítulo 5 - Síntesis quimioenzimática de nucleósidos

La reacción enzimática acoplada está limitada por la especificidad de la PPM y las NPs. Se

ha reportado que la PPM de E. coli expresada acepta como sustratos Ia D-ribosa 5-fosfato, 2

desoxi-D-ribosa S-fosfato y D-arabinosa S-fosfato’. Las NPs que se utilizaron para la reacción de

acoplamiento fueron la Purín Nucleósido Fosforilasa (PNP) bacteriana comercial (Sigma) y Ia

Timidín Fosforilasa (TP)comercial de E. coli (Sigma), las cuales aceptan como sustratos nucleósidos

purínicos y pirimidínicos, respectivamente. Las bases se seleccionaron en base a la accesibilidad

comercial de los nucleósidos modificados sintetizados a partir de las mismas, para así poder contar

con material de referencia para determinar la identidad cromatográfica, el rendimiento y la

cinética de los nucleósidos obtenidos.

5.2.2- Síntesis enzimática de ribonucleósidos.

Se sintetizaron diversos ribonucleósidos utilizando D-ribosa 5-fosfato y diversas bases

como sustrato, y como biocatalizador, el sistema enzimático acoplado formado por Ia PPM y PNP,

aplicando las condiciones optimizadas discutidas previamente en el capítulo 4.

En primer lugar se sintetizaron los ribonucleósidos naturales adenosina, inosina y

guanosina. Labase natural hipoxantina fue rápidamente convertida a inosina cuantitativamente (2

h, 45, Figura 5.1). Cuando se utilizó adenina Ia actividad relativa fue menor pero se obtuvieron,

igualmente, altos rendimientos a mayores tiempos de reacción (46, Figura 5.1). Finalmente, la

reacción enzimática de síntesis de guanosina ocurrió con un rendimiento del 30 % y una actividad

relativa similar a la síntesis de adenosina. Losvalores de actividad se expresaron en forma relativa,

asignando el valor del 100 % a la actividad dela reacción de síntesis de inosina.

1 Hammer-jespersen, K.;Petersen, A.; Eur. J. Bíochem., 1970, 17, 397


9HO-lIP-O H0 B

. o B O

PPM. PNPHO OH Tris H0 OH

Comp. N' Base Act. Rel. (96) Rend. (96) Tiempo (hs)É _ —

45 hlpoxantlna 100’ 99 246 adenlna 14 97 20

47 guanlna 14 30 3048 6-SH-Pu 66 89 2

49 6-Cl-2-NHz-Pu 1 25 32

50 z-F-Ad 4 40 96

51 TCA 127 100

'EI valor de la actividad relativa del 100% corresponde a 570 prnol.rnin".mg prot "

í 0 NH, oN NH N \N N\|/"\NH(N | y (’N IN) <’ ' ’

H HN u/NHiponnlinl Adulhll TCA

SH Cl NH;

</N I \N </ I \N (¡N l \NN N NH N H N NH, H N F

o-su-Pu 6—(_‘I-1-NII¡ I-F-Ad

Figura 5.1. Reacción de transglicosidación enzimática utilizando D-ribosa 5-fosfato y bases.

La diferencia entre las actividades de las reacciones de síntesis de adenosina e inosina, se

debió principalmente a la especificidad de la PNP utilizada en esta reacción. La PNP comercial

utilizada en estos ensayos (Sigma, St.Louis, MO, USA)no cuenta con una especificación de origen.

Si bien el rótulo indica "origen bacteriano”, no se aclara el microorganismo. En trabajos previos se

presumió que el origen de la PNPcomercializada por Sigma era de E. coli. Esta enzima pertenece a

la clase de PNP de alto peso molecular, y acepta como sustratos tanto 6-oxo como 6

aminopurinas. En cambio, las PNPdel tipo de bajo peso molecular aceptan como sustratos solo 6

oxopurinas y en algunas excepciones 6-aminopurinas con menor actividad. Se ha sugerido

recientemente que la enzima comercializada por Sigma no es de E. coli sino probablemente de

184 Capitulo 5 - Sintesis quimioenzimática de nucleósidos

Cellulomonasz. La PNP de Cellulomonas es del tipo de bajo peso molecular. Se ha reportado que la

fosforólisis de adenosina no es detectable utilizando esta enzima, mientras que la adenina sí es

sustrato de la reacción de síntesis de nucleósidos. Con el objeto de determinar el origen dela PNP,

y de esta forma evaluar la especificidad dela misma durante este trabajo de tesis, se han realizado

ensayos de fosfórolisis de adenosina e inosina utilizando la PNP comercial, observando que la

inosina se hidroliza rápidamente mientras que la adenosina no es sustrato de esta enzima.

Asimismo, se ha estimado el peso molecular por electroforesis en geles de poliacrilamida (aprox.

100 kDa, dato no mostrado). Este dato junto con Ia preferencia de esta enzima por hipoxantina

sobre adenina (Figura 5.1), sugiere que esta enzima pertenece a la familia de PNP de bajo peso

molecular, posiblemente de Cellulomonas,como se ha propuesto previamente.

Con respecto al bajo rendimiento obtenido en la sintesis de guanosina, éste se puede

explicar debido a Ia baja solubilidad en solución acuosa de la base guanina.

Luego se examinaron diversas purinas sustituidas para explorar Ia generalidad del método

propuesto. De esta forma se ensayaron las bases 6-mercaptopurina, 6-cloro-2-aminopurina, 2

fluoroadenina y 1,2,4-triazol-3-carboxamida. Aunque los valores de actividad y rendimiento fueron

aceptables para la preparación del 6-mercaptopurin ribonucleósido (48, Figura 5.1), los resultados

en el caso del 6-cIoro-2-aminopurín ribonucleósido (49, Figura 5.1) y 2-fluoroadenín

ribonucleósido (50, Figura 5.1) no fueron tan positivos. Esto se debió a Ia alta especificidad en

relación a las bases de las PNP de bajo peso molecular. Un ejemplo interesante es Ia síntesis del

antiviral Ribavirina (Virazole) a partir de la base no convencional triazólica, 1,2,4-triazoI-3

carboxamida (51, Figura 5.1). La reacción procedió cuantitativamente con alta actividad (1.5 h).

Estudios cristalográficos por rayos X3indican que el nucleósido triazólico es capaz de mimetizar la

conformación de diversos ribonucleósidos purínicos canónicos. Como se observa en la Figura 5.2,

el oxigeno y el nitrógeno del grupo 3-carboxamida se encuentran espacialmente ubicados de

f0rma similar a los átomos 06 y N1 de Ia inosina y guanosina. Por rotación (180 °) del enlace C3

CG,la rivabirina también se asemeja a Ia conformación de la adenosina (Figura 5.2). Esto explicaría

la aceptación como sustrato de esta base no convencional triazólica por la enzima.

2Bzowska, A.; Kulilowska, E.; Shugar, D.; Pharmacol. & Therap. , 2000, 88, 3493Wu, J.; Lin,C.; Hong, 2.; Journal ofAntimicrobíal Chemotherapy, 2003, 52, 543


_ o — o6

NQPkNHz N N“HO N/N HO N N/

o o:>OH OH on OH

NH2 I NH:nomN \

n (VS </ I “HO N/N HO N N/

o o

on OH OH OH_ _lRm Am

Figura 5.2. Diversas conformaciones de Ia ribavirina y su similitud con los ribonucleósidos naturales.

5.2.3- Síntesis enzimática de 2'-desoxirribonucleósidos

A continuación, se utilizó Ia 2-desoxirribosa 5-fosfato como sustrato de la PPM y Ia TP de E.

coli, para Ia reacción de sintesis enzimática de 2'-desoxirribonucleósidos, tanto naturales como

modificados, en conjunto con las bases pirimidinicas: timina, uracilo, S-fluorouracilo y 5

bromouracilo (52-55, Figura 5.3). Asimismo, con el objeto de evaluar Ia especificidad de Ia PNP por

el sustrato 2-desoxirribósido, se decidió comparar las cinéticas y los rendimientos de las

reacciones de síntesis de desoxirribonucleósidos purínicos, empleando para este ensayo una base

purinica natural, hipoxantina, asi como una modificada, 6-mercaptopurina (56-57, Figura 5.3). Las

velocidades de reacción se expresaron relativas a la síntesis de inosina, corno se ha descripto en Ia

Figura 5.1.

Como se muestra en Ia Figura 5.3, se observaron altos rendimientos y actividades en la

síntesis de 2'-desoxirribonuc|eósidos pírimidínicos, en todos los casos ensayados. Como se ha

descripto en bibliografia, la TP es especifica con respecto a los azúcares, para la 2-desoxirribosa 1

fosfato, mientras que la especificidad por las bases pirimidinicas es más Iaxa. Se ha reportado que

Ia posición 5 del anillo pirimidinico puede ser intercambiada por hidrógeno, metilo o amino con

efectos despreciables en los valores de actividad“. En el caso de la síntesis de nucleósidos

4 a) Razzel, E.; Khorana, H.; Bíochim. Biophys. Acta ,1958, 28, 562; b) Razzel, E.; Casshyap, P.; J. Biol. Chem., 1964, 239,1789

186 Capitulo 5 - Síntesis quimioenzimática de nucleósidos

utilizando bases tipo 5-halogenouracilo, se determinó que disminuye significativamente la

actividad en comparación con la utilización de timinas. Este efecto puede deberse al reemplazo del

grupo en la posición S por un sustituyente voluminoso, dificultando estéricamente la unión de la

base modificada al centro activo de la TP (54 y 55, Figura 5.3).

H0-il>—o H0 Bo. o H B 0

PPM. NPH0 Tris HO

Comp. N' NP Ba_se Act. Rel. (96) Rend. (%) Tiempo (hs)52 TNP uracllo 148 75 2

53 TNP tlmlna 204 75 2

54 TNP S-F-dU 145 60 2

55 TNP S-Br-dU 104 41 2

56 PNP hlpoxantlna 5 16 S57 PNP fi-SH-Pu 5 15 S

o o O oF Br

I NH I NH I I I NHN/Ko NÁO N o NÁoH H H H

Uruilo Tlnin SF-U SBr-U

o SH

N N \

</ I NH </ I N

a N) u a)Hiponllin ‘_SH_P.

Figura 5.3. Reacción de transglicosidación enzimática utilizando 2-desoxi-D-ribosa S-fosfato y bases.

En el caso de la preparación del compuesto 55 (Figura 5.3) mediante el uso de las

condiciones de reacción óptimas descriptas en el capítulo 4, se observó la aparición del producto

de reacción deshalogenado en la posición 5, Ia 2'-desoxiuridina (—,Flgura 5.5), junto con el

producto deseado, S-bromo-2'-desoxiuridina (-- , Figura 5.5). Una posible explicación de Ia

aparición de este producto secundario puede ser la formación del nucleósido desbromado

5 Panova, N.; Alexeev, C.; Kusmichov, A.; Shchevelva, E.; Gavryshov, K.;Polyakov, A.; Kritzyn, A.; Esipov, R.; Miroshnikov,A.; Biochemístry , 2007, 72, 21

¡00.00.0000.00...OOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOO*

Capítulo 5 - Síntesis quimioenzimática de nucleósidos

mediante una reacción de deshalogenación quimica, tanto en la base (5-bromouracilo) como en el

nucleósido (5-bromo-2'-desoxiuridina), promovida por el B-mercaptoetanol (200 mM) presente en

el medio de reacción. Al ser el bromo localizado en Ia posición C-5, un grupo atractor de

electrones, se verá incrementada la reactividad del C-6 para reacciones de adición nucleofílica. Por

lo que se propone como posible mecanismo de la formación del subproducto desbromado, en

primer lugar, el ataque nucleofílico del B-mercaptoetanol a la posición C-G, formándose dos

posibles intermediarios tíólicos (6-TUy 5,6-TU, Figura 5.4). Luego, al ser ahora el grupo halógeno

en Ia posición C-S,un grupo saliente muy activo en los intermediarios, se propone la formación del

producto final mediante reacciones de eliminación de los sustituyentes azufrados.

Se han repertado reacciones similares del S-bromo-2'-desoxiuridina (S-Br-U, Figura 5.4)

con cisteína, en las cuales se ha explicado la formación de 2'-desoxiuridina (U, Figura 5.4) por

eliminación de disulfuro de dihidrógeno a partir de los intermediarios 6-tiol (6-TU, Figura 5.4) y

5,6-ditiol (5,6-DTU, Figura 5.4) formados por adición nucleofílica del compuesto azufrado al 5

bromo-Z'-desoxinucleósido°.

HU O-TU 5.6-DTU

O O 0

El BI RVS

NH M1 NH

T 0 R‘S ï 0 ES T OR R R

Figura 5.4. Reacción de deshalogenación qulmica promovida por compuestos azufrados.

Con el objeto de maximizar el rendimiento de la reacción de síntesis del S-bromo-2'

desoxiuridina, se evaluó el efecto de Ia concentración del B-mercaptoetanol en los valores de

6Ver por ejemplo: a) Szabo, L.; Kalman, T.; Bardos, T.; J. Org. Chem, 1970, 35, 1434, b) Pal, 8.; J. Am. Chem. Soc; 1918,100, 5170; c)Chikuma, T.; Negishi, K.;Hayatsu, H.; Chem. Pharm. Bull., 1973, 95, 2312

- Capítulo5- Síntesisquimioenzimáticadenucleósidos

dicha variable. Como se observa en la Figura 5.5, mientras que la actividad relativa (se considera

100 % el valor de máxima actividad) aumenta con el incremento del agente reductor, como se

describió previamente en el capítulo 4, el rendimiento alcanza un valor máximo a 50 mM de B

mercaptoetanol, obteniéndose la 5-bromo-2'—desoxiuridinacon un 100 % de rendimiento.

+ s-an-duusmMmunioebnol)

- O-dU(15m mrcnluw)

+ s-m-dwsomMmrtnloennol)

- A —dutsom meuwloeunol)

+ s-ai-auuoomMminploclanol)

- I -dU(lm)mM«¡culminan

O S-Bl-dUHSOmM"mc-pluma)

0 dUflSOmMmruploeund)

— s-aniuuoomMMIKWIMW)

- e -dU(100mMmrcqfloeuool)

Tlünpo (mh)

B-Mercaptoetanol (mM) Act. Rel. (96) Rend. (96) Tiempo (hs)

25 38 68 15050 67 100 150

100 71 BO 150150 81 S7 150200 100 41 120

Flgura 5.5. Efecto de la concentración de B-mercaptoetanol en la síntesis de S-bromo-2'-desoxiuridina.

El incremento en la concentración de B-mercaptoetanol, aumenta la proporción del

nucleósido 2'-desoxiuridina en Ia mezcla de reacción (----,Figura 5.5), obteniéndose de esta forma,

rendimientos menores con el aumento de la concentración del agente reductor.

Finalmente, se evaluó la actividad y el rendimiento de la reacción de síntesis de 2'

desoxinucleósidos purínicos, empleando dos bases purínicas: hipoxantina y 6-mercaptopurina.

Ambos casos dieron resultados desalentadores, observándose en ambas reacciones rendimientos

aproximadamente del 15%, así como actividades inferiores a las obtenidas en el caso de la síntesis

de nucleósidos pirimidínicos. Esto se debió, posiblemente, a Ia especificidad de la PNP de bajo

peso molecular con respecto a los azúcares 1-fosfato.

0......0.0.0.0...0.0.0.0...OOOOOOOOOOOÓOOOOOÓOO00‘

189 Capítulo 5 —Síntesis quimioenzimática de nucleósídos

5.2.4-Síntesis enzimática de arabínonucleósidos

Finalmente, se utilizó arabinosa 5-fosfato como sustrato para la reacción de glicosidación

catalizada por la PPM y PNP con hipoxantina, adenina, 6-mercaptopurina y 1,2,4-triazoI-3

carboxamida (58-61, Figura 5.6). Ha sido reportado previamente7 que los arabínonucleósidos son

sustratos menos activos que los correspondientes nucleósídos ribósidos en Ia reacciones de

hidrólisis utilizando PNP. En esa publicación se ha justificado este hecho experimental mediante el

empleo de experimentos ¡n silico, demostrándose en los mismos, la ausencia de uniones puente

de hidrógeno entre el hidroxilo en la posición 2 del esqueleto arabinósido y los aminoácidos del

sitio activo de la enzima. Esta asunción podría explicar las bajas actividades y rendimientos

obtenidos para las reacciones de síntesis de arabínonucleósidos, así como también podría explicar

la baja actividad observada en el caso de los ensayos realizados con desoxirribosa S-fosfato. Sólo el

compuesto 58 (Figura 5.6) fue obtenido con un rendimiento del 46%, debido a que es el sustrato

(hipoxantina) más activo para esta enzima. Posteriormente, se ensayó la síntesis del nucleósido 58

(Figura 5.6), variando la cantidad de arabinosa 5-fosfato, con el objeto de evaluar la cinética del

sistema enzimático acoplado en la síntesis de dicho nucleósido. Como se puede observar en la

Figura 5.7, la velocidad inicial aumenta en forma lineal con el aumento de la concentración de

sustrato (si se supone cine'tica del tipo de Michaelis Menten, no se ha alcanzado el valor de

velocidad máxima a las concentraciones de sustrato analizadas). Sin embargo el rendimiento de la

reacción alcanza un valor máximo en todos los casos analizados, posiblemente debido al efecto

inhibitorio del fosfato inorgánico liberado como subproducto de Ia reacción.

7 Bennet, E.; Li,C.; Allan, P.; Parker, P.; Ealick, S. ;J.Biol. Chem., 2003, 278, 47110


9HO-lï-O H0 B

. o B O

PPM, PNPHO n-s H0

Comg. N' NP Base Act. Rel. %) Rend. (96) TÍEITIEO(hs)

58 PNP hlpoxantlna 1.2 46 4659 PNP adenlna 0.5 8 96

60 PNP 6-SH-Pu 0.4 7 24

61 PNP TCA 0.2 19 72

— 0 NH, o _

N NH N \N NÏJLNH< ' 2 <’ I 2 <’ N' ’

H N ll N ll”

"¡palillíll Adnin TCA

SH

N \

<a N)

¿SH-PI J

Figura 5.6. Reacción de transglicosidación enzimática utilizando D-arabinosa 5-fosfato y bases.

Para maximizar los valores de actividad y rendimiento de la reacción de síntesis de

arabinonucleósidos, se deberia acoplar la PPMsobreexpresada en nuestro laboratorio con NPs de

diversos orígenes, con el objeto de hallar la NPque acepte en mayor medida D-arabinosa 1-fosfato

como sustrato. Diversos estudios realizados por nuestro grupo8 demostraron que es posible

sintetizar arabinonucleósidos utilizando células enteras de E coli BL21.Por lo que se proyecta, en

un futuro, ensayar Ia síntesis de arabinonucleósidos utilizando corno biocatalizador el sistema

enzimático acoplado formado por la PPM y células enteras de E. coli BL21.

a Rogert, M; Martinez, N.; Porro, 5.; Lewkowicz, E.; Iribarren, A.; Molecules, 2000, 5, 535.

191 Capitulo 5 —Sintesis quimioenzimática de nucleósidos

0 007

0.00“ <

ooo; Jmidi mid-¿71%

AclvndadlmM.m|n"

00055 ‘

0.005 n

[D-a'uirua S-fshlol I rnM

Figura 5.7. Efecto de la concentración de arabinosa S-fosfato en la velocidad inicial de la reacción de síntesisdel nucleósido Ara-l.

5.3- Conclusiones

Se ha demostrado exitosamente la versatilidad de la estrategia quimioenzimática de

sintesis de nucleósidos tanto naturales como modificados, utilizando como biocatalizador el

sistema enzimático acoplado (PPM + NPs), partiendo de las pentosas S-fosfato sintetizadas

previamente y bases comerciales.

De esta forma se han obtenido con altos rendimientos (70-100%) los nucleósidos:

adenosina, inosina, 6-mercaptopurín ribonucleósido, 1,2,4-triazol-3-carboxamida ribonucleósido

(Rivabirina), timidina, 2'-desoxiuridina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina y 5-bromo-2'-desoxiuridina.

Asimismo se han obtenido diversos nucleósidos con moderados rendimientos (30-50%), tales

como la guanosina, 2-amino-6-cloro-purín ribonucleósido, 2-fluoroadenosina y hipoxantin

arabinonucleósido. Finalmente se han obtenido con bajo rendimiento (10-30%) los siguientes

nucleósidos: adenin arabinonucleósido, 6-mercaptopurín arabinonucleósido, 1,2,4-triazoI-3

carboxamida arabinonucleósido, 2'-desoxiinosina y 2-amino-6-cloropurin 2'

desoxirribonucleósido.

Resta ensayar la sintesis de nucleósidos arabinósidos utilizando purín nucleósido y/o

timidin fosforilasas de diversos origenes.


0......OO...OO...O...OOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0.000004

193 Capítulo 6 —Inmovilización dela PPM y del sistema enzimático acoplado

29Minmovilización de la PPM y co-inmovilización de la PPM y PNP


Este capítulo tiene como objetivos la inmovilizacióneficiente de Ia enzima sobreexpresada

para este trabajo de tesis (PPM), y la co-inmovilización del sistema enzimático acoplado (PPM-NP)

utilizado en la síntesis de nucleósidos naturales y/o modificados, como se describe en el capítulo

5. El objeto de este proceso es la obtención de un biocatalizador eficiente para potenciales

aplicaciones tecnológicas.

Para lograr este objetivo, se han analizado diversas metodologías de inmovilización, así

como diversos soportes. En particular se estudió la factibilidad técnica de inmovilizar dichas

enzimas por encapsulación en soportes vitreos híbridos (SiOz+ polímero), elaborados mediante

tecnología sol-gel, utilizando como precursores: tetraetilortosilicato (TEOS) y tetra(2

hidroxietiljortosilicato (THEOS),y como auxiliares poliméricos: alcohol polivinílico y quitosano. Se

trataron los mismos por el proceso denominado ISISA(Ice-Segregatíon-Induced-SeU'-Assembly),

con el objeto de crear materiales híbridos jerárquicos con mejores propiedades mecánicas y de

transp0rte de masa.


6.2.1- Selección de la técnica de inmovilización

Se realizaron una serie de experimentos preliminares, con el objeto de explorar qué

estrategia de inmovilización (unión covalente, adsorción o atrapamiento) era la más adecuada

para la enzima de interés (PPM). Los ensayos fueron realizados inmovilizando únicamente esta

enzima, dejando en solución la NP correspondiente. Se utilizó como ensayo modelo, para evaluar

la actividad del nuevo biocatalizador obtenido, la conversión de ribosa S-fosfato e hipoxantina a

inosina.

En primer lugar se evaluó la estrategia de inmovilización por unión covalente de la enzima

a un sop0rte sólido. Para estos ensayos se seleccionó, en primer lugar, un soporte comercial

denominado amino sefarosa (GE, Healthcare Life Sciences) que contiene grupos aminos

194 É Capítulo 6 - inmovilización de la PPM y del sistema enzimático acoplado

disponibles unidos, a través de un espaciador de brazo largo, a una resina de agarosa

entrecruzada. Elacoplamiento de la enzima al soporte se realizó por medio de la activación de los

grupos carboxilos de la enzima con una carbodiimida soluble en agua (1-[3-(dimetilamino)propil]

3-etilcarbodiimida, EDC),quedando unida la misma al soporte por medio de la formación de

enlaces amida. Se ensayaron diversas condiciones variando Ia proporción enzimazresina, utilizando

las condiciones recomendadas por el fabricante. Se observó, en todos los casos analizados, que la

enzima inmovilizada se inactivaba por esta metodología. Esta inactivación de la PPM puede

deberse a la posible presencia de grupos carboxilos en el sitio activo de la enzima que

reaccionaron con este agente, alterándose la estructura de dicho sitio. Debido a esta suposición,

se intentó inmovilizar la enzima mediante la activación del soporte, utilizándose para esto

glutaraldehido como agente activante. Esta inmovilizaciónnuevamente condujo a biocatalizadores

inactivos. Por este motivo se reemplazó la resina de amino sefarosa por perlas de quitosano para

intentar lograr la inmovilización por adsorción. Asimismo se intentó inmovilizar la enzima a este

soporte por unión covalente con los agentes activantes mencionados anteriormente.

Elquitosano es un polisacárido lineal compuesto por dos tipos de unidades estructurales

distribuidas de manera aleatoria a lo largo de Ia cadena, la N-acetiI-D-glucosamina y la D

glucosamina, las cuales se encuentran unidas entre sí por enlaces del tipo B(1->4) glicosídicos. El

quitosano es soluble en soluciones acuosas ácidas (pH< 6), encontrándose cargado positivamente

en dichas soluciones. Lasperlas se prepararon utilizando el método de neutralización que consiste

en Ia precipitación del quitosano, al poner en contacto una solución ácida de de este polímero con

álcalí y etanol. Este último se agrega para facilitar la precipitación de las perlas de quitosano,

debido a la baja solubilidad del polímero en este solvente. Para llevar a cabo la inmovilización, en

primer lugar, se prepararon las perlas de quitosano por goteo, a velocidad controlada, de una

solución ácida de quitosano (2.5% en ácido acético 0.3 M, pH=4.5) sobre una solución 1 M de

NaOHque contenía 26 % (v/v) etanol. Para lograr el tamaño y la forma deseado de las perlas se

procedió al goteo mediante el uso de una jeringa con presión positiva constante. Las perlas de

quitosano se mantuvieron en Ia solución de NaOH/etanol para permitir el endurecimiento de las

mismas. Una vez logrado esto, se Iavaron exhaustivamente con agua destilada hasta pH neutro y

con diversas soluciones amortiguadoras. Se realizaron dos procedimientos diferentes para lograr

la inmovilizaciónde la enzima sobre este soporte:

.000...0....OO...OOOOOO...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.4

V195,z Capítulo 6 - Inmovilización de la PPM y del sistema enzimático acoplado

- Inmovilización por unión covalente: Se trabajó con dos agentes activantes para

modificar el soporte: la carbodiimida (EDC)para la activación de los grupos hidroxilo y

el glutaraldehido para la activación de los grupos amino

- Inmovilización por adsorción: se intentó aprovechar Ia alta afinidad de este soporte

por las proteínas.

Con el tratamiento con glutaraldehido no se obtuvieron biocatalizadores activos, al igual

que para la inmovilización sobre el sop0rte de aminosefarosa. En cambio, los biocatalizadores

obtenidos con la carbodiimida y sin el uso de agente activante brindaron resultados positivos y

similares. Esta similitud en la actividad de los biocatalizadores obtenidos por las dos estrategias de

inmovilización mencionadas sugiere que la PPM no se ha unido covalentemente al soporte, sino

que fue adsorbida sobre el soporte debido a la alta afinidad de éste por las proteínas.

Lasuposición de que la enzima se haya adsorbido sobre el soporte y no se encuentre unida

covalentemente se basa en que sólo se ha encontrado un reporte en bibliografíaque demuestre el

uso de carbodiimidas para la activación de grupos hidroxilos1en soportes derivados del quitosano,

siendo ésta utilizada casi exclusivamente para la activación de carboxilos.

Se decidió repetir el ensayo de inmovilización de la PPM p0r adsorción para verificar su

reproducibilidad. Se obtuvieron valores de actividad de diversa magnitud, mostrando la pobre

reproducibilidad de este biocatalizador. Se intentaron cambiar parámetros para obtener

resultados más constantes pero no se logró la reproducibilidad buscada.

Siendo infructuosos los intentos de inmovilización de la PPM mediante Ia metodologia de

unión covalente y adsorción, se decidió modificar la estrategia evaluándose la inmovilización por

atrapamiento de la PPM en diversos materiales. Se decidió ensayar, en primer lugar, el

atrapamiento en perlas de agar. Las mismas se prepararon por goteo a velocidad controlada de

una solución enzimática en agar al 4 % (a 50 °C), sobre un baño de aceite de girasol comercial,

seguido de un lavado exhaustivo del biocatalizador, para así remover los remanentes del aceite de

girasol y acondicionarlo con la solución amortiguadora utilizada para medir la actividad enzimática.

Se ensayó entonces la reacción modelo de síntesis de inosina. Se comparó luego la estabilidad

operacional de la enzima inmovilizada en un proceso batch repetitivo. Aunque la actividad fue

aceptable en el primer uso del biocatalizador (250 pM.min".mgprot'1), cayó a un 18% de la inicial

en el segundo uso y a un 1.7 % en el tercero. Ladisminución de la actividad del biocatalizador con

los usos se debió presumiblemente a la Iixiviaciónde la enzima de las perlas de agar.

‘ Chiou, s.; Wu, w.; Biomateríals, 2004, 25, 197

196 Capítulo 6 —lnmovilización de la PPM y del sistema enzimático acoplado

Considerando que un material con poros de menor tamaño podría ser una alternativa para

resolver la pérdida de enzima por Iixiviación, se ensayó la encapsulación de la PPM dentro de

matrices de órgano-silicatos preparadas mediante la metodología de procesamiento sol-gel a bajas

temperaturas (en forma de hidrogeles), con el posterior tratamiento del biomaterial para Ia

obtención del xerogel, por la metodologia ISISAZ,descripta en la introducción.

Se ha utilizado en este trabajo un sol de sílica acuoso sintetizado a partir del precursor

TEOS, en el cual se ha añadido una entidad soluble, el alcohol polivinílico (PVA) previo a la

polimerización del mismo. La mezcla del aditivo y sílica favorece la formación de entramados

interpenetrados (IPN),debido a Ia condensación de los grupos silanoles con los hidroxilos del PVA,

resultando en la formación de enlaces Si-O-C.Asimismo la adición de PVA,protege a la enzima de

la inactivación (ésta puede deberse a la desnaturalización de la enzima por su interacción con los

grupos silanoles del soporte), promueve la retención de moléculas de agua alrededor del

biocatalizador, favorece los efectos de dispersión de las moléculas de enzima, facilitando de esta

forma el transporte de masa, y por ultimo actúa como crioprotector durante el congelamiento

utilizado en el procesamiento del material. A su vez se obtienen materiales menos quebradizos

que los obtenidos sin su agregado.

Con objeto de optimizar la estrategia de inmovilización, la actividad de la PPM fue

ensayada utilizando un conjunto de sol-geles con diversas proporciones de TEOS y PVA,

manteniendo constante Ia suma de ambos, en un valor igual a 8 %’.

La disminución en el contenido de PVAcon el consecuente aumento del porcentaje de

TEOSafectó profundamente la actividad de Ia PPM (Tabla 6.1). Esto puede ser explicado por el

efecto desnaturalizante de Ia sílice cargada negativamente sobre la estructura de la enzima y a los

varios efectos protectores del auxiliar polimérico (PVA)anteriormente citados. Como se puede

observar en la Tabla 6.1, Ia actividad es nula cuando el material es sintetizado sin el auxiliar

polimérico y es máxima cuando éste es preparado sin el agregado de sílica, siendo la última, el 11

% de la actividad de Ia enzima en solución. También se pudo observar que los materiales

preparados con sílica pura eran extremadamente quebradizos, tornándose más resistentes y

gomosos a medida que se aumenta la proporción de PVA.

zGutierrez, M.; joba'ggy, M.; Rapun, N.; Ferrer, M.; Del Monte, F.; Adv. Matan, 2006, 18, 11373 Long, J.; Hutcheon, 6.; Cooper, A.; .I.Comb. Chem., 2007, 9, 399

1.... Capítulo 6 - lnmovilización de la PPMy del sistema enzimático acoplado

N' 96'I’EOS ,6 WA Act. Rel ' Rend. 96(24hs)

1 8 0 0.00 0

2 6.4 1.6 0.02 43

3 4.8 3.2 0.05 47

4 4 4 0.06 56

5 3.2 4.3 0.07 60

6 1.6 6.4 0.11 58

7 0 8 0.11 S3

8 0 0 1 88

' Act. Rel.= actividad dela enzima inmovilizada /actividad de la enzima en solución.Laactividad de la enzima en solución fue de 572.5 uM/minmg proteina.

Tabla 6.1. Efecto del % de TEOSy del 96de PVAen la actividad y en el rendimiento de la PPM

inmovilizada en el sistema hlbrido silica/PVA.

Asimismose midió la actividad de la enzima atrapada en los hidrogeles antes y después del

procesamiento ISISAde los mismos, c0n el fin de estudiar el efecto de la exposición de la enzima a

las bajas temperaturas utilizadas por esta metodología (-196°C). No se observó variación en las

actividades relativas en este ensayo, por lo que es posible concluir que el procesamiento de los

biomateriales a dichas temperaturas no afecta la actividad de la PPM,siendo el atrapamiento de la

misma, la que disminuye Ia actividad con respecto a Ia enzima en solución.

Como se describió en el capítulo 4, la PPM posee un requerimiento absoluto del agente

reductor B-mercaptoetanol. Este agente permite el plegamiento correcto de la estructura nativa

de la proteína siendo, de esta forma, activa. En los ensayos preliminares descriptos anteriormente

la enzima era atrapada sin el agregado del agente reductor, siendo éste añadido directamente en

el medio de reacción en los ensayos de actividad. AI encontrarse restringida la movilidad de la

enzima por su encapsulación en los materiales porosos, se evaluó si parte de la pérdida de la

actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima en solución, se podía deber al

atrapamiento de la enzima en su conformación no nativa, no recuperando la misma su estructura

activa ante el posterior agregado de B-mercaptoetanol, por dicha restricción en su movilidad. Por

lo que se decidió llevar a cabo los bioinmovilizados agregando, previo a la etapa de polimerización,

el agente reductor, con el objeto de permitir el correcto plegamiento de la enzima antes de Ia

confinación de Ia misma en el material poroso. La actividad de la PPM inmovilizada en estos

soportes con el agregado del agente de reductor previo y posterior al paso de polimerización fue

- Capítqu6- lnmovilizacióndelaPPMydelsistemaenzimáticoacoplado

la misma. Esta similitud en las actividades de los biocatalizadores inmovilizados se puede deber a

que los poros del material son los suficientemente grandes para permitir la libre movilidad de Ia

enzima, pudiendo adquirir su conformación nativa una vez inmovilizada. Por lo que la pérdida de

actividad al ser inmovilizada no se debe a un incorrecto plegamiento dentro de la matriz del sol

gel.

Otros motivos por los cuales puede darse la pérdida de actividad de la enzima inmovilizada

con respecto a la libre son:

- la Iixiviaciónde la enzima del material por un tamaño de poro elevado

- una menor difusión de los reactivos y productos

- Ia interacción entre el soporte y la enzima

- Ia liberación de etanol (desnaturalizante para las enzimas) producida en la etapa de

hidrólisis del precursor TEOS.

A continuación, se evaluó la estabilidad operacional de los sistemas inmovilizados,

analizando la actividad y el rendimiento de la reacción de síntesis de inosina, a través de los

repetidos usos de los biocatalizadores obtenidos.

Se evaluaron los biomateriales que dieron los mejores valores de actividad en el ensayo

preliminar (Tabla 6.1, condiciones experimentales de las entradas N° 4, S, 6 y 7). La actividad

disminuyó en todos los casos analizados con el re-uso de los biocatalizadores(Flgura 6.1) hasta ser

nula en el cuarto uso (dato no mostrado), probablemente debido la Iixiviaciónde la enzima debido

a la desintegración parcial del soporte.

1,2

1 +3uso

. 0.8 . +2USO

El3 0.6

0.4 0'2- /"‘0 A . . .

35 45 5.5 6.516 PVA

'UJU, : Actividad de la PPM lnmovillzada en el uso n/ actividad dela enzima lnmovillzada en el primer uso

Figura 6.1. Estabilidad operacional de la PPM inmovilizada en el sistema hibrido slIica/PVA

199 Capítulo 6 - lnmovilizacióndela PPMy del sistema enzimático acoplado

De todas las estrategias analizadas, se concluyó que Ia inmovilizaciónpor atrapamiento de

la PPM en soportes vitreos híbridos, elaborados mediante tecnología sol-gel, con el posterior

procesamiento mediante la metodología denominada ISISAera la más prometedora. En este

sentido, se decidió intentar optimizar el tamaño de poro (por variación del precursor y del

polímero auxiliar) para aumentar la estabilidad operacional del biocatalizador inmovilizado y Ia

actividad de la enzima inmovilizada, y desarrollar precursores "libres de etanol” para así mejorar

las propiedades dela enzima atrapada.

6.2.2- lnmovilización en compuestos híbridos de guitosano-sílica mr la tecnología sol

gel.

Recientemente se han encontrado metodologías para el procesamiento de los sol-geles

biocompatibles y más suaves que las descriptas anteriormente en este capítulo. Las mismas se

basan en el uso de precursores modificados para la inmovilización de proteínas activas. Las

principales desventajas del procesamiento utilizando como precursor TEOS,son la presencia del

etanol liberado durante la hidrólisis y la necesidad de cambios abruptos en el pH para el inicio de

la etapa de polimerización, ambos posibles efectos perjudiciales en la actividad de la enzima

atrapada. Para solucionar los mismos se desarrollaron nuevos precursores biocompatibles, como

el THEOS.La liberación de un alcohol "amigable" a la enzima atrapada (etilenglicol) disminuye la

posible desnaturalízación proteica. Otra ventaja de estos precursores es que pueden ser disueltos

directamente en agua y condensan a pH neutros, eliminando la necesidad de alteraciones

abruptas en el pH durante el procesamiento del gel‘. Estos materiales de partida, asimismo,

generan materiales con menor grado de encogimiento, menor diámetro de poro y propiedades

mecánicas mejores que los materiales basados en TEOSS.En particular el precursor modificado

THEOSpuede ser preparado fácilmente por medio de reacciones de transesterificación del TEOS

con etilenglicol.

Con el objeto de obtener materiales mecánicamente más resistentes, y de menor tamaño

de poro se modificó, asimismo, el auxiliar polimérico adicionando a los sol-geles de sílica,

quitosano en lugar de PVA.Es sabido que la presencia de quitosano, una molécula policatiónica,

‘ Chery, H.; Tameki, R.;J. Am. Chem. Soc., zooo, 122, 10063sBrandhuber, D.; Torma, V.; Raab, C.; Peterlik, H.; Kulak, A.; Husing, N. Chem. Mat., 2005, 17, 4262

200 Capítulo 6 —lnmovilización dela PPMy del sistema enzimático acoplado

puede actuar como agente nucleante para la silica, debido a la formación de enlaces puente de

hidrógeno entre los grupos aminos del quitosano y los hidroxilos de los silanoless.

6.2.2.1-f‘“ ” v ‘ ' " del prggrsngi-IEQ;

Se obtuvo el precursor THEOSmediante una reacción de transesterificación del TEOScon

etilenglicol (Figura 6.2). Fue posible directamente reemplazar al grupo etoxilo en el TEOS,sin el

uso de catalizadores. A Ia vez, este diol fue sometido a Ia mencionada reacción de

transesterificación sin la necesidad de solventes. La reacción se llevó a cabo bajo atmósfera inerte

a 150°C utilizando directamente TEOS y etilenglicol, recién destilados, con remoción de

subproducto formado, etanol (por destilación), para así permitir el avance de Ia reacción. Se

consideró Ia reacción finalizada, cuando se halló la misma estequiométricamente balanceada, esto

es, cuando los equivalentes de etanol liberados igualaron aproximadamente a los grupos etoxilos

en el material de partida. Asimismo,se demostró espectroscópicamente el intercambio completo

del alcohol, debido a que, en general, no se evidenciaron grupos etoxilos en los espectros de RMN

de lH y 13C.Una vez alcanzado el rendimiento máximo, se removió el remanente de etilenglicol por

destilación a presión reducida, para así obtener al THEOScomo un aceite transparente, con un 80

% de pureza.

Ho/\/0H /\/OHSi o/\ ————> s¡ o4

Figura 6.2. Preparación de THEOS.

La síntesis fue diseñada para minimizar la presencia de silanoles parcialmente

condensados (siloxanos) en el producto final. Por ello, se destilaron ambos reactivos, para eliminar

cualquier remanente de agua, para así obtener únicamente especies Q°. De Io contrario, la

reacción de transesterificación sería acompañada por reacciones de hidrólisis y condensación,

para dar las especies Q1, Q2 y Q3 en el producto (Q“ es una forma de expresar el grado de

condensación de los tetraedros Si04,es decir, del número de átomos de oxigeno compartidos por

dos tetraedros (o la conectividad entre tetraedros), donde n corresponde al número de átomos de

° Wang, G.; Zhang, L;.J. Phys. Chem. a, zoos, 11o, 24864

201 Capítqu 6 - lnmovilización de Ia PPMy del sistema enzimático acoplado

oxígeno compartidos). Aunque, por limitaciones experimentales, no fue posible realizar

experimentos de RMN de 25’Sipara confirmar esta suposición. AI no ser necesario el uso de

catalizadores para Ia transesterificación descripta, se evitó Ia contaminación posible de la sílica

resultante.

ElTHEOSfue totalmente soluble en agua, con un tiempo de gelificación en solución acuosa

neutra de varias horas, dependiendo de Ia concentración del precursor en la solución (a

temperatura ambiente). Tal como se citó anteriormente las moléculas de quitosano actúan como

centro de nucleación, acelerándose los tiempos de gelificación enormemente, efecto combinado

con el aumento de pH. A concentraciones de quitosano constante (1%), el tiempo de gelificación

dependió de Ia concentración del precursor, siendo de 8 minutos para una concentración de sílice

del 12%, 6 minutos para 20% de sílice y de 3 minutos para 40% de sílice. Estos ensayos se

realizaron con soluciones de buffer Tris pH=8 con una concentración final en la solución de 100

mM.

Por último cabe destacar que al mezclar el precursor THEOScon Ia solución acuosa ácida

de quitosano, no se observó precipitación ni separación de fases, mostrando una buena

compatibilidad.

6.2.2.2- lnmovilización de la PPM: Efecto de la ‘ “ de THEOSy guitosano en la

inmovilización por sol-gel.

Teniendo en cuenta que Ia polimerización del precursor THEOSes menos desnaturalizante

que la análoga basada en TEOS,se evaluaron concentraciones más elevadas del precursor de

partida. Enprimer lugar, se prepararon diversos sol-geles a concentración constante de quitosano,

variando el porcentaje de THEOSentre un 10% y un 40%, fijando eI pH de la inmovilización en un

valor igual a 8. La concentración de quitosano en el material se vio limitada al encontrarse el

mismo disuelto en una solución de pH ácido, lo cual podría afectar Ia actividad enzimática, por lo

que dicha concentración fue fijada en un valor de 0.8% (Tabla 6.2).

En estos experimentos (Tabla 6.2) se observó que un aumento en el porcentaje de THEOS

dísminuía Ia actividad de la PPM inmovilizada. Esto puede ser explicado por el efecto

desnaturalizante de Ia sílicacargada negativamente sobre la estructura de la enzima, como se citó

anteriormente para el caso de Ia enzima inmovilizada en sol-geles basados en el precursor TEOS.

202 Capítulo 6 —Inmovilización de la PPM y del sistema enzimático acoplado

Ensegundo lugar, se estudió la influencia del contenido de quitosano en la actividad de la

PPM inmovilizada, dejando constante la concentración de THEOSen el valor de máxima actividad

obtenido en los experimentos previos (10%,Tabla 6.2). Se puede observar que un aumento en el

porcentaje de quitosano disminuye la actividad de la enzima (4-6, ïabla 6.2). Esto puede deberse a

una disminución en el pH de la inmovilización. Esto ha sido verificado experimentalmente,

observándose que al aumentar la cantidad de la solución ácida de quitosano, el pH final

disminuye, siendo menor a 6 en el caso de los geles preparados con 0.8 % de quitosano.

También se exploró el efecto del pH de la solución amortiguadora empleada durante el

proceso de inmovilización, fijando las concentraciones de quitosano en 0.4 % y THEOSen 10 %.

Cuando el pH fue elevado de 8 a 8.5, la actividad enzimática relativa aumentó de 0.26 a 0.46

(Tabla 6.2, entradas 5 y 7), mientras que a pH 9.0, la actividad relativa disminuyó (Tabla 6.2,

entrada 8). Consecuentemente, el pH de Ia solución amortiguadora empleada durante el proceso

de inmovilizaciónfue fijado para todos los efectos a 8.5.

Al comparar los valores de actividad de los biocatalizadores obtenidos utilizando TEOS

como precursor del sol-gel y PVAcomo auxiliar polimérico, con respecto a los obtenidos mediante

el uso de THEOSy quitosano, se observó que la actividad relativa de los últimos aumentó

considerablemente (10 %, en el caso de los materiales basados en TEOSa 50 % en el caso de los

basados en THEOS,con respecto a la enzima en solución) posiblemente debido a los efectos

perjudiciales descriptos para ei TEOS con respecto al uso de THEOS. Esto fue confirmado al

comparar los valores de actividad relativa de los experimentos realizados en ausencia del auxiliar

polimérico (Tabla 6.1 y Tabla 6.2). En el caso de los sistemas inmovilizados obtenidos a partir del

precursor TEOSsin agregado del auxiliar polimérico no se observó actividad (Tabla 6.1, entrada 1),

mientras que en el caso de los obtenidos utilizando THEOScomo precursor sin agregado del

auxiliar, se observó una actividad relativa de 0.59 (Tabla 6.2, entrada 4).

Capitulo 6 - Inmovilizacióndela PPMy del sistema enzimático acoplado

N‘ % quitosano 96THEOS pH lnmov. Act. Rel.’ Rend. %

1 0.8 10 8 0.04 21

2 0.3 20 8 0.02 16

3 0.3 40 8 0.01 10

4 0 10 8 0.59 85

5 0.4 10 8 0.26 73

6 1.3 10 3 0.01 8

7 0.4 10 3.5 0.46 93

8 0.4 10 9.0 0.31 37

' Act. Rel. = actividad dela enzima inmovilizada /actividad dela enzima en solución. Laactividad delaenzima en solución a pH=8,fue de 1130 uM/minmg proteina

Tabla 6.2. Efecto del % de THEOS, del % de quitosano y del pH de inmovilización en la actividad y en el

rendimiento dela PPM inmovilizada.

Posteriormente, se evaluó la estabilidad operacional de los sistemas inmovilizados,

analizando Ia actividad y el rendimiento de la reacción de síntesis de inosina, a través de los

consecutivos usos de los biocatalizadOres obtenidos. Se analizó el desempeño del biocatalizador

con los re-usos de los sol-geles de quitosano/THEOS/PPM con contenidos de quitosano entre 0

0.6%.

Como se observa en la Figura 6.3, los mejores resultados fueron obtenidos en los sistemas

inmovilizados con un contenido de quitosano de 0.4 %, mientras que con contenidos de 0.2 % y

0.6%, la actividad disminuyó abruptamente en los primeros usos, perdiéndose completamente en

el quinto. En el caso de los sistemas inmovilizados en sílica pura se observó un descenso abrupto

de Ia actividad luego del primer uso, no observándose actividad aparente luego del segundo uso

(dato no mostrado). Los sol-geles obtenidos con sílica pura mostraron una menor resistencia

mecánica, siendo quebradizos, Io que explicaría la ausencia de estabilidad operacional. Como se

observa en la Figura 6.3, la actividad desciende abruptamente luego del primer o segundo uso,

para mantenerse luego constante con los posteriores usos, en el mejor caso estudiado (0.4%).Esta

observación se debe posiblemente a la pérdida de parte de la enzima con los usos, que se hallaba

débilmente adsorbida en el soporte.

204 Capítulo 6 - Inmovilización de la PPMy del sistema enzimático acoplado

'Í////////////. |IIl|II|||l|IIIl|I \\\Y IIIIlIllIIlllllllll

Umlcromollmlnmg

08555555

N' reusos

IE 0.2%quit. E 0.4%quit. a 0.6%quit. 1

Figura 6.3. Actividadde los sol-geles con diversos contenidos de quitosano en función del número de reusos.

Con respecto a la estabilidad operacional, también se observó que los sistemas

inmovilizados utilizando THEOScomo precursor y quitosano como auxiliar polimérico son mejores

con respecto a los obtenidos a partir del TEOSy PVA(de pobre estabilidad operacional, Figura

6.1). Esto es debido a las ventajas descriptas en la primera sección de este apartado.

Los ensayos de estabilidad operacional fueron realizados midiendo Ia actividad hasta el

máximo rendimiento, lavando exhaustivamente los sol-geles luego de cada uso y liofilizando los

mismos para extraer de esta forma el agua de hidratación. La resistencia mecánica de los

materiales asi como la actividad de los mismos puede verse afectada por el proceso de

Iiofilización, por lo que se decidió evaluar el efecto del secado de los sol-geles en la estabilidad

operacional (Figura 6.4). Los biocatalizadores fueron almacenados, entonces, en solución

amortiguadora luego de ser medida su actividad, para su posterior uso. Se observó que los

sistemas almacenados de esta manera mostraron mejor estabilidad operacional que los lioflizados.

Este efecto puede ser explicado por la desintegración parcial de los soportes generada por Ia

contracción/expansión que acompaña el secado y rehidratación de los mismos con el pr0ceso de

Iiofilización.

Una manera de aumentar la resistencia mecánica de los sol-geles de

quitosano/THEOS/PPM es realizar un recubrimiento, por ejemplo con agar. Esto se realizó por

inmersión de los mismos una solución 2.5 % de agar a 509€ para rápidamente sumergirlos en

aceite de girasol. Aunque la actividad disminuyó en el material recubierto con agar (Figura 6.4),

205 Capítulo 6 —Inmovilización de Ia PPM y del sistema enzimático acoplado

probablemente debido a restricciones difusionales en el caparazón de agar, la disminución de Ia

actividad relativa entre el primer y quinto uso fue menor en comparación con el que no presenta

recubrimiento (Figura 6.4).

Umlcromollmlnmg

N°reusos

G 0-496auit- liofilizado E 0.4% quit. sin liofilizadoI:l 0.4% quit. con recubrimiento de agar

Figura 6.4. Actividad de los sol-geles con 0.4 % de quitosano, con y sin secado y con recubrimiento de agar

6.2.2.3- Co-inmovilizacion de las enzimas PPM y PNP en sol-geles híbridos de guitosano

sílica

Finalmente, se analizó Ia co-inmovilización dela PPM y PNP utilizando sol-geles basados en

el precursor THEOScon el agregado de 0.4 % de quitosano. La co-inmovilización dio por resultado

un biocatalizador activo, sobre el cuál fue evaluada la estabilidad operacional del sistema

enzimático inmovilizado, observándose sorpresivamente que el mismo no perdió actividad

significativa hasta el sexto re-uso (Figura 6.5A-), lo que es marcadamente diferente de Ia

inmovilización dela PPM, dejando ala enzima PNPen solución.

Cabe destacar que no se observó disminución en el valor de la actividad de los sol-geles en

los cuales se ha atrapado simultáneamente la PPMy la PNP, luego del almacenamiento del mismo

por dos meses a 4 °C,mostrando una elevada estabilidad en el tiempo, a diferencia de la enzima

soluble, en Ia cual se observó una marcada disminución dela actividad luego del almacenamiento.

206 Capítulo 6 - lnmovilización de la PPMy del sistema enzimático acoplado

U(uM/minmgprot)

Actividadrelativa

6 7 B 9 10 11

pH

I. Enzimaslibres o PPM+PNPco-inn10vllizadasJ

Figura 6.5. A-actividad de los sol-geles de PPM+PNPcontra el numero de re-usos. B-perfil de actividadcontra pH de las enzimas co-inmovilizadas y de las enzimas libres.

Finalmente, se compararon los perfiles de actividad contra pH de los sol-geles de

PPM+PNPy los de las enzimas en solución (Figura 6.SB-). Ambas curvas resultaron ser bastante

similares, observándose un desplazamiento del pH óptimo a condiciones más básicas (pH 9 para la

enzima en solución y pH 10 para el sistema inmovilizado). Esto concuerda con los reportes

obtenidos que muestran que la unión de la enzima a soportes polianiónicos (dado que la sílica se

encuentra en mayor proporción que el quitosano) resulta en desplazamientos del pH óptimo a

mayores valores.

Debido a estos resultados satisfactorios se decidió evaluar el rendimiento de la síntesis de

guanosina con las enzimas co-inmovilizadas. Como se ha descripto en el capítulo 5, la

biotransformación de guanina en guanosina se encuentra limitada por la baja solubilidad de la

base en agua. Debido al desplazamiento del pH óptimo del sistema inmovilizado a pHs más

207 Capitulo 6 —Inmovilización dela PPM y del sistema enzimático acoplado

básicos, se decidió aumentar el valor de este parámetro en la sintesis de guanosina (a pH=10) para

obtener una mayor solubilidaddela base guanina.

Elrendimiento de la reacción utilizando el sistema co-inmovilizado de la PPM y PNP, a este

nuevo valor de pH, fue del 40% en 2.5 hs. En el capítulo S se puede encontrar el valor del

rendimiento utilizando las enzimas en solución, siendo éste del 30% en un día de reacción. Por Io

que se puede concluir que utilizando el sistema inmovilizado a pH 10, se aumenta el rendimiento

de Ia reacción así como también su cinética.

Con el objetivo de evaluar potenciales aplicaciones de este biocatalizador co-inmovilizado,

se decidió evaluar el efecto del aumento de la concentración de sustrato en Ia actividad y el

rendimiento de síntesis. En trabajos con estas enzimas en solución se utilizaron bajas

concentraciones de furanosas S-fosfato debido a Ia inhibición que produce el fosfato liberado en Ia

reacción de glicosidación. AI trabajar con las enzimas inmovilizadas, se utilizaron mayores

concentraciones de sustrato con el agregado equimolar de manganeso, según Io comentado en eI

capítulo 4 y en todos los casos se trabajó con una c0ncentración final de 30mM de hipoxantina

debido a la solubilidad de Ia misma. Cuando se utilizó una solución 10 mM de ribosa S-fosfato, se

alcanzó un 97% de rendimiento en Ia reacción de síntesis de inosina en 24 h. AI aumentar la

concentración del reactivo a 30 mM, se obtuvo un 65% de rendimiento en 3 h, pero Ia reacción no

continuó avanzando. En este último ensayo se ve que el sustrato y Ia base se encuentran en

condiciones estequiométricas, pudiendo ser este el motivo del menor rendimiento con respecto al

primer ensayo mencionado, en el cual la base se encontraba en exceso.

6.3- Conclusiones

Se ensayaron diversas estrategias de inmovilización de la enzima PPM con el objeto de

determinar Ia más adecuada para dicha proteína.

De las estrategias analizadas, se encontró que Ia más eficiente (mayores valores de

rendimiento, actividad y estabilidad operacional) fue el atrapamiento de la misma en materiales

híbridos de sílica-biopolímero, preparados mediante la tecnología sol-gel y procesados por la

metodología de ISISA.Losmejores resultados se obtuvieron utilizando como precursor del sol-gel,

el THEOS,y como polímero auxiliar, el quitosano.

Luego se co-inmovilizaron exitosamente las enzimas PPM y PNP en el sol-gel hibrido silica

quitosano. La mejor estabilidad operacional, considerando la actividad contra el número de usos

208 Capítulo 6 —Inmovilizacíón dela PPM y del sistema enzimático acoplado

del biocatalizador inmovilizado, correspondió al sistema co-inmovilizado, en comparación con Ia

enzima PPM inmovilizada. Para la reacción modelo de sintesis de inosina, se alcanzó un alto

rendimiento en tiempos cortos, siendo Io más relevante que no se observa pérdida de actividad

hasta el séptimo uso del mismo.

Por último se trabajó con mayores concentraciones de sustrato, demostrándose que

pueden utilizarse concentraciones de hasta 30 mM con buenos rendimientos a tiempos cortos.

Anuestro leal y saber entender, este el primer reporte de Ia inmovilizacióndela PPM.

Capitulo 7 - Estudio estructural y funcional dela PPM de E. coli

9MEstudio estructural y funcional de la PPM de E.coli

7.1 Obietivos y resumen

Losprincipales objetivos de este capítulo son la elucidación estructural de la enzima expresada

en nuestro laboratorio (PPM de E. coli), Ia determinación del sitio activo de Ia misma y el modo de

unión de los ligandos. Esto se llevó a cabo con el objeto de:

o Comprender el mecanismo biológico fundamental de Ia PPM y los modos de unión de los

Iigandos al sitio activo de la enzima.

o Proyectar un diseño racional de mutantes, con el objeto de aumentar la estabilidad de la

enzima, ampliar su perfil de pH y Ia especificidad de los sustratos 5-fosfato. Esto último

permitiría la síntesis biocatalizada de nuevos nucleósidos modificados en el azúcar.

o La predicción de las propiedades físico-químicas de la enzima. Esto posibilitará, en un

futuro, evaluar la distribución de cargas y los residuos expuestos al solvente, permitiendo

una selección más racional de la metodología de inmovilización.

Para la consecución de los objetivos antes mencionados, se precisó predecir el complejo

proteína-Iigando. Para esto fue necesario llevar a cabo tres pasos: (1) la elucidación de la

estructura de la molécula objetivo (PPM), (2) la localización de sitio de unión a ligandos y (3) la

determinación del modo de unión. El primer paso fue realizado mediante metodologías de

modelado por homologia. La localización del sitio de unión a ligandos fue llevado a cabo

computacionalmente (por software específicos para dicha tarea), y a su vez, por comparación con

las regiones aminoacídicas conservadas en diversos miembros de Ia familia de las

fosfopentomutasas y de enzimas relacionadas. Elúltimo paso involucró la aplicación de algoritmos

de acoplamiento molecular (docking) incluidos en la el programa Autodock (versión 4.0.).

_ Capítqu7-EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

7.2 Resultados y discusiones

7.2.1 Elucidaciónestructural de Ia PPM:Modelado mr homologia.

El modelado de una proteína por homología es un método que permite predecir la

estructura terciaria (3D) de una proteína deseada (target) conociendo su secuencia de

aminoácidos (estructura primaria) y la estructura terciaria de una homóloga (templado) resuelta

por rayos-x o RMN. Este método aprovecha las similitudes de secuencias de aminoácidos y las

similitudes estructurales entre proteínas, construyendo una estructura tridimensional para Ia

secuencia incógnita, usando los datos de estructuras tridimensionales conocidas de otras

proteínas, cuyas secuencias de aminoácidos guardan similitud con la secuencia incógnita. El

modelado por homología se realizó siguiendo la metodología habitual que, en general, consta de

cuatro pasos. El primer paso llevado a cabo fue la búsqueda del templado adecuado. Elsegundo

paso fue el alineamiento de las secuencias (target-templado). El tercer y cuarto paso fueron el

modelado de la proteína y su refinamiento por diversas metodologías respectivamente.

El correcto alineamiento de la secuencia a ser modelada con la de la estructura del

templado es el requerimiento más importante en modelado por homología. La identificación de

las secuencias homólogas a la de la secuencia de la PPM y el alineamiento múltiple de las mismas

se obtuvo por medio del servidor denominado HHpred server (Homology detection & structure

prediction by HMM-HMMcomparison),1 aplicando los parámetros por defecto y eligiendo las

bases de datos del PDB(Protein Data Bank) y SCOP(Structural Classification of Proteins).

Como material inicial de trabajo se empleó la secuencia aminoacídica de la PPM (407 aa)

con número de acceso POA6K6en la base de datos UNIPROT(Universal Protein Resource). A partir

de dicha secuencia se identificaron las proteínas homólogas con mayores porcentajes de similitud

de estructuras resueltas en la base de datos PDB y SCOP mediante una búsqueda utilizando

perfiles de modelos ocultos de Markov (profile HMMs)z.Este algoritmo de búsqueda se basa en la

comparación de secuencias con modelos estadísticos que describen una familia o patrón de

secuencias. Asimismo, se ha demostrado que el uso del algoritmo empleado por el servidor

HHpred brinda alineamientos de elevada calidad. Elalineamiento múltiple obtenido se muestra en

la Figura 7.1.

1Sóding, J.; Biegert, A.; Lupas, A.; Nucleic Acids Research, 2005, 33; W2441Sóding, J.; BIOINFORMATIG,2M, 21, 951

OOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO00.000....4

T... Capítulo 7 - Estudio estructural y funcional de la PPM de E.coli

am .8!!!- muuum-W.111!- _m_.425!-mwii-m- .1!!_EI- mmmmm

Phosphopentomutase [Streptococcus mutans (2i09_A)]Probab=100.00 E-value=0 Score=357.34 Aligned_cols=118 ldentities=43%

’L' L L I¡.a . , _, " r J phosphoglycerate mutase [Bacillusstearothermophilus(109B_A)]

Probab=99.83 E-value=1.6e-20 Score=196.36 Aligned_cols=129 ldentities=24%

Figura 7.1. Alineamiento múltiple de secuencias por HHpred.

La Figura 7.1 muestra en primer lugar una lista de barras de colores, que indica las

posiciones y códigos de color de los templados hallados, que c0mparten con la proteína target una

probabilidad de ser un verdadero positivo mayor al 40% (estos se denominan aciertos). Elcolor de

las barras varía según Ia impartancia de los aciertos, desde el rojo (muy importante) siguiendo con

el naranja, amarillo, verde, cian hasta el azul (poco significativo). Luego el servidor provee una lista

de estos templados o aciertos, en la cual se indica para cada uno de los aciertos hallados el valor

de probabilidad anteriormente citado, el E-value o valor esperado, que refleja el nivel de fiabilidad

de cada acierto (éste indica el número de falsos positivos con una mejor puntuación que el

templado en cuestión), el score o puntuación, que se calcula comparando Ia distribución de

aminoácidos entre el target y el templado, y finalmente el porcentaje de identidad. En la figura 7.1

sólo se muestran los valores representativos de los templados con mayor porcentaje de

probabilidad.

_ Capitulo7-EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

Cabe remarcar que se observa una elevada similitud entre diversas proteinas en la zona de

los aminoácidos 250 a 400 (Figura 7.1). Éste es el dominio de unión a metal, que se encuentra

altamente conservado en diversas familiasde metaloproteinas, como se discutirá más adelante en

este capítulo.

De esta forma, se identificó una proteína de la familia de las PPMs en la base de datos PDB

(PDB 2i90_A) que comparte un 43 % de identidad con la secuencia de la PPM de E. coli, y su

estructura de rayos Xfue utilizada como estructura templado (resolución de 2 Á).

Se conoce que la precisión de los modelos obtenidos por homología es altamente

dependiente del grado de similitud entre las secuencias de la proteina target y la correspondiente

al templado. Como se observa en la Figura 7.2, a mayor porcentaje de similitud entre las

secuencias analizadas, menor será el valor de la desviación estándar cuadrática medía (RMSD)de

Ia posición de los carbonos a del esqueleto proteico. Usualmente, el modelado de proteínas

basado en templados que comparten un porcentaje de identidad de secuencia mayores al 40 % a

Ia secuencia target, genera modelos que poseen Ia estructura global y el plegamiento proteico

correctos’.

Proteinas homologase .\ I l l

1.a - *\ [.6 - ¡.4 -

A 1.a b .43 l - 2 0.a - “i 0.5 - a

0.4 - M

0.a u. l l l l

o zo 40 eo oo no

%identidad

Figura 7.2. Representación de la variación en los valores de RMSDcon el porcentaje de similitud entresecuencias.

Una vez obtenido el templado (PDB2i90_A)alineado correctamente con la secuencia de la

PPM, se procedió a Ia construcción del modelo (tercer paso). Para esto, se utilizó el programa

MODELLER(versión 4.0), utilizando el templado seleccionado previamente. El último paso llevado

a cabo para la elucidación del modelo de Ia PPM mediante la metodología de modelado por

3Kauffman, C.; Rangwala, H.; Karypis,G. CSB2008: Stanford University: improving homology models for protein-ligandbinding site, Peter Markstein ( Imperial College Press), 2008, ISBN:1848162634

OOOOCOOOOOOOOOOO-OOOOOÓOOOOOOOOOOÓOOOOOOGOGOOOOOOO

1.... Capitulo 7 - Estudio estructural y funcional de la PPM de E. coli

homología consistió en Ia evaluación de la calidad del modelo obtenido y su posterior

refinamiento. En la Figura 7.3A, se muestra la estructura de cinta del modelo obtenido por el

programa MODELLER,en la cual se muestra la conformación de la cadena polipeptídica y el patrón

de plegamiento global de la cadena.

puntuación

residuo

Flgura 7.3.AzModelo de la PPMgenerado por MODELLERutilizando como templado la fosfopentomutasa deStreptococcus mutants. Q Representación de Ia calidad del modelo por Verify3D

Con el objeto de evaluar la calidad del modelo de la PPM generado, en primer lugar, se

compararon los gráficos de Ramachandran del templado con el del modelo. Esta comparación

mostró que la mayoría de los aminoácidos se encontraron en las conformaciones posibles de las

cadenas polipeptídicas (95%), similar al gráfico de Ramachandran del templado utilizado.

Asimismo, como se observa en la Figura 7.38, la representación de Ia calidad del modelo obtenido

por el programa Verify3D confirma que la estructura de la PPM obtenida por el programa

MODELLERes un modelo razonable. En esta representación se observa que todos los aminoácidos

poseen puntuaciones mayores a O (el área rosa remarca las puntuaciones menores a O, Figura

7.38), indicando una alta compatibilidad secuencia-estructura.

Finalmente se debió realizar el refinamiento del modelo obtenido. Uno de los

refinamientos que debió realizarse fue la incorporación de los átomos metálicos (manganeso) al

sitio activo de la enzima, debido a que el modelo generado no los incorporaba. Para lo cual se

realizó un estudio bibliográfico y secuencial en primera medida, con el objeto de

aproximadamente localizar el sitio de unión a metal en dicha proteína.

_ Capítulo7- EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

Galperin et al‘ han realizado un análisis de la conservación aminoacídica en las secuencias

de diversas familias de enzimas. En esta publicación se ha encontrado que las secuencias de las

enzimas pertenecientes a la familia de las PPMs muestran similitudes significativas con secuencias

de enzimas de la familia de la fosfatasa alcalina (AP)y con otras familias de enzimas, tales como la

familia de las sulfatasas, y diversas transferasas e hidrolasas, que actúan sobre sustratos similares

(carbohidratos fosfatados). Estas similitudes incluyen una elevada conservación de los residuos del

sitio de unión a metal de sus centros activos, y mecanismos catalíticos similares. Estos hallazgos

sugieren para los autores, que estas familias de proteínas pertenecerían a una superfamilia de

enzimas, denominada Ia superfamilia de la fosfatasa alcalina.

En el mismo estudio se observó una absoluta conservación de los residuos del sitio de

unión a metal en dos familias, la familia de las PPMs y otra familia de enzimas denominada 2,3

bífofosglicerato mutasas independientes (iPGMs) que catalizan la isomerización de 2- y 3

fosfogliceratos (2-PGAy 3-PGA).Ambas familias de enzimas poseen un requerimiento absoluto de

dos iones manganeso para su actividad, a Ia vez que comparten la misma actividad y poseen una

elevada conservación estructural, como se observa en la Figura 7.4C. Estas similitudes son de

elevada utilidad, debido a que todavía no se dispone de suficiente información de las PPMs a nivel

estructural, pero existe una gran cantidad de información estructural y funcional sobre las IPGMs.

Por Io tanto, a fin de completar el modelo de Ia estructura target se precisó incorporar los

dos iones metálicos en el sitio de unión a metal. En primer lugar, con el modelo aproximado en

mano, se encontraron sin ambigüedad los residuos que formaban parte de dicho sitio en Ia PPM

por comparación entre las secuencias de la PPM y diversos miembros de la familia de la iPGM (los

aminoácidos que forman parte del sitio de unión a metal en los miembros de la familia

previamente citada, han sido estructuralmente identificados) debido a la absoluta conservación de

los mismos. Losaminoácidos que forman parte de este sitio en la enzima PPM son: Asp 8, Asp 345

y His346 , esta triada de residuos une a uno de los iones manganesos y Asp 304, His 309 y His357,

que coordinan al segundo ión del mismo metal.

'Galperin, M.; Bairoch, A.; Koonin, E.; Protein Science, 1998, 7, 1829

1.... Capítulo 7 - Estudio estructural y funcional de la PPM de E. coli

Figura 7.4. A)Superposición del sitio de unión a metal dela PPM e IPGMantes del refinamiento dela

estructura mediante simulaciones de dinámica molecular. B)Superposición del sitio de unión a metal dela

PPMe IPGMposterior al refinamiento dela estructura mediante simulaciones de dinámica molecular. C)

Superposición estructural de Ia PPM e IPGM(magenta: PPM, celeste: IPGM).

Luego, se añadieron manualmente ambos manganesos en el entorno de los residuos

anteriormente citados, en posiciones similares a las descriptas para la proteína iPGM,

superponiedo ambos sitios (Figura 7.4A). En particular se trabajó con una enzima de la familia de

las fosfoglicerato mutasas, que ha sido exitosamente cristalizada (iPGM de bacillus

Stearothermophillus, PDB1098), su estructura cristalográfica de rayos X de sus complejos con 2

PGA y 3-PGA determinada y que además presenta un elevado porcentaje de similitud entre

secuencias con Ia PPM en estudio. En Ia Figura 7.4A se muestra la superposición del sitio de unión

a metal de las dos enzimas (PPM (verde), iPGM (amarillo)), esto ayudó a localizar a los dos iones

metálicos aproximadamente en las cercanías de dicho sitio. Una vez aproximadamente ubicados

dichos iones, se optimizó la geometría del modelo, en primer lugar utilizando el campo de fuerzas

proporcionado por AMBERpara luego finalizar Ia optimización por dinámica molecular.

_ Capítqu7-EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

En la Figura 7.48 se muestra la superposición del sitio de unión a metal de las enzimas

citadas previamente, posterior al paso de optimización y dinámica molecular, con el objeto de

evaluar la factibilidad de dicha optimización. En esta figura se observa la conservación de la

estructura global del sitio. Asimismo se calcularon las distancias metal-ligando, para el caso

particular del aminoácido histidina, se calcularon las distancias N-Mn, mientras que en el caso del

aminoácido aspartato, las distancias O-Mn, obteniéndose valores similares a las distancias

promedio calculadas por el servidor MESPEUS(Metal sites in proteins) (Tabla 7.1).

PPM ( ost dinámica molecular) Media (MESPEUS)

2.22 A

2.23 A

N-Mn

O-Mn

Tabla 7.1. Distancias Mn-Iigando medias y experimentales.

7.2.2 Localizacióndel sitio de unión.

Un prerrequisito para el acoplamiento molecular o docking de pequeños Iigandos es la

determinación del sitio en el cual el ligando interactúa con la proteína. Tales sitios de unión a

sustrato generalmente se localizan en cavidades o hendiduras en la superficie de las proteínas. La

determinación de estas cavidades es por lo tanto un paso importante en el estudio del modo de

unión de la PPM con ligandos.

Para esta determinación se explotaron las similitudes, tanto estructurales como

funcionales, entre la's proteínas de la familia de las PPMs y las iPGMs. En particular, como se citó

previamente, se estudió la enzima iPGM de bacillus Stearothermophíllus debido a su elevado

porcentaje de similitud y, también, a que ha sido resuelta su estructura por difracción de rayos X.

La estructura de esta enzima se compone de dos dominios, denominados fosfotransferasa y

fosfatasa, a cuenta de sus respectivos roles en la catálisis (ambos dominios poseen una topología

a/B, asi como los dominios correspondientes de la PPM). Los residuos del sitio de unión a ambos

sustratos (2-PGA y 3-PGA) y a ambos iones manganesos están localizados en una hendidura

situada entre los dominios. La localización del sitio activo en una interfase entre dominios es

característica de muchas enzimas. Elgrupo fosfato del sustrato, así como los dos iones manganeso

interactúan principalmente con el dominio fosfatasa, que contiene un residuo esencial para la

Capítulo 7 - Estudio estructural y funcional de la PPM de E. coli

actividad enzimática, Ser 62, mientras que el carbohidrato del PGAinteractúa sólo con el dominio

transferasa. En reportes anteriores‘, se realizó una comparación estructural de las iPGMs con la

superfamilia de la fosfatasa alcalina mostrándose que estas enzimas poseen una estructura básica

común y una localización similar del residuo esencial conservado en todos los miembros de la

superfamilia, pudiendo ser tanto Ser, Cyscomo Thr y dos iones divalentes (que pueden ser además

de manganeso, níquel, cobalto, etc.) en sus sitios activos.

Se demostró en el mismo estudio, que este residuo era esencial para la actividad. Con este

objetivo se sobreexpresó y cristalizó una enzima mutante (SGZA),en la cual se intercambió el

residuo serínico 62 por alanina. Esta mutante no mostró actividad mutasa. Asimismo, se demostró

que la enzima mutada perdía la capacidad de unir a uno de los iones manganeso, comprobándose

de esta forma, que los residuos del sitio de unión a metal, eran insuficientes para la unión del

metal al centro activo.

El mecanismo catalítico propuesto para esta enzima involucra Ia formación de un

intermediario fosforilado (E-P).El ion manganeso juega un rol esencial en el mecanismo, a través

de la coordinación de tanto el sustrato como el producto de la reacción, así como, del

intermediario fosfoserínico. Se ha propuesto que el dominio fosfatasa es responsable de la

actividad fosfatasa de la reacción catalítica mientras que el dominio transferasa contribuye a la

reorientación del glicerato del los PGA(2- y 3-) y es el responsable de la transferencia del grupo

fosfato al glicerato reorientado‘.

En la Figura 7.4C se muestra la superposición estructural de las dos enzimas previamente

citadas (PPM y iPGM).Asimismo, se realizó la superposición de las estructuras de diversas PPMs e

iPGMs, utilizando el servidor denominado DALI(datos no mostrado) observándose que todos los

miembros de las familias analizadas c0ntienen dos dominios distintivos, formando una hendidura

entre ambos, sugiriendo este hecho la misma localización del sitio activo. Se vio que en todas las

proteínas estudiadas, la orientación de ambos dominios era Ia misma. A su vez, como se citó

previamente, los seis residuos involucrados en el sitio de unión a metal se encuentran

completamente conservados.

Con lo mencionado anteriormente, se puede concluir que la información mecanística y

estructural de las iPGMs es relevante para la investigación funcional y estructural de la PPM en

cuestión. Considerando la información estructural de Ia iPGM,se puede proponer que la enzima

sRigden, D.; Lamani, E.; Mello, L; Littlejohn, 1.; Jedrzejas, M.; J. Mol. Biol., 2003, 328, 9096Chander, M.; Setlow, P.; Lamani, E.;Jedrzeias, M.; Journal of Structural Biology, 1999, 126, 156

_ Capítulo7-EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

PPM posee también estos dos dominios, el dominio fosfatasa (conservado en todos los miembros

de la superfamilia de la fosfatasa alcalina) y el dominio transferasa (sólo presente en estas dos

familias de enzimas), que uniria a la ribosa y desoxirribosa; y a su vez que el sitio activo de Ia

enzima estaría localizado en la hendidura entre ellos, así como se describió para las iPGMs.

Con el objeto de confirmar estas suposiciones, se ha estudiado a la vez el sitio de unión a

sustratos utilizando un software denominado LIGSITE’.Éste es un programa desarrollado para la

detección automática y eficiente de hendiduras en la superficie de las proteínas, las cuales podrian

actuar como sitios de unión para pequeños moléculas de Iigando. Utiliza el algoritmo de Levitt y

Baznack’,generando grillas cartesianas y calculando Ia accesibilidad a solvente en cada punto de la

grilla. Como se muestra en la Figura 7.5A, la hendidura calculada se encuentra localizada en la

cavidad situada entre ambos dominios, como se supuso previamente por comparación estructural

y funcional entre las proteínas PPM e iPGM.

Por último, se estudió también la conservación aminoacídica entre las secuencias de varios

miembros de la familia de la PPM.Se escogieron para este estudio de alineamiento de secuencias,

las PPMs de 88 orígenes bacterianos diversos con una redundancia secuencial menor al 90 % y de

similar peso molecular. En la Figura 7.58 se muestra la localización de los residuos total y

fuertemente conservados cercanos al sitio activo propuesto (se excluyeron, para este estudio, los

residuos conservados lejanos a la hendidura entre dominios). Se concluyó que esta cavidad se

encuentra altamente conservada entre los miembros de la familia de las PPMs, confirmando la

hipótesis planteada en este capítulo, acerca de la localización del sitio activo de Ia PPM en la

hendidura entre los dominios fosfatasa y fosfotransferasa.

7Hendlich, M.; Rippmann, F.; Barnickel, G.; Journal of Molecular Graphics and Model/ing , 1997, 15, 359

CCC...COOOOOOCCÓÓÓOOOÓ..............O...ÓÓOCOOOCÓ

1.... Capítulo 7 - Estudio estructural y funcional dela PPM de E. coli

Figura 7.5. A)Modelo de cintas dela PPM,en el cual se resalta en rojo el sitio de unión a sustrato obtenidopor el servidor LIGSITE.B)Modelo de cintas en el cual se resaltan los residuos conservados próximos al sitio

de unión propuesto, obtenido por alineamiento de secuencias de 88 PPMs.

Como se describió previamente en este capítulo, el estudio realizado por Schein et ala

basado en el alineamiento de secuencias de diversos miembros de la superfamilia de Ia fosfatasa

alcalina utilizando PSI-BLAST,permitió hallar los residuos conservados del sitio de unión a metal en

todos los miembros de la superfamilia, asi como la localización de los residuos Ser, Cys o Thr,

esenciales para la unión del fosfato a Ia enzima. De acuerdo a esta publicación no se pudo

identificar, en el caso de la PPM,este residuo sin ambigüedad, pero fue tentativamente predicho a

partir del alineamiento de las estructuras secundarias como el residuo Thr 28. Con el modelo de Ia

PPM en mano, se intentó confirmar dicha predicción. Como se muestra en la Figura 7.6, p0r

comparación entre Ia estructura de la PPM (modelo) con la correspondiente de la IPGMde bacillus

Stearothermophíllus, el residuo propuesto se encuentra lejos del sitio de unión a metal. En lugar

de este residuo, se propone la Thr 96 como residuo esencial para Ia unión del fosfato (Figura

7.63). Esta asunción será verificada experimentalmente en trabajos futuros, sobreexpresando una

mutante (generada por mutagénesis dirigida) en la cuál dicho residuo sea eliminado o

intercambiado.

a Chen, D.; Menche, G.; Power, T.; Sower, L.;Peterson, J.; Schein, C.; PROTEINS:Structure, Function, and Genetics, 2001,45, 318

- Capítulo7-EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

Figura 7.6. A) Sitio activo de la IPGM. B) Sitio activo parcial de la PPM (Azul: sitio de unión a metal, rosa:otros residuos del sitio activo, rojo: residuo esencial para la unión a fosfato, amarillo: sustrato)

—>“‘ïg\—> \ ¿rEl

7.2.3 Determinación del modo de unión.

La determinación del modo de unión de ligandos dentro de la estructura de Ia PPM, que

podría llevar al diseño de nuevos sustratos para la reacción transferasa, es desafiante por dos

motivos. El primero es el uso de un modelo generado por Ia metodología citada en la primera

sección, esto es, por modelado por homología para el experimento de acoplamiento molecular o

docking. Losmodelos así generados, en general, presentan menores precisiones que los obtenidos

a través de determinaciones estructurales por rayos Xo RMN.Elsegundo refiere a las dificultades

inherentes al dockingde pequeños Iigandosen estructuras de metaloproteínas.

En el primer caso, se han publicado un gran número de estudios del uso de modelos de

proteínas generados por la metodología de modelado por homología para realizar experimentos

de docking’. Estos estudios muestran que la performance de los cálculos de docking es altamente

dependiente de la representación de Ia proteína. Los modelos obtenidos por modelado por

homología con similitudes de secuencias entre 30% y 50% son considerados de moderada

precisión. Estos modelos pueden ser utilizados directamente para los experimentos de docking de

pequeñas moléculas si son construidos y refinados mediante simulaciones de dinámica molecular,

o si se considera, en los experimentos, la flexibilidad de la proteína”. Para la consecución de los

objetivos planteados, se consideró que el modelo refinado por dinámica molecular obtenido en la

9 a) Thorsoe, K.; Bak, 5.; Olsen, C.; Imberty, A.; Breton, C.; Moller, 8.; Plant Physiol., 2005, 139, 664 ,b) Iorga, B.; Heriem,D.; Barre, 6.; Guillou, C.; J. Mol. Model., 2006, 12, 366 ,c) Radestock, 5.; Weil, T.; Renner, S.; J. Chem. Inf. Model., 2008,48, 1104 ,d) Schafferhans, A.; Klebe, G.; J. Mol. BioI., 2001, 307, 4071°Krovat, E.; Steindl, T.; Langer, T.; Current Computer-Aided Drug Design, 2005, 1, 93

1.... Capitulo 7 - Estudio estructural y funcional de la PPM de E. coli

primera sección de este capitulo es lo suficientemente preciso para la determinación aproximada

del modo de unión de Iigandos a la PPM.

En el segundo caso, el docking de moléculas en sitios activos que contengan uno o más

metales es muy desafiante, como se ha mencionado anteriormente, debido a las múltiples

geometrías posibles de coordinación y asimismo debido a la falta de parámetros de campos de

fuerza suficientemente precisos para las interacciones Iigando-metal. Además, no es directa la

inclusión o no de moléculas de agua en el sitio activo de la enzima. Ciertas moléculas de agua

discretas pueden mediar la unión del Iigando a la enzima, o pueden directamente participar como

una molécula de co-sustrato en la catálisis junto con los metales. Se decidió en primera instancia

explorar el modo de unión removiendo todas las moléculas de agua de la estructura de la PPM

optimizada, como recomiendan muchos manuales de docking“. Con respecto al tratamiento de Ia

coordinación del metal, se sabe que los programas actuales que realizan experimentos de docking

son deficientes en este particular caso. En estudios anteriores" se ha comparado la performance

de diversos programas de docking, mediante experimentos de acoplamiento molecular de

sustratos llevados a cabos sobre sitios activos de metaloproteínas. Elresultado de estos estudios

mostró que el programa denominado AUTODOCKera el más confiable para este tipo de

experimentos. A la vez, el programa AUTODOCKes uno de las herramientas de docking accesibles

más fiables en la actualidad, siendo esta eficiencia debida al uso de un algoritmo genético y a

funciones de puntuación (scoríng) que. incluyen diversos parámetros (energias de

dispersión/repulsión, carácter direccional de los puentes de hidrógeno, potenciales electrostáticos

coulómbicos basados en el campo de fuerzas AMBER,un término de solvatación basado en

volumen, y una suma ponderada de los grados de libertad torsionales para estimar el costo

entrópico de la unión). Estos parámetros así como la posibilidad de utilizar tanto torsiones

flexibles como rígidas para los ligandos durante el procedimiento llevado a cabo con el programa

AUTODOCK,hacen de éste una herramienta apropiada para el propósito de este capitulo”.

“ Pospisil, P.; Folkers, 6.; FABADJ. Pharm. Sci., 2004, 29, a1

n Chen, D.; Menche, G.; Power, T.; Sower, L.;Peterson, J.; Schein, C.; PROTEINS:Structure, Function, and Bioinfarmatics,2007, 67, 593n Comell, W.; Cieplak, P.; Bayly, C.; Gould, l.; Merz, K.; Ferguson, D.; Spellmeyer, D.; Fox, 1.; Caldwell, J.; Kollman, P.; J.Am. Chem. Soc, 1995, 117, 5179

_ Capitulo7-EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

7.2.3.1. Estudios r Ilmln r sen i m n l . Ev lu i n dela car a del metal

l fi i n i r'm ¡liz n l

programa AUÏQDQQK.

Se conoce que alterar la carga de los iones metálicos afecta en gran medida las

puntuaciones (scores) globales de los experimentos de docking realizados utilizando el programa

AUTODOCK”.Con el objeto de investigar el efecto de la carga de los iones manganeso en la

precisión del experimento de acoplamiento molecular, se evaluó en primer lugar el docking del

sustrato 2-PGAen el sitio activo de Ia ¡PGMvariando la carga del metal. Se utilizó para este ensayo

la estructura cristalina del complejo proteína-ligando (iPGM-Z-PGA)que fue obtenido de la base

de datos PDB (PDB 1098). El experimento de docking del 2-PGA en el sitio activo de la ¡PGM fue

realizado con el programa AUTODOCK(version 4.0).

Se utilizó la interfaz gráfica, AUTODOCKTOOLS“para añadir hidrógenos polares y cargas

parciales a la proteina y al ligando. Los parámetros diversos para el éxito del experimento de

docking se fijaron con las herramientas ADDSOLy AUTOTORSy se describen, así como las

condiciones experimentales empleadas para el ensayo, en la sección de materiales y métodos. La

carga del manganeso fue añadida manualmente directamente sobre los archivos pdbq generados

por estas herramientas. Se realizaron dos ensayos variando la carga del manganeso de +1 a +2.

Una vez generada la grilla de afinidad utilizando el programa auxiliar AUTOGRID,se realizó el

experimento de docking utilizando el algoritmo genético hibrido de búsqueda local (GA-LS).Las

conformaciones resultantes del experimento de docking fueron agrupadas en clusters o familias

con modos de unión similar, con una tolerancia entre grupos de la desviación cuadrática media

(RMSD)de 2 Á. La eficiencia del experimento fue medida basada en la RMSD de los sustratos

obtenidos por el experimento de docking relativos al obtenido experimentalmente.

“ Sanner, M.; Duncan, 3.; Carrillo, c.; Olson, A.; Pac. symp. Biocomput., 1999, 401

1.... Capitqu 7 - Estudio estructural y funcional de Ia PPM de E. coli

Mn +1 Mn +2

— Conlormaa'ónexperimental

— Conformaciónde menorRMSD

— Conformadónde menorenergia

-16.13 -2.Ü

'RmmhmnlonndóndonwmhimA "RmmhwflmmmmhtflA

Figura 7.7. Efecto de Iacarga del ión manganeso en la precisión del experimento de docking.

Asimismo se analizaron las distancias Mn-O-P y Mn-Ser62 (Figura 7.7) .En la Tabla 7.2, se

muestran los resultados de un reporte publicado por otros autores, en el cual se calculó el

promedio de las distancias entre el metal y eI grupo fosfato del ligando (Mn-O y Mn-P) en

metaloproteinas“. En este estudio se caracterizó la geometría de la unión proteina-metaI-fosfato

utilizando información estructural derivada de todas las estructuras depositadas en la base de

datos del Protein Data Bank.Se seleccionaron para este ensayo, las estructuras con una resolución

de 2.8 Áo mejor, para validar los resultados obtenidos en los experimentos de docking.

Distancia medía Mn —o,,,,.,,, (Á) I 1.90 l

I DistanciamediaMn—Ph“, (Á) l

Tabla 7.2. Distancia media entre los iones manganeso y el grupo fosfato en metaloproteínas.

Como se observa en la Figura 7.7, basados en los valores de RMSD,Ia conformación del

ligando que brindó el mejor resultado (el de menor RMSD),se encontró próxima a la posición

determinada experimentalmente en la estructura cristalina del co-cristal 2-PGA-IPGM,en ambos

casos estudiados, o sea, con el manganeso de carga +1 y +2. Sin embargo, Ia conformación de

mayor energía en módqu (best docked energy) no coincidió con la conformación de menor RMSD

(los valores de RMSDde las conformaciones de mayor energia en módulo se indican al pie de

cuadro). No obstante las dos conformaciones en ambos casos, no difieren significativamente y

‘5Harding, M; Acta Cryst., 2006, 062,678


ambas cumplen con el criterio de "éxito" descripto en literatura”, que indica una diferencia s 2.4

Á de RMSDentre las conformaciones obtenidas por el experimento de docking y las determinadas

experimentalmente. Losvalores obtenidos en los experimentos de docking variando la carga del'

metal, no difieren significativamente, por lo que no se pudieron utilizar como parámetro para la

selección de la carga óptima del metal para realizar estos ensayos. A pesar del éxito logrado en la

localización aproximada del sustrato en el sitio activo de Ia iPGM, el programa AUTODOCK

posicionó al grupo fosfato más cercano que lo esperado al ión manganeso. En la tabla de la Figura

7.7, se muestran las distancias manganeso-fosfato, calculadas a partir de las conformaciones

obtenidas por los experimentos de docking realizados, así como las calculadas a partir de la

estructura del co-cristal determinada experimentalmente por rayos X. Las distancias Mn-O y Mn

O-P calculadas a partir de las mejores conformaciones obtenidas por los experimentos de

acoplamiento molecular son menores a las medias así como menores a las experimentales,

indicando estos resultados, una sobreestimación de la interacción entre el manganeso y el grupo

fosfato. Estas observaciones serán discutidas en la siguiente sección de este capítulo.

7.2.3.2. Ex riment kln - l n l n ii n x rim nt I s

Luego, se exploraron diversas condiciones experimentales en el análisis de docking,

utilizando como ligando ribosa S-fosfato y el modelo de Ia PPM generado en las secciones

anteriores. Elprimer parámetro analizado fue Ia carga en el ión manganeso. Como se ha citado en

la sección de materiales y métodos el archivo PDBdel ligando fue extraído de Ia base de datos

depositada en el RCSBPROTEINDATABANKy se optimizó tanto su geometría como su carga

utilizando el servidor Dundee PRODRGZ.Con el objeto de confirmar Ia localización del sitio activo

propuesto de la PPM, se realizó un experimento denominado blind docking (como se indica en

materiales y métodos). Este ensayo implicó realizar el procedimiento de docking a toda la proteína

sin imposición de un sitio específico de unión. Se seleccionaron las cargas del manganeso +1 y +2

nuevamente. Como se observa en Ia Figura 7.8A, en ambos experimentos el sustrato fue situado

lejos del sitio activo propuesto. En los dos experimentos realizados, el fosfato no presentó uniones

de puente de hidrógeno con el residuo Thr 96, aminoácido propuesto como esencial para la unión

del grupo fosfato y, asimismo, no presentó interacción alguna con los iones manganeso.


Figura 7.8. A) Docking de la ribosa 5-fosfato en la PPM fijando la carga del Mn'l B) Docking de la

ribosa S-fosfato en la PPMfijando la carga del Mn". Tabla) efecto dela carga del manganeso en los

experimentos "blind docking” de la ribosa 5-fosfato en el modelo de la PPM.

Por esta razón se decidió realizar nuevos experimentos de acoplamiento molecular,

fijando la carga del ión manganeso en valores más elevados (+3, +5 y +7). En estos ensayos se

observó que el ligando efectivamente se situó en el sitio activo esperado. Asimismo, se observó

que el grupo fosfato se ubicó cerca de los iones manganesos, formando uniones puentes de

hidrógeno con el residuo Thr 96 (Figura 7.88).

Luego se realizó un experimento de acoplamiento molecular imponiendo el sitio activo

propuesto de la enzima, como se indica en materiales y métodos, fijando para dicho experimento,

Ia carga del manganeso como se llevó a cabo en el estudio de blind docking (+1, +2, +3, +5 y +7). Se

observó en estos casos (exceptuando cuando se fijó la carga del manganeso en +1), que las

mejores conformaciones obtenidas (best docked energy) mediante estos experimentos, formaron

uniones puente de hidrógeno con el residuo Thr 96, y se situaron cerca de uno de los iones

manganeso. Asimismose obtuvieron mayores valores absolutos de energía de interacción que los

obtenidos para el experimento realizado sin fijar el sitio activo de la enzima. Esto se debe a que

una mejora en la resolución de la grilla de afinidad permite una mejor evaluación de las


interacciones ligando-proteina y en consecuencia aumenta el valor absoluto de la energia de

interacción con respecto al ensayo "a ciegas". Sin embargo, cuando el experimento se llevó a cabo

fijando la carga del metal en +1, sólo algunas conformaciones se situaron en las proximidades del

sitio activo propuesto, observándose la conformación de mayor energía (en módulo) lejos del

mismo.

Por este motivo se seleccionaron, para los experimentos de docking, las condiciones con el

centro de Ia grilla localizado próximo al sitio activo propuesto de la PPM y fijando la carga del ión

manganeso en +2, como se indica en la mayoria de las publicaciones que describen el

acoplamiento molecular de sustratos a metaloproteínas que contienen cationes divalentes.

En todos los casos estudiados, se observó Ia sobreestimación de Ia interacción fosfato

manganeso, mostrando distancias menores que las esperadas entre el metal divalente y el grupo

fosfato. Con estos resultados se puede concluir que el programa Autodock reconoce el sitio de

unión a manganeso en todas las simulaciones llevadas a cabo (excepto para el caso del Mn +1). Sin

embargo parece ser que doquea consistentemente a las conformaciones más cerca de los iones

manganeso que Io esperado. Esto se puede atribuir a errores en la función de puntuación

energética utilizada por el programa, Io cual no es sorprendente considerando la falta de precisión

en los parámetros del metal. De hecho, ha sido reportado el mismo problema en simulaciones de

acoplamiento molecular de diversos ligandos a metaloproteínas que contienen zinc en su sitio

activo. En estos reportes se han mejorado los resultados obtenidos mediante la variación de la

carga formal en los átomos metálicos, metodología también aplicada en este trabajo.

AUTODOCKutiliza el método de Gasteiger-Marsili para el cálculo de las cargas atómicas, el

mismo calcula las electronegatividades basadas en el grado de ocupación y valencia de los

orbitales interaccionantes. Como resultado, las cargas de los metales sólo pueden asignarse con

exactitud teniendo en cuenta las cargas en todos los átomos vecinos y por lo tanto, cualquier

variación manual en la carga atómica debe ser reflejada en las cargas de los átomos circundantes.

Corno esto no puede ser realizado adecuadamente con el programa actual, la adopción de cargas

formales como primera aproximación es probablemente la opción más segura hasta que se

publique una nueva versión del AUTODOCKmás eficiente.

1.... Capitulo 7 - Estudio estructural y funcional dela PPM de E. coli

7.2.3.3.-Experimentg de Mking evaluando ggmgliggngglas furgngg; S-fgsfigg.

Una vez seleccionado el sitio de unión del ligando para los experimentos de docking

(centro de la grilla de afinidad) y la carga del metal, se realizaron experimentos de acoplamiento

molecular con los sustratos conocidos de la PPM (desoxiribosa S-fosfato, ribosa 5-fosfato y

arabinosa 5-fosfato). Como no se conoce la preferencia diasteromérica de los ligandos unidos a la

estructura de la PPM, se precisó realizar experimentos de docking tanto para los anómeros de las

furanosas a como para los B, así como para las formas acíclicas de los tres azucares fosfato. Se

observó en todos los casos, que los sustratos se localizaron en el sitio de unión propuesto

anteriormente, formándose uniones puente de hidrógeno entre el fosfato y el residuo Thr 96.

Asimismo el grupo fosfato se halló a la distancia esperada del ión manganeso. Sin embargo, se

observaron diversas orientaciones del resto sacárido de los ligandos, agrupadas las mismas en

clusters o grupos de conformaciones (RMSD < 2A). Se halló que los residuos comúnmente

involucrados en la interacción de los azúcares fosfato con el sitio activo de la proteína fueron Asp

171, Lys257, His 346, Thr 96, Ser 304, Ser 305. Estos residuos se encontraron entre los residuos

conservados dentro de la familia de las PPMs. Sin embargo, no se puedo observar un patrón de

selectividad único entre los ligandos citados previamente, por comparación de las energías de

interacción brindadas por el programa de docking, probablemente debido a que la energía de

unión entre el grupo fosfato y el manganeso (de gran magnitud) enmascara pequeñas variaciones

en la energía debido a las interacciones entre el resto carbohidrato del ligando y la proteína. En los

tres casos estudiados la mej0r energía de unión calculada por el algoritmo del programa de

docking fue obtenida para el anomero B.

7.2.3.4. Ex rimentos de kin v I n rn li an -D-f r n 1-f

Debido a la complejidad estructural de los ligandos (diversos epímeros) y la falta de

información acerca de la actividad de la PPM utilizando como sustratos azucares 5-fofatos, se

decidió realizar experimentos de acoplamiento molecular ensayando como sustratos las furanosas

1-fofato. Se conoce que el anómero a es el sustrato para la reacción de transferencia del fosfato, y

asimismo hay varias publicaciones donde se evaluó la actividad de la PPM para varios azúcares 1

fosfato. El procedimiento para llevar a cabo los experimentos de docking fue el mismo que el

citado previamente, evaluando en este caso la a-D-ribosa 1-fosfato (a-R-l-P), la a-D-desoxirribosa

- Capítulo7-EstudioestructuralyfuncionaldeIaPPMdeE.coli

1-fosfato (a-dR-l-P) y la a-D-arabinosa 1-fosfato (a-A-l-P). Se utilizaron los parámetros por

defecto, excepto por el número de generaciones, evaluaciones de energia y corridas de docking

(esto es el número de conformaciones que el programa registra) que se fijaron en 100 en todos los

casos (a diferencia de 10 que fue el número de conformaciones obtenidas en los casos descriptos

anteriormente). Elaumento en el número de corridas de docking fue realizado con el objeto de

llevar a cabo un análisis estadístico más preciso, aunque este aumento afecte en gran medida el

tiempo de análisis (10 horas (100 corridas) contra 30 minutos (10 corridas)).

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Figura 7.9. A)Representación gráfica de los clusters obtenidos en el docking de a-D-desoxirribosa 1-fosfatoen la estructura de la PPM. B)Representación gráfica de los clusters obtenidos en el dockíng de a-D-ribosa

1-fosfato en la estructura de Ia PPM. (Eje x: Energias de interacción (docked energies). Eje Y:Número deconformaciones).

Las 100 conformaciones resultantes de los tres ligandos analizados fueron agrupadas

según el criterio descripto anteriormente, y se observó que las mismas se localizaron en el sitio

activo propuesto. En el caso de la a-R-l-P y a-dR-l-P, se observó un grupo o cluster mayoritario

con una población de aproximadamente el 80 % de las conformaciones (con las mejores energías

de interacción, Figura 7.9). Mientras que en el caso de la a-A-l-P, no se observó un grupo

mayoritario, en cambio se observó una elevada dispersión de grupos o clusters, por este motivo

los resultados obtenidos para este ligando no pudieron ser utilizados en el análisis del modo de

unión ala PPM.

Luego, al analizar los clusters mayoritarios en ambos azúcares (a-R-IP y a-dR-l-P), se

encontraron dos posibles modos de unión con un RMSDde aproximadamente 1.3 Á. los criterios

de selección de modo de unión fueron los siguientes:

o La similitud espacial de las diversas soluci0nes generadas para los diversos

Iigandos

lo...Capítulo 7 - Estudio estructural y funcional dela PPM de E. coli

o Lamayor proporción de interacciones entre el ligando y Ia proteina.

o La conservación de los residuos involucrados en el modo de unión dentro de

la familia de las PPMs.

o Elnúmero de confórmeros en cada modo.

Los modos de unión fueron definidos superponiendo todas las conformaciones de los dos

ligandos estudiados y comparando los residuos involucrados en la interacción ligando-proteina.

Elprimer modo de unión propuesto se muestra en Ia Figura 7.10A. En el caso de Ia aR-l-P se

halló que el grupo fosfato interaccionaba con el residuo Thr 96 y con la Lys 257. El azúcar del

sustrato aR-l-P mostró interacciones puente de hidrógeno entre el grupo OH-Sy el residuo Ser

304, entre el grupo 0H-2 y los residuos Lys257 y Asp 171 y finalmente entre el grupo OH-3 y el

residuo Asp 171. Este patrón de unión se repite en el caso del sustrato adR-l-P, donde se

encontraron las mismas interacciones salvo pequeñas excepciones. En este caso el grupo fosfato

además de interaccionar con los dos residuos anteriormente citados (Thr 96 y Lys 257) lo hace

también con el residuo His346. LosOH-5y 0H-3 mostraron puentes de hidrógeno con los residuos

Ser 304 y Asp 171 respectivamente, así como en Ia aR-l-P. En ambos casos, la predicción de este

modo de unión se halló entre las mejores energías de docking.

Figura 7.10. Modos de unión representativos de Ia a-D-ribosa 1-fosfato con la PPM. A) Primer modo deunión propuesto. B)Segundo modo de unión propuesto.

_ Capítulo7- EstudioestructuralyfuncionaldelaPPMdeE.coli

Enel segundo modo de unión propuesto, el grupo fosfato en ambos azúcares se comporta

como en el primer modo, como puede observarse en Ia Figura 7.108. Ladiferencia entre estos dos

modos de unión radica en la orientación del esqueleto furanósico. En el caso de la aR-l-P, los 0H

S, OH-3y OH-Zse unen por interacciones puente de hidrógeno con los residuos Lys257, Ser 305 y

Ser 304 respectivamente. En el caso de las adP-l-P, se repite el patrón de interacción,

observándose también la unión por interacciones puente de hidrógeno entre el OH-3y el residuo

Asp 171.

Cabe destacar que los residuos involucrados en las interacci0nes entre las furanosas 1

fosfato y la PPM son los mismos que los hallados anteriormente para la interacción de las

furanosas 5-fosfato y esta enzima.

Los resultados obtenidos muestran posibles modos de unión de ligandos al sitio activo de

la PPM de manera aproximada. Esta incertidumbre se encuentra relacionada al hecho de que se

ha utilizado un modelo generado por modelado por homología para el proceso de docking (con su

incerteza asociada), a que no se ha podido seleccionar una carga del ión manganeso óptima, y

finalmente a que no se ha considerado Ia flexibilidad de la proteína. Este último factor puede

influenciar los modos de unión de los ligandos y entonces las afinidades y orientaciones pueden

verse modificadas. Adicionalmente, cabe destacar que estos modos de unión fueron hallados en

ausencia de moléculas de agua. Debido a estas incertidumbres se hace necesario verificar

experimentalmente estas predicciones. Pero, para el propósito de obtener un modelo preliminar

para la determinación de los aminoácidos claves involucrados en las interacciones Iigando

proteína, se considera que es una aproximación suficientemente precisa, y nos guiará en un futuro

para el diseño racional de mutantes con el objeto de aumentar su estabilidad (temperatura y pH)y

de relajar la especificidad por los azúcares fosfato.

7.2.4 gna explicaciónexperimental

Con esta propuesta del modelo de la PPM, se evaluaron los resultados relacionados con la

imposibilidad de hidrolizar la cola de polihistidinas en la enzima PPM sobreexpresada. Esta cola de

polihistidinas había sido añadida en el sistema de expresión c0n el objeto de facilitar la

purificación de la enzima recombinante. De esta manera, la enzima puede ser fácilmente

purificada utilizando cromatografía de afinidad usando columnas de Ni-agarosa. Luego del paso de

purificación y debido a Ia baja actividad de la PPM, se intentó remover estos residuos de histidina


añadidos, utilizando una hidrolasa especifica denominada enteroquinasa. Se intentaron diversas

condiciones para enzimáticamente remover esta cola de polihistidinas, sin éxito. Como se observa

en la Figura 7.11, la cola de polihistidinas se encuentra ubicada dentro de uno de los dominios de

la PPM modelada (los residuos del extremo N-terminal de la proteína se han resaltado en rosa). La

incapacidad de hidrolizar enzimáticamente Ia cola de polihistidinas puede ser explicado debido a

que la misma se halla enterrada dentro del dominio, siendo de esta forma inaccesible al ataque

por la enteroquinasa.

Figura 7.11. Localización de los residuos N-terminales en la cadena de Ia PPM.

7.3 Conclusiones

En el presente capitqu se ha generado el modelo de la PPM de E. coli por la metodología

de modelado por homologia. Luego se ha hallado el sitio de unión a Iigandos por diversos medios.

Finalmente se ha determinado el modo de unión por experimentos de acoplamiento molecular o

docking. Estos experimentos revelan dos posibles modos de unión para los ligandos estudiados, en

los cuales intervienen los mismos residuos.

Se precisará de futuras investigaciones para establecer el modo de unión de esta enzima.

¿33‘ Capítulo 8 - Resumen de resultados, conclusiones y perspectivas

Capitulo 8

Resumen de resultados, conclusiones y perspectivas

8.1- Resumen de resultados

1. Se obtuvieron D-ribosa S-fosfato, D-desoxirribosa 5-fosfato y D-arabinosa 5-fosfato

mediante el uso de una estrategia quimio-enzimática versátil partiendo de los azúcares

naturales. Para ello, se estudió Ia regioselectividad de las reacciones de desprotección

mediante reacciones de hidrólisis biocatalizadas utilizando diversas fuentes enzimáticas,

hallándose regioselectividades distintas dependiendo del tipo de pentosa. También se

llevó adelante un método de obtención del difenil (3-azido-3-desoxi-1,2-O-isopropiliden-a

D-xilofuranosa) fosfato.

2. Se logró sobreexpresar con buen rendimiento y alta pureza, Ia PPM de E. coli utilizando

métodos habituales de biología molecular. Se determinaron las condiciones

experimentales óptimas para Ia reacción de sintesis de nucleósidos a partir de las

furanosas 5-fosfato.

3. Se exploró la generalidad de esta aproximación sintética, utilizando como biocatalizador

el sistema enzimático acoplado (PPM + NPs), partiendo de las furanosas S-fosfato

sintetizadas previamente y distintas bases comerciales. De esta forma se han obtenido con

altos rendimientos (70-100%) los nucleósidos: adenosina, inosina, G-mercaptopurin

ribonucleósido, 1,2,4-triazol-3-carboxamida ribonucleósido (Rivabirina), timidina, 2'

desoxiuridina, S-fluoro-Z'-desoxiuridina y S-bromo-2'-desoxiuridina. Asimismo se han

obtenido diversos nucleósidos con moderados rendimientos (30-50%), tales como la

guanosina, 2-amino-6-cloro-purín ribonucleósido, 2-fluoroadenosina e hipoxantín

arabinonucleósido. Finalmente se han obtenido con escaso rendimiento (10-30%) los

siguientes nucleósidos: adenin arabinonucleósido, 6-mercaptopurín arabinonucleósido,

1,2,4-triazoI-3-carboxamida arabinonucleósido, 2'-desoxiinosina y 2-amino-6-cloro-purin

2'-desoxirribonuc|eósido.

234 Capítulo 8 - Resumen de resultados, conclusiones y perspectivas

4. Se ensayaron diferentes estrategias para Ia inmovilización de la PPM, encontrándose que

la más eficiente consistió en el atrapamiento de la enzima en materiales híbridos de sílica

quitosano preparados mediante la tecnología sol-gel, utilizando THEOScomo precursor y

procesados por la metodología de lSISA.Luego se co-inmovilizaron exitosamente la PPM y

PNPen eI sol-gel hibrido silica-quitosano, mostrando una elevada estabilidad operacional.

Por último se trabajó con mayores concentraciones de sustrato, demostrándose que

pueden utilizarse concentraciones de hasta 30 mM con buenos rendimientos, a tiempos

COl’tOS.

S. Se generó el modelo estructural de la PPM de E. coli por Ia metodología de modelado por

homología. Luego se localizó el sitio de unión a ligandos por diversos medios. Finalmente

se determinó aproximadamente el modo de unión de los ligandos mediante experimentos

de acoplamiento molecular o docking. Estos experimentos revelan dos posibles modos de

unión para los ligandos estudiados, en los cuales intervienen los mismos residuos.

8.2- Conclusiones y perspectivas

Enprimer lugar, se ha presentado una estrategia quimio-enzimática versátil para la síntesis

de diversas furanosas S-fosfato partiendo de los azúcares libres. Con este fin, se protegieron

químicamente todas la funciones hidroxílicas de diversas pentosas, para luego evaluar la

regioselectividad de las reacciones de hidrólisis biocatalizadas por diversas fuentes enzimáticas. Se

encontró que, usualmente, estas reacciones eran regioselectivas para la posición 5, pero

sorpresivamente, se observó que ciertas pentosas eran regioselectivamente desprotegidas en

posiciones secundarias. Éstas fueron:

- La desacetilación enzimática utilizando CRL del metil 2,3,5-tri-0-acetiI-u,B-D

xilofuranósido asi como de su análogo 3,5-di-O-acetiI-1,2-0-isopropiliden-a-D

xilofuranósido, que proporcionó los productos desacetilados en la posición 3.

- La desacetilación del butil 2,3,5-tri-0-acetiI-a,B-D-xi|ofuranósido utilizando p0rciones

de banana, que procedió regioselectivamente dependiendo de la configuración del

carbono anomérico, obteniéndose únicamente de forma pura el anómero B

desprotegido en la posición 2, es decir el butil 3,5-di-0-acetiI-B-D-xilofuranósido.

235 Capítqu 8 - Resumen de resultados, conclusiones y perspectivas

- La desacetilación utilizando porciones de banana del metil 2,3,5-tri-O-acetiI-u,B-D

arabinofuranósido, que procedió con elevada regioselectividad, obteniéndose como

producto mayoritario el arabinósído desacetilado en la posición 2, a conversiones de

reacción moderadas.

Estas furanosas desprotegidas en hidroxilos secundarios podrían utilizarse como posibles

precursores en la síntesis de diversas furanosas 5-fosfatos modificadas. La síntesis de estos

compuestos seria de interés con el fin de:

o Evaluar la posible síntesis de diversos nucleósidos modificados en el azúcar,

utilizando el sistema enzimático acoplado descripto en esta tesis.

o Extender la información relativa a la especificidad de sustrato de la PPM en

estudio.

Esto último es de gran interés ya que Ia especificidad de sustrato de la PPM de E. coli ha

sido pobremente estudiada, habiéndose ensayado sólo las actividades relativas de Ia D-ribosa 5

fosfato, 2-desoxi-D-ribosa S-fosfato, D-arabinosa S-fosfato y 2,3-didesoxi-D-ribosa 5-fosfato.

Asimismo, el estudio de Ia selectividad de la enzima contra diversos sustratos podría ser de

utilidad para complementar el experimento de acoplamiento molecular o docking realizado sobre

el modelo obtenido de la PPM.

Con respecto a la síntesis de nucleósidos llevada a cabo en este trabajo de tesis, se

observó que, en general, los ribo- y desoxirribonucleósidos fueron obtenidos con elevados

rendimientos utilizando el sistema enzimático acoplado, mientras que los arabinósídos

correspondientes se obtuvieron con rendimientos menores. Como se ha descripto anteriormente,

esto podría deberse a Ia especificidad de la NPs más que a la de la PPM, para la cual se reportó

que la D-arabinosa-S-fosfato presentaba una actividad relativa similar a Ia del sustrato natural.

Con el objeto de obtener arabinonucleósidos con altos rendimientos, se debería acoplar la PPM

sobreexpresada a NPs que acepten más eficientemente como sustraro la D-arabinosa 1-fosfato.

Diversos estudios realizados por nuestro grupol demostraron que es posible sintetizar

arabinonucleósidos purinicos utilizando células enteras de E coli BL21, partiendo de

arabinonucleósidos pirimidinicos y bases purinicas. Por Io que es posible obtener

arabinonucleósidos con elevados rendimientos utilizando como biocatalizador el sistema

enzimático acoplado formado por la PPMy células enteras de E.colíBL21.

1Rogert, M.; Martinez, N.; Porro, S.; Lewkowicz, E.; Iribarren, A.; Molecules, 2000, 5, S35.

236 . Capítqu 8 - Resumen de resultados, conclusiones y perspectivas

Por otra parte, Ia inmovilización de la PPM y la PNP permitió el re-uso de estos

biocatalizadores al menos durante 7 ciclos sin observarse pérdidas significativas de la actividad.

Este resultado preliminar permitiría abordar futuros estudios de escalado a nivel multigramo de Ia

reacción, con el objeto de evaluar su potencial utilidad tecnológica. Asimismo, la inmovilización de

los biocatalizadores permitiría estudiar el posible uso de co-solventes orgánicos con el objeto de

aumentar la solubilidad de las bases, factor usualmente limitante en los reacciones en medios

acuosos

Por último, se llevó adelante un modelo estructural de la PPM utilizando herramientas

bioinformáticas, determinando un sitio aproximado de unión de los ligandos. Esto se realizó con el

fin de comprender el mecanismo por el cual esta enzima ejerce su especificidad, permitiendo de

esta forma el diseño racional de mutantes con el objeto de disminuir dicha especificidad. Debido a

que la determinación realizada por experimentos de dockíng no es suficiente para demostrar

fehacientemente el modo de unión de los sustratos al sitio activo de la enzima, es decir los

aminoácidos involucrados y su posición, restaría realizar ensayos de mutagénesis dirigida de forma

de demostrar que estos aminoácidos son fundamentales para la unión del Iigando, además de los

correspondientes ensayos bioquímicos confirmatorios.

síntesis quimio-enzimática de nucleósidos naturales y modificados · 2018-07-13 ·...

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