speciation of volatile antimony compounds in culture headspace gases of cryptococcus humicolus using...

7
Speciation of volatile antimony compounds in culture Speciation of volatile antimony compounds in culture headspace gases of headspace gases of Cryptococcus humicolus Cryptococcus humicolus using solid using solid phase microextraction and gas chromatography±mass phase microextraction and gas chromatography±mass spectrometry spectrometry L. M. Smith 1 *, W. A. Maher 2 , P. J. Craig 1 and R. O. Jenkins 1 1 Departments of Biological Sciences and Chemistry, Faculty of Applied Sciences, De Montfort University, The Gateway, Leicester LE1 9BH, UK 2 Ecochemistry Laboratory, Science and Design, University of Canberra, ACT 2601, Australia Received 24 September 2001; Accepted 18 February 2002 Direct analysis of the volatile antimony compounds stibine (SbH 3 ), monomethylantimony, di- methylantimony (Me 2 Sb) and trimethylantimony (Me 3 Sb) using solid phase microextraction (SPME) with polydimethylsiloxane fibres and gas chromatography±mass spectrometry (GC±MS) is described. The best analyte to background signal ratio was achieved using a 20 min extraction time. Antimony species were separated using a 3% phenylmethylsilicone capillary column operated at a column pressure of 70 kPa, a flow rate of 1.4 ml min 1 and temperature ramping from 30 to 36 °C at 0.1 °C min 1 . Cryogenic focusing of desorbed species was required to achieve resolution of antimony species. The optimized SPME±GC±MS method was applied to the analysis of headspace gases from cultures of Cryptococcus humicolus incubated with inorganic antimony(III) and (V) substrates. The headspace gases from biphasic (aerobic±anaerobic) biomass-concentrated culture incubations revealed the presence of SbH 3 , Me 2 Sb and Me 3 Sb. Stibine was the major antimony species detected in cultures amended with inorganic antimony(V). Me 3 Sb was the sole volatile antimony species detected when cultures were amended with antimony(III). Copyright # 2002 John Wiley & Sons, Ltd. KEYWORDS: SPME; GC±MS; antimony; methylantimony; stibine; biomethylation; Cryptococcus humicolus INTRODUCTION Solid phase microextraction (SPME) gas chromatography± mass spectrometry (GC±MS) has been used extensively for the analysis of volatile organic compounds (VOCs). 1±4 SPME with GC±MS or inductively coupled plasma (ICP) MS detection has, in recent times, been applied to the analysis and speciation of derivatized involatile organometallic compounds of lead, tin and mercury. 5±7 As yet, there are no reports of the analysis of volatile organometallic compounds of environmental origin using SPME. SPME is a simple, solventless technique that allows the rapid pre-concentration of trace compounds onto a fibre from samples. Volatile species may be sampled from the gaseous phase, whilst involatile species may be sampled from the aqueous phase, or derivatized to a volatile form and sampled from the headspace. 8 The technique excludes water from the extract, avoiding the analysis problems associated with water when headspace and aqueous samples are extracted by other means. 9,10 This is advantageous for the analysis of environmental samples and microbial cultures, where abundant quantities of water vapour may be present in headspace gases. The SPME technique relies upon the equilibration of analytes between the liquid, and or the headspace gas and the stationary phase coating of the fibre. Equilibration, therefore, depends on the dissociation constant of the analyte and the thickness of the stationary phase. The amount of analyte adsorbed by the fibre is directly proportional to the concentration of the analyte in the *Correspondence to: L. M. Smith, Institut fu È r Umweltanalytik, Uni- versita È t Essen, Universita È tsstr. 3±5, 45141, Essen, Germany. E-mail: [email protected] Copyright # 2002 John Wiley & Sons, Ltd. APPLIED ORGANOMETALLIC CHEMISTRY Appl. Organometal. Chem. 2002; 16: 287±293 Published online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI:10.1002/aoc.303

Upload: l-m-smith

Post on 06-Jun-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

��������� � �������� ��� �� �� ����� � ���������������� � �������� ��� �� �� ����� � ���������������� ����� ���������� ����� � ����������� ����� ������������ ����� � ���� ��������� ���������� ������������� �� ��� ���� ���������� �������� ������������� �� ��� ���� ���������� ���������� ����������� ������ �� ������ �� � ������� �� �� ����� ��� �� �� �������

1Departments of Biological Sciences and Chemistry, Faculty of Applied Sciences, De Montfort University, The Gateway, LeicesterLE1 9BH, UK2Ecochemistry Laboratory, Science and Design, University of Canberra, ACT 2601, Australia

�������� �� ���� �� ����� ������� �� �� ����� ����

������ ������� � ��� �������� ��� �� �� ����� ������ ������� �� �������� ��� ���

�������� �� ��� ��� �� ��� �������� �� ������� ���� ����� ����� ������������� ��!�"�

#��� ������ ������������ ����� �� ��� ���� ���������� ��� ������� ���� �$%���� ��

���������& '�� ���� ������ �� ���(����� ����� ����� #�� �������� ���� � ) � ���������

�� �& *�� �� ������� #��� ��������� ���� � �+ ����� ������������ ��������� ���� ��������

�� � ���� �������� � ,) (!�� � ��# ���� � -&. � ��- �� �� �������� �� ��� �� �) �� �/°%�� )&-°% ��-& %������� ������ � �������� ������� #�� ��0����� �� ������� ��������� �

��� �� �������& '�� ���� �1�� �!�"�$%��� ����� #�� ������� �� ��� ������� � ���������

����� �� �������� � ����������� ����� � �������� #��� ������� ��� ���222� �� �3�

����������& '�� ��������� ����� �� �������� ������������������ ��� �������������� �������

��������� �������� ��� ������� � ����� �� �� �� �����& ������ #�� ��� �4�� ��� ��

������� �������� � �������� � ���� #��� ������� ��� ���3�& ����� #�� ��� ���� ��������

��� �� ������� �������� #�� �������� #��� � ���� #��� ��� ���222�& %��������� )) 5��

6���� 7 ���� 8��&

9":6;<��= ���� ����� ��������� ��� �!��������� "�� ���� ����� �!������ ����������� ����� �

2>'<;�?%'2;>

�!�� �"� ������#�������� $���% &�" � ������&�� ��

��"" "���������� $����% �" ��� �"�� �#���"���!� '��

� � ���!�"�" �' ��!���!� ��&���� �������" $()�"%*��� ���

+�� ���� �� ���������!� ���!�� !�"�� $,��% �

��������� �"- �� ������ ����"- ��� �!��� �� � � ���!�"�"

��� "�������� �' ��������.�� ����!���!� ��&�������!!��

�������" �' !���- ��� ��� �������*/�0 �" ���- � ��� ���

�� �����" �' � � ���!�"�" �' ��!���!� ��&�������!!��

�������" �' ������������! ���&�� �"��& ���*

��� �" � "��!�- "�!����!�"" ��� ��1�� � �� �!!�+" � �

���� ��2������������� �' ����� �������" ���� � '� ��

'��� "��!�"* (�!���!� "����" ��� � "��!�� '��� � �

&�"���" �"�- + �!"� ����!���!� "����" ��� � "��!��

'��� � � �1����" �"�- �� ��������.�� �� � ��!���!� '��� ���

"��!�� '��� � � ���"���*� 3 � ��� ��1�� �#�!���" +����

'��� � � �#�����- �������& � � ���!�"�" �� !��" �""�������

+�� +���� + �� ���"��� ��� �1����" "��!�" ���

�#������� � �� �� ����"*4-�� 3 �" �" �������&���" '�� � �

���!�"�" �' ������������! "��!�" ��� ����� ��! ��!����"-

+ ��� � ������ 1��������" �' +���� ����� ��� � ��"���

�� ���"��� &�"�"*

3 � ��� ��� ��1�� ��!��" ��� � � �1��!� ������ �'

���!���" ��+��� � � !�1���- ��� �� � � ���"��� &�" ���

� � "��������� �"� ������& �' � � '� ��* �1��!� ������-

� ���'���- �����" �� � � ��""�������� ���"���� �' � �

���!��� ��� � � � ��5��"" �' � � "��������� �"�* 3 �

������ �' ���!��� ��"�� �� � � � '� �� �" ������!�

���������! �� � � ������������� �' � � ���!��� �� � �

*�����"������� ��6 7* �* ��� - ,�"����� '�8 � 9�+�!����!���5- 9��2���"���8� �""��- 9�����"���8�""��* :�/- �/���- �""��- �������*�2���!6 !���"�*"��� ;���2�""��*��

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��*

���7,�? )���@)��3�77,� �A��,3�B

��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

�� !�" �� ��!��� �� =�!�� ,���������� $+++*�����"������*+�!��*���%* ?),6��*����C���*:�:

"��!� + �� � � "�"��� �" �� �1��!� ����* 3 � ��!�����" �

�' � �"� '�����" �" ��"��� �� � �1�* $�%6��

� � �������

��� � ���: � �����

+ ��� � �" � � ��� �� �' ���!��� ��!�" "�� �� � � � '� ��

������&- �� �" � � ������! ���!��� ������������� �� � � �1����"

�"�- ��- �� ��� �: ��� � � ��!���" �' � � ������&- �1����"

�"� ��� � � ���"��� ��"������!�- �� �" � � ��������

���''������ �' � � ���!��� ��+��� � � ���"��� ��� � �

�1����" �"�"- ��� � $D ����% �" � � &!� �! ��������

���''������ �' ���!���" ��+��� � � '� �� ������& ��� � �

�1����" �"�*

��� �" � ���'��� ��&�!���� � �������� ���''������" ���

A����E" ���"����" $+ �� ��� ���������� ��������%-�� ���

�!"� � � ��!��� �' �1����" "��!� ��� ���"��� ��!���

��� � � ���� �!!�+�� '�� ��"������ �� �����*

3 ��� ��� "�����! �����" �' �������� ����� �!����� �

����'���� ����������" �' ������� &��+� ����� ������ ��

���������"*����� ������!�- ��� �!5� �� � ��/ ������� � �

����� �!����� �' ����&���� �������� � ��� ��!����" �'

� ��� ��� ���&���� ��� ��� "����"- �' � � �����!����

������� � �������� �� ���������� ��� �' � � "�!'�&��

��� �������� �� ����* (�!���!� ������ �!�������� +�" ��2

������ �" � � "�!� ��� �!�������� "����" �� ���"���

&�"�" �' � �"� ��!����"* ��� �!5� �� � � �!"� ������� � �

��������� �' "�� ��� �� ��������������� ��������� ��!����"

������� +�� �������� ���� !�����*�/

� ��� �� �' &���" ��� ������� �� � � � �!��� �' � �

'��&�" ����� ������ �������� � �� ������ ��!���!� ��������

"����" '��� ����&���� �������� "� "�����*�F��� <��5��" ��

� ��F ������� � � ��������� �' ������ �!�������� '���

���""��� �������� �������� $��3% � ����� ������ ������

��� � ��� ����� � � ��������� �' ��5��+� ��!���!�

�������� "����" + �� ��!����" +��� ������� +��

�������� ����#��� �� �������� ����#���* �����+�" ��

� ��0 �!"� ������� � � ��������� �' !�+ �������������" �'

������ �!��������- �" +�!! �" ����� �������������" �' "�� ���-

������� �!�������� ��� ����� �!��������- '��� ��3 �

� �" ��&���"�*

=� ����� � � ����!����� �' �� �������� ��� ��

'�� � � ���!�"�" �' ��!���!� ��&����������� �������"- ���

� � �!������� �' � �" ��� �� �� � � ���!�"�" �' ��!���!�

�������� "����" ������� � � � '��&�" �����������

����� � + �� ��!����" ��� ������� +�� ��������$,,,%

��� $(% �������"* 3 �" ��&���"� �" � 5��+� ����� �2

!���� �' ����&���� ��"���� ��� �" ��� �����"������ �� '���

������ �!��"���� �� ���"��� &�"�"*�4-��

"@!"<2�">'*8

!��������� � �������� �� ���������� ���- ������� �!��������- ����� �!�������� ��� ���2

��� �!�������� "�������" +��� ������ � ������2

&��������& ������ �!�������� ��� !����� $5���!� �������

� ���'�""�� =* �* ��!!��- 9�����"��� �' G����" ��!�� ��-

������% �� �� �#�&������ ����" ��� �� �� ���� ��"����2

���� �' � � ������ �!���� �������� "����" �� � � !�+��

��� �!���� �������"* (�!���!� ������" �' � �"� "����"

+��� &�������� �� � / �! �������� ���! ���������& �*/ �!

�����'��� "��!� $��� �! ��H $+C�% A�!- �*�/ �! ������.��

+���� ���������& ������ �!�������� ��� !����� "�������% �

� � ��I������ �' �/� �! �H $+C�% "����� ��� ������ ��� � �

"����*

�!�"��� +�" ��'����� �"��& �!������ �!"�!�#��� '� ��"-

��� �� '�!� � ��5��"" $��!��- ��"�!� A�!!- @�+ ��� =�!�"-

��"���!��%* ��� '� ��" +��� ����������� �� � � �� ��I������

��� '�� � �� � � "���� �' � � ���!�����! ���- ��� "� "�1����!�

'�� �� ��� ��+��� ��� ��I������* A���"��� �#��������"

+��� ��'����� �� �/°� '��� "�������" ��� !�1��� "��!�"

$��!���� �����% � �� +��� �&������ ���������"!� �"��&

��&����� "������&* ��"������� �' ��� "��!��& �' ���!���"

'��� ���"��� &�"�" �" ��� �����"������ �� � �����"�!�

��!���� �� � � ���"��� ��!���*��-�� 3 � "��!� ���"���

+�" "�� �� �*/ �! '�� "�������" ��� � �! '�� "��!�"- "����

� �"� +��� � � "��!!�"� ���"��� ��!���" � �� ���!�

�������!!� � �"��* 3 � ����� �' �1����" �"� �� ���"���

��!��� +�" ���������� '�� "��!�" ��� "�������"*

3 � &��&� "�����& $�� ��I�"� '� �� !��&� % �� � � �����!

'� �� �!��� '�� ���"��� �#��������" +�" �*�* )��� � �

�#�������� ����� +�" ���!���- � � &��&� "�����& �� � �

�����! '� �� �!��� +�" ��I�"��� �� :*� ��� � � '� �� +�"

����"'����� �� � � �� ��I����� ���* 3 � �#�������� ����� +�"

������ �� �����.� �#�������� �' "����" �' ������"� +��

��"��� �� ��5&����� ���"�*

$%��� ������� � �������� �� ��������!! ���!�"�" +��� ��'����� �� �� A� /�4� &�" � ������2

&�� +�� � "!���"!��!�"" ��I�����- � ��� �� ���#��� ����2

&���� '���"��& ���� $��- ���&+���- (�������- ��"���!��%- �

'!��� ����.����� ��������- ��� ��A� /40���"" "����������

$A�+!��� ���5���- G!��5 ���- (�������- ��"���!��%* 3 �

��I����� +�" ������� �� "!��!�"" ���� +�� � ��!�� ����

�' :� "* ��������" +��� ��'����� �"��& � :� �� �*�/ ��

$�*�/ �� '�!� � ��5��""% A�2/ $:H ���!��� �!�!�2

"�!�#���% ���!!��� ��!��� $A�+!��� ���5���%* 3 � ��!�� ���

��� �������� +��� ���������� �� �/�°� ��� :��°� ��"��2

����!�* A�!��� $�*� �! �����% +�" �"�� �" � � ������� &�"*

��!��� ��� ��""��� +�" ���������� �� 0� 5��* ����&����

'���"��& �' ��!���!� "����" +�" �� ����� � ���!��& � �

������! ��� �' � � ��!��� �� �/�°�* �'��� � "��!� ���- � �

���� ���������� +�" ���"�� �� �/�°� '�� �� ��� �� ��&�

��� �������!" �������� �� � � ��!���* 3 � ��"" "�����2

����� +�" ������� �� �!������2����� ����* ������& +�"

���� � � ���&� /���/� ��"" ����"*

!��������� � �� ����� � ���������� ����� � +�" ���������� � ������� "� 2��!���� ��

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��* ��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

��� 7* �* ��� �� � �

"�!���'��� B� ������ ������ �" ��"��� �� � B����� ��

� ��: 7�1��� B� ������ +�" �"�� '�� ��!���� ���� �����"*

3 � ������ +�" ������ "�� � �� � � '���! ��!���

������� ��H �' ����! '!�"5 ��!���- �*&* '�� � /�� �! '!�"5

��� �! �' ������ +�" �"��* 3 � ������ +�" �������

+�� ��������$,,,% �" ��3 �� ��������$(% �" ���""���

�#� ����#����������� $�AA�% $�&����!���� - ���!�-

?��"��- 9J%- �� &��� �������� �������������" �' /� �& !��-'��� "����!� "���5 "�!�����" � �� �� ��� �����!����*

��!���� �����!�� +�" ������ '��� �&�� "����5 !���"-

���� ���� ������& � �� ��°�* ��!���� +�" "+� �� �'' �&��

!���" ��� ��"�"����� �� �� �! �!�1���" �' '��" !�1���

������ �� ������ � ��� �� ��!! "�"��"��� +�� ��

� "�� ���� �' ��� ���� �� � D F�� ��* ,����!�� +�" �����

�� ��!���� ������ �� �*/ �! �� ��� �!* ��!����" +���

���� ���� �� ��°� ��� ��� �� �� � ��!!��5�� �� ���!

���� ���� '�� F ���"* �!�1���" $:� �!% �' ��!���� +���

����"'����� �� :/ �! �������� ���!" ���������& � ��&�����

'!�� ��� "��!�� +�� � ����!� "����* �������� ���!" +���

���� ���� ������ ���!!� $� �� �� ���"%- ����! ��� ���!�"�"

+�" ��'�����- �� �� �� ���! ���� ���� $�� ��°� ��� ��� ��%

�� ������.� ���"����� �' ����"" �� � � �������� ���!"*

������������ ����"" ��!����" +��� ������ '�� ���

���!�"�" � ������������& F2��� ��!����" ���'�!� � ������2

'�&����� $���� ��- �� ���%- ��� ���� ����& �" ��"��� ��

� ���* ������! ���� �����" +��� ������ � �������&

�����!����� �' ����""*

$%���� �� ��������� ������� ���� �**��������� � �������� ��� �� �������A���"��� &�"�" '��� �� ����� � ��!����" +��� �!"�

���!�"�� � �����* ������������ ��!����" +��� ������

�" ��"��� �� � ��� '�� �������� ���!�"�"* �'��� � �

���� ����� ����� +�" ���!���- ���"��� &�"�" +���

��&�� �"��& � '!�+ �' �!��� $�� �! �����% '�� �� ���

� ���& � !�1���2�����&��2���!�� /� ��� � �� �*�* &!�""

��!��� ��5�� +�� �3 ��H )(��� �� ��C��� ��"

� ����"�� 2=2A� $�!!��� �""������"- ?���'��!�- ,!!����"-

9�% +���� +�� ���5�!�� ������ ��"�"����� +��� $��*�� ����%* �'��� ��&��&- � � !�1��� �����&�� +�" ������� ���

� � ��!��� +�" ����� �!������ ����!!� � ���"���� ��!��&�

�!������� �' �� (- �� � '���! ���������� �' 4�°�* (�!���!�"����" +��� �!���� '��� � � ��!��� ��������& �� � ���

��!��& ���� ��� ���!�"�� �"��& � ���5�� �!��� $G�����"2

'��!�- G��5"*- 9J% ���:�� ������ � "������ "����������- �"

��"��� �� ������"!�*��

<"�?8'� *>� �2�%?��2;>

;��� �1���� � �!�" ���� �������� ���"��� �#��������" +��� ��'����� �� �/°�- "���� �& �� ����������" &�����!!� '����� �#�������� �' ����!���!�

"����"*�-�/ ,�����"��& � � �#�������� ����� '��� / �� �� ���

"�!������!� ������"�� � � ������ �' ��� �!�������� ���!���

�������� ���� ��5&����� "�&��! � ���� $��&* �%* ���� ��

������"��& � � �#�������� ����� �� �� ��� �&��� ������"��

� � ������ �' ��� �!�������� ��������- �� �!"� "�&��'�2

����!� ������"�� � � ��5&����� "�&��!* 3 � ��5&�����

"�&��! +�" ������'��� �" ���& "�!�#���"- � �!���" ���

�#������� ���� �"���"- + �� ��"� !�5�!� ���"� '��� � �

!�"��� "��� "�"��� �"�� +�� � � �������� ���!* 3 �

������������& ��5" ��� ��� ���"� '��� � � '� �� ��"�!'- "����

���!�"�" �' !��5 '� ��" ��� ��� �����! � � ��"���� �' "��

�������"*

3 � �#�������� ���� �' �� ���!��� � ��� �" ������!�

��!���� �� � � ���!��� �������� ���''������" $�� ��� ��%- + ��

&�����!!� ������"� +�� ������"��& ��!���!�� +��& �*��

,�����"��& � � �#�������� ����� +�!! � ���'��� ��"�!� ��

Figure 1. ���������� ��� ��� �� ������� ���� ������ �� ��� ����� ���� ���� ��� ����� ��������� ������� ��� � ��� �� �� � ����� �� � ���� ����� ������ �������� ���� �����

������� ������� ��������� ��� ����� ������ � � ! " ���# �$! %& ��� �� ��! '& ���� (� �� ) � )�� *

�������� ������� ��������

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��* ��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

���2��2� ���!�"�" �' ��!���!� �������� �������" ��4

"�!������ �� �������� �' � � �#�������� �' �& �� ��!���!��

+��& � �������"- "�� �" � � !�"����.��" � "����� ���*

��""� !� ��������� ��+��� "� "�1���� ���!�"�"- �*�* � �

�����!��� ��"������ �' "��!� ���!��� '��� ��� '� ��"-

+�" ����"��&����* ���!�"�" �' ���"������� '� �� !��5"

'�!!�+��& �#�������� �' � �� �& !�� ��������.�� ������ �!2

�������� � !����� "�!����� ��� ��� �����! � � ��"���� �'

�������� "�� ��� �� ��� �!�������� "����"* 3 �" ��������"

� �� � � ��!���!� �������� "����" +��� �''������!� ��"�� ��

'��� � � '� �� ����� � � �#��������! ���������" �"��*

�!�����& �' '� ��" ��+��� �#��������" +�" ��'�����

$�� ��� �� �/�°�% �� '�!!� ��"�� ����!������� �& �� ��!���2

!�� +��& � �������"- "�� �" "�!�#���" ��� � �!���"-

'��� � � '� ��*

;��� �1���� � $%��� ���� �����������! �' � � �� &���� ��!��� ��� ��������� �� ��������

�' � � �� ��I����� ��� ��!�� !���� '��� � �� � �� �*�* ��

��"�!��� �� ��5 " ������&- "���� � � !����� ��!����� �' � �

���!���" � ���& � � ��I����� ��� +�" ������"�� ���

���!���" +��� ���������� ���� � � ��!��� �� � �����+��

���*

?�����"��& � � ��!��� ���������� ��&��� $������!

��!��� ���������� ��°� �� :/°�� '���! ���������� ���°�

�� ��°� ����� �� /�°� �� /°������% �� �� � "����� �''���

�� � � ��"�!����� �' � � '��� �������� "����"* ��"�!����� �'

����� �!�������� ��� ������ �!�������� "����" +�"

�� ����� � ����&���� '���"��& �' � � �������� "����"

��"�� �� '��� � � ��� '� �� �'��� "�������� �� � �

���!!��� ��!��� $��&* �%* ?�����"��& � � ��!��� ������2

���� �����& ��&��� '��� /°� ����� �� �*�°� ����� �'�������&���� '���"��& ��"�!��� �� � � ��"�!����� �' �!! '���

��!���!� �������� "����"� "�� ���- ������� �!��������

������- ����� �!�������� ������ ��� ������ �!��������

$��&* �%* 3 � �������� �' � �"� "����" +�" ���'����� � � ���

��"" "����� $"�� ��&* : '�� �#��!�"%*

��������� ����������#�������� �' ��!���!� �������� "����" '��� ��!���� ���2

"��� &�"�" +�" ��'����� �� �/°� '�� �� ���* 3 � ��!����

������ +�" �&������ ���������"!� �"��& ��&����� "������&*

3 � &��&� "�����& �� � � �����! '� �� �!��� +�" �*� �����&

� � �#�������� �����* )��� � � �#�������� ����� +�"

���!���- � � '� �� +�" ��������� ��� � � &��&� "�����& ��

� � �����! '� �� �!��� +�" ��I�"��� �� :*�* 3 � '� �� +�"

���������!� ����"'����� �� � � �� ��I����� ��� '�� ���!�"�"*

��!�" +��� ��"�� �� ��� ����&�����!!� '���"�� �

���!��& � � ������! ��� �' � � ��!��� �� �/�°�* )���

Figure 2. ���������� ��� ��� �� �� ��� ���� ������� ������� ������� �������� �������� ���� ��� ���� �� ������� ������� �������� ������� ���� ��

������ �� ����� � ������ ����� ��� �� �����+���� ����� ��� �� ���� �� )

� �� �� ��������� �� �� ��� ��� ���� ������� �������� (� ������ , � ��� �

����� � ����� ��� �� % ��� �� ��� ���� ��� �� �� -� � ����� ��� � �� ��

�� ��,�. � ! /"°�# "&°�0 "°� ����10 �$! /"°�# '"°�0 1�&°� ����10 ��! /&°�#/2°�0 &�1°� ����1� 3��������� �� ������� ������� ����� �� ������� ��������$!# �� �������# ��������� ������� �����# ������� ������� ����� ��

������� ������� ��!# , � ������ �� �������� �������� �� �� ������� �������

������� ��� �� ���� -�� ����� ��� ���� �� �� �� ������� 3�������� �����

�� ��� ���� ������� ������� ,��. �������# 1�/ ���0 ��������� ������� �����#

1�" ���0 ������� ������� �����# 1�4 ���0 ������� �������# %�1 ����

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��* ��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

�4� 7* �* ��� �� � �

���������� +�" ��&������ "�� � �� $����% ����������

+�" ���������� �� :�°� '�� � ���- ��� � �� ����� �� :F°��� �*�°� ����� ��� �!� �� � �" ���������� '�� � '��� ��

� ���* �'��� ��� "��!� +�" ���!�"�� � � ���������� �'

� � ���� +�" ���"�� �� �/�°� '�� �� ��� �� ��&� ���

�������!" �������� �� � � ��!���*

� !����� ��!� ������ +�" � ������ '�� ������ �!��������

��� !����� !�����& ��� ����! ������ �' ��!���!� ��������

"����" �������� � ���� $� D �*�4� � �*�::4- !� D �*40�%*

(�!���!� �������� "����" ���!� � ��!�� !� �������� �� �

!�����& �' �*� �& !�� ������ �!�������� ��� !�����*

K�����'������� �' ��!���!� �������� "����" �� ��!���� ���2

"��� &�"�" +�" ���� � �����!����& � � ��5 ���� �'

"�������" +�� � � ������ �' ��!���!� �������� ��������.��

'��� ������ �!�������� ��� !����� $ �"�� �� ���"�������

�' ��������- � ,��2� �� �������� ��#����" ��2 ��� �"�2

��������.����� �' ������ �!�������� ��� !�����%* )�� ��"�!�"

��������� � �� ������ /�H $�? F*�H% �' � � ������ �!����2

���� ��� !����� �" ��������.�� �� ��!���!� �������� "����"

� "����� ��� ������ ����� � �"� �������� ���������"*

A����- '�� "�������"6 +�� � �*/ �! �1����" �"� ��� �

�*/ �! ���"���- �*� �& !�� $/*� �& ����! �1����" !�����&%������ �!�������� ��� !����� "������� �� � � �1����" �"�

+�" �""���� �� '��� �*/ �& �' ��!���!� �������� "����"

$"�� ��� �*�/ �& !��- ������� �!�������� �*�: �& !��-����� �!�������� �*�: �& !��- ������ �!�������� :*�4 �& !��%* 3 � ����� �' ��!���!� �������� "����" +�" � "�����

�� � ���"���� ���� � � ������������� ���&� �' ������ �!����2

���� ��� !����� "������* 3 � ������������� �' ��!���!�

�������� "����" �������� �� ��!���� ���"��� &�"�" +�"

��!��� ��������� ��� �#��""�� �� ����" �' ������ �'

�������� �� &��� ��� +��& � ����""*

�!�"�$%��� ������� � �������� ��� ��������� �������� �� �� ����� ����!�"�" �' � � ���"��� &�"�" '��� ��������$(%2�������

Figure 3. � ��5��� ��� ��� � �� � ����� ���� � ����� �� ���� ���� �� ���! �������# ������� �������

����� �� ������� ������� ��� ���� �� ���� �� �� � ��� �� �� �� ������� ������� �������� ,�� �66 �

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��* ��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

���2��2� ���!�"�" �' ��!���!� �������� �������" �4�

��!����" �'��� F ���" ���� �� ��� �� ���" ������ �� ����2

����� " �+�� � � ��"���� �' "�� ���- ����� �!��������

������ ��� ������ �!�������� $��&* :%* �� ��� +�" � �

���������� �������� "����" �������� $3� !� �%* ,� ���2

���"�- ������ �!�������� +�" � � "�!� ��!���!� ��������

"����" �������� �� � � ���"��� �' ��!����" ������� +��

��������$,,,% $3� !� �%* @� ��!���!� �������� "����"

+��� �������� �� ��� �' � � ������! ���� �����" �� + ��

�� ����� � +�" � "���- ���������& � �� � � ��!���!�

�������� "����" �������� ���"� �" � ��"�!� �' ��!�&���!

��������*

?����� ����� ���!�"�" �' ���"��� &�"�" $����"'�����

����� �!��� '!�+ �� � !�1���2�����&��2���!�� ��!���% '���

�� ����� � ��!����" $���'�!� ����""2������������% "�2

!��� +�� ��3 ���'����� � � ��������� �' ������ �!2

�������� �" "�!� ��!���!� �������� "����" �� ��!����

���� �����" "�!��� +�� ��������$,,,% "� "����� $��&* �%*

9 �� ��*0 �& &�� ��� ����"" �' ������ �!�������� +�"

� "�����- + �� �" ������ !� +�� � � ��������

���"������� �' ��*� �& &�� ��� ����"" '�� "���!�� ����2

�����" $3� !� �%* 3 �" �����"���" �� � ��!���!�.�����

�''������� �' �*���H �' � � ����&���� �������� "� "�����

"�!���* @� ��!���!� �������� "����" +��� �������� ��

������!" +�� ��� �� ����� � �� �������� "� "�����-

���'�����& � � ��&���� ������ �' � � ������ �!��������

'�������� ��� ��!���!�.�����* 3 �"� ���� ��� � � '��"�

�����"������� �' �������� ����� �!����� '��� �� ����2

&���� �������� "� "����� � � �" ��&���"�- ��� �����2

"�����" "�� ��� '�������� � � ��5������� ��&���"�* �!� ��&

�����+�" �� � ��0 ��"��� �� � � ��������� �' ����� ���������2

����" $���&���% �' "�� ���- ������� �!�������� ���

����� �!�������� �����& ���� ����� �' �� �������� � +��

��3 ��� �"������!!� ����� �� $4�*0H% ��:�AA�- � � �����2

���� �' "�� ��� ��� ������� �!�������� ������ �� ��

�������� � ���"��� &�"�" +�" ������������ ��� ��� ����2

����� �� ��!����� ���� �����"*

���5������� ��!���!�.����� �' �������� �" ������!� ���

�����"������ ��� �!5� �� � ��/ 3 �"� ��� ��" ������� � �

��������� �' ����&��� 1��������" �' "�� ��� �� ��!����

���"��� &�"�" �' �� ��������� ��!����" "�!��� +��

��������$,,,% "� "�����* ������� �!�������� ������- ��2

��� �!�������� ������ ��� ������ �!�������� +��� �!"�

" �+� �� � ��"��� �� ��!���� ���"��� &�"�"* G� ������"�-

�� � � +��5 ������� �� ��� '�� � � ��5������ �� ����� �-

"�� ��� +�" ������� '��� ��������$(% "� "����� �� ���

'��� ��������$,,,% "� "�����* ,�����! �#������� �' ������2

��$,,,% "� "����� �� �� ��������$(% '��� � �� ���������

+��!� ������� '�� � �" ������ ��''������ �� ��������

"� "����� ��1�������� ��+��� � �"� ��&���"�"* ���5�������

��2�#������� �' �������� L$,,,% �� $(% ����"'��������M ��� �'

� � �!�"�!� ��!���� ���� �/ �!����� ��"���� ��� ���

������� ����� ���� �� ��!�������� ���������"��F��4 ����&�

������� '��� � � �#������� �' �������� ����#��� � �������

������ ���������� �" ��� " �+� �� � ���!�� �� ��"��� 2

�"�"*�4 A�+����- ��������$,,,% �� $(% ����"����� � ��

��������� �" ��"� ��!�5�!� �� ��� �������� +�� �� � � �& !�

������ �� ��� ��&����� ����# �������! �����������" ��2

1����� '�� ��!�������� �' � � ��� ���&���� ��� ���*

Table 1. ���������� � ����� �� ��� ���� ������� ������������� �� � ��� �� � ��� ��� �� ������� ����� �����

����! "� "����� �������� "����" $�& &�� ��� ����""%�

A: �� ��� ��:

��3 L $,,,%M ��� �� �� ��*�� �*/

�AA� L $(%M ���*F� �*� �� /*�� �*: ��*�� �*�

� ����� "������� ���������- � D : ��!����� ��!���� ���� �����"*� �� D ��� �������� $��*� �& &�� ��� ����""%- ����&���� �������� "� 2

"����� +�" "�!��� �� ���� �����" �� /� �& !��*

Figure 4. (���� � ��� � ��� ��� � �� ��� ���� �������

��������� ������� �� �� ������� ��� ���� ��� �������

����� ��� � ! ��� ��� � �� ��� ���� ������� ��� �� ��!

������� �� ���� ��� ���� �� ������� ������� ���������

�$! 6� ��� �� � ����� �� �� ������� ������ ����� ����

�������� ,�� � (�

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��* ��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

�4� 7* �* ��� �� � �

�����+�" �� � ��0 ������� � � ��������� �' "��!! 1��������"

$�� �� &% �' "�� ��� '��� ���� �� ��!����" �' �� �������� �

"�!������� +�� ��������$,,,%* 3 � � �!��� �' � �" '��&�"

�� �#���.� ��������$,,,% �� ��������$(% �" �!"� ���

�������- �!� ��& "������& ���� +��� ��� �������*�0 ,�

�" �""� !�- � ���'���- � �� � �" ��5������ ������!!� �#���.��

"��� �' ��" ��������$,,,% "� "����� �� ��������$(%- + ��

� �� "����� �" ������"'�������� "� "����� '�� "�� ���

'��������*

)�� +��5 �� � � '��&�" �� ����� � ��������" � ��- '�� � �"

��5������� ��&���"� �� !��"�- "�� ��� '�������� �����" '���

��������$(% �� ��� '��� ��������$,,,% "� "�����* ,� �"

�""� !� � �� � �" �!�" '�� �� �� '��&� $��5������"%� � ��� �"

��� ��& �� � � !��������� �� "�&&�"� �� ��+�"�* G�"�� �� � �

��"��� ����� ��� � � ������� !��������� �� ����� ��! "�� ���

'��������-�/-�0 +� ���"� � �� �+���� ���"�" �' ����� ��!

'�������� �' "�� ��� '��� ����&���� �������� �#�"�6 ���

��1�����& ��������$(% "� "����� ��"��� �� ������� ��5����2

��� ������&���"�"- � � �� �� ��1�����& ��������$,,,% "� 2

"����� ��"��� �� ������� ��5������� ������&���"�"*

3 � ��"���� ������� �� ��� " �+" � �� ��� ���

"����""'�!!� � �!��� �� � � �������2"���'�� �����2

�������� �' �����&��� �� !���� �������������" �' ��!���!�

�������� "����" �� ������������! "��!�"- ��� ��������"

� �� ���"��� ��� �#�������� �" "�&��'����� �������! ��

� � "�������� ��� ���!�"�" �' ��&�������!!�� �������" ��

������������! "��!�"*

<"A"<">%"�

�* <�� �B- J�.��! < ��� ��+!�".�� <* "�� � ��� � ���� #���� � �����.6 0:*

�* 3���� ��2����� ?<- A��""�� �� ��� @����� J=* $� "������ ��������� ./6 4:�*

:* ?������.�! < ��� ����&� �* "������% $� ��� � ���� �444� �/.6F�/*

�* 7!����� �- 7� J ��� ���&�" �* #� ���� �444� .B6 �/�*

/* ��� B- ���"�!�� - ������ J�- <�''� � ��� <���" �?* ��� ����������� ���� �44�� - 6 /F/*

F* )��!!���2(�!��� @�- ������� � ��� ��.2����! �* $� ��� � ������������ ����� -/6 :0F*

0* ���&����� �- �!���2������ �- 7���!!� , ��� G����� � �* $� ��� ���� ��������� ����� -C6 0�/*

�* N ��& NB- B��& �< ��� ��+!�".�� <* ��� � ���� �44�� //6 ����*4* ������ ��� ��&�� <* $� ���������� � �44F� ,C)6 F:*��* <��!!��" G- G������� ( ��� ��&�� <* #� ���� �444� .B6 0�0*��* �����!!��� �� @- ������������ - ?�����!�� � ��� ?� 7�� �*

"������% $� ��� � ���� ����� �/D6 /��*��* ��8 �!���85 A- (�� �!���2��!��� ( ��� � �"���� 3�* ��� �

���������� ���� �440� --6 �0�*�:* ����" �@- A���� A�- ���� �� <G ��� ��� ��"� G* ���� #���

&������� �440� )C6 ��/*��* <��5��" �)- ����& �<- ��!!�� ?�- ��� 7���- )"�� @ ���

�����" 32�* ��� � ���������� ���� �44�� - 6 ��4*�/* ��� �!5� J- =��5�� ��"�� �G- �� ���& �- A����� �( ���

A��"�! �* ��� � &������� �������� � ����� //6 �04�*�F* <��5��" �)- ����& �<- ���""!�� =- ��!!�� ?- )"�� @ ��� ,�&�!��

J<* &������� ���� #���� � �44�� � 6 ���*�0* �����+�" �- ��!!�� =�- ��!����� <- J�� ,- ��!�" ��5 � ���

������ J<* ��� � ���������� ���� �44�� - 6 ��0*��* �����+�" �- ��!!�� =�- ��!����� <- J�� , ��� ��!�" � �5 �*

��� � ���������� ���� �444� -�6 F��*�4* ��# ?� ��� �!�#����� �* '� � &������� ������� #� ��� � �40:� D6

��*��* ��!!�� =�- ����"� �7- 7�� �- ��G���� G�- ������� ?< ���

������ �* $� ���������� ���� �400� -�D6 F�*��* ��!��* '� ���� ()*- �44/� ��F*��* ��!��* ��� ������� +��� ),- �440� ���*�:* B����� �- 9I��� A- J��� B- @�5�"� 3- J���&�+� J- ,��"�5� 3-

������� J- 3�5� �" � @ ��� ���"����� B* '������ '��������� �44F� - D.6 �/:*

��* ����& �<- ���"��� @- <��5��" �) ��� ��!!�� ?�* ��� �� �444�- .6 ���:*

�/* ��������.�- ������ �-������� 7- � ��� - ��!�� � �- � ������� ��� ������� * $� ���������� � ����� D 6 �/0*

�F* ����� AA* �� ���� $� ���� �4��� -.6 �/F*�0* K��"��! <� ��� � �!�O�!� ��* ��� ���� �4/:� ,C6 �04*��* )" ���� �A ��� � �!�� A7* $� ��� � '������� � �40F� .-6 �4/*�4* 7��!�5��� @@* ��-����� ���-� �40�� )C6 ����*

�����& � � ���� <� � =�!�� > ��"- 7��* ��� � ���������� � ���� ����� -/6 ��0��4:

���2��2� ���!�"�" �' ��!���!� �������� �������" �4: