Spekter mutacij pri bolnikih s

hemofilijo A v Sloveniji

M. Debeljak, L. Kitanovski, A. Trampuš Bakija, M. Benedik Dolničar

Pediatrična klinika

UKC Ljubljana

Laško, oktober 2012

X-vezana

HEMOFILIJA A

Hemofilija A je X-vezana recesivna dedna bolezen z motnjo v strjevanju krvi.

Hemofilija A se pojavlja pri vseh etničnih skupinah z enako pogostnostjo, 1 / 10.000 rojenih dečkov

Gre za pomanjkanje, odsotnost ali neaktivnost koagulacijskega faktorja VIII, kot posledica mutacij v genu za faktor VIII.

Glede na aktivnost faktorja ločimo:

težko (< 1%),

srednje težko (1-5%) in

lahko obliko bolezni (>5-30%).

Krvavitve pri hemofiliji – sklepi, mišice

1. Hemartroza z vnetjem

2. Kronični proliferativni artritis

3. Kronična hemofilična artropatija

ZDRAVLJENJE: koncentrat FVIII, koncentrat rFVIII, (FVII)

DDAVP-sproščanje FVIII iz celičnih zalog

INHIBITORJI

Pri nekaterih hemofilikih (30% težka oblika HA), ki so zdravljeni z

nadomestnim faktorjem VIII, imunski sistem terapijo zamenja za grožnjo

organizmu.

V odgovor, imunski sistem tvori IgG protitelesa (=inhibitorje), ki napadajo

faktor VIII.

Inhibitorji so zelo resen problem saj preprečujejo ali zavirajo nadomestno

zdravljenje z FVIII in s tem nadzor nad krvavitvijo.

Zdravljenje z nadomestnim faktorjem VII

Nadomestna terapija

FVIII inhibitorji

HEMOSTAZA (= vsi procesi in reakcije, ki prispevajo k

ustavljanju krvi po poškodbi žilne stene)

PRIMARNA reakcija

Kontrakcija žilne stene

Adhezija trombocitov

Nastanek trombocitnega čepa

SEKUNDARNA reakcija

Koagulacijski faktorji

v kompleksni koagulacijski kaskadi

pomagajo pri tvorbi fibrina

Učvrstitev trombocitnega čepa

intrinzična

pot

ekstrinzična

pot

skupna

pot

fibrin (prečno povezan)

Hoffman et al. Blood Coagul Fibrinolysis 1998;9(suppl 1):S61.

FVIII mRNA (9010 bp)

5’UTR FVIII kodirajoča regija + stop kodon 3’UTR

(150 bp) (9010 bp) (1806 bp)

NH2

Arg 372 Arg 740

A1 A2 B C1 A3 C2 COOH

težka veriga lahka veriga

Arg 1689

5’ 3’

1 2-6 7-9 10-12 13 14 15-22 23-25 26

10kb intron 22

FVIII

ORGANIZIRANOST

Kromosom X Xq28

exon 23 exon 22

HEMOFILIJA A

179 bolnikov s hemofilijo A

82 bolnikov s težko obliko HA

18 srednje težko obliko HA

79 lahko obliko HA

Laboratorijska in genetska diagnostika hemofilij

(1998 → ) – 150 bolnikov z opredeljeno mutacijo

Ocena tveganja za tvorbo inhibitorjev

Ugotavljanje prenašalk + prenatalna diagnostika

Debeljak M, Kitanovski L, Trampuš Bakija A, Benedik Dolničar M.. Spectrum of F8 gene mutations in haemophilia A patients from Slovenia.

Haemophilia. 2012 Sep 7. doi: 10.1111/hae.12003. [Epub ahead of print]

Laboratorijski testi

Ugotovitev in opredelitev hemofilije

Presejalni testi koagulacije

(Aktiviran Parcialni Tromboplastinski Čas, Protrombinski Čas, Trombinski Čas, koncentracija fibrinogena)

Aktivnost koagulacijskega faktorja FVIII:C (APTČ)

Enostopenjska metoda

Dvostopenjska metoda

Metoda s kromogenim substratom

FVIII deficitarna plazma

Vzorec – razredčena plazma

Aktivator + fosfolipidi

Dodatek Ca 2+

za tvorbo trombina

-nastanek fibrinskega

strdka v enem koraku.

Stopenjska diagnostika

↓ faktorja / inhibitorji

test 50:50 Inhibitorji

(LA, inh. FVIII

inh. drugih F

intrinzične poti)

pomanjkanje F FIX, XI, XII, V

vWD, DIK, ↓fib, ↓ FXIII

Težka

<1%

Srednje težka

1-5% Lahka

>5%

FVIII:C

<30%

HEMOFILIJA A

APTČ ↑

PČ, TČ – N

Zapiralni čas – N

Štev. trombocitov - N

Težka

<1%

Srednje težka

1-5%

Lahka

>5%

Prenašalka

30 - 50%

presejalne metode

PCR/SSCP, DGGE, dHPLC

sekvenciranje F8

(26 eksonov – eksoni, 5'UTR, 3'UTR,

promotorji, odseki izrezovanja

Inverzija

int 22

Inverzija

Int 1

+ -

-

PRENATALNA DIAGNOSTIKA

neznana znana

+

qter

qter

Faktor VIII gen

26

F8A

dist.

F8A

proks.

qter

F8A

znotraj introna 22

1 26

22 1 23 26

1

F8A

dist.

F8A

proks.

F8A

znotraj introna 22

Inverzija introna 22 50 % težkih hemofilij A, v Sloveniji 48%, 40 bolnikov

Intrakromosomska rekombinacija med F8A (int 22) in telomernim identičnim genom

Inverzija de novo nastane 1/10.000 mejoz pri moških

Inverzija introna 22

P

Q A

B

int22h1

Int22h2&3

10 kbp

ni prenaš. hemofilik prenaš. prenaš. M

PQ AQ PB AB

Mutacije gena F8

Podatkovna banka -

HGMD - the Human Gene Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php), HaMSTERS

2517 opisanih mutacij

Točkovne mutacije (1492 različnih zamenjav enega baznega para, 165 pri izrezovanju intronov).

Delecije 223 primerov večjih (2-210 kb) in 419 manjših (1-23 bp).

Insercije 131 primerov insercij; večinoma 1bp.

Izolacija DNA iz levkocitov periferne krvi (odvzem z EDTA), horionske resice

pri prenatalni diagnostiki

PCR pomnoževanje posameznih eksonov

Matrica: genomska DNA

Par oligonukleot. začetnikov + dNTP

Enako dolgi fragmenti

Agarozna elektroforeza

Sekvenčna reakcija

Matrica: pomnožen fragment DNA

En oligonukl. začetnik + dNTP + ddNTP

Vse dolžine fragmentov

Kapilarna elektroforeza

Analiza kromatogramov

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Genetska diagnostika hemofilije A

Metode, mutacije v 26 – pregled vseh eksonov z

eksonsko/intronskimi regijami gena F8

179/149 bolnikov; 126/95 družin

81/82 težka obl. HA, 15/18 srednja, 53/79 lahka

54 različnih mutacij; 21 mutacij samo pri Slovencih

Pri 43% bolnikih je dedna osnova negativna

En bolnik z lahkim fenotipom ima 2 različni mutaciji

TIP MUTACIJE TEŽKA OBL. SREDNJA

OBL.

LAHKA OBL.

INVERZIJA INTRONA 22 40 0 0

INVERZIJA INTRONA 1 0 0 0

MAJHNE DELECIJE 9 0 0

MAJHNE INSERCIJE 4 0 0

MAJHNE DUPLIKACIJE 2 0 0

INSERCIJE-DELECIJE 1 0 0

VELIKE DELECIJE 0 0 0

DRUGAČNO-SMISELNE 11 13 52

MUTACIJE IZREZOVANJA

INTRONOV

3 2 0

NESMISELNE MUTACIJE 11 0 0

5'UTR 0 0 1

Inhibitorji in mutacije

222 (98) bolnikov med 1977-2011

15 inhibitorje, 12 težka obl. HA, 3 lahka obl. HA

Prevalenca 6,7% za celotno kohorto, 12,2% za težko obliko

HA

Mutacije pri lahki obliki HA: p.Arg593Cys in p.Arg2307Gln

Mutacije pri težki obliki HA:

inv 22 (6)

delecija p.Glu1801fs (3)

nesmiselne p.Arg1696X in p.Arg602X (2)

splicing c.6273+2T>C

Sklepi

Hemofilija A je genetska bolezen z uspešnim nadomestnim zdravljenjem za bolnike.

Hemostaza je proces ustavitve krvavitve po poškodbi žilne stene. FVIII je kofaktor v intrinzičnem delu koagulacije. Okvara proteina povzroča hemofilijo A.

V Sloveniji se vsakemu bolniku določi stopnjo hemofilije z laboratorijsko diagnostiko.

Večina slovenskih bolnikov ima določeno genetsko mutacijo

Ugotavljanje prenašalk

Prenatalna diagnostika