studio dell'espressione di una flavon diiron protein (fdp ... · studio dell'espressione...
TRANSCRIPT
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI SASSARI
SCUOLA DI DOTTORATO IN SCIENZE BIOMOLECOLARI E BIOTECNOLOGICHE
Indirizzo: Microbiologia molecolare e clinica
Studio dell'espressione di una Flavon Diiron
Protein (FDP) in Giardia intestinalis
Relatore Prof. Pier Luigi Fiori
Tesi di Dottorato Dott.ssa Antonia Mura
XXII ciclo
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
3
ABSTRACT...............................................................................................................................................................................1 GIARDIA INTESTINALIS ....................................................................................................................................................2
MEMBRANA PLASMATICA.....................................................................................................................................................3 CITOSCHELETRO ..................................................................................................................................................................4 IL DISCO VENTRALE..............................................................................................................................................................5 IL CORPO MEDIANO ..............................................................................................................................................................5 GENOMA ................................................................................................................................................................................6 DIFFERENZIAMENTO ............................................................................................................................................................6 INCISTAMENTO ......................................................................................................................................................................7 STIMOLI PER L’INCISTAMENTO............................................................................................................................................8 EXCISTAMENTO ....................................................................................................................................................................8 EPIDEMIOLOGIA..................................................................................................................................................................10 CLINICA E PATOGENESI .....................................................................................................................................................11 DIAGNOSI.............................................................................................................................................................................12 TRATTAMENTO ....................................................................................................................................................................13 IL METRONIDAZOLO ...........................................................................................................................................................13
FLAVOPROTEINE A DOPPIO FERRO (FDP) ..............................................................................................................15 SCOPO DEL LAVORO ........................................................................................................................................................17 MATERIALI E METODI.....................................................................................................................................................18
CONDIZIONI DI CRESCITA DELLA FORMA VEGETATIVA E DI INCISTAMENTO .............................................................18 FDP ......................................................................................................................................................................................19 OTTENIMENTO DELL’ANTISIERO IN TOPO........................................................................................................................19 SAGE: SERIAL ANALYSIS OF GENE EXPRESSION .......................................................................................................20 IMMUNOFLUORESCENZA ...................................................................................................................................................21 WESTERN BLOTTING ..........................................................................................................................................................21 IPERESPRESSIONE DI FDP IN GIARDIA ..........................................................................................................................23 ELETTROPORAZIONE DELLE GIARDIA. ............................................................................................................................26 RICONOSCIMENTO DELLA FDP CON ANTICORPI SPECIFICI MEDIANTE WESTERN BLOTTING ...............................26 RISPOSTA DI GIARDIA ALLO STRESS OSSIDATIVO E NITROSATIVO ............................................................................27 ESPRESSIONE DELLA PROTEINA FDP CELLULE FARMACO SENSIBILI E FARMACO RESISTENTI ............................29 ESPRESSIONE DELLA FDP DURANTE IL FENOMENO DI INCISTAMENTO ...................................................................30
RISULTATI.............................................................................................................................................................................31 ESPRESSIONE DI FDP IN LINEE CELLULARI MZ SENSIBILI E MZ RESISTENTI .........................................................33 TRASFORMATI IPERESPRIMENTI FDP .............................................................................................................................35 INCISTAMENTO ....................................................................................................................................................................36 IMMUNOFLUORESCENZA IN CELLULE IPERESPRIMENTI ...............................................................................................38
DISCUSSIONE .......................................................................................................................................................................39 SEQUENZA VETTORE AU1 ................................................................................................................................................42
BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................................................................44
ABSTRACT
Giardia lamblia is a flagellated unicellular eukaryotic microorganism that
commonly causes diarrheal disease throughout the world. Although Giardia has a
relatively poor tolerance to O2, it preferentially colonizes the fairly aerobic upper
part of the small intestine (duodenum and jejunum). It lacks the conventional
respiratory oxidases as well as the systems (catalase, superoxide dismutase,
glutathione reductase) responsible for the scavenging of radical oxygen species
(ROS).
The flavodiiron proteins (FDP) are widespread among strict or facultative
anaerobic prokaryotes, where they are involved in the response to nitrosative
and/or oxidative stress. The FDP from Giardia has high O2-reductase activity but
very low NO-reductase activity; O2 reacts with the reduced protein quite rapidly
and with high affinity.producing H2O.
Preliminary experiments were designed to examine whether the FDP
recombinant, obtained from an artificial gene, cloned and expressed in E. coli,
stimulate the immune system of the host (mouse) producing specific antibodies. ,
To verify if they specifically recognize the native protein in G. intestinalis, the
antibodies have been used to set up by immunoblotting and
immunofluorescence techniques.
Experiments were performed under conditions of nitrosative and oxidative stress
in order to obtain information on the location and expression of the native
protein, even in these stressful conditions.
By cloning the gene of interest in plamid expression vector, I wanted to study the
overexpression of the protein to determine its intracellular location and confirm
the data obtained with not transformed cells.
Moreover, further characterization experiments have led to study the protein
expression during different phases of the cell cycle of the protozoan, especially
during encystation.
Since recombinant protein showed reducing activities, a portion of the study was
devoted to evaluating the expression of FDP in metronidazole-resistant cells
compared to drug sensitive protozoa, to assume a putative role of protein in the
mechanisms of sensitivity to the main anti – protozoa.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
2
GIARDIA INTESTINALIS
Giardia intestinalis (sinonimi: G. duodenalis, G. lamblia) è un
protozoo, microaerofilo e flagellato (Barwick et al. 2000).
E’ un parassita intestinale diffuso nell’uomo, nei mammiferi, negli
uccelli e nei rettili ed è la maggiore causa di diarrea non virale nell’uomo
(Müller e Von Allmen 2005). Non è un parassita invasivo ma, in seguito
all’adesione reversibile alla parete intestinale, provoca cambiamenti
morfologici e fisiologici a livello dell’epitelio. E’ l’agente eziologico della
giardiasi, patologia che presenta i sintomi tipici delle malattie da
malassorbimento (Thompson e Monis 2004).
Questo protozoo presenta due stadi prevalenti nel proprio ciclo
vitale, che affronta in due forme differenti: quella del trofozoita e della cisti.
Fig. 1. Forma vegetativa e forma cistica di G. intestinalis
Il trofozoita è la forma vegetativa, classicamente descritto “a forma
di cucchiaio” (Fot. 1). Le sue dimensioni variano dai 12-15 micrometri di
lunghezza, ai 5-9 micrometri di larghezza. Presenta due nuclei,
trascrizionalmente attivi, localizzati anteriormente e simmetrici rispetto
all’asse longitudinale (Kabnick and Peattie 1990).
Possiede quattro paia di flagelli (anteriori, posteriori, ventrali e
caudali) ed una depressione reniforme denominata disco ventrale (Gillin et
al 1996). Il disco ventrale permette l’ancoraggio a substrati sia naturali che
artificiali.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
3
I flagelli sono importanti per la motilità, ma non per l’adesione
(Buchel et al 1987). Giardia è un eucariote molto antico, non possiede
mitocondri, perossisomi, idrogenosomi (Genchi et al 2003). Non è
confermata, nelle forme in attiva crescita, la presenza dell’apparato di
Golgi, il quale inizia a vedersi solo durante l’incistamento (Gillin et al 1996).
La forma infettiva della Giardia è quella cistica. Le cisti hanno forma
ovale e loro dimensioni variano dai 6 ai 10 micrometri di diametro. Sono
rivestite da una parete spessa e resistente, costituita da uno strato esterno
filamentoso ed uno strato interno membranoso. La componente glucidica
predominante dello strato più esterno è la galattosammina in forma di N-
acetilgalattosammina. Possiedono quattro nuclei in quanto l’incistamento
inizia solo dopo che è avvenuta le replicazione nucleare, ma prima della
citocinesi (Erlandsen et al 1990). Le cisti sono relativamente inerti,
permettono la sopravvivenza del microorganismo in diverse condizioni
ambientali, tra le quali, i livelli ordinari di clorazione delle acque e le alte
temperature, fino ai 50°C (Ortega et al 1997).
E’ stato suggerito che G. lamblia comprenda numerose specie,
identiche morfologicamente, ma divise in gruppi geneticamente distinti. Il
ruolo nella trasmissione zoonotica è ancora incerto, come la connessione
tra severita’ dell’infezione e differenti gruppi. G. lamblia è la sola specie
infettante l’uomo. I genotipi isolati nell’uomo sono gruppi A e B mentre
esistono altri, chiamati C (cani), E (ungulati), F (gatti) e F (ratti e topi)
(Weilinga et al 2007).
Membrana plasmatica
La membrana plasmatica è un bilayer lipidico semipermeabile
importante per la segnalazione cellulare e come punti di ancoraggio del
citoscheletro intracellulare. La membrana specializzata della Giardia
interagisce con l’ambiente dell’ospite ed è cruciale come sito di
alimentazione (endocitosi), eliminazione di cataboliti (esocitosi) e
nell’attivazione delle difesa immunitaria dell’ospite.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
4
Il monostrato di antigeni di superficie riveste il trofozoita e la
capacità di far variare questi, è necessaria per la sopravivenza del protozoo.
Questo meccanismo cellulare di difesa è chiamato “variazione antigenica” e
coinvolge attivazione e silenziamento di geni facenti parti di una super
famiglia di proteine di superficie (Simon et al 2007). Per evadere al sistema
immunitario dell’organismo ospite, Giardia attiva un processo di variazione
antigenica, processo che permette al parassita di sviluppare infezioni
croniche e ricorrenti. Da un repertorio di circa 190 geni codificanti Proteine
di Superficie Varianti-specifiche (VPS), Giardia esprime solo una VSP sulla
superficie del parassita in un particolare momento ma cambia verso VSP
differenti con un meccanismo che coinvolge le componenti del macchinario
dell’RNA interference (Prucca et al 2008). Le varianti di VPS posso essere
selezionate tramite la pressione del sistema immunitario o tramite
condizioni fisiologiche. Le VSP di Giardia hanno un peso molecolare tra i 20
e 200 KDa, estremamente ricche di cisteina (circa il 12%). Il Tipo I sono
proteine integrali di membrana con multipli motivi CXXC e con la parte C-
terminale che contiene una regione strettamente conservata CRGKA. Tutte
hanno un caratteristico segnale di poliadenilazione un peptide segnale N-
teminale (14-17 aminoacidi) per il trasporto per il reticolo endoplasmatico
(ER) (Nash et al 1997]. La maggior parte dei residui di cisteina si trovano in
ponti intracellulare determinando la resistenza alle dure condizioni
dell’apparato digestivo dell’ospite (Aley et al 1993).
Citoscheletro
Il citoscheletro di Giardia è una struttura dinamica richiesta in
numerosi processi che includono divisione nucleare, citocinesi,
mantenimento della forma cellulare, motilita’, movimento dei flagelli e
trasporto intracellulare (Tilney et al 1996). Il parassita resiste a perdite di
membrana ed a collassi strutturali (Elmendorf et al 2003) ed è composto
dalle componenti citoscheletriche classiche (microtubuli e microfilamenti) e
da proteine e organelli Giardia-specifici (Pathuri et al 2007). Ci sono cinque
tipi di strutture microtubolari: il fuso mitotico, flagelli/assonema, disco
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
5
ventrale, corpo mediano e il funis. I primi due sono organelli universali del
citoscheletro ma il disco ventrale, il corpo mediano e il funis sono Giardia-
specifici.
Il complesso citoscheletro di Giardia sottostà a drammatici
riarrangiamenti durante entrambe le differenziazioni.
Il disco ventrale
Il disco ventrale permette l’adesione del parassita alla superficie. C’è
una forte relazione tra disco ventrale e malattia. L’attaccamento alle cellule
epiteliali dell’ospite è necessario per evitare l’eliminazione con la peristalsi
(Elmendorf et al 2003; Muller et al 2005). Il bordo ventro-laterale del disco
si interdigita tra i microvilli dell’intestino tenue ma è anche capace di
aderire a superfici inerti [Erlandsen et al 2004]. Durante la crescita in vitro,
Giardia alterna la fase di adesione a quella di nuoto libero.
La divisione cellulare inizi in cellule adese con il distaccamento dei
microtubuli del disco dal corpo basale.
Il corpo mediano
Il corpo mediano è un organello citoscheletrico Giardia-specifico che
è stato usato per la classificazione in specie. Le funzioni proposte per
questo organello sono (Piva et al. 2004):
- una riserva di microtubuli
- progenenesi del disco ventrale
- immobilizzazione dei microtubuli durante la divisione cellulare
- sito di enucleazione dei mitocondri
- coda laterale flessibile.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
6
Il corpo mediano del trofozoita è piriforme (Adam 2001), in
microscopia elettronica sembra allineato in fascicoli o clusters (Elmendorf
et al 2003) e nella cisti e simile ad un clusters di microtubuli non
organizzati (Hesko et al 1998).
Genoma
Il sequenziamento del menoma del parassita diplomonade Giardia
lamblia WB (assemblaggio A) è completo (Morrison et al 2007) e rivela circa
12 milioni di paia di basi distribuite su 5 cromosomi. Ci sono circa 6500
ORF cui il 73% mostrano essere trascritti attraverso studi di SAGE (Serial
Analysis of Gene Expression).
Le maggiori conclusioni dallo studio dell’analisi del genoma della
Giardia è che esso è compattato in strutture. Contiene sono 4 introni
conosciuti, pochi resti di geni mitocondriali e un macchinario di
replicazione del DNA semplice Archaeal-like. E’ presente un macchinario
della trascrizione e traduzione yeast-like e un limitato set di enzimi
metabolici bacterial-like [Morrison et al 2007; Galperin et al 2002].
Poiché Giardia è un protozoo tetraploide binucleato, si potrebbe
presupporre l’esistenza di un alto livello di eterozigocita’ ma,
sorprendentemente, questo è stimato essere meno dello 0.01%.
Differenziamento
Il differenziamento in Giardia coinvolge due transizioni, da
trofozoita mobile e replicativo a cisti dormiente (incistamento) e dalla cisti
ingerita allo excizoita (excistamento) (Svar et al 2003; Bernander et al
2001).
Durante il differenziamento c’è uno spegnimento regolato dei
programmi di espressione genica in risposta all’ospite e agli stimoli
ambientali.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
7
Incistamento
La cisti è essenziale per ila sopravvivenza del parassita al di fuori
dell’ospite (Gerwig et al 2002). La peristenza dell’infezione endemica è
dovuta della cisti da ospite ad ospite attraverso contaminazioni oro-fecali.
L’incistamento è la graduale trasformazione del trofozoita mobile in
citi immobile, dormiente e refrattaria in risposta a fattori ospite-pecifici
(Lauwaet et al 2007). Come i flagelli del trofozoita vengono internalizzati, il
parassita perde la capacita’ di adesione (Faubert et al 1991), il disco
ventrale si frammenta (Palm et al 2005), si arrotonda ed inizia in una
dormienza ipometabolica. La parete della cisti (CW, cyst wall) è resistente
all’ambiente ma trasducente e responsabile della sopravvivenza della
giardia nell’ambiente esterno. La natura altamente insolubile della parete
della cisti è dovuta alle forti interazioni intercatena dei carboidraiti e gli
zuccheri della parete associati con le porteine della parete. La parete è
sintetizzata de novo da glucosio endogeno tramite una via di enzimi
inducibili che sono trascrizionalmente e allostericamente regolati (Gerwing
et al 2002).
La sintesi delle proteine della parete della cisti (CWP, cyst wall
proteins) inizia precocemente nell’incistamento e conduce alla formazione
nuove grandi vescicole secretorie dell’incistamento (ESV, encystation
secretory vescicles) (Reiner et al 1990; Marti et al 2003; Lanfredi-Ragel et al
2003) le quali sono organelli che esportano le CWP. Tardivamente
nell’incistamento, dopo che la parete della cisti è stato prodotta, serviranno
delle divisioni nucleari per avere 4 nuclei della cisti (Reiner et al 1990;
Gillin et al 1996). L’incistamento delle Giardia è una reminescenza di un
processo sessuale di meiosi [Svard et al 2003]. Fino ad ora, Giardia è stata
considerata strettamente asessuata ma la presenza di geni meiotici
(Morrison et al 2007; Ramesh et al 2005), bassi livelli di eterogozicita’
allelica (Teodorovic et al 2007) e nuove evidenze di ricombinazioni da
popolazioni genetiche (Cooper et al 2007) sembrano indicare il contrario.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
8
Stimoli per l’incistamento
Come è stato a lungo osservato, c’è una relazione tra secrezione
della bile e numero di trofozoiti colonizzanti (Hegner et al 1937). Quando
una bassa concentrazione di bile viene aggiunta al medium di coltura del
parasita, la crescita aumenta drammaticamente (Keinster et al 1983). Si è
ipotizzato che l’ambiente dell’intesino poterebbe stimolare l’incistamento.
Esperiementi condotti da Gillin F. mostrano che è possibile osservare
l’encistamento in vitro dopo l’aggiunta di alte concentrazioni di bile a pH
fisiologico di 7.8 (Gillin et al 1987; Gillin et al 1989).
Quando, in topo affetto da giardiasi sono ridotti i fisiologici livelli di
bile, si è osservata una significativa riduzione (103-104) nell’escrezione
fecale delle cisti. (Erlandsen 2005). Mentre l’incistamento è indotto da
grandi quantita’ di bile, non sono stati ancora identificati meccanismi
molecolari per indurre l’incistamento.
Excistamento
L’excistamento è un drammatico risveglio dalla fase dormiente che è
necessario per iniziare l’infezione.
L’infezione dell’ospite ha inizio quando le cisti vengono ingerite,
attraverso l’assunzione di acque o cibi contaminati. Negli uomini la dose
infettiva sufficiente varia dalle 10 alle 100 cisti ingerite (Rendtorff 1960).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
9
Fig. 2 Ciclo biologico di Giardia intestinalis
L’excistamento è un processo rapido (Lioyd et al 2007). Dopo che
vengono esposte all’ambiente acido dello stomaco, le cisti vengono attivate
(5-10 minuti) e passano nell’intestino prima della rottura della parete (20-
60 secondi). Appaiono i flagelli attraverso una apertura in un polo della
cisti, seguito dal corpo dell’excizoita (Svard et al 2003).
Ultrastrutturalemente è possibile vedere una nuova protusione di
citoplasma chiaro vicino ai flagelli che aiuta nello stabilire la polarita’ della
cellula excistante (Htesko et al 1998). La citocinesi ha un importanza
centrale nel processo per dare due cellule figlie (7-8 minuti) che si
divideranno ancora per dare 4 trofozoiti diploidi (Svard et al 2003).
L’excizoita deve simultaneamente dividersi, segregare i suoi
organelli, attivare la sua motilità e la sua adesione e, infine, aumentare il
suo metabolismo (Lauwaet et al 2007). Biochimicamente, durante
l’excistamento, le CWP sono defosforilate (Slavin et al 2002) mentre
vengono rilsciate cistein proteasi endogene nello spazio peritrofico (Ward et
al 1997) e vengono espressi trascritti excistamento-specifici (Hetsko et al
1998). Molti dei trascritti espressi sono geni VSP (Svard et al 1998).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
10
Giardia ha almeno 3 set di geni la cui espressine è unicamente
regolata:
-geni incistamento specifici quando il trofozoita si differenzia i cisti;
-geni ecistamento-specifici espressi dall’excizoite durante
l’excistamento
-VSP che sono espressi , uno alla volta, sulla superficie del
trofozoita.
L’accurata traduzione dei segnali ambientali, sincronizzata con il
riassemblamento del citoscheletro, dipende da un sofisticato sistema di
segnalazione.
Epidemiologia
Il serbatoio di infezione è costituito principalmente dagli ospiti
umani e dalle acque superficiali (Genchi et al 2003). Nei paesi in via di
sviluppo l’incidenza della giardiasi è circa del 20% a confronto con il 5% dei
paesi sviluppati, dove essa è associata prevalentemente a viaggi esotici e
contaminazione delle acque (Flanagan 1992). Ha una distribuzione di tipo
globale, sono stimati circa 2,8 x 108 casi all’anno (Lane et al 2002). In Asia,
Africa ed America Latina circa 200 milioni di persone all’anno manifestano
la giardiasi. Nei paesi in via di sviluppo, dove la giardiasi raggiunge le
prevalenze più elevate, la via di trasmissione più frequente sembra essere
quella oro-fecale diretta. La gravità della malattia è definita da
un’interrelazione tra la virulenza del parassita, lo sviluppo del paese e le
condizioni nutrizionali ed immunologiche dell’ospite (Eckmann 2003).
In Italia i primi dati riguardanti la giardiasi risalgono al 1960 (Pucci
1967), ma solo più avanti, furono eseguiti degli studi su larga scala, i quali
dimostrarono che gli individui clinicamente affetti erano per il 3.2% adulti
(Libanore et al 1991) e dallo 0.9% (Caprioli et al 1996) al 4.7% bambini
(Cevenini et al 1985).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
11
Successivamente tra gli anni (1994-1998) è stato registrato un
significante declino dell’incidenza, dal 4.66 allo 0.94% e dal 10.99 al 2.41%,
indipendentemente dall’età (Ballone et al 2001).
Nonostante Giardia non sia considerata un comune patogeno
opportunistico nei pazienti immunodepressi, nei soggetti affetti da HIV
l’incidenza della giardiasi varia dal 3.47 al 6.15%, prima dell’ introduzione
della HAART (Terapia Anti-Retrovirale Altamente Attiva) (Angarano et al
1997).
Clinica e patogenesi
Il periodo di incubazione varia da 5 a 25 giorni. Le manifestazioni
cliniche, della giardiasi, possono essere molto variabili, da un’assenza dei
sintomi ad una diarrea di tipo cronica o acuta, perdita di peso,
deidratazione, gonfiore addominale, nausea e vomito (Eckmann 2003).
I trofozoiti colonizzano la mucosa del duodeno e dell’ileo e
aderiscono ad essa grazie al loro disco ventrale, non penetrando nella
parete intestinale.
I sintomi della giardiasi possono essere provocati dal rilascio di
enzimi proteolitici che riducono le funzioni della barriera epiteliare e
possono indurre apoptosi cellulare. (Genchi et al 2003). Studi avanzati
sulle proteasi della Giardia hanno chiarito che questo protozoo contiene
numerosi enzimi proteolitici che giocano un importante ruolo nei processi
metabolici e fisiologici (Parenti 1989, Hare et al 1989 , Williams et al 1989).
Altri studi hanno evidenziato che queste molecole sembrano importanti in
processi come adesione, nutrizione, patogenesi ed evasione dalla risposta
immunologica dell’ospite (Kaur et al 1995). L’infezione riduce lo spessore
dei microvilli (Scott et al 2000) e parallelamente viene inibita l’espressione è
l’attività di molti enzimi digestivi (Nain et al 1991).
L’alterazione dei microvilli non è la diretta conseguenza
dell’interazione tra i trofozoiti e l’epitelio intestinale, essa è provocata dal
sistema immunitario dell’ospite (Nain et al 1991). Vengono secreti anticorpi
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
12
IgA ed IgM in grandi quantità, nel lume intestinale, questo sottolinea
l’elevata importanza dell’azione dei linfociti B (Snider et al 1986; Nash et al
1987; Heyworth 1989 e Faubert 2000). Inoltre gli antigeni di Giardia
provocano l’emissione, da parte dei linfociti T della mucosa intestinale, di
linfochine tossiche per gli enterociti (Genchi et al 2003). In aggiunta alla
secrezione di anticorpi, riveste un ruolo importante, nella difesa
immunitaria, il rilascio di fattori antimicrobici, in particolar modo il rilascio
di NO. NO oltre ad avere un’azione antimicrobica, per un ampio range di
parassiti patogeni (Daniel set al 1994; Brunet 2001), riveste altri ruoli come
quello di neurotrasmettitore e di regolatore dell’integrità della mucosa
intestinale e del tono vasale (Wallance et al 2000).
NO ha un’azione citostatica e citotossica nei confronti dei trofozoiti
(Fernandes et al 1997), può determinare l’inibizione dell’incistazione e
dell’excistazione.
Diagnosi
La diagnosi è resa possibile dall'evidenziazione, mediante esame
microscopico, nelle feci dei caratteristici trofozoiti o delle cisti. Questi sono
facilmente rinvenuti nelle infezioni acute, ma l'eliminazione del parassita è
intermittente e a bassi livelli nella infezione cronica. La diagnosi può
richiedere perciò ripetuti esami delle feci o l'esame del contenuto
dell'intestino superiore ottenuto con una striscia di nylon o per aspirazione
endoscopica.
Più sensibile alla microscopia è la ricerca di antigeni di Giardia nelle
feci mediante test immunoenzimatici o in immunofluorescenza. Sonde
specifiche di DNA sono in fase di studio (Genchi et al 2003).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
13
Trattamento
I farmaci più usati per il trattamento dell’infezione da Giardia sono i
nitroimidazoli, metronidazolo e tinidazolo (Genchi et al 2003).
Il Metronidazolo
Il metronidazolo (Mz) è una antibiotico e un anti parassitario della
famiglia dei nitroimidazoli. Scoperto nel 1957, è utilizzato nella pratica
medica da circa trent’anni. E’ attivo su quasi la totalita’ dei batteri anaerobi
metre i protozoi sensibili sono Trichomonas vaginalis, Balantidium coli,
Entamoeba histolytica, Blastocystis hominis e Giardia lamblia.
Fig 3 Formula chimica del metronidazolo e riduzione del gruppo nitro
Il meccanismo di azione del farmaco è correlato con la tossicita’ dei
suoi prodotti. Infatti il Mz puo’ essere considerato come una profarmaco in
quanto è inattivo. Il gruppo nitroso è essenziale per l’attivita’ antimicrobica
(Escobedo e Cimerman 2007). Quando il Mz si trova all’interno del
trofozoite, la proteina di trasporto degli elettroni ferrodoxina dona gli
elettroni al gruppo nitro del farmaco. La riduzione del gruppo nitro
favorisce il trasporto e l’accumulo intracellulare del Mz. Il gruppo nitroso
ridotto causa un danno alla funzionalità di importanti biomolecole e, come
risultato finale, porta alla morte delle cellule sensibili. I prodotti tossici
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
14
possono essere anche reattivi verso le componenti cellulari. (Upcroft e
Upcroft 1998) inoltre Mz inibisce il consumo di ossigeno attivando un
alternativo accettare degli elettroni (Paget et al 1983).
Il farmaco è stato estesamente utilizzato nella terapia in differenti
modalità e dosi. In media l’efficacia della cura è del 89%, in pazienti adulti
a cui il farmaco era stato somministrato per 5-10 giorni. La
somministrazione, la media dell’efficacia della cura. Con la maggior durata
della terapia di riducono le complicanze ma aumentano gli effetti collaterali.
Gli effetti collaterali sembrano essere dose-dipendenti e includono: gusto
metallico, nausea, mal di testa, vertigeni e leucopenia (Misra et al 1995).
Il Mz è stato visto essere mutagene nei batteri e studi su animali
mostrano che, somministrata ad alte dosi e per lunghi periodi, è
cancerogena (Rosenkranz et al 1975).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
15
FLAVOPROTEINE A DOPPIO FERRO (FDP)
Prima denominazione: A-type flavoproteins (Wasserfallen et al
1998), proteine tipicamente espresse in procarioti anaerobi (stretti o
facoltativi), recentemente identificate anche in un ristretto gruppo di
parassiti protozoali, tra i quali Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica e
Trichomonas vaginalis (Andersson et al 2003).
E’ una famiglia di enzimi in grado di catalizzare la riduzione del NO
in N2O e dell’ O2 in H2O, contribuendo a proteggere da stress di tipo
nitrosativo e/o ossidativo, i microorganismi nei quali esse sono espresse.
La caratteristica distintiva di questa famiglia di proteine è la
presenza di un core comune costituito da un dominio N-terminale nel quale
risiede un sito a doppio ferro non emico (Fe-Fe), dove avviene la reazione
con i substrati gassosi, e un dominio C-terminale contenente un flavin
mononucleotide (FMN).
Hanno una struttura omodimerica di tipo testa-coda, in cui il FMN
di un monomero ed il centro Fe-Fe dell’altro sono posti ad una distanza tale
da garantire un rapido trasferimento elettronico tra i due centri redox (Di
Matteo et al 2008).
FDP di G. intestinalis è la prima FDP eucariotica ad essere stata
espressa, purificata e caratterizzata per mezzo di raggi-X, cristallografia e
spettroscopia. Ha una elevata attività di O2-riduzione ed una bassa attività
di NO-riduzione (Gomes et al 2002).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
16
Fig. 3. Struttura 3D della FDP un monomero è blu ed azzurro, l’altro
monomero è rosso ed arancione. I colori chiari indicano le estremità N-
terminali ed i colori scuri indicano le estremità C-terminali. In verde sono i
centri a doppio Fe e in giallo sono indicati gli FMN.
Giardia ha una scarsa tolleranza per l’ossigeno, si ritiene che
l’attività ossidasica le permetta di colonizzare il tratto superiore
dell’intestino tenue, dove l’ossigeno è presente in concentrazioni
relativamente alte. Inoltre l’attività NO-riduzione le permette di difendersi
dall’ossido nitrico prodotto dal sistema di difesa dell’organismo ospite, N2O
viene eliminato per diffusione (Parenti 1989).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
17
SCOPO DEL LAVORO
Questo studio si focalizza sullo studio e caratterizzazione di una
flavoproteina a doppio ferro (flavondiiron protein, FDP) presente in Giardia
intestinalis.
La FDP è presente sia in batteri sia in protozoi anaerobi e anaerobi
facoltativi. La sua funzione è di protezione dell’organismo in risposta ad uno
stress nitrosativo e ossidativo.
Lo scopo è stato quello di verificare se la FDP ricombinante, ottenuta a
partire da un gene artificiale, clonata ed espressa su E. coli, stimolasse il sistema
immunitario dell’ospite (topo) nella produzione di anticorpi specifici. Una volta
ottenuti gli anticorpi verificare, con tecniche di immunoblotting e
immunoflorescenza , se questi riconoscessero in maniera specifica la proteina
nativa in G. intestinalis.
Gli studi, in collaborazione con l’Università degli studi di Roma “ La
Sapienza”, hanno previsto inizialmente la valutazione di un’attività NO-
degradativa e O2-degradativa.
In Giardia sono stati eseguito successivamente esperimenti in
condizioni di stress nitrosativo e ossidativo, al fine di ottenere informazioni sulla
localizzazione e sulla espressione della proteina nativa.
Mediante clonazione del gene di interesse all’inteno dei un vettore di
espressione, ho voluto studiare l’iperespressione della proteina e la sua
immunolocalizzazione.
Inoltre studiare l’espressione della proteina durante le fasi della vita del
protozoo (incistamento).
Poiche’ la proteina artificiale mostrava proprieta’ riducenti, andare a
valutare l’espressione in cellule farmaco resistenti e farmaco sensibili.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
18
MATERIALI E METODI
Condizioni di crescita della forma vegetativa e di incistamento
Negli esperimenti venivano impiegate cellule Mz resistenti e Mz
sensibili. Le linee sensibili era costituite C6, 713 e 106 mentre le linee
resistenti corrispondenti erano 713-MzR e 106-21D10. Le linee resistenti
sono state ottenute a partire dalle linee sensibili, tramite mutazione indotta
dagli UV. Dati sulla resistenza sono presenti in letteratura.
Tab .1 Comparazione di MIC (minima quantità inibente) in linee di G.
intestinalis MZ resistenti (Upcroft et al 2006)
I trofozoiti G. lamblia erano fatti crescere nel medium TYI-S-33
modificato con bile bovina (Diamond et al 1978; Keister 1983) e completato
con il 10% di siero bovino. Le cellule erano poste in incubatore a 37°C in
tubi da 10 ml che permettano la crescita e l’ adesione.
L’incistamento era stato indotto come descritto da Boucher e Gillin
1990. I trofozoiti, dopo 48 ore nel medium di crescita a pH 7.2 senza bile,
erano trasferiti nel terreno di incistamento contenente 0.25 mg/ml di bile
bovina e acido lattico 5 mM a pH 7.8. A 21h dal processo di incistamento,
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
19
le ESV erano contate mediante microscopio ottico a contrasto
interferenziale. Il numero delle ESV indica se avverra’ o meno
l’incistamento. Se il valore ESV/cellula è inferiore 3 si avra’ un basso
numero di cisti; se il valore è zero, non ci saranno cisti.
Le cisti venivano raccolte, dopo 48 ore dall’incistamento, dal fondo
della provetta mentre i restanti trofozoiti erano lisati per incubazione in
acqua distillata sterile per 20’ a 4°C.
FDP E’ stata utilizzata la flavondiiron protein (FDP) sotto forma di
proteina ricombinante del peso di 45 kDa. Questa proteina è stata prodotta
a partire da un gene sintetico, clonata e espressa in E. coli, dal
dipartimento di Biochimica dell’Università La Sapienza (Di Matteo et al
2008). Questo è stata una delle poche FDP identificate su basi genomiche.
La proteina mostra attivita’ O2-reduttasica e una bassa attivita’ NO
reduttasica. Inoltre l’O2 è stato trovato reagire non solo velocemente con la
proteina ma anche con una alta affinità cedendo H2O come prodotto. Su
questi dati è stato proposto che FDP giochi un ruolo cruciale in vivo di
detossificazione dall’O2(Di Matteo et al 2008).
Ottenimento dell’antisiero in topo
L’immunizzazione di topi BALB/c di 5 settimane è stata ottenuta
mediante due inoculi a distanza di 10 giorni , sia per via sottocutanea che
intraperitoneale, di 20 µg di proteina ricombinante risospesa in Adiuvante
di Freund (completo per il solo primo inoculo). 10 giorni dopo il secondo
inoculo, i topi sono stati immunizzati per la sola via intraperitoneale con 10
µg di proteina risospesa in PBS. 6 giorni dopo il booster finale, i tipo sono
sacrificati per dissanguamento ed il siero iperimmune ottenuto dopo aver
eliminato il coagulo . Dopo aver raccolto il siero, la reattività, sia generale
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
20
che specifica, è stata testata mediante western blotting verso la proteina
ricombinante, ed il titolo anticorpale determinato mediante tecniche ELISA.
SAGE: Serial Analysis of Gene Expression
L’insieme di tutti gli mRNA presenti in una cellula si definisce
trascrittoma. Ogni trascrittoma ha una composizione complessa, con
migliaia di mRNA diversi, ciascuno presente ad una data concentrazione.
Idealmente, per caratterizzare un trascrittoma è necessario identificare tutti
questi mRNA. Il modo più diretto di caratterizzare un trascrittoma sarebbe
quello di convertire tutti gli mRNA in cDNA e poi di determinare la
sequenza di tutti i cloni della libreria di cDNA così ottenuta. Questo
approccio, seppur realizzabile, è estremamente dispendioso sia in termini di
tempo che di risorse, perché si analizza un gene alla volta. Diverse tecniche
consentono invece l'analisi in serie dei geni: la visualizzazione differenziale
degli mRNA è utile per capire come si modifica l'espressione genica nelle
cellule in diverse fasi fisiologiche e di sviluppo (analisi comparativa); questo
metodo però identifica solo un gruppo parziale di geni e non è utilizzabile
per determinare l'abbondanza dei diversi trascritti. L'analisi seriale
dell'espressione genica (SAGE) permette di determinare
contemporaneamente la struttura, la funzione e l'espressione di un intero
trascrittoma. Questa tecnica è stata ideata e messa a punto nel 1995 da
Velculescu (Velculescu et al 1995 ).
l SAGE si basa su due principi:
- Una corta etichetta di sequenza (9-10 pb) contiene sufficiente
informazioni per identificare un qualunque mRNA in modo univoco;
- La concatenazione di molte etichette (tag) in un unico clone di
cDNA consente l’analisi in serie degli mRNA in modo più efficiente.
Opportuni programmi al computer saranno successivamente in
grado di convertire le informazioni inizialmente presenti come un’unica
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
21
stringa di dati in una tabella che riporta per ogni mRNA identificato
descrizione e livello di espressione genica (numero di tag).
Immunofluorescenza
I trofozoiti erano raccolti e lasciati aderire ai vetrini coprioggetto a
37°C per 10’. Il citoscheletro era estratto in situ con una soluzione di Triton
X-100 0.5% in TRIS 10mM pH 8.5, EDTA 2 mM, MgCl2 2 mM, KCl 150 mM
e ditiotreitolo (DTT) 2 mM. Le cellule erano fissate in metanolo e
permeabilizzate con Triton X-100 0.5% in PBS.
Successivamente, trofozoiti venivano prima saturati con la soluzione
bloccate (siero di capra 5%, glicerolo 1%, BSA 0.1%, gelatina di pesce 0.1%
e sodioazide 0.04%) per 1 ora e poi incubati con anticorpi anti-AU1(1/500)
per 1 ora.
I vetrini venivano lavate 3 volte in PBS e, in seguito, incubate con
anticorpo di primario specifico per FDP (1/500), per un ora a temperatura
ambiente. I vetrini coprioggetto, lavati 3 volte in PBS, venivano incubati,
successivamente, con l’ anticorpo secondario policlonale Anti-Mouse
fluorosceinato (FITC)(1/10000). I vetrini, lavati 3 volte in PBS, venivano
postfissati in paralformaldeide 4% per 5’, lavati in PBS e montati con
ProLong Gold con 4’,6-diamino-2-fenilindolo (Molecular Probes). La
localizzazione della proteina avveniva tramite microscopio Nikon Eclipse
E800 con lampada fluorescente X-CiteTM 120.
Western blotting
Le cisti e i trofozoiti in differenti stadi della vita venivano lavati in
PBS e raccolti per centrifugazione 1800 rpm per 10’.
Le proteine totali cellulari erano precipitate con TCA al 6% e
quantificate con Low Density Protein Assay (Pierce).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
22
Mediante SDS PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide) su un
gel Tris-HCl al 4-20% (Invitrogen), 5 ug/line di proteine venivano separate e
trasferite in una membrana di nitrocellulosa (iBlot® Transfer Stack,
Invitrogen) mediante iBlot Dry Blotting System (Invitrogen).
Per tutte le corse elettroforetiche è stato seguito il metodo descritto
da Laemmli. Il tampone della corsa elettroforetica era costituito da 24 mM
Tris, 3,4 mM SDS, 192 mM glicina; la corsa veniva inoltre effettuata ad un
voltaggio costante a 131 V.
La membrana veniva saturata con PBST 0.1% (135 mM NaCl, 1,3
mM KCl, 3,2 mM Na2HPO4, 0,5 mM KH2PO4, 0,05% di Tween 20, pH 7,4),
Siero di capra 1% e latte 3% per 1 ora e poi incubata con anticorpi murini
anti FDP o anti-AU1 per 1 ora in agitatore orbitante.
Gli anticorpi anti-AU1 riconoscono la sequenza aminoacidica
DTYRYI di pOCT-AU1.
Il loading control (LC) era costituito dalle proteine tubulina o
taglina. La membrana veniva incubata con anticorpi murini anti- tubulina
(1/1000) o anticorpi anti-taglina (1/1000) per un ora in agitatore orbitante.
Successivamente la membrana veniva lavata 3 volte in PBST 0.1%
per 5’ e incubata con anticorpi HRP-goat serum anti-mouse IgG (H+L)
(Invitrogen) (1/5000).
Il filtro, lavato 3 volte in PBST 0.1% per 5’, sviluppato con ECL o
ECL plus (Amesham) e il segnale chemiolumiescente era esposto su Hyblot
CL Autoradiography Film.
L’intensita’ delle bande era quantificata mediante il programma
Quantità One (Bio-Rad). L’intensità delle bande AU1 o FDP era
normalizzata con l’intensita’ del LC (FDP/LC o AU1/LC) in modo che C6=1
e C6 FDPAU1=1.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
23
Iperespressione di FDP in Giardia
La proteina FDP è stata ottenuta, a partire da DNA genomico del
clone WBC6, mediante PCR utilizzando i seguenti primers:
FDPover-For: aaactcgagATGTCTTCTAAGCCCAAGTATGTGCAGG
FDPover-Rev: aaagggcccCTGCTTAGGGGCGTTCTTCTCGCAG
La reazione di PCR era ottenuta in un volume 50 ul contenente
Phisium mastermix , FDPover-for e FDPover-rev 10mM, 100 ng DNA
permetteva di ottenere un amplicone di 1245 pb.
3’ 98°C 15’’ 98°C 30’’ 60°C x 2 cicli 50’’ 72°C 15’’ 98°C
H2O 23.5 ul
Phisium mastermix 25.0 ul
Pr. FDP Over-For (10 uM) 0.5 ul
Pr. FDP Over-Rev (10 uM) 0.5 ul
DNA 0.5 ul
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
24
30’’ 65°C x 29 cicli 50’’ 72°C 5’ 72°C
4°C
Al fine di ottenere l’iperespressione della proteina, FDP era clonata
all’interno del plasmide pOCT-AU1 (Lauwaet et al 2006). Utilizzando 1 mg
di DNA, veniva effettuata una doppia digestione a 37°C per 1 ora con gli
enzimi Apa1 (Promega) e Xhol (Promega):
Plasmide
(ul)
DNA FDP
Over (ul)
DNA 0.5 28
Apa1 1 1
Xhol 1 1
10X Buffer 4 5 5
H2O 42.0 14.5
BSA (stock 10
mg/ml) 0.5 0.5
TOTALE 50 50
Il plasmide e DNA FDP Over erano purificati con PCR products
purification kit (QIAGEN) ed eluiti in 30 ul di acqua. La concentrazione è
stata determinato allo spettrofotometro a 260 nm.
E’ stata fatta una seconda digestione con l’enzima Apa1 a 25°C:
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
25
Plasmidi (ul) DNA FDP
Over (ul)
DNA 25 29
Apa1 1 1
10X Buffer 4 5 5
H2O 18.5 14.5
BSA (stock 10
mg/ml) 0.5 0.5
TOTALE 50 50
Il vettore OTC è stato purificato con PCR products purification kit
(QIAGEN), eluito in 30 ml di acqua e desfoforilato con Shrimp Alkaline
Phosphatase (Promega).
DNA
vector
30
ul
SAP 1
ul
H2O 5
ul
SAP buffer 10X 4
ul
TOTALE 40
ul
Dopo un incubazione a 37° per 15’ e inattivazione dell’enzima
tramite calore a 65°C per 15’, il vettore è stato caricato su un gel 1%
agarosio in TAE buffer. Il DNA, estratto tramite Gel Extraction kit
(QIAGEN), è stato eluito in 30 ul di H2O.
Per la ligation è stato utilizzato il kit AccuPower® Ligation PreMix
(Bioneer). A 5 ul del vettore vengono addizionati 15 ul di inserto (FDP over o
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
26
H2O per il controllo) e 20 ul di mix. L’incubazione avveniva per 10’ a
temperatura ambiente.
I plasmidi erano trasformati in E. coli JM109 (Promega). I batteri
erano lasciati crescere over night a 37°C in LB con Ampicillina (500 ug/ml)
e i plasmidi purificati utilizzando con Nucleobond Ax plasmid DNA
purification (MACHEREY- NAGER).
Elettroporazione delle giardia.
I trofozoiti sono stati elettroporati seguendo il protocollo di Yee e
Nash 1995 (Yee e Nash 1995).
A 300 ml contenente 107 cellule, venivano aggiunti 10 ml di DNA (o
H2O per controllo). L’elettroporazione avveniva alle seguenti condizioni:
Trasmittanza 350V
Capacitanza 1000 mF
Resistenza 720 Ohm
Le cellule cosi’ trattate venivano poste in ghiaccio per 15’ e trasferite
in 8 ml di medium fresco con puromicina alla concentrazione finale di
0.054 ug/ml.
Riconoscimento della FDP con anticorpi specifici mediante Western Blotting
L’esperimento è stato condotto al fine di verificare se la
proteina ricombinante FDP, espressa in E. coli, stimolasse il sistema
immunitario dell’ospite ed inoltre se gli anticorpi murini potessero
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
27
riconoscere la proteina di interesse anche in vivo, al fine di confermare
l’espressione di FDP nei protozoi.
Le cellule sono state staccate ponendo 20 minuti i tubi in ghiaccio e
sono state lavate 2 volte in PBS (135 mM, 1,3 mM KCl, 3,2 mM Na2HPO4,
0,5 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifugando a 1800 rpm per 10 minuti a
temperatura ambiente. Sono state prelevate 106 cellule, centrifugate a 1800
rpm per 10 minuti. Il pellet è stato risospeso in 20 ml di Laemmli buffer
(4% SDS, 20% glicerolo, 0,125 M Tris HCl, 0,004% Blu di bromo fenolo,
10% b-mercaptoetanolo) e posto in termoblock a 75°C per 15 minuti al fine
di denaturare completamente le proteine.
In seguito alla corsa elettroforetica, viene eseguito il Western
Blotting (Fig.6) come descritto in precedenza.
Risposta di Giardia allo stress ossidativo e nitrosativo
Il fine dell’esperimento era capire quale fosse il destino della
proteina in condizioni di stress ossidativo e nitrosativo.
Per eliminare l’ossigeno dal medium di coltura, vengono utilizzati
due enzimi:
D-GLUCOSIO OSSIDASI (GOD)
CATALASI (CAT)
I due enzimi svolgono una reazione accoppiata, D-Glucosio Ossidasi
metabolizza il glucosio rilasciando H2O2 che a sua volta viene consumato
dalla Catalasi.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
28
Fig. 4 Rappresentazione schematica del sistema GOD/CAT
Inoltre per testare gli effetti dell’ NO sulla FDP, ho utilizzato una
molecola capace di rilasciare cronicamente NO nell’ambiente, il DETA
NONOate (Cayman).
Fig. 5 Formula del DETA NONOate.
Sono state allestite tre condizioni diverse. Ad 1 ml di sospensione
cellulare, contenente 5x106 cellule sono stati aggiunti:
• 6 µl di GOD 17 U/ml (Sigma) e 6 µl di CAT 130 U/ml (Sigma).
• 250 mM
• 500 mM
Un uguale numero di cellule costituiva il mio controllo.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
29
Le cellule sono state poste in incubatore a 37°C per 12 ore.
Successivamente sono state risospese tenendo le provette in ghiaccio per
20 minuti. Le cellule sono state quindi lavate in PBS e centrifugate per 10
min a 1800 rpm a temperatura ambiente. I pellet di cellule, a cui vengono
aggiunti 15 µl di Laemmli Buffer, sono stati posti successivamente in
termoblock a 75°C per 15 minuti al fine di denaturare completamente le
proteine.
I campioni sono stati caricati in un gel di poliacrilammide al 12%. In
seguito alla corsa elettroforetica, è stato eseguito il Western Blotting.
Espressione della proteina FDP cellule farmaco sensibili e farmaco resistenti
L’esperimento era volto a verificare se ci fossero differenze
nell’espressione della proteina in linee cellulari di Giardia resistenti e
sentibili al Metronidazolo.
A 5 ug di proteine totali, appartenenti linee cellulari C6, 106, 106-
21D10 (MzR), 713, 713 MzR, venivano aggiunti 3 ul di DTT , portato il
volume a 20 ul con simple buffer e bolliti a 100°C per 5’.
Dopo SDS-PAGE e blotting, la membrana veniva saturata e incubata
con l’anticorpo primario policlonali murino Anti-FDP (1/1000) e
successivamente incubata con l’anticorpo secondario HRP-goat serum anti-
mouse IgG (H+L) (Invitrogen) (1/5000).
Il filtro, lavato 3 volte in PBST 0.1% per 5’, sviluppato con ECL o
ECL plus (Amesham) e il segnale chemiolumiescente era esposto su Hyblot
CL Autoradiography Film.
L’intensita’ delle bande era quantificata mediante il programma
Quantità One (Bio-Rad).
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
30
Espressione della FDP durante il fenomeno di incistamento
E’ stata studiata l’espressione della proteina durante l’incistamento
mediante western blotting.
Sono stati raccolti campioni a tempi 12, 21 42 ore, a partire
dall’inizio del processo.
Le cellule sono state coltivate in medium di crescita per 28 ore e
successivamente trasferite in terreno di incistamento. Dopo 4, 12, 21 e 42
ore, le cellule era raccolte mediante centrifugazione a 2000 rpm per 10’ a
4°C.
Le cellule lavate due volte con PBS e le proteine totali erano
precipitate con TCA al 6%. Le proteine, previa centrifugazione a 10000 rpm
a 4°C per 7’, venivano risospese in simple buffer e quantificate con Low
Density Protein Assay (Pierce).
Il SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ha mostrato che i
trascritti di FDP sono upregolati durante l’incistamento. Il livello di
espressione è più alto a 21ore.
I risultati del western blotting con linea trasfettata C6FDPAU1 e
anticorpi anti-AU1 hanno mostrato che FDP è down regolata
nell’incistamento.
La più alta espressione si trova nei trofozoiti.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
31
50
RISULTATI
Il primo esperimento è stato condotto al fine di verificare se la
proteina ricombinante FDP, espressa in E. coli, stimolasse il sistema
immunitario dell’ospite (topo) ed inoltre se gli anticorpi murini potessero
riconoscere la proteina di interesse anche in vivo.
Fig. 6
Gli anticorpi murini sembrano riconoscere in maniera specifica una
proteina in G. intestinalis.
Si puo’ osservare che nelle linee 2 e 3, in cui sono state caricate
cellule di G. intestinalis a concentrazioni diverse, è presente un unica banda
di circa 50 KDa. Questa banda sembra avere lo stesso peso molecolare
della proteina ricombinate (K+) che ha il peso di 45 kDa. Questi risultati
indicano quindi che FDP è espressa dai trofozoiti di giardia in condizioni di
crescita normali.
Successivamente, indagini preliminari di caratterizzazione, hanno
permesso di verificare quale fosse il comportamento della FDP di G.
intestinalis in condizioni di stress ossidativo ed in assenza di O2.
37
50
1 2 3 4
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
32
Quando l’O2 viene eliminato dal medium di coltura mediante
l’aggiunta di D-glucosio ossidasi e catalasi, la banda di 45kDa scompare.
Al contrario, la presenza di NO nel medium non ha alcun effetto
sulla espressione della proteina.
Questi risultati sembrano indicare un preciso ruolo di FDP nel
controllo delle condizioni di ossidazione cellulari
Fig. 7
L’immunoflurescenza, effettuata con anticorpi policlonali murinici
anti-FDP, mostra la localizzazione cellulare della proteina.
Fig. 8 e 9. Immunofluorescenza di G. lamblia.
Dalle immagini si puo’ osservare la distribuzione citosolica della
proteina mentre, nell’immagine adiacente, si puo’ notare l’assenza della
CTR H2O2 500 µM
1 2 3 4 5 6 7
1 FDP ricombinante
2 Giardia CTL
3 Giardia CTL
4 Giardia + GOD/CAT
5 Giardia + GOD/CAT
6 Giardia + 250 µM DETANONoati
7 Giardia + 500 µM DETANONoati
50
37
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
33
proteina nelle cellule esposte ad alte concentrazioni di H202 confermando i
risultati già osservati mediante western blotting.
In collaborazione con l’Universita’ La Sapienza di Roma sono stati
effettuati ulteriori esperimenti in condizione di stress ossidativo, volti a
verificare modulazione nell’espressione della proteina che mostrava, da dati
biochimici ( Di Matteo et al 2008), attivita’ ossidativa.
I trofozoiti erano risospesi in buffer di PBS+Glucosio 30 mM con
H2O2. Brevi esposizioni a H2O2 modificavano l’espressione della proteina e,
a concentrazioni di maggiori di 100 uM di H2O2, l’espressione della proteina
mostrava livelli piu’ bassi rispetto al controllo. A concentrazioni maggiori si
osservava fino alla scomparsa della banda al peso molecolare atteso.
Una preincubazione delle cellule con inibitore di proteasoma MG132
previene la degradazione della proteina indotta da H2O2. A concentrazione
di 500 uM di H2O2, la banda a corrispondente alla FDP era presente.
Espressione di FDP in linee cellulari Mz sensibili e Mz resistenti
Per studiare l’espressione se l’espressione della proteina fosse o
meno correlata con la sensibilita’ al farmaco, erano fatti esperimenti di
western blotting.
Le linee sensibili era costituite C6, 713 e 106 mentre le linee
resistenti corrispondenti erano 713-MzR e 106-21D10.
Le proteine cellulari venivano raccolte e quantificate come indicato
precedentemente. Per riconoscere la proteina nativa, venivano usati
anticorpi murini anti-FDP (1/1000).
L’espressione della proteina era normalizzata con espressione della
tubulina.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
34
FDP
LC
Graf. 1 espressione di FDP in diverse linee di Giardia
Come si puo’ notare dal grafico l’espressione della FDP è maggiore
nelle linee 106-21D10 e 713-MzR. L’espressione, rispetto alle cellule C6 che
fungono da controllo, è maggiore di circa un 50% nelle cellule 106-21D10 è
circa il 180% in piu’. L’espressione sembra quindi essere maggiore nelle
linee resistenti al farmaco. Tale differenza è evidente nel grafico 2. Nel
grafico sono confrontate le linee sensibili e resistenti ad Mz.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
35
La differenza è osservabile se si considerano le cellule MzS e le
corrispettive cellule MzR. La differenza maggiore è presente nelle cellule
713 che mostra, da dati in letteratura, una maggiore resistenza al farmaco.
Graf.2 Espressione di FDP in linee sensibili e resistenti a MZ
Trasformati Iperesprimenti FDP
Al fine di studiare possibili differenze nell’iperespressione di FDP,
venivano trasformate diverse linee di G. lamblia.
Erano utilizzate linee Mz sensibili (106, 713) ed Mz resistenti (106-
21D10, 713 MzR). Le cellule venivano elettroporate con il vettore pOCT-AU1
come descritto precedentemente.
Tutte le linee sono state trasfettate con successo. L’iperespressione
della FDP sembra essere compatibile con la vitalita’ cellulare.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
36
Incistamento
E’ stata studiata l’espressione della proteina durante l’incistamento
mediante western blotting. Sono stati raccolti campioni a tempi 12, 21 42
ore, a partire dall’inizio del processo.
Le bande sono state evidenziate con anticorpi anti-AU1.
Il SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ha mostrato che i
trascritti di FDP sono upregolati durante l’incistamento. Il livello di
espressione è più alto a 21ore come si puo’ osservare anche nella tabella.
Fig 10. Espressione della proteina FDP in diverse fasi della vita di G. lamblia
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
37
Fig 11. Espressione di FPD in una popolazione di G. lamblia
I risultati del western blotting con linea trasfettata C6FDPAU1 e
anticorpi anti-AU1 hanno mostrato che FDP è downregolata
nell’incistamento.
La più alta espressione si trova nei trofozoiti.
T kDa
LC
21 12 42
50 37
20
25
FDP
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
38
Fig. 12. Western blotting di Giardia a 12, 21 e 42 ore dall’incistamento.
Immunofluorescenza in cellule iperesprimenti
Al fine di confermare la localizzazione cellulare della proteina, sono
state utilizzate linee trasfettate con FDPAU1 e AU1 (controllo negativo).
Fig 13 e 14. Immunofluorescenza di Giardia.
La FDP mostra localizzazione citosolica ed ha una distribuzione
uniformente. Non sembra ci siano differenze tra le diverse linee cellulari
che mostrano tutte un segnale molto forte.
La distribuzione è la medesima anche nei trofozoiti incistanti. A 21 e
42 ore dall’incistamento è talvolta osservabile una piccola popolazione
cellulare (talvolta in cui FDP sembra associato alla membrana delle ESV.
Queste vescicole si formano solo durante l’incistamento ed al loro interno si
trovano proteine (tra cui CW1 e CW2, proteine della parete della cisti). Non
sono state trovate cisti in cui FDP fosse espressa.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
39
DISCUSSIONE
Le flavoproteine a doppio ferro (FDP) sono espresse in procarioti
anaerobi, stretti o facoltativi e in alcuni protozoi parassiti microaerofili.
Questa proteina sembra essere sintetizzata in risposta a stress ossidativi e
nitrosativi. Le FDP sono state recentemente identificate in un ristretto
gruppo di protozoi, tra questi, Giardia intestinalis, l’agente eziologico della
giardiasi, una malattia infettiva umana.
L’FDP di G. intestinalis, a partire da un gene sintetico è stata
espressa, purificata, e caratterizzata utilizzando tecniche come: raggi X,
cristallografia e spettroscopia.
Esperimenti preliminari da me effettuati avevano il fine di verificare
se la proteina ricombinante, espressa in E. coli, stimolasse il sistema
immunitario dell’ospite e se gli anticorpi così ottenuti, potessero
riconoscere la proteina anche in vivo, dimostrandone l’espressione nei
trofozoiti.
Si puo’ osservare dalla foto 6, la presenza di un unica banda per
line al peso molecolare atteso. La proteina ricombinate stimola il sistema
immunitario del topo e sembra comportarsi come la proteina nativa di G.
intestinalis.
Il siero iperimmune di topo, ottenuto dopo stimolazione con FDP
ricombinate, è in grado di riconoscere la proteina nativa espressa dal
protozoo.
Da esperimenti di immunofluorescenza si puo’ osservare che la FDP
in giardia ha una distribuzione citosolica uniforme.
Indagini preliminari sulla proteina, hanno mostrato che FDP ha
attivita’ ossidatati a nitrosativa. Per investigare in tal senso i trofozoiti sono
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
40
stati esposti a diverse concentrazioni differenti di NO, e in presenza o
assenza di ossigeno.
Differenti concentrazioni di NO non alterano l’espressione della
proteina.
Se viene rimosso l’ossigeno dal medium si puo’ osservare la
scomparsa della banda a 45KDa. Lo stress ossidativo, ma non quello
nitrosativo, elimina totalmente la reattività anticorpale. Questi risultati
sembrano indicare un ruolo nel controllo dello stato di ossidazione
cellulare.
L’esposizione delle cellule a H2O2 causa la scomparsa della proteina,
nel caso vengano usate concentrazioni maggiori di 100 uM. La scomparsa
della proteina potrebbe essere causata o da una rapida proteolisi oppure da
una secrezione nel surnatante. Fin ora non è stato possibile trovarla nel
surnatante, suggerendo che non È coinvolto un fenomeno legato alla
secrezione specifica di FDP. Tuttavia l’utilizzo di un inibitore di proteasi,
quale MG132, sembra impedire la scomparsa della proteina. Non è ancora
chiaro il meccanismo di protezione sia diretto (protezione dalla proteolisi) o
indiretto (blocco del meccanismo di secrezione della proteina). Ulteriori
studi sono in corso per chiarire il fenomeno.
Non è ancora noto il motivo per il quale G. lamblia colonizzi
preferenzialmente duodeno o digiuno, piuttosto che il colon (meno
aerobica), dove è presente la maggior parte della microflora batterica. I
trofozoiti di Giardia sono molto vulnerabili a H2O2, soprattutto perché
mancano sia catalasi e H2O2-reduttasi. Pertanto, si è tentati di sostenere
che la localizzazione peculiare di Giardia nel tratto prossimale dell’intestino
tenue sia legata al potere tampone redox più elevato di questo tratto
intestinale rispetto a quello intestino crasso (Fig. 6); L’ipotesi sul perchè
questo parassita colonizzi preferenzialmente la parte prossimale
dell’intestino è perché qui vi è una maggiore capacità di tampone redox e
quindi una minore propensione allo stress ossidativo rispetto al colon.
Dati di immunoflurescenza mostrano che la localizzazione della
proteina è citosolica. E’ possibile osservarla sia nei trofozoiti in fase
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
41
vegetativa ma anche in trofozoiti incitanti. A 12 ore dall’incistamento è
stata talvolta osservabile un’aggregazione di FDP nel citosol invece di una
distribuzione uniforme. Tuttavia questo potrebbe non essere significativo.
FDP non è presente nelle cisti tuttavia qualche volta è stata osservabile un
aggregazione della proteina alle pareti della cisti. A tempo 21 e 42 ore,
sembra che FDP non si trovi nelle ESV anche se sembrerebbe esservi
associata. Il forte segnale nel citosol non sembra pero’ chiarire
definitivamente l’esistenza di questa associazione.
L’utilizzo di anticorpi da noi prodotti suggerisce che la proteina era
piu’ abbondante in linee cellulari Mz-resistenti piuttosto che nelle linee
parentali sensibili al farmaco. Questo potrebbe suggerire una correlazione
tra livello di espressione della proteina e resistenza ad Mz. Per investigare
in questa direzione, ciascuna linea, sensibile e resistente ad Mz, era stata
trasformata con FDP-AU1 e selezionata con puromicina. Tutte le linee sono
stabili e vitali. Sono eseguiti western blotting ma non è stato possibile
apprezzare differenze utilizzando anticorpi anti-AU1. E’ possibile che il forte
segnale mascheri differenze tra le linee cellulari.
Il SAGE ha mostrato che i trascritti di FDP sono up-regolati durante
l’incistamento con la piu’ alta espressione a 21 ore. I risultati del western,
usando linee iperesprimenti FDP e utilizzando anticorpi anti-AU1, hanno
mostrato che FDP è down-regolata durante l’incistamento. La piu’ alta
espressione è nei trofozoiti della fase vegetativa. Tali risultati sono
confermati anche da esperimenti di immunofluorescenza.
E’ necessario condurre ulteriori esperimenti per determinare se la
iperespressione della proteina porti dei vantaggi alla cellula, quali una
maggiore resistenza al farmaco. Verificare se il knock-down di FDP possa
essere vitale ed avere effetti sulla resistenza al farmaco ed infine, effettuare
studi in vivo, in condizioni fisiologiche, per verificare o meno una maggiore
efficacia nella colonizzazione dell’intestino da parte delle diverse popolazioni
cellulari iperesprimenti.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
42
Sequenza vettore AU1 TACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCAGCTGATCGGCGCCGGGATGGGGGT
CCTGGGGCAGATAGCCGTTGGAACGGACAGCGACTTCCGCATCGTCAAGCACGCCCGTCGAACCCGGAAAAGGTAA
ATATTCACTTCAGCCCTCACTCGAGGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCACCAGGTGCGCGGTCCTTCGGGCACCTC
GACGTCGGCGGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAAAAGGGGAGGTTGCGGGGCGCGGAGGTCTCCAGGAAGGC
AGGCACCCCGGCGCGCTCGGCCGCCTCCACTCCGGGGAGCACGACGGCGCTGCCCAGACCCTTGCCCTGGTGGTC
GGGCGAGACGCCGACGGTGGCCAGGAACCACGCGGGCTCCTTGGGCCGGTGCGGCGCCAGGAGGCCTTCCATCTG
TTGCTGCGCGGCCAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCTGCGCGGGCCGATCTCGGCGAACACCGCCCCCGCTTCG
ACGCTCTCCGGCGTGGTCCAGACCGCCACCGCGGCGCCGTCGTCCGCGACCCACACCTTGCCGATGTCGAGCCCG
ACGCGCGTGAGGAAGAGTTCTTGCAGCTCGGTGACCCGCTCGATGTGGCGGTCCGGGTCGACGGTGTGGCGCGTG
GCGGGGTAGTCGGCGAACGCGGCGGCGAGGTGCGTACGGCCCGGGGGACGTCGTCGCGGGTGGCGAGGCGCAC
CGTGGGCTTGTACTCGGTGCCCATGGATTTTAAAATCTGGGGCGCCTGTAATTAAAGGCGTTATTTGTGGTCAAGCTT
GATATCGAATTCGGGCCCGACACGTACCGCTACATCTAGACTCCTCAACAGAGAGTCAGAGTAAACGAATTTCTGCC
GGTCAGGTCGTCTTGGGGACGGGGGAGATGTTTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCC
AATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTA
CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCT
TCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG
TTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCA
CGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCG
ACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGT
TGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGAT
TTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAA
AATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATAC
ATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT
CAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGA
AAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTG
AGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTAT
TGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGA
AAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAAGCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA
CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCT
TGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAA
CAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGGGCGGA
TAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGC
GTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGC
AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCA
GACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTG
ATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATC
TTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTG
CCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTA
GTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA
GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCG
GTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAG
CGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAA
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
43
CAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA
CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG
GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACC
GCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAA
GAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGA
CTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT
GCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGAT
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
44
BIBLIOGRAFIA Adam RD. Biology of Giardia lamblia.Clin Microbiol Rev.14(3):447-75. Aley SB, Gillin FD. (1993) Giardia lamblia: post-translational processing and status of
exposed cysteine residues in TSA 417, a variable surface antigen. Exp Parasitol. 77(3):295-305.
Andersson J.O., Sjogren A.M., Davis l.A., Embley T.M., Roger A.J. (2003) Evidence for Golgi bodies in proposed “Golgi-lacking” lineages. Curr. Biol. 13:94-104
Angarano G., Maggi P., Di Bari M.A., Larocca A.M., Congedo P., Di Bari C., Chiodo F. (1997) Giardiasis in HIV: a possible role in patients with severe immune deficiency. Eur J Epidemiol 13:485-487
Ballone E., Fazii P., Riario Sforz G., Scassa E., Di Nicola M., Ippolito N., Di Mascio C., Schioppa F., (2001) Survey on giardiasis propagation in Pescara. Ann Ig 13:111-120
Barwick R.S., Levy D.A., Braun G.F., Beach M.J., Calderon R.L.. (2000) Surveillance for water-borne disease outbreaks United States, 1997-1998. Morb. Mortal. Wkly. Rep. CDC Surveill. Summ. 49(SS-4):1-36
Bernander R, Palm JE, Svärd SG. (2001) Genome ploidy in different stages of the Giardia lamblia life cycle. Cell Microbiol. 3(1):55-62.
Boucher SE, Gillin FD. (1990) Excystation of in vitro-derived Giardia lamblia cysts. Infect Immun 58:3516–3522.
Brunet L.R. (2001) Nitric oxide in parasitic infections. Int Immunopharmacol 1:1475-1467
Buchel L.A., Gorenflot A., Chochillon C., Savel J., and Gobert J.G. (1987). In vitro excystation of Giardia from humans: a scanning electron microscopy study. J. Parasitol. 73:487-493
Caprioli A., Pezzella C., Morelli R., Giammanco A., Arista S., Crotti D., Facchini M., Guglielmetti P., Luzzi I. (1996) Enteropathogens associated with chilhood diarrhea in Italy. Pediatr Infect Dis J 15:876-883
Cevenini R., Varoli O., Mazzaracchio R., Nanetti A. (1985) A two-years longitudinal study on the etiology of acute diarrhea in young children in Northen Italy. Microbiologica 8:51-58
Cooper MA, Adam RD, Worobey M, Sterling CR. (2007) Population genetics provides evidence for recombination in Giardia.Curr Biol.;17(22):1984-8.
Daniels C.W., Belosevic M. (1994) Serum antibody response by male and female C57B1/6 mic infected with Giardia muris. Clin Exp Immunol 97:424-429
Di Matteo A., Scandurra F.M., Testa F., Forte E.,Sarti P., Brunori M., Giuffrè A. (2008) The O2 scavenging Flavodiiron protein in the human parasite Giardia intestinalis. 283:4061-4068
Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. (1978) A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg 72:431–432.
Eckmann, L. (2003). Mucosal defences against Giardia. Parasite Immunol. 25:259-270.
Elmendorf HG, Dawson SC, McCaffery JM.(2003) The cytoskeleton of Giardia lamblia. Int J Parasitol.;33(1):3-28.
Erlandsen SL, Russo AP, Turner JN. (2004) Evidence for adhesive activity of the ventrolateral flange in Giardia lamblia. J Eukaryot Microbiol. 51(1):73-80.
Erlandsen, S.L., W.J. Bemrick, D.E. Schupp, J.M. Shields, E.L. Jarroll, J.F. Sauch, and J.B. Pawley. (1990). High-resolution immunogold localization of Giardia cyst wall antigens using field emission SEM with secondary and backscatter electron imaging. J. Histochem. Cytochem. 38:625-632
Escobedo AA, Cimerman S. (2007) Giardiasis: a pharmacotherapy review. Expert Opin Pharmacother. ;8(12):1885-902.
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
45
Faubert G, Reiner DS, Gillin FD. (1991) Giardia lamblia: regulation of secretory vesicle formation and loss of ability to reattach during encystation in vitro.Exp Parasitol. 72(4):345-54.
Faubert G. (2000) Immune response to Giardia duodenalis. Clin Microbiol Rev 13: 35-54
Fernandes P.D., Assreuy J. (1997) Role of nitric oxide and super-oxide in Giardia lamblia killing Braz J Med Biol Res. 30(1):93-9.
Flanagan P.A. (1992) Giardia – diagnosis, clinical course and epidemiology. A reviw. Epidemiol. Infect 109:1-22
Galperin MY. (2007) Some bacteria degrade explosives, others prefer boiling methanol. Environ Microbiol.;9(12):2905-10.
Genchi C., Pozio E., ed De Carneri Parassitologia generale e umana (2003) Gerwig GJ, van Kuik JA, Leeflang BR, Kamerling JP, Vliegenthart JF, Karr CD,
Jarroll EL. (2002) The Giardia intestinalis filamentous cyst wall contains a novel beta(1-3)-N-acetyl-D-galactosamine polymer: a structural and conformational study.Glycobiology. 12(8):499-505.
Gillin FD, Boucher SE, Rossi SS, Reiner DS. (1989) Giardia lamblia: the roles of bile, lactic acid, and pH in the completion of the life cycle in vitro.Exp Parasitol.69(2):164-74.
Gillin FD, Reiner DS, Gault MJ, Douglas H, Das S, Wunderlich A, Sauch JF. (1987) Encystation and expression of cyst antigens by Giardia lamblia in vitro. Science.;235(4792):1040-3.
Gillin FD, Reiner DS, McCaffery JM. (1996) Cell biology of the primitive eukaryote Giardia lamblia.Annu Rev Microbiol.;50:679-705.
Gillin, F.D., Reiner D.S., and McCaffery J.M. (1996) Cell biology of the primitive eukaryote Giardia lamblia. Annu. Rev. Microbiol. 50:679-705
Gomes C.M., Giuffrè A. Forte E., Vicente J.B., Saraiva L.M.,Brunori M. (2002) A novel type of nitric-oxide reductase. J. Biol. Chem. 277:25273-25276
Hare DF, Jarroll EL, Lindmark DG (1989) Giardia lamblia: characterization of proteinase activity in trophozoites. Exp Parasitol 68:168-175
Hetsko ML, McCaffery JM, Svärd SG, Meng TC, Que X, Gillin FD. (1998) Cellular and transcriptional changes during excystation of Giardia lamblia in vitro.Exp Parasitol. 88(3):172-83.
Heyworth M.F.(1989) Intestinal IgA responses to Giardia muris in mice depleted of helper T lymphocytes and in immunocompetent mice. J Parasitol 75:246-251
Kabnick, K.S., and D.A. Peattie (1990) In situ analyses reveal that the two nuclei of Giardia lamblia are equivalent. J. Cell Sci. 95:353-360
Kaur H, Ghosh S, Samra H, Vinayak VK, Ganguly NK (2001) Identification and characterization of an excretory-secretory product from Giardia lamblia. Parasitology 123:347-356
Keister D.B. (1983) Axenic culture of Giardia lamblia in Tyi-S-33 medium supplemented with bile. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg 77:487-488
Keister DB. (1983) Axenic culture of Giardia lamblia in TYI�S�33 medium supplemented with bile. Trans R Soc Trop Med Hyg 77:487–488.
Lane S., Lloyd D. (2002). Current trends in research into the waterborne parasite Giardia. Crit Rev Microbiol. 10:122-127
Lanfredi-Rangel A, Attias M, Reiner DS, Gillin FD, De Souza W. (2003) Fine structure of the biogenesis of Giardia lamblia encystation secretory vesicles.J Struct Biol.143(2):153-63.
Lauwaet T, Davids BJ, Reiner DS, Gillin FD. (2007) Encystation of Giardia lamblia: a model for other parasites. Curr Opin Microbiol.;10(6):554-9.
Lauwaet T, Davids BJ, Torres-Escobar A, Birkeland SR, Cipriano MJ, Preheim SP, Palm D, Svärd SG, McArthur AG, Gillin FD.(2007) Protein phosphatase 2A plays a crucial role in Giardia lamblia differentiation.Mol Biochem Parasitol.;152(1):80-9.
Libanore M., Bicocchi R., Rossi Montanari P., Sighinolfi L., Ghinelli F. (1991) Incidence of giardiasis in adults patients with acute enteritis. Minerva Med 82:375-380
Lloyd D, Wallis P. (2001)A Giardia feast.Trends Parasitol.;17(3):115-7
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
46
Marti M, Regös A, Li Y, Schraner EM, Wild P, Müller N, Knopf LG, Hehl AB. (2003) An ancestral secretory apparatus in the protozoan parasite Giardia intestinalis.J Biol Chem. ;278(27):24837-48
Misra PK, Kumar A, Agarwal V, Jagota SC. (1995) A comparative clinical trial of albendazole versus metronidazole in children with giardiasis. Indian Pediatr. ;32(7):779-82.
Morrison HG et al. (2007) Genomic minimalism in the early diverging intestinal parasite Giardia lamblia. Science.317(5846):1921-6.
Müller N, von Allmen N. (2005) Recent insights into the mucosal reactions associated with Giardia lamblia infections.Int J Parasitol. 35(13):1339-47.
Müller N., Von Allmen N. (2005) Recent insights into the mucosal reactions associated with Giardia lamblia infections. Int J Parasitol 35:1339-1347
Nain C.K., Dutt P., Vinayak V.K. (1991) Alterations in enzymatic activities of the intestinal mucosa during the course of Giardia lamblia infection in mice. Ann Med Parasitol 85:515-522
Nash T.E., Herrington D.A., Losonsky G.A., Levine M.M. (1987) Experimental human infections with Giardia lamblia. J Infect dis 156: 679-705
Nash TE, Merritt JW Jr, Conrad JT. (1991) Isolate and epitope variability in susceptibility of Giardia lamblia to intestinal proteases. Infect Immun.;59(4):1334-40.
Ortega, Y. R., and R. D. Adam. (1997). Giardia: overview and update. Clin. Infect. Dis. 25:545-549
Paget TE, Jarroll EL, Manning P, Lindmark DG, Lloyd D ( 1989 ) Respiration in the cysts and trophozoites of Giardia muris. J. Gen. Microbiol. 135 : 145 -154
Palm D, Weiland M, McArthur AG, Winiecka-Krusnell J, Cipriano MJ, Birkeland SR, Pacocha SE, Davids B, Gillin F, Linder E, Svärd S. (2005) Developmental changes in the adhesive disk during Giardia differentiation. Mol Biochem Parasitol. 141(2):199-207.
Parenti DM (1989) Characterization of a thiol proteinase in Giardia lamblia. J Infect Dis 160:1076-1080
Pathuri P, Nguyen ET, Ozorowski G, Svärd SG, Luecke H. (2009) Apo and calcium-bound crystal structures of cytoskeletal protein alpha-14 giardin (annexin E1) from the intestinal protozoan parasite Giardia lamblia. J Mol Biol.;385(4):1098-112.
Piva B, Benchimol M. (2001) The median body of Giardia lamblia: an ultrastructural study. Biol Cell. 2004 Dec;96(9):735-46.
Prucca CG, Slavin I, Quiroga R, Elías EV, Rivero FD, Saura A, Carranza PG, Luján HD. (2008) Antigenic variation in Giardia lamblia is regulated by RNA interference. Nature. ;456(7223):750-4.
Pucci R., Marino R., Ilardi I. (1967) Giardiasis in chilhood. Arch Ital Scia Med Trop Parassitol 48:135-144
Ramesh MA, Malik SB, Logsdon JM Jr. (2005) A phylogenomic inventory of meiotic genes; evidence for sex in Giardia and an early eukaryotic origin of meiosis.Curr Biol.;15(2):185-91.
Reiner DS, McCaffery M, Gillin FD. (1990) Sorting of cyst wall proteins to a regulated secretory pathway during differentiation of the primitive eukaryote, Giardia lamblia.Eur J Cell Biol. 53(1):142-53.
Rendtorff RC. (1960). The experimental trasmission of human intestinal protozoan parasites. 59(2):209-220
Rosenkranz HS, Speck WT. (1975) Mutagenicity of metronidazole: activation by mammalian liver microsomes. Biochem Biophys Res Commun. 16;66(2):520-5.
Sahagun J, Clavel A., Goni P., Seral C.,Llorente M.T., Castillo F.G., Capilla S., Aria A., Gomez-Lus R. (2008) Correlation between the presence of symptons and the Giardia duodenalis genotype. Eur J Clinic Microbiol Infect Dis 27:81-83
Scott K.G., Logan M.R., Klammer G.M. (2000) Jejunal brush border microvillous alterations in Giardia muris-infected mice: role of T lymphocytes and inteleukin-6. Infect Immun 68:3412-3418
Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari
47
Simon MC and JH Schmidt (2007) Antigenic variation in ciliates: antigen structure, function, expression. J Eukaryot Microbiol. 54(1):1-7.
Slavin I, Saura A, Carranza PG, Touz MC, Nores MJ, Luján HD.(2002) Dephosphorylation of cyst wall proteins by a secreted lysosomal acid phosphatase is essential for excystation of Giardia lamblia. Mol Biochem Parasitol.;122(1):95-8.
Snider D.P., Underdown B.J. (1986) Quantitative and temporal analyses of murine antibody response in serum and gut secretions to infection with Giardia muris. Infect immune 52:271-278
Svärd SG, Hagblom P, Palm JE. (2003) Giardia lamblia -- a model organism for eukaryotic cell differentiation. FEMS Microbiol Lett. 218(1):3-7.
Svärd SG, Meng TC, Hetsko ML, McCaffery JM, Gillin FD.(1998) Differentiation-associated surface antigen variation in the ancient eukaryote Giardia lamblia.Mol Microbiol;30(5):979-89.
Teodorovic S, Braverman JM, Elmendorf HG. (2007) Unusually low levels of genetic variation among Giardia lamblia isolates.Eukaryot Cell.6(8):1421-30.
Thompson R.C., Monis P.T. (2004) Variations in Giardia: implications for taxonomy and epidemiology. Adv parasitol 58:69-137
Tilney LG, Tilney MS. (1996)The cytoskeleton of protozoan parasites. J Cell Biol.;133(1):61-74.
Upcroft J, Upcroft P. (1998) My favorite cell: Giardia Bioessays.;20(3):256-63. Upcroft JA, Dunn LA, Wright JM, Benakli K, Upcroft P, Vanelle P. (2006) 5-
Nitroimidazole drugs effective against metronidazole-resistant Trichomonas vaginalis and Giardia duodenalis.Antimicrob Agents Chemother. 50(1):344-7
Upcroft JA, Upcroft P. (2001) Drug susceptibility testing of anaerobic protozoo Antimicrob Agents Chemother. 45(6):1810-4.
Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. (1995) Serial analysis of gene expression. Science. 270(5235):484-7.
Wallace J.L., Miller M.J. (2000) Nitric oxide in mucosal defense: a little goes a long way. Gastroenterology 119:512-520
Ward W, Alvarado L, Rawlings ND, Engel JC, Franklin C, McKerrow JH. (1997)A primitive enzyme for a primitive cell: the protease required for excystation of Giardia. Cell. 89(3):437-44.
Wasserfallen A., Ragettli S., Jouanneau Y., Leisinger T. (1998) A family of flavoproteins in the domains Archaea and Bacteria. Eur. J. Biochem. 254:325-332
Wielinga CM. and RC Thompson. (2007) Comparative evaluation of Giardia duodenalis sequence data. Parasitology.134(Pt 12):1795-821.
Williams AG, Coombs GH (1995) Multiple protease activities in Giardia intestinalis trophozoites. Int J Parasitol 25:771-77
Yee and Nash, PNAS (1995) Transient transfection and expression of firefly luciferase in Giardia lamblia. 92: 5615-5619