studio del ruolo dei membri della famiglia genica dell'oncosoppressore p53 nella modulazione...
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Tesi di Laurea Triennale Sperimentale in Biologia Molecolare di Alessandro Renato FerrariTRANSCRIPT
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI BARI FACOLTA' DI SCIENZE BIOTECNOLOGICHE
Corso di laurea triennale inBiotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche
Tesi di laurea sperimentale inBiologia Molecolare
Studio del ruolo dei membri della famiglia genica dell'oncosoppressore p53 nella modulazione dell'espressione dei geni STIM1 e STIM2.
RelatoreChiar.ma Dott.ssa Anna Maria D'ErchiaCorrelatoreChiar.ma Dott.ssa Apollonia TulloChiar.mo Dott. Mariano Francesco Caratozzolo
LaureandoAlessandro Renato Ferrari
Anno Accademico 2009-2010
1
INDICE
1. SINTESI DEL PROGETTO FORMATIVO ........................................................ 2
2. SINTESI DEL CONTESTO APPLICATIVO ...................................................... 5
3. DESCRIZIONE DELL’ATTIVITÀ SVOLTA ..................................................... 9
3.1 Amplificazione delle p53REs mediante PCR .................................... … 9
3.1.1 Purificazione degli amplificati da gel di agarosio ............................... 10
3.1.2 Reazione di ligazione .......................................................................... 12
3.1.3 Trasformazione di cellule competenti con i vettori ricombinanti ....... 14
3.1.4 Estrazione del DNA plasmidico .......................................................... 14
3.2 Saggi di luciferasi .................................................................................... 15
3.2.1 Colture cellulari .................................................................................. 15
3.2.2 Piastramento della linea cellulare H1299 (p53 -/-) ............................. 16
3.2.3 Trasfezione della linea cellulare H1299 .............................................. 16
3.2.4 Saggio Reporter .................................................................................. 17
4. RISULTATI E CONCLUSIONI .......................................................................... 19
5. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 23
2
1. SINTESI DEL PROGETTO FORMATIVO
I segnali mediati dal calcio (Ca2+
) citosolico controllano un'ampia gamma di funzioni
cellulari che vanno da risposte a breve termine, come la contrazione e la secrezione,
a regolazioni a lungo termine, come la crescita cellulare e la proliferazione.
Nelle cellule non eccitabili, il signaling mediato dal Ca2+
è tipicamente avviato dalla
produzione (in risposta ad attivazione recettoriale) di inositol-1,4,5-tri-fosfato (IP3)
che porta ad un rapido rilascio di Ca2+
immagazzinato nel reticolo endoplasmatico
(RE). In seguito a questo evento, per ripristinare i livelli di Ca2+
intracellulari,
principalmente nel reticolo endoplasmatico (RE), si verifica l'attivazione e quindi
l'apertura dei canali del Ca2+
presenti nella membrana cellulare (PM), chiamati SOCs
(store-operated channels).
Tra i SOCs, il più conosciuto è il canale CRAC (Ca2+
release-activated Ca2+
). In
questi canali il passaggio del Ca2+
è mediato dalla proteina CRACM1 (Ca2+
release-
activated Ca2+
modulator 1) che forma un poro selettivo all'interno dei CRACs grazie
a quattro segmenti transmembrana (1).
L'associazione dei due processi (apertura dei canali del Ca2+
nel RE e la successiva
apertura di quelli della PM), chiamata nel complesso SOCE (store-operated Ca2+
entry), è mediata dalle proteine STIM1 (Stromal Interaction Molecular gene 1) e
STIM2 (Stromal Interaction Molecular gene 2), che agiscono come sensori del Ca2+
intracellulare ed in particolare dei suoi livelli nel lume del RE dove sono localizzate
come proteine transmembrana (2).
STIM1 e 2 hanno una similarità strutturale del 61% differendo soprattutto nella
regione C-terminale; in comune hanno una coppia di domini “EF-hand” responsabili
della rilevazione e del monitoraggio dei livelli di Ca2+
nel lume del RE all'interno del
quale questi domini risiedono (3). In particolare, in condizioni di riposo, i domini
“EF-hand” di STIM1 legano a bassa affinità il Ca2+
(Figura 1A) e in seguito a una
3
Figura 1: Meccanismi postulati per l’attivazione
dei SOCs da parte di STIM1 (Spassova MA et
al., 2006)
sua deplezione si determina un cambiamento conformazionale di STIM1, che lo
porta a formare dei multimeri, che appaiono come regioni distinte del RE vicine alla
membrana plasmatica (Figura 1B) (4).
Sono stati postulati due meccanismi da Spassova et al. (2006) per spiegare in che
modo avvenga il meccanismo del SOCE:
modello inserzionale, secondo il quale i multimeri della proteina STIM1
vengono traslocati e inseriti nella
membrana plasmatica cellulare e
attivano i canali SOCs, per
interazione diretta (Figura 1C,
Figura1D).
modello dell'influenza, secondo il
quale l'aggregato di STIM1 nel RE
si associa con le proteine STIM1
presenti nella membrana plasmatica cellulare e induce la formazione di un
complesso tra STIM1 e i canali SOCs che porta all'attivazione di questi ultimi
(Figura 1E, Figura 1F).
Mentre STIM1 è coinvolto nell'attivare l'afflusso di Ca2+
in risposta alla deplezione
delle scorte dello ione mediata da recettore, STIM2, di cui ancora poche
informazioni sono presenti in letteratura, lo fa in risposta a più basse diminuzioni dei
livelli dello ione nel RE, funzionando così da regolatore che stabilizza i livelli basali
di Ca2+
citosolici e del RE (5).
Il meccanismo del SOCE svolge un ruolo chiave nella risposta immunitaria di tipo T
(6) e mutazioni nei geni coinvolti nel processo di regolazione delle scorte di Ca2+
portano a patologie come ad esempio l'immunodeficienza combinata grave (7).
4
Inoltre, il meccanismo del SOCE è implicato nella regolazione di numerosi processi
cellulari fondamentali come la migrazione, la proliferazione e il differenziamento, e
un alterato signaling del Ca2+
è stato osservato in numerosi tipi di cellule tumorali.
Difatti l'inibizione dell'afflusso di Ca2+
può indurre o l'arresto della crescita o la
morte della cellula in molti tipi di tumore (8).
Per quanto riguarda STIM1, in letteratura sono riportati dati contrastanti circa il suo
coinvolgimento nel processo della cancerogenesi.
Inizialmente, STIM1 era stato considerato un gene oncosoppressore poiché causa
l'arresto del ciclo cellulare nelle cellule umane G401 di tumore rabdoide (un tipo di
tumore renale dell'infanzia): in queste cellule, infatti, l'espressione del gene è
fortemente repressa e potrebbe avere un ruolo nella patogenesi di tale neoplasia;
l'effetto oncosoppressore era stato osservato solo in questo tipo di cellule (9,10).
Successivamente è stato riportato che STIM1 ha un ruolo fondamentale nella
migrazione cellulare e nella capacità di metastatizzare nel carcinoma mammario
umano (11). Inoltre, nel carcinoma mammario canino è stata trovata una up-
regolazione di STIM1, associata ad una aumentata migrazione cellulare e
progressione tumorale negli organi distali (12). Un ruolo centrale nella migrazione
cellulare è svolto dal turnover dell'adesione focale (adesione della cellula alla matrice
extracellulare mediante le integrine cellulari): il disassemblamento delle adesioni
focali nella parte posteriore della cellula e il contemporaneo assemblaggio delle
stesse nella parte anteriore determinano il movimento della cellula in avanti (13,14).
Si è visto che bloccando l'afflusso di Ca2+
(con siRNA contro STIM1) si ha una
disregolazione del turnover delle adesioni focali che le rende più stabili e quindi
fortemente aderenti, impedendo la rapida migrazione delle cellule, incluse quelle
5
metastatiche del cancro. Questo apre a nuove potenziali strategie terapeutiche per il
trattamento dei tumori metastatici che vadano a bloccare i SOCs (15).
Tuttavia, altri lavori recenti sembrerebbero confermare il ruolo di STIM1 come
oncosoppressore, come inizialmente ipotizzato. Infatti, nel carcinoma polmonare
derivato da metastasi del melanoma umano, la soppressione di STIM1 ha portato ad
una accelerata motilità delle cellule (11).
Anche nel tumore di Wilms, nonostante possa metastatizzare, manca l'attività di
ripristino delle riserve di Ca2+
dovuta ad una riduzione di STIM1 poiché c'è una
notevole up-regolazione del gene WT1 che sembra inibire direttamente l'espressione
di STIM1 (16).
Pertanto anche se si è capito il meccanismo molecolare alla base del SOCE, si sa
ancora poco circa la regolazione trascrizionale dei geni STIM1 e STIM2.
2. SINTESI DEL CONTESTO APPLICATIVO
Il lavoro oggetto di tesi, svolta presso l’Istituto di Tecnologie Biomediche (ITB) –
CNR di Bari, ha avuto come obiettivo lo studio della regolazione dell’espressione dei
geni STIM1 e STIM2 da parte dei diversi membri della famiglia genica
dell’oncosoppressore p53.
Il nostro progetto è partito da uno studio in silico. Infatti, abbiamo interrogato il
database p53FamTAG (17) per verificare la presenza nelle sequenze regolatorie dei
geni STIM1 e STIM2 di elementi suscettibili al controllo trascrizionale da parte dei
membri della famiglia genica di p53, chiamati p53 Responsive Element (p53RE).
La famiglia genica di p53 comprende tre membri (p53, p63 e p73), fattori di
trascrizione coinvolti in processi cellulari fondamentali: nello specifico p53 è un
oncosoppressore che svolge un ruolo critico nella risposta cellulare a diversi stress e
6
Figura 2: Struttura dei tre membri della famiglia genica di
p53
nel mantenimento dell'integrità genomica, mentre p63 e p73 sono principalmente
coinvolti nel differenziamento e nello sviluppo (18).
Ogni membro della famiglia ha diverse isoforme che portano ad un maggiore grado
di complessità, necessaria nel contesto della regolazione delle funzioni indicate.
Il primo grado di
diversificazione è costituito
dal promotore: oltre a
quello che precede il primo
esone e che porta alla
produzione delle isoforme
TA (ovvero con dominio di
trans-attivazione), la trascrizione può iniziare a partire da promotori alternativi che
si trovano nell'introne tre per p73 e p63 e nell'introne quattro per p53; da questi
promotori alternativi si originano le isoforme ΔN che sono prive del dominio di
trans-attivazione N-terminale. Comunque esse possono attivare direttamente geni
target specifici grazie alla presenza di dominii di transattivazione secondari,
localizzati a valle (19). Le isoforme ΔN sono in grado di esercitare un effetto
dominante-negativo sull'attività delle isoforme TA e hanno un potenziale anti-
apoptotico e proliferativo.
Un ulteriore livello di diversificazione è dato dallo splicing alternativo a livello delle
estremità C-terminali. Pertanto globalmente sono state descritte finora nove
isoforme per p53, ventinove per p73 e dieci per p63 (20). Le isoforme α sono le più
lunghe poiché presentano tutti gli esoni.
Le tre proteine della famiglia genica hanno tre domini funzionali in comune: il
dominio N-terminale di transattivazione (TA), che recluta i fattori di inizio della
trascrizione sui promotori dei geni target; il dominio di legame al DNA e il dominio
7
di oligomerizzazione, che permette la formazione di oligomeri, rendendo le proteine
funzionalmente attive. Nelle isoforme α di p63 e p73 è presente anche il dominio
SAM (Sterile α Motif) seguito dal dominio inibitore TI che permette l'auto-
inibizione dell'attività trascrizionale delle isoforme TA.
Sebbene ci sia conservazione a livello strutturale, sarebbe un errore considerare
ridondanti le funzioni dei tre membri della famiglia. Studi condotti su topi knockout
per ciascuno dei tre geni hanno dimostrato che p53, p63 e p73 hanno funzioni
specifiche.
Infatti, topi transgenici che esprimono una forma mutata di p53 o che ne sono del
tutto privi (p53 -/-) nascono normalmente, ma sviluppano spontaneamente dei
tumori maligni e ciò indica che p53 non partecipa direttamente ai processi di
sviluppo, ma è indispensabile per la protezione dell’organismo dalla trasformazione
tumorigenica delle cellule.
Al contrario, topi knock-out per p63 (p63 -/-) mostrano notevoli alterazioni dello
sviluppo, gli arti e la pelle sono fortemente affetti, mancano di uno strato epidermico
pluristratificato a ricoprire il corpo e muoiono nel giro di pochi giorni dalla nascita
per disidratazione.
Infine, topi knock-out per tutte le isoforme di p73 esibiscono profondi difetti, che
includono la disgenesia dell’ippocampo, idrocefalo, infezioni croniche e processi
infiammatori, così come anormalità nel pathway di percezione dei ferormoni, però
non mostrano un’aumentata suscettibilità al cancro.
Sono state evidenziate funzioni di p73 sia peculiari come il ruolo nella neurogenesi
di particolari strutture neuronali (le isoforme ΔN in particolare neutralizzano la
morte delle cellule neuronali mediata da p53) e il mantenimento del fluido
cerebrospinale sia funzioni simili a quelle di p53: l'overespressione ectopica di p73α
e p73β mima strettamente l'attività trascrizionale (espressione di target specifici di
8
p53 come p21 e GADD45) e le funzioni biologiche di p53 (induzione arresto ciclo
cellulare e apoptosi). È stato visto, infatti, come p73 (e in particolare p73β) sia in
grado di indurre apoptosi in linee cellulari tumorali, indipendentemente dallo stato
di p53.
Oltre al conclamato ruolo delle mutazioni di p53 nei tumori umani ultimamente è
stato dimostrato un coinvolgimento anche degli altri due membri della famiglia
genica. p63 e p73 raramente si ritrovano mutati e l’alterazione più comune
evidenziata nel cancro umano è la loro iper-espressione piuttosto che una perdita di
espressione come ad esempio nel carcinoma primario a cellule squamose della testa
e del collo dove l'isoforma ΔNp63α è iper-espressa. È stato quindi suggerito che
questa forma sia richiesta per mantenere uno stato di staminalità, permettendo una
continua proliferazione e promuovendo la crescita tumorale.
Il contributo diretto di p63 e p73 (e in particolare delle isoforme α sia TA che ΔN)
alla proliferazione cellulare è stato dimostrato verificando come queste proteine
attivino la trascrizione di specifici sottoinsiemi di geni coinvolti nella progressione
della crescita e specificatamente nella transizione G1-S del ciclo cellulare come
ADA (Adenosine Deaminase) e FASN (Fatty Acid Synthase), che possiedono
p53REs nella sequenze geniche. La soppressione delle isoforme TA e ΔN di p63 e
p73 porta ad una riduzione del tasso di proliferazione rispetto ai controlli. Viceversa
l'espressione ectopica delle isoforme TA e ΔN di p73α e p63α, ma non di p53,
aumenta il tasso di proliferazione cellulare dimostrando come le isoforme di p63 e
p73 abbiano ruoli opposti a quelli di p53 nel ciclo cellulare in condizioni
fisiologiche (21).
Il nostro studio in silico, attraverso l'interrogazione del database p53FamTAG ci ha
permesso di individuare cinque p53REs nei primi introni del gene STIM1 e una
p53RE nel primo introne del gene STIM2.
9
Per verificare se le p53REs presenti nei geni STIM1 e STIM2 rispondano
all'attivazione trascrizionale da parte dei membri della famiglia genica
dell'oncosoppressore p53, abbiamo clonato le due p53REs di STIM1 più vicine al
sito di inizio della trascrizione e l'unico p53RE presente nel gene STIM2 in un
vettore reporter per poter effettuare dei saggi di luciferasi.
3. DESCRIZIONE DELL’ATTIVITÀ SVOLTA
3.1 Amplificazione delle p53REs mediante PCR
L’analisi in silico ha evidenziato la presenza di un’unica p53RE presente
nell’introne uno del gene STIM2 e cinque diverse p53REs presenti nei primi introni
del gene STIM1. Per compiere il nostro studio sono stati scelti il target presente nel
gene STIM2 (chiamato STIM2 p53RE) e i primi due target presenti nel gene STIM1
(chiamati STIM1.1 e STIM1.2, corrispondenti alle due sequenze più vicine al sito di
inizio della trascrizione del gene).
Le regioni fiancheggianti le p53REs oggetto di studio sono state amplificate, a
partire da DNA genomico, utilizzando coppie di primers specifici per ogni sequenza
da analizzare. Per favorire le fasi successive del clonaggio dei tre frammenti nei
vettori reporter, al 5’ dei primers forward è stata aggiunta una sequenza contenente il
sito di restrizione per l’enzima NheI, mentre al 5’ dei primers reverse è stata
aggiunta una sequenza contenente il sito di restrizione per l’enzima BglII.
Dimensioni
STIM2 p53RE 297 bp
STIM1.1 p53RE 244 bp
STIM1.2 p53RE 252 bp
Tabella 1: Dimensioni degli amplificati
Per ogni p53RE sono state effettuate due reazioni di PCR (campione da amplificare
e, in parallelo, bianco, usato come controllo negativo, a cui non è stato aggiunto il
DNA stampo) allestite seguendo lo schema riportato qui di seguito:
10
Campione Bianco
Buffer (5X → 1X) 10 μl 10 μl
MgCl2 (25 mM → 3 mM) 6 μl 6 μl
DNTP (10 mM → 0,2 mM) 1 μl 1 μl
Primer FOR (10 pmol/μl → 0,4 pmol/μl) 2 μl 2 μl
Primer REV (10 pmol/μl → 0,4 pmol/μl) 2 μl 2 μl
TAq DNA Pol (5 U → 2,5 U) 2 μl 2 μl
DNA stampo 3 μl -
H2O 25,5 μl 28,5 μl
Volume finale 50 μl 50 μl
Una volta miscelati i vari componenti della reazione, il termociclatore è stato
programmato secondo il seguente schema di reazione:
Temperatura Tempo N° di cicli
Denaturazione iniziale 95°C 5' 1
Denaturazione 95°C 30''
Annealing 64°C 30'' 30 cicli
Estensione 72°C 30''
Estensione finale 4° ∞ 1
3.1.1 Purificazione degli amplificati da gel di agarosio
I prodotti di PCR sono stati sottoposti a corsa elettroforetica su gel di agarosio
all'1,4% e la banda corrispondente al prodotto amplificato, per ogni campione, è
stata tagliata dal gel ad un transilluminatore U.V. e inserita in una provetta da 1,5 ml.
L'eluizione da gel è stata fatta utilizzando il “Wizard® SV Gel and PCR Clean – Up
System” della Promega, secondo il seguente protocollo:
1) Aggiungere, 10 μl per ogni 10 mg di gel, di Membrane Binding Solution.
2) Incubare la sospensione per 10 min a 65°C e agitare al vortex ogni 2-3 min,
in modo che l’agarosio si dissolva rilasciando il DNA.
3) Inserire una colonnina SV con filtro nel Collection Tube; trasferire l’intero
contenuto della eppendorf nella colonnina e incubare per 1 min a temperatura
ambiente.
11
4) Centrifugare a 14000 rpm per 1 min ed eliminare l’eluato.
5) Aggiungere 700 μl di Membrane Wash Solution complementata con EtOH al
95% (al fine di permettere la formazione di un aggregato di DNA che
precipitando rimane legato al filtro) e centrifugare a 14000 rpm per 5 min;
eliminare l’eluato.
6) Ripetere il lavaggio con 500 μl di Membrane Wash Solution e centrifugare a
14000 rpm per 5 min; eliminare l’eluato.
7) Centrifugare a 14000 rpm per 1 min per allontanare eventuali tracce di EtOH;
8) Trasferire la colonnina in una eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 50 μl di
H2O Nuclease-Free direttamente nel centro della colonnina, facendo
attenzione a non toccare il filtro.
Incubare per 1 min a temperatura ambiente e centrifugare a 14000 rpm per 1
min.
Dosare i campioni eluiti su gel di agarosio all’1,4%, mediante confronto con
marker di 100 bp (0,5 μg/μl).
Successivamente, gli amplificati purificati sono stati sottoposti a digestione con
gli enzimi di restrizione:
- NheI (1 U/μg di frammento di DNA) e BglII (1 U/μg di frammento di DNA) a
37° o.n., per le p53REs chiamate STIM2 e i due target di STIM1.
3.1.2 Reazione di ligazione
Le tre p53REs oggette dello studio sono state clonate nei vettori reporter pGL3
Basic e pGL3 Promoter. Nei vettori pGL3 Basic, la sequenza viene clonata
esclusivamente a monte del gene reporter della luciferasi (LUC) e permette di
valutare se tale sequenza abbia o meno funzione di promotore; nei vettori pGL3
Promoter è presente un promotore minimo di SV40 che ha un'attività basale di
trascrizione e ciò ci permette di valutare se la sequenza oggetto di studio abbia
12
funzione di enhancer o di silencer (Figura 3).
Figura 3: Rappresentazione schematica del vettore pGL3 basic e del vettore pGL3 promoter.
I vettori pGL3 Basic e pGL3 Promoter (5 μg) sono stati digeriti con gli enzimi di
restrizione BglII (1 U/μg DNA) e NheI (1 U/μg DNA) a 37°C O.N..
Successivamente, i vettori sono stati defosforilati alle estremità 5’ mediante
trattamento con fosfatasi alcalina per 30 min a 37°C, in modo da impedire, durante la
ligazione, la ri-circolarizzazione delle molecole di vettore, eventualmente digerite da
uno solo degli enzimi di restrizione utilizzati, ed avere così una bassa efficienza di
ligazione. Infine il vettore digerito e defosforilato è stato purificato mediante
estrazione fenolica, seguita da precipitazione alcolica.
Una volta terminate tutte queste operazioni, si è proceduto alle reazioni di ligazione
vettori-inserti.
Per facilitare l'incontro tra inserti e vettore, normalmente si aggiunge una quantità di
inserto da 3 a 8 volte maggiore rispetto al vettore (favorendo la formazione di legami
inter-molecolari piuttosto che intra-molecolari) e cioè:
3*
bp
bpng
ngVettore
InsertoVettore=Inserto
Utilizzando la formula, abbiamo effettuato i calcoli considerando le dimensioni degli
inserti riportate in Tabella 1. Date le concentrazioni dei vari frammenti e dividendo i
valori ottenuti dalla formula 2 con queste si otterrà il volume da prelevare.
Ad esempio per la reazione di ligazione tra vettore pGL3 Basic e la p53RE di
13
STIM2, si ricava il volume di frammento (concentrato 13,1 ng/μl) nel modo
seguente:
Quindi si è allestita la reazione di ligazione come segue:
STIM1.1
pGL3 Basic
STIM1.2
pGL3 Basic
STIM2 pGL3
Basic
STIM1.1
pGL3
Promoter
STIM1.2
pGL3
Promoter
STIM2 pGL3
Promoter
Buffer di diluizione
(5X)
4 μl 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl
Buffer di ligazione
(2X)
10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl
T4 ligasi (1/μl) 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl
Vettore (25 ng/μl) 2 μl 2 μl 3,33 μl 2 μl 2 μl 2,08 μl
Frammento 1,04 μl 1,04 μl 0,71 μl 1,04 μl 1,04 μl 0,7 μl
H2O 1,96 μl 1,96 μl 0,96 μl 1,96 μl 1,96 μl 2,21 μl
Volume finale 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl
La reazione di ligazione è stata condotta per 20 min a temperatura ambiente.
3.1.3 Trasformazione di cellule competenti con i vettori ricombinanti
La trasformazione è stata condotta utilizzando il ceppo super-competente di E. Coli
XL-1 blu (capace di inglobare il DNA con altissima efficienza), secondo il seguente
protocollo:
1. Aliquotare 50 μl di cellule batteriche XL-1 blu competenti in tubi da 15 ml e
aggiungere l'intero volume (20 μl) di ligato.
2. Incubare 30 min in ghiaccio ed effettuare lo shock termico a 42°C per 50 sec per
facilitare l'apertura di pori nella parete cellulare attraverso i quali, il vettore
adsorbito alla parete cellulare possa entrare in cellula.
3. Trasferire immediatamente in ghiaccio per 2 min per favorire la ri-chiusura dei
pori.
4. Aggiungere 900 μl di terreno Luria-Bertani (LB) ed incubare a 37°C per 1 h in
μl=ng/µl
bp
bpng
=STIM2μl 0,7113,1
34818
30050
μl=ng/µl
bp
bpng
=STIM2μl 0,7113,1
34818
30050
14
agitazione a 200 rpm per consentire l’espressione dei geni necessari alla
selezione (in particolare Ampr ovvero resistenza all'ampicillina).
5. Dividere ciascun campione in due aliquote (1/10 e 9/10) e piastrare su un terreno
solido di LB/agar contenente ampicillina (che serve a permettere la crescita
selettiva di quei batteri che hanno inglobato il vettore chiuso).
6. Incubare le piastre a 37°C O.N. per permettere la crescita delle colonie
ricombinanti.
3.1.4 Estrazione del DNA plasmidico
Le colonie batteriche isolate, inoculate e fatte crescere o.n. a 37°C a 200 rpm in LB
(addizionato di ampicillina) sono sottoposte a protocollo di estrazione del DNA
plasmidico ricombinante, utilizzando il kit “Wizard® Plus SV Minipreps DNA
Purification System” della Promega. Il protocollo applicato prevede:
1. Trasferire la coltura batterica in eppendorf da 1,5 ml.
2. Centrifugare a 10000g per 5 min ed eliminare il sovranatante.
3. Aggiungere 250 μl di Cell Resuspension Solution e miscelare al vortex per
risospendere il pellet.
4. Aggiungere 250 μl di Cell Lysis Buffer, invertire 10 volte, per miscelare la
soluzione, e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
5. Aggiugere 10 μl di Alkaline Protease Solution, invertire 4 volte e incubare per 5
min a temperatura ambiente.
6. Aggiungere 350 μl di Neutralization Solution e invertire 4 volte; centrifugare a
14000g per 10 min.
7. Inserire la colonnina con il filtro nel Collection Tube e trasferire il sovranatante;
centrifugare a velocità massima per 1 min ed eliminare l’eluato.
8. Aggiungere 750 μl di Column Wash Solution (complementata con EtOH al 95%).
9. Centrifugare a velocità massima per 1 min ed eliminare l’eluato.
15
10. Ripetere il lavaggio usando 250 μl di Column Wash Solution e centrifugare a
velocità massima per 2 min.
11. Trasferire la colonnina in una eppendorf da 1,5 ml e aggiungere 50 μl di Nuclease
Free Water direttamente al centro della colonnina.
12. Centrifugare a velocità massima per 1 min.
13. Rimuovere la colonnina e dosare il DNA eluito.
I cloni sono stati poi sottoposti a sequenziamento automatico, per controllare la
sequenza del frammento clonato e verificare che non siano state introdotte mutazioni
che potrebbero alterare l’attività della sequenza clonata.
3.2 Saggi di luciferasi
3.2.1 Colture cellulari
Per i nostri saggi reporter sono state utilizzate cellule di carcinoma polmonare H1299
(prive di p53) cresciute in terreno di coltura D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium) complementato con siero fetale bovino (10%), penicillina/streptomicina
(100 U/ml), L-glutammina (2 mM).
L'incubazione è avvenuta a 37°C in presenza del 5% di CO2.
3.2.2 Piastramento della linea cellulare H1299 (p53 -/-)
Circa 24h prima della trasfezione, sono piastrate circa 1.8 * 105 cellule in 2 ml di
terreno D-MEM complementato per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
Il protocollo utilizzato per recuperare le cellule dalle flasca è il seguente:
1. Eliminare il terreno dalla flasca.
2. Lavare 2 volte con PBS freddo.
3. Aggiungere 2 ml di tripsina e farla agire per qulche minuto in modo da
favorire il distacco delle cellule.
4. Aggiungere 4 ml di terreno complementato con siero che inibisce la tripsina.
5. Raccogliere il contenuto della flasca in un tubo falcon e centrifugare a 1200
16
rpm per 5 minuti al fine di pellettare le cellule.
6. Risospendere il pellet di cellule nel volume adeguato al numero di cellule
necessarie per ogni pozzetto.
Le piastre sono incubate a 37°C in un incubatore al 5% di CO2.
3.2.3 Trasfezione della linea cellulare H1299
Le cellule H1299 sono state trasfettate, al 70-80% di confluenza, utilizzando il
seguente protocollo:
1. Preparare una serie di provette pari al numero di trasfezioni da effettuare e in
ciascuna di queste aggiungere 50 µl di terreno D-MEM non complementato e
2 μl, per ogni μg di DNA da trasfettare, di Mirus TransIT-LT1 Transfection
Reagent (reagente a base lipidica in grado di complessare il DNA e mediarne
l’ingresso nelle cellule),
2. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
3. Preparare un’altra serie di provette in cui aggiungere 50 µl di terreno D-MEM
non complementato e i DNA plasmidici ricombinanti, secondo il seguente
schema:
4. Al termine dell’incubazione, aggiungere la miscela D-MEM/Mirus a quella
contenente i vettori plasmidici ricombinanti e miscelare delicatamente.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Vettore pGL3
pCDNA3 150 ng - - - - - - - - - - - - - - -
p53wt - 150 ng - - - - - - - - - - - - - -
ΔNp53wt - - 150 ng - - - - - - - - - - - - -
p53H175 - - - 150 ng - - - - - - - - - - - -
p73α - - - - 150 ng - - - - - - - - - - -
p73αV156A - - - - - 150 ng - - - - - - - - - -
p73β - - - - - - 150 ng - - - - - - - - -
ΔNp73α - - - - - - - 150 ng - - - - - - - -
TAp63α - - - - - - - - 150 ng - - - - - - -
TAp63αR279Q - - - - - - - - - 150 ng - - - - - -
ΔNp63α - - - - - - - - - - 150 ng - - - - -
ΔNp63αR279Q - - - - - - - - - - - 150 ng - - - -
TAp63β - - - - - - - - - - - - 150 ng - - -
ΔNp63β - - - - - - - - - - - - - 150 ng - -
TAp63γ - - - - - - - - - - - - - - 150 ng -
ΔNp63γ - - - - - - - - - - - - - - - 150 ng
1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg
17
5. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
6. Aggiungere la miscela di trasfezione ai corrispondenti pozzetti delle piastre.
7. Incubare a 37°C in un incubatore al 5% di CO2 per circa 40 ore prima di
effettuare il saggio reporter.
3.2.4 Saggio Reporter
Il saggio reporter prevede l’utilizzo di due vettori di espressione, uno di questi
contiene, per esempio, il cDNA codificante per un fattore di trascrizione, come nel
nostro caso uno dei membri della famiglia di p53, e l’altro contenente un cDNA
codificante per una proteina reporter (nel nostro caso la luciferasi-LUC di lucciola),
a monte del quale è stata clonata una determinata sequenza di cui si vuole valutare
la capacità di avere funzione di promotore e/o enhancer per il fattore di trascrizione
in esame. Questi vettori vengono introdotti in cellule ospiti all’interno delle quali
avviene contemporaneamente la loro espressione, e successivamente si misura
l’attività della proteina reporter (LUC). Se l’espressione della luciferasi del vettore
reporter ricombinante risulta maggiore, rispetto a un controllo negativo, quando
viene over-espresso uno dei fattori di trascrizione, vuol dire che la sequenza clonata
nel vettore reporter funziona da promotore e/o da enhancer; se i livelli di
espressione diminuiscono, allora la sequenza funziona da silencer.
L’attività della LUC dipende anche dall’efficienza di trasfezione e/o dalla vitalità
cellulare, ma anche da fonti di variabilità più comuni come differenze nei volumi
pipettati, nell'efficienza di lisi e del saggio stesso. Per normalizzare eventuali
differenze dovute a questi fattori esterni, un terzo vettore, contenente il gene per la
luciferasi di renilla (pRL SV40), che viene espressa in maniera costitutiva, viene
cotrasfettato insieme agli altri due vettori fungendo da calibratore.
Sebbene questa proteina abbia un'intensità luminosa minore, rispetto alla luciferasi di
lucciola, le due attività possono essere misurate parallelamente andando però ad
18
inattivare prima LUC.
Le differenti origini evolutive di queste due luciferasi sono alla base delle differenze
di struttura e attività enzimatica, che permettono di discriminare selettivamente le
loro reazioni bioluminescenti.
Per effettuare il saggio, è stato utilizzato il kit Dual-Luciferase Assay System della
Promega e il protocollo utilizzato è il seguente:
A circa 40 ore dalla trasfezione, lavare le cellule con 2 ml di PBS freddo
per due volte.
Aggiungere in ciascun pozzetto 1 ml di PLB (Passive Lysis Buffer 5X) ed
incubare per 20' a temperatura ambiente per lisare le cellule.
Raccogliere i lisati in eppendorf da 1,5 ml e metterli subito in ghiaccio
per evitare la degradazione ad opera delle endopeptidasi cellulari.
Aggiungere 47 μl di LAR II (Luciferase Assay Reagent, contenente il
substrato e i cofattori necessari per la reazione catalizzata dalla LUC)
nelle cuvette per il luminometro.
Trasferire 5 μl di lisato cellulare nel tubo contenente la LAR II e
miscelare con cura pipettando 2 o 3 volte.
Inserire la cuvetta nel luminometro e condurre la prima misura.
Aggiungere 47 μl di Stop & Glo® Reagent
(il quale possiede i
componenti necessari per la reazione catalizzata dalla REN e permette un
rapido smorzamento del segnale di LUC, il quale altrimenti interferirebbe
con la seconda misurazione).
Miscelare ed effettuare la seconda misurazione.
19
4. RISULTATI E CONCLUSIONI
Per verificare se l'espressione dei geni STIM1 e STIM2 è regolata dai membri della
famiglia genica di p53, le due p53REs identificate mediante analisi in silico più
vicine al sito di inizio della trascrizione di STIM1 e l'unica p53RE presente in
STIM2 sono state amplificate e clonate nei vettori reporter pGL3 Basic e pGL3
Promoter.
Quindi i cDNA di p53, ΔNp53, p73α, p73β, ΔNp73α, TAp63α, TAp63β, ΔNp63α
ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ clonati nel vettore di espressione pcDNA3, sono stati
cotrasfettati insieme ai vettori reporter ricombinanti, in cellule di carcinoma
polmonare H1299 (p53 null).
La linea cellulare è stata inoltre co-trasfettata con un plasmide di espressione vuoto
(pcDNA3), che funge da controllo negativo: queste cellule non produrranno il fattore
di trascrizione in esame e pertanto si monitorerà una minore attività del gene reporter
(fornisce il livello basale di trascrizione della LUC) confermando la specificità della
reazione e che la sequenza clonata nel vettore reporter funziona da promotore o da
enhancer.
Sono stati condotti tre esperimenti indipendenti dei quali si è calcolata la deviazione
standard.
I risultati degli esperimenti effettuati dimostrano che p53 è poco implicato
nell'attivazione trascrizionale dei p53REs sia di STIM1 che di STIM2 in entrambi i
tipi di vettore (Figure 4, 5, 6).
Al contrario, l'isoforma TA p73α e le isoforme ΔN di p73α, p63α e p63β sono in
grado di transattivare in maniera significativa tutti i p53RE analizzati, aumentando di
molto i livelli della trascrizione rispetto al vettore vuoto.
In particolare, per quanto riguarda STIM2 le isoforme ΔN di p73α, p63α e β attivano
20
fortemente la trascrizione dalle dieci alle venti volte più del controllo (Figura 4a).
Figura 4: a) Istogramma relativo all'attività del vettore vuoto (pCDNA3), p53wt, ΔNp53wt, p73α
p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla p53RE di STIM2 nel
vettore pGL3 Basic. b) Istogramma relativo all'attività delle isoforme mutate di p53, p73α, TAp63α,
ΔNp63α sulla p53RE di STIM2 nel vettore pGL3 Basic.
Le due p53REs presenti in STIM1 sono suscettibili a una attivazione trascrizionale
da parte delle stesse isoforme sebbene con diversa efficienza (Figura 5a e Figura 6a).
Figura 5: a) Istogramma relativo all'attività del vettore vuoto (pCDNA3), p53wt, ΔNp53wt, p73α
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22pC
DN
A3
p53w
t
ΔN
p53w
t
p73α
p73β
ΔN
p73α
TA
p63α
ΔN
p63α
TA
p63β
ΔN
p63β
TA
p63γ
ΔN
p63γ
fold
a
pGL3 Basic STIM 2
isoforme wt
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
pC
DN
A3
p53H
175
p73αV
156A
TA
p63αR
279Q
ΔN
p63αR
279Q
fold
b
pGL3 Basic STIM 2
isoforme mutate
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
pC
DN
A3
p53w
t
ΔN
p53w
t
p73α
p73β
ΔN
p73α
TA
p63α
ΔN
p63α
TA
p63β
ΔN
p63β
TA
p63γ
ΔN
p63γ
fold
a
pGL3 Basic STIM 1.1
isoforme wt
0
2
4
6
8
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12
14
16
18
20
22
pC
DN
A3
p53H
175
p73αV
156A
TA
p63αR
279Q
ΔN
p63αR
279Q
fold
b
pGL3 Basic STIM 1.1
isoforme mutate
21
p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla prima p53RE di STIM1
nel vettore pGL3 Basic. b) Istogramma relativo all'attività delle isoforme mutate di p53, p73α,
TAp63α, ΔNp63α sulla prima p53RE di STIM1 nel vettore pGL3 Basic.
Figura 6: a) Istogramma relativo all'attività del vettore vuoto (pCDNA3), p53wt, ΔNp53wt, p73α
p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla seconda p53RE di
STIM1 nel vettore pGL3 Basic. b) Istogramma relativo all'attività delle isoforme mutate di p53, p73α,
TAp63α, ΔNp63α sulla seconda p53RE di STIM1 nel vettore pGL3 Basic.
Risultati simili li abbiamo ottenuti anche negli esperimenti reporter in cui sono state
utilizzate le p53REs di STIM1 e STIM2 clonate nel vettore pGL3 Promoter (dati non
mostrati in questa tesi).
Al fine di valutare la specificità di legame di p53, p63 e p73 a questi responsive
elements, abbiamo anche co-trasfettato con vettori di espressione contenenti i cDNA
di alcune isoforme di p53, p63 e p73 mutate nella regione di binding e come si può
osservare nelle Figure 4b, 5b, 6b queste non hanno transattivato il gene reporter.
In conclusione, dai risultati ottenuti, è evidente come p53 sembra non essere
implicato nell'attivazione trascrizionale delle proteine STIM e come, viceversa, p63 e
p73, pur con diversa efficienza, siano in grado di attivarne la trascrizione. Questo
conferma sempre più come i diversi membri della famiglia genica di p53 abbiano
0
2
4
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pC
DN
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p53H
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156A
TA
p63αR
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ΔN
p63αR
279Q
fold
b
pGL3 Basic STIM 1.2
isoforme mutate
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DN
A3
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ΔN
p53w
t
p73α
p73β
ΔN
p73α
TA
p63α
ΔN
p63α
TA
p63β
ΔN
p63β
TA
p63γ
ΔN
p63γ
fold
a
pGL3 Basic STIM 1.2
isoforme wt
22
target differenti.
I saggi di luciferasi sono solo il primo passo per dimostrare la modulazione
dell’espressione di geni da parte di fattori di trascrizione: certamente, a questo tipo di
esperimenti vanno aggiunti esperimenti in grado di misurare i livelli endogeni di
STIM1 e STIM2, in relazione alle proteine della famiglia genica di p53.
Pertanto, in prospettiva futura si andrà a valutare, mediante esperimenti di Real-
Time PCR, in quali condizioni fisio-patologiche l’espressione di STIM1 e STIM2
possa essere modulata e capire il reale coinvolgimento dei membri della famiglia
genica di p53 nella regolazione dell'espressione di questi geni.
Inoltre si andranno a valutare i livelli proteici di STIM1 e STIM2 in seguito a over-
espressione dei membri della famiglia genica di p53 per rivelare eventuali
meccanismi regolatori traduzionali o post-traduzionali.
23
5. BIBLIOGRAFIA
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