synthetische biologie und nanosysteme * ausgewählte beispiele * vorlesungsreihe "biophysik der...

Synthetische Biologie und Nanosysteme

* ausgewählte Beispiele *

Vorlesungsreihe "Biophysik der Systeme"2008-02-06

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Ausrichtung der Forschung

SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese

Mikrofluidik

Fortschritte in

VerständVerständnisnis

AnwenduAnwendungng

Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle

Transkriptionsbasierte

Schalter und Oszillatoren

de novo Design biologischer Systeme

induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus

selbstorganisierte Strukturen

DNA/RNA als Template

gerichtete EvolutionProtein Engineering

Erweiterung des genetischen Codes

nicht-natürliche Aminosäurenlogische biochemische Netzwerke

molekulare Biocomputer

Metabolic Pathway Engineering

Synthese/Abbau chemischer Substanzen

DNA Maschinen

Ausrichtung der Forschung

SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese

Mikrofluidik

Fortschritte in

VerständVerständnisnis

AnwenduAnwendungng

Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle

Transkriptionsbasierte

Schalter und Oszillatoren

de novo Design biologischer Systeme

induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus

selbstorganisierte Strukturen

DNA/RNA als Template

gerichtete EvolutionProtein Engineering


nicht-natürliche Aminosäurenlogische biochemische Netzwerke

molekulare Biocomputer

Metabolic Pathway Engineering

Synthese/Abbau chemischer Substanzen

Seminar 12.12.07

DNA Maschinen

Beispiel 1:

Chemotaxis in E. coli

bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor

Umdesign Signalweg

Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)

CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY:ermöglicht Rotation gegen UZS Mobilität

WT

CheZ

geradlinigeFortbewegung

Taumeln


Riboswitches kontrollieren die Genexpression abhängig von Liganden


CheZ kombiniert mit Riboswitch: Mobilität abhängig von Ligandenkonzentration


konzentrationsabhängige Mobilität Migration entlang Gradienten zu höherer Konzentration ("Pseudotaxis")

Beispiel 2:

Lichtgesteuerte Expression in E. coli

bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor

Neudesign Rezeptor


Phytochrom: Chimäre aus 2 Modulen- extrazellulärer Photorezeptor (Cph1 aus Cyano-Bakterium Synechocystis)- intrazellulärer Regulator (EnvZ aus E. coli, zuständig für osmotische Regulation)

Transformation in EnvZ E. colifür die Synthese von PCB in E. coli:ho1 und pcyA Gene aus Synechocystis

EnvZ

Cph1

on off

Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)


SelektionChimäre Cph8 mit hohem hell-dunkel "Kontrast"

+EnvZ

Belichtungszeit: 4h bei 37°C



räumliche Kontrolle der Genexpression Auflösung: 108 Bakterien (Pixel) pro square inch


Beispiel 3:

Gerichtete Evolution

bestehendes Protein

veränderte Funktionalität

Mutation Selektionsdruck

verbesserte VarianteAusgangsprotein


Erzeugung der Bibliothek (107-1010) - Mutagenese einer Oligonukleotid-Kassette- fehleranfällige PCRUmklonierung in Plasmid und Transformation z.B. in E. coli Genpool

Kopplung von Phenotyp und Genotyp- Affinität: Phage display oder Yeast cell display - Funktionalität: E. coli, in vitro Kompartimentisierung

Selektion und Screening- Affinität: über Antigen- Funktionalität: FACS (fluorescent activated cell sorting)

Antigen


in vitro Kompartimentisierung: Wasser-in-Öl-(in-Wasser) Emulsionen

kleine Reaktionsvolumina: hohe Konzentration, schnelle Kinetik

1010 pro ml: hoher Durchsatz

Selektionsdruck frei wählbar

kompatibel mit Mikrofluidik, FACS: 107 pro h

Mastrobattista et al., Chem. Biol. 12: 1291 (2005)

Gerichtete Evolution: Anwendungen

typischerweise 6-12 Runden

Biokatalysatoren

- veränderte Substratspezifität- veränderte/verbesserte Enantioselektivität- erhöhte Aktivität (50x) in unnatürlichem Reaktionsmilieu- erhöhte Thermostabilität (+15°C)

Antikörper

- Affinitätssteigerung 10-100x- Affinität für neues Antigen: 100-1000x schlechter als in der Natur

Beispiel 4:


Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine


Standard-Code

stellenspezifisch,cotranslational

anstatt dernatürlichen AS

Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren

Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)

Anforderungen:- orthogonales tRNA-Codon Paar- orthogonale aminoacyl-tRNA-Synthetase- nnAS im Cytosol



amber stop codon (UAG) supression- orthogonales tyrosyl-tRNA/tyrosyl-RS Paar aus Methanococcus janaschii- gerichtete Evolution der tRNA in E. coli mit negativ/positiv-Selektion- gerichtete Evolution der Substratspezifität der RS



Fluorescein

?

Beispiel 5:

DNA Computing

Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen

mithilfe von DNA Sequenzen

DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)

Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph

Existiert ein Weg von 0 nach 6, der alle Knoten genau einmal durchläuft?


Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph

Algorithmus

1. Generation zufälliger Wege

2. Auswahl Pfade von 0 nach n

3. Auswahl Pfade mit n Knoten

4. Auswahl Pfade, die alle Knoten durchlaufen

5. "wahr" / "falsch"


Knoten und Kanten20mer DNA

Algorithmus

1. Ligation

2. PCR mit Primer O0 und O6

3. Agarose-Gel: Bande mit 140bp

4. Affinitätsselektion von ssDNA mit O1,…,O5

5. Probe: PCR mit O0 / O1, O0 / O2,…, O0 / O6

2

1

3

Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)

boolsche Logik"0": niedrige Konzentration"1": hohe Konzentration

in out

AND

Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)

Logische biochemische NetzwerkeZhang et al., Science 318: 1121 (2007)

Signalverstärkung- kinetisch inhibiert (Zeitskala Experiment)- Katalysator (Input) beschleunigt Reaktion um 104 - Entropie-getrieben

Beispiel 6:

DNA Maschinen

Spielerei?

DNA Maschinen

DNA-Läufer entlang DNA-Schiene

Unidirektionalität durch

Zerstörung der SchieneZugabe der Treibstoffsträngein definierter Reihenfolge

Restriktionsenzym

Passivierung der Schienedurch Treibstoffstränge

Treibstoff

Treibstoff

Abfall

Yin et al., Nature 451: 318 (2008)Bath & Turberfield, Nat. Nanotech. 2: 275 (2007)

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