szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe
DESCRIPTION
Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe. Charakterystyka szczepionek Ściśle zdefiniowany skład Bezpieczeństwo produkcji - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe
Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka szczepionekCharakterystyka szczepionek
Ściśle zdefiniowany składŚciśle zdefiniowany skład Bezpieczeństwo produkcjiBezpieczeństwo produkcji• wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych
w celu izolacji antygenów szczepionkowychw celu izolacji antygenów szczepionkowych• mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o
statusie GRAS (statusie GRAS (Generally Recognized as Safe)Generally Recognized as Safe) Bezpieczeństwo stosowaniaBezpieczeństwo stosowania• brak możliwości wywołania chorobybrak możliwości wywołania choroby• niska odczynowośćniska odczynowość Wymagają stosowania adiuwantówWymagają stosowania adiuwantów Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcjiKoszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcji
Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych BakterieBakterie• dobrze scharakteryzowanedobrze scharakteryzowane• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznychłatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych• wydajne systemy ekspresyjnewydajne systemy ekspresyjne• brak modyfikacji posttranslacyjnychbrak modyfikacji posttranslacyjnych• możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał
inkluzyjnychinkluzyjnych• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny
ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, zwiększające immunogenność zwiększające immunogenność
Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych DrożdżeDrożdże• dobrze scharakteryzowanedobrze scharakteryzowane• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznychłatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych• wydajne systemy ekspresyjnewydajne systemy ekspresyjne• trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z
genomem gospodarza genomem gospodarza • modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych, modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych,
glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny
ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność
Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Komórki owadzieKomórki owadzie• systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusiesystemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusie• modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach
ssaczych ssaczych • wrażliwe na zakażenia wirusowewrażliwe na zakażenia wirusowe
Komórki ssaczeKomórki ssacze• modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie
kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych • droga hodowladroga hodowla• stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania
Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Rośliny transgeniczneRośliny transgeniczne• manipulacje genetyczne trudne do przeprowadzeniamanipulacje genetyczne trudne do przeprowadzenia• tania produkcja tania produkcja • modyfikacje posttranslacyjnemodyfikacje posttranslacyjne• szczepienie drogą pokarmowąszczepienie drogą pokarmową• wywołanie odporności błon śluzowych wywołanie odporności błon śluzowych
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Czynnik etiologiczny – wirus HBV Czynnik etiologiczny – wirus HBV Rodzina: Rodzina: HepadnaviridaeHepadnaviridae Rodzaj: Rodzaj: OrthohepadnavirusOrthohepadnavirus Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd
otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. 42 nm42 nm
Kwas nukleinowy: DNAKwas nukleinowy: DNA Replikacja: hepatocytyReplikacja: hepatocyty Rezerwuar: człowiek Rezerwuar: człowiek
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Droga przenoszenia: krew i płyny Droga przenoszenia: krew i płyny ustrojowe, w tym wydzielina szyjki ustrojowe, w tym wydzielina szyjki macicy, nasieniemacicy, nasienie
Wysoka zakaźność – nawet 0,1 Wysoka zakaźność – nawet 0,1 μμl l krwi może spowodować zakażeniekrwi może spowodować zakażenie
Hodowla w warunkach Hodowla w warunkach laboratoryjnych – nie zakaża laboratoryjnych – nie zakaża zarodków kurzych i powszechnie zarodków kurzych i powszechnie stosowanych linii komórkowych stosowanych linii komórkowych
We krwi do 1010 wirusów/ml
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu BOstre wirusowe zapalenie wątroby typu B Okres wylęgania 2 – 3 miesiąceOkres wylęgania 2 – 3 miesiące Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączkaPoczątkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka ŻółtaczkaŻółtaczka
Wyzdrowienie (90%)
Nadostre zapalenie wątroby
(0,1%)
Zgon
Przewlekłe zakażenie (10%)
Antygenemia
brak uszkodzenia wątroby
Przetrwałe zapalenie wątroby
niewielkie uszkodzenie wątroby
Aktywne zapalenie wątroby
Marskość wątroby
Pierwotny rak wątroby
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Wirusowe zapalenie wątroby typu B Wirusowe zapalenie wątroby typu B zakażenie okołoporodowezakażenie okołoporodowe
Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw BDzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B zakażenie z ostrymi objawami chorobyzakażenie z ostrymi objawami choroby
Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw BDzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B zakażenie bez ostrych objawów chorobyzakażenie bez ostrych objawów choroby nosicielstwo HBVnosicielstwo HBV śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15% śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15%
dziewczynek)dziewczynek)
Na świecie 200 mln nosicieli HBV
z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Antygeny wirusa HBVAntygeny wirusa HBV HBcAg – białko rdzeniaHBcAg – białko rdzenia HBeAg – białko rdzeniaHBeAg – białko rdzenia HBsAg – białko powierzchnioweHBsAg – białko powierzchniowe • tworzy zewnętrzną osłonkę wirusatworzy zewnętrzną osłonkę wirusa• nadmiar białka obecny we krwi w postaci nadmiar białka obecny we krwi w postaci
kulistych lub pałeczkowatych agregatówkulistych lub pałeczkowatych agregatów
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3 polipeptydy
preS1
preS2
S
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Odpowiedź immunologiczna na Odpowiedź immunologiczna na zakażenie HBVzakażenie HBV
Odpowiedź humoralnaOdpowiedź humoralna• przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S)przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S)• przeciwciała anty-HBcAgprzeciwciała anty-HBcAg• przeciwciała anty-HBeAgprzeciwciała anty-HBeAg
Odpowiedź komórkowaOdpowiedź komórkowa• limfocyty Tc limfocyty Tc
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki I generacji Szczepionki I generacji (plazmatyczne)(plazmatyczne)
Substancja czynna – białkowy Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAgantygen powierzchniowy HBsAg
• białko Sbiałko S• śladowe ilości białka preS1śladowe ilości białka preS1• śladowe ilości białka preS2 śladowe ilości białka preS2 Sposób otrzymywania – izolacja ciał Sposób otrzymywania – izolacja ciał
kulistych i pałeczkowatych z krwi kulistych i pałeczkowatych z krwi bezobjawowych nosicieli HBV, bezobjawowych nosicieli HBV, inaktywacja formaldehydeminaktywacja formaldehydem
Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji patogenów przenoszonych przez patogenów przenoszonych przez krewkrew
Nie są stosowane w Polsce
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji Szczepionki II generacji (rekombinowane)(rekombinowane)
Pierwsza szczepionka Pierwsza szczepionka zarejestrowana w 1986 r.zarejestrowana w 1986 r.
Substancja czynna – białkowy antygen Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAgpowierzchniowy HBsAg
• białko Sbiałko S Sposób otrzymywania – produkcja białka Sposób otrzymywania – produkcja białka
S w komórkach drożdży S w komórkach drożdży S. cerevisiaeS. cerevisiae
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji Szczepionki II generacji (rekombinowane)(rekombinowane)
Pierwszy układ ekspresyjny Pierwszy układ ekspresyjny opublikowany w 1982 r. opublikowany w 1982 r. (P. Valenzuela, A. Medina, W.J. (P. Valenzuela, A. Medina, W.J. Rutter, Nature, 289, 347 – 350)Rutter, Nature, 289, 347 – 350)
wektor ekspresyjny – pHBS-16wektor ekspresyjny – pHBS-16• autonomiczna replikacjaautonomiczna replikacja • ori ori replikacji pBR322replikacji pBR322• gen oporności na ampicylinęgen oporności na ampicylinę• ori ori replikacji plamidu 2replikacji plamidu 2μμ• gen gen trptrp11• sekwencja kodująca białko S pod sekwencja kodująca białko S pod
kontrolą promotora ADH I kontrolą promotora ADH I dehydrogenazy alkoholowej I dehydrogenazy alkoholowej I
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji Szczepionki II generacji (rekombinowane)(rekombinowane)
gospodarz – gospodarz – S. cerevisiae S. cerevisiae XV610-8C XV610-8C • szczep auksotroficzny – brak zdolności do szczep auksotroficzny – brak zdolności do
wzrostu na podłożu nie zawierającym wzrostu na podłożu nie zawierającym tryptofanu tryptofanu
białko S produkowane w postaci białko S produkowane w postaci kulistych agregatówkulistych agregatów
(agregaty 1000x bardziej immunogenne (agregaty 1000x bardziej immunogenne niż pojedyncze cząsteczki białka S)niż pojedyncze cząsteczki białka S)
2 – 5 2 – 5 μμg białka z 200 ml hodowlig białka z 200 ml hodowli
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane) Adiuwant – wodorotlenek glinuAdiuwant – wodorotlenek glinu Postać szczepionki – płynnaPostać szczepionki – płynna Temperatura przechowywania – 2-8Temperatura przechowywania – 2-8°°CC Sposób podawania – domięśniowoSposób podawania – domięśniowo Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach
od pierwszego szczepienia)od pierwszego szczepienia) Skuteczność szczepionki Skuteczność szczepionki • u 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkachu 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkach• u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniemu 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem• 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed
zakażeniemzakażeniem• 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed
zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzeniazakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia• indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej
Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał w cyklu szczepień przeciwko WZW typu Bw cyklu szczepień przeciwko WZW typu B
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane) Bezpieczeństwo szczepionki – wysokieBezpieczeństwo szczepionki – wysokie• może być stosowana u kobiet ciężarnychmoże być stosowana u kobiet ciężarnych• matek karmiących piersiąmatek karmiących piersią• osób z niedoborami odporności osób z niedoborami odporności Niepożądane odczyny poszczepienneNiepożądane odczyny poszczepienne• łagodne miejscowe odczyny poszczepiennełagodne miejscowe odczyny poszczepienne• rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych, rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych,
wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony układu nerwowegoukładu nerwowego
Przeciwwskazania do szczepieńPrzeciwwskazania do szczepień• nadwrażliwość na składniki szczepionkinadwrażliwość na składniki szczepionki• ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane) Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynno-Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynno-
bierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą bierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą dawką szczepionki)dawką szczepionki)
Dostępne w postaci szczepionek monowalentnychDostępne w postaci szczepionek monowalentnych• Engerix B, GlaxoSmithKlineEngerix B, GlaxoSmithKline • H-B-VAX, Merck Sharp DohmeH-B-VAX, Merck Sharp Dohme Dostępne w postaci szczepionek skojarzonychDostępne w postaci szczepionek skojarzonych• Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B)Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B)• Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B)Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B)• Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane)
Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Hansenula polymorpha Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea)(Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea)
Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Pichia Pichia pastoris pastoris
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B
Szczepionki III generacji Szczepionki III generacji (rekombinowane)(rekombinowane)
Białka S i preS2 produkowane w Białka S i preS2 produkowane w linii komórkowej CHO (Chinese linii komórkowej CHO (Chinese Hamster Ovary cells), Hamster Ovary cells), Heprecombe, Swiss Serum and Heprecombe, Swiss Serum and Vaccine Institute Vaccine Institute
Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
Niski poziom produkcji i Niski poziom produkcji i sekrecji białeksekrecji białek
Niestabilność plazmidów Niestabilność plazmidów rekombinantowychrekombinantowych
Hiperglikozylacja białekHiperglikozylacja białek Wąski zakres Wąski zakres
metabolizowanych źródeł metabolizowanych źródeł węglawęgla
Pichia pastoris Pichia pastoris ii Hansenula polymorpha Hansenula polymorpha-- podstawowa charakterystyka biochemicznapodstawowa charakterystyka biochemiczna
P. pastorisP. pastoris H. polymorphaH. polymorpha
Źródła węgla Źródła węgla
i energiii energii
glukoza glukoza
glicerol glicerol
metanolmetanol
glukozaglukoza
glicerolglicerol
metanolmetanol
Źródła azotuŹródła azotu jony amonowejony amonowe jony amonowejony amonowe
sole kwasu sole kwasu azotowego (V)azotowego (V)
Optymalna Optymalna temperatura temperatura
wzrostuwzrostu
30 30 °°CC 37-43 37-43 °°CC
Metabolizm metanoluMetabolizm metanolu
1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa, 5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu
Drożdżowe systemy ekspresyjneDrożdżowe systemy ekspresyjne
Szczepy gospodarzy Szczepy gospodarzy ekspresyjnychekspresyjnych
Wektory ekspresyjneWektory ekspresyjne• bakteryjne bakteryjne ori ori replikacjireplikacji• bakteryjny marker selekcyjnybakteryjny marker selekcyjny• sekwencja umożliwiająca sekwencja umożliwiająca
utrzymanie się wektora w utrzymanie się wektora w komórce drożdży komórce drożdży
• drożdżowy marker selekcyjnydrożdżowy marker selekcyjny• drożdżowy promotor i drożdżowy promotor i
terminator transkrypcji terminator transkrypcji
Drożdżowy wektor
ekspresyjny
PTEF1
AmpR
URA3
PHO5t
25S rDNA
ColE1 ori
Szczepy ekspresyjne Szczepy ekspresyjne Pichia pastorisPichia pastoris
SzczepSzczep FenotypFenotyp UwagiUwagi
X-33, Y-11430X-33, Y-11430 szczep dzikiszczep dziki Selekcja antybiotykowaSelekcja antybiotykowa
GS115GS115 HisHis--, Mut, Mut++ Selekcja na podłożu bez histydyny; Selekcja na podłożu bez histydyny; szybki metabolizm metanoluszybki metabolizm metanolu
KM71KM71 HisHis--, Mut, Mutss Selekcja na podłożu bez histydyny; Selekcja na podłożu bez histydyny; wolny metabolizm metanoluwolny metabolizm metanolu
SMD1168SMD1168 HisHis--, Pep4, Pep4--, Mut, Mut++ Selekcja na podłożu bez histydyny; Selekcja na podłożu bez histydyny; brak aktywności proteazy A; szybki brak aktywności proteazy A; szybki
metabolizm metanolumetabolizm metanolu
JC300JC300 AdeAde--, Arg, Arg--, His, His-- Selekcja na podłożu bez adeniny, Selekcja na podłożu bez adeniny, argininy i histydynyargininy i histydyny
JC308JC308 AdeAde--, Arg, Arg--, His, His--, , UraUra--
Selekcja na podłożu bez adeniny, Selekcja na podłożu bez adeniny, uracylu, histydyny i argininyuracylu, histydyny i argininy
Szczepy ekspresyjne Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorphaHansenula polymorpha
SzczepSzczep FenotypFenotyp UwagiUwagi
DL-1, DL-1, NCYC495, NCYC495, CBS4732CBS4732
szczep dzikiszczep dziki Selekcja antybiotykowaSelekcja antybiotykowa
DL10DL10 LeuLeu--, Ura, Ura-- Selekcja na podłożu bez leucyny i Selekcja na podłożu bez leucyny i uracyluuracylu
uDLB11uDLB11 LeuLeu--, Ura, Ura--, Pep4, Pep4-- Selekcja na podłożu bez leucyny i Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności proteazy A uracylu; brak aktywności proteazy A
L1L1 LeuLeu-- Selekcja na podłożu bez leucynySelekcja na podłożu bez leucyny
A11A11 AdeAde-- Selekcja na podłożu bez adeninySelekcja na podłożu bez adeniny
LR9LR9 UraUra-- Selekcja na podłożu bez uracyluSelekcja na podłożu bez uracylu
Promotory transkrypcji Promotory transkrypcji P. pastorisP. pastoris
Promotor Promotor UwagiUwagi
AOX1AOX1 (genu oksydazy (genu oksydazy alkoholowej)alkoholowej)
Indukowany metanolem; represja Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy i gliceroluw obecności glukozy i glicerolu
FLD1FLD1 (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy formaldehydowej)formaldehydowej)
Indukowany metanolem i Indukowany metanolem i metyloaminą; represja w metyloaminą; represja w
obecności glukozy i gliceroluobecności glukozy i glicerolu
PEX8 PEX8 (genu kodującego białko (genu kodującego białko tworzące matrix peroksysomów)tworzące matrix peroksysomów)
Słaba aktywność w obecności Słaba aktywność w obecności glukozy; wzrost aktywności w glukozy; wzrost aktywności w
obecności metanoluobecności metanolu
GAPGAP (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego)aldehydu 3-fosfoglicerynowego)
Konstytutywny, aktywny w Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i gliceroluobecności glukozy i glicerolu
YPT1 YPT1 (genu GTPazy niezbędnej w (genu GTPazy niezbędnej w sekrecji białek)sekrecji białek)
Konstytutywny, aktywny w Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i metanoluobecności glukozy i metanolu
Promotory transkrypcji Promotory transkrypcji H. polymorphaH. polymorpha
PromotorPromotor UwagiUwagi
MOXMOX (genu oksydazy (genu oksydazy metanolowej)metanolowej)
Indukowany metanolem; represja w Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności obecności glukozy; aktywny w obecności
gliceroluglicerolu
DHASDHAS (genu syntazy (genu syntazy dihydroksyacetonu)dihydroksyacetonu)
Indukowany metanolem; represja w Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności obecności glukozy; aktywny w obecności
gliceroluglicerolu
FMDFMD (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy mrówczanowej)mrówczanowej)
Indukowany metanolem; represja w Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności obecności glukozy; aktywny w obecności
gliceroluglicerolu
AMOAMO (genu oksydazy aminowej) (genu oksydazy aminowej) Indukowany metylo- i etyloaminą; represja Indukowany metylo- i etyloaminą; represja w obecności jonów amonowychw obecności jonów amonowych
YNT1YNT1, , YNI1YNI1, , YNR1YNR1 (genów (genów kodujących białka niezbędne w kodujących białka niezbędne w
metabolizmie azotanów)metabolizmie azotanów)
Indukowane solami kwasu azotowego (V), Indukowane solami kwasu azotowego (V), represja w obecności jonów amonowych represja w obecności jonów amonowych
GAPGAP (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego)aldehydu 3-fosfoglicerynowego)
KonstytutywnyKonstytutywny
PMA1 PMA1 (genu ATPazy błony (genu ATPazy błony cytoplazmatycznej)cytoplazmatycznej)
KonstytutywnyKonstytutywny
Drożdżowe markery selekcyjneDrożdżowe markery selekcyjne
P. pastorisP. pastoris geny oporności na antybiotykigeny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynęgen oporności na zeocynę
markery auksotroficznemarkery auksotroficzne• gengen HIS4 P. pastoris HIS4 P. pastoris lub lub S. cerevisiaeS. cerevisiae• gengen ARG4 S. cerevisiae ARG4 S. cerevisiae• gengen URA3 P. pastoris URA3 P. pastoris• gengen ADE1 P. pastoris ADE1 P. pastoris
Drożdżowe markery selekcyjneDrożdżowe markery selekcyjne
H. polymorphaH. polymorpha geny oporności na antybiotykigeny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynęgen oporności na zeocynę• gen oporności na fleomycynęgen oporności na fleomycynę
markery auksotroficznemarkery auksotroficzne• gengen LEU 1.1 H. polymorpha LEU 1.1 H. polymorpha• gengen URA3 H. polymorpha URA3 H. polymorpha• gengen ADE11 H. polymorpha ADE11 H. polymorpha• gengen LEU2 S. cerevisiae LEU2 S. cerevisiae• gengen URA3 S. cerevisiae URA3 S. cerevisiae• gen gen LEU2 C. albicans LEU2 C. albicans
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdżywektora ekspresyjnego w komórce drożdży
P. pastorisP. pastoris Sekwencje umożliwiające rekombinację Sekwencje umożliwiające rekombinację
homologiczną z genomem drożdżyhomologiczną z genomem drożdży• 5’ fragment promotora 5’ fragment promotora AOX1AOX1• 5’ fragment promotora 5’ fragment promotora GAPGAP• gen gen HIS4 P. pastorisHIS4 P. pastoris
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdżywektora ekspresyjnego w komórce drożdży
H. polymorphaH. polymorpha Sekwencje umożliwiające rekombinację Sekwencje umożliwiające rekombinację
homologiczną wektora z genomem drożdżyhomologiczną wektora z genomem drożdży• gen gen MOX H. polymorphaMOX H. polymorpha• gen AMO gen AMO H. polymorphaH. polymorpha • gen gen LEU2 S. cerevisiaeLEU2 S. cerevisiae• gen gen URA3 S. cerevisiaeURA3 S. cerevisiae
Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdżywektora w komórkach drożdży
• sekwencje ARS sekwencje ARS H. polymorphaH. polymorpha
Zewnątrzkomórkowa produkcja białekZewnątrzkomórkowa produkcja białek
Sekwencje sygnalne
obcego białka
α-faktora S. cerevisiae
kwaśnej fosfatazy
Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdżykomórki drożdży
Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w genów kodujących białka opiekuńcze obecne w
retikulum endoplazmatycznymretikulum endoplazmatycznym
Foldazy Foldazy • izomerazy disulfidoweizomerazy disulfidowe
Białka opiekuńczeBiałka opiekuńcze• kalneksynakalneksyna• kalretikulinakalretikulina
Kierowanie białek do peroksysomówKierowanie białek do peroksysomów
PeroksysomyPeroksysomy Zdolne do akumulacji dużej Zdolne do akumulacji dużej
ilości białekilości białek Nie zawierają enzymów Nie zawierają enzymów
modyfikujących białkamodyfikujących białka• fosfokinazfosfokinaz• glikozylazglikozylaz• proteazproteaz
Umożliwiają produkcję Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białekniezmodyfikowanych białek
Sekwencja kierująca do Sekwencja kierująca do peroksysomów peroksysomów
-Ser-Lys-Leu-COOH-Ser-Lys-Leu-COOH
peroksysomy
H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem
Szczepionki przeciwko wirusowi HPV Szczepionki przeciwko wirusowi HPV (wirusowi ludzkiego brodawczaka)(wirusowi ludzkiego brodawczaka)
Silgard (MSD)Silgard (MSD)
Substancja czynna – białko L1 Substancja czynna – białko L1 czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11)czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11)
Adiuwant – sole glinuAdiuwant – sole glinu
Cervarix (GlaxoSmithCline)Cervarix (GlaxoSmithCline)
Substancja czynna – białko L1 Substancja czynna – białko L1 dwóch typów HPV (16 i 18)dwóch typów HPV (16 i 18)
Adiuwant – sole glinu + MPL Adiuwant – sole glinu + MPL (monofosforylowany lipid A)(monofosforylowany lipid A)
Białko L1 produkowane w drożdżach S. cerevisiae