ĐẶt v Ấn ĐỀ...ph ươ ng th ị hà lu ận v ăn th ạc s ĩ khoa h ọc 1 ĐẶt v Ấn...
TRANSCRIPT
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con
người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có
khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và
có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư
gan [17,33,36]. Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut
viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới
[14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ
người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc
nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42].
HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử
dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình
tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân
virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của
HCV là qua đường máu. Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV,
Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có
vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng
số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan
C (HCV Genotypes) [1,37]. Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý,
mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43]. Hiện nay trên
thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở
Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50].
Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ
sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều
kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer,
Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes
HCV với độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên
chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
2
HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ
thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu
gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc
subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều
kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên
cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ
thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù
hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định
được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6. Với mục đích khuyến cáo
bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài:
“Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C
bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau :
1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử
dụng Taqman probe.
2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing)
trên đoạn gen NS5B.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân loại
Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền
máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu
phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt
tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton,
Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính
virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính
thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7].
Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus
ARN. Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu
chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV). Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9].
Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh
viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12].
1.1.2. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C
Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát
hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1).
Hình 1.1 Hình thái của HCV dưới kính hiển vi điện tử
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
4
Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein
và màng vỏ (Hình 1.2).
Kích thước khoảng 60nm
Hình 1.2. Cấu trúc của virut viêm gan C
1.1.3. Genome HCV
Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính
phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa
diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một
chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut
khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông
tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47].
Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng
Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:
- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để
tạo nuclecapsit.
- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.
- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70.
Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:
Màng vỏ ARN virus
Màng vỏ glycoprotein
Core
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
5
- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23).
- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72).
- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa
cho protein p27.
- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho
ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép.
Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading
frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino
axit (Hình 1.3). Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt
bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core,
E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B,
NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay
thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao
chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46].
Cấu trúc Không cấu trúc
Tổng hợp chuỗi polyprotein
Protein
Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase
Hình 1.3: Tổ chức genome HCV
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
6
Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là
E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã
hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B
(Hình 1.3). Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó
các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong
quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50].
ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’
và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan
đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các
vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV.
Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu:
+ Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử.
+ Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut.
+ Nghiên cứu kháng sinh chống HCV.
Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với
bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba
đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut
[ 21,52]. Các vùng (II-IV) thiết lập một tâm đầu vào của ribosome bên trong (IRES)
bao gồm ribosome liên kết và độc lập khởi động cho quá trình sao chép tương
ứng[7,52].
Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay
đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao
tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không
quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể
dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của
chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
7
30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép
ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào
[22,49]. Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba
stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các
vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình
tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng
mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35]. Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN
tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép
HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49]. Cuối cùng cả NCRs đều xuất hiện
để làm việc cùng với sự tương tác ARN-ARN theo chiều dài có thể sẽ hình thành
một vòng tuần hoàn gen tạm thời [46].
1.1.4. Gen và Protein
Như đã mô tả ở phần trên, quá trình chuyển hóa của chuỗi protein HCV là được
khởi động thông qua sự tương tác của một số phần trong NCRs của hệ genome
HCV ARN. Chuỗi protein là sản phẩm có chứa 10 protein sẽ đồng thời chuyển hóa
hoặc chuyển hóa bước đầu được kích hoạt từ chuỗi protein. Các protein đuôi N như
C, E1, E2 và p7 đều được kích hoạt bởi một tín hiệu peptit trong tế bào (SP)[15,20].
Lõi tiền protein được tạo ra vẫn có chứa tần số tín hiệu E1 tại đuôi C của nó. Tiếp
theo sẽ kích hoạt tần số tín hiệu này bằng một tín hiệu peptit là peptidase (SPP) dẫn
đến việc hình thành lõi protein hoàn chỉnh [15,20].
Các protein phi cấu trúc NS2 đến NS5B của chuỗi protein HCV là đều kích hoạt
bởi hai protease có virut mã hóa ( NS2-NS3 và NS3) với protease NS2-NS3
cysteine được kích hoạt tại chỗ ghép nối NS2-NS3 và protease NS3 serine được
kích hoạt bởi các protein duy trì chức năng [17,51].
Các vị trí tiếp theo của nucleotit virut và gốc amino axit theo HCV chuỗi H77
kiểu gen 1a, được tiếp nhận theo số NC_004102. Một số thông số đặc trưng cho
các protein HCV được tập hợp trong bảng dưới đây.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
8
Bảng 1.1: Tổng quan về kích thước của protein HCV
Protein Số aa Vị trí aa trong chuỗi Trọng lượng protein
Core: protein core HCV có độ pH kiềm cao là một protein gắn ARN tạo ra
nucleocapsid của HCV. Protein core đã được báo cáo tương tác với nhiều loại
protein của tế bào tác động đến chức năng của nhiều protein của tế bào và chức
năng của tế bào túc chủ như gen dịch mã, chuyển hóa lipid, chết theo chương trình
và khá nhiều tín hiệu dẫn đường. Ngoài ra protein core mồi dẫn gan hóa mỡ và ung
thư gan ( UTG)[51,52].
E1 và E2: là protein type I xuyên màng và có đoạn cuối C ái nước làm neo.
Được chuyển vị đến ruột của ergoplasme và được glycosyl hóa tại đấy. Do kết nối
rất mạnh với N liên kết glycosyl hóa. E1,E2 tạo thành non-covalent heterodimer đã
cho là tạo thành vỏ của HCV. Quá trình đóng gói các phần tử của HCV và trồi ra
chưa được hiểu thấu đáo nên cần nghiên cứu có hệ thống vấn đề này[15,20,48].
F-Protein, ARFP: Tổng hợp protein này là do một khung đọc mở thay thế
trong nội tại gen core. Được đặt tên là khung protein đọc mở thay thế ( ARFP ) hay
là khung F ( F frame shift ) có 160 amino acid. ARFP hay F là cần thiết cho
ARN-HCV tăng sinh. Được thể hiện trong diễn biến tự nhiên như thế nào khi nhiễm
HCV cần làm sáng tỏ [7,46].
Protein P7: P7 là một polypeptide có 60 amino acid, nằm tại vị trí giao nhau
của gen cấu trúc và gen không cấu trúc. Chưa biết chắc chắn là P7 có được đóng gói
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
9
không với các phần tử khác của HCV, P7 gồm 2 vùng để tạo thành hexamer là kênh
cho các ion hoạt động, có thể cho rằng P7 có vai trò quan trọng trong đóng gói vì
một protein như vậy của virus gây tiêu chảy ở Bò ( BVDV- bonine diarrhea virus)
đã chứng minh là rất cần thiết để sản sinh virus-progeny nhưng không thể để cho
tăng sinh ARN virus [28].
Protein tự tiêu NS2-3 ( autoprotease): kết nối NS2/3 bị tách bởi autoprotease
để có NS2 và đoạn cuối N thứ ba của NS3. Mặc dù hoạt tính protease của NS2-3
cho genome HCV tăng sinh trong chu kỳ sinh trưởng nội bào cũng như trong in
vitro cho subgenomic replicon nhưng cũng cần để biết NS2 còn có chức năng nào
khác sau khi tách rời NS3[7,48,51].
Protein NS3-4A-NS3: là protein đa chức năng có chứa một serin protease tại
phần ba đoạn N-cuối chịu trách nhiệm dòng xuôi tách biệt ở vùng không cấu trúc là
một NTPase/ARN vùng helicase hai phần ba của C tận cùng.
NS4A :là 154 polyamino acid tác động đến NS3 tại tế bào nội màng và cần như
một đồng yếu tố cho NS3 serin protease. Cấu trúc tinh thể của phức hợp đã cho thấy
NS3-4A là thành phần tích hợp của enzyme nhân. Đáng ngạc nhiên NS3 seri
protease có ảnh hưởng tới sự đề kháng miễn dịch tế bào tự nhiên của túc chủ bởi đã
ức chế tín hiệu RIG-1 và TLR. Nhận xét này sẽ rất hấp dẫn NS3 có thể là hướng
cho thuốc chống HCV. Chất ức chế serin protease đã nổi lên là thành phần cực kỳ
có hiệu quả và trở thành nguyên lý hàng đầu để nghiên cứu điều trị bệnh nhân HCV
mạn tính. Tác dụng men hoạt tính của NS3NTP-ase /helicase là rất cần thiết cho
ARN-HCV tăng sinh. Đích của chức năng trong quá trình sinh trưởng có thể là
không xoắn 2 vòng tăng sinh, ARN trung gian làm loại trừ ARN cấu trúc thứ phát
hay là tách rời genome với protein gắn kết. Những tiến bộ về hiểu biết cơ chế phân
tử của enzyme này có thể là một chiến lược mơi về thuốc ức chế HCV.
NS4B : Do tính chất rất ái nước nên NS4B là thành phần HCV rất khó nghiên
cứu và hiểu biết chưa nhiều, cho đến nay được biết NS4B với 27-kDa là thành phần
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
10
tích hợp với protein màng khu trú tại ergoplasme xuất xứ từ thành phần riêng lẻ của
màng. Đáng chú ý biểu hiện của NS4B sẽ mồi dẫn tổn thương màng đặc hiệu được
đặt tên là web-màng tác dụng như một giàn giáo để tạo thành cấu tạo phức hợp tăng
sinh HCV.
NS5A :là kẽm phosphoryl hóa protein kim loại chức năng chưa biết, mặc dù đã
có nhiều tài liệu nói về chức năng có thể có của NS5A cũng như một danh mục
khổng lồ về tương tác với các yếu tố khác của NS5A nên chức phận của NS5A lại
không rõ ràng. Khởi đầu thì rất hấp dẫn vì NS5A có tiềm năng điều hòa đáp ứng
interferon, tuy kết quả nghiên cứu còn trái ngược nhau. Một nhận xét nổi bật là trên
replicon thích ứng của nuôi cấy tế bào thấy độ tập trung đột biến cao trong phần
trung tâm của NS5A, hiện tượng trên chỉ ra rằng NS5A có tác động hiệu quả trên
điều hòa tăng sinh của HCV. Yếu tố liên kết màng của NS5A được làm trung gian
bởi một amphipathic alpha helix khu trú tại N-đoạn cuối, tuy ít thực nghiệm về
tiêu hủy protein mới đây nhưng cũng cho phép định nghĩa ba vùng protein tại
domain cytosolic. Gần đây nhất cấu trúc ba chiều của đoạn N- cuối domain 1 cũng
được giải quyết bằng chụp hình. Sau khi dimer hóa cấu trúc này tạo ra basic groove
đối diện với cytosol tại bề mặt màng tế bào. Cấu trúc kiểu claw like được cho rằng
đã cung cấp chỗ cho ARN gắn kết và vì vậy đã tham dự vào việc điều hòa đích của
genome ngay trong phức hợp sinh trưởng HCV [7,48,51].
NS5B: Chìa khóa của replicase khởi hoạt tổng hợp genome ARN mới là NS5B
ARN- phụ thuộc ARN polymerase (RdRp). NS5B là kích thước đo theo mấu của
protein neo màng (tail-anchored protein) có đặc trưng bởi domain xuyên màng tại
C- đoạn cuối của protein chịu trách nhiệm tác động hậu dịch mã màng. Cấu trúc của
NS5B là điển hình cấu tạo polymerase dáng hình bàn tay phải với dưới vùng ngón
tay, mu bàn tay, ngón tay cái bao bọc thành vòng tròn nơi có hoạt tính cao. Quá
trình tăng sinh thông qua tổng hợp một vòng ARN bổ sung mang dấu (-) sử dụng
genome như là một khuôn mẫu và hậu quả của tổng hợp được ARN (+) từ ARN(-)
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
11
trung gian. Tác động như là thành phần trung tâm của tăng sinh NS5B nổi lên như
là một đích chính để làm thuốc mới có hiệu quả.
1.1.5. Vòng đời của virut viêm gan C
Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in
vitro để thể hiện vòng đời và sinh trưởng của HCV. Nhưng vì hình thành hệ thống
replicon đã như một cuộc cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời của HCV.
Hình 1.4 : Mô hình hiện tại vòng đời và sinh trưởng HCV [51]
(1:Sự hấp phụ bề mặt tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận. 2: Xâm nhập nội tế
bào. 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào gan. 4: Phá bỏ lớp vỏ ngoài giải
phóng ARN (+). 5: Dịch mã và sao chép ARN nhờ Web màng. 6: Tập hợp
và đóng gói. 7: Tạo virut hoàn chỉnh. 8: Sự phóng thích ra khỏi tế bào gan).
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
12
Mô hình thay thế nghiên cứu bước xâm nhập đầu tiên bao gồm kiểu nhiễm virus
sao chép ngược kiểu giả type ( infectious retroviral pseudotype) đã làm rõ vai trò
chức năng của glycoprotein HCV:
Bước 1: xâm nhập kiểu nội nhập tế bào trong môi trường phụ thuộc pH thấp và
cũng chưa biết yếu tố nào là khuôn cho virion thâm nhập, tuy cũng xác định được
các yếu tố tham gia, pH thấp, và hòa màng nội nhập tế bào gan và đầu tiếp nhận trên
tế bào gan là bước khởi đầu[11,32].
HCV E2 có ái lực mạnh với vòng ngoài rộng của CD81, một tetrspaspamin có
trên mặt nhiều loại các tế bào kể cả các tế bào gan và có thêm các đồng tiếp nhận
lớp B type 1 SR-B1 ( tế bào dọn rác – scavenger cell) và CLDN1 ( the tight junction
claudin -1 ) (Hình 1.5) [7,16].
Ngoài ra lipoprotein tỷ trọng thấp ( low density lipoprotein) cũng được xem là
một dạng đầu tiếp nhận quan trọng và được xác định giá trị do nghiên cứu với sự
hiện diện của thành phần huyết thanh người. Đặc biệt là lipoprotein tỷ trọng cao kết
hợp làm cho SR-B1 tăng độ hướng dẫn và thâm nhập HCV vào tế bào gan và còn
bảo vệ chống kháng thể trung hòa của cơ thể [7,34].
Bước 2: giải phóng sợi ARN (+) tác dụng như một m-ARN và có 2 vùng NCR3’
và 5’ vùng không mã hóa là vùng bảo tồn cao trong các chủng HCV được phân lập
và có chứa IRSE ( internal ribosome entry site). IRES gắn trực tiếp với riboxom
40S và được coi là yếu tố tiền khởi động cần thiết cho cap-dependent dịch mã. Cấu
trúc ba chiều HCV IRES gắn với 40S ribosomal subunit minh họa cơ sở phân tử để
dịch mã tạo ra polyprotein bằng bộ máy dịch mã của tế bào [7,46].
Bước 3: xâm nhập ergoplasme và polyprotein tự cắt đoạn để sinh 3 protein cấu
trúc C,E1,E2 và 7 protein không cấu trúc NS; đặc biệt tạo ra ARN (-) làm khuôn
mẫu để HCV sinh trưởng tạo lại ARN sợi (+), tại 1 thời điểm nào đó genome HCV
thay chức phận trở thành phức hợp sinh trưởng liên quan đến màng (membrane
associated replication complex)[7].
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
13
Bước 4: đóng gói và xuất ra ngoài.
Mọi việc của quá trình đều trong nguyên sinh chất không liên quan đến nhân tế
bào gan như HBV.
Như tất cả virus ARN (+) đã nghiên cứu từ trước đến nay HCV tạo ra một phức
hợp màng liên kết bao gồm protein virut,yếu tố tổn thương màng, và những thành tố
của tế bào túc chủ. Yếu tố tổn thương màng đặc hiệu được coi như là một web
màng, đã được xác định là nơi ARN tăng sinh trên tế bào Huh-7 chứa subgenomic
HCV replicon.
Hình 1.5 : Các đầu đồng tiếp nhận HCV[29]
Một khi đã vào trong tế bào gan và chỉ trong nguyên sinh chất tế bào gan chu kỳ
sinh trưởng của HCV mới khởi động dựa chủ yếu vào bộ máy của nội tế bào để
hoàn thành chu kỳ sinh trưởng. đặc hiệu nhất genome HCV dịch mã để tạo ra một
protein đơn độc có khoảng 3011 amino acid gọi là chất đa protein. Chất đa protein
tiếp theo quá trình tự phân hủy bởi protease của virus và tế bào gan để tạo ra 3
protein cấu trúc có liên quan đến virion và 7 protein không cấu trúc.
Một khung nhóm có thể xuất hiện tại vùng nhân (core) để sản xuất ra khung đọc
mở thay thế protein ( ARFP). HCV mã hóa hai protease NS2 cystein tự tiêu protein
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
14
và NS3-4A serin protease. NS protein tuyển chọn genome HCV vào trong một phức
hợp ARN sinh trưởng gắn với săp xếp lại màng nguyên sinh chất. theo Olaf Isken
tuyển chọn là do cái gọi là NF/NFAR protein đặt tên là NF90/NFAR-1 can thiệp
vào quá trình tăng trưởng của ARN-HCV.
1.2. Genotype HCV
HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử
dụng men RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình
tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân
virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50].
Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được
từ các bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm
tại các vùng miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất
là 06 nhóm gen chính bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39].
Khi tính toán mức trung bình trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt
về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là
glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen nhân và một số gen không có cấu
trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn. Khả năng khác nhau của các chuỗi ở mức
thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại đó chuỗi riêng lẻ
và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng chuyển
hóa[44,47].
Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước
trên đoạn gen là có sự đồng nhất. Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự
biến đổi của chuỗi trình tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của
protein là không có sự bảo tồn cao với kiểu gen. Điều này trái ngược với tính chất
bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng ý với ý kiến này cho rằng có khả
năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có sự biến đổi codon thứ
ba của gen lõi[42,44].
Phương Thị Hà
Hình 1.6 : S
Mỗi nhóm gen trong b
một chuỗi các subtype có li
mỗi subtype vào khoả
>30%. Một số genotype nh
thể là kết quả của quá tr
sử dụng ma túy trong v
nước phương tây (Hình 1.6 ).(
các thử nghiệm lâm sàng và thông tin m
với interferon (INF) và các ph
toàn thế giới, 1b phân b
và Trung Đông, type 3 ch
Nam Phi, type 6 ở Hồng
Type 6a tìm thấy ởkhu công nghiệp ởgần đây tìm thấy ở
Kiểu gen 3a được phân bố ở các khu vực công nghiệp hóa ở Châu
Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thchủ yếu ở các nước vùng
Trung Hải và viễn Đ
Luận văn Th
15
Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [4
i nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV
i các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong đ
ảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con s
genotype như 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng h
a quá trình truyền máu và dùng chung kim tiêm gi
ng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớ
ình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp ph
àng và thông tin mới nhất đã được thu thậ
eron (INF) và các phương pháp điều trị virus khác). Trong
i, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân b
ông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung
ồng Kông và Việt Nam [42,44].
Kiểu gen 1a được phân bbắc Âu và Mỹ, các nướ
nghiệp hóa.
Kiểu gen 1b thb
Type 4a phân b
Type 5a thường tìm thấy duy nhất ở Nam Phi
ấy ở Việt Nam, các ệp ở Hồng Kông và ấy ở Autralia
ở các khu Âu
ìm thấy ùng Địa
ễn Đông
n văn Thạc sĩ khoa học
44].
t của HCV đều có chứa
Trong đó, sự khác biệt của
i genotype con số này là
ộng hơn cả, điều này có
à dùng chung kim tiêm giữa những người
ần lớn là phân bố ở các
ặp phổ biến nhất trong
c thu thập trên các phản ứng
. Trong đó 1a phân bố
, type 2 phân bố địa trung hải
ố ở trung đông, type 5 ở
c phân bố rộng rãi ở ớc có nền công
p hóa.
u gen 1b thường thường phân bố toàn thế giới
Type 4a phân bố rộng rãi ở Trung Đông
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
16
Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực
châu Phi và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ
thể. Ví dụ, sự lây nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi
những người ở Trung Phi, chẳng hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại
có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là
phổ biến. Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng sự có mặt của các kiểu gen này
có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất vài thế kỷ [42,44].
Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành. Thật
vậy, kiểu gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các
nhà nghiên cứu phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42]. Những chủng này khi được
phân loại như là phân nhóm của kiểu gen 6. Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số
đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm
trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn
thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ,
Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia
[42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông
Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái
Lan [42] và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-
3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á
là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong
khu vực Đông Á.
Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả
năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype
khác: 18,1% so với 54,9%)[2]
Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:
+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ
nhiễm HCV mạn cao (>80%)
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
17
+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái
nhiễm
+ Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin
(do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng
virut mới)
1.3. Bệnh học viêm gan virut C
1.3.1. Dịch tễ học
HCV lây truyền bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao
gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, dây cầm máu, ống hút,
ống píp,vv… Kim dùng xăm mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV,
dùng chung các vật dụng cá nhân như dao cạo, bàn chải đánh răng hay dũa móng
tay tuy ít nguy cơ nhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh.
Trước năm 1992, nhiều người đã bị nhiễm HCV qua máu hoặc do nhận máu
của người khác. Đến năm 1992, cách thử máu đáng tin cậy để xác định kháng thể
HCV được sử dụng và từ đó các nguồn cung cấp máu được thử nghiệm. Ngày
nay, tỉ lệ lây nhiễm HCV do truyền máu bị nhiễm rất thấp dưới 0.01 % một số ít
(khoảng 1%- 3% người có quan hệ tình dục khác phái, một vợ một chồng) có thể
bị lây nhiễm HCV do có quan hệ tình dục không an toàn. Những người thuộc
nhóm có “nguy cơ mắc bệnh cao” (như đàn ông đồng tính, mãi dâm, người có
nhiều bạn tình, người mang bệnh lây qua đường tình dục) thường dễ bị nhiễm
HCV qua đường tình dục hơn.
Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm như
bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thêt tránh được có thể tiếp xúc trực
tiếp với máu của người mang bệnh.
Khoảng 5% những bà mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước
hoặc trong khi sinh nở. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu
của người mẹ. Có đến 10% người có HCV không xác định được tại sao họ bị mắc
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
18
bệnh. HCV không lây truyền qua những tiếp xúc thông thường hang ngày như ăn
chung bàn, uống chung ly nước, ôm, hắt hơi hoặc ho.
1.3.2. Diễn biến của bệnh nhân nhiễm virut viêm gan C
Viêm gan C cấp tính
Khỏi (10-30%) Mang các dấu ấn của HCV mạn tính (70-90%)
Mang dấu ấn âm tính không triệu chứng 50% VGMT tối thiểu 50%
Xơ gan 10%
Ung thư gan 2%
Các triệu chứng thường gặp: Nhiều người không có hoặc có một ít triệu chứng
trong giai đoạn nhiễm HCV cấp tính. Phần lớn các người mang bệnh HCV kinh
niên cũng không có triệu chứng nào và vẫn sống gần như bình thường. Tuy nhiên,
những người khác có triệu chứng giống như bị cảm cúm nhẹ như buồn nôn, mệt
mỏi, sốt, nhức đầu, ăn không ngon, đau vùng bụng, và nhức bắp thịt hay ở khớp.
Một số người lại có những triệu chứng như bị cảm cúm nặng, cũng như vàng da và
mắt bị đục, nước tiểu đậm. Sau một thời gian (thường là nhiều năm hoặc vài chục
năm), người có bệnh HCV kinh niên có thể có những triệu chứng liên quan đến hư
gan. Viêm Gan C kinh niên có thể liên quan đến nhiều triệu chứng khác.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
19
1.3.3. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh viêm gan virut C
1.3.3.1. Các xét nghiệm kháng thể HCV
+ ELISA II là một cuộc thử nghiệm máu đơn giản để phát hiện kháng thể HCV
+ RIBA là cuộc thử nghiệm kháng thể thứ nhì, có thể được dung sau cuộc thử
nghiệm Elisa,để xác nhận sự hiện diện của kháng thể HCV
1.3.3.2. Xét nghiệm số lượng siêu vi C
Cuộc xét nghiệm đo số lượng HCV lưu truyền trong máu. Đơn vị đo lường siêu
vi HCV là số lượng mỗi mili-lít(ml) máu hoặc đơn vị đo lường tiêu chuẩn được gọi
là Đơn Vị Quốc Tế (International Units).
1.3.3.3. Xét nghiệm chức năng và sinh hóa của gan
Có một số cuộc thử nghiệm máu để đo lường sức hoạt động của gan. Bảng thử
nghiệm gan (hepatic panel) gồm các số đo lường chức năng của gan. Số đo lường
phổ thông nhất là ALT và AST (alanine aminotransferase & aspartate
aminotransferase - mà trước đây gọi là SGPT và SGOT). ALT và AST là những
chất men (enzymes) được tiết vào trong máu khi gan bị hư và thường tăng cao ở
người bị nhiễm HCV. Nhiều người có HCV có chỉ số cao của hai loại men gan này,
thường là dấu hiệu đầu tiên là họ đã bị nhiễm bệnh. Những cách đo lường khác là
ALK và GGT. (alkaline phosphatase & gamma-glutamyl transpeptidase) cũng được
sử dụng trong việc thử nghiệm.
1.3.3.4 Sinh thiết gan
Sinh thiết ( hay thử mẫu tế bào) gan được dùng để đo lường mức độ viêm, số
lượng sẹo, và tình trạng sức khỏe của gan. Việc này cũng có thể dùng để xác định
cách chữatrị. Cách thức thông thường nhất là làm tê da và bắp thịt rồi nhanh chóng
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
20
đưa một kim dài và nhỏ vào gan và rút ra để lấy mẫu thử nghiệm. Cách thức này
làm nhiều người sợ, nhưng rất hiếm có biến chứng.
1.3.3.5 Xét nghiệm phân định loại HCV (Genotype HCV)
Cuộc xét nghiệm phân định loại HCV được dùng để xác định bạn bị nhiễm loại
HCV nào. Ðiều này rất hữu ích cho việc quyết định cách chữa trị, như là chọn lựa
loại thuốc, và cần điều trị bao lâu.
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV
Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ
thuật Real-time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing).
1.4.1. Kỹ thuật Real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR( Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi
polymerase) mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ
nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là Real-time. Như vậy, có thể nói
Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản
sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị
cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
21
1.4.1.1. Lịch sử phát hiện kỹ thuật PCR
Vào một buổi tối cuối tuần tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường
ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng lóe lên trong đầu của Kary Mullis
khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai
làn bánh xe cũ:” Dùng nhiệt độ tách đôi sợi AND thành hai mạch đơn’’. Lúc đó
Kary Mullis chỉ là một nhà hóa sinh học bình thường, đang làm việc tại một phòng
thí nghiệm nhỏ.
Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR ( phản ứng chuỗi
polymerase) vào năm 1985, tạo nên cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa
học. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hóa học nhờ
phát minh này.
1.4.1.2. Nguyên lý kỹ thuật PCR
Từ một đoạn ADN chọn lọc, nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn
nữa trong một thời gian ngắn. Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra
trong môi trường in vitro như trong quá trình phân bào.
Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức
bị tách thành hai nhánh đơn. Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của
enzyme ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh
ADN bổ sung được tổng hợp. Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra
được mà phải có các đoạn ADN mồi (primer) sẽ tổng hợp với những vị trí bổ sung
trên hai chuỗi đơn. Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được tổng hợp nhân
tạo. Từ vị trí gắn của mồi khởi đông, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp. Mồi khởi
động mang tính đặc thù riêng cho mỗi AND có trình tự nhất định. Với mỗi loại mồi
khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
22
Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành
qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được
lặp lại như thế để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn.
Hình 1.7 : Minh họa kỹ thuật PCR ( P1 và P2: các đoạn mồi primer )
1.4.1.3. Nguyên lý kỹ thuật RT-PCR
Phương pháp dựa sự phiên mã ngược của bộ gên RNA của HCV thành cDNA
bằng mồi ngẫu nhiên rồi sau đó sử dụng PCR để khuếch đại một đoạn đặc hiệu dài
khoảng 240bp trên vùng 5’NC của HCV-cDNA. Trong khi chạy PCR,một khi có
sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu
với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị thủy giải bởi men taq
polymerase ( nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn
kéo dài. Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang
(fluorophore) FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ của
probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser
và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real time của máy.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
23
Hình 1.8: Nguyên lý kĩ thuật Real time PCR sử dụng Taqman Probe (phát
hiện , đinh lượng và định type HCV).
1.4.1.4. Máy Real-time PCR [10]
Điều kiện đầu tiên để có thể thực hiện được Real-time PCR (RT - PCR) là phải
có máy RT - PCR. Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
24
luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị được gọi là thiết
bị real-time. Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng:
+ Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng xác định
lên các tube phản ứng RT- PCR.
+ Có được camera hay cảm biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang
phát ra từ các tube phản ứng RT- PCR khi các tube phản ứng này được chiếu các tia
sáng kích thích.
1.4.2. Kỹ thuật Sequencing
Nguyên lý: Kỹ thuật Sequencing dựa trên phương pháp enzyme Sanger (phương
pháp đầu tận cùng của chuỗi). Chìa khóa của phản ứng này là sử dụng
dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp ADN.
Do đó khi enzyme AND polymerase gắn chúng vào sợi AND thì quá trình tổng hợp
bị ngừng lại. Vì vậy phương pháp này còn được gọi là phương pháp dideoxy[5].
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
25
Hình 1.9 : Qúa trình tổng hợp chuỗi AND khi có mặt của didNTP
Hình 1.10: Xác định trình tự nucleotid
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
26
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định
Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai.
Tổng số mẫu xét nghiệm antiHCV (+) là 239 mẫu trong đó có 228 mẫu có số lượng virut >102copies/ml máu mới xác định kiểu gen bằng kỹ thuật RT- PCR.
Bệnh nhân có các tiêu chuẩn sau:
+ Đã xác định Anti HCV (+).
+ Không đồng nhiễm với các virut gây viêm gan khác như HBV, HGV.
+ Không đồng nhiễm với HIV.
+ Số lượng virut >102copies/ml máu.
2.2. Dụng cụ và hóa sinh phẩm
2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị
Dụng cụ: Kim tiêm các loại,Tube các loại, Pipet các loại, Đầu côn các loại.
Trang thiết bị: Hệ thống máy Real-time PCR CFX96TM, Máy ủ nhiệt khô
MS0030, Máy li tâm Microfuge 16, Máy li tâm, Máy Vortex Biocote, Máy
Spindow, Pipet Man Nichipet EX, Máy hút chân không 7A-230, Tủ lạnh, máy giải
trình tự gen 3130XL do Công ty Nam Khoa thực hiện.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
27
2.2.2. Hóa chất sinh phẩm
Bộ hóa chất do Công Ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp bao gồm:
+Sinh phẩm dùng để tách chiết ARN:Bộ thuốc thử NK RNA PREP.
+ Sinh phẩm dùng để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên:Bộ thuốc thử NKcDNAsynthesys kit (cung cấp cho 50 mẫu thử).
+ Sinh phẩm dùng để phát hiện và định lượng HCV-RNA:Bộ thuốc thử NK
HCV-TQPCRHEX kit.
+ Sinh phẩm dùng để định type HCV
+ Hệ thống mồi và mẫu dò được thiết kế dựa vào trình tự các gen trên vùng
5’NC trên bộ gen HCV được công bố trên ngân hàng gen được tổng hợp và cung
cấp bởi công ty Nam Khoa và có trình tự như sau:
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
28
Bảng 2.1. Mồi và mẫu dò trên vùng 5’ NC của HCV
Tên
Chức
năng Trình tự
Chiều
dài
(bp)
Kích
thước
sản phẩm
PCR (bp)
Primer F
Mồi
xuôi
5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 99
Primer R Mồi
ngược
5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’ 17
Probe1
Mẫu dò 5’-FAM-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG-
BHQ1-3’
22
Probe2
Mẫu dò 5’-Cy5-AAGGACCCAGTCTTCCCGGCAATTC-
BHQ2-3’
25
Probe 3
Mẫu dò 5’-ROX-ACCCGGTCACCCCAGCGATTCC-
BHQ2-3’
23
Probe 6
Mẫu dò 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCAT-
BHQ1-3’
26
Hóa chất để thực hiện giải trình tự gen do Công ty Nam Khoa thực hiện:
Bygdye Terminal V1.3, mồi HCV thiết kế trên NS5B.
2.3. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu.
Mẫu có đủ các điều kiện như trên sẽ được tách chiết và tinh sạch ARN sau đó
tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm
cDNA của các mẫu bệnh nhân sẽ được định lượng bằng phương pháp Real-time
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
29
PCR dựa trên các cặp mồi đặc hiệu. Những mẫu có nồng độ > 102copies/ml máu sẽ
được lựa chọn để định type.
2.3.1. Kĩ thuật tách chiết ARN
Kỹ thuật dựa trên phương pháp do Chomczynski và Sacchi sáng chế. Nguyên
tắc là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để
làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ bị
vón lại, DNA sẽ tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và
sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay li tâm lắng
tách. RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hỗ trợ
của tRNA và glycogen.
Các bước tiến hành:
Bước 1: 20µl IC-HCV ARN ,100µl huyết thanh, 300µl R1 ủ 10 phút nhiệt
độ phòng.
Bước 2: 80µl R2 úp ngửa 5-6 lần ủ 10 phút nhiệt độ phòng sau đó li tâm
15 phút.
Bước 3: Hút 200 dịch nổi chứa ARN vào tube có 200µl R3 úp ngửa 5-6 lần ủ 10
phút nhiệt độ phòng sau đó li tâm 10 phút.
Bước 4: Hút bỏ hết dịch nổi cho 700µl R4 li tâm 5 phút.
Bước 5: Hút bỏ dịch nổi ủ 560C trong 10 phút cho 300µl R5 sau đó mix nhẹ sau
đó ủ ở 560C trong 10 phút.
Qua năm bước trên ta có được dung dịch cần tách chiết.
2.3.2. Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên
Phương pháp này sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexamer
primers) mà không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử
thành cDNA từ ARN nhờ men Reverse Transciptase. Ngoài ra trong hệ thống phản
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
30
ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ ARN bị bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã
ngược thành cDNA.
RNA
250C
RNAse H 420C cDNA
RNAse H 420C
RNAse H 850C
cDNA
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên
Các bước tiến hành
Trong 1 tube PCR 0.2 có chứa sẵn 5µl NKRT+RTmix đang ngâm trong đá, cho
vào mẫu trích biệt RNA 15µl.
Sau đó, thực hiện tổng hợp cDNA bằng cách ủ ống phản ứng trong máy luân
nhiệt theo các bước sau:
5 phút
30 phút
5 phút
Giữ
250C,
420C
850C
40C
Sản phẩm cDNA (2-20 µl) được dùng để thực hiện phản ứng PCR.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
31
2.3.3. Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh
lượng HCV-RNA.
Các bước tiến hành
Sau khi tách chiết RNA ta tổng hợp cDNA sử dụng NKcDNAsynthesis kit để
thực hiện phản ứng revers transcription với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA
trong các dịch trích biệt RNA ở trên (mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm) thành
cDNA. Cho vào PCR mix để chuẩn bị chạy PCR.
Phải thực hiện giai đoạn này với các PCR mix giữ trong khay lạnh hay đá bào
Cho PCR mix vào low-profile white PCR tube: Tính toán số phản ứng cần phải
thực hiện để lấy đủ số tube chứa master mix vào tube PCR. Để các tube Master mix
ở 40C-100C trong tối cho đến khi rã đông hoàn toàn; lăc nhẹ để trộn sau đó li tâm
nhẹ để lắng. Cho vào các tube PCR, mỗi tube 20�l NKHCV-TQPCRHEX mix. Giữ
các tube này trong đá bào hay các giá lạnh.
Đối với mỗi mẫu cDNA từ bệnh phẩm và mẫu chứng âm: cho 5�� mẫu cDNA
vào một tube PCR chứa 20�� NKHCV-TQPCRHEX mix.
Đối với các NK
HCVDNA chuẩn : cho vào 3 tube PCR khác chứa 20�� NKHCV-
TQPCRHEX mix, mỗi tube 5�� một độ pha loãng NKHCVDNA chuẩn.
Chạy real-time PCR
Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình luân nhiệt.
Cho tất cả các ống PCR mix đã chuẩn bị ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy real-time
PCR. Chọn plate set-up để chọn vị trí các giếng mà các tube phản ứng được đặt vào.
Chọn hai kênh huỳnh quang là “ FAM” và “HEX” phát được huỳnh quang khi các
taqman probe tương ứng bị thủy giải, và máy chọn được các kính lọc huỳnh quang
tương ứng các camera của máy ghi nhận được các ánh sáng huỳnh quang phát ra.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
32
Chọn thể tích phản ứng là 25��. Sau đó chạy chương trình luân nhiệt real-time PCR
như sau:
1 chu kỳ 400C trong 10 phút
1 chu kỳ 950C trong 5 phút
40 chu kỳ 940C trong 15 giây
650C trong 1 phút
Chụp hình Real-time ở giai đoạn này.
2.3.4. Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen
HCV
Sản phẩm cDNA sau khi đem định lượng, nếu mẫu nào có số lượng
>102copies/ml ta đem xác định kiểu gen.
Tiến hành:
Cho 20µl đã Mix sẵn vào tube loại nhỏ, sau đó cho 3µl cDNA của bệnh nhân đã
định ARN-HCV (+) cho vào máy Real-time PCR để định type.
2.3.5. Kỹ thuật sequencing trong xác định kiểu gen HCV
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng.
Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, sự phân bố lưu hành kiểu gen trong mẫu đã được lựa chọn.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
33
Sơ đồ nghiên cứu:
Định lượng HCV-ARN bằng kỹ thuật Real-time PCR trên máy CFX96TM
Bệnh nhân chẩn đoán với virut viêm gan C bằng test nhanh
Chọn mẫu bệnh phẩm anti-HCV dương tính
Tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên
Chạy Eliza
Tách chiết ARN
Chọn mẫu có HCV-ARN >= 102 copies/ml máu
Mẫu có HCV-ARN < 102 theo dõi kiểm tra lại sau 6 tháng
Định type bằng kỹ thuật Real-time PCR trên máy CFX 96TM
Type 1 Type 2 Type 6 Không xácđịnh
Type 3
Giải trình tự gen trên máy 3130XL
Chọn ngẫu nhiên 30 mẫu
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
34
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu
Độ tuổi trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu thấp nhất là 21 tuổi và cao nhất là 75
tuổi, tuổi trung bình trong nhóm nghiên cứu là 41 tuổi.
3.1.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính
Trong thời gian từ tháng 01/2011 đến tháng 01/2012 có tổng số 239 mẫu huyết
thanh xét nghiệm dương tính với HCV bằng phương pháp Eliza và không bị đồng
nhiễm HIV, HBV,HGV. Trong đó số bệnh nhân nam được xác định là 171 trường
hợp, bệnh nhân nữ là 68 trường hợp (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính
Anti-HCV* Nam Nữ Tổng
Số lượng 171 68 239
Tỉ lệ % 71.55% 28.45% 100%
Anti-HCV*: Anti-HCV dương tính ( Anti-HCV (+))
Trong tổng số 239 mẫu huyết thanh đã xác định là anti-HCV(+) thì có 171 mẫu
huyết thanh là bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 71,55%, chỉ có 68 mẫu huyết thanh chiếm
28,45% là của bệnh nhân nữ. Vậy số lượng bệnh nhân nam nhiễm HCV (+) cao
hơn số lượng bệnh nhân nữ, điều này có thể do sự khác biệt về lối sống theo giới
tính hoặc có thể do sự lây nhiễm ở nam giới cao hơn ở nữ giới do sự khác nhau về
kiểu gen. Tuy nhiên hiện nay chưa đủ bằng chứng để chứng minh và giải thích vấn
đề trên.
Phương Thị Hà
Tỉ lệ này được biểu di
Hình 3.1. T
3.1.2. Tỉ lệ bệnh nhân
Qua xét nghiệm
hiện và định lượng số
mới đọc được ta kí hiệ
máy không đọc được ta kí hi
Bảng 3.2
HCV-ARN
Giới tính
Nam
Nữ
Tổng số
Tỉ lệ %
Nhận xét: qua bảng 3.2 t
và chỉ có 4,6 % là có HCV
chẩn đoán viêm gan C m
tễ học đưa ra [17,33,36
Luận văn Th
35
u diễn ở hình 3.1
. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo gi
nh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn
Real-time PCR (RT-PCR)dùng mồi Taqman probe
lượng copies/1ml máu, nếu số lượng HCV
ệu là HCV-ARN (+), còn nếu số lượng HCV
c ta kí hiệu là HCV-ARN (-), ta có bảng sau đ
ng 3.2 Kết quả bệnh nhân chẩn đoán HCV
ARN HCV-ARN
dương tính
HCV- ARN
âm tính
163 8
65 3
ố 228 11
95,4% 4,6%
ng 3.2 tỉ lệ xác định HCV-ARN (+) là rất cao chi
có 4,6 % là có HCV-ARN (-) (người lành mang bệnh). V
oán viêm gan C mạn là rất cao, tỉ lệ này tương đồng với t
a ra [17,33,36].
Nam, 71.55%
Nữ, 28.45%
n văn Thạc sĩ khoa học
theo giới tính
i Taqman probe để phát
ng HCV-ARN≥ 102 thì máy
ng HCV-ARN < 102 thì
ng sau đây:
-ARN
Tổng số
171
68
239
100%
t cao chiếm tới 95,4%
nh). Vậy tỉ lệ bệnh nhân
i tỉ lệ mà các nhà dịch
Nam, 71.55%
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
36
Cũng qua bảng 3.2 ta thấy rằng trong tổng số 239 mẫu huyết thanh xác định với
antiHCV(+), ta đem định lượng số lượng copies thì có 228 mẫu có số lượng HCV-
ARN(+) và có 11 mẫu có HCV-ARN(-), theo khuyến cáo của nhà sản xuất và cung cấp
bộ kit xác định genotype thì những mẫu có HCV-ARN(-) thì không định được type tuy
nhiên để kiểm định khuyến cáo trên, nhóm đã thực hiện trong số 11 mẫu huyết thanh
HCV-ARN (-) chọn ngẫu nhiên lấy 3 mẫu đem xác định kiểu gen, qua xét nghiệm
Revers transcription RT - PCR dùng mồi taqman probe đặc hiệu 5’NC ta không xác
định được kiểu gen trong 3 mẫu ngẫu nhiên đó.Như vậy số lượng HCV-ARN (+) thì ta
mới có thể xác định được kiểu gen HCV bằng kỹ thuật RT- PCR.
3.2. Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR
3.2.1. Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type
Trong số 228 mẫu bệnh phẩm đã định lượng HCV-ARN (+) đem định type ta
được kết quả định lượng tương ứng với kết quả xác định genotype được trình bày
trong bảng 3.2
Bảng 3.3 Kết quả định genotype so với kết quả định lượng
Kết quả định lượng Số
mẫu
Type
1 2 6 Không
xác định
100-999 17 13 0 3 1
1000-9.999 47 29 1 16 1
10.000-99.999 61 33 1 27 0
100.000-999.999 75 55 2 21 0
>=1.000.000 28 24 1 3 0
Từ kết quả định lượng so với kết quả định type ta thấy rằng tại ngưỡng định
lượng nào thì type 1 cũng có số lượng nhiều nhất sau đó là type 6 và cuối cùng là
type 2, kết quả được biểu diễn trong hình 3.2.
Phương Thị Hà
Hình 3.2
Lượng siêu vi C dao gen 1,2,6 có số lượng sisố lượng siêu vi dưới 1,0x10có sự khác nhau có ý ngh
Từ bảng trên cho ta thsố lượng virut có trong máu.
3.2.2. Tỉ lệ kiểu gen trong 228 b
Kiểu gen
HCV
Type 1
Số mẫu 151
Tỉ lệ % 66.23%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Luận văn Th
37
Hình 3.2: Kết quả định lượng so với kết quả đị
dao động từ 1,0x102 bản sao/1ml đến 1,2x10ợng siêu vi trên 1,0x105 bản sao /ml là 76-3-24. Kiới 1,0x105 bản sao/ml là : 75-2-46 qua đó nh
khác nhau có ý nghĩa giữa lượng siêu vi trong máu và kiểu gen c
ên cho ta thấy kiểu gen của virut viêm gan C không bng virut có trong máu.
u gen trong 228 bệnh nhân được xác định genotype
Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV
Type 2 Type 3 Type 6
5 0 70
2.19% 0% 30.7%
n văn Thạc sĩ khoa học
ả định type
n 1,2x107 bản sao/ml, kiểu 24. Kiểu gen 1,2,6 có
đó nhận thấy rằng không ểu gen của siêu vi.
êm gan C không bị ảnh hưởng bởi
nh genotype
Không xác
định được
Tổng
2 228
0.88% 100%
Tổng sốmẫu
Type 1
Type 2
Type 6
Không xác định
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
38
Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì
tỉ lệ type 1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70
mẫu chiếm 30.7% tỉ lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không
xác định được type có 2 mẫu với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type
3 trong 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu.
Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3
Hình 3.3. Tỉ lệ phân bố các kiểu gen
Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã
sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã
ghi nhận có 28 trường hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm
30%, và 7 trường hợp là type 2 chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50].
Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng
sự tại trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ
thuật LIPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan
siêu vi C mạn tính, tác giả cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6.
Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type
Type
1, 66.23%
type 2, 2.19%
Type 3, 0.00%
Type
6, 30.70%
Không xác định, 0.88%
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
39
1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a) 23,9% và kiểu gen 2 là 13,1%
(type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%)[ 50].
Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ
thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong
nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng
5’NC, cho thấy kết quả nghiên cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai
tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung
ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm cao nhất. Tuy nhiên tỉ lệ này chưa
thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những người nhiễm HCV tại
Việt Nam.
3.2.3. Tỉ lệ kiểu gen lưu hành theo giới tính
Trong số 228 bệnh nhân có HCV-ARN (+) ta xác định được kiểu gen,tỉ lệ kiểu
gen được phân chia theo giới tính ta có bảng sau đây:
Bảng 3.5 Tỉ lệ kiểu gen HCV theo giới tính
Giới tính
Kiểu gen
Nam Nữ
Số bệnh
nhân
Tỉ lệ (%) Số bệnh
nhân
Tỉ lệ (%)
Type 1 112 68.71 39 60.00
Type 2 2 1.23 3 4.61
Type 3 0 0.00 0 0.00
Type 6 48 29.45 22 33.85
Không xác định 1 0.61 1 1.54
Tổng số 163 71.50 65 28.50
Theo bảng 3.5 ta thấy rằng số bệnh nhân Nam được xác định HCV-ARN(+)
nhiều hơn bệnh nhân nữ trên tổng số 228 trường hợp bệnh nhân được nghiên cứu,
trong đó:
Số bệnh nhân Nam là 163 chiếm 71,50%,Số bệnh nhân Nữ là 65 chiếm 28.50%.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
40
Trong số 163 mẫu huyết thanh của bệnh nhân nam xác định HCV-ARN (+) sau
khi đem định kiểu gen ta có tỉ lệ kiểu gen trên số bệnh nhân Nam là :
+Type 1có 112 trường hợp chiêm tỉ lệ là 68.71%, type 2 có 2 trường hợp chiếm
tỉ lệ là 1.23% ,type 6 có 48 trường hợp chiếm tỉ lệ là 29.45%, type 3 không có
trường hợp nào được xác định.
+ Trong đó có 1 trường hợp không xác định được chiếm tỉ lệ là 0.61%.
Trong số 65 mẫu huyết thanh bệnh nhân nữ có HCV-ARN (+) ta cũng xác định
được tỉ lệ kiểu gen trên số bệnh nhân nữ như sau:
+ Type 1có 39 trường hợp chiếm tỉ lệ là 60%, type 2 có 3 trường hợp chiếm tỉ
lệ là 4.61%, type 6 có 22 trường hợp chiếm tỉ lệ là 33.85%, type 3 cũng không có
trường hợp nào được xác định lưu hành trên bệnh nhân nữ
+ Không xác định được type có 1 trường hợp chiếm tỉ lệ là 3,92%.
Tỉ lệ %
Hình 3.4: Tỉ lệ kiểu gen phân bố ở nam và nữ
68.71%
1.23% 0.00%
29.45%
0.61%
60%
4.61%0.00%
33.85%
1.54%
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
80.00%
Type 1 Type 2 Type 3 Type 6 Không xác định
Nam Nữ
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
41
Qua bảng 3.5 và hình 3.4 ta thấy rằng sự phân bố tỉ lệ các kiểu gen ở hai giới là
như nhau, type 1 là cao nhất sau đó là type 6 và thấp nhất là type 2.
3.2.4. Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi
Độ tuổi trong tổng số 228 bệnh nhân được nghiên cứu thấp nhất là 21 tuổi, cao
nhất là 75 tuổi.
Bảng 3.6 Phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi
Độ tuổi
Type1
Type2
Type6
Không
xác định Tổng số Tỉ lệ
21-29
14
1
11
0
26
11.4%
30-39
59
0
30
0
89
39.06%
40-49
37
1
14
1
53
23.24%
50-59
26
3
13
1
43
18.85%
60-69
12
0
2
0
14
6.14%
>70
3
0
0
0
3
1.31%
Theo bảng 3.6 ta thấy rằng sự phân bố kiểu gen ở các nhóm độ tuổi là có sự
chênh lệch trong đó:
+ Nhóm tuổi từ 30-39 chiếm tỉ lệ nhiều nhất là 39.06%
+ Nhóm tuổi từ 40-49 tuổi chiếm tỉ lệ cao thứ hai là 23.24%
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
42
+ Nhóm tuổi từ 50-59 tuổi chiếm tỉ lệ cao thứ ba là 18.85%
+ Nhóm tuổi từ 20-29 tuổi chiếm tỉ lệ là 11.4%
+ Nhóm tuổi từ 60-69 tuổi chiếm tỉ lệ 6.14%
+ Nhóm tuổi >70 tuổi chiếm tỉ lệ 1,97%.
Sự phân bố các kiểu gen theo từng nhóm tuổi được thể hiện trong hình 3.3
Tỉ lệ %
Nhóm tuổi
Hình 3.5 Sự lưu hành kiểu gen ở các nhóm tuổi
Trong những nhóm tuổi từ 21 đến 59 thì sự lưu hành của virut là có tỉ lệ
cao, mà trong những nhóm tuổi này đều nằm trong độ tuổi lao động chính của
xã hội, như vậy ảnh hưởng đến kinh tế của gia đình nói riêng và của xã hội
nói chung là khá lớn.
11.4
39.06
23.24
18.85
6.14
1.31
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
21-29 30-39 40-49 50-59 60-69 >70
Tỉ lệ % theo nhóm tuổi
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
43
3.3. Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải tình tự gen (Sequencing) trên đoạn NS5B.
Đối với hệ mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng
RNA chứng dương là HCV genotype 1 được đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers
transcription RT- PCR chứa các probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 và 6.
Việc bố trí thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại. Kết
quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe 1 đặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho
tín hiệu dương tính. Kết quả tương tự cho các genotype còn lại (Hình 3.6)
HCV genotype 1
HCV genotype 3
HCV genotype2
HCV genotype 6
Chứng âm
Hình 3.6 Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên
vùng 5’NC của HCV
Hình 3.6 cho thấy các phản ứng nếu có các kiểu gen tương ứng với các mẫu dò
đặc trưng thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm
(được thiết kế với các thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR và real-time
RT PCR) có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền.
Tuy nhiên trong 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết
quả cho hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype 1 và 6 (Hình 3.7).
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
44
Hình 3.7 Tín hiệu dương tính genotype 1 và 6
Vậy tín hiệu mẫu dò giữa type 1 và type 6 là có sự tương đồng cao.Theo một số
nhà nghiên cứu trên thế giới [18] chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng
NS5B thì sẽ phân biệt các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’NC, cũng như là phân
biệt được type 6 với subtype 1b.
Trong số 151 mẫu của bệnh nhân đã xác định là genotype l ta l ấy ngẫu nhiên 30
trường hợp đem giải trình tự gen trên đoạn NS5b được kết quả như bảng sau:
Bảng 3.7 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b của HCV
Kiểu gen
Type 1 Type 6 Không xác định được
Type 1a Type 1b Type 6k Type 6e Type 6f Type 6h
Số mẫu 9 7 2 6 1 2 3
Tổng 16 11
3
Tỉ lệ % 53.33 36.67 10.0
Tín hiệu mẫu dò type 6
Tín hiệu mẫu dò type 1
Tín hiệu mẫu dò type 2
Tín hiệu mẫu dò type 3
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
45
Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1 và 11 mẫu huyết
thanh xác định là type 6 và có 3 mẫu là không giải được trình tự gen, không chỉ xác
định type mà giải trình tự gen còn xác định đến subtype. Như vậy có 11 mẫu huyết
thanh định type bằng phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang
FAM phát hiện genotype HCV cho tín hiệu dương tính với genotype 1 còn phương
pháp giải trình tự gen cho kết quả là type 6, trong đó có 2 mẫu là type 6k, 6 mẫu là
type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h (Bảng 3.7 ).
Kết quả định type bằng kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với
genotype1 ta đem giải trình tự được kết quả như hình dưới,kết quả giải trình tự gen
là type 6h (Hình 3.8).
78 HCV
GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCCTGACCGCTCGGGCTC
GGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCTGAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCG
GGAGAGTACCCATGGAGTGAGAATGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCG
GAGTGATTGAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTGCCTGGAGT
ATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGGGGGCATACATAATGATGTTCCCTAA
CCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGTCTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGA
GTGAGGTAGTAATATCTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA
Hình 3.8 Kết quả giải trình tự gen trên đoạn NS5b
Trong 3 mẫu không giải trình tự gen được thì có 2 mẫu có ARN-HCV thấp nhất
là 1,1x102 và 4,2x102 và có 1 mẫu là 5,8x103. Như vậy tuy giải trình tự gen có xác
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
46
định kết quả chính xác đến subtype tránh được sự nhầm lẫn giữa type 1 và type 6
nhưng nếu định lượng ARN-HCV có số copies< 103 thì ta không định được type,
điều này cũng được các nhà sản xuất bộ kit và hóa chất khuyến cáo.
Ta thấy rằng tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng
phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 11/27 mẫu bằng
40,74%.
Như vậy định type bằng phương pháp Real-time PCR xét về mặt kinh tế thì phù
hợp với đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và tỉ
lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 là 40,74% vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều
trị của bệnh nhân,do các genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây
bệnh và khả năng đáp ứng điều trị và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các
genotype khác (Genotype 1 thường điều trị trong vòng 48 tuần còn các genotype
khác điều trị trong 24 tuần). Do đó bệnh nhân khi đã xác định là type 1 bằng
phương pháp RT- PCR và có kết quả định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại
bằng phương pháp giải trình tự gen.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Qua kết quả nghiên cứu định genotype HCV bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Real-time PCR cho tỉ lệ genotype 1 là cao nhất chiếm 66,23%, tiếp đó là type 6
chiếm tỉ lệ 30,7%, type 2 có tỉ lệ thấp nhất là 2,19%, type 3 không có trong 228
trường hợp nghiên cứu
2. Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu đã xác định là genotype 1 bằng kỹ thuật Real-time
PCR giải trình tự gen có 16 mẫu huyết thanh là type 1trong đó có 9 mẫu là type 1a
và 7 mẫu là type 1b , có 11 mẫu huyết thanh xác định là type 6 trong đó 2 mẫu là
type 6k, 6 mẫu là type 6e, 1 mẫu là type 6f và 2 mẫu là type 6h . Ta thấy rằng tỉ lệ
nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương pháp Real-
time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 40,74%, tuy nhiên khi nồng độ virut
thấp không làm được giải trình tự gen.
KIẾN NGHỊ:
1. Vẫn có thể dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type khi nồng độ virut
thấp.
2. Khi đã xác định là type 1 bằng phương pháp Real-time PCR và có kết quả
định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự
gen (Sequencing).
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng viêt:
1. Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân (2008), “ Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp
sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm
xét nghiệm định kiểu gen HCV”, Y học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), pp.243-248.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh.
3. Lê Thanh Hòa, Lê Thanh Hà, Hoàng Quang (2007), “ Định typ (genotyping), virus
viêm gan C (HCV) sử dụng chỉ thị 5’ UTR trên bệnh nhân viêm gan virus ở Hà
Nội”, Tạp chí y học Việt Nam, 7, pp.29-36.
4. Học viện quân y (2008), Bệnh học truyền nhiễm và nhiệt đới, NXB y học. Hà Nội.
5. Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà
Nội.
6. Hà Văn Mạo (2006), Ung thư gan nguyên phát, NXB y học, Hà Nội.
7. Phạm Song (2009), Viêm gan virut B,D,C,A,E,GE cơ bản, hiện đại và cập nhật, NXB
Y học, Hà Nội.
8. Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng vi sinh vật y học, NXB y học, Hà Nội.
9. Phạm Văn Ty (2005),Virut học, NXB giáo dục, Hà Nội.
10. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng
thường gặp, NXB y học, TP Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
11. Akazawa D., Date T., Morikawa K., Murayama A., Miyamoto M., Kaga M., Barth
H., Baumert T.F., Dubuisson J., Wakita T. (2007), “ CD81 expression is important
the permissiveness of huh7 cell clones for heterogeneous hepatitis C virus
infection”, Journal of Virology, 81, pp.5036-5045.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
49
12.Alfonso V., Mbayed V.A., Sookozian S., Campos R.H. (2005), “Intra-host
evolutionary dynamies of hepatitis C virus E2 in treated patients”, Journal of
General Virology, 86, pp.2781-2786.
13.Alter M.J. (2007), “Epidemiology of hepatitis C virus infection”, World J
Gastroenterol, 13(17), pp.2436-2441.
14. Batey R.G. (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of
hepatitis C”, World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176.
15. Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K.,
Toida T., Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F.
(2003), “ Cellular Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires
cell surface heparin sulfate”, The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp.
41003-41012.
16. Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C.,
Rouille Y. (2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated
endocytosis”, Journal of Virology, 80(14), pp.6964-6972.
17. Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L. (2005), “ The
hepatitis virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the
alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift, and others”,
Seminars in liver disease 2005, 25(1), pp.105-117
18. Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David
H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D. (1992), “ The
declining risk of post-transfusion hepatitis C virus in fection”, The new England
Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373.
19. Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J.
(2002), “ Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs
posttranslationally in a mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
50
line”, Insttutde Biologie delille/ Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex,
France.
20. Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K.
(2010), “ Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptase-
loop-mediated isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology
Research, 4(23), pp.2580-2586.
21. Friebe P., Bartenschlager R. (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’
nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”,
Journal of Virology, 76(11), pp.5326-5338.
22. Friebe P., Boudet T., Simorre J.P., Bartenschlager R. (2005), “ Kissing-loop
interation in the 3’ end of the hepatitis C virus genome essential for RNA
replication”, Journal of Virology, 79(1), pp.380-392.
23. Fu Y., Wang Y., Xia W., Pybus O.G., Qin W., Lu L., Nelson K. (2011), “New treds of
HCV infection in China revealed by genetic analysis of viral sequences deter mined
from firt-time volunteer blood donors”, Journal of viral hepatitis, 18, pp.42-52.
24. Germer J.J., Rys P.N., Thorvilson., Persing D.H. (1999), “ Determination of hepatitis
C virus genotype by direct sequence analysis of products generated with the
amplicon HCV test”, Journal of Clinical Microbiology, 37(8), pp.2625-2630.
25. Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., Zhong J., Liao W., Chisari F.V. (2008), “
Cellular determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation and
seretion”, Journal of Virology, 82(5), pp.2120-2129.
26. Halfon P., Trimoulet P., Bourliere M., Khiri H., Deledinghen V., Couzigou P., Feryn
J.M., Alcaraz P., Renou C., Fleury H.J.A., Ouzan P. (2001), “ Hepatitis C virus
genotyping based on 5’ noncoding sequence analysis (Trugene)”, Journal of
Clinical Microbiology, 39(5), pp.1771-1773.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
51
27. Haqshenas G., Mackenrie J.M., Dong X., Gowans E.J. (2007), “ Hepatitis C virus p7
protein is localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a
replication-competent genome”, Journal of General Virology, 88, pp.134-142.
28. Helle F., Dubuisson J. (2008), “Hepatitis C virus entry into host cells”, Cellularand
Molecular Life Sciences, 65, pp. 100-112.
29. Honda M., Beared M.R., Ping L.H., Lemon S.M. (1999), “ A phylogenetically
conserved stem-loop structure at the 5’ border of the internal ribosome entry site of
hepatitis C virus is required for cap-independent viral translation”, Journal of
Virology, 83(2), pp.1165-1174.
30. Hotta H., Handajami R., Lusida M.I., Soemarto W., Doi H., Miyajama H., Homma
M. (1994), “ Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b
region sequences”, Journal of Clinical Microbiology, 32(12), pp.3049-3051.
31. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A.
(2003), “ Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of
pseudotyped retro viral particles”, 1230 York Avenue, New York.
32. James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A.,
Rettz M.D., Kenrad E. (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C
virus infection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373.
33. Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V. (2007), “ Initiation
of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between
CD81 and scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383.
34. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. (1996), “ Identification of a highly
conserved sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”,
Journal of Virology, 70(6), pp. 3363-3371.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
52
35. Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D.,
Neri B.P., deArruda M. (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in
the United States by Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of
Clinical Microbiology, 35(12), pp.3156-3162.
36. Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia
J. (1999), “ High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of
hepatitis C virus RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332.
37. Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierre-
louis S., Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R. (2004), “ Hepatitis C virus
(HCV) genotypes in the Caribbean island of martinique: evidence for a large
radiation of HCV for a recent introduction from Europe of HCV-4”, Journal of
Clinical Microbiology, 42(2), pp.784-791.
38. McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S.,
Medgyesi G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Al-
rasheed A.M. (1994), “ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in
blood donors : an international collaborative survey”, Journal of Clinical
microbiology, 32(4), pp.884-892.
39. Moradpour D., Cerny A., Heim M..H., Blum H.E. (2003), “ Hepatitis C: an update”,
Swiss Med Wkly, 131, pp.291-298.
40. Ndjomou J., Dybus O.G., Matz B. (2003), “ Phylogentic analysis of hepatitis C virus
isolates indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon”, Journal of
General Virology, 84, pp. 2333-2341.
41. Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., Lemey P., Markov P.V., Rasachak B., Syhavong
B., Phetsouvanah R., Sheridan I., Humphrey I.S., Lu L., Newton P.N., Klenerman
P. (2009), “ Genetic history of hepatitis C virus in East Asia”, Journal of Virology,
83(2), pp.1071-1082.
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
53
42. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E.,
Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S. (1993), “ Classification subtype by phylogenetic
analysis of the NS-5 rigion”, Journal of General Virology, 74, pp. 2391-2399.
43. Simmonds P. (2004), “Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years
on”, Journal of General Virology, 85, pp.3173-3188.
44. Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al. (2005), “ Consensus proposals for a unified
system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes”, Hepatology 2005, 42, pp.
962-973.
45. Song Y., Friebe P., Tzima E., Junemann C., Bartenschlager R., Niepmann M. (2006),
“ The hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region entry site”, Journal of Virology,
80(23), pp.11579-11588.
46. Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al. (2001), “ Evidence for a new hepatitis
C virus antigen encoded in an overlapping reading frame”, RNA 2001, 7, pp.710-
721.
47. Xu Z., Fan X., Xu Y., Bisceglie A.M.D. (2008), “ Comparative analysis of nearly
full-length hepatitis C virus quasispecies from patients experiencing viral break
through during antiviral therapy: clustered mutations in three functional genes,
E2,NS2 and NS5a”, Journal of Virology, 82(19), pp.9417-9424.
48. You S., Rice C.M. (2008), “ 3’RNA elements in hepatitis Cvirus replication: kissing
partners and long poly (U)”, Journal of Virology, 82(1), pp.184-195.
Trang web
49. http://www.drthuthuy.com
50. http://www.HepatologyTextbook.com
51. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
54
Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học
55
45-42,40,38-37,35,33,30,25-22,13,11,5-3
1-2,6-10,12,14-21,26-29,31-32,34,36,39,41,46-53