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INSTITUTO FEDERAL GOIANO CAMPUS URUTAÍ
ANDRESSA DE SOUZA ALMEIDA
Trabalho de Conclusão de Curso: ASPECTOS CULTURAIS, MORFOLÓGICOS E
MORFOMÉTRICOS DE Sordaria fimicola INCIDENTE EM FOLHAS DE CAPIM-MASSAMBARÁ (Sorghum arundinaceum)
URUTAÍ – GOIÁS 2016
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ANDRESSA DE SOUZA ALMEIDA
ASPECTOS CULTURAIS, MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS DE Sordaria fimicola INCIDENTE EM
FOLHAS DE CAPIM-MASSAMBARÁ (Sorghum arundinaceum)
Trabalho de conclusão de curso apresentado para obtenção do grau de Licenciada em Ciências Biológicas do Instituto Federal Goiano- Campus Urutaí.
Orientador: Prof. Dr. Milton Luiz da Paz Lima
URUTAÍ
2016
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema Integrado de Bibliotecas – SIBI/IF Goiano Campus Urutaí
F866e Almeida, Andressa de Souza.
Aspectos culturais, morfológicos e morfométricos de
Sordaria fimicola incidente em folhas de capim-massambará (Sorghum arundianaceum) / Andressa de Souza Almeida. -- Urutaí, GO: IF Goiano, 2016.
35 fls.
Orientador: Prof. Dr. Milton Luiz da Paz Lima.
Monografia (Graduação) – Instituto Federal Goiano -Campus Urutaí, 2016.
1. Etiologia. 2. Identificação. 3. Ascomicota. 4. Saprofitismo. 5. Patogenicidade. 6. Poaceae. 7. Taxonomia. 8. Identificação. 9. Caracterização. I. Título.
CDU 581.2
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ANDRESSA DE SOUZA ALMEIDA
ASPECTOS CULTURAIS, MORFOLÓGICOS E
MORFOMÉTRICOS DE Sordaria fimicola INCIDENTE EM FOLHAS DE CAPIM-MASSAMBARÁ (Sorghum arundinaceum)
Trabalho de Curso aprovado como
requisito parcial para a conclusão do
curso de Licenciatura em Ciências
Biológicas do Instituto Federal de
Educação, Ciências e Tecnologias
Goiano Campus Urutaí, pela banca
examinadora composta pelos membros a
seguir:
Prof. D.Sc. Milton Luiz da Paz Lima (IF Goiano Campus Urutaí)
Presidente da banca examinadora
Prof. D.Sc. Andre Luis da Silva Castro (IFGoiano Campus Urutaí)
Membro titular da banca examinadora
Eng. Agr. Mestranda Karoliny de Almeida Souza (IFGoiano Campus Urutaí)
Membro titular da banca examinadora
Data da defesa do Trabalho de Curso: 21 de dezembro de 2016.
v
Dedico...
À todos os meus familiares e
amigos, principalmente à
minha mãe, que fez tudo o que
pôde para que fosse possível
minha chegada até aqui.
vi
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente à Deus, pelo dom da vida e por todas as
bênçãos concedidas para que eu chegasse até aqui.
Ao Instituto Federal Goiano campus Urutaí, pelo uso de materiais de consumo
laboratoriais e estrutura física.
Aos meus pais, Leila R. de Souza e Hugo de Almeida, mas principalmente à
minha mãe e meu padrasto Lindomar Ribeiro, pois sem eles seria impossível que eu
completasse essa importante etapa.
Ao meu irmão Keybert Almeida, que sempre esteve presente quando precisei.
À minha prima Débora Rojas e ao seu marido José Luís Rojas, pois sempre que
precisei eles estenderam a mão.
Aos meus colegas de classe e também amigos, Marcos Costa, João Carvalho,
Eduardo de Alcântara, Lucinete Estrela, Edilana Ferreira, e tantos outros, pelo apoio,
compreensão, conselhos, e, a Lucinete em especial, pois esteve sempre disposta a me
ajudar.
À Jennifer Decloquement pela ajuda nas atividades do laboratório e no texto
escrito.
Ao meu professor e orientador Milton Luiz da Paz Lima, pela paciência, cuidado,
respeito e atenção, por toda a disposição, pois todas as vezes que precisei ele esteve
pronto para me ajudar, seja final de semana, feriado, madrugada, à qualquer hora, ele me
atendeu.
E também a todos os meus familiares, e amigos.
À todos os meus professores, desde à Nalva, que me alfabetizou, aos meus professores do
Ensino Fundamental, Eliane Pelosi, Nair Pacheco, e Hellen Simone; também à todos os
meus professores do Ensino Médio, que não citarei o nome pois são muitos, mas que sem
eles eu não teria chegado aqui; e por último, mas não menos importante, meus
professores do IF-Goiano. Muito Obrigada a todos vocês.
vii
"Para se ter sucesso, é necessário amar de verdade o que se faz. Caso contrário, levando em conta apenas o lado racional, você simplesmente desiste. É o que acontece com a maioria das pessoas." (Steve Jobs)
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SUMÁRIO AGRADECIMENTOS ...................................................................................................... vi LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... viii LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... viii LISTA DE ANEXOS ....................................................................................................... viii RESUMO ............................................................................................................................ 1 ABSTRACT ........................................................................................................................ 2 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 3 2. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 6
2.1. Teste biológico ......................................................................................................... 6 2.2. Teste fisiológico ....................................................................................................... 7 2.3. Caracterização morfológica e morfométrica do isolado. ......................................... 8
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 9 3.1. Teste biológico ......................................................................................................... 9 3.2. Teste fisiológico ..................................................................................................... 12 3.3. Caracterização morfológica e morfométrica do isolado. ....................................... 17
4. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 23 6. ANEXO ......................................................................................................................... 27
LISTA DE TABELAS Tabela 1. ............................................................................................................................ 13 Tabela 2. ............................................................................................................................ 18
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. ............................................................................................................................ 11 Figura 2. ............................................................................................................................ 16 Figura 3. ............................................................................................................................ 20 Figura 4. ............................................................................................................................ 21 Figura 5. ............................................................................................................................ 22
LISTA DE ANEXOS Anexo 1. ............................................................................................................................ 27 Anexo 2 ............................................................................................................................. 28 Anexo 3. ............................................................................................................................ 29 Anexo 4. ............................................................................................................................29
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RESUMO
ALMEIDA, A.S. Aspectos culturais, morfológicos e morfométricos de Sordaria fimicola incidente em folhas de capim-massambará (Sorghum arundinaceum). Trabalho de Conclusão de Curso, 2016.
O capim-massambará (Sorghum arundinaceum – Poaceae) é uma planta espontânea no Brasil que botanicamente assemelha-se ao sorgo cultivado, representando na natureza uma ampla relação biológica aos quais pode ter como consequência o reservatório biológico ou fonte de inóculo para surtos epidêmicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a fisiologia do crescimento, patogenicidade e identificar um isolado de Sordaria sp. incidente em manchas foliares de capim-massambará. Amostras de folhas capim-massambará (Urutaí, GO, 1/2016) apresentando sintomas de manchas foliares foram analisadas em microscópio estereoscópio, e em seguida submetidas a isolamento em meio de cultura. A partir deste isolado de Sordaria sp. oriundo de uma cultura pura, foram aplicados os seguintes testes: a) teste fisiológico – análise do crescimento micelial em meio de cultura ágar-água (AA), suco-de-tomate (ST), batata-dextrose-ágar (BDA), Neon (N) e nutriente-ágar (NA). b) Teste de patogenicidade – discos de micélio foram inoculados em folhas sadias sob regime de máxima saturação de umidade; e c) identificação – a morfologia e morfometria das estruturas reprodutivas. As maiores áreas abaixo da curva de progresso do crescimento micelial foram observadas em meio de cultura BDA e ST. O isolado em condições artificiais não expressou sintoma de mancha foliar em capim-massambará. O isolado apresentou peritécio gregário, semi-imerso em meio de cultura, sub-globoso, com organização celular reticulada, de dimensões 1946,3-(1351,0)-507,9 x 1131,4-(828,2)-86,4 µm, com ostíolo de diâmetro 413,85-(257,8)-123,8 µm; asca cilíndrica à clavada, unitunicada, com oito ascósporos, de dimensões de 195,0-(167,8)-135,6 x 21,8-(16,8)-9,1 µm; ascósporos apresentando dimensões de 29,7-(22,6)-13,7 x 14,9-(10,9)-1,6 µm. Com base nas características morfológicas e morfométricas o isolado foi identificado como sendo S. fimicola.
Palavras-chave: ascomycota, meio de cultura, identificação, taxonomia,
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ABSTRACT
ALMEIDA, A.S. Cultural media, morphological and morphometric aspects of Sordaria fimicola incident in Johnson grass leaves (Sorghum arundinaceum). Final Work, 2016.
Johnson grass is a spontaneous plant in Brazil that botanically resembles cultivated sorghum, representing a wide biological in nature for which may result in the biological reservoir or source of inoculum for epidemics. The objective of this study was to evaluate the physiology of growth, pathogenicity and identify an isolated Sordaria sp. coming from leaf spots of Johnson grass. Samples of leaves Johnson grass (Urutaí, GO, 1/2016) having leaf spot symptoms were analyzed in a stereoscopic microscope, and then subjected to isolation from the culture medium. From this isolated Sordaria sp. comes from a pure culture, the following tests were applied: a) physiological test - mycelial growth analysis in agar-water media (AA), juice-of-tomato media (ST), potato dextrose agar media (PDA) neon media (N) and nutrient agar media (NA). b) pathogenicity test - mycelial discs were inoculated in healthy leaves under maximum moisture saturation regime; and c) identification - the morphology and morphometric of reproductive structures. The largest areas below the mycelial growth progress curve were observed in the middle of BDA and media ST. Isolated in artificial conditions not expressed leaf spot symptoms in grass massambará; The isolate showed gregarious perithecium, semi-immersed in the culture medium, sub-globular, reticulated cellular organization, dimensions 1946,3- (1351,0) -507,9 x 1131,4- (828,2) -86,4 µm with diameter of ostiole 413,85- (257.8) -123.8 µm cylindrical asca to clavada, unitunicada with eight ascospores, dimensions of 195,0- (167.8) -135.6 x 21,8- (16.8) -9.1 µm ascospores presenting dimensions of 29,7- (22.6) -13.7 x 14,9- (10.9) -1.6 µm. Based on morphological and morphometric features the isolate was identified as S. fimicola.
Key-words: ascomycota, medium cultural, identification, taxonomy.
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1. INTRODUÇÃO
O capim-massambará ou sorgo selvagem (Sorghum arundinaceaum - Poaceae) é
uma planta espontânea no Brasil que botanicamente assemelha-se ao sorgo cultivado,
representando na natureza uma ampla relação biológica aos quais pode ter como
consequência o reservatório biológico ou fonte de inóculo para surtos epidêmicos.
Lorenzi e Matos (2008) apontaram que se trata de uma planta originária da África,
também conhecida como sorgo-selvagem ou falso-massambará, é uma planta daninha
e/ou infestante, mediamente frequente em quase todo o país. É uma planta anual ou
perene, herbácea, cespitosa, ereta, que infesta principalmente lavouras perenes, cafezais,
beira de estradas e terrenos baldios. É uma planta de introdução recente e que vem
aumentando em sua área infestada ano após ano. É ocasionalmente utilizada como
forrageira. Apresenta colmos com até 1 cm de diâmetro e entrenós de 18-20 cm de
comprimento, com 1,5-2,5 m de altura, propaga-se exclusivamente por meio de sementes.
É frequentemente confundida com o S. halepense, entretanto, este, é perene,
rizomatoso e de porte menor que o capim-massambará. Chiang et al. (1989) identificaram
quatro fungos fitopatogênicos capazes de controlar plântulas desta espécie espontânea de
sorgo.
Pelo fato de ser uma planta daninha pode hospedar patógenos, se não são, podem
apresentarem-se emergentes e bastante devastadores as lavouras cultivadas; As formas
sexuais de fitopatógenos representam a incidência de um ciclo com máxima variabilidade
e ampliação do potencial adaptativo de Sordaria sp.
O fungo Sordaria sp. é um ascomiceto que é muito encontrado causando
apodrecimento de vegetação e tecidos animais, e este gênero tem sido utilizado como
modelo para estudo de processos de troca cromossômica (“crossing-over”) devido suas
características reprodutivas. O gênero Sordaria é um fungo com ascósporos escuros e
apresenta uma superfície circundada por uma massa gelatinosa. Algumas vezes apresenta
uma parede fina, outras vezes de difícil observação. A espécie S. fimicola é uma das mais
importantes espécies pertencentes ao gênero (ALEXOPOULOS e MIMS, 1979).
Doguet (1960) apontou que o núcleo de algumas espécies iniciam o processo de
formação e do crescimento da hifa que se divide por mitoses típicas. E tem sido
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observado a presença de equinulações de 1,5 à 3 µm de comprimento que tem orientações
seguidas para vários sentidos de acordo com a largura da hifa. A espécie S. fimicola é um
fungo homotálico, que sua fase anamórfica produz tanto conídios quanto microconídios,
reproduz-se sexualmente através de ascósporos que são liberados através da abertura
ostiolar do peritécio.
Curiosamente foi apontado que detalhes do desenvolvimento do peritécio não
foram completamente elucidados, exatamente como a plasmogamia se desenvolve
(GREYS, 1936). Greys (1942) registrou o contato entre os gametângios representados
por ascogônios e anterídio, Ritchie (1937) e Carr e Olive (1958) demonstraram a fusão de
hifas entre dois isolados e a fusão nuclear de uma para outra. A provável somatogamia
opera como o principal método de reprodução sexual ou o simples contato entre os
gametângios e a produção de fungos periteciais pode ocorrer abundantemente quando
ocorre uma supressão de carboidratos tornando desfavorável o crescimento vegetativo
(ALEXOPOULOS e MIMS, 1979).
Em pH acima de 6 e a presença de biotina e tiamina, observou-se a produção de
peritécios e maturação de ascos. Contudo a concentração de biotina é pouca, com relação
ao estímulo à produção de peritécio de S. fimicola e outros ascomicetos formados.
Quando adultos pode ocorrer a supressão da formação de ascos, impedindo a formação de
ascósporos (ALEXOPOULOS e MIMS, 1979).
Há uma formação direta entre a formação de biotina e surgimento de ascósporos
produzidos (BARNETT e LILLY, 1947). O processo de liberação de ascósporos por
muitos ascomicetos e os fungos periteciais pertencentes ao gênero Sordaria sp. são
extremamente influenciados pela luz (INGOLD, 1953; INGOLD 1955; INGOLD 1956).
Os ascos maduros quando estão aptos, liberam estes ascósporos através da abertura
peritecial (ostíolo), alguns ascos são liberados pela abertura ostiolar (ALEXOPOULOS e
MIMS, 1979). Os ascósporos de Sordaria sp. não ficam confinados no peritécio, eles tem
um método de liberação que pode ser um padrão desenvolvido para vários membros
pertencentes a diferentes gêneros e famílias de ascomicetos. Muitos dos ascósporos são
liberados e germinam produzindo micélio em condições favoráveis (ALEXOPOULOS e
MIMS, 1979).
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Em trabalhos de citologia e genética para fungos homotálicos, tem sido observado
interessantes mutações em S. fimicola que produzem ascósporos laranja-acinzentados a
ascósporos marrons escuros (sendo observado em cepas selvagens). Estes mutantes
crescem junto aos selvagens, obtendo e produzindo peritécios com ascos heterotálicos,
contendo ambas as características (OLIVE, 1956).
E nesta monografia de Sordariaceae, Moreau (1953), reconheceu 4 espécies de
Sordarieaceae, todas homotálicas, todas com conídios e microconídios (forma
anamórfica). Olive e Fantine (1961) descreveram S. drevecolins como a primeira espécie
heterotálica, pertencente ao gênero, ao qual produz microconídios de funções sexuais e
macroconidióforos septados. Fields e Maniotis (1963) descreveram S. heterotalis, por
produzir ascósporos via heterotálica (sexual), gerando ascósporos funcionais e
microconidióforos septados (assexual). A espécie S. heterotalis se diferencia por
apresentar carbono na parede peritecial membranosa, e as três espécies heterotálicas, S.
drevecolens, S. heterotalis e S. esclerogenea, também podem produzir ascósporos que
foram descritos por Fields e Grear (1953). O fungo Sordaria sp. foi registrado em sorgo
(Sorghum sp.) no mundo somente por Swarup (1962) infectando sementes no Kansas
(EUA), não sendo reconhecido mais nenhum registro, inclusive no Brasil.
O uso de fungos para controle biológico e/ou uso como bioherbicida tem sido
bastante apontado em literatura pra diferentes espécies de invasoras de campos agrícolas
(FIGLIOLA et al., 1988; HETHERINGTON et al., 1966; TEMPLETON, 1982;
WASHERE, 1974; WINDER e van DYKE, 1990; ZHANG e WATSON, 1997a; ZHANG
e WATSON, 1997b; ZHANG e WATSON, 1997c; ZHANG et al., 1996).
O objetivo deste trabalho foi realizar uma análise comparativa de aspectos
biológicos, morfológicos e morfométricos de Sordaria sp. incidentes em folhas de capim-
massambará (Sorghum arundinaceum).
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2. MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras de folhas capim-massambará apresentando sintomas de manchas
foliares foram coletadas na cidade de Urutaí, GO. A partir deste isolado de Sordaria sp.
oriundo de folhas capim-massambará foi obtido uma cultura pura, que fora submetida aos
seguintes testes: a) teste de patogenicidade- para análise da patogenicidade sob expressão
de sintomas, foram inoculados discos de micélio em folhas com e sem ferimento; que
fora realizado de duas formas: i) inoculação de discos de micélio em 10 folhas, em
tratamentos com e sem ferimento, ii) inoculação de 104 suspensão de ascósporos.mL-1
pulverizados em folhas. A presença ou ausência de sintomas foi avaliada ao que
representa a patogenicidade do isolado. b) teste fisiológico – análise do crescimento
micelial em meio de cultura ágar-água (AA), suco-de-tomate (ST), batata-dextrose-ágar
(BDA), Neon (N) e nutriente-ágar (NA); e c) caracterização - a partir de registro
microfotográfico onde foram preparadas lâminas semipermanentes para registro e
morfometria das estruturas do patógeno; e por fim os dados morfológicos e
morfométricos foram comparados com os dados taxonômicos descritos em literatura.
2.1. Teste biológico
Foram inoculados discos de micélio em folhas com e sem ferimento para análise
da patogenicidade sob expressão de sintomas; O teste de patogenicidade em capim-
massambará foi realizado através de um cultivar de capim-massambará semeado em
laboratório, e depois do crescimento do cultivar foram retiradas 10 folhas sem ferimento
para o teste. As folhas foram submetidas à um processo chamado assepsia superficial,
que ocorre com esterilização das folhas superficialmente para a eliminação de outros
microrganismos que podem estar presentes na folha, o método consiste na borrifagem de
álcool etílico, hipoclorito de sódio (HClO) e três vezes de água destilada, depois as folhas
foram secadas com a utilização de um papel absorvente e colocadas em uma vasilha de
plástico com tampa. A vasilha com as folhas foram levadas para a câmara de fluxo,
devidamente esterilizada, as folhas foram furadas com a ajuda de uma pinça e estilete,
para facilitar a patogenicidade da folha, os discos de micélio foram inoculados sob estes
furos e por fim as folhas foram pulverizadas com água destiladas para ficarem em um
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ambiente úmido, a vasilha foi tampada e deixada dentro da câmara de crescimento por
sete dias, e após os sete dias os resultados foram analisados. Este teste foi repetido por
três vezes.
A partir de uma placa de Petri cultivada por um período de sete dias, adicionou-se
em cada placa por volta de 10 mL de água destilada estéril, pincelou-se a superfície da
cultura afim de que os ascósporos desprendessem. Essa suspensão foi filtrada com gaze, e
o filtrado foi depositado foi quantificado utilizando câmara de Neubauer, e a solução
diluída afim de que pulverizasse a suspensão de 104 ascósporos.mL-1, em folhas de
capim-massambará sadio, previamente submetido a assepsia. Apos a inoculação as
amostras de folha permaneceram em condições de saturação máxima de umidade por um
período de 10 dias. Esta metodologia adaptada pode ser observada em ALFENAS e
MAFIA (2007).
2.2. Teste fisiológico de crescimento cultural
Se deu através da observação de crescimento micelial através de discos de
micélio inoculados ao centro de placas de Petri contendo meio ágar-água (AA), suco-de-
tomate (ST), batata-dextrose-ágar (BDA), Neon (NE) e nutriente-ágar (NA). Que foi
repetido três vezes. Esta avaliação foi feita através da observação e medição do diâmetro
da temporal colônia.
Para esta etapa foram preparados 5 meios, com quantidade necessária para a
realização das 3 repetições: (AA) 10 g de ágar e 250 mL de água destilada; (ST) 250 mL
de água destilada, 62,5 mL de suco-de-tomate, 0,93 g de carbonato de cálcio, 5,6g de
ágar; (BDA) 50 g de batata descascada, 5 g de dextrose, 4 g de ágar, 300 mL de H2O
destilada; (NE) 25 mg de azul de bromofenol, 25 mg de cloranfenicol, 28 mg de mametol,
(NA) 7 g de ágar nutritivo, 250 mL de água destilada. Todos os solutos foram dissolvidos
na quantidade de água destilada necessária para cada receita (exceto no meio BDA em
que a batata foi cozida na água destilada e o meio fora preparado com o caldo da batata
proveniente deste cozimento) em um balão de fundo chato com tampa, e em seguida
colocados na auto-clave para a esterilização dos mesmos, na temperatura de 120 ºC por
20’, e depois de esfriarem foram levados para a câmara de fluxo esterilizada e colocados
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em placas-de-Petri, em seguida foram tampados e identificados e colocados na geladeira.
Após estarem secos foi adicionado um disco de micélio retirado da cultura pura do
Sordaria sp. oriundas das manchas foliares citadas anteriormente, e colocados sob os 5
meios, e foram inoculados os discos em dois exemplares de cada meio para uma melhor
precisão, e o crescimento fora medido com a utilização de uma régua todos os dias,
anotando as medidas diariamente até que as placas se completassem. Este teste foi
repetido por três vezes. As médias do diâmetro de colônia diário e taxa de crescimento
micelial (TC) em diferentes dias após a inoculação (DAI) foram transformadas por
√(x+10) e foram submetidas ao teste F e teste de comparação de media Skott Knott a
P~0.05.
2.3. Identificação e caracterização morfológica e morfométrica do isolado. As folhas de capim-massambará foram exsicatadas e analisadas em microscópio
estereoscópico. Utilizando pinça e estilete, propágulos do patógeno foram transferidos
para lâminas contendo fixador (2,6 mL ácido acético, 62,5 mL ácido lático, 100 mL de
glicerina e 100 mL de água destilada) diluído com azul-de-algodão, sendo esse processo
denominado “Pescagem direta”). Em seguida fragmentos de tecido contendo sinais do
patógeno foram recortados em formato retangular, depositados numa lâmina
microscópica e visualizado pelas oculares do microscópio estereoscópico com auxílio de
lâmina de barbear; cortes histológicos transversais foram realizados, e esses fragmentos
foram transferidos para lâminas microscópicas contendo fixador, em seguida foi
depositada uma lamínula, onde o excesso do fixador foi retirado, e a lâmina foi vedada à
lamínula com esmalte. O espécime fora levado para visualização em microscópio óptico
e fotodocumentado. As estruturas observadas no microscópio foram comparadas com
estruturas descritas.
O segundo procedimento utilizado foi o recorte entre fragmento de tecido entre a
região doente e sadia, e foi submetido a assepsia superficial (3´ em álcool [50 %], 3´ em
HClO [0,03 %], 3 vezes mergulho em água destilada). Em seguida os fragmentos foram
secos com papel mata borrão, e em seguida plaqueados em meio de cultura ágar água.
Após 48 horas de incubação à 25 oC discos de micélio foram repicados para meio de
cultura BDA, também sob incubação a 35 oC em fotoperíodo de 12h de luz por um
período de sete dias. A partir de registro microfotográfico foram preparadas laminas
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semipermanentes para registro e morfometria das estruturas do patógeno, onde as folhas
de capim-massambará foram exsicatadas e analisadas em microscópio estereoscópico. A
morfometria de 100 unidades representada pelas dimensões das estruturas reprodutivas
foram realizadas para peritécios (dimensões C x L [comprimento – C, e largura - L]),
asca (dimensões C x L [comprimento – C, e largura - L]) e ascósporos (dimensões C x L
[comprimento – C, e largura - L]), além dos aspectos morfológicos observados e
descritos (Tab. 2). Macro e microfotografias descritivas das características morfológicas
foram registradas para confecção de pranchas.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Teste biológico
Neste trabalho foi inoculado 104 ascósporos.mL-1 de Sordaria sp. em folhas de S.
arundinaceum Chandramohan e Charudattan (2011) inocularam uma mistura de fungos
representadas por Drechslera gigantea, Exserohilum longirostratum e E. rostratum, todos
agentes causais de helmintosporioses, na concentração maior de 2.105 esporos.mL-1 com
objetivos de agirem como bioherbicidas, sendo uma importante estratégia anti-resistência
a herbicidas para plantas daninhas. O isolado em condições artificiais obtido, não
reproduziu os sintomas descritos acima e pela Figura 1 de mancha foliar em capim-
massambará, mesmo após a repetição de três ensaios de inoculação, resultado contrário
ao de Chandramoham e Charudattan (2011), que detectaram três candidatos para uso
como bioherbicidas. Dentre um seleto e variado grupo de fungos S. fimicola foi relatada
em serapilheira nos EUA por BROW (1995).
Os sintomas inicialmente detectados na amostra submetida ao isolamento não
apresentavam sinais (Fig. 1) superficiais nos tecidos lesionados. Entre a região doente e
sadia – halos arroxeados (Fig. 1), recortada e submetida assepsia superficial para
isolamento que resultou no isolado de Sordaria sp. obtido. Antes do isolamento, as folhas
coletadas de capim-massambará apresentaram manchas arroxeadas, que representaram as
lesões iniciais e necrose partindo do ápice, seguido de rompimento do tecido denominado
de fendilhamento (Fig. 1A). As lesões naturalmente observadas apresentaram formas
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irregulares e alongadas (devido morfologia foliar) de coloração marrom pálea circundada
por halos arroxeados (Fig. 1BC) tanto na face abacial como adaxial.
Quanto a hipótese de não patogenificade em S. arundinacearum confirmada pelas
três inoculações confirmou-se as afirmações de Alexopoulos e Mims (1979) que ressaltou
que este gênero trata-se de um fungo saprófito, que cresce decompondo material orgânico,
podendo ser um candidato a processos de biorremediação de resíduo orgânico. Não se
tem registrado nenhum trabalho de uso S. fimicola como agente de degradação de
materiais vegetais com elevada relação C/N, somente para uso na agricultura visando
redução da aplicação de herbicidas. Cabe ressaltar que por um método de isolamento de
fungos fitopatogênicos em condições que desfavorecem saprófitos este organismo se
desenvolveu.
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Figura 1. Aspectos sintomatológicos de folhas de capim-massambará. A. Manchas arroxeadas, necrose apical foliar e fendilhamento, B. Lesões necróticas irregulares e alongadas, de coloração marrom pálea com halos arroxeados na face abaxial, C. Lesões irregulares alongadas com halos arroxeados na face abaxial, D. Detalhe da forma da lesão, E. Lesão inicial e final arroxeada.
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3.2. Teste fisiológico No primeiro dia após a inoculação a taxa de crescimento micelial não houve
diferença significativa no crescimento dos diferentes meios de cultura. Já no segundo dia
houve diferença significativa, sendo que o maior crescimento foi observado nos meios ST,
BDA, e no meio AA. Aos três dias após a inoculação, foi observado que o maior
crescimento ocorreu nos meios ST e BDA, diferindo estatisticamente dos demais meios,
ao quarto dia, foi observado que o meio ST e BDA promoveram um maior crescimento
micelial, diferindo estatisticamente, sendo observado que no meio NA que é um meio
específico para crescimento de bactérias este fungo cresceu com menor intensidade,
desenvolvendo menor quantidade de propágulo vegetativo, no quinto e sexto dia de
avaliação foi observado que os meios ST e BDA novamente promoveram um maior
crescimento micelial, diferindo dos demais. Ao sétimo dia o meio de cultura que
promoveu o maior crescimento micelial foi o ST e o BDA para o crescimento do
Sordaria sp. os meios que não seriam recomendados para o seu crescimento seriam os
meios AA, NE e NA. No oitavo e nono dia os melhores meios de crescimento foram
BDA e ST, e somente no nono dia de crescimento este gênero de fungo completou a
placa atingindo 90 cm de diâmetro de colônia.
Ao teste F (teste de hipótese) somente no primeiro dia de crescimento após a
inoculação não rejeitou-se a hipótese em unidade, havendo rejeição da hipótese de
unidade para o diâmetro de colônia nos diferentes meios de cultura, nos dias dois, três,
quatro, cinco, seis, sete, oito e nove rejeitou-se a hipótese de unidade. Ou seja, existe
diferença significativa das médias apresentadas na (Tab. 1) do diâmetro de colônia de
Sordaria sp. observado nos diferentes meios de cultura.
Não rejeitou-se apenas no primeiro dia de avaliação, os demais rejeitou-se a
hipótese de nulidade para a variável TC, ou sejas, existe diferença significativa das
médias da TC. A maior taxa de crescimento mm.dia-1 ocorreu nos meios de cultura BDA
e ST (Tab. 1).
13
Tabela 1. Médias do diâmetro do crescimento micelial em diferentes dias após a inoculação (DAI) e taxa de crescimento (TC) de Sordaria sp. submetida a crescimentos em diferentes meios de cultura (batata-dextrose-ágar [BDA], ágar-água [AA], Neon, suco de tomate [ST] e nutriente ágar [NA]).
Tipos de meios de cultura
1 DAI 2 DAI 3 DAI 4 DAI
BDA 7 a 16 a 32,5 a 48,0 a AA 3,75 a 17,5 a 24 b 36,3 b Neon 0 a 0 b 0 d 0,0 d ST 2,25 a 15,5 a 30,75 a 46,0 a NA 2,5 a 2,5 b 16 c 32,0 c Valor F F4,5= 8,56ns F4,5= 77,28** F4,5= 232,83** F4,5= 883,71** CV % 4,88 3,59 2,35 1,4
Tipos de meios de cultura (Cont.)
5 DAI 6 DAI 7 DAI
BDA 55,5 a 69,3 a 72,3 a AA 27,0 c 39,5 c 63,0 b Neon 0,0 d 0,0 d 0,0 c ST 54,3 a 67,8 a 76,0 a NA 40,0 b 49,5 b 55,5 b Valor F F4,5= 508,87** F4,5= 559,02** F4,5= 362,11** CV % 2,0 2,0 2,5
Tipos de meios de cultura (Cont.)
8 DAI 9 DAI TC (mm.dia-1)
BDA 80,5 a 90,0 a 9,7 a AA 67,8 b 73,5 b 8,5 b Neon 0,0 c 0,0 d 0,0 d ST 85,5 a 90,0 a 10,3 a NA 60,5 b 61,0 c 7,6 c Valor F F4,5= 328,43** F4,5= 854,58** F4,5= 625,05** CV % 2,7 1,7 0,75
14
As maiores curvas de crescimento micelial foram observadas nos meios ST e
BDA (Fig. 2). Estes meios apresentam maiores concentrações de C e N, elementos
essenciais importantes para a nutrição e desenvolvimento micelial (TORTORA et al.,
2000). Hall (1971) estudou aos invés dos tipos de meios mais propícios aos crescimento
estudou taxas de uso de C e N e seus efeitos no progresso do crescimento micelial de S.
fimicola. A próxima e maior curva de crescimento observada foi encontrada no meio AA
(ágar-água), um meio sem nutriente, e que normalmente é utilizado como seletivo para
organismos saprofíticos em isolamentos de fitopatógenos (AGRIOS, 1997), em que se
busca fungos endofíticos parasitários.
Conceitualmente Sordaria sp. é considerado um fungo saprofítico
(ALEXOPOULOS e MIMS, 1979), e este seria favorecido em meios de cultura ricos em
C e N, havendo pouco crescimento em meios de cultura pobres, o que não foi observado
pela curva que aponta as medias de crescimento micelial em AA (Fig. 2). As formas
sexuadas como do grupo dos ascomicetos crescem e esporulam melhor em meios pobres,
pois são estimulados por essa condição adversa a produzirem esporos com variabilidade
genética para suportarem essa adversidade do substrato. As fases assexuadas do ciclo ou
a formação de micélio é mais frequente em meios de cultura ricos em C e N, havendo
pouca formação para alguns gêneros inclusive de conídios assexuais (BERGAMIN
FILHO et al., 1995; BLUM et al., 2006).
Neste ensaio o meio de cultura NE (Neon) utilizado para detecção de Sclerotinia
sclerotiorum não permitiu o crescimento de Sordaria sp. provavelmente porque este
ascomiceto não produz nas condições artificiais o acido oxálico como descrito por
Napoleão et al. (2006), pois mudaria da cor azul para um halo amarelo mesmo com
mínimo desenvolvimento micelial (Fig. 2). A respeito do meio de cultura NA clássico
para crescimento bacteriano promoveu a menor curva de crescimento, provavelmente
porque os componentes presentes no meio de cultura favorecem o crescimento de
bactérias e não fungos (Fig. 2).
15
16
Figura 2. Curvas de crescimento micelial do isolado de Sordaria sp. oriundo de manchas foliares de campim-massambará em diferentes meios de cultura.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-1 1 3 5 7 9 11
Diâ
met
ro d
a co
lôni
a (m
m)
Dias de incubação
Meio de Cultura BDA Meio de cultura AA Meio de Cultura Neon Meio de Cultura ST Meio de Cultura NA
17
3.3. Caracterização morfológica e morfométrica do isolado.
Caracterização de Sordaria sp. (teleomorfo): o isolado obtido em meio de
cultura BDA apresentava micélio flocoso, pouco elevado de coloração acinzentada (Fig.
4AB), peritécio globoso, cônico a piriforme, imerso no substrato, gregário, semi-imerso
no meio de cultura (Fig. 4AB), desenvolveu tecido estromático liso e reticulado (Fig. 4I),
com dimensões de 1946,3-(1351,0)-507,9 x 1131,4-(828,2)-86,4 µm, base arredondada, o
ostíolo apresentou dimensões de 413,85-(257,8)-123,8 µm, o rostro algumas vezes
ausente (Fig. 4CFG), constricto ou conóideo (Fig. 4DE), alongado (Fig. 4HJ), espesso e
curvo. A asca unitunicada (Fig. 5AB), cilíndrica (Fig. 5B) à clavada, rostrada, região
apical truncada hialina (Fig. 5AB) (liberação de ascósporos); com 8 ascósporos por asca,
apresentou dimensões de 95,0-(167,8)-135,6 x 21,8-(16,8)-9,1 µm. Os ascósporos
apresentaram forma elipsoide à ovóide (Fig. 5CDEF), com pouca variação morfológica,
unisseriados na asca, apresentou dimensões de 29,7-(22,6)-13,7 x 14,9-(10,9)-1,6 µm, de
coloração marrom-oliváceo a enegrecido (Fig. 5CDEF), não apresentava ornamentação
nem septação, foi observado uma fenda longitudinal de centro oleoso com núcleo hialino
(Fig. 5EF).
18
Tabela 2. Comparação do isolado de Urutaí (2016) reconhecido e identificado com espécies descritas mais próximas do isolado (nd. não determinado).
Características morfológicas
Isolado Urutaí (2016)
S. fimicola Roberge ex Desm. Ces.& De Not.
(1963)
S. macrospora – Auersw. (1866)
Index Fungorum (2016a)
Index Fungorum (2016b)
Peritécio
Forma globoso, cônico a piriforme sub-globoso globoso
Imersão no substrato semi-imerso (1/5- 1/4) nd
Agregação gregário gregário ndForma do tecido estromático membranáceo à
coriáceo membranáceo
Dimensões (µm)1946,3-(1351,0)-507,9 x 1131,4-
(828,2)-86,4nd nd
Diâmetro do ostíolo (µm)
413,85-(257,8)-123,8 nd nd
Forma do rostroausente ou
conóideo, espesso e curvo
conóideo, espesso e curvo cônico a reto
Asca
Forma cilíndrica e rostrada cilíndrica e rostrada tabulóide de ápice retuso-truncado
Dimensões (µm)195,0-(167,8)-135,6 x 21,8-
(16,8)-9,1100-150 x 14-16 280-360 x 160-180
Ascósporos Forma elipsóide a ovóide ovóide ndNúmero por asca 8 nd 8Organização unisseriada nd unisseriada
Dimensões (µm) 29,7-(22,6)-13,7 x 14,9-(10,9)-1,6 17-20 x 10-12 36-28 x 16-18
Coloração marrom-oliváceo marrom-oliváceo
Presença de ornamentação
ausente, presença de fenda
longitudinal e de núcleo oleoso com
centro hialino
núcleo oleoso com centro hialino nd
19
As características morfométricas do comprimento (C) e largura (L) do peritécio
(Fig. 3AB), o C do peritécio variou de 1000 µm a 1600 µm, e o L do peritécio variou
700-1100 µm. estas foram as amplitudes mais frequentes observadas na população. Estes
não apresentam distribuição normal, o C e L são tendenciosos e sua variação desqualifica
como característica taxonômica deste isolado de Sordaria sp. oriundo de isolamento em
meio de cultura. A partir da amostra analisada observou-se que na asca não apresentou
Distribuição Normal, o C e L. Apresentou amplitudes variáveis de C de 155 µm até 175
µm, a L de 16 µm até 22 µm (Fig. 3CD). As dimensões dos ascósporos apresentaram
Distribuição Normal com amplitudes mais frequentes do C entre 18 à 26 µm, e largura de
9 à 14 µm (Fig. 3EF). O diâmetro do ostíolo apresentou Distribuição Normal com
amplitude ocorrendo entre 160 a 300 µm de diâmetro (Fig. 3G).
A possibilidade de investigação de Sordaria sp. como um possível decompositor
de material orgânico de S. arundinaceum pode ser uma estratégia de aplicação e uso. Para
as espécies S. bicolor (sorgo comercial) e S. halepense bastante cultivada (a primeira) e
infestante nos campos de produção (segunda) brasileiros, foi utilizado o uso dos fungos
Drechslera gigantea, Exserohilum longistratum e E. rostratum como agentes de controle
de biológico desta planta espontânea nos EUA (CHANDRAMOHAM e
CHARUDATTAN, 2011)
O fungo Sordaria sp. foi encontrado em condições extremas na antártica por
Pearce et al. (2012). Outro extremo de temperatura foi reconhecido por Kiage (2009) em
solos do Quênia.
20
Figura 3. Análise de frequência de dimensões de Sordaria sp. A. Comprimento do peritécio; B. Largura do Peritécio; C. Comprimento da asca; D. Largura da asca; E. Comprimento do Ascósporo; F. Largura do Ascósporo; G. Abertura do ostíolo.
21
Figura 4. Aspectos morfológicos da cultura e do peritécio de Sordaria sp. isolada de folhas de capim-massambará (Sorghum arundinaceum). A. Cultura micélio flocoso, pouco elevado de coloração acinzentada; B. Detalhe da superfície micelial do peritécio em cultura demonstrando elevação do rostro; C. Peritécio de rostro curto e formato cilíndrico e base arredondada; D. Peritécio de base arredondada e rostro constrito; E. Rostro enegrecido de base arredondada de forma clavada; F. Peritécio de base arredondada, superfície lisa, rostro pouco evidente; G. Peritécio de corpo alongado, rostro pouco evidente; H. Peritécio de base elíptica ovóide e rostro proeminente e alongado; I. Superfície do tecido peritecial formando células angulares enegrecidas; J. Vários peritécios de forma elíptica e rostro proeminente.
22
Figura 5. Aspectos morfológicos da asca e ascósporos de Sordaria sp. isolada de folhas de capim-massambará (Sorghum arundinaceum). A. Ascas unitunicadas contendo conjuntos de oito ascósporos; B. Detalhe da asca contendo sete ascósporos com detalhe na região apical truncada hialina de liberação de ascósporos; C. Ascósporos de formato elíptico enegrecido; D. Detalhe dos ascósporos de forma elíptica com pouca variação morfológica; E. Ascósporos de coloração marrom, em microscopia de contraste de fase de forma elíptica e enegrecida; F. Detalhe dos ascósporos apresentando na região mediana uma gútula transparente.
23
4. CONCLUSÕES
O isolado de Sordaria obtido de folhas de capim-massambará não foi patogênico
e virulento em testes artificiais de inoculação em folhas tanto pelo método de disco de
micélio como solução de ascósporos.
O meio de cultura ideal para crescimento micelial deste isolado foi ST e BDA.
Com base nas características morfológicas e morfométricas o isolado foi
identificado como sendo S. fimicola sensu Roberge.
As medias de Comprimento e Largura dos ascósporos e o diâmetro do ostíolo,
representaram os valores mais confiáveis para fins taxonômicos.
Este é o primeiro registro de ocorrência de Sordaria sp. em uma espécie de sorgo
no Brasil.
24
5. LITERATURA CITADA - Revista de Agricultura Neotropical.
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27
6. ANEXO
Anexo 1. Listagem de espécies de Sordaria sp. e informações morfológicas e morfométricas de estruturas reprodutivas utilizadas para comparação (Fonte: INDEX FUNGORUM, 2017).
28
Anexo 2. Descrição original de Sordaria fimicola (INDEX FUNGORUM, 2017a).
29
Anexo 3. Descrição original de Sordaria macrospora (INDEX FUNGORUM, 2017b).
30
Anexo 4. Normas de publicação da Revista de Agricultura Neotropical. Diretrizes para Autores
Forma e preparação de manuscritos
O trabalho submetido à publicação deverá ser cadastrado no portal da revista https://periodicosonline.uems.br/index.php/agrineo. O cadastro deverá ser preenchido apenas pelo autor correspondente que se responsabilizará pelo artigo em nome dos demais autores.
Só serão aceitos trabalhos depois de revistos e aprovados pela Comissão Editorial, e que não foram publicados ou submetidos em publicação em outro veículo. Excetuam-se, nesta limitação, os apresentados em congressos, em forma de resumo.
Os trabalhos subdivididos em partes 1, 2..., devem ser enviados juntos, pois serão submetidos aos mesmos revisores. Solicita-se observar as seguintes instruções para o preparo dos artigos.
Pesquisa envolvendo seres humanos e animais obrigatoriamente deve apresentar parecer de aprovação de um comitê de ética institucional já na submissão.
Não existem taxas de sumbissão ou de publicação na Revista de Agricultura Neotropical. Todo o processo é realizado gratuitamente.
Composição sequencial do artigo
a) Título: no máximo com 15 palavras, em letras maiúsculas, negrito e centralizado;
b) Os artigos deverão ser compostos por, no máximo, 5 (cinco) autores;
c) Resumo: A palavra “resumo” deve ser escrita em letras maiúsculas, negrita e justificada. O texto do resumo se inicia após a palavra “resumo” e deve ter no máximo com 15 linhas;
d) Palavras-chave: A “palavra-chave” deve ser escrita em letras maiúsculas, negrita e justificada. As palavras-chave, no mínimo três e no máximo cinco, não constantes no Título e separadas por vírgula, escrita em letras minúscula;
e) Título em inglês: escrito em letras maiúsculas, no máximo com 15 palavras, em letras maiúsculas, negrito e centralizado; devendo ser tradução fiel do título.
f) Abstract: no máximo com 15 linhas, devendo ser tradução fiel do Resumo;
g) Key words: no mínimo três e no máximo cinco;
31
h) Introdução: destacar a relevância do artigo, inclusive através de revisão de literatura;
i) Material e Métodos;
j) Resultados e Discussão;
k) Conclusões devem ser escritas de forma sucinta, isto é, sem comentários nem explicações adicionais, baseando-se nos objetivos da pesquisa;
l) Agradecimentos (opcional);
m) Referências Bibliográficas;
Outras informações
Quando o artigo for escrito em inglês, o título, resumo e palavras-chave deverão também constar, respectivamente, em português.
Os itens INTRODUÇÃO; MATERIAL E MÉTODOS; RESULTADOS E DISCUSSÃO; CONCLUSÕES; REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS devem ser justificados e com letras maiúsculas, em Negrito.
Os trabalhos devem ser escritos em Português ou Inglês. Os trabalhos devem ser apresentados em até 20 páginas. O texto deve ser editado em Word for Windows (tamanho máximo de 2MB, versão docx) e digitado em página tamanho A-4 (210 mm x 297 mm), com margens de 2,5 cm, em coluna única e espaçamento 1,5 entre linhas. A fonte tipográfica deve ser Times New Roman, número 12, para todos os itens e informações no arquivo. Usar tabulação de parágrafo de 1,25 cm.
As figuras deverão estar em programas compatíveis com o WINDOWS, como o EXCEL, e formato de imagens: Figuras (GIF ou TIFF) e Fotos (JPEG) com resolução de 300 dpi. As Tabelas e Figuras devem estar inseridas no texto e não no final do trabalho. As chamadas das Tabelas e Figuras no texto iniciam-se com Letra Maiúscula (Exemplos: Tabela 1; Tabela 2; Figura 1; Figura 2 etc).
A redação dos trabalhos deverá apresentar concisão, objetividade e clareza, com a linguagem no passado impessoal;
Para Notas Científicas a estrutura do trabalho é a mesma do artigo científico e o máximo de 10 páginas no envio do trabalho.
As informações apresentadas no trabalho são de responsabilidade exclusiva de seus autores, bem como a exatidão das referências bibliográficas, ainda que reservado aos editores o direito de proceder a ajustes textuais e de adequação às normas da publicação.
32
As citações no corpo do texto devem ser feitas de acordo com a norma ABNT, NBR 10520/2002. Exemplos: Com um autor: Soares (2009) ou (SOARES, 2009); Com dois autores, usar Pereira e Farias (2008) ou (PEREIRA; FARIAS, 2008); Com três ou mais autores, usar Martins et al. (2009) ou (MARTINS et al., 2009). Citações de citação devem ser evitadas;
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No item REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, serão relacionadas todas as obras bibliográficas citadas no texto, em ordem alfabética. Normas para referência (ABNT NRB 6023, Ago. 2002). Complemento à norma: texto justificado e não alinhado à esquerda; todos os autores devem constar nas referências e não et al.; Os destaques para títulos devem ser apresentados em negrito e os títulos de periódicos não devem ser abreviados.
OBS.: NÃO EXISTEM TAXAS DE PROCESSAMENTO NEM DE SUBMISSÃO DOS ARTIGOS.
Alguns exemplos são apresentados a seguir:
ARTIGO DE PERIÓDICO
AUTOR (es). Título do artigo. Título do periódico, local de publicação, v., n., p., ano.
Exemplo:
REISSER JÚNIOR, C.; BERGAMASCHI, H.; RADIN, B.; BERGONCI, J. I. Alterações morfológicas do tomateiro em resposta redução de radiação solar. Revista Brasileira de Agrometeorologia, Santa Maria-RS, v. 11, n. 1, p. 7-14, 2007.
ARTIGO DE PERIÓDICO EM MEIO ELETRÔNICO
AUTOR(es). Título do artigo. Título do Periódico, cidade, v., n., p., ano. Disponível em:<endereço eletrônico>. Acesso em: dia mês (abreviado). ano.
Exemplo:
REISSER JÚNIOR, C.; BERGAMASCHI, H.; RADIN, B.; BERGONCI, J. I. Alterações morfológicas do tomateiro em resposta redução de radiação solar. Revista Brasileira de
33
Agrometeorologia, Santa Maria-RS, v. 11, n. 1, p. 7-14, 2007. Disponível em <http://www.sbagro.org.br/rbagro/ojs/index.php/rbagro>. Acesso em: 12 dez. 2010.
AUTOR(es). Título do artigo. Título do Periódico, local de publicação, v., n., p., ano. CD-ROM
Exemplo:
REISSER JÚNIOR, C.; BERGAMASCHI, H.; RADIN, B.; BERGONCI, J. I. Alterações morfológicas do tomateiro em resposta redução de radiação solar. Revista Brasileira de Agrometeorologia, Santa Maria-RS, v. 11, n. 1, p. 7-14, 2007. 1 CD-ROM.
LIVRO
AUTOR(es). Título: subtítulo. edição (abreviada). Local: Editora, ano. p. (total ou intervalo parcial)
Exemplo:
KÄMPF, A. N.; FERMINO, M. H. Entomologia agrícola: informações atuais sobre os insetos de importância agrícola. 4. ed. Porto Alegre-RS: Gênesis, 2006. 645 p.
Obs. Quando for a primeira edição não precisa colocá-la.
LIVRO EM MEIO ELETRONICO
AUTOR(es). Título. Edição (abreviada). Local: Editora, ano. p. (total ou intervalo parcial). Disponível em: <endereço eletrônico>. Acesso em: dia mês (abreviado). ano.
Exemplo:
KÄMPF, A. N.; FERMINO, M. H. Entomologia agrícola: informações atuais sobre os insetos de importância agrícola. 4. ed. Porto Alegre-RS: Gênesis, 2006. 645 p. Disponível em: <www.culturabrasil.pro.br/download.htm>. Acesso em: 12 dez. 2010.
AUTOR (es). Título. Edição (abreviada). Local: Editora, ano. p. CD-ROM
Exemplo:
KÄMPF, A. N.; FERMINO, M. H. Entomologia agrícola: informações atuais sobre os insetos de importância agrícola. 4. ed. Porto Alegre-RS: Gênesis, 2006. 645 p. 1 CD-ROM.
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CAPÍTULO DE LIVRO
AUTOR(es). Título do capitulo. In: AUTOR(es) do livro. Título: subtítulo. Edição (abreviada). Local: Editora, ano. intervalo das páginas do capítulo.
Exemplo:
MINAMI, K. Pragas das culturas agrícolas, frutíferas, florestais, hortaliças e ornamentais. In: KÄMPF, A. N.; FERMINO, M. H. Entomologia agrícola: informações atuais sobre os insetos de importância agrícola. 4. ed. Porto Alegre-RS: Gênesis, 2006. p. 147-152.
CAPÍTULO DE LIVRO EM MEIO ELETRONICO
AUTOR(es). Título do capitulo. In: AUTOR(es) do livro. Título: subtítulo. Edição (abreviada). Local: Editora, ano. intervalo das páginas do capítulo. Disponível em: <endereço eletrônico>. Acesso em: dia mês (abreviado). ano.
Exemplo:
MINAMI, K. Pragas das culturas agrícolas, frutíferas, florestais, hortaliças e ornamentais. In: KÄMPF, A. N.; FERMINO, M. H. Entomologia agrícola: informações atuais sobre os insetos de importância agrícola. 4. ed. Porto Alegre-RS: Gênesis, 2006. p. 147-152. Disponível em: <www.culturabrasil.pro.br/download.htm>. Acesso em: 12 dez. 2010.
AUTOR(es). Título do capitulo. In: AUTOR(es) do livro. Título: subtítulo. Edição (abreviada). Local: Editora, ano. intervalo das páginas do capítulo. 1 CD-ROM
Exemplo:
MINAMI, K. Pragas das culturas agrícolas, frutíferas, florestais, hortaliças e ornamentais. In: KÄMPF, A. N.; FERMINO, M. H. Entomologia agrícola: informações atuais sobre os insetos de importância agrícola. 4. ed. Porto Alegre-RS: Gênesis, 2006. p. 147-152. 1 CD-ROM.
BOLETIM TÉCNICO / CIRCULAR TÉCNICA / DOCUMENTOS
Exemplo 1.
OLIVEIRA, A. M. G.; SOUZA. L. F. S.; RAIJ, B. V.; MAGALHÃES, A. F. J.; BERNARDI, A. C. C. Nutrição, calagem e adubação do mamoeiro irrigado. Cruz das Almas-BA: Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, 2004. 10p. (Circular Técnica 69).
Exemplo 2.
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BEZERRA, F. C. Diferentes espaçamentos para o cultivo da mandioca. Fortaleza-CE: Embrapa Agroindústria Tropical, 2003. 19 p. (Documento 72).
AUTOR CORPORATIVO
IBGE. IINSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Estado@. Lavoura permanente 2008: Maracujá. Brasília-DF: IBGE, 2008. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/estadosat/temas.php?sigla=df&tema=lavourapermanente2008. Acesso em: 16 mai. 2014.
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