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Ⅰ．はじめにCD4

＋CD25

＋Foxp3

＋制御性 T細胞（Treg）は自己応答性 T細胞の活性化を制御し，免疫寛容を維持する上で必須の T細胞サブセットである。Tregのマスター遺伝子Foxp3 の異常により Tregが欠損すると，免疫寛容が得られず IPEX症候群（X-linked immune

dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked，X染色体連鎖免疫制御異常多発性内分泌障害消化器受付日：平成 27 年 6 月 29 日　受理日：平成 27 年 9 月 29 日

関西医科大学内科学第一講座

制御性 T細胞選択的増幅メカニズムを利用した免疫疾患制御へのアプローチ－新たな急性GVHD治療法開発の試み－

佐竹　敦志

Therapeutic approach to immune-mediated diseases by utilizing the regulatory T cell selective expansion mechanism

- The challenge for developing a novel treatment against acute graft-versus-host-disease -

Atsushi Satake M.D.,Ph.D.

First Department of Internal Medicine, Kansai Medical University, Osaka, Japan

AbstractStrategies to expand regulatory T cells (Treg)s hold therapeutic potential for ameliorating T cell-mediated infl ammatory

diseases. TCR signaling is partially dispensable for IL-2-induced Treg proliferation, as has been shown recently. In contrast, conventional T cells (Tconv)s require TCR signal activation for their proliferation. Therefore, we can expect that in conjunction with IL-2, pharmacological inhibition of TCR signaling may induce the expansion of Tregs while simultaneously inhibiting Tconv proliferation. We hereby demonstrate that costimulation but not TCR-mediated phospholipase Cγ (PLCγ) activation is required for the IL-2-induced Treg proliferation. Using Cyclosporine A (CSA) to inhibit TCR signaling and rapamycin to suppress costimulatory signaling pathways, we also demonstrate that while both agents attenuated antigen-specifi c Tconv proliferation, only CSA permitted IL-2-induced Treg expansion. Rapamycin, however, did increase the Treg:Tconv ratio due to its negative effects on Tconv survival. Importantly, CSA synergized with IL-2 in protection against experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). However, CSA abolished whereas rapamycin augmented the beneficial effect of IL-2 in graft-versus-host disease (GVHD). These differences could be potentially explained by the ability of rapamycin to promote inducible Treg generation and to allow TCR-enhanced Treg proliferation, processes that were inhibited by CSA but are important for GVHD protection. Thus, depending on the disease setting, different signaling pathways need to be targeted to increase the Treg:Tconv ratio for treatment of T cell-mediated infl ammatory disorders.

Key words : Regulatory T cell, IL-2, T cell receptor, GVHD, EAE

総　説

Selective expansion of Tregs and acute GVHD

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病）患者や Scurfyマウスで見られるような重症の自己免疫病が発症する 1）2）。その他にも，Tregは多くの生理的，病的な免疫応答の制御において重要な役割を果たしている 3）。

Tregによる免疫抑制作用は自己免疫反応に対してのみならず，非自己抗原を標的とした同種免疫においても発揮されることが分かっている 4）5）。同種造血幹細胞移植は主として造血器悪性疾患に対する根治的治療法であるが，移植片対宿主病（GVHD）はドナー由来の免疫細胞によって引き起こされる重大な合併症である。GVHDは重症化すると致死的となるほか，GVHDを制御するために使用する免疫抑制剤の大量投与は日和見感染症や，ドナー由来免疫細胞による抗腫瘍効果を減弱させてしまう危険性がある。マウスモデルを用いた基礎研究の結果から Tregは GVHDに対しても抑制効果を持つことが示されており 5），Treg

の免疫抑制作用を利用した GVHD治療への応用が期待されている。Tregによる GVHD治療の方法としては，体外増幅した Tregを輸注する方法と，体内でTregを増幅させる方法が考えられる。しかし，Treg

は in vitroでの増殖効率が悪く，凍結保存も困難であることから，必要時に十分な Tregを安定して得られない可能性があり，体外増幅による治療運用には課題がある。一方，生体内で免疫促進的に働く他の免疫細胞を増殖・活性化させること無く，同種抗原応答性のTregを選択的に増幅させることが出来れば，効果的に GVHDを抑制する事ができると考えられる。本稿では，Tregの選択的増幅に必要なメカニズム

について得られた知見と，急性 GVHDモデルに加え自己免疫疾患モデルでの Tregによる疾患制御の試みを紹介する。

Ⅱ．同種造血幹細胞移植後の Treg プール通常生体内の Tregは，胸腺内での分化・成熟段

階の過程で Foxp3を獲得した naturally occurring Treg

（nTreg）と，末梢組織で naive T細胞（CD4＋

CD25＋

Foxp3－）から Foxp3を獲得して Tregとなる inducible

Treg （iTreg）から構成されていると考えられている 6）。同種造血幹細胞移植後の Tregプールもこの両者から構成されていることが推測されるが，その比率やそれぞれが GVHD抑制に果たす役割は解明されていない。これらは移植後の時期やカルシニューリン阻害薬の使用等により影響を受ける可能性があるが，マウス急性GVHDモデルを用いた検討では免疫抑制剤を使用しない条件下で，移植後早期の Tregプールは，nTregと

iTreg（iTregには CD4＋

iTregと CD8＋

iTregが混在）がほぼ同比率で存在し （Fig. 1），さらに両者共に GVHD

抑制効果を持つ事が分かっている 7）。このことから，急性 GVHD抑制を目的とした Treg選択的増幅を目指す場合，nTregあるいは iTregに関わらず Tregが増幅されれば，GVHD抑制効果が期待出来ると考えられる。

Ⅲ．Treg の維持・増幅メカニズムマウスを用いた基礎研究により，定常状態では

Tregの維持・増殖には樹状細胞（DC）などの抗原提示細胞上の MHCクラスⅡ（MHCⅡ）から T細胞受容体（TCR）を介する刺激や，IL-2が重要であることが示されている 8）9）10）。この IL-2の供給源は通常 T

細胞（Tconv：CD4＋

Foxp3－）であるが，TCRシグナ

ル経路の PLCγのリン酸化が不可能な T細胞あるいは MHCⅡ KOマウスを用いた実験から，DC存在下でIL-2が供給される場合，DCからの共刺激シグナルがあれば，Tregの増殖は大部分維持されることが明らかとなった 11）12）13）。すなわち，Tregの増殖には TCR

シグナル活性化は必要不可欠ではないことが解明されている（Fig. 2）。一方，Tregに比較し Tconvの増殖には共刺激シグナ

ルだけではなく，強力な抗原刺激による TCRシグナル活性化を必要とする。これらの違いから，PLCγ以下の活性化阻害と IL-2供給を同時に行うことで，Tconvの活性化を抑制しつつ Tregだけを選択的に増幅させることが出来る可能性が考えられた。

Ⅳ．薬剤による Treg 選択的増幅と自己免疫疾患上述した Tregと Tconv活性化における PLCγ活性

化への依存度の違いから，薬剤によって PLCγ以下のシグナル活性化を阻害しながら IL-2投与を行えば，Tconvの活性化・増殖を抑制しながらTregを増幅でき，より強い免疫抑制効果を得られることが期待される。実際，PLCγより下流にあるカルシニューリンの阻害薬であるシクロスポリン A（CSA）を加え，IL-2存在下で Tregを DCと共培養した場合，Treg増殖はほとんど抑制されなかった。一方，共刺激シグナルの主たるシグナル経路である AKT-mTOR経路を阻害するmTOR阻害薬（ラパマイシン：Rapa）を使用した場合，Tregの増殖は著明に抑制されたため Treg増殖における mTOR活性化の重要性が示唆された （Fig. 3A, B）。尚，AKT-mTOR経路は DCからの共刺激シグナルだけでなく IL-2シグナルの下流にも含まれ，Rapaはこの経路も阻害すると考えられるが，Tregの維持・増

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Figure 1　nTreg and iTregs contribute equally to the total Treg pool during GVHD.GFP+ Tregs （CD4+ and CD8+） were sorted from CD45.1+ Foxp3.GFP mice （H-2b） and mixed with GFP－ Tconvs （CD4+ and CD8+） sorted from CD45.2+ Foxp3.GFP mice （H-2b）. The T cells were combined with T cell‒depleted BM （H-2b） and injected into irradiated CD45.1/CD45.2 heterozygous B6D2F1 mice （H-2bxd）．Representative FACS plots of splenocytes harvested on day 8 after BMT are shown. The plots are gated on donor-derived Foxp3+ T cells （left plot） （host cells are also gated out by CD45.1/CD45.2 double positivity）, CD8+Foxp3+ T cells （top plot） and CD4+ Foxp3+T cells （bottom plot）. （文献７より一部改変し引用）

Figure 2　Interactions among DCs, Tconvs, and Tregs.IL-2-induced Treg proliferation occurs MHC class II/TCR and costimulatory molecule-dependent manner in the steady state （top）. Exogenous IL-2 signals can induce Treg proliferation in an MHC class II/TCR-independent manner （bottom）.

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殖には IL-2シグナル経路のうち AKT-mTOR経路とは別経路に存在する STAT5の活性化が重要であることが示されている 12）14）。従って，Rapaの作用は Tregの増殖に必要な IL-2シグナルの阻害によるものではないと考えられる。抗原特異的 TCRを持つ T細胞を輸注した野生型マウスに抗原を投与し，CSAと IL-2の単独投与または併用投与を行った in vivoの実験でも，CSAと IL-2の併用は抗原特異的 Tconvの増殖を抑制しながら Tregを増殖させることが示されている 15）。一方，Rapaは Tregの増殖を促進しなかったものの，Tconvの細胞数を減らすことで相対的に Treg比率を増加させた。さらに，多発性硬化症モデル（Experimental

autoimmune encephalomyelitis：EAE）に対して CSAと

IL-2を併用投与した場合，Tregの増殖が誘導され，疾患発症に関わる IFN-γや IL-17産生性 Tconv細胞数が減少する。CSA，IL-2の単独投与と併用投与した場合の EAE重症度を未治療群と比較すると，CSA，IL-2

いずれも単独投与で重症度改善効果が得られるのに対して，併用投与した場合，その効果に相乗作用が得られることが分かっている 15）。

Ⅴ．同種造血幹細胞移植でのCSA/IL-2 併用療法それでは GVHDに対しても CSA，IL-2併用療法は

有効であるのであろうか。この解答を見出すために，MHC不一致の急性 GVHDモデル（C57/BL6 → BDF1）を用いて，IL-2と CSA又は Rapaを併用し各々の単独

Figure 3　CSA permits and rapamycin inhibits IL-2-induced Treg division.（A）Schema of TCR and costimulation signaling pathway. CSA inhibits a signaling pathway downstream of PLCγ. Rapa inhibits mTOR downstream of costimulation signaling pathway. （B）Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester （CFSE）-labeled FACS-sorted Tregs were co-cultured with syngeneic DCs with IL-2 in the presence of CSA （100 ng/ml） or Rapa （10 ng/ml）. Representative histograms gated on Tregs treated with or without CSA （100 ng/ml） or Rapa （10 ng/ml） are shown.AKT: AKT8 virus oncogene cellular homolog, DAG: Diacylglycerol, Erk: Extracellular signal-regulated kinase, IP3 : inositol trisphosphate, mTOR: Mammalian target of rapamycin, NFAT: Nuclear factor of activated T cells, NF-kB: Nuclear factor κ B, PI3K: Phosphoinositide 3 kinase, PIP2 : Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate, PIP3 : Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PKCθ: Protein kinase C-theta

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療法と GVHD抑制効果や T細胞に与える影響を比較検討した（Fig. 4A）。その結果，予想に反して CSAとIL-2の併用投与は GVHD抑制に相乗効果が見られなかっただけでなく，GVHDを増悪させたため全てのマウスが死亡した（Fig. 4B）。CSAと IL-2の併用群では，Tregの増殖は nTreg，iTreg共に阻害され，T細胞中の割合，細胞数共に低下していた （Fig. 5A-F）。これに対して，Rapaは過去に報告されていたように IL-2との併用により Tregを増幅させ GVHD重症度改善に相乗効果が見られた 16）17）。

CSAと IL-2の併用が急性 GVHDを増悪させた要因を調べるために，Foxp3-GFP reporterマウスをドナーに用いて移植後の nTreg，iTregの比率や絶対数の解析を行ったところ，CSAの併用は nTreg，iTreg共に減少させていることが明らかとなった。CSA，Rapa

共に Tregの Tcov増殖抑制機能に関しては影響を与えなかったため，CSA併用は Tregの増殖を抑制するこ

とで GVHDを増悪させた可能性が示唆された。一方，Syngeneic移植（B6 → B6）では，CSAと IL-2の併用は IL-2単独投与と同等の Treg増殖効果を示したことから，前処置後のリンパ球減少や前処置により惹起される組織障害と炎症等は Tregの増殖抑制には関係しないことがわかった 16）。定常状態や自己免疫疾患のような場合，CSAによ

る TCRシグナルの活性化阻害は IL-2投与によって補完されTreg増殖は維持される。この時Tconvの活性化・増殖は抑制されるため，結果的に強い免疫抑制を誘導できる。しかし，急性 GVHDモデルにおいては Treg

の選択的増幅，GVHDの抑制効果は見られなかった16）。このことから，病原となる抗原が自己抗原であるのか，非自己抗原であるのかによって Treg増殖メカニズムにおける TCRシグナルの重要性に違いがあると考えられる。

Figure 4　CSA abolishes while Rapa keeps the benefi cial eff ect of IL-2 ICs in protection against acute GVHD.（A）Schema of the experiments. B6 splenocytes and T cell-depleted BM cells were injected into irradiated BDF1 mice. The mice were treated with either vehicle （PBS）, CSA （25mg/kg） or Rapa （0.5mg/kg） for 5 days （days 0-4） with or without concomitant IL-2 ICs （1.5μg/mouse） for 3 days （days 0-2）. （B）GVHD score are plotted over days post transplant. Two independent experiments were combined with a total of n=8 or 10 mice/group. *p<0.05 by ANOVA with Tukey’s post hoc test. BMT: Bone marrow transplantation

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Ⅵ．おわりにIL-2投与により Treg増殖を誘導する場合，病因と

なっている標的抗原に応じた併用薬剤を選択することは，Treg増幅による免疫抑制効果を最大限得る上で重要である。しかしながら，同様のことがマイナー抗原不一致の同種造血幹細胞移植により生じる急性GVHDや，自己免疫疾患に類似する慢性 GVHDの場合にも当てはまるかは不明である。実際，難治性慢性GVHDに対する IL-2投与は Tregを増加させて GVHD

を軽減させることが報告されているが 18），これらの症例のうち約半数がカルシニューリン阻害薬の投与を受けていた。以上のことから同種造血幹細胞移植後のTreg増幅機構には炎症病態，併用薬や MHCの不一致など，様々な要因が複合的に関与して影響を及ぼしている可能性が考えられる。今後のさらなる研究により，GVHDを含む様々な疾患ごとの Treg増殖機構が解明され，Treg選択的増幅による新たな細胞療法が確立されることが期待される。

利益相反本論文発表内容に関連して特に申告なし。

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Figure 5　CsA suppresses while Rapa promotes pre-existing donor-derived Treg expansion and iTreg generation during GVHD.GFP－Tconvs （CD4+ and CD8+） and GFP+CD4+Tregs were FACS-sorted from CD45.1+Foxp3 GFP-reporter mice and CD45.2+Foxp3 GFP-reporter mice, respectively, combined with T cell-depleted BM cells （CD45.2+）, and injected into irradiated B6D2F1 mice. Host mice were treated as shown in Figure 3. Eight days after BMT, donor Tregs in the spleen were analyzed by fl ow cytometry. （A） The percentage and （B） absolute number of pre-existing donor nTregs, （C） the percentage and （D） absolute number of CD4+iTregs, （E） the percentage and （F） absolute number of CD8+iTregs are plotted as mean ± SEM of n=5‒6 mice/group from two independent experiments. *p<0.05; **p<0.001 by two-tailed Student t test compared with the group treated with IL-2 ICs.　（文献 15 より引用）

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