TCVN

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A

TCVN 8400-6:2011

Xuất bản lần 1

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN –

PHẦN 6: BỆNH XUẤT HUYẾT THỎ

Animal disease – Diagnostic procedure – Part 6: Rab bit haemorrhagic disease

HÀ NỘI – 2011

TCVN 8400-6:2011

3

Lời nói ñầu

TCVN 8400-6:2011 ñược chuyển ñổi từ 10 TCN 725:2006 thành tiêu

chuẩn quốc gia theo quy ñịnh tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn

và Quy chuẩn kỹ thuật và ñiểm a khoản 1 Điều 7 Nghị ñịnh số

127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy ñịnh chi tiết thi

hành một số ñiều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;

TCVN 8400-6:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát

triển nông thôn ñề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng

thẩm ñịnh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8400-6:2011

4

TCVN 8400-6:2011

5

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN 8400-6:2011

Bệnh ñộng vật – Quy trình ch ẩn ñoán –

Phần 6: Bệnh xu ất huy ết thỏ

Animal disease – Diagnostic procedure – Part 6: Rabbit haemorrhagic disease

CẢNH BÁO – Vi ệc áp dụng tiêu chu ẩn này có th ể liên quan ñến các v ật li ệu, thi ết b ị và các thao

tác gây nguy hi ểm. Tiêu chu ẩn này không th ể ñưa ra ñược hết tất cả các vấn ñề an toàn liên

quan ñến vi ệc sử dụng chúng. Các phòng thí nghi ệm sử dụng tiêu chu ẩn này ph ải tự thi ết lập

các nguyên t ắc bảo ñảm an toàn sinh h ọc ñể không ph ải b ị nhi ễm bệnh ngh ề nghi ệp hoặc thất

thoát các m ầm bệnh từ phòng thí nghi ệm ra môi tr ường.

1 Phạm vi áp d ụng

Tiêu chuẩn này quy ñịnh quy trình chẩn ñoán bệnh xuất huyết thỏ ñối với thỏ ở mọi lứa tuổi.

2 Thuật ngữ và ñịnh ngh ĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và ñịnh nghĩa sau:

Bệnh xu ất huy ết thỏ (Rabbit haemorrhagic disease)

Bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Calici thuộc họ Caliciviridae gây ra cho thỏ ở mọi lứa tuổi (ñặc biệt

ñối với thỏ 2 tháng tuổi trở lên). Bệnh có biểu hiện là gây chết nhanh và xuất huyết nặng ở gan, khí

quản, phổi,

3 Thuốc thử và vật li ệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần hoặc nước ñã ñược khử

khoáng hoặc nước có ñộ tinh khiết tương ñương, trừ khi có quy ñịnh khác.

Xem Phụ lục A về mô tả tất cả các dung dịch thuốc thử.

TCVN 8400-6:2011

6

– Cồn 70 %.

– Kháng huyết thanh chuẩn xuất huyết thỏ.

– Kháng nguyên chuẩn xuất huyết thỏ.

4 Thiết b ị, dụng cụ và ñộng vật thí nghi ệm

4.1 Thiết b ị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm và cụ thể sau ñây:

– Tủ lạnh.

– Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt ñộ 37 oC, 5 % CO2.

– Cân phân tích.

– Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt ñộ từ 100 0C ñến 200 oC.

– Nồi hấp ướt.

– Nồi ñun cách thủy.

– Buồng cấy.

– Máy ly tâm lạnh, tốc ñộ tối ña 3000 r/min.

– Máy ly tâm lạnh, tốc ñộ tối ña 12000 r/min.

– Máy khuấy từ, thanh khuấy từ.

– Máy lắc ñĩa 96 giếng làm phản ứng ngưng kết.

– Micropipet ñơn kênh cỡ từ 0,5 µl ñến 10 µl, 1 µl ñến 20 µl, 20 µl ñến 200 µl, 100 µl ñến 1000 µl.

– Micropipet ña kênh cỡ từ 5 µl ñến 50 µl.

– Đầu tip phù hợp với các loại micropipet (có lọc và không có lọc).

– Đĩa phản ứng 96 giếng, ñáy chữ U.

– Máy ñọc ELISA.

– Bộ ñồ mổ tiểu gia súc.

TCVN 8400-6:2011

7

– Ống nghiệm vô trùng, dung tích 10 ml.

– Giá ñựng ống nghiệm.

– Ống effendorf chắt huyết thanh, dung tích 1,5 ml.

– Ống effendorf, dung tích 0,2 ml.

– Ống hút Pasteur.

– Pipet khắc ñộ 1 ml, 5 ml, 10 ml.

– Pipet.

– Bơm tiêm loại 1 ml, 5 ml và kim tiêm.

– Lọ ñựng bệnh phẩm 20 ml.

– Bộ cối chày sứ.

– Đĩa lồng Petri

– Panh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm.

– Đèn cồn hoặc ñèn ga.

– Bình nón 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml.

– Hộp nhuộm tiêu bản.

– Hộp giữ ẩm cho lam kính.

– Giấy nhôm bao gói.

– Bộ micropipet và ñầu hút.

– Bông cồn.

– Giấy dán nhãn.

– Bút dạ ghi nhãn.

– Bút chì mỡ ghi lam kính.

4.2 Động vật thí nghi ệm

Chuẩn bị thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, không bị bệnh.

TCVN 8400-6:2011

8

5 Cách ti ến hành

5.1 Chẩn ñoán lâm sàng

5.1.1 Đặc ñiểm d ịch t ễ

Bệnh xuất huyết thỏ lây truyền do tiếp xúc trực tiếp giữa thỏ khỏe mạnh và thỏ bị nhiễm bệnh qua các

chất bài tiết, chất thải như phân, nước tiểu, thức ăn và các vật dụng nuôi nhốt, quần áo...

Vi rút xuất huyết thỏ lây truyền qua không khí.

Thỏ bị bệnh có tỷ lệ chết cao từ 80 % ñến 100 %.

Thỏ bệnh trở thành vật mang trùng và có thể ñào thải vi rút ra ngoài môi trường trong vòng 4 tuần sau

khi khỏi bệnh.

5.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Bệnh xuất huyết thỏ có thời gian ủ bệnh từ 1 ngày ñến 3 ngày.

Thỏ non thường cảm nhiễm với bệnh mạnh nhất, thỏ bị bệnh sẽ chết ñột ngột hàng loạt trong vòng 6 h

ñến 24 h mà không biểu hiện triệu chứng.

Đối với thỏ mắc bệnh, lúc ñầu có biểu hiện sốt cao (40,5 0C) nhưng khó phát hiện, chỉ khi thỏ có các

triệu chứng thì mới nhận ra ñược thỏ bệnh.

Thỏ mắc bệnh có biểu hiện chán ăn, ñờ ñẫn, co giật, khó thở, ít vận ñộng, chảy máu mũi và thường bị

chết sau 18 h ñến 40 h.

5.1.3 Bệnh tích

5.1.3.1 Lấy mẫu

Lấy vô trùng gan, thận thỏ nghi mắc bệnh ñể kiểm tra bệnh tích ñại thể, vi thể. Bảo quản và xử lí mẫu

theo 5.2.1.

5.1.3.2 Bệnh tích ñại thể

– Tổ chức dưới da bị xuất huyết ñiểm.

– Gan, thận, lách của thỏ bệnh sưng to, xung huyết, xuất huyết.

– Hệ hô hấp xung huyết, xuất huyết và chứa nhiều bọt khí, dịch nhầy.

– Viêm dạ dày cata, viêm ruột xuất huyết, hạch màng treo ruột sưng to.

TCVN 8400-6:2011

9

5.1.3.3 Bệnh tích vi th ể

Các tế bào gan hoại tử, trong phế nang và tiểu cầu thận có nhiều cục huyết khối.

5.2 Chẩn ñoán phòng thí nghi ệm

5.2.1 Lấy mẫu

Lấy vô trùng gan, thận thỏ nghi mắc bệnh ñể phát hiện kháng nguyên.

Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh chẩn ñoán thỏ mắc bệnh ñược lấy sau khi thỏ có triệu chứng lâm sàng

tối thiểu là 10 ngày trở ñi ñối với thỏ chưa ñược tiêm phòng bệnh xuất huyết thỏ, hoặc sau từ 3 tuần

ñến 4 tuần ñối với thỏ ñã tiêm phòng bệnh xuất huyết thỏ ñể phát hiện kháng thể. Lấy từ 5 mẫu ñến

10 mẫu huyết thanh.

Mẫu ñược lấy ngay sau khi mổ khám, ñựng vào lọ hoặc túi nilon sạch có dán nhãn có ghi ngày lấy

mẫu, ñịa ñiểm lấy mẫu, chủ vật nuôi, lứa tuổi.

Mẫu ñược bảo quản ở nhiệt ñộ từ 4 0C ñến 8 0C và gửi ñến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt,

chậm nhất là 48 h và có kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm.

5.2.2 Phát hi ện kháng nguyên

5.2.2.1 Xử lý bệnh ph ẩm

Cho dung dịch PBS pH 6,4 vào cối sứ có gan hoặc thận thỏ nghi mắc bệnh với tỷ lệ 9:1.

Nghiền nát gan hoặc thận thành huyễn dịch 1/10, ly tâm huyễn dịch với tốc ñộ 3000 g trong thời gian

30 min.

Thu dịch nổi, xử lý vô trùng bằng dung dịch kháng sinh ñậm ñặc (Phụ lục A) liều lượng 0,1 ml /10 ml

huyễn dịch, ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có ñường kính 0,45 µm. Huyễn

dịch bệnh phẩm ñã xử lý dùng ñể chẩn ñoán phát hiện vi rút bằng các phản ứng HA, HI, phân lập vi rút

trên bản ñộng vật hoặc phản ứng RT-PCR (Phụ lục D), ELISA.

5.2.2.2 Phản ứng ng ưng kết hồng cầu người typ O (xem Ph ụ lục B)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA) dùng phát hiện vi rút trong mẫu bệnh phẩm, cho huyễn

dịch ñã xử lý kết hợp với hồng cầu người typ O 0,75 % trên ñĩa nhựa chữ U và dung dịch ñệm PBS có

pH 6,4.

Vi rút xuất huyết thỏ làm ngưng kết hồng cầu người typ O.

Phản ứng ngưng kết xảy ra ở ñộ pha loãng lớn hơn hoặc bằng 1/160 ñược kết luận là dương tính.

TCVN 8400-6:2011

10

5.2.2.3 Phản ứng ng ăn trở ngưng kết hồng cầu người typ O (xem Phụ lục C)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI) dùng ñể giám ñịnh vi rút xuất huyết thỏ hoặc

kiểm tra kháng thể kháng vi rút xuất huyết thỏ trong huyết thanh.

Chuẩn bị kháng nguyên: Huyễn dịch bệnh phẩm dương tính theo 5.2.2.2 ñược pha 8 ñơn vị HA.

Thực hiện phản ứng HI với hồng cầu người 2,5 % và dung dịch ñệm phosphat pH 6,4. Đọc kết quả

sau 1 h.

– Mẫu dương tính: có ngăn trở ngưng kết hồng cầu (thường ñạt hiệu giá từ 1/20 ñến 1/80).

– Mẫu âm tính: không có ngăn trở ngưng kết hồng cầu.

5.2.2.4 Phân l ập vi rút

5.2.2.4.1 Cách ti ến hành

Tiêm bắp huyễn dịch bệnh phẩm cho 3 thỏ, mỗi con với liều 1 ml huyễn dịch. Theo dõi triệu chứng,

bệnh tích thỏ ñược tiêm bệnh phẩm trong vòng 5 ngày ñến 7 ngày.

Nếu bệnh phẩm có vi rút, thỏ sẽ có triệu chứng lâm sàng như miêu tả trong 5.1.2, thỏ chết mổ khám sẽ

thấy bệnh tích giống như miêu tả trong 5.1.3. Sau ñó thu hoạch gan, thận và xử lý theo 5.2.2.1.

Làm phản ứng ngưng kết hồng cầu người typ O (Phụ lục C) và giám ñịnh vi rút các mẫu dương tính

HA bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu typ O với kháng thể kháng vi rút xuất huyết thỏ chuẩn

như trong 5.2.2.3 ñể kết kuận.

5.2.2.4.2 Đánh giá k ết quả

– Nếu phản ứng HA và HI dương tính, có vi rút xuất huyết thỏ trong bệnh phẩm.

– Nếu kết quả HA dương tính và HI âm tính, có thể có vi rút xuất huyết thỏ nhưng lượng vi rút ít nên

tiếp tục phân lập lần 2 lặp lại như mô tả (5.2.2.4.1).

– Nếu kết quả HA âm tính và HI âm tính, kết luận trong mẫu bệnh phẩm không có vi rút xuất huyết thỏ.

5.2.2.5 Phát hiện kháng nguyên b ằng ph ương pháp ELISA

Sử dụng huyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1) hoặc huyết thanh của thỏ ốm ñể tiến hành thực hiện phản

ứng. Khi sử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2.2.6 Phát hi ện kháng nguyên b ằng ph ương pháp PCR

Sử dụng huyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1), tiến hành chiết tách RNA và nhân gen ñể chẩn ñoán sự có

mặt của vi rút. Khi sử dụng kít chiết tách và nhận gen, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

TCVN 8400-6:2011

11

5.2.3 Phát hi ện kháng th ể

5.2.3.1 Nguyên t ắc

Sử dụng huyết thanh của thỏ ốm ñể chẩn ñoán bệnh xuất huyết thỏ khi chưa tiêm phòng, hoặc nhiễm

vi rút xuất huyết thỏ từ trước ñó. Cũng có thể kiểm tra hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vacxin xuất

huyết thỏ.

5.2.3.2 Phản ứng ng ăn trở ngưng kết hồng cầu người nhóm O

a) Xử lý huyết thanh làm HI ñể phát hiện kháng thể xuất huyết thỏ:

– Vô hoạt bổ thể ở 56 0C trong 30 min.

– Xử lý với dung dịch kaolin 25 % (Phụ lục A) trong 20 min ở nhiệt ñộ phòng theo tỷ lệ 1 phần huyết

thanh với 9 phần dung dịch kaolin 25 %, ly tâm 1500g trong 10 min sau ñó thu dịch nổi.

– Xử lý với hồng cầu người typ O: Cho 1 phần hồng cầu người typ O ñậm ñộ 50 % và 9 phần dịch nổi

ở trên. Lắc ñều ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 20 min, ly tâm 1500g trong 10 min, thu dịch nổi ñể làm HI.

Huyết thanh ñã xử lý có hiệu giá ban ñầu là 1/10.

b) Tiến hành phản ứng HI (xem Phụ lục C)

– Phát hiện kháng thể Xuất huyết thỏ bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu người typ O với

kháng nguyên chuẩn xuất huyết thỏ,

– Hiệu giá kháng thể ñược tính ở ñộ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ngăn trở

ngưng kết hồng cầu.

– Mẫu huyết thanh có hiệu giá lớn hơn hoặc bằng 1/80 ñược ñánh giá là dương tính ñối với thỏ nghi

bệnh chưa tiêm phòng,

5.2.3.3 Phương pháp ELISA phát hi ện kháng th ể

Sử dụng mẫu bệnh phẩm là huyết thanh của thỏ ốm.

Khi sử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6 Kết luận

Thỏ ñược xác ñịnh mắc bệnh xuất huyết thỏ khi có các ñặc ñiểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, giải

phẫu bệnh tích của bệnh xuất huyết thỏ và kết quả dương tính với một trong những phương pháp sau:

– Phản ứng ngưng kết hồng cầu người typ O (HA) và phản ứng ngăn trở hồng cầu người typ O (HI)

dương tính hoặc phản ứng RT-PCR hoặc rRT-PCR dương tính.

– Phát hiện thấy kháng thể trong trường hợp chưa tiêm vacxin xuất huyết thỏ.

TCVN 8400-6:2011

12

Phụ lục A

(Quy ñịnh)

Thành ph ần và chu ẩn b ị dung d ịch thu ốc thử

A.1 Dung d ịch kháng sinh ñậm ñặc

Penicillin 106 IU

Streptomycin 1 g

Mycostatin 5 x 105 U

Polymixin 15 x 104 U

Kanamycin 1 g

Nước 10 ml

Lắc ñều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc cỡ 0,45 µl và bảo quản ở âm 20 0C.

A.2 Dung d ịch mu ối ñệm phosphat (PBS) pH 7,2

Natri clorua (NaCl) 8,5 g

Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4) 1,15 g

Kali dihydrophosphat (KH2PO4) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước 1000 ml

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 30 min.

Giữ trong tủ mát ở 4 0C ñến 8 0C trong 2 tuần.

A.3 Dung d ịch PBS pH 6,4

NaCl 8,5 g

Na2HPO4 2,53 g

TCVN 8400-6:2011

13

KH2PO4 6,66 g

Nước 1000 ml

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 30 min.

Giữ trong tủ mát ở 4 0C ñến 8 0C trong 2 tuần.

A.4 Dung d ịch PBS pH 9,0

Axit boric 3,092 g

NaOH 0,96 g

NaCl 7,012 g

Nước 1200 ml

Hấp vô trùng ở 121 oC trong 30 min.

Giữ trong tủ mát ở 4 0C ñến 8 0C trong 3 tháng.

A.5 Dung d ịch hồng cầu người typ O 0,75 %

Hồng cầu người typ O rửa sạch: 0,75 ml

Dung dịch PBS pH 6,4: 100 ml

Lắc ñều, giữ trong tủ mát ở 4 0C ñến 8 0C. Pha dùng trong ngày.

A.6 Dung d ịch hồng cầu người typ O 2,5 %

Hồng cầu người typ O rửa sạch: 2,5 ml

Dung dịch PBS pH 6,4: 100 ml

Lắc ñều, giữ trong tủ mát ở 4 0C ñến 8 0C. Pha dùng trong ngày.

A.7 Dung d ịch kaolin 25 %

Bột kaolin 10 g

Dung dịch PBS pH 9,0 40 ml

Lắc ñều, giữ trong tủ mát ở 4 0C ñến 8 0C trong 3 tháng.

TCVN 8400-6:2011

14

Phụ lục B

(Quy ñịnh)

Kỹ thuật làm ph ản ứng ng ưng k ết hồng c ầu người typ O

B.1 Nguyên li ệu

– Hồng cầu người typ O 0,75 % (A.5)

– Huyễn dịch bệnh phẩm 10 % trong PBS pH 6,4 (hoặc kháng nguyên chuẩn xuất huyết thỏ)

– Dung dịch PBS pH 6,4 (A.3)

B.2 Trình t ự tiến hành ph ản ứng

Dùng ñĩa ngưng kết 96 giếng, ñáy chữ U

Cho 25 µl PBS pH 6,4 từ giếng 1 ñến giếng 12.

Cho 25 µl huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý 10 % trong PBS hoặc kháng nguyên chuẩn vào giếng 1.

Pha loãng kháng nguyên: Trộn ñều huyễn dịch hoặc kháng nguyên với PBS ở giếng 1, hút 25 µl

chuyển sang giếng 2 trộn ñều, hút 25 µl chuyển sang giếng 3 trộn ñều, tiếp tục làm như vậy ñến giếng

11, hút bỏ 25 µl ở giếng 11. Giếng 12 chỉ có PBS ñể làm ñối chứng hồng cầu.

Cho hồng cầu người 0,75 % vào mỗi giếng 25 µl, lắc nhẹ trên máy lắc 1 min. Để ñĩa phản ứng ở nhiệt

ñộ phòng. Đọc kết quả sau 30 min ñến 60 min.

– Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm.

– Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống ñáy tạo thành chấm tròn.

Hiệu giá ngưng kết HA ñược tính ở ñộ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện ngưng kết hoàn

toàn. Ví dụ: giếng cuối cùng còn có ngưng kết hoàn toàn ở cột 8, hiệu giá HA = 1/256 (hay 8 log2).

TCVN 8400-6:2011

15

Giếng Các bước

Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

PBS, µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Pha loãng kháng nguyên

xuất huyết thỏ

Kháng nguyên huyễn

dịch bệnh

phẩm, µl

25 Trộn ñều, chuyển 25 µl lần lượt từ giếng 1 ñến giếng 11 rồi hút bỏ 25 µl. 0

Hồng cầu

0,75 %, µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Cho

hồng cầu

người typ O

Độ pha loãng kháng nguyên

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048

B.3 Nhận ñịnh kết quả

– Nếu HA dương tính: Kết luận có vi rút gây bệnh. Để xác ñịnh là vi rút xuất huyết thỏ cần phải làm

phản ứng HI với kháng huyết thanh dương tính chuẩn xuất huyết thỏ.

– Nếu phản ứng HA âm tính: Có thể trong bệnh phẩm không có mặt vi rút xuất huyết thỏ hoặc lượng

vi rút quá ít. Vì vậy, cần tiêm truyền bệnh phẩm trên thỏ 3 tháng tuổi không có kháng thể kháng vi rút

gây bệnh xuất huyết thỏ và giám ñịnh lại bằng phương pháp HA, HI.

TCVN 8400-6:2011

16

Phụ lục C

(Quy ñịnh)

Kỹ thuật làm ph ản ứng ng ăn trở ngưng k ết hồng c ầu người typ O

C.1 Chuẩn b ị

– Dung dịch PBS pH 6, 4 (A.3)

– Hồng cầu người typ O 2,5 % (A.6)

– Huyết thanh kiểm tra (hoặc kháng huyết thanh chuẩn xuất huyết thỏ) ñược xử lý theo 5.2.3.1.

– Kháng nguyên chuẩn (hoặc huyễn dịch bệnh phẩm cần kiểm tra xuất huyết thỏ)

– Kháng nguyên dùng cho phản ứng HI ñược pha 8 ñơn vị HA.

C.2 Cách pha và chu ẩn ñộ kháng nguyên 8 ñơn v ị HA

VÍ DỤ: Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng HA là 1/256 thì 8 HA bằng 1/256 x 8 = 1/32

Pha 8 HA gồm 1 phần kháng nguyên và 31 phần PBS pH 6,4.

Chuẩn ñộ kháng nguyên 8 HA ñã pha bằng phản ứng HA. Nếu kết quả ngưng kết ñến giếng thứ 3, như

vậy kháng nguyên pha ñạt. Nếu ngưng kết ñến giếng thứ 4 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha ñặc. Nếu

ngưng kết chỉ ở giếng ñầu tiên hoặc giềng thứ 2 là kháng nguyên pha loãng. Dựa vào kết quả ñó ñể bổ

xung thêm kháng nguyên hoặc PBS ñể có kháng nguyên 8 HA chuẩn.

C.3 Cách ti ến hành ph ản ứng

Dùng ñĩa ngưng kết 96 giếng, ñáy chữ U.

Cho PBS vào mỗi giếng 25 µl từ giếng 2 ñến giếng 12.

ho 50 µl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1. Hút 25 µl từ giếng 1 chuyển sang giếng 2.

Pha loãng huyết thanh: Trộn ñều huyết thanh với PBS ở giếng 2, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng 3 trộn

ñều, hút 25 µl chuyển sang giếng 4 tiếp tục làm như vậy ñến giếng 11, hút bỏ 25 µl ở giếng 11 ñi.

Cho 25 µl kháng nguyên 8 ñơn vị HA vào các giếng từ 1 ñến 11. Giếng 12 cho thêm 25 µl PBS.

Lắc nhẹ trên máy lắc sau ñó ñể ñĩa ở nhiệt ñộ phòng 30 min.

TCVN 8400-6:2011

17

Cho hồng cầu người typ O 2,5 %: mỗi giếng 25 µl, lắc nhẹ 1 min. Để ñĩa phản ứng ở nhiệt ñộ phòng.

Đọc kết quả sau 30 min ñến 60 min.

Mỗi ñĩa phản ứng phải có mẫu ñối chứng kháng nguyên chuẩn hoặc kháng thể chuẩn làm tương tự

như mẫu cần chẩn ñoán ñể ñảm bảo 8 HA trong 25 µl ñã ñược sử dụng cho phản ứng là ñúng, mục

ñích là ñể kiểm soát mẫu huyết thanh và mẫu bệnh phẩm khi làm phản ứng.

Giếng Các bước

Nguyên li ệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

PBS, µl 0 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Pha loãng huyết thanh

Huyết thanh 50 Chuyển 25 µl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn ñều, chuyển tiếp tục ñến

giếng 11 rồi hút bỏ 25 µl 0

Cho kháng nguyên

KN 8 HA, µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0

Lắc nhẹ, ñể 30 min ở nhiệt ñộ phòng

Hồng cầu, µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

Cho hồng cầu

Độ pha loãng huyết

thanh

1

10

1

20

1

40

1

80

1

160

1

320

1

640

1

1280

1

2560

1

5120

1

10240

C.4 Đọc kết quả

– Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống ñáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng.

Hiệu giá kháng thể ñược tính ở ñộ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.

– Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa kháng nguyên và

kháng thể trong phản ứng.

C.5 Đánh giá k ết quả

Mẫu là huyết thanh kiểm tra kháng thể: Những thỏ chưa ñược chủng vắc xin có kháng thể lớn hơn

hoặc bằng 1/80 thì mẫu ñó ñược coi là nhiễm vi rút xuất huyết thỏ.

Mẫu là kháng nguyên (huyễn dịch bệnh phẩm, huyễn dịch sau phân lập):

– Nếu có hiện tượng ức chế ngưng kết với kháng huyết thanh xuất huyết thỏ chuẩn thì vi rút phân lập

ñược là vi rút xuất huyết thỏ.

– Nếu không có hiện tượng ức chế ngưng kết, mà HA dương tính cần phân lập tiếp trên thỏ.

TCVN 8400-6:2011

18

Phụ lục D

(Quy ñịnh)

Kỹ thuật làm ph ản ứng RT-PCR

D.1 Chiết tách RNA

Dùng huyễn dịch ñã xử lý theo 5.2.2.1 ñể chiết tách RNA. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen Rneasy

Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình dưới ñây.

Nhỏ 200 µl dịch nghiền mô vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 µl Qiagen buffer RLT có 1 % β-

ME, lắc ñều trên máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

Thêm 500 µl cồn 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ;

Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 s gia tốc ≥ 8000g ở nhiệt ñộ phòng;

Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 s ở tốc ñộ

≥ 8000g, thay ống thu mới vào cột lọc;

Nhỏ 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8000g, thay

ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer;

Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc ñộ tối ña, bỏ ống thu;

Đặt cột lọc vào ống thu RNA, nhỏ 50 µl nước không chứa RNase vào cột lọc, ủ ở nhiệt ñộ phòng trong

ít nhất 1 min. Tách RNA bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc ≥ 8000g, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch

trong ống thu RNA;

Bảo quản mẫu RNA thu ñược ở 4 0C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu sau 24 h, nên

bảo quản mẫu ở âm 20 0C hoặc nhiệt ñộ thấp hơn.

D.2 Cách ti ến hành

D.2.1 Chuẩn b ị cặp mồi

Cặp mồi ñược thiết kế dựa trên ñoạn gen mã hóa protein bám gắn của vi rút ñể khuếch ñại một sản

phẩm có kích thước 269 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:

Cặp mồi Trình t ự

Mồi xuôi 5’-d CAGCCGTACTGAGCCAGATGTA -3’

Mồi ngược 5’-d AAGGACTAGTGGGAACAAGG- 3’

Cặp mồi này ñược sử dụng ở nồng ñộ 10 µM

TCVN 8400-6:2011

19

D.2.2 Thực hi ện phản ứng PCR

Pha hỗn hợp phản ứng (hỗn hợp mẹ).

VÍ DỤ: Sử dụng kít Platinium Quantitative PCR Superscript II của hãng Invitrogen, Co., USA.

Hỗn hợp mẹ Lượng cho 01 ph ản ứng , µl

Nước cất siêu sạch không có men Nuclease 9,5

Superscript II reverse transcriptase mix 12,5

Mồi xuôi 1

Mồi ngược 1

Mẫu RNA 1

Tổng lượng 20,0

Để tính lượng hỗn hợp phản ứng cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho một phản ứng nhân

với tổng số mẫu và các ñối chứng.

Sau khi pha hỗn hợp phản ứng, chia 20 µl hỗn hợp mẹ vào các ống PCR, sau ñó cho 5 µl RNA mẫu và

ñối chứng vào các ống thích hợp, ly tâm nhanh, rồi ñặt ống PCR vào máy PCR.

Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt như sau:

Chu trình 1 Chu trình 2 Chu trình 3

42 oC, 2 min;

94 oC,10 min 30 x (94 oC,1 min; 56 oC, 45 s; 72 oC, 50 s)

72 oC,10 min;

Giữ ở 4 oC

D.2.3 Điện di và hi ển th ị sản phẩm PCR

Pha 1,2 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE, rồi ñun nóng trong lò vi sóng cho ñến khi tan hoàn toàn.

Khi hỗn hợp nguội bớt có thể chạm tay vào, cho tiếp 2 µl etidi bromua (10 mg/ml) vào. Sau ñó ñổ gel

vào khay gel và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.

Đổ ñầy dung dịch 1xTAE vào bể ñiện di (ñến vạch full level), ñặt khay gel vào vị trí trong bể ñiện di.

Pha 2 ul loading dye với 4 µl 100 bp lader rồi ñưa vào giếng ñầu tiên của miếng Gel. Pha 2 µl loading

dye vơi 8 µl mẫu (ñối chứng âm và dương) rồi ñưa vào các giếng còn lại của miếng Gel.

Điện di gel ở 80 V ñến 100 V trong 30 min ñến 40 min.

D.3 Đọc kết quả

Đặt gel ñã ñiện di vào máy chiếu UV (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm. Các mẫu có hiển thị

band sản phẩm kích thước 269 bp là dương tính.

TCVN 8400-6:2011

20

Phụ lục E

(Quy ñịnh)

Kỹ thuật làm ph ản ứng rRT-PCR

E.1 Chiết tách RNA

Xem Phụ lục D.

E.2 Cách ti ến hành

E.2.1 Chuẩn b ị cặp mồi

Các mồi xuôi và mồi ngược và mẫu dò ñược thiết kế ñặc hiệu ñể phát hiện gen RNA pol của vi rút

Calici thuộc họ Caliciviridae.

Cặp mồi Trình t ự

Mồi xuôi 5’-d ACYTYACTAAACTYATTGACG -3’

Mồi ngược 5’-d TCAGACATAAGAAAAGAAATTGG- 3’

Mẫu dò FAM – CCAARAGCACRCTCGTGTTCAACCT- TAMRA

Cặp mồi này ñược sử dụng ở nồng ñộ 10 µM

Công thức pha hỗn hợp mẹ (master mix) có thể thay ñổi cho phù hợp với từng loại cặp mồi và từng

loại kít rRT-PCR khác nhau. Dưới ñây quy trình giới thiệu 1 bộ kit.

Công thức áp dụng cho kít RT-PCR của hãng Invitrogen

Hỗn hợp mẹ Lượng cho 01 ph ản ứng , µl

Nước 5,5

2X Reaction buffer 12,5

Enzym mix 0,5

Mồi xuôi 0,5

Mồi ngược 0,5

Mẫu dò 0,5

Mẫu RNA 5

Tổng cộng 25 µl

TCVN 8400-6:2011

21

E.2.2 Thực hi ện phản ứng PCR

Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR bằng phần mềm trên máy vi

tính. Nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ñối chứng dương tính, âm tính vào phần Ký hiệu mẫu

trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy. Cài ñặt chương trình phân tích dữ liệu cho máy chu

kỳ nhiệt (ví dụ: máy Cepheid Smart Cycler hoặc Biorad IQ5) và chạy chương trình.

Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt như sau:

Chu trình 1 Chu trình 2 Chu trình 3

50 oC, 30 min;

94 oC, 2 min

45 x (94 oC, 3 s; 55 oC, 45 s) 68 oC, 45 s;

Giữ ở 4 oC

E.3 Phân tích k ết quả

Các giá trị mặc ñịnh ñã ñược thiết lập trong chương trình chạy của máy Realtime RT-PCR ñể phát hiện

vi rút xuất huyết thỏ. Mẫu ñối chứng dương tính (ñược chuẩn ñộ trước) phải có giá trị Ct như ñã biết (±

2 Ct) và mẫu ñối chứng âm tính phải có Ct = 0 thì kết quả rRT-PCR mới ñược công nhận.

Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 ñược coi là dương tính. Mẫu không có Ct ñược coi là âm tính. Mẫu có giá trị Ct

trong khoảng từ 35 ñến 40 ñược coi là nghi ngờ. Những mẫu nghi ngờ này cần ñược xác chẩn bằng

phương pháp phân lập vi rút trước khi có kết luận chẩn ñoán cuối cùng.

TCVN 8400-6:2011

22

Thư mục tài li ệu tham kh ảo

[1] O.I.E., 2009. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Rabbit haemorrhagic

disease, Chapter 2.6.2

[2] A. Gall, B. Hoffmenn, J.P Teifke, B. Lange, H. Schirrmeier. Persisitence of viral RNA in rabbits

which overcome an experimental RHDV infection detected by a highly sensitive multiplex realtime

RT-PCR. Tạp chí Veterinary Microbiology 120 (2007), trang17-32, Đức.

____________________________