técnicas de laboratório

Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

I

Índice Geral 1. Objectivos 2 2. Introdução 3 3. Tipos de Testes de Diagnóstico 5 3.1. Testes Microbiológicos 5 3.1.1. Cultura em placas 6 3.2. Testes Imunológicos 7 3.2.1. Reacções de Aglutinação 7 3.2.1.1. Reacções de Aglutinação Directa 7 3.2.1.2. Reacções de Aglutinação Indirecta 8 3.2.2. Reacções de Precipitação 113.2.2.1. Em meio líquido 113.2.2.2. Em meio sólido (gel) 113.2.2.2.1. Teste de Imunodifusão 113.2.3 Reacção de Neutralização 143.2.4. Técnicas de Imunofluorescência 163.2.4.1. Técnicas de Imunofluorescência directa 163.2.4.2. Técnicas de Imunofluorescência indirecta 183.2.5. Teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 203.2.5.1. Teste de ELISA directo 203.2.5.2. Teste de ELISA indirecto 233.2.6. Testes Imunológicos com pouca aplicação actualmente 243.2.6.1. Testes Radioimunológicos (RIA) 253.2.6.2. Teste de Imunoelectroforese 253.2.6.3. Reacção de Fixação do Complemento 263.3. Testes Baseados em Técnicas de Engenharia Genética (TEGs) 273.3.1. Southern Blotting 283.3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) e Variantes 293.3.2.1. Multiplex PCR 303.3.2.2. Nested PCR 323.3.2.3. MSP-PCR (methylation specific PCR) 343.3.2.4. Real-time PCR 383.3.3. Utilização de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) 423.3.4. Biochips 443. 4. Complementação entre técnicas 483.4.1. Imunocaptura e transcrição reversa PCR 483.4.2. Sondas e Imunocaptura 504. Perspectivas Futuras 525. Problemas Éticos 546. Problemas Sócio-Económicos 586.1. Legislação dos TEGs 586.2. Perspectivas económicas 607. Bibliografia 61


II

Índice de Figuras

Figura 1 - Representação esquemática de uma reacção de aglutinação

9

Figura 2 - Kit Ontrak Testcard 9 10

Figura 3 - Pormenor do kit Ontrak Testcard 9 10

Figura 4 - Teste de Imunodifusão 12Figura 5 - Resultado de um Teste de Imunodifusão 13Figura 6 - Teste de neutralização de uma toxina microbiana 14Figura 7 - Resultado de um teste da neutralização 15Figura 8 - Esquema de um resultado positivo de um teste de

imunofluorescência directa 17

Figura 9 - Esquema de um resultado positivo de um teste de imunofluorescência indirecta

18

Figura 10 - Resultado de um teste de imunofluorescência indirecta 19Figura 11 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA

directo 20

Figura 12 - Teste de gravidez 22Figura 13 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA

indirecto 23

Figura 14 - Kit Trinity Biotech SeroCard™ HIV 24Figura 15 - Southern Blotting 28Figura 16 - Mapa da região amplificada por multiplex PCR 31Figura 17 - Rastreio de ratos transgénicos utilizando o kit QIAGEN

Multiplex PCR 32

Figura 18 - Mapa da região amplificada por Nested-PCR do gene de V. vulnificus

33

Figura 19 - Electroforese dos produtos de amplificação enzimática do DNA de V.vulnificus

34

Figura 20 - Esquema da técnica de MSP-PCR 35Figura 21 - DNA isolado do carcinoma prostático (C) e de tecido

prostático hiperplástico benigno (B) por MSP-PCR 37

Figura 22 - Ensaio 5´nuclease 39Figura 23 - SYBR Fluorescência Verde 40Figura 24 - Mecanismo geral do Biosensor 43Figura 25 - Teste da presença de arsénio 43Figura 26 - Biochip 45Figura 27 - Microarray AmpliChip CYP450 46Figura 28 - Princípio da imunocaptura e transcrição reversa PCR 48Figura 29 - Desenvolvimento natural do cancro cervical 50Figura 30 - Tecnologia de Hybrid Capture® 51


III

Índice de Tabelas Tabela 1 - Tipos de drogas detectadas pelo kit Ontrak Testcard 9 e

respectivos limites de detecção mínimos 10

Tabela 2 - Tipos e características de fluorocromos utilizados nos testes de imunofluorescência

16

Índice de Gráficos Gráfico 1 - Perspectivas de vendas da indústria Biotecnológica Norte-

Americana.

60


IV

Abreviaturas Ac - anticorpo Ag - antigénio ANA - anticorpos anti-nucleares Auc - auto-anticorpos DNA - deoxyribose nucleic acid ELISA - enzyme linked immunosorbent assay EUA - Estados Unidos da América FITC - fluoresceína de isotiocianato FRET - fluorescent resonant energy transfer GRAS - generally regarded as safe hCG - hormona gonadotrofina coriónica HIV - human immunodeficiency virus HPV - human papillomavirus IHS - inibição da hemólise sinérgica MSP-PCR - methylation specific PCR OGM - organismos geneticamente modificados PCR - polymerase chain reaction PGD - preimplantation genetic diagnosis RBC - red blood cells RIA - testes radioimunológicos RNA - ribose nucleic acid RT-PCR - reverse transcription PCR TEGs - testes baseados em técnicas de engenharia genética UV- ultravioleta VCT - vírus citrus tristeza VRS - vírus respiratório sincicial


2

1. Objectivos

No âmbito da disciplina de Aplicações da Engenharia Genética, foram propostos cinco temas que visam abordar a situação actual e os novos desenvolvimentos na área da engenharia genética. O tema que este trabalho trata é: Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise.

Neste trabalho pretendemos por um lado, dar uma panorâmica dos

testes/técnicas de diagnóstico e análise que se efectuam actualmente, apresentando uma perspectiva histórica dos mesmos e, por outro, dar a conhecer um dos testes que se encontra ainda em fase experimental.

Na aplicação e desenvolvimento de testes/técnicas de diagnóstico e

análise, tem que se ter em conta quais os problemas sócio-económicos, assim como os problemas éticos que lhes estão associados, pelo que também iremos abordar este ponto.


3

2. Introdução Com este trabalho iremos abordar as novas tecnologias de

diagnóstico/análise no campo da saúde, do ambiente e da indústria agroalimentar. A distinção entre análise e diagnóstico não é muito clara, existindo campos

comuns em que estes dois termos se aplicam. Na elaboração deste trabalho optámos, por uma questão de clareza, destinar a palavra diagnóstico ao campo da saúde, enquanto que a palavra análise será utilizada para nos referirmos à área agroalimentar e ambiental.

A palavra diagnóstico vem do grego δια, “por meio de” e γυϖσιζ,

“conhecimento”, ou seja, a arte de conhecer as doenças pela observação dos sinais ou sintomas que apresentam.[1] O significado desta palavra tem sofrido alterações ao longo do tempo, de acordo com os avanços científicos.

Inicialmente, o diagnóstico de uma determinada enfermidade consistia na

observação de sinais e sintomas do paciente. Mais tarde, começaram a ser efectuados exames complementares de diagnóstico, tais como: análises qualitativas e quantitativas de todos os fluidos do organismo, pesquisa de microrganismos, radiografia, etc.

Com o desenvolvimento da engenharia genética houve a criação de uma

míriade de testes/técnicas de diagnóstico, os quais passaram a ser utilizados por exemplo para determinar se um determinado indivíduo tem uma predisposição hereditária para uma certa doença.

Entende-se por análise como sendo a identificação e doseamento dos

constituintes de carácter químico e biológico de uma amostra, tanto no aspecto qualitativo como quantitativo. [2]

A necessidade de efectuar testes/técnicas de análise na área ambiental e

agroalimentar, decorre da maior preocupação acerca da qualidade de tudo o que nos rodeia, desde o ar que respiramos aos alimentos que ingerimos.

As técnicas e os meios utilizados nestas três áreas são em número

crescente e de aplicação cada vez mais complexa. Por vezes, exigem o emprego de materiais e aparelhos altamente dispendiosos, o que torna o diagnóstico cada vez mais oneroso, mas também, cada vez mais preciso. A precisão do diagnóstico está na base de uma terapêutica racional, a qual quando específica, garante resultados mais perfeitos e rápidos. [1]

Neste trabalho pretendemos abranger os principais testes/técnicas de

diagnóstico/análise utilizados em cada uma das áreas referidas anteriormente, assim como apresentar exemplos práticos da sua aplicação.


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É na área da saúde que existe um maior desenvolvimento de técnicas de

diagnóstico, o que se deve em grande parte aos orçamentos avultados nesta área. Actualmente, é possível o diagnóstico de doenças de índole genética, hereditárias e não hereditárias (entre os quais os testes pré-natais são o exemplo mais representativo), assim como diagnosticar a presença de bactérias, vírus e parasitas em seres humanos e animais. Relativamente ao ambiente, é possível efectuar análises para verificar a presença de poluentes e de microrganismos (patogénicos e não patogénicos). Por último, na área agroalimentar é possível detectar a presença de microrganismos patogénicos e de microrganismos causadores da deterioração de alimentos.

É importante referir os diversos factores que têm de ser considerados

quando se pretende implementar um teste de diagnóstico/análise: − fim a que se destina; − custo do processo; − tempo necessário para a sua realização; − sensibilidade; − capacidade de automatização e aumento de escala; − nível de qualificação da mão-de-obra necessária.


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3. Tipos de Testes de Diagnóstico De entre a grande variedade de testes de diagnóstico e análise existem três

grupos principais: testes microbiológicos, testes imunológicos e testes que têm na sua base técnicas de engenharia genética (TEGs). Por sua vez, cada um destes grupos pode ser subdividido em categorias mais específicas.

Este trabalho foi estruturado de acordo com a divisão acima referida, sendo

que, para cada teste irá ser apresentado o seu princípio de acção, as vantagens e desvantagens da sua aplicação e, por fim, um exemplo prático da sua utilização. Procurámos estabelecer uma ordem cronológica dos mesmos, de modo a permitir uma melhor percepção dos avanços tecnológicos desta área ao longo do tempo.

3.1. Testes Microbiológicos

O desenvolvimento do microscópio óptico no início do século XIX, permitiu a identificação visual dos microrganismos presentes numa determinada amostra. No entanto, para efectuar estudos pormenorizados acerca da natureza dos microrganismos, era necessário obtê-los em grandes quantidades e capazes de se multiplicar quando inoculados num meio que suportasse o seu crescimento. Para tal, foi necessário reproduzir em laboratório as características essenciais do meio de origem de cada microrganismo em estudo. Deste modo, surgiu a técnica de cultura em placas e em meio líquido.

Apesar destes testes serem dos mais antigos na área do

diagnóstico/análise, actualmente ainda encontram bastante aplicação na análise de alimentos, bebidas e, no diagnóstico clínico. A identificação inequívoca dos microrganismos patogénicos ou responsáveis pela deterioração de alimentos/bebidas, passa pelo seu cultivo em meios de crescimento diferenciais, selectivos ou de enriquecimento, seguido de testes de natureza bioquímica.

Tal como referimos anteriormente, com este trabalho pretendemos incidir

sobre as novas tecnologias de diagnóstico/análise, pelo que, apesar de existir uma grande variedade de testes microbiológicos, iremos (e apenas por motivos históricos), mencionar somente a técnica de cultura em placas.


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3.1.1. Cultura em placas PPrriinnccííppiioo:: Consiste na inoculação de uma amostra de um alimento/bebida, num meio e em condições de incubação que permitam o crescimento de quaisquer microrganismos (patogénicos ou responsáveis pela deterioração desse alimento/bebida), que possam estar presentes. VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− É um método de custos reduzidos; − Não requer equipamento nem mão-de-obra sofisticada; − Processo moroso; −− Por vezes é difícil encontrar um meio com as características necessárias

para suportar o crescimento específico de um determinado microrganismo.

EExxeemmpplloo::

O método de cultura em placas é utilizado para efectuar a análise de estreptococos fecais em águas para consumo. A ocorrência destes microrganismos indica a existência de contaminação fecal.

A amostra de água é filtrada com um filtro cujo diâmetro de poro é inferior

ao diâmetro médio das bactérias (0,45 µm). De seguida, o filtro é colocado em meio de agar de enterococos, procedendo-se à sua incubação durante 48 horas a 37ºC. O resultado é positivo se as colónias forem castanhas, vermelhas ou rosa. De forma a confirmar que de facto se tratam de estreptococos fecais, algumas destas colónias são transferidas para meio agar de esculina, canamicina e azida, sendo os dois últimos inibidores do crescimento de microrganismos que não sejam estreptococos. Este meio é incubado durante 24 horas a 44ºC. Os microrganismos do grupo dos estreptococos fecais degradam a esculina (glucósido fenólico), pelo que o teste é positivo se as colónias apresentarem uma coloração castanha, verde escuro ou negra.[3]


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3.2. Testes Imunológicos Nesta secção, serão referidas as técnicas específicas de diagnóstico e análise que têm por base reacções imunológicas, ou seja, reacções antigénio-anticorpo. Estes testes podem-se basear em reacções de precipitação, aglutinação, neutralização, técnicas de imunofluorescência e na marcação com uma enzima para detecção da ligação antigénio-anticorpo (testes de ELISA). 3.2.1. Reacções de Aglutinação (Teste de Coombs)

As reacções de aglutinação são promovidas por antigénios na forma de partículas ou antigénios solúveis associados a partículas. Estes, quando em contacto com anticorpos, dão origem a aglutinados (muitas vezes é necessário outro composto adicional para promover a aglutinação). Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1945. 3.2.1.1. Reacções de aglutinação directa PPrriinnccííppiioo:: A reacção de aglutinação directa permite a detecção de anticorpos contra antigénios celulares relativamente grandes, tais como os da superfície dos eritrócitos, das bactérias ou dos fungos. Actualmente, para efectuar estas reacções utilizam-se placas de microtitulação, nas quais todos os poços contêm a mesma quantidade de antigénio. No entanto, a quantidade de anticorpo vai diminuindo ao longo dos poços, de tal forma que o conteúdo de cada poço contenha metade da quantidade de anticorpo do poço anterior, permitindo deste modo saber o título do anticorpo na amostra.[4] VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Um único título é de uso limitado para se efectuar o diagnóstico, pois apesar deste valor indicar o número de anticorpos, não permite saber se estes foram formados em resposta a uma infecção recente ou, anteriormente, quando se entrou em contacto com a infecção pela primeira vez;

− Efectuando vários títulos ao longo do tempo podemos observar a evolução da concentração de anticorpos e, deste modo, conseguir estabelecer um diagnóstico mais preciso;


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− É um método sensível e de fácil visualização; − Existem vários testes e, podem ser utilizados para efectuar um alargado

número de análises/diagnóstico. EExxeemmpplloo::

Detecção de anti-anticorpos contra a Leishmania donovani no soro humano ou canino, através do teste de aglutinação directa da KIT Biomedical Research.

A leishmaniose é uma parasitose (provocada por um protozoário flagelado), cujo hospedeiro primário são os cães, os humanos e os roedores. As moscas da areia são o seu hospedeiro intermediário. O ciclo de vida deste parasita tem duas fases: uma na mosca e outra no cão/humano. Quando o parasita se encontra na mosca, toma a forma de promastigoto. Quando a mosca pica um animal, o promastigoto entra na corrente sanguínea, sendo posteriormente ingerido pelos macrófagos, onde toma a forma de amastigoto. Nesta forma alguns parasitas ficam no sangue periférico, enquanto outros são transportados para os órgãos internos provocando a leishmaniose visceral.

A KIT Biomedical Research realizou um tratamento aos promastigotos da estirpe L. donovani 1S, de modo a torná-los utilizáveis em condições inóspitas, tais como as que existem nos países subdesenvolvidos. No teste de aglutinação, estes promastigotos são adsorvidos a poços de placas de microtitulação, onde posteriormente se coloca a amostra suspeita de conter anti-anticorpos contra a Leishmania. Estes provocam a aglutinação dos promastigotos, sendo esta aglutinação visível a olho nu, na forma de um grande floco no topo dos poços da placa microtitulação. [5]

3.2.1.2. Reacções de aglutinação indirecta PPrriinnccííppiioo:: A reacção de aglutinação indirecta permite a detecção de anticorpos contra antigénios solúveis, quando estes estão adsorvidos a partículas de bentonite, argila ou, mais frequentemente, esferas de látex (Figura 1). O mesmo princípio pode ser aplicado de modo inverso, utilizando anticorpos adsorvidos a partículas para detectar antigénios específicos.


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VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Os anticorpos aglutinam de forma mais intensa a antigénios adsorvidos do que a antigénios solúveis (método directo);

− Teste rápido (poucos minutos) e sensível; − Resultados relativamente fáceis de visualizar; − Existe uma grande variedade de testes.

EExxeemmpplloo:: Detecção qualitativa de drogas na urina através do kit Ontrak Testcard 9 (Tabela 1). O kit acima referido baseia-se na inibição da aglutinação antigénio-anticorpo por partículas de látex. Esta inibição consiste na competição pelo anticorpo entre o conjugado droga-látex e qualquer droga presente na amostra a analisar. A amostra é difundida por capilaridade desde o local onde é colocada até à zona de validação do teste. Se não existir droga na amostra, o conjugado droga-látex liga-se ao anticorpo livre formando grandes partículas que aglutinam, dando origem a uma banda azul. Se a amostra contiver droga, esta irá ligar-se ao anticorpo livre impedindo a sua associação ao conjugado droga-látex, não se formando o aglutinado, pelo que se verifica uma ausência de banda. [6]

Figura 1 - Representação esquemática de uma reacção de aglutinação.

Em que (a)- na ausência de droga e (b)- na presença de droga, sendo que L-látex e D-droga. in: PRESCOTT L., HARLEY J. e KLEIN D. 1993 Microbiology 2ndEd Wm.C. Brown Publishers Oxford


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Actualmente, este teste já analisa simultaneamente 9 drogas numa única amostra.

Tabela 1 - Tipos de drogas detectadas pelo kit Ontrak Testcard 9 e respectivos limites de detecção mínimos. in: http://us.labsystems.roche.com/products/drugs/testcard9.shtml

Drogas a analisar Limite de detecção mínima (ng/mL)

cocaína marijuana

barbitúricos benzodiazepinas

feniciclidina metanfetaminas antidepressivos

morfina anfetaminas

300 50 200 100 25 500 1000 300 1000

Figura 2 - Kit Ontrak Testcard 9 in: http://npt.mah.roche.com/images/products/ testcard_9/image_01.jpg

Figura 3 - Pormenor do kit Ontrak Testcard 9. 1- zona de validação do teste, 2- resultado positivo (ausência de banda) e 3- resultado negativo (presença de banda azul). in: http://us.labsystems.roche.com/products/ drugs/testcard9.shtml.


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3.2.2. Reacções de Precipitação As reacções de precipitação envolvem antigénios solúveis e podem ocorrer em meio líquido ou meio sólido (gel). 3.2.2.1. Em meio líquido PPrriinnccííppiioo:: Estas reacções permitem a identificação de antigénios numa amostra em estudo. Esta é diluída numa solução que contém anticorpos específicos para o antigénio a pesquisar. A ligação antigénio-anticorpo origina agregados moleculares. Desta forma, se ocorrer precipitação o teste imunológico é positivo, o que significa que a amostra tem o antigénio em estudo. Caso não ocorra formação de precipitado, o teste é negativo.[4] VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Teste rápido; − Apresenta baixa sensibilidade; − Obtém-se frequentemente falsos negativos, especialmente quando a

concentração de antigénio na amostra é baixa. 3.2.2.2. Em meio sólido (gel) 3.2.2.2.1. Teste de Imunodifusão Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1953.[7] PPrriinnccííppiioo: Este teste consiste numa reacção de precipitação que se efectua em gel de agar numa placa de Petri ou numa lâmina de microscópio. O princípio do método é semelhante ao anterior mas, neste caso, a precipitação está dependente da difusão do antigénio e do anticorpo no agar. A amostra com antigénio é colocada num dos extremos da caixa de Petri ou da lâmina de microscópio e, no extremo oposto coloca-se a solução com anticorpos. No caso do teste ser positivo ocorre precipitação, o que se traduz na formação de uma linha que corresponde à zona onde os antigénios e os


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anticorpos se encontram e se ligam maioritariamente. O resultado é visível depois de um ou dois dias.

Figura 4 - Teste de Imunodifusão. Em que: A- adição de anticorpos (Ab) e antigénios (Ag) a

uma placa de agar. B- difusão dos anticorpos e antigénios através do agar. C- formação de uma linha de precipitação resultante da ligação específica Ag-Ab. in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/agid/diagram.html


− Teste mais demorado e mais específico que a reacção de precipitação em meio líquido;

− Detecta diferenças entre antigénios com alta sensibilidade; − Para se conseguir detectar antigénios ou anticorpos, estes têm de se

encontrar em altas concentrações.


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EExxeemmpplloo::

Detecção de anticorpos contra diferentes agentes fúngicos provenientes dos seguintes géneros: Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e Blastomyces dermatitidis, através de Exo-Antigen Identification System da Immuno-Mycologics, Inc.

Os géneros acima referidos são fungos patogénicos, e: - Histoplasma capsulatum é responsável pela histoplasmólise (doença respiratória que se assemelha à gripe); - Coccidioides immitis geralmente afecta os pulmões, provocando uma infecção denominada coccidioidomicose (febre de San Joaquin, febre do vale), a qual pode resultar numa pneumonia.[8] - Blastomyces dermatitidis causa uma blastomicose (blastomicose norte-americana, doença de Gilchrist), a qual é uma infecção na pele, pulmões ou generalizada. [9]

Figura 5 - Resultado de um Teste de Imunodifusão. Nos poços centrais é colocado o antigénio contra cada um dos agentes fúngicos a detectar. A amostra de controlo (C) é colocada em poços diametralmente opostos e consiste num soro contendo anticorpos para cada um dos agentes fúngicos. As amostras de soro do paciente são colocadas nos restantes poços em redor do poço central. Os testes da esquerda para a direita são referentes à detecção de anticorpos para Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e Blastomyces dermatitidis, respectivamente. O resultado é positivo (+) se ocorrer formação de linhas de precipitação brancas e é negativo (-) se não ocorrer a formação das mesmas, pelo que este paciente apresenta apenas anticorpos para C. immitis. in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/agid/fig3.html


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3.2.3. Reacção de Neutralização

Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1961.[7]

PPrriinnccííppiioo:: A reacção de neutralização baseia-se numa reacção antigénio-anticorpo, na qual os efeitos nocivos de uma exotoxina bacteriana (antigénio) são bloqueados por anticorpos específicos (antitoxina). A antitoxina ao ligar-se à exotoxina neutraliza os efeitos desta última e, desta forma, as células não são danificadas. Conhecendo os anticorpos específicos contra determinado vírus, é possível usar esses anticorpos para identificar doenças virais ou para determinar o título dos anticorpos e dos vírus.

Teste Positivo Teste Negativo

Figura 6 - Teste de neutralização de uma toxina microbiana. a)- toxina microbiana, Ac-anticorpo e RBC-células dos glóbulos vermelhos de ovelhas. Em A, na presença de uma amostra que contém anticorpos anti-toxina, estes ligam-se à toxina, pelo que em B, quando se adicionam os eritrócitos, não ocorre lise dos mesmos, sendo o resultado do teste negativo. Em C, na ausência de anticorpos, a toxina está livre para lisar os eritrócitos (D). in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/diagram_b.html


− Testes de neutralização in vitro são de realização complexa, o que leva ao seu uso menos frequente em laboratórios clínicos modernos.

EExxeemmpplloo::


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Teste de inibição da hemólise sinérgica (IHS) que permite a detecção de anticorpos contra a bactéria Rhodococcus equi, no soro do cavalo.

A bactéria Rhodococcus equi produz uma toxina denominada por “factor

equi” que é composta por duas enzimas: a colesterol oxidase e a fosfolipase C. Estas enzimas possuem características antigénicas, podendo por este motivo, ser utilizadas como um antigénio num teste imunológico.[10]

O teste de IHS foi desenvolvido, tendo como base o facto de o “factor equi”

aumentar a actividade hemolítica de outras bactérias. Desta forma, esta toxina actua sinergeticamente com as toxinas produzidas por Corynebacterium pseudotuberculosis de modo a provocar a hemólise de eritrócitos de mamíferos. Para efectuar este teste o soro de cavalo é misturado com a toxina de R. equi e, posteriormente colocado num poço numa placa de agar de sangue, na qual previamente se inocula uma cultura de C. pseudotuberculosis com uma zaragatoa traçando linhas no agar.[11]

Assim sendo, caso o soro de cavalo não contenha anticorpos contra o

“factor equi”, este vai difundir no agar e, vai em sinergia com a toxina de C. pseudotuberculosis promover a hemólise completa dos eritrócitos, o que se traduz na presença de um halo (ver Figura 7). Caso o soro de cavalo contenha anticorpos para o “factor equi”, vai ocorrer a formação de um complexo antigénio-anticorpo, o que faz com que a toxina de R. equi não esteja disponível para promover a hemólise completa.

Figura 7 - Resultado de um teste da neutralização, para a determinação da presença de anticorpos contra a toxina de Rhodococcus equi numa amostra de soro, em que: a)- poço, b)- halo resultante de hemólise completa. in:http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/fig2.html


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3.2.4 Técnicas de Imunofluorescência A técnica de imunofluorescência é muito utilizada na detecção de microrganismos em amostras e, na detecção de um anticorpo específico em células e tecidos. Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1982. A base deste teste consiste na utilização de um composto fluorescente que detecta a ligação entre anticorpos e antigénios. Os anticorpos estão associados a partículas que possuem fluorescência, tais como a fluoresceína, a rodamina, Texas Red®, citocromo 3 e citocromo 5.

Tabela 2 -

Tipos e características de fluorocromos utilizados nos testes de imunofluorescência.

in: http://www.chemicon.com/resource/litlibrary/ant101.pdf.

Fluorocromo Excitação (nm)

Emissão (nm) Coloração

AMCA 350 450 Azul Cy3 550 680 Laranja, Vermelho Cy5 650 680 Laranja, Vermelho

Fluoresceína 495 520 Verde Hoechst 33258 360 470 Azul

B-ficoeritrina 545, 565 575 Laranja, Vermelho R-ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja, Vermelho Rodamina 539, 574 602 Vermelho

Texas red 558, 594 623 Vermelho

Quando o anticorpo se liga ao antigénio, observa-se fluorescência da partícula fluorescente que está associada ao anticorpo.

Existem dois tipos de técnicas de imunofluorescência: a directa e a

indirecta.

3.2.4.1. Técnicas de imunofluorescência directa PPrriinnccííppiioo:: Este método baseia-se na adição à amostra em estudo, de anticorpos específicos associados a partículas fluorescentes. A amostra é fixada numa lâmina à qual serão adicionados os anticorpos marcados com a partícula fluorescente. Após incubação, esta é lavada por forma a retirar os anticorpos que não se ligaram aos antigénios. Desta forma, se nessa amostra existirem antigénios, observa-se fluorescência quando a amostra é exposta a radiações UV.


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Figura 8 - Esquema de um resultado positivo de um teste de imunofluorescência

directa. Em que: A- adsorção a uma lâmina de uma amostra suspeita de conter antigénios e, posterior adição de anticorpos (específicos para os antigénios em estudo) marcados com fluorocromo (F); B- ligação específica dos anticorpos aos antigénios; C- resultado do teste visto por microscopia de fluorescência. No caso de não existirem antigénios na amostra, não se observa fluorescência. in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/ifa/iagram_direct.html


− Procedimentos rápidos, sensíveis e muito específicos; − Não é facilmente automatizado; − Método dispendioso; − Não fornece resultados quantitativos.

EExxeemmpplloo:: O vírus respiratório sincicial (VRS) afecta as crianças no primeiros anos de vida, dando origem a pneumonia e bronquiolites. O kit VRS DFA da Chemicon International permite a identificação de VRS em culturas de tecidos ou em soluções de células colhidas da via respiratória, aplicando a técnica de imunofluorescência directa de anticorpos.

Os anticorpos monoclonais são associados à fluoresceína de isotiocianato (FITC), que possui uma coloração verde quando exposta ao ultravioleta. Adiciona-se este complexo à amostra a estudar e, caso existam antigénios específicos para o anticorpo, ocorre ligação. O complexo anticorpo-FITC que não se ligou ao antigénio é removido com uma lavagem com tampão. Assim, a amostra quando é exposta ao ultravioleta só apresenta coloração verde quando contém os antigénios que se pretendia estudar.[12]


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3.2.4.2. Técnicas de imunofluorescência indirecta PPrriinnccííppiioo:: Estes testes são aplicados com vista a detectar numa amostra a presença de anticorpos específicos após a exposição a um microrganismo (antigénio), sendo por regra mais sensíveis que os métodos directos. Neste caso, o antigénio específico é fixado a uma lâmina onde, posteriormente, se adiciona a amostra em estudo. Se existir na amostra algum anticorpo específico contra o microrganismo, ocorrerá uma reacção entre os dois dando origem a um complexo. Para que se possa detectar a formação deste complexo, adiciona-se uma anti-imunoglobulina sérica marcada com fluorescência, que irá por sua vez reagir com o anticorpo. É importante referir que a anti-imunoglobulina só reage com o anticorpo quando ele está associado ao antigénio. Depois da incubação, efectua-se a lavagem da lâmina por forma a eliminar todos os anticorpos que não complexaram.

Figura 9 -

Esquema de um resultado positivo de um teste de imunofluorescência indirecta. A- adsorção a uma lâmina de um tecido com um antigénio específico (Ag), seguida da adição da amostra suspeita de conter anticorpos (Ac) para os quais os antigénios têm especificidade, ocorrendo ligação entre estes e, posterior adição de anti-anticorpos marcados com fluorocromo (F); B- ligação específica dos anti-anticorpos ao complexo anticorpo-antigénio; C- resultado do teste visto por microscopia de fluorescência. No caso de não existirem anticorpos na amostra, não se observa fluorescência. in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/ifa/iagram_direct.html


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− Mais sensível que o teste directo; − Esta técnica pode ser utilizada para detectar vários vírus num único ensaio.

Isto é possível devido ao facto das anti-imunoglobulinas se ligarem a anticorpos que são produzidos, como reacção à presença de diferentes vírus da mesma espécie;

− Exige um trabalho laboratorial intenso, não sendo facilmente automatizado; − Método dispendioso; − Não fornece resultados quantitativos; − É difícil obter células alvo ideais para efectuar o teste. Os tecidos humanos

são obtidos através de dadores de órgãos. EExxeemmpplloo:: Detecção de Anticorpos Anti-Nucleares (ANA) por imunofluorescência indirecta. Os ANA são auto-anticorpos que se encontram livres no soro, actuando contra componentes nucleares nomeadamente, contra o DNA, histonas, vários complexos de RNA e proteínas (antigénios).

O método consiste na adsorção de um tecido animal a um determinado

suporte com a posterior adição de uma amostra (soro). O tecido deve ser colhido post mortem de modo a conter células mortas, possibilitando deste modo a penetração dos auto-anticorpos (Auc), quando presentes no soro, nas estruturas nucleares. Após uma lavagem, na qual são eliminados os Auc que não se tenham ligado às estruturas nucleares, são adicionados anti-Auc fluorescentes, os quais devido à sua especificidade vão ligar-se aos Auc. O ensaio é observado ao microscópio sob luz ultravioleta. Se os núcleos estiverem verdes fluorescente, o teste é positivo.[13]

Figura 10 - Resultado de um teste de imunofluorescência indirecta. A presença de

fluorescência no núcleo das células indica a existência de auto-anticorpos contra os componentes nucleares das células de um indivíduo. in:http://www.mds.qmw.ac.uk/biomed/kb/resources/immunology/tests/anf/anfcosp1.jpg


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3.2.5. Teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Consiste na marcação com uma enzima para detecção da ligação antigénio-anticorpo. Existem dois tipos de testes ELISA: directo e indirecto, sendo que o primeiro detecta a presença de antigénios e, o segundo detecta a presença de anticorpos. Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1982.[7]

3.2.5.1. Teste de ELISA directo PPrriinnccííppiioo:: Um anticorpo específico é adsorvido à superfície dos poços de placas de microtitulação, aos quais posteriormente é adicionada a amostra que contém o antigénio a ser detectado. Após um período de incubação, adiciona-se um segundo anticorpo específico para o antigénio em estudo e, que se encontra ligado covalentemente a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) que converte um substrato incolor num produto com cor. Por fim, adiciona-se o substrato. Se o anticorpo ligado à enzima, se ligar ao antigénio (no poço), ocorre actividade enzimática, podendo ser detectada por uma alteração de cor.

Figura 11 -

Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA directo. Em que: 1- Ag ligado a Ac específico adsorvido a poços de placas de microtitulação, com posterior adição de um segundo Ac específico, ligado a uma enzima (E); 2-ligação do segundo Ac ao Ag; 3- adição do substrato incolor (S) da enzima e produção do produto (P) colorido. in:http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/elisa/diagram_Ag.html


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− Os resultados podem ser facilmente quantificados por espectofotometria; − Todo o processo pode ser automatizado e analisado por computador; − Existência de kits para a população em geral (Ex.:teste de gravidez); − Necessita de um controlo cuidado, para diferenciar entre reacções

específicas e reacções não específicas.

EExxeemmpplloo:: Detecção da hormona hCG (gonadotrofina coriónica), através do kit Trinity Biotech Uni-GoldTM hCG Stick.

A hCG pode ser encontrada na urina de mulheres grávidas e o kit acima referido permite detectar a sua presença. Este kit é constituído por três áreas:

− área de reacção que contém anti-anticorpos monoclonais (anti-hCG)

ligados a uma enzima mas que não se encontram adsorvidos à membrana;

− área de teste que contém anti-anticorpos policlonais imobilizados e o substrato da enzima;

− área de controlo que contém anti-anticorpos de rato e o substrato da enzima.


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Figura 12 - Teste de gravidez. 1- O stick é mergulhado na amostra de urina que possui a

hormona hCG; 2- A amostra é arrastada por acção da capilaridade ao longo da membrana até alcançar a zona de reacção (R), onde a hormona liga-se aos anti-Ac monoclonais contra hCG, os quais estão livres e ligados a uma enzima. A hormona ligada ao conjugado anti-Ac/enzima é dissolvida e arrastada por capilaridade. 3- O conjugado hCG-Ac/enzima alcança a zona de teste (T). Outros epitopos da molécula de hCG ligam-se aos anti-Ac policlonais imobilizados. 4- Na zona de controlo (C) os Ac monoclonais não ligados a hCG ligam-se aos anti-Ac de rato imobilizados. 5- As enzimas fixadas são agora capazes de degradar o substrato, tanto na zona T como na C, originando um produto com cor. 6- A presença de uma banda vermelha na zona T indica um resultado positivo (+), enquanto que uma banda vermelha na zona C indica que a reacção funcionou, tal como também se verifica para o resultado negativo (-). in: http://www.whfreeman.com/kuby/con_index.htm?06

CT

R

C T R


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3.2.5.2. Teste de ELISA indirecto PPrriinnccííppiioo:: O seu princípio é semelhante ao do ELISA directo. No entanto, neste teste pretende-se efectuar a detecção de anticorpos, pelo que se adsorve à superfície dos poços de placas de microtitulação um antigénio específico. Posteriormente, é adicionada a amostra que contém o anticorpo a ser detectado. É utilizada a mesma enzima do método anterior, estando neste caso ligada a um segundo antigénio específico. A detecção da ligação anticorpo-antigéno é efectuada do mesmo modo que para o ELISA directo.

Figura 13 -

Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA indirecto. Em que: 1- Ac ligado a Ag específico adsorvido a poços de placas de microtitulação, com posterior adição de um anti-anticorpo ligado a uma enzima (E); 2- ligação do anti-anticorpo ao Ac; 3- adição do substrato incolor (S) da enzima e produção do produto (P) colorido. in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/elisa/diagram_Ab.html


−− Idênticas às referidas para o ELISA directo.


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EExxeemmpplloo:: Detecção de anticorpos do vírus de imunodefeciência adquirida (HIV) tipo 1 e 2 no sangue humano, através do kit Trinity Biotech SeroCardTM. Este kit consiste numa matriz sólida à qual estão adsorvidos péptidos sintéticos do HIV - estes péptidos representam as proteínas da cápsula do HIV-1 e do HIV-2. Estes péptidos estão num local que tem uma ligação com a janela onde se coloca a amostra de sangue. Se a amostra contiver anticorpos do HIV, estes irão formar um complexo com o antigénio do HIV na janela de reacção. De seguida, é adicionada na janela de reacção uma anti-IgG do HIV, à qual está ligada uma fosfatase alcalina. Finalmente, adicionando-se o substrato da enzima na janela de reacção, surge um ponto azul como resultado positivo da presença de anticorpos do HIV.

Figura 14 - Kit Trinity Biotech SeroCard™ HIV. O ponto azul indica um resultado positivo

da presença de anticorpos do HIV na amostra. in: http://www.trinitybiotech.com/EN/index2.asp?pg=pro_dtls.asp%3Fid%3D370

3.2.6. Testes Imunológicos com pouca aplicação actualmente No capítulo sobre os testes imunológicos procurámos incidir sobre os testes que maior aplicação encontram actualmente. No entanto, existem outros testes que, apesar de no passado terem tido bastante importância, encontram-se ultrapassados do ponto de vista tecnológico. De seguida iremos apresentar alguns destes métodos.


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3.2.6.1. Testes Radioimunológicos (RIA) Esta técnica foi desenvolvida em 1977 por Rosalyn R. Yalion.[14] PPrriinnccííppiioo:: Este teste tem por base a marcação radioactiva de anticorpos ou antigénios com iodo (125I) ou hidrogénio (3H), que posteriormente são colocados em contacto com a amostra em estudo. A existência de ligações antigénio-anticorpo é determinada por contagem de radioactividade. VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Fornece uma informação quantitativa; − É um método muito sensível, permitindo a detecção de pequenas

quantidades de anticorpo ou de antigénio; − Exige áreas de trabalho especiais no laboratório clínico; − O material radioactivo tem de ser descartado.

3.2.6.2. Teste de Imunoelectroforese Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1979. PPrriinnccííppiioo:: Este teste consiste na combinação da técnica de imunodifusão com a electroforese, de forma a permitir a identificação de antigénios numa determinada amostra de modo mais rápido. Na imunoelectroforese utiliza-se um gel com poços onde é aplicada a amostra (soro humano) que contém os anticorpos específicos para o antigénio em estudo. A amostra com antigénios é colocada nesse poço e, por electroforese consegue-se efectuar a separação das diversas proteínas presentes na amostra. De seguida, adiciona-se o anticorpo específico que migra em direcção ao antigénio, dando origem a um precipitado na região de concentração óptima.


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− Possui alta resolução pois consegue detectar pequenas diferenças de carga total entre antigénios;

− Apresenta uma sensibilidade limitada, pois o método é eficaz apenas quando se utilizam elevadas concentrações de antigénios, apesar de ser melhor que a do teste de imunodifusão;

− Método barato; − Mais rápido que o teste de imunodifusão, uma vez que é “acelerado” pela

electroforese. 3.2.6.3. Reacção de Fixação do Complemento PPrriinnccííppiioo:: Este teste é utilizado para detectar a presença de pequenas quantidades de anticorpos contra um antigénio conhecido e consiste em duas etapas. A primeira etapa consiste na fixação do complemento (grupo de proteínas séricas) ao complexo anticorpo-antigénio. De modo a confirmar a formação do complexo anticorpo-antigénio-complemento, segue-se então a etapa de revelação, na qual adicionam-se eritrócitos e os respectivos anticorpos. Se tiver existido a fixação de todo o complemento, então não restará nenhum complemento livre para promover a hemólise dos eritrócitos. [4] VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Detecta quantidades muito pequenas de anticorpo; − A execução do teste exige cuidado e bons controlos; − O teste necessita de duas etapas.


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3.3. Testes Baseados em Técnicas de Engenharia Genética (TEGs)

O que são TEGs? Os TEGs envolvem a análise do DNA de um indivíduo (retirado de células de uma amostra de sangue, de fluidos corporais ou de tecidos), recorrendo a uma grande variedade de técnicas laboratoriais, que permitem a pesquisa de uma mutação ou polimorfismo que aponte para uma determinada doença ou um distúrbio fisiológico.

Os três métodos mais utilizados para efectuar os TEGs são: identificação

de alterações na totalidade dos cromossomas; análise de pequenos fragmentos de DNA marker contidos nos genes ou perto destes e, análise dos produtos da transcrição e subsequente tradução dos genes (as proteínas).[15],[16],[17]

A execução de TEGs é um processo complexo e, para que sejam utilizados em diagnóstico ou análises é necessário que haja uma grande fiabilidade dos procedimentos laboratoriais envolvidos, que os resultados obtidos sejam sujeitos a uma análise precisa e um grande cuidado na forma como os resultados de um TEG são transmitidos aos indivíduos afectados e às suas famílias. Os testes também variam na sua sensibilidade, isto é, na sua capacidade de detectar mutações ou de avaliar todos os indivíduos que têm, ou que irão desenvolver, uma determinada doença. [17]

Que informação é que os TEGs podem fornecer? Os TEGs podem ser utilizados para efectuar uma previsão, avaliando se

um determinado indivíduo tem uma predisposição hereditária para uma determinada doença antes da manifestação dos sintomas, ou para confirmar um diagnóstico se os sintomas já estivem presentes. Os TEGs também podem ser utilizados para determinar se um indivíduo é portador de uma doença, sendo este diagnóstico importante, pois apesar do indivíduo não desenvolver a doença, pode vir a passar o alelo mutado à sua progénie. [16]


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3.3.1. Southern Blotting Esta técnica foi desenvolvida em 1975 por E. M. Southern.[18]

PPrriinnccííppiioo:: Permite a detecção de moléculas de DNA após a sua separação

electroforética, por hibridação com uma sonda cuja sequência é complementar à sequência de DNA em estudo.

Figura 15 - Southern Blotting. Em que: A- os fragmentos DNA, obtidos por digestão com

enzimas de restrição, são separados electroforeticamente em gel de agarose; B- coloca-se uma membrana de nitrocelulose ou nylon sobre o gel, ocorrendo a transferência dos fragmentos de DNA por blotting. O gel está colocado num tampão que contém compostos alcalinos, os quais desnaturam o DNA. O tampão é transferido por capilaridade para as folhas de papel absorvente colocadas sobre a membrana de nylon, promovendo a passagem dos fragmentos de DNA para a membrana; C- a membrana de nylon é removida e os fragmentos de DNA ficam na mesma posição que ocupavam no gel; D- coloca-se a membrana num saco de plástico selado que contém sondas de DNA marcadas radioactivamente e específicas para os fragmentos de DNA em estudo. Nestas condições é favorecida a hibridação; E- retira-se a membrana do saco e após lavagem desta, efectua-se a visualização do DNA hibridado por exposição a raios X.

in: http://www.accessexcellence.org/AB/GG/southBlotg.html&h=536&w=700&pre v=/images%3Fq%3DSouthern%2BBlotting%2B%26svnum%3D10%26hl%3DptPT %26lr%3D%26ie%3DUTF-8%26oe%3DUTF-8%26sa%3DN


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VVaannttaaggeennss ee ddeessvvaannttaaggeennss:: − Técnica muito sensível; − Não é necessário ter informação sobre a função do gene para elaborar o

protocolo de diagnóstico; − É necessária informação sobre a mutação que dá origem à doença; − Permite a detecção de um único fragmento de restrição no meio de milhões

de fragmentos.

3.3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) e Variantes A PCR como técnica baseada em engenharia genética data de 1985, no

entanto as primeiras aplicações na área do diagnóstico foram realizadas em 1989.[19]

PPrriinnccííppiioo:: Numa reacção em cadeia catalisada pela DNA polimerase, é possível

amplificar especificamente um determinado fragmento de DNA, tirando partido das características da DNA polimerase. A enzima mais utilizada é a Taq polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus. Para efectuar a reacção de amplificação é necessário ter uma pequena quantidade do DNA que se pretende amplificar e, dois oligonucleótidos sintéticos de DNA (primers) em cadeia simples. Os primers são complementares às extremidades 3’ dos fragmentos de DNA em cadeia simples a amplificar e devem ser adicionados à reacção em grande quantidade. São também necessários nucleótidos livres (dNTPs) para a síntese de novas cadeias de DNA.

A reacção de PCR consiste numa sucessão de vários ciclos (normalmente entre 25 e 30 ciclos), em que cada ciclo consiste de três etapas, que correspondem à incubação da reacção a três temperaturas diferentes. A Taq polimerase polimeriza novas cadeias de DNA a partir dos primers de DNA, tendo como molde as cadeias de DNA previamente desnaturadas, às quais os primers se ligaram especificamente. Este ciclo de três etapas é repetido várias vezes. Em cada ciclo, o DNA sintetizado no ciclo anterior serve de molde à síntese de novas moléculas de DNA, de tal modo que a quantidade do fragmento de DNA pretendido aumenta exponencialmente.


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− Técnica rápida e muito sensível; − Tamanho de DNA a ser amplificado é limitado; − Dada a elevada sensibilidade da técnica, a ocorrência de contaminações

pode resultar na presença de falsos positivos; − Perigo de inibições; − Perigo de ocorrer annealing entre primers.

3.3.2.1. Multiplex PCR PPrriinnccííppiioo:: Permite a amplificação de duas ou mais sequências alvo de DNA diferentes na mesma amostra simultaneamente. Nos testes de diagnóstico utiliza-se um conjunto de primers para amplificar um controlo interno para verificar a integridade da PCR e, um segundo conjunto de primers que amplifica a região de interesse do DNA. Um resultado positivo do controlo interno, permite garantir que as condições estão optimizadas por forma a se realizar a PCR e, confirma a integridade e disponibilidade do DNA para a detecção do gene alvo. A PCR multiplex é também utilizada em laboratórios clínicos, para a detecção da existência de diversos microrganismos numa amostra com um único ensaio, ou seja, a reacção de PCR pode conter, para além da amostra, uma panóplia de primers que têm como alvo, por exemplo, diferentes estirpes virais. VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Analisar a presença de diferentes organismos em simultâneo num único tubo de PCR;

− A reacção pode tornar-se inespecífica com o aumento de sequências a amplificar (annealing de primers);

− Obtém-se resultados em menos 24 horas.


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EExxeemmpplloo:: Identificação de animais transgénicos através do kit QIAGEN Multiplex PCR. O kit QIAGEN Multiplex PCR é o primeiro kit que se baseia no método de PCR multiplex e, permite uma amplificação padronizada, sendo por esse motivo de rápida e fácil aplicação.[20] Este kit contém concentrações pré-optimizadas de HotStarTaq® DNA Polymerase, de cloreto de magnésio, de dNTPs e de um tampão especial para a utilização em multiplex PCR, que consiste na combinação de sais e aditivos que asseguram eficiências de annealing reprodutíveis. A HotStarTaq® DNA Polymerase aumenta a especificidade, de forma a que à temperatura ambiente não se formem produtos de PCR inespecíficos, nem dímeros de primers. A solução Q fornecida neste kit permite a amplificação das zonas ricas em GC ou alvos com estrutura secundária complexa. [20] Animais transgénicos, como por exemplo o rato, podem ser detectados por este método, através da distinção entre o locus wild-type e o locus mutante. Essa distinção é feita através da utilização de primers especificamente desenhados para cada caso. [21]

Figura 16 - Mapa da região amplificada por multiplex PCR.

in: http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit.

Na Figura 17, um dos primers está localizado no locus wild-type. Foram desenhados dois primers reversos, um específico para o locus wild-type e outro para o locus mutante; dando origem a produtos de PCR com diferentes tamanhos.


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Figura 17 - Rastreio de ratos transgénicos utilizando o kit QIAGEN Multiplex PCR. O kit

possui três primers específicos para o locus do gene 2 da recombinação. Os primers foram desenhados de forma a originar produtos de PCR de diferentes tamanhos permitindo a distinção entre o rato homozigoto wild type (wt), o rato heterozigoto mutante (ht) ou o homozigoto mutante (hm). in: http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit.

3.3.2.2. Nested PCR PPrriinnccííppiioo:: Nesta técnica são utilizados dois conjuntos de primers de amplificação, em que a sequência alvo de um dos conjuntos de primers está compreendida no produto de amplificação do outro conjunto de primers. VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess::

− Aumenta a sensibilidade e especificidade da reacção. EExxeemmpplloo::

Detecção em amostras clínicas, da bactéria Vibrio vulnificus, por Nested PCR.

Vibrio vulnificus é uma bactéria halófila de estuário que provoca septicémia

primária fatal e gangrena. A septicémia é uma infecção que ocorre devido à entrada de bactérias virulentas na corrente sanguínea. Posteriormente, multiplicam-se e libertam uma substância, a hemolisina, que é capaz de lisar hemácias e outras células.[22] A infecção desencadeia-se a seguir à ingestão de marisco cru. V. vulnificus tem um efeito mais nocivo em indivíduos com doenças hepáticas, com hábitos de elevado consumo de álcool e com HIV.


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O género Vibrio inclui mais do que 30 espécies, das quais 12 são patogénicas para o Homem, ou têm sido isolados de amostras clínicas humanas. Oito destas espécies de Vibrio associadas a humanos foram isoladas de amostras clínicas extraintestinais. Para um diagnóstico preciso, V. vulnificus deveria ser diferenciada de pelo menos outras sete espécies de Vibrio extraintestinais.[23]

Esta infecção progride de forma bastante rápida e a percentagem de

mortalidade é superior a 50% em apenas um ou dois dias após a sua admissão no hospital. Mesmo com o equipamento mais sofisticado ou métodos de detecção presuntivos rápidos que se socorram de meios diferenciais, são necessários mais do que dois dias para a identificação precisa de V. vulnificus a partir de amostras de sangue ou tecido. Normalmente, os médicos iniciam uma terapia utilizando vários antibióticos sem esperar pelos resultados dos testes das culturas, no entanto, este tratamento não é específico. Para que seja administrada uma terapia eficaz, é crucial reduzir ao mínimo o tempo necessário para a identificação do microrganismo responsável pela infecção, de modo que a que se possa iniciar um tratamento baseado em antibióticos específicos para a septicémia provocada por V. vulnificus.[23]

A grande vantagem do diagnóstico através do método de nested PCR consiste no tempo necessário para efectuar o teste, o qual é realizado em cerca de 6 horas. Para além disso, consegue-se uma melhor sensibilidade e especificidade nesta técnica quando comparada com a PCR simples.[23]

Figura 18 - Mapa da região amplificada por Nested-PCR do gene de V. vulnificus. O gene que codifica para a hemolisina (vvh) é clonado no plasmídeo pCVD 702 . O conjunto de primers externo P1-P2 amplifica um segmento de DNA de 704bp e, o conjunto de primers interno P3-P4 amplifica o segmento de DNA interno de 222bp. As setas a cheio indicam a direcção e as ORFs dos genes vvh. in: http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/10/2887


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Figura 19 -

Electroforese dos produtos de amplificação enzimática do DNA de V. vulnificus. Esta electroforese foi realizada a partir de amostras de soro de pacientes com septicémia. A- DNA ladder de 100bp; B- controlo positivo (pellet de V. vulnificus C7184); C- controlo negativo; D a I- produtos de amplificação do DNA de amostras de pacientes. A seta indica a banda alvo. in: http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/10/2887

3.3.2.3. MSP-PCR (methylation specific PCR) PPrriinnccííppiioo::

Para distinguir o estado de metilação de uma sequência de DNA, a técnica MSP apoia-se em modificações químicas diferenciais que ocorrem nos resíduos de citosina do DNA. Assim, inicialmente, procede-se ao tratamento do DNA com bissulfito de sódio, o qual converte os resíduos de citosina não metilados em uracil, mas não altera as citosinas metiladas. Esta modificação cria assim sequências diferentes de DNA, originando DNA metilado e não-metilado, sendo estes usados como molde para PCR.

Os primers são desenhados para um determinado locus com 80-250bp e,

com a capacidade para distinguir DNA metilado de DNA não metilado. O número e a posição de citosinas dentro do dinucleótido CpG determina a especificidade dos primers para os moldes metilados e não metilados. Tipicamente, 1-3 locais CpG estão incluídos em cada primer e estão concentrados na região 3’ de cada primer. Este conjunto de características fornece uma especificidade óptima e minimiza os falsos positivos que possam ocorrer devido a emparelhamentos errados. [24]

São desenhados dois pares de primers, um par contém sequências cujas

A B C D E F G H I


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citosinas não estão alteradas (metiladas no DNA genómico) e o outro par de primers contém sequências cujas citosinas estão alteradas (não metiladas no DNA genómico). Uma comparação entre resultados de PCR que utilizem os dois pares de primers revela o estado de metilação do DNA. Desta forma, se o par de primers com a sequência alterada der origem a um produto de PCR, então a citosina indicada estava não metilada. Por sua vez, se o par de primers com a sequência não modificada originar um produto de PCR, então as citosinas estavam metiladas pois estavam protegidas da alteração induzida pelo bissulfito de sódio.

São realizadas duas reacções de PCR com a amostra de DNA. Uma

reacção é feita com o DNA originalmente metilado para o gene de interesse (amostra suspeita de conter citosinas metiladas) e, outra reacção com o DNA originalmente não metilado (amostra que não tem citosinas metiladas).

Figura 20 - Esquema da técnica de MSP-PCR.

in: http://www.oncomethylome.com/technology.htm Para facilitar a análise simultânea das reacções metiladas e não metiladas

de um dado gene feitas num mesmo termociclador, deve-se ajustar o comprimento dos primers, de forma a originar temperaturas de annealing semelhantes. Tal facto, resulta num produto não metilado com mais alguns pares de bases do que o produto metilado, obtendo-se duas bandas diferentes no gel de electroforese, permitindo assim a sua diferenciação. A presença de uma banda de um dado peso molecular, indica a presença de alelos não metilados e/ou metilados na amostra original.[24]


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VVaannttaaggeennss ee lliimmiittaaççõõeess:: −− Método rápido e simples; −− Método que apresenta extraordinária sensibilidade, permitindo a detecção

de uma cópia de um gene metilado em 1000 cópias não metiladas, mantendo a especificidade;[25]

−− Depois da amplificação por PCR e da electroforese em gel, os resultados são obtidos imediatamente sem necessitar de nenhuma análise complementar;

−− Método com custos reduzidos e de fácil execução, permitindo o estudo de marcadores múltiplos através de uma rápida análise;

−− Necessita de pequenas amostras de DNA; −− Esta técnica permite apenas mapear padrões de metilação no DNA.

EExxeemmpplloo::

Detecção de cancro da próstata por metilação específica-PCR (MSP-PCR). A metilação do DNA consiste na adição de um grupo metil a certas

citosinas, sendo esta modificação química catalisada por uma enzima denominada metiltransferase. Em eucariontes superiores o DNA é metilado apenas em certas citosinas localizadas na extremidade 5’, as quais passam a guanosinas. Em células normais, a metilação ocorre predominantemente em regiões do DNA que são pobres em repetições CG. As regiões promotoras de genes que controlam a expressão de proteínas são normalmente ricas em ilhas CpG (regiões em que os resíduos CG são predominantes), pelo que em células normais encontram-se pouco metiladas. [26]

As ilhas CpG encontram-se dentro dos promotores de 60% dos genes

humanos e, normalmente não se encontram metiladas, não obstante o grau de expressão do gene. A metilação aberrante (hipermetilação) do promotor conduz geralmente à inibição irreversível da transcrição do gene.[27] A hipermetilação de regiões promotoras é muitas vezes um factor decisivo na inactivação de genes supressores de tumores em cancros humanos. Uma vez que os padrões de metilação são específicos para tumores, o seu mapeamento tem-se tornado numa importante ferramenta para compreender a expressão dos genes nos tumores. A hipermetilação dos promotores dos genes pode ser um valioso marcador de tumores pois: - Ocorre com muita frequência e são sempre encontrados na mesma posição de um gene;

- Podem ser usados líquidos acessíveis como amostra (soro, etc.), o que


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elimina a necessidade de ter uma amostra complexa do tumor.[26]

O adenocarcinoma da próstata é o cancro mais frequentemente diagnosticado entre os homens no mundo ocidental. É uma doença multifactorial, na qual estão envolvidos diversos factores ambientais e genéticos. A hipermetilação do promotor do gene GSTP1 (normalmente expresso em tecido epitelial humano normal, incluindo a próstata) é a alteração mais frequente no DNA em carcinomas prostáticos, ocorrendo em mais de 90% destes. Esta hipermetilação encontra-se ausente em tecido hiperplástico prostático normal ou benigno. Como tal, a frequência de metilação fornece um óptimo marcador molecular de cancro da próstata.[28] O gene GSTP1, localizado a 11q13, pertence à superfamília dos genes das enzimas Glutationa S-transferase (GSTs). Estas enzimas estão envolvidas na destoxificação de compostos electrofílicos, tais como carcinogeneos e xenobióticos, por conjugação da glutationa. Pensa-se que estas enzimas estejam envolvidas na protecção do DNA contra danos oxidativos.[29] A hipermetilação do promotor do gene GSTP1 é frequentemente associada à perda de expressão da enzima GSTP, sendo este o efeito mais comum descrito para o adenocarcinoma da próstata. A inactivação de GSTP1 pode, também, levar a um aumento da vulnerabilidade celular para danos oxidativos no DNA, podendo ocorrer uma acumulação de aductos de DNA, os quais originam alterações genéticas relevantes nas células tumorais.[29]

Figura 21 -

DNA isolado do carcinoma prostático (C) e de tecido prostático hiperplástico benigno (B) por MSP-PCR. O DNA foi modificado com bissulfito e foi realizada uma MSP com 32 ciclos. Os primers eram específicos para um fragmento de 92bp do gene GPTP1, derivado da sequência metilada (azul), ou para um fragmento de 99bp derivado da sequência não metilada (verde). Os produtos da PCR foram resolvidos num gel de poliacrilamida e visualizados usando a detecção laser-fluorescência. A amostra de carcinoma tem a presença tanto de sequências metiladas como não metiladas, devido à presença de células normais na amostra. in: http://www.qiagen.com/clinical/applications /oncology/prostate_cancer_i.asp


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3.3.2.4. Real-time PCR A primeira experiência tendo por base a tecnologia que daria origem ao real-time PCR foi executada em 1990, tendo sido desenvolvida e patenteada em 1999. PPrriinnccííppiioo::

O sistema de real-time PCR permite a detecção dos produtos de PCR ao longo da reacção, sendo a informação recolhida na fase exponencial da reacção de PCR. Apenas nesta fase, a quantidade de fluorescência medida é directamente proporcional à quantidade de produto amplificado. Esta técnica permite uma quantificação fácil de DNA e RNA.[30]


− Permite a quantificação da amplificação ao longo do processo ao contrário das PCR convencionais (em que a quantificação só é possível no final da reacção);

− O processamento dos resultados depois da reacção de PCR é efectuado por um software adequado;

− Minimiza problemas de contaminação; − Possui elevada sensibilidade e especificidade; − Fácil de realizar e com possível automatização; − Possui maior reprodutibilidade relativamente aos métodos convencionais.


39

A quantificação dos produtos da amplificação pode ser feita de duas formas:

Ensaio da 5´nuclease associada à Fluorescent Resonant Energy Transfer (FRET) Figura 22 - Ensaio 5´nuclease. Em que 1- adição de uma sonda que possui um repórter

fluorescente de elevada energia na extremidade 5’, uma molécula de baixa energia denominada por quencher na extremidade 3’ e uma sequência complementar à zona intermédia entre os dois primers. Quando a sonda está intacta e excitada por uma fonte luminosa, a libertação da partícula repórter é suprimida pela partícula quencher devido à sua proximidade; 2- a polimerase (P) inicia a amplificação em direcção à sonda; 3- quando a polimerase encontra a sonda, esta é clivada pela actividade 5´ exonucleolítica da enzima. O afastamento entre as duas partículas fluorescentes leva a um aumento da fluorescência da partícula repórter e a uma diminuição da fluorescência da partícula quencher. in: http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf

Vantagens e limitações: − Hibridação específica entre a sonda e o alvo, o que origina um sinal

fluorescente; − As sondas podem ser feitas com repórteres diferentes permitindo a

distinção de duas sequências distintas numa só PCR; − A análise de resultados é simples; − É necessário construir diferentes sondas consoante a sequência a

analisar.[31]

SYBR Fluorescência Verde


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Figura 23 - SYBR Fluorescência Verde. Em que: A- cadeia de DNA desnaturada e partículas de SYBR verdes livres, o que se traduz numa ausência de sinal; B- ligação dos primers às cadeias desnaturadas e início da polimerização, com a incorporação das partículas de SYBR verdes; C- produto da amplificação com as partículas de SYBR intercaladas dando origem a um sinal fluorescente.

in:http://fermat2.cer.jhu.edu/~as410610/geneorg_summer_2003/lecture_pdf/Real_Time_PCR.PDF

Vantagens e limitações: − Consegue monotorizar a amplificação de qualquer sequência de DNA em

cadeia dupla; − Não são necessárias sondas, reduzindo o custo do processo; − Pode originar sinais falsos positivos, porque a partícula verde de SYBR

liga-se a qualquer cadeia dupla de DNA, inclusive a sequências não específicas.[31]


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EExxeemmpplloo:: Detecção de Salmonella em produtos alimentares através da utilização do kit LightCycler foodproof Salmonella. A espécie Salmonella entrica é nociva, podendo provocar diarreia. Esta espécie pode ser encontrada em alimentos de origem animal (bife, leite, ovos) ou vegetal.

O kit de detecção de Salmonella é utilizado para quantificar o DNA de

Salmonella existente numa amostra de comida. Contém primers e sondas de hibridação (específicas para a zona de detecção), bem como um controlo interno (CI), de forma a evitar uma má interpretação de falsos negativos. As sondas de hibridação são desenhadas de forma a se ligarem ao controlo interno, sendo este detectado a um comprimento de onda diferente do do DNA de Salmonella no LightCycler Instrument. O kit possui todos os reagentes com a excepção do material a analisar e por isso minimiza o risco de contaminação. [32]

O processo ocorre em quatro passos: Passo 1- Utilizando os primers de sequência específica para o controlo

interno e para a sequência característica de Salmonella (na região 16S do rDNA por ser uma região altamente conservada), a PCR é efectuada num LightCycler Instrument, permitindo a amplificação e a detecção dos fragmentos dos genes específicos de Salmonella.

Passo 2- O LightCycler Instrument detecta os fragmentos amplificados em

tempo real, através da fluorescência gerada pela ligação das sondas. Para cada sequência específica, uma sonda de hibridação é marcada na extremidade 5´ com o fluoróforo vermelho LightCycler (LightCycler Red 640 ou LightCycler Red 705 para a detecção do controlo interno) e, para evitar a extensão, é modificado na extremidade 3´ por fosforilação. A outra sonda é marcada na extremidade 3´ com fluoresceína LightCycler.

Passo 3- Durante a fase de annealing de cada ciclo de PCR, estas sondas

hibridam com uma zona interna da sequência específica. Só quando hibridam perto uma da outra é que estas sondas originam FRET entre os dois fluoróforos. Durante a FRET, a fonte luminosa do LightCycler Instrument, excita o fluoróforo dador (fluoresceína LightCycler) e parte da energia de excitação é transferida para o fluoróforo aceitador (fluoróforo vermelho LightCycler).

Passo 4- O LightCycler Instrument mede a fluorescência emitida pelo

fluoróforo vermelho LightCycler. [33],[34]


42

3.3.3. Utilização de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) PPrriinnccííppiioo:: O avanço da tecnologia em genética permitiu alterar as características naturais dos microrganismos, transformando-os em organismos geneticamente modificados. Estes passaram a ser utilizados para a produção de proteínas com aplicação na medicina (quer em diagnóstico quer em terapêutica), a agricultura (plantas modificadas), a obtenção de novos produtos alimentares, a tecnologia associada ao uso de enzimas, a biorremediação e a detecção de poluentes no ambiente. [35]

A escolha do microrganismo depende de vários factores, sendo sem

dúvida o seu carácter não patogénico um factor primordial. Os outros factores incluem as características do gene a clonar (frequência dos codões utilizados) e da proteína codificada (processamento proteolítico, glicosilação, massa molecular). São igualmente importantes as características fisiológicas do microrganismo, nomeadamente a taxa de crescimento, as fontes de carbono e energia e a capacidade de excretar a proteína heteróloga.[35]


− Produção em larga escala, eficiente e de baixo custo; −− Para aplicações directamente relacionadas com os seres humanos só é

permitida a utilização de microrganismos considerados seguros (Generally Regarded As Safe - GRAS).

EExxeemmpplloo:: Detecção de arsénio biodisponível em águas para consumo através do Biological heavy metal kit da Aboatox.

O arsénio encontra-se largamente distribuído em toda a crosta terrestre. Este metalóide é introduzido na água através da dissolução de minerais e minérios ou de efluentes industriais. A exposição prolongada ao arsénio, através da ingestão de água contaminada, resulta num envenenamento crónico e provoca cancro da pele, dos pulmões, da bexiga e do rim, assim como alterações da pigmentação e espaçamento da pele (hiperqueratose).

A quantificação precisa de arsénio em águas para consumo e em níveis

relevantes para a saúde pública, requer análises laboratoriais através de equipamentos e técnicas sofisticadas e caras, assim como mão-de-obra


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qualificada, algo que não está ao alcance dos países subdesenvolvidos. Daí a importância do desenvolvimento de kits que possam ser facilmente transportados e que permitam a detecção de baixas concentrações de arsénio.[36],[37]

O kit referido consiste num biosensor, ou seja, numa bactéria geneticamente modificada capaz de medir o arsénio biodisponível, que é a fracção de arsénio disponível para a assimilação biológica (factor importante para determinar a toxicidade do metal). Para a obtenção desta bactéria, um gene repórter (gene que codifica para a luciferase) é acoplado a genes de resistência ao arsénio e inserido numa estirpe de uma bactéria hospedeira. Na presença de arsénio, o biosensor emite uma quantidade de luz que pode ser medida e usada para determinar a concentração de arsénio biodisponível. [37]

Figura 24 - Mecanismo geral do Biosensor.

in: http://www.clu-in.org/download/char/bacterial_biosensors.pdf

Figura 25 - Teste da presença de arsénio. A- o biosensor é adicionado à amostra; B- na

ausência de metal, a síntese de luciferase é reprimida e a bactéria emite pouca quantidade de luz; C- na presença de metal, a síntese de luciferase é activada e a bactéria emite uma elevada quantidade de luz. in: http://www.aboatox.com/environmental_analysis.html


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Este teste permite detectar concentrações subtóxicas e, é muito rápido quando comparado com os métodos laboratoriais, permitindo testar centenas de amostras diariamente.[38]

3.3.4. Biochips PPrriinnccííppiioo::

Em 1998 alguns investigadores conseguiram fazer um "casamento" entre ferramentas de investigação biológica e a tecnologia dos microprocessadores, permitindo o desenvolvimento de um número variado de sensores (micromáquinas), desde “narizes” e “línguas” electrónicas até sensores para a identificação de moléculas de DNA. Estas micromáquinas conseguem efectuar o trabalho de muitos técnicos de laboratório, como por exemplo o processamento do DNA, análises de sangue, testes de doenças genéticas, etc. Assim, um dos avanços recentes nas técnicas citogenéticas foi o desenvolvimento dos chips biológicos, biochips ou microarrays, que permitem a análise de uma grande quantidade de alterações genéticas ao mesmo tempo.

Os biochips são pequenos rectângulos recobertos de vidro, ou silicone, que

servem como plataforma para fixação de DNA. Estes chips foram projectados para o estudo de DNA, RNA ou outras substâncias orgânicas.

A hibridação entre a sonda fixada ao chip e qualquer sequência de ácido

nucleico presente numa amostra, ocorre quando existe complementaridade entre estas. A amostra a ser estudada deverá ser marcada então com um fluorocromo e adicionado ao biochip, permitindo assim a identificação da ocorrência de hibridação. Posteriormente, o biochip é lavado para que as sequências não hibridizadas sejam retiradas. As sequências perfeitamente hibridizadas geram fluorescência intensa, enquanto outras sequências com discordância de uma única base geram fluorescência de menor intensidade. Programas electrónicos sofisticados permitem a análise dos resultados.[39]


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Figura 26 - Biochip. Os pontos sem fluorescência representam o caso em que não ocorre

hibridação; os pontos fluorescentes azuis resultam da hibridação entre cDNA de tecido cancerígeno e cDNA fixo ao biochip; os pontos fluorescentes vermelhos resultam da hibridação entre cDNA de tecido normal e cDNA fixo ao biochip e, os pontos fluorescentes amarelos resultam da hibridação entre cDNA de ambos os tipos de tecidos e cDNA fixo ao biochip. in: www.thelifewire.com/conindex.htm?17

De um modo geral, os biochips apresentam larga aplicação no campo

farmacêutico (farmacogenómica), no estudo das mutações e variações genéticas (incluindo o diagnóstico de cancro), no diagnóstico preciso de agentes infecciosos e na identificação de genes responsáveis pela resistência aos agentes antimicrobianos.

Os biochips são também utilizados para o estudo da estrutura de genomas

inteiros, no estudo da expressão de genes activos, ordenamento e sequenciação dos genes, determinação das variantes genéticas e várias outras aplicações estão a ser desenvolvidas.


− Necessita de pouco tempo para a execução da técnica; − Necessita de uma pequena quantidade de amostra; − Num único chip podem ser analisados milhares de genes simultaneamente; − A possibilidade de automatização que permite a realização de exames em

larga escala sem prejuízo da fidelidade, podendo contribuir para a diminuição do custo;

− À medida que aparelhos portáteis para análise dos dados forem desenvolvidos, os biochips passarão a ocupar também lugar de destaque nos consultórios médicos;

− O custo actual do equipamento é elevado; − Problemas de padronização e consistência (variações entre experiências);


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− É necessário um controlo de qualidade rigoroso, para garantir que as alterações genéticas que são identificadas não são simplesmente devido a defeitos e variações entre arrays;

− Os níveis de expressão do mRNA não representam necessariamente os níveis de proteínas nas células. É sabido que as proteínas também podem ser alteradas por vários processos que ocorrem a seguir à transcrição do DNA em mRNA ou, a seguir à tradução do mRNA em proteína. Este facto significa que, quaisquer mudanças com significado sugeridas por uma experiência de array, têm de ser subsequentemente verificadas por RT-PCR ou por Northern blot, e Western blot para determinar alterações nos níveis de proteína;

− Uma amostragem precisa (hora e mês) e capacidade de analisar amostras de tecido homogéneo são passos cruciais para obter uma análise precisa.[40]

EExxeemmpplloo:: Detecção de variações naturais nos genes CYP2D6 e CYP2C19, através do biochip AmpliChip CYP450.

A 25 de Junho de 2003, a Roche anunciou o lançamento do microarray AmpliChip CYP450 nos Estados Unidos, o primeiro microarray da companhia para aplicações clínicas. Este chip permite identificar determinadas variações naturais (denominadas polimorfismos) em dois genes: CYP2D6 e CYP2C19, membros da família do citocromo P450, os quais desempenham o papel principal no metabolismo de fármacos.[41]

Figura 27 - Microarray AmpliChip CYP450. in: http://diagnostics.roche.com/products_services/amplichip_cyp450.html#links

O biochip AmpliChipTM, feito a partir da tecnologia da Affymetrix usa a fotolitografia e uma fase sólida química. Cada microarray contém centenas de milhares de oligonucleotídeos sonda. O chip tem um tamanho semelhante a uma unha de um dedo da mão.

O citocromo P450 é constituído por uma família de cerca de 60 genes, sendo conhecidas as mutações ou polimorfismos que ocorrem nestes genes. No


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entanto, apenas alguns genes são responsáveis pela metabolização de fármacos, nomeadamente 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 e 3A4. Estudos já realizados indicam que o CYP2D6 é um dos genes mais importantes da família do CYP450, pois é responsável pela metabolização de dezenas de fármacos, incluindo analgésicos, antidepressivos, antihistamínicos e medicamentos para o coração e para tensão arterial.[42]

As variações mencionadas, têm um papel crucial na determinação da forma como uma pessoa processa ou metaboliza vários fármacos. O conhecimento destas variações, quando consideradas com outros factores que também contribuem para a doença, pode ajudar o médico a seleccionar o melhor fármaco e ajustar a dose para o paciente (podendo também levar à redução de custos relacionados com a saúde), bem como evitar o uso de fármacos que possam provocar sérias reacções adversas.

Através do reconhecimento de polimorfismos ou mutações comuns no DNA nos genes já referidos, os chips de DNA podem determinar se uma pessoa é um metabolizador fraco (MF) ou um metabolizador ultra-rápido (MU). Os MF apresentam problemas na inactivação e na eliminação de certos fármacos. Geralmente os MF apresentam um elevado risco para sofrer reacções adversas a fármacos e risco de toxicidade.

Por outro lado, os MU apresentam cópias adicionais e funcionais dos genes e, como tal, têm um elevado risco de não apresentarem resposta na presença de fármacos, pois os MU podem inactivar ou eliminar um fármaco antes que este tenha a hipótese de alcançar o seu efeito terapêutico.

O processo de hibridação é simples e tem por base as seguintes etapas:

− extracção do DNA presente na amostra (pequena quantidade de sangue ou células do interior da bochecha);

− amplificação da zona de interesse usando a técnica de PCR; − marcação do produto da PCR com um fluorocromo; − aplicação do mesmo sobre o microarray.

O local no chip onde ocorrer o aparecimento de um ponto fluorescente corresponde ao local de hibridação e, a fluorescência é visível utilizando para tal uma tecnologia de laser.


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A B C D

3. 4. Complementação entre técnicas As técnicas descritas no capítulo dos Testes Imunológicos (3.2.) podem ser usadas em conjunto com as técnicas de engenharia genética (3.3.) de forma a criar outros testes, dos quais iremos dar dois exemplos. 3.4.1. Imunocaptura e transcrição-reversa PCR (RT-PCR) PPrriinnccííppiioo:: Os anticorpos contra um determinado vírus (partícula antigénica) são adsorvidos a material plástico. Sobre estes anticorpos adiciona-se a amostra que contém, hipoteticamente, os antigénios. A este processo dá-se o nome de imunocaptura. Depois da formação do complexo anticorpo-vírus são necessárias várias lavagens do mesmo, de forma a remover os constituintes presentes na amostra que possam interferir na reacção de PCR. Após estas lavagens, a temperatura é aumentada para que ocorra a desnaturação da cápsula viral e seja libertado para o meio o ácido nucleico do vírus.[43] No caso do ácido nucleico do vírus ser RNA, este tem de ser transcrito em cDNA pela acção da transcriptase reversa na presença de todos os constituintes necessários à amplificação por PCR. Os produtos de PCR são analisados por electroforese em gel de agarose. O seu peso molecular pode ser determinado por comparação com o padrão de migração dos marcadores de peso molecular.

Figura 28 - Princípio da imunocaptura e transcrição reversa PCR. A- imunocaptura, B- desnaturação por acção térmica, C- transcrição reversa e D- PCR. in: KOENIG, R. e LESEMANN, D. Plant Virus Identification Encyclopedia of Life Sciences 2001


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− Pode ser usado para viroses e vírus que não produzem proteínas para a cápsula viral;

− A PCR é muito sensível e, como já foi referido, é preciso ter cuidado com contaminações, pois estas podem resultar em reacções que levam ao aparecimento de falsos positivos;

− É mais oneroso e mais demorado do que o ELISA; − É necessário conhecer o RNA dos vírus para poder desenhar os primers.

Não é possível utilizar para novos vírus, só usando zonas do RNA altamente conservadas para certas famílias de vírus.[43]

EExxeemmpplloo:: Detecção do vírus citrus tristeza (CTV) em citrinos.

O vírus citrus tristeza causa uma das mais perigosas doenças em citrinos e trata-se do vírus patogénico, economicamente mais importante neste tipo de colheita.

O CTV pertence ao grupo dos Closterovirus. Estes viriões não têm uma

estrutura rígida e o seu genoma consiste em RNA de cadeia simples não-segmentado. A sequência do genoma de CTV contém doze janelas de leitura (ORFs), potencialmente codificadores de, pelo menos, dezassete proteínas. As ORFs 7 e 8 codificam para proteínas que já foram identificadas como sendo proteínas da cápsula viral. Vários isolados de CTV foram já totalmente sequenciados.[44]

A primeira etapa da análise deste vírus consiste na adsorção de uma

mistura de dois anticorpos monoclonais (3DF1 e 3CA5), capazes de reconhecer todos os isolados testados de CTV a partir de diferentes colecções internacionais. De seguida, submete-se a amostra (extracto de citrino previamente tratado com tampão fosfato) à imunocaptura. Depois desta, os tubos são lavados e a solução obtida é submetida a uma RT-PCR, com os respectivos primers para o vírus em questão. [44]


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3.4.2. Sondas e Imunocaptura PPrriinnccííppiioo//EExxeemmpplloo:: Detecção de vírus papiloma humano (HPV) através da tecnologia de Hybrid Capture®. O HPV são vírus causadores de tumores que pertencem à família Papovaviridae. Estudos efectuados demonstram que as infecções do cervix por HPV originam cancro passado aproximadamente 12 meses. A detecção deste vírus na fase de progressão (Figura 29) facilita o tratamento deste tipo de cancro.[45]

Figura 29 - Desenvolvimento natural do cancro cervical. in: http://www.mlo-online.com /ce/pdfs/mar03.pdf


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O sistema de Hybrid Capture® (HC) é um teste de amplificação de sinal que utiliza anticorpos para efectuar a captura. A detecção do sinal é efectuada por luminiscência química. O processo ocorre em 5 passos:

Figura 30 - Tecnologia de Hybrid Capture®. A- amostra em estudo é colocada numa

solução básica de modo a provocar a quebra da estrutura do vírus, levando à libertação do DNA; B- o DNA é combinado com sondas de RNA específicas, dando origem a híbridos RNA-DNA; C- estes híbridos são reconhecidos por anticorpos específicos; D- o complexo formado é reconhecido por anticorpos conjugados com fosfatase alcalina, amplificando o sinal; E- o sinal é obtido pela detecção da ligação da fosfatase alcalina, com luminiscente químico (susbtrato dioxetano). Através da clivagem por fosfatase alcalina, o substrato é convertido num produto capaz de emitir luz, que é quantificada. in: http://www.digene.com/lifesciences_2_1_1.html


− Resultados de fácil visualização no mesmo dia; − Fornece dados relevantes de uma forma barata; − Sensibilidades equivalentes às das tecnologias existentes para a

amplificação de zonas específicas de DNA, mas sem a complexidade das mesmas;

− Não é necessário um laboratório sofisticado e pessoal especializado; − O teste pode ser feito com uma amostra pequena, facilitando o processo; − Não é susceptível a problemas de contaminação.[46],[47]


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4. Perspectivas Futuras

O futuro do Imunodiagnóstico O desenvolvimento de anticorpos monoclonais revolucionou o diagnóstico

imunológico, pois trouxe a possibilidade de se obter de modo económico, grandes quantidades de anticorpos específicos. Isso levou ao desenvolvimento de novos testes, mais sensíveis, rápidos, específicos e de execução mais fácil. A maioria dos testes mais recentes exige um menor input humano e menos pessoal com formação especializada. Determinadas técnicas não imunológicas (os TEGs), tais como PCR e sondas de DNA, estão a ser cada vez mais utilizadas.

Actualmente, a maioria dos testes imunológicos aplica-se à detecção de

doenças, no entanto, num futuro próximo, é provável que sejam desenvolvidas ainda mais aplicações direccionadas na previsão do desenvolvimento de doenças. [4]

O futuro dos testes baseados em técnicas da engenharia genética

É provável que os principais factores genéticos envolvidos na susceptibilidade de doenças comuns, tais como diabetes, doenças cardíacas, doença de Alzheimer e alguns tipos de cancros, venham a ser descobertos na próxima década. Para os indivíduos que estão em risco de desenvolver estas doenças, em alguns casos, uma alteração do seu estilo de vida, alimentação e uma maior vigilância médica pode ser benéfico. Isto vai favorecer o aparecimento de uma grande variedade de TEGs que permitam a identificação de predisposições individuais para uma futura doença, para virtualmente qualquer indivíduo.[16]

Exemplo de futuras aplicações dos TEGs - Análise por PCR do esperma para identificar malformações genéticas A concepção por fertilização in vitro possibilita que seja efectuado o screening dos embriões através do diagnóstico de pré-implantação (PGD). No entanto, através desta técnica podem não ser detectadas todas as malformações genéticas, pois este procedimento envolve a realização de análises laboratoriais a apenas uma célula dos embriões fertilizados. Os embriões que possuírem genes com malformações não são transferidos para o útero da mulher. Este descarte de embriões levanta questões éticas, que não serão abordadas neste trabalho.


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O screening do esperma por PCR, antes da fertilização in vitro, aparenta ser uma opção ao PGD, podendo efectuar-se a detecção de anomalias genéticas no esperma a ser injectado nos óvulos. Deste modo, evitar-se-iam os problemas éticos referidos anteriormente. Este projecto foi apresentado, em Agosto do corrente ano, no encontro anual da European Society para a Human Reproduction and Embryology. Existem algumas dúvidas acerca da manutenção da integridade do esperma após a reacção de PCR, sendo necessário prosseguir a investigação neste campo.[48]


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5. Problemas Éticos

Nesta secção são enunciados alguns dos problemas éticos que se relacionam com o recurso a tecnologias da engenharia genética, para efectuar o diagnóstico de doenças humanas, tais como: os benefícios e desvantagens dos TEGs, quem deve efectuá-los, quais as entidades que devem ter acesso aos resultados, a eugenia e, por fim, a necessidade do aconselhamento genético.

Quando é que devem ser efectuados testes baseados em técnicas da engenharia genética (TEGs):

Actualmente, já existem TEGs que permitem diagnosticar cerca de duas dezenas de desordens genéticas.[15] Efectuar TEGs para doenças que podem ser prevenidas ou tratadas pode ser benéfico, na medida em que permite que um determinado indivíduo receba um tratamento adequado e altere o seu modo de vida, por forma a reduzir o risco de desenvolvimento da doença.

Por outro lado, o diagnóstico de doenças incuráveis e para as quais não

existe qualquer tipo de tratamento (como por exemplo a doença de Alzheimer), parece não trazer qualquer tipo de vantagem.[49] Benefícios dos TEGs

Quando se efectua um TEG, um resultado negativo pode gerar um

tremendo sentimento de alívio e pode eliminar a necessidade da realização de check-ups e testes com alguma frequência, algo que é necessário por exemplo em famílias com um elevado risco de desenvolvimento de cancros. [15]

Desvantagens dos TEGs É importante referir que os TEGs apenas podem dar a probabilidade e não

a certeza de um determinado indivíduo vir a desenvolver uma certa doença ou patologia. No entanto, o público em geral não tem os conhecimentos científicos necessários para compreender esta diferença, pelo que tende a pensar que estes testes são 100% fiáveis.

Um indivíduo cujo resultado de um TEG seja positivo, pode vir a ser

considerado pelos seus pares, como estando doente ou como sendo um potencial doente. Esta situação pode trazer problemas sociais e psicológicos, tanto ao indivíduo em causa como aos seus familiares.

Existem outras situações em que, devido a resultados positivos para

doenças incuráveis e para as quais não existe qualquer tipo de tratamento, o


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indivíduo se sinta impotente, na medida em que não pode controlar o seu estado de saúde. Nestes casos, os TEGs podem ter um impacto particularmente negativo. Devido a isto, em 1993, o Instituto de Medicina da Academia Nacional de Ciências dos EUA, aconselhou contra a realização de testes para as doenças que não podem ser prevenidas ou que são incuráveis. [49]

É também necessário considerar os casos em que devido ao padrão de

hereditariedade de uma mutação genética, o facto de efectuar testes a um membro de uma determinada família pode ser equivalente a testar todos os membros da família. Pode ocorrer que um determinado membro da família não queira ser testado para essa mutação.

Os TEGs também podem criar conflitos entre casais, na medida em que

indivíduos que são testados positivamente para mutações provocadas por delecções, poderem decidir acerca de terem ou não filhos (Exemplo: Doença de Huntigton).[49]

Confidencialidade dos resultados dos TEGs Actualmente, quando preenchemos formulários para seguros de vida ou

seguros médicos, temos de responder a questões acerca do nosso peso, se fumamos ou bebemos bebidas alcoólicas e sobre a nossa história familiar de doenças cardíacas. Estas questões são feitas de modo a efectuar uma estimativa dos riscos de ocorrência de doença no futuro.

A pergunta que surge é, será que com o avanço da investigação científica

no genoma humano e com a criação de mais TEGs para diagnosticar doenças, as companhias de seguro vão passar a exigir que os seus clientes lhes forneçam os resultados dos seus TEGs? Ou talvez exijam a cedência de uma amostra de DNA para que elas próprias possam efectuar os TEGs e, assim estimar o risco de no futuro os seus clientes desenvolverem essas doenças. Se tal acontecesse, e se com base nos resultados determinassem o valor que cada indivíduo deveria pagar, poderiam poupar dinheiro, pois poderiam cobrar mais aos indivíduos que tivessem genes que predispõem para uma determinada doença.

Esta não é uma ideia nova. Em 1994, um relatório do Concelho Americano

das Seguradoras apoia o direito das companhias de seguro de recusar a atribuição de seguros de vida a indivíduos, com base nos resultados de TEGs a genes que predispõem para o cancro. [49]

Uma vez que, tanto os factores genéticos como o modo de vida de um

indivíduo (fumar, beber bebidas alcoólicas em excesso) podem contribuir para o risco de esse indivíduo vir a desenvolver uma determinada doença, porque é que basear o valor do custo de um seguro nos resultados de TEGs em vez de nos


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hábitos do modo de vida de um indivíduo parece ser um problema ético mais grave?

Talvez pelo facto de que um indivíduo poder escolher manter hábitos que

aumentam o risco de desenvolvimento de uma doença, mas não poder escolher os seus genes. Diferenciar o valor do custo de um seguro com base nos resultados de TEGS seria tão grave quanto fazê-lo com base numa discriminação racial ou entre géneros.

Todavia, foram já registados casos de indivíduos que não puderam obter

um seguro de saúde, que perderam empregos ou promoções, e até de indivíduos que foram rejeitados como candidatos em processos de adopção, com base em resultados de TEGs.[15]

Será que os testes pré-natais vão levar à eugenia? Antes do nascimento de uma criança, a mulher grávida pode efectuar um

grande número de testes para saber se o feto tem alguma doença de natureza genética. Em alguns locais, como no estado da Califórnia, as mulheres são de facto encorajadas a serem testadas para defeitos do tubo neural fetal. No entanto, as entidades competentes baseiam o sucesso do programa no número de crianças deficientes que não nasceram e não na divulgação feita junto das mulheres grávidas. Relacionar a prevenção do nascimento de crianças deficientes ao sucesso obtido, sugere que a eugenia negativa motiva o programa.[49]

Os TEGs também podem ser utilizados no diagnóstico de

pré-implantação. Em mulheres férteis, que apresentam risco do embrião vir a desenvolver determinada patologia, podem optar por efectuar a técnica de fertilização in vitro e assim fazer o screening de embriões e, posteriormente, implantar apenas aqueles que não possuem desordens genéticas. Este teste pode ser visto como uma alternativa a exames invasivos, tais como a amniocentese e a análise das vilosidades coriónicas, que por vezes contribuem para o fim espontâneo da gravidez.

Os testes pré-natais e de pré-implantação levantam demasiadas questões

ético-religiosas que não serão abordadas neste trabalho. Apenas pretendemos dar uma percepção de quais as opções que as técnicas de engenharia genética fornecem aos futuros pais, em termos da “gestão” de uma gravidez.


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Aconselhamento Genético A decisão de efectuar TEGs é uma decisão pessoal e deve ser

absolutamente independente. Após receber aconselhamento genético de profissionais devidamente especializados, um indivíduo deve concordar em efectuar os testes não para satisfazer os familiares ou as companhias de seguro, mas sim porque de facto pretende tomar um conhecimento mais aprofundado do seu estado de saúde.[15]


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6. Problemas Sócio-Económicos

6.1. Legislação dos TEGs

Estados Unidos da América

Em Outubro do corrente ano, o Senado americano aprovou uma lei que proíbe as companhias de seguro e entidades empregadoras de efectuem discriminação baseada em informações genéticas de determinados indivíduos.[50]

Esta lei proíbe as companhias de recusarem ou efectuarem qualquer tipo

de discriminação em relação a um pedido de registo de um determinado indivíduo com base nos resultados de TEGs feitos a esse indivíduo; ou a um membro da sua família; ou por ele se recusar a efectuar TEGs; ou fornecer os resultados de TEGs. Também estão proibidas de determinar o valor do custo do seguro com base nos resultados de TEG, assim como, de exigir a sua realização.[50]

A lei acima referida também proíbe que um empregador, uma organização

ou programa de treino, privem um determinado indivíduo de oportunidades de emprego, com base em informações genéticas. Também torna ilegítima a recolha de informações genéticas, excepto quando o empregador: fornece serviços de saúde ou genéticos; necessita de certas informações para cumprir a lei que rege a licença médica, compra documentos que estão pública e comercialmente disponíveis e que incluem a história médica familiar ou, quando é necessário controlar o efeito de substâncias tóxicas no local de trabalho (quando autorizado pelo empregado ou quando exigido por lei). [50]

De acordo com a lei referida anteriormente, toda a informação genética

deve ser tratada como parte do ficheiro médico confidencial de um indivíduo, limitando a sua divulgação a certas entidades, incluindo o indivíduo, a sua família, investigadores da área da saúde ou determinados oficiais do governo. Permite a divulgação, quando autorizada por ordem de um tribunal ou quando é necessária para que um trabalhador aja em conformidade com as leis que regem licença médica. [50]


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Europa

Em 1997, na Convenção sobre os Direitos Humanos e a Biomedicina do Conselho da Europa, foram estabelecidas duas directivas: a proibição de qualquer tipo de discriminação baseada na herança genética de um indivíduo e a autorização da realização de testes genéticos apenas como um diagnóstico de previsão ou para investigação científica ligada à área da saúde e sempre sujeita a aconselhamento genético. Também ficou previsto que a discriminação genética possa ser alvo de penas na forma de multas ou sentenças de prisão até um máximo de 6 meses.[51]

Em alguns países, tais como na Aústria, Bélgica, França, Noruega e Dinamarca, existe legislação que proíbe o uso de informação genética pelas companhias de seguro. Noutros países, o acesso às informações genéticas é permitido em determinadas condições, como nos casos em que o prémio do seguro exceda um determinado limite. Assume-se que o risco de selecção adversa só é real quando estão em questão montantes de dinheiro muito elevados, este é o caso da Holanda, onde as companhias de seguro estão proibidas pelo Medical Examinations Act de procurar a divulgação dos resultados de TEGs quando estão em questão montantes inferiores a 300.000,00 guilders. No Reino Unido, apesar de não existir um carácter legislativo, as companhias de seguro podem ter em conta TEGs que são validados pelo Genetics and Insurance Committee. [52]

A adopção de uma moratória acerca do uso de informações genéticas tem sido uma resposta largamente utilizada pela indústria das seguradoras em toda a Europa, pois o número de TEGs relevantes e precisos, disponíveis é muito reduzido. As moratórias são indefinidas (por exemplo na Finlândia e na Alemanha); por um número limitado de anos (por exemplo na França e na Suíça); ou limitadas a políticas das seguradoras que não ultrapassem um certo valor. [52]

Em Portugal, não existe nenhuma legislação no que diz respeito aos TEGs. No entanto, o Ministério da Saúde está a elaborar guias de orientação relativamente à confidencialidade, privacidade e aconselhamento genético ligados aos TEGs.[52]


60

6.2. Perspectivas económicas A indústria Biotecnológica tem registado um grande desenvolvimento nos últimos anos, atingindo-se em 1997 nos Estados Unidos um volume de vendas de 13 biliões de dollars americanos.[53] Em 2001 este valor subiu para 49,9 biliões de dollars americanos, sendo que as aplicações terapêuticas e de diagnóstico são as que geram mais lucros. A tendência é para que o volume de vendas continue a aumentar nos próximos anos. [54]

05

10152025303540455055

2003 2008 2013

$ Biliões

Terapêutica (11%)

Diagnósticohumano (7%)

Agricultura (14%)

Diagnóstico nãohumano (10%)

Outros (13%)

Gráfico 1 - Perspectivas de vendas da indústria Biotecnológica Norte-Americana.

Fonte: http://www.consultingresources.net/biotechnology.html

Na Europa, a indústria Biotecnológica tem tido um desenvolvimento mais lento devido à falta de investimento. No entanto, pensa-se que no futuro esta situação irá se alterar.[55] A Roche, uma das maiores empresas europeias, estima que o biochip AmpliChip CYP450 gere receitas superiores a 100 milhões de dollars americanos anuais, até 2004.[41]


61

7. Bibliografia [1] PORTO, J. 1967 Enciclopédia Luso-Brasileira de Cultura Volume 6 Lisboa

[2] SANTOS, M. 1964 Enciclopédia Luso-Brasileira de Cultura Volume 2

Lisboa

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[34] http://www.roche-applied-science.com/biochemica/No.4_02/PDF/p19.pdf

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(em 25 de Novembro de 2003) [51] http://conventions.coe.int/treaty/en/treaties/html/164.htm


[52] http://europa.eu.int/comm/research/biosociety/pdf/bmh4_ct98_0550_partb.pdf (em 25 de Novembro de 2003)

[53] http://www.bio.org/aboutbio/guide1.html (em 27 de Novembro de 2003) [54] http://www.mindbranch.com/catalog/print_product_page.jsp?code=R1-2251

(em 27 de Novembro de 2003) [55] http://www.biojapan.de/features/globalbt2003.htm


técnicas de laboratório

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