UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANNFACULTAD DE CIENCIASESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOLOGA MICROBIOLOGA

Tcnicas para el aislamiento de biotoxinas marinas

Asignatura: Microbiologa de los alimentosDocente: Dr. Csar Julio Cceda QuirozEstudiantes: Jos Sandoval Niebles Franco Lin Vigo

TACNA-PER2015INTRODUCCINLas biotoxinas marinas son metabolitos secundarios que producen ciertas microalgas del ecosistema marino. Es probable que se utilicen para competir por el espacio, vencer a las presas o defenderse del crecimiento excesivo de otros organismosDe las casi 4000 especies marinas del fitoplancton microscpico que existen, unas 300 pueden proliferar en nmero tan alto que alcancen densidades de millones de clulas por litro de agua, siendo txicas alrededor de 60 de ellas. Esa alta densidad puede llegar a modificar la coloracin del agua y provocar efectos luminiscentes observables por la noche. Si esta proliferacin es de fitoplancton txico recibe el nombre de floracin algal nociva (HAB, harmful algal bloom), si bien de forma coloquial se le denomina marea roja.Existen distintos tipos de clasificaciones de las biotoxinas marinas, con diferentes estructuras qumicas y mecanismos de accin. Una de las ms empleadas se basa en los sntomas txicos producidos en humanos, distinguindose cinco grupos de toxinas: paralizantes, diarreicas, neurotxicas, implicadas en la ciguatera y amnsicas. Adems hay otras biotoxinas que no se pueden incluir en los grupos anteriores, como pectenotoxinas, azaspircidos, yessotoxinas, maitotoxinas, palitoxinas.Las biotoxinas marinas pueden producir episodios txicos en humanos, debido a su presencia en diversos alimentos. El principal riesgo lo representan los moluscos filtradores, puesto que su forma de alimentacin implica la filtracin de grandes volmenes de agua, facilitndose as la concentracin de las toxinas en sus tejidos. En este grupo cabe destacar a ostras, mejillones, vieiras y almejas. Existen otros alimentos como ciertos pescados, tortugas, cangrejos y algas que tambin pueden contener biotoxinas, pero tienen menor importancia porque suelen presentar menores cantidades y su consumo a nivel mundial es menor.

Tabla 01. Clasificacin de algunas biotoxinas marinas.GRUPO TOXINAS

Toxinas paralizantes (PSP)Saxitoxinas (STXs)

Gonyautoxinas (GTXs)

N-sulfocarbamoil-11 hidroxisulfatotoxinas (Cs)

Toxinas diarreicas (DSP)cido okadaico (OA)

Dinofisistoxinas (DTXs)

Toxinas lipoflicasPectenotoxinas (PTXs)

Yessotoxinas (YTXs)

Toxinas amnsicas (ASP) cido domoico (DA) y derivados

Toxinas neurotxicas no PSPToxinas implicadas en la ciguatera (CFP)

Maitotoxinas (MTXs)

Brevetoxinas (PbTXs)

Iminas cclicas

Policavernsidos y gambierol

Palitoxinas (PlTXs)Palitoxina (PlTX)

Ostreocina

Ovatatoxina

Azaspircidos (AZAs) Azaspircidos (AZAs)

Otras toxinasTetrodotoxina (TTX)

Toxinas producidas por Pfiesteria spp.

Toxinas producidas por cianobacterias

Fuente: Alfonso Mndez, M. 2008

1. Intoxicacin paralizante por mariscos (PSP) Las toxinas paralizantes (PSP) son compuestos que se acumulan en los mariscos que ingieren algas productoras de estas toxinas. La ingestin de estos mariscos contaminados por acumulacin de toxinas causa, en el ser humano, la intoxicacin paraltica por mariscos. Los sntomas de PSP pueden presentarse como un entumecimiento o picazn leve hasta la parlisis respiratoria completa, que en casos fatales, ocurre entre dos y doce horas despus de la ingestin.La ms txica es la saxitoxina (STX), la primera toxina PSP caracterizada qumicamente. Los dinoflagelados del gnero Alexandrium de zonas de clima tropical o templado son los principales responsables de la produccin de estas toxinas. Los mariscos que se alimentan de estos dinoflagelados acumulan las toxinas, sin sufrir los efectos nocivos de las toxinas ya que son bastante resistentes. Una veintena de pases cuentan con reglamentacin referente a las toxinas PSP, en la mayora de los casos referida a las toxinas PSP como un grupo.1.1 Estructuras qumicas y propiedadesLas toxinas PSP constituyen un grupo de compuestos de la tetrahidropurina estrechamente relacionados, divididos en cuatro subgrupos: i) carbamato (STX, neoSTX y las gonyautoxinas (GNTX1-4); ii) N-sulfo-carbamoil (GNTX5-6, C1-4); iii) decarbamoil (dc-) (dcSTX, dcneoSTX, dcGNTX1-4); y iv) compuestos de desoxidecarbamoil (do-) (doSTX, doneoSTX y doGNTX1).

Figura 01: Estructuras qumicas de algunas toxinas del PSPFuente: Alfonso Mndez, M. 2008.2. Intoxicacin Diarreica por Mariscos (DSP)Las toxinas diarreicas (DSP) son compuestos liposolubles que se acumulan en los tejidos adiposos de los bivalvos, como mejillones, vieiras, ostras y almejas. La ingestin de estos mariscos contaminados por acumulacin de toxinas causa, en el ser humano, la Intoxicacin Diarreica por Mariscos (DSP), cuyos sntomas incluyen diarrea, nauseas, vmitos y dolores abdominales. Los sntomas aparecen entre 30 minutos y algunas horas luego de la ingestin; la recuperacin completa se observa dentro de los tres das. Las toxinas DSP se clasifican segn su estructura qumica. El primer grupo incluye las toxinas cidas e incluye el cido okadaico (AO) y sus derivados, las dinofisistoxinas (toxinas DTX); el segundo grupo las toxinas neutras y compuestos tipo politer lactona del grupo de las pectenotoxinas (toxinas PTX); y el tercero los politeres sulfatados y sus derivados, las yesotoxinas (toxinas YTX).Los productores de toxinas DSP son, generalmente, los dinoflagelados del gnero Dinophysis spp. Las reas ms afectadas parecen ser Europa y Japn, aunque, se observa una tendencia creciente en la incidencia de las DSP, o al menos en la presencia de toxinas DSP, ya que con frecuencia se informa de algas productoras de toxinas DSP y de bivalvos txicos en zonas nuevas.2.1 Estructuras qumicas y propiedadesTodas las toxinas DSP son politeres termoestables lipfilos, aisladas de distintas especies de mariscos y de dinoflagelados. Los distintos tipos qumicos de toxinas asociados al sndrome DSP incluyen:a) El primer grupo de toxinas cidas, formado por varios compuestos lipfilos que se acumulan en el tejido adiposo de los mariscos: el cido okadaico (AO) y sus derivados, las dinofisistoxinas (las toxinas DTX: la DTX1, la DTX2 y la DTX3).b) El segundo grupo de toxinas, las neutras, est compuesto por lactonas politer del grupo de las pectenotoxinas (toxinas PTX). A la fecha se han aislado diez toxinas PTX y seis de ellas las PTX1, -2, -3, -4, -6 y 7 se han identificado qumicamente.c) El tercer grupo comprende un compuesto sulfatado denominado yesotoxina (YTX), un politer tipo brevetoxina y su derivado la 45-hidroxiyesotoxina (45-OH-YTX) d) Una toxina nueva (C47H71NO12), denominada azaspiracida.

Figura 02: Estructuras qumicas de las toxinas causantes de la DSP.Fuente: Alfonso Mndez, M. 2008.

3. Mtodos de deteccin.

Parte de estos se utilizan para aislar e identificar los diferentes compuestos mientras que otros son tiles para cuantificar su concentracin en extractos de microalgas y/o de moluscos. Existen mtodos biolgicos, qumicos, inmunolgicos y funcionales, cada uno con sus ventajas e inconvenientes.

3.1. Bioensayos.

El bioensayo de ratn es el mtodo tradicional para detectar la mayor parte de las biotoxinas marinas. Este mtodo consiste en preparar un extracto lipoflico o hidroflico, en funcin de la naturaleza qumica de las toxinas que se desee detectar, a partir del molusco contaminado o de la muestra de dinoflagelados. Este extracto se diluye en el medio apropiado y se inyecta intraperitonealmente en ratones de peso aproximado de 20 g. Finalmente se observan los sntomas que aparecen y el tiempo que el animal tarda en morir, en funcin del cual se calcula la toxicidad de la muestra comparando este parmetro con los valores obtenidos con estndares de toxinas. Este ensayo presenta diversos inconvenientes, como la necesidad de mantener una colonia de ratones, la variabilidad del resultado en funcin de la especie de ratn, la cantidad de tiempo consumido para llevar a cabo el ensayo y la gran cantidad de sacrificios animales que implica.

La principal ventaja del bioensayo de ratn es que garantiza la seguridad alimentaria, puesta que puede detectar nuevas toxinas y anloga, por lo que es el mtodo ms utilizado para los programas de monitorizacin y proteccin de la salud de los consumidores. Adems de los bioensayos de ratn existen otros bioensayos que se aplican para algunas biotoxinas en concreto. En el caso de las toxinas DSP se pueden utilizar diversos bioensayos que se basan en la induccin de diarrea a los animales. El bioensayo en ratas se basa en la induccin de diarrea a estos animales, para lo que se alimentan con una dieta mezclada con tejido de molusco y se observa la aparicin de sintomatologa. Tambin se pueden hacer ensayos con el tracto intestinal de conejos o ratas, expresndose los resultados como relaciones entre el volumen de fluido acumulado y la longitud del tracto intestinal. En todos estos casos se detectara la presencia de cualquier toxina que produjera diarrea.

3.2. Ensayos inmunolgicos.Los ensayos inmunolgicos se basan en utilizar anticuerpos que reaccionan con las biotoxinas y detectar dicha reaccin.El primer paso de un ensayo inmunolgico consiste en producir los anticuerpos necesarios. Para ello las toxinas se administran a los animales de experimentacin que los van a producir. ste es un proceso complicado ya que las toxinas son molculas pequeas y no tienen capacidad antignica, por lo que deben unirse a molculas ms grandes antes de ser administradas. Esta reaccin previa hace que no todas las toxinas puedan ser utilizadas para producir anticuerpos. Adems para realizar todo el proceso es necesario disponer de cada una de las toxinas puras y en gran cantidad y conseguir anticuerpos que presenten reactividad cruzada frente a toxinas estructuralmente relacionadas para asegurar una buena deteccin.Una vez se han obtenido los anticuerpos, la forma de realizar el ensayo con las toxinas y de detectar la unin anticuerpo-toxina puede variar. Los ms frecuentes son los enzimoinmunoensayos (ELISA), en los que se cuantifica la unin anticuerpo-toxina mediante la reaccin de una enzima ligada al anticuerpo con un sustrato especfico. Esta reaccin puede producir un producto coloreado o fluorescente. De esta forma se han desarrollado kits para detectar casi todas las toxinas marinas Otra forma de detectar la unin anticuerpo-toxina son los biosensores de afinidad en los que se estudia la unin entre ambas especies fijando una de ellas, generalmente la toxina, a una superficie resonante.

3.3. Ensayos funcionales.

Los mtodos funcionales se basan en la unin de las toxinas y algn componente molecular que las reconoce de manera selectiva. Esta interaccin se puede cuantificar o produce diversos eventos que se pueden medir y con esos datos se determina la cantidad de toxina en la muestra. Para desarrollar estos mtodos es preciso conocer el mecanismo de accin de las toxinas y/o sus dianas celulares. Dentro de este grupo de mtodos se distinguen los ensayos de citotoxicidad con varias lneas celulares y los ensayos que utilizan las dianas celulares de las biotoxinas aisladas. Los ensayos de citotoxicidad son ensayos celulares que permiten detectar e incluso a veces cuantificar una respuesta txica de clulas en cultivo expuestas a extractos sospechosos de contener biotoxinas.Las preparaciones de clulas de hipocampo de rata se utilizan para detectar la presencia de STX, PbTX y DA, identificndose cada toxina por sus efectos electrofisiolgicos especficos [72]. Tambin se pueden utilizar clulas de neuroblastoma de ratn para realizar un ensayo con bloqueantes del canal de sodio, detectndose la presencia de toxinas que actan sobre estos canales en funcin de la existencia o no de cambios morfolgicos en las clulas.Para las toxinas lipoflicas se pueden utilizar ensayos de citotoxicidad en distintas lneas celulares. Si se miden los cambios morfolgicos en cultivos primarios de hepatocitos de rata se pueden diferenciar por un lado OA y DTX1 y por otro PTX1 y YTX; se trata de un proceso lento y laborioso y no funciona muy bien con mezclas de toxinas [7]. Ensayos similares se pueden llevar a cabo con clulas KB (una lnea celular humana derivada de carcinoma epidrmico), fibroblastos, etc. Para las YTXs existe un ensayo con clulas HeLa, ya que estas toxinas inducen la muerte celular y la activacin de varias isoformas de caspasas. Las clulas MCF-7 tambin se pueden emplear para detectar YTX, pues esta biotoxina origina en ellas la acumulacin de un fragmento de E-caderina, de manera dosisdependiente. Se han desarrollado ensayos de unin a los receptores de glutamato ykainato, en los que el DA de una muestra se cuantifica debido a su competicin con el cido kanico marcado radiactivamente. Esto se ha llevado a cabo en primer lugar con sinaptosomas de cerebro de rana y posteriormente con receptores de glutamato de cerebro de rata clonados. En este ltimo caso se ha conseguido cuantificar el DA en muestras de agua de mar y de tejido de molusco.Existen diversos ensayos in vitro tiles para la deteccin de PbTXs, como el ensayo de unin a sinaptosomas de cerebro de rata. Consiste en medir la competicin por los receptores entre las brevetoxinas marcadas radiactivamente y las que existan en la muestra a analizar. Tambin se puede hacer un ensayo con sinaptosomas de cerebro de ratn para detectar CTXs, consiguiendo una mayor sensibilidad que con el bioensayo de ratn. Entre los ensayos que utilizan las dianas celulares aisladas destacan los que se emplean para detectar toxinas DSP y YTXs.Para detectar las toxinas DSP se pueden emplear distintos mtodos basados en la inhibicin de las fosfatasas de serina y treonina PP2A. Estos mtodos se diferencian por el sustrato que emplean para medir la inhibicin de las fosfatasas. Se pueden utilizar sustratos radioactivos, colorimtricos o fluorimtricos. El mtodo que ms se utiliza es con el sustrato fluorescente, ya que es ms preciso, ms sensible y produce menos falsos positivos. Con este mtodo se pueden detectar todas las toxinas del grupo DSP, es sencillo y permite el anlisis simultneo de mltiples muestras; por todas estas ventajas est en proceso de validacin.Tambin existen ensayos funcionales basados en la interaccin entre las fosfodiesterasas y las YTXs. Uno de ellos cuantifica la actividad de las fosfodiesterasas sobre un derivado fluorescente del AMPc, observndose que al aumentar la concentracin de toxina en las muestras se produce un incremento de dicha actividad. El otro mtodo se basa en la deteccin de la unin entre las YTXs y las fosfodiesterasas utilizando un biosensor de afinidad, y se puede utilizar para cuantificar la toxina presente en una muestra.Los ensayos funcionales que utilizan clulas son sensibles y detectan todas las toxinas de cada grupo. Como inconvenientes se pueden citar el tiempo de realizacin, pues se necesita esperar para observar el efecto citotxico, y la variabilidad inherente a la obtencin y mantenimiento de cultivos celulares, lo cual hace difcil su validacin internacional. Frente a ellos los mtodos funcionales que emplean molculas aisladas suelen ser casi instantneos, pero en general son ms difciles de desarrollar por la necesidad de obtener el receptor o la molcula a la que se unen las biotoxinas.

3.4. Ensayos fsico-qumicos.

Existen distintos mtodos fsico-qumicos que permiten detectar y cuantificar toxinas marinas en muestras. En todos los casos se trata de mtodos que necesitan ser calibrados con estndares puros de cada una de las toxinas que se detecten, por ello son costosos de mantener. Por otro lado, se trata de mtodos muy sensibles con una realizacin compleja, por lo que requieren personal especializado.Estos mtodos suelen consistir en una separacin de las toxinas y los distintos componentes de las muestras utilizando cromatografa, seguida de una deteccin por absorbancia, fluorescencia o espectrometra de masas. La cromatografa puede ser de capa fina, para las toxinas DSP o el DA, de gases, para el OA, de alta eficacia, utilizada para la mayor parte de las toxinas, o electrocintica micelar, para el OA o las PbTXs. La absorbancia se utiliza para ciertos mtodos de deteccin de toxinas DSP y la fluorescencia se emplea tanto para las DSP como para las PSP. Sin embargo quizs el sistema de deteccin ms verstil es la espectrometra de masas, con el que se han descrito mtodos para prcticamente todas las biotoxinas conocidas.De todos los mtodos fsico-qumicos existentes slo hay dos oficiales, validados y que representan una alternativa real al bioensayo de ratn: el que emplea deteccin por fluorescencia para las toxinas PSP y el que utiliza la deteccin ultravioleta para las ASP.El mayor problema para la validacin de estos mtodos es la escasez, y en algunos la inexistencia, de estndares puros que permitan llevar a cabo los estudios intra- e interlaboratorio. El otro problema habitual es la dificultad de disear procesos de extraccin de las biotoxinas presentes en las muestras que consigan un alto porcentaje de recuperacin y que no arrastren sustancias que interfieran con la tecnologa empleada.

4. Procedimiento Operativo Estndar para toxinas PSP mediante Bioensayo de ratn-EURLMB 4.1. Aparatos y materiales Un mezclador de alta velocidad o homogeneizador (mnimo 13.500 rpm) Balanza analtica, con precisin de 0.1 mg Balanza con precisin de 0,01 mg Bloque de calor Centrfuga (velocidad mnima 3.000 rpm) Cabina de extraccin Papel filtro (Whatman N1 o similar) Instrumentos para preparacin de muestras, cuchillo, esptulas, tijeras, jarras de plsticos, tamiz de acero inoxidable Matraces de fondo redondo (400 - 1000 ml) Matraces volumtricos de 100 ml, 250 ml Tubos de ensayo 100 ml Tubos de vidrio min 10 ml Pipetas automticas ajustables Agitador magntico Jeringas estriles desechables de 1 ml con aguja de calibre 22 a 26, Cronmetro rango de medida mnimo 60 min., de precisin de 1/10 segundo pH-metro 4.2. RatnUtilizar ratones albinos cepa suiza (se recomienda CD1) con un peso de preferencia entre 19 g y 21 g, de la colonia stock utilizada para los ensayos de rutina. No utilice los ratones> 23 g ni 4,5, se recomienda el uso de H2O pH 3.Pruebe diluciones adicionales en incrementos de 1 ml de H2O, por ejemplo, si 10 ml se diluy con 25 ml de H2O mata ratones en los 5-7 minutos, las soluciones de prueba se diluyen 10 + 24 y 10 + 26.Inyectar un grupo de 10 ratones con cada 2 o preferiblemente 3 diluciones que caen dentro del tiempo medio de muerte de 5-7 min. Dar 1 ml de dosis a cada ratn mediante inyeccin intraperitoneal y determinar el tiempo de la muerte como el tiempo transcurrido desde la finalizacin de la inyeccin hasta el ltimo aliento jadeante del ratn.Repetir el ensayo 1 o 2 das ms tarde, utilizando diluciones preparadas anteriormente que difera por incrementos de 1 ml de H2O. A continuacin, repita la prueba entera, comenzando con la prueba de diluciones preparadas a partir de solucin patrn de trabajo preparadas recientemente.Calcular el tiempo medio de muerte para cada grupo de 10 ratones utilizados en cada dilucin. Si todos los grupos de 10 ratones inyectados con cualquier dilucin dio tiempo medio de muerte 7 min, los resultados hacen caso omiso de esta dilucin en los clculos posteriores. Por otra parte, si algn grupo de 10 ratones inyectados con la dilucin tienen un tiempo medio de muerte entre 5 y 7 minutos, incluir a todos los grupos de 10 ratones utilizados en esa dilucin, incluso los que su tiempo medio de muerte puede ser 7min. Del tiempo medio de muerte de cada grupo de 10 ratones en cada una de las diluciones seleccionadas, determinar el nmero de unidades ratn/ml de la Tabla de Sommer. Dividir el ug de veneno/ml calculado por las unidades ratn /ml para obtener el factor de conversin (valor CF) que expresa los ug veneno equivalente a 1 unidad de ratn (MU). Calcular el promedio de los valores individuales CF, y utilizar este valor medio como punto de referencia para comprobar los ensayos de rutina.4.4.2. Preparacin de la muestra Las almejas, ostras, mejillones, berberechos, navajas y similares: Limpiar cuidadosamente el exterior de los mariscos con agua fresca. Abrir cortando los msculos aductores. Enjuague el interior con agua fresca para eliminar arena u otro material extrao. Retirar la carne de la valva separando los msculos aductores y los tejidos que conectan al umbo. Trasferir la carne a un tamiz de acero o papel de filtro y dejar escurrir. Recoger de 100-150 g de carne y homogeneizar. Otros tipos de mariscos: Separar la porcin comestible y aplicar pruebas a esta parte individualmente. Escurrir y homogeneizar como en el prrafo anterior. Mariscos en conserva: Coloque todo el contenido de lata (carne y lquidos) en una licuadora y mezcle hasta homogeneizar. Para latas grandes, escurrir la carne unos minutos en un tamiz y recoger todo el lquido. Determinar el peso de la carne y el volumen de lquido. Recombinar la porcin de muestra de cada uno en cantidades proporcionales. Licuar las porciones de muestras recombinadas en una licuadora hasta tener una mezcla homognea.4.4.3. ExtraccinPesar 100 g de material bien mezclado. Aadir 100 ml de HCl 0,1 N, revolver bien, y anotar el peso de la muestra y HCl 0,1N. Verificar el pH (pH debe ser 4,5).Para bajar el pH, se aade HCl 5N gota a gota con agitacin; para elevar el pH, aadir NaOH 0,1 gota a gota con agitacin constante para evitar la alcalinizacin local y la consiguiente destruccin de veneno. Aadir agua destilada pH 3 hasta obtener el peso previo de la muestra y HCl 0,1N.Revolver y comprobar el pH. Dejar reposar hasta que la parte del sobrenadante sea translcido y se puede decantar libre de partculas slidas suficientemente grandes como para bloquear la aguja hipodrmica. Si es necesario centrifugar el sobrenadande de la mezcla por 5 min a 3000 rpm. Slo es necesario lquido suficiente para realizar el bioensayo.4.4.4. Prueba del ratn Inocular intraperitonealmente cada ratn prueba con 1 ml del extracto cido. Anotar el momento de la inoculacin y observar los ratones con cuidado por el tiempo de muerte indicado por ltimo aliento jadeante. Registrar el tiempo de muerte con un cronmetro. Un ratn puede ser utilizado para la determinacin inicial, pero se prefieren 2 o 3. Si el tiempo de muerte o el tiempo medio de muerte de varios ratones es 7 min, un total de 3 ratones debe ser inoculado para establecer la toxicidad de la muestra.4.4.5. Clculo e interpretacin de ToxicidadLos ratones deben ser observados 60 min. Determinar tiempos medios de muerte de ratones, incluyendo a los sobrevivientes, y de la Tabla de Sommer, determinar el nmero de unidades de ratn correspondiente.Nota: Tenga en cuenta el tiempo de la muerte de los ratones supervivientes> 60 min o equivalente a 800 ug equivalentes de STX diHCl / kg se considera como resultado positivo, si el resultado est dentro 400 y