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Tecniche molecolari per la diagnosi di funghi fitopatogeni
Tecniche che consentono l’identificazione, la diagnosi, la quantificazione di un organismo mediante l’analisi degli acidi nucleici:
DNA
RNA
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Diagnosi Molecolare
Si basa sull’analisi degli acidi nucleici
Vantaggi rispetto ad altri metodiLa struttura degli acidi nucleici non viene influenzata né dal ciclo di sviluppo
né dall’ambiente
Elevatissima sensibilità (singole molecole/cellule)
Possibilità di spaziare sull’intero genoma (solo il 2-5% del genoma virale
codifica per il capside proteico)
E’ possibile la diagnosi di tutti i patogeni (virus, viroidi, fitoplasmi, batteri,
funghi etc.)
Svantaggi
Maggiori difficoltà e costi
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Composizione del DNA
Nucleotide
1
23
4
5
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Il legame zucchero-fosfato conferisce al
filamento di DNA una direzione (5’ – 3’)
La formazione di legami idrogeno A-T e C-G
determina la struttura a doppia elica del DNA
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Struttura del DNA (Watson & Crick, 1953)
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Il DNA si
organizza in
cromosomi
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Tecniche di diagnosi molecolari Ibridazione degli acidi nucleici Dot blot Southern blotMicroarrays
Reazione a catena della polimerasi (PCR) PCR convenzionale PCR in tempo reale
Amplificazione casuale (RAPD, AP-PCR, UP-PCR, ecc)
Analisi del cariotipo (cromosomi)
Analisi dei profili di restrizione (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Microsatelliti
Microarrays e Macroarrays
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Ibridazione degli acidi nucleici
La denaturazione del DNA è un processo reversibile
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Ibridazione degli acidi nucleici
Sonde molecolari (frammenti di DNA o RNA marcati)
Marcatura con 32P (isotopo radioattivo) o con molecole non radioattive (digossigenina e/o biotina)
Ibridi DNA-DNA < RNA-RNA < DNA-RNA
Preparazione di una sonda PCR Frammento clonato (trascrizione in vitro)
• Southern blot
• Dot blot
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Sonde marcate con Digossigenina
DNA fissato alla membrana
Sonda marcata con digossigenina
Anticorpo antidigossigenina
Fosfatasi alcalina
Substrato dellafosfatasi alcalina
Reazione chemioluminescente
Membrana nylon
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Elettroforesi del DNA
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Elettroforesi del DNA
Gel di agarosio (>100 bp) o poliacrilamide (<100 bp)
Molecole > di 20 kb non vengono separate)
Concentrazione (1-2.5%)
Tampone elettroforetico (TAE o TBE)
Colorazione con bromuro di etidio o “SYBR safe”
Visualizzazione su transilluminatore (312 nm)
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Elettroforesi del DNA
Concentrazione (1-2.5%)
Molecole > di 20 kb non
vengono separate)
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Southern blot
Vaschetta contenente soluzione alcalina (NaOH)
Supporto
2 Fogli di carta Whatman
Gel
Membrana di nylon
2 Fogli di carta Whatman
Carta assorbente
Peso
Trasferimento del DNA da gel a
membrana per capillarità
Analisi di profili di restrizione o di PCR
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Ibridazione degli acidi nucleici su membrana
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Sonde marcate con Digossigenina
DNA fissato alla membrana
Sonda marcata con digossigenina
Anticorpo antidigossigenina
Fosfatasi alcalina
Substrato dellafosfatasi alcalina
Reazione chemioluminescente
Membrana nylon
Risultato
Film di autoradiografiasviluppato
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Trasferimento di piccole aliquote su membrana di nylon o nitrocellulosa e fissaggio mediante esposizione a luce UV
Macerazione dei tessuti in soluzione alcalina (NaOH, EDTA)
Ibridazione degli acidi nucleici
(Dot Blot)
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Ibridazione (overnight) Sonda marcata Soluzione di ibridazione
Concetto di stringenza Temperatura (65°C) Concentrazione salina Formammide
Lavaggi Esposizione a lastra fotografica
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Dot Blot(Analisi dei risultati)
Sviluppo della lastra
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La tecnologia dei Microarrays
• E’ una reazione di ibridazione molecolare fatta avvenire su piccoli vetrini (chips) di vetro o silicio
• Consente l’analisi contemporanea di un numero elevatissimo di campioni
• Viene utilizzata per lo studio dell’espressione genica
• A scopo diagnostico
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La tecnologia dei Microarrays • Preparazione dei “chips”
Spotting (vetrini di vetro) Sonde costituite da DNA e/o cDNA (librerie genetiche)
Le sonde vengono fissate con sistemi robotizzati (spots di 100-150 µm distanziati di 200-250 µm)
Fissazione mediante esposizione luce UV
Lavaggi per eliminare la sonda non legate
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La tecnologia dei Microarrays
• Preparazione dei vetrini
Preparazione “in situ” Sviluppata dalla Affimetrix
Sfrutta oligonucleotidi (5-50 bp)
Oligonucleotidi sintetizzati direttamente sul supporto di silicio
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Applicazioni dei microarrays
Diagnostica Uso di sonde specifiche per un numero elevato di patogeni
Studio dell’espressione di geni Solo una piccola frazione dei geni è espressa (trascitta in mRNA)
in una determinata cellula o tessuto
L’espressione dei geni viene influenzata da una molteplicità di
fattori
• fase di sviluppo
• ambiente
• trattamenti di varia natura (chimici, biologici, fisici, ecc)
• patogeno
• ecc. ecc.
Lo sviluppo esponenziale della tecnologia dei Microarrays è stato
reso possibile dalla crescita esponenziale di genomi disponibili
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Testimone Campione
trattato
Estrazione dell’RNA
messaggero
Sintesi di cDNA (trascrizione inversa)
Marcato con molecole fluorescenti
Verde (Cy3) Rosso (Cy5)
Ibridazione
molecolareLavaggi
Lettura della
fluorescenza
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Verde: geni espressi nel testimone.
Rosso: geni espressi nel campione trattato.
Giallo: geni espressi sia nel testimone che nel campione
trattato.
Nero: Geni che non hanno ibridato.
Eccitazione delle molecole
fluorescenti (laser)
Acquisizione dell’immagine
Analisi dell’immagine digitale
Elaborazione dei risultati
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Tecniche di diagnosi molecolare
Ibridazione degli acidi nucleici Dot blot
Reazione a catena della polimerasi (PCR) PCR convenzionale PCR in tempo reale
Amplificazione casuale (RAPD, AP-PCR, UP-PCR, ecc)
Analisi del cariotipo (cromosomi)
Analisi dei profili di restrizione (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Microsatelliti
Microarrays e Macroarrays
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Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)(Mullis, 1985 – Premio Nobel nel 1993)
Reazione enzimatica in cui frammenti di DNA compresi tra due
brevi oligonucleotidi sintetici (primer) sono amplificati in modo
esponenziale ed altamente specifico
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Durante la duplicazione del DNA, il
doppio filamento è separato attraverso
una elicasi.
Ogni filamento di DNA serve come
stampo per la sintesi di un nuovo
filamento, prodotto grazie alla DNA
polimerasi.
Durante la replicazione del DNA la
direzione di sintesi è da 5' a 3'.
Replicazione del DNA
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Elementi fondamentali
1) Taq DNA Polimerasi (Thermophilus
aquaticus)
2) Primer
3) Nucleotidi fosforilati (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
4) DNA bersaglio (“target o template”)
5) Tampone (buffer) 10X
6) Termociclatori automatici e termostabili
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Denaturazione94-95°C
Annealing50-60°C
Estensione (Extension)72°C
30
-4
0 c
icli
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Amplificazione esponenziale
DNA “target”
1° ciclo
2° ciclo
3° ciclo
4° ciclo
21 = 2 copie
22 = 4copie8 copie 16 copie
35 cicli
235 = 34 miliardi
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A. Double
strand DNA
B. Denature95º
50º
C. Anneal
primers50º
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72ºTaq
Taq
E. Copy
strands
1
2
3
4
F.
Denature
95º
Taq
Taq
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1
2
3
4
Taq
Taq
Taq
Taq
I. Copy
strands
72º
Second
round of
cDNA
synthesis
(8 strands)
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1
2
3
4
72º
K. Bind polymerase
(not shown) and
copy strands
Third
round of
cDNA
synthesis
(16
strands)
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1
23
4
L.
Denature at 95º
Anneal primers
at 50º
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1
23
4
After 5 rounds
there are 32
double strands of
which 24 (75%)
are are same
size
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Primer (determinano la specificità) Lunghezza 20- 25 bp TM 50-60°C Rapporto AT/CG 40-60% Disegno dei primer (software anche in rete) Evitare dimeri
Dimeri
“Target” specfico
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Fasi dell’amplificazioneDenaturazione iniziale 94-95°C (2-5 min)
30-40 cicli: Denaturazione 94-95°C (30 s)
Annealing 50-60°C (30 s)Estensione 72°C (30 s – 5 min)
(circa 1000 bp/min)
Miscela di reazioneTampone (buffer) 10X - (MgCl2)
Stringenza della reazione
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DNA sintetizzato dopo 35 cicli: 235 = 34 miliardi di copie?
Effetto “plateau”: Esaurimento TaqAccumulo dei prodotti
Fase esponenziale
“Plateau”
DN
A s
inte
tizz
ato
Cicli di PCR
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Phytophthora spp.
P. nicotianae
P. citrophthora
Risultato dell’ amplificazione mediante PCR
Primers genere-specifici
Primers specie-specifici
Primers specie-specifici
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Organizzazione di un gene eucariotico
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Strategia più utilizzata per lo sviluppo di
primer specifici
Regione conservata Regione variabile Regione conservata
Regioni geniche codificanti
(esoni)
Primer
universale
Primer
universale
Regioni intergeniche
e introni
Identificazione mediante primer specifici
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Gene Regione intergenica Gene
Possibile primer universale
GTTCGARTCCCTTTTTTTGC
Palni GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTATATTTTTATTTATTAGATAA------ATGGACCCAAA
Pfragariae GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTATATTTTTATTTATTAAATAA------ATGGACCCAAA
Psojae GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTTATATTTTT---TATTAGATAA------ATGGACCCAAA
Pcinnamomi GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTTATATGTATATATTAATAATAATAATAAATGGACCCAAA
Pkatsurae GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTATATTATATT----------A-----AATGGACCCAAA
Ppalmivora GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTATTTTTTTATTTAATTTTACA-----AATGTACCCAAA
Pcapsici GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTAAAAATATTAA-----ATTTAA----AAATGGACCCAAA
Pcitricola GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTATAATATTAA-----ATTA-A----AAATGGACCCAAA
Pcitrophthora GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTTTAATATTAA-----AATATA----AAATGGACCCAAA
Pquercina GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTTTTATATAAA-----T---------AAATGGACCCAAA
Ppseudosyringae GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTTATTATTTAAA-----TCTAAT----AAATGTACCCAAA
Pinundata GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTGAACT-----------ATTTT----AAATGGACCCAAA
Pmegasperma GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTTAATTTAAAGGAATCAAATAT----AAATGGACCCAAA
Pkernoviae GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTTTAAATATTTTAAATAA----------AATGGACCCAAA
Pnicotianae GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTTAAT-ATTTATAT-TAT--------AAATGGACCCAAA
Pinfestans GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTTAT--ATATTTTA-AAT--------AAATGGACCCAAA
Plateralis GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTTATATATTTATTA-GAT--------AAATGGACCCAAA
Pramorum GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTTTAAATATTTATTA-GAT--------AAATGAACCCAAA
Perythroseptica GTTCGAATCCCTTTTTTTGCTTT-TTTATACAATATAAT--------AAATGAACCCAAA
Pmedicaginis GTTCGAGTCCCTTTTTTTGCTTTATTTATACAATA-------------AATGGACCCAAA
R = A o G (primer degenerati)
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Allineamento di sequenze ed identificazione di primer specifici
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Geni codificanti per l’RNA ribosomiale (rRNA)
Tandem identicamente ripetuti
(60-200 copie per genoma aploide)
SSU (18 S) IGS25.8 LSU (28 S) 5SIGS1
ITS
1
ITS
2
Internal Transcribed
Spacer Regions
(ITS1 e ITS2)
Intergenic spacer regions
(IGS1 e IGS2)
Non-transcribed spacer
(NTS)
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SSU (18 S) 5.8 LSU (28 S)ITS1 ITS2
ITS1
ITS5
ITS6 ITS3
ITS2
ITS4
Regioni ITSPresenti nel genoma in molteplici copie (elevata sensibilità)
Elevata variabilià interspecifica
Assenza di variabilità Intraspecifica
Sono facilmente amplificabili con primer universali
Elevatissima disponibilità di dati in “GenBank”
600-900 bp
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Gene ß-tubulina
Altri geni utilizzati per lo sviluppo di
diagnostici molecolari (esempi)
Actina
Ras-related Protein gene (Ypt 1 gene)
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Analisi dei profili di restrizione
Enzimi di restrizione: Nucleasi che riconoscono e tagliano sequenze il
DNA in corrispondenza di sequenze specifiche di 4-8 basi
RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism
Le notevoli dimensioni del
genoma fungino determinano
una strisciata (smear) di bande
Digestione di frammenti di DNA
amplificati mediante PCR
(AFLP)
Analisi del DNA mitocondriale
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Identificazione di specie di Phytophthora
mediante digestione delle regioni ITS1 e ITS2
(CABI e SCRI)
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 con
primer universali
Digestione dei frammenti con enzimi di
restrizione
Separazione dei frammenti ottenuti mediate
elettroforesi
Stima delle dimensioni delle bande ottenute ed
identificazione delle specie
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PhytID - Identification of Plant Pathogenic
Phytophthora Species by ITS Fingerprinting
Phytophthora Identification Page
Enter a name for your strain
Enter the name of the host plant
Enter the country of origin
Enter your enzyme and fragment data and then click on Identify it. See Help for more information.
Enzyme Fragments (in ascending size and
comma separated) % Width
Lower cut-off length
Identify it Clear data
The calculation will take a few seconds.
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RAPD = Random Amplified of Polymorphic DNA
Singoli primer corti (10-15 basi)
Basse condizioni di stringenza
Bassa temperatura di annealing
Alta concentrazione salina
Elevato numero di cicli di PCR
Amplificazione casuale di regioni omologhe del genoma
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Studio dei polimorfismi genetici (Variabilità genetica)
Interspecifica
Intraspecifica
Aure
obasid
ium
pullu
lans
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Dendrogrammi (numero di bande in comune)
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Identificazione di frammenti di DNA specifici per la produzione di sonde molecolari e/o
primer
Eluizione
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AFLP (Elettroforesi su gel di poliacrilamide)
Eluizione
Purificazione
Clonaggio
Sequenziamento
Disegno di primer
Valutazione della specificità
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Clonaggio
Frammenti RAPD unici
Sintesi di sonde Molecolari(Dot Blot, Southern Blot)
Sequenziamento
Disegno di primer SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
Valutazione della specificità
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Real time PCRAnalisi molecolare
IF 2001,pagg.58-62 Identificazione dei patogeni in tempo reale
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Real time PCRAnalisi molecolare
Ct: cycle treshold (valore soglia), n° di cicli di PCR necessari per l’emissione di un segnale
fluorescente distinguibile dal rumore di fondo. Esso è proporzionale alla concentrazione
della molecola bersaglio (analisi quantitativa), minore quanto maggiore è l’omologia di
sequenza fra i reagenti.
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Real time PCRAnalisi molecolare
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Real time PCR
Analisi molecolare
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Amplification Plot
clvatumexp5dec2012 676/4/2013
Primers 2f/3r
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Vantaggi della Real Time PCR
• Semplificazione delle procedure di visualizzazione del risultato: la presenza di amplimero (patogeno) è rivelata dall’emissione di fluorescenza (rilievo visivo o con fluorimetro del termociclatore)
• Identificazione multipla di diversi patogeni sullo stesso campione (uso di fluorofori e quencer diversi)
• Quantificazione del patogeno (curve di taratura del Ct alle diverse concentrazioni della molecola bersaglio) patogeno
• Automazione della reazione
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Smart Cycler per real time PCR in
campo
Analisi molecolare