UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Alexandra A. C. Nascimento Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Pa Larson Ndia Monesi Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues

Reviso 1: Eliana Valria Patussi Mrcia A. S. Graminha

Reviso 2: Fbio Mrcio Squina Josane de Freitas Sousa Roberto Ruller Valeria Valente

2003

1

I. CONCEITOS BSICOS

1. INTRODUO

At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser analisado.

Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era geralmente

analisada atravs de meios indiretos como a sequncia de protenas e anlise gentica. A

partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a

purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem gnica. Na verdade,

muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e

Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O

DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies

especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade

de milhares de nucleotdeos por dia.

A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este

conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da seqncia de um gene e

conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas

microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio

de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicao

comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel.

Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente possvel

realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas

atravs da anlise de DNA.

2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR

A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia

de bactrias como um clone porque todos os indivduos so geneticamente idnticos

bactria inicial.

A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular, a

qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A clonagem

molecular compreende pelo menos dois estgios importantes. Primeiro, o fragmento do

2

DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de

vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de

transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada.

Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular,

produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante.

3. ENZIMAS DE RESTRIO Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao de um

bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em

determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente

especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa

bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A bactria protege seu prprio DNA desta degradao camuflando-o atravs da metilao de algumas bases especficas

(modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias.

As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias

classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem.

As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so

proteinas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu

reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma

seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1).

3

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.

Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades

abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqncias esto mostrados

na Figura 1.

Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a

enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido

de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada de EcoRI purificada

de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI, enquanto

que a Hind III isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III. A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem de algumas

enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto que

outras fazem cortes abruptos ou no coesivos.

a) Clivagem no eixo de simetria

Molculas com extremidades abruptas Molculas com extremidades coesivas

b) Clivagem simtricamente situada aoredor do eixo de simetria

...TC GA...

...AG CT...

3

5 3

5

+

...GAA TTC...

...CTT AAG...

+3

5

3

5

4

Tabela 1. Algumas endonucleases de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de

clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas

simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a

recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano

poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a

possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas.

Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio que o

nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo definido e

Microrganismo Enzima Sequncia Alvo

EcoRIEscherichia coli

Bacillus amyloliquefaciens H

Haemophilus aegyptius

Haemophilus aegyptius

Haemophilus aegyptius

Providencia stuartii

Streptococcus albus G

Thermus aquaticus

Serratia marcescens

Brevibacterium albidium

Bacillus globigii

BamHI

BglII

PstI

BalI

SmaI

HaeIII

TaqI

SalI

HindIII

HaeII

G A A T T CC T T A A G

G G A T C CC C T A G G

A G A T C TT C T A G A

P G C G C P iP i C G C G Pu

y u

A A G C T TT T C G A A

C T G C A GG A C G T C

G T C G A CC A G C T G

T G G C C AA C C G G T

A G G C C T

T C C G G A

C C C G G GG G G C C C

T C G AA G C T

5

permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera

uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. Enzimas

que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em mdia

a cada 256 nucleotdeos (44=256). Aquelas que reconhecem stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta mdia pode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente da composio de bases do

DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um stio de restrio contendo 8pb,

incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamferos.

A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente

detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os

fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram

mais rapidamente (Figura 2).

Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdio, uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.

4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de

bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma enzima de restrio produzem

fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de

Sentid

o d

a mi

gra

o

Pares debase

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dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima

DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente.

A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de

DNA clivado for um plasmdeo.

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de

clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para clivar

DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial

linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA plasmidial contendo

DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria

atravs de transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo.

Geralmente, antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as

linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).

Plasmdeo de

E.coli

DNA humano

DNA ligase

Plasmdeo hbrido

Enzima Enzima

GCA T T ACG

TGCA TGCAACGT ACGT

TGCAACGT

TG

CA

TGCA

AC

GT

ACGT

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5. DNA LIGASE

Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligao dos fragmentos de

DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer um

grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na

extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras

bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4 requer ATP como

cofator.

Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice.

5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase

a) Fragmentos com extremidades coesivas

As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio permitem que

dois fragmentos de DNA sejam mais facilmente ligados. Isto porque ocorre inicialmente o pareamento das fitas simples das extremidades coesivas das duas diferentes molculas,

atravs da formao de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases.

Finalmente, a ligao covalente (fosfodister) dos fragmentos realizada pela DNA ligase (ver figura 4).

b) Fragmentos com extremidade no coesivas

DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito menos eficincia

que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior de DNA ligase

DNA DNA3 OH-

O O 5P

O

-

O

DNA DNA3 O O 5

O

P-

O

+

DNA-LigaseATP ou NAD

8

e mesmo dos DNAs envolvidos necessria para que as molculas com extremidades no

coesivas sofram reao de ligao.

No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela transformao prvia

das extremidades no coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito atravs de

dois processos:

a) Adio de polidesoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da enzima

desoxinucleotidil-transferase-terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA

polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita

simples proeminentes de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade

proeminente a molcula tratada previamente com uma exonuclease 5-especfica para remover alguns nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos

complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os

espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas. Os adaptadores so

oligonucleotdeos sintticos que contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de

restrio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade no coesiva, pode-se optar pela

utilizao de T4 ligase em grande concentrao, o que permitir a ligao entre molculas

de DNA sem proeminncias.

6. TRANSFORMAO BACTERIANA

6.1.Conceito de transformao induzida

O processo de transformao constitui um evento de alta importncia na tcnica de

manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao com

DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e submetida a

um curto choque trmico 42oC. Estes mesmos autores tambm verificaram que as

bactrias crescidas at a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros

estgios do crescimento.

9

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adio de poli

(A) e poli (T).

Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador.

5 55 53

3

AAAA TTTT

33

3

AAAA TTTT

3

3

3

5 - Exonuclease especfica

Deoxinucleotdio transferase terminal

Espaos preenchidos com DNA Pol I. DNA ligasepara completar a ligao

+dATP +dTTP

DNA a ser inserido

+

GAATTCCTTAAG

AdaptadorSinttico

T4 DNA ligase

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

EcoRI

AATTC G

GCTTAA

GAATTCCTTAAG

Vetor

EcoRI

G AATTCCTTAA G

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O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz uma eficincia de transformao da ordem de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a

partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afetam o processo de

transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente incorporados pela clula

bacteriana competente; DNA linear pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer

degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico.

6.2. Mecanismos de captao do DNA

O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente ainda

desconhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais situados

nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde a membrana interna e externa da clula

bacteriana unem-se formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento

bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido a repulso

eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da membrana

bacteriana e dos grupo fosfato da molcula do DNA.

O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0oC a fluidez da membrana

celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca+2

formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim

facilitando a atrao eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque

trmico, complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano

trmico entre o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do

DNA atravs da zona de adeso. A figura 7 ilustra este processo.

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Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformao de E. coli com uma molcula de DNA exgeno.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA

obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa

outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em

centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de

DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.

Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA

recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de

clonagem em diferentes situaes.

A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na

biologia molecular.

- -

-

-

-

--

--

-

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-

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-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- -- -

----

Zona de adeso

Plasmdeo

Bicamada lipdica(interna)

Bicamada lipdica(externa)Fosfolipdeoson de clcio

Camada peptidoglucan

DNA genmico ClulaBacteriana

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1. PLASMDEO Plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos

necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a

antibitico. Estes elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes

num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem

a amplificao do segmento do DNA neles clonado.

Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes

propriedades:

a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira; b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O conjunto destes stios, denominado de Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem;

c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere

resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam

morrendo.

A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo.

Figura 8. Estrutura molecular de um plasmdeo tpico usado em clonagem molecular. Esto representados o gene de resistncia (AmpR), a regio de mltiplos stios de clonagem (MSC) e a origem de replicao (O).

AmpR

O

MSC

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Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima

de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser

clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser

introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de

transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o

nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela

aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibitico.

2. FAGOS Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o

denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veculo de clonagem molecular, vamos mostrar

resumidamente as suas propriedades biolgicas e estruturais.

2.1 Biologia do fago

O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao. Aps a infeco da E.coli o

genoma do fago pode seguir duas vias:

a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a concomitante

inativao de outros, dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o

cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese das protenas da capa e da

cauda e formam-se novas partculas virais. Em aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos.

b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir o denominado estado lisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado

profago. No estado lisognico, todos os genes do profago esto inativos com excesso do

gene que produz a protena repressora. A bactria hospedeira carregando o profago

multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as bactrias descendentes.

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Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende das

condies do meio. Assim, via de regra, em meio rico em nutrientes o estado ltico

preferencial, por exemplo o fago na bactria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em

condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os fatores do

meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do bacterifago.

2.2 Genoma do fago

O bacterifago uma partcula viral constituda de aproximadamente 50% de

protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula viral, uma molcula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12

nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que o

DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estas extremidades so denominadas de stios cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 protenas, cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico.

As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biolgico do fago em uma clula hospedeira e

o genoma do fago com alguns dos seus principais genes, respectivamente.

2.3 Controle de expresso dos genes do fago

Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via ltica ou lisognica, a expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea pelos produtos dos genes N e Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados esquerda (pL) e direita (pR) do gene cI.

Durante o transcurso da via ltica, o produto do gene cro est diretamente

relacionado com a replicao do genoma do fago , atravs da induo da expresso dos

genes OP. Por outro lado, o produto do gene N est diretamente relacionado com a expresso dos genes da regio de empacotamento, ou seja genes A e J, responsveis pela

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sntese das protenas da cabea e da cauda do fago , como tambm da expresso dos genes

S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula hospedeira.

Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Aps adsoro (1) e injeo (2) do genoma do fago na bactria, a via ltica indicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a formao de novas partculas virais. Alternativamente, a via lisognica (6) pode ser ativada levando integrao do material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira.

Figura 10. Representao esquemtica do genoma do fago .

Durante a via lisognica, a transcrio tambm inicia-se pelos promotores pL e pR coordenando a expresso dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes coordena a

expresso do gene cI que produz uma protena repressora inibindo a expresso dos genes

responsveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante o int,

12

6

34

5

Empacotamento Recombinao Regulao Replicao Lise

cos A J

N CropL pr

.cIII cI cII O P S Rint

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cujo produto relaciona-se com a integrao do fago no genoma bacteriano estabelecendo o estado lisognico.

2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia so

dispensveis e consequentemente a regio de integrao do genoma do fago pode ser

totalmente substituda por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alterao nos processos envolvidos na via ltica.

Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos so empacotados teremos 100% de eficincia na infeco da

E.coli hospedeira. Este processo altamente eficiente quando comparado com o da

transformao bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao

redor de 108 transformantes por g de DNA o que significa que menos de 1 em 1000

plasmdeos so incorporados na E.coli hospedeira.

Atualmente, existem vrios derivados do fago nos quais um ou mais stios de restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando a sua substituio por um outro

DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes vetores

o EMBL3, no qual a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA

variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo.

Outros derivados do fago so os chamados vetores de insero. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no mximo at 7kb de

tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago.

Os vetores de insero derivados do fago mais bem utilizados especialmente na

clonagem de cDNA, so os vetores gt10 e o gt11. Vamos a seguir fazer algumas consideraes sobre estes dois tipos de vetores.

No fago gt10, o inserto geralmente cDNA, inserido no stio da EcoRI situado no

gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o gene cI obstrudo e consequentemente

durante a cultura provocar a lise das colnias de bactrias transformadas. Essas colnias

lisadas so visualizadas como crculos com o centro claro (placas de lise), bastante distintos

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das colnias no recombinantes, que por possurem o gene cI ntegro no so lisadas e

permanecem como colnias turvas.

Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento de DNA genmico no fago . As regies indicadas por a contm todas as informaes necessrias para replicao em E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digesto do DNA de interesse com enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento.

Por outro lado, o fago gt11 contm um stio de restrio EcoRI localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotdeos do cdon de trmino da enzima codificada por esse

gene (-galactosidase). Essa enzima, cuja expresso pode ser induzida por IPTG (isopropil-

EcoRI

EcoRI

ligase

empacotamentoin vitro

a

a

b

b

b

b

c

DNA bacterifago

DNA camundongo

bacterifagocontendogenes do

camundongo

informaesdesnecessrias replicao

c

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-D-galactosdeo), degrada o substrato X-gal produzindo um precipitado de cor azul. Portanto, colnias de bactrias carregando o DNA do fago com o gene LacZ intacto (sem inserto), na presena do indutor IPTG e do substrato X-gal, ficaro azuis. Enquanto que, aquelas portanto o DNA o fago que incorporou o inserto no stio de EcoRI, no expressam a

-galactosidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificao dos clones recombinantes.

3. COSMDEO A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma limitao, pois o

fragmento a ser clonado no pode ser maior do que cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as

sequncias flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento a chamada

clonagem em cosmdeos.

Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago que

inclui o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular

empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago

(cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira. As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem os dois stios cos

situados de 35 a 49 kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente empacotados.

O DNA genmico de interesse clivado com uma enzima de restrio que produz

grandes fragmentos de DNA, os quais sero ligados ao cosmdeo, tambm clivado com a

mesma enzima.

A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio cos

nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os

stios cos situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e empacotam estas molculas.

O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do

19

fago. As clulas infectadas sero selecionadas com base na resistncia adquirida a um

determinado antibitico. A figura 12 ilustra um tpico processo de clonagem em cosmdeo.

Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdeo.

4. VRUS A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do

advento da metodologia do DNA recombinante. O vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas

de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas

regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies so chamadas de regio precoce e

regio tardia.

fragmentos de restriode

35 a 40 kb

AmpRStio alvo de restrio

cos

DNA circularizaaps infeco

seleo de clones resistentes a ampicilina

20

A regio precoce expressa atravs do ciclo ltico, enquanto que a expresso dos

genes da regio tardia ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre estas

duas regies situa-se a origem de replicao do DNA do vrus.

Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T, o qual responsvel pela transformao maligna de clulas no permissveis (clulas nas quais o vrus no completa a sua replicao), como tambm pelo incio da replicao viral em clulas permissveis. Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s

protenas que formam o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do virus SV40.

Figura 13. O DNA do virus SV40

4.1. Clonagem no vrus SV40 A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser realizada atravs da

substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia.

No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T, ao passo que na segunda opo no haver produo das protenas do capsdeo. Entretanto, estas funes deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir.

4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, perde-se a

expresso das protenas do capsdeo (funes tardias). Para que o sistema de clonagem

o

Expressoprecoce

Expressotardia

SV40

Genoma do SV40

21

funcione adequadamente pode-se realizar a infeco simultnea com um outro vrus SV40

que tem uma deleo nos genes da regio precoce, mas a regio tardia intacta. Nas clulas

co-infectadas as protenas da regio precoce sero produzidas pelo vrus recombinante e as

protenas do capsdeo pelo vrus deletado. Como resultado, teremos a produo de uma

populao de partculas virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra este procedimento.

Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

SV40

gene

cotransfeco

partculas Virais

SV40

Regio funcional tardia

Regio funcionalprecoce

O

daglobina

SV40-globina

empacotamento e lise

22

4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo de partculas

virais depende do suprimento, por uma outra fonte, das protenas codificadas pela regio

precoce (antgeno T). Para evitar uma infeco mista com um vrus SV40 deletado, usa-se uma linhagem celular, as clulas COS as quais, apresentam uma poro do genoma do

SV40 integrado ao seu prprio cromossomo. Esta linhagem celular produz a protena viral

denominada antgeno T, a qual liga-se na origem de replicao do vrus e induz a sua

replicao. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem. Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso em muitas

estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o gene

a ser clonado no pode ser grande, a outra que as clulas hospedeira s podem ser clulas

de macacos e finalmente, o genoma da clula hospedeira pode sofrer rearranjados ou delees.

Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o

vrus da vacina e o Baculovrus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais que ambos

apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por processos de

recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento em relao aos processos

tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante.

Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os retrovrus que so vrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas

de mamferos e o seu RNA transcrito reversamente para DNA o qual incorporado ao

genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partculas

virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovrus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.

5. BACTERIFAGO M13 O bacterifago M13 um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita de

DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a clula hospedeira infectada

23

pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e

amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e a

fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da cpsula viral e sai da clula

hospedeira atravs de processo no ltico (Figura 16).

Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce.

SV40

gene

Partcula Viral

O

da

Regio funcionaltardia

Regiofuncionalprecoce

SV40-Ha

hemaglutinina (Ha)

co-transfeco

SV40mutante

empacotamentoe lise

SV40 mutanteintegrado aogenoma da clula COS

antgeno T replicao

24

Figura 16. Replicao do bacteriofago M13.

5.1. Clonagem no bacterifago M13 A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de

DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante de uma cultura lquida da E.coli

infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples bastante til

no processo de sequenciamento do DNA pelo mtodo desenvolvido por Sanger e

colaboradores (1977). Para facilitar o seu uso especialmente em estratgias de seqenciamento, foram

desenvolvidos vetores da srie M13mp, os quais contm o MSC inserido no gene que

expressa a -galactosidase. Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa quando o vetor est

na clula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de

alfacomplementao. A incluso do mltiplo stio de clonagem no gene da galactosidade visa a identificao dos possveis recombinantes quando na presena de um substrato

cromognico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil--D-galactosdeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor est intacto (no recombinante), a enzima funcional e frente ao substrato cromognico este clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando

um fragmento de DNA inserido no mltiplo sitio de clonagem, a expresso da enzima

suprimida, portanto as clulas so incapazes de metabolizar o substrato cromognico

formando placas incolores.

++ ++

+

-

M13

E.coli

25

5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio de clonagem,

tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a insero de um fragmento de DNA em ambas as orientaes. Como veremos adiante, esta estratgia apresenta grande aplicao no programa

de sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger.

A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1

(P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada permite a insero do fragmento de DNA na orientao 5'3' no

vetor M13mp8 e na orientao 3'5' no vetor M13mp9.

Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9 clivados com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).

6. FAGOMDEOS Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos

processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras geraes de fagos, os

quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da

srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos e apresentam as seguintes caractersticas principais:

P5 3

P E

EP

E

E P

PE

M13 mp9 M13 mp8

26

fagomdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem de grandes

insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as enzimas situadas neste stio

foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o

processo de sequenciamento.

utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de restrio, possvel

criar terminaes 5' e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptvel ao da Exonuclease III. Esta estratgia, permite a obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do inserto, os

quais aps a recircularizao tornam-se apropriados para o sequenciamento.

Este procedimento, facilita o seqenciamento de um grande inserto de DNA,

sem a necessidade de mltiplas subclonagens como usual no sistema M13 ou a

sntese de vrios oligonucleotdeos internos, usados como iniciadores no

processo de seqenciamento.

6.1. Clonagem no fagomdeo Vamos utilizar como exemplo, o fagemdeo ZAP que particularmente til para

clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um

cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um fagomdeo

denominado pBluescript.

Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo

uma protena de fuso quando na orientao correta, podendo assim tambm ser rastreada

com anticorpos.

Quando uma cepa da E.coli (F') infectada com o fago recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, esse produz as protenas do sistema M13. Essas

protenas reconhecem os sinais de iniciao e trmino da sntese de DNA do fago auxilar

(f1) que esto flanqueando o pBluescript, que por sua vez est incorporado no fago ZAP e carrega o inserto. Com a clivagem destas duas seqncias, o DNA automaticamente

circularizado na bactria para originar a forma recombinante do plasmdeo Bluescript

SK(M13). O inserto clonado no Bluescript flanqueado por promotores para as RNA

polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, aps o vetor ser convenientemente

27

linearizado, cpias do RNA relativo ao inserto, podem ser obtidas em ambas as direes

atravs do uso das RNA polimerases T3 e T7.

7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae e

Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato de que tratam-se de organismos eucariotos

inferiores e como tais possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm

disso, muitas protenas de leveduras so similares estrutural e funcionalmente s suas

homlogas em mamferos. A utilizao de leveduras como um modelo de estudo traz as

seguintes vantagens:

tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes quantidades

de leveduras em pouco tempo.

genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de

mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas.

possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o que

permite a obteno de mutaes recessivas em clulas haplides, bem como a

realizao de experimentos de complementao gentica. As clulas de

mamferos so diplides o que torna impossvel a deteco de mutaes

recessivas.

Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em leveduras. A maior

parte dos genes marcadores utilizados em leveduras so genes envolvidos na biossntese de

aminocidos e nucleotdeos. Um dos marcadores frequentemente utilizados o gene de

levedura LEU2 que codifica para uma das enzimas da via de sntese da leucina, a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2, no cresce em meio

de cultura que no contm leucina. Assim quando o gene LEU2 utilizado na

transformao da linhagem leu 2, as clulas desta linhagem que adquiriram o gene LEU2

sero capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminocido leucina. Esta

estratgia semelhante a resistncia ampicilina adquirida por bactrias que foram

transformadas com plasmdeos que contm o gene que promove a resistncia ampicilina.

A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleo comumente utilizados em

levedura.

28

GENE ENZIMA SELEO HIS3 Imidazol glicerolfosfato desidratase Histidina LEU2 -Isopropilmalato desidrogenase Leucina LYS2 -Aminoadipato redutase Lisina TRP1 N-(5'-fosforibosil)- antranilato isomerase Triptofano URA3 Orotidina-5'fosfato decarboxilase Uracil

Tabela 2. Genes marcadores de seleo em levedura. Os meios de cultura utilizados em geral contm todos os aminocidos necessrios manuteno da levedura com exceo de um. Assim, por exemplo, clulas transformadas com o gene HIS 3 so selecionadas em meio de cultura deficiente em histidina.

Os vetores utilizados na transformao de leveduras so capazes de se propagar

tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulao destes vetores (clonagem, mutagnese, seqenciamento, etc) realizada em bactria como para qualquer plasmdeo convencional e ento o mesmo transferido para levedura, organismo onde os ensaios de interesse so

realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo ponte (shuttle vectors) e contm entre outros elementos origens de replicao de bactria e levedura bem como genes

marcadores que funcionam para a seleo nos dois organismos.

Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de leveduras:

Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de bactrias e genes

marcadores para seleo em bactria e levedura. Neste caso o plasmdeo no capaz de

replicar de modo autnomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor propagado e

capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos

cromossomos de levedura.

Vetores que replicam em levedura: tais vetores tambm contm origem de replicao de

bactria e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Dois tipos de origens de

replicao de levedura so empregadas nestes plasmdeos. O primeiro tipo consiste na

origem de replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em levedura. O

segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA cromossomal denominadas

ARS (Autonomously Replicating Sequence, sequncias de replicao autnoma). Plasmdeos contendo a origem de replicao do plasmdeo de 2m ou sequncias tipo ARS

replicam em mltiplas cpias em levedura (Figura 18). Uma variante deste tipo de vetor inclui, alm da sequncia ARS, uma sequncia tipo centromrica, denominada CEN, que

garante que a replicao destes plasmdeos seja estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo

29

celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura (Figura 18). YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) so uma variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e sequncias telomricas, que so sequncias das extremidades dos cromossomos. A presena de

sequncias telomricas nestes vetores permite que sejam replicados como molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs no so

utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, tm se mostrado uma

ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que

possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura 19).

Figura 18. Vetores de levedura. Contm sequncias de plasmdeo (aqui de pUC118) que permitem a propagao e do resistncia a ampicilina em E.coli, o gene de seleo em levedura (neste caso LEU 2) e stios nicos de restrio. Vetores multicpias: Estes plasmdeos existem na forma circular na levedura. Alguns destes vetores empregam a origem de replicao do plasmdeo de 2 m, outros utilizam origens de replicao isoladas de cromossomos que so denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicao do plasmdio em mltiplas cpias. Vetores cpia nica: Vetores que contm origens de replicao tipo ARS podem ser mantidos estavelmente atravs da adio de sequncias centromricas, CEN. A existncia de sequncias tipo CEN assegura que o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado de modo preciso durante a diviso celular.

GLOSSRIO - ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao autnoma). Sequncia

que funciona como uma origem de replicao em cromossomos de levedura.

- BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de bactria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no fator F de plasmdeo que assegura

que o plasmdeo seja mantido em pequeno nmero de cpias na bactria. - Centrmero: regio do cromossomo que apresenta uma constrico e qual liga-se o

fuso mittico durante a meiose ou mitose. necessria para a manutno da estabilidade e segregao correta dos cromossomos durante a diviso celular.

LEU2 LEU2

ARS ARS

Puc118 Puc118

DNA LeveduraDNA Levedura

Cpia nicaCEN

Multicpias

30

- Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em um dado fragmento de DNA.

- Telmero: extremidade do cromossomo que contm sequncias repetitivas de DNA sintetizadas pela enzima telomerase e importantes na manuteno da integridade

cromossomal.

- YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura). Sistema de clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de replicao

autnoma e que contm um centromro de levedura e duas sequncias telomricas em

suas extremidades.

Figura 19. YACs: Contm um centrmero, dois telmeros, gene(s) marcadores para seleo em levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.

III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE

A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um

fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e

relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de

interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado comumente

quando o objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo, claro que quando queremos clonar

um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele

codificado(s) necessrio obteno de colees de clones recombinantes, portadores de

AmpR

TRP1

ARS1CEN4

EcoRI

URA3

+EL+EL HIBam

YAC

31

molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados

de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de

clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso

dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar.

O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma

haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em

106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais

na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones. Embora a

soluo deste problema envolva estratgias especficas no preparo do DNA alvo e na

escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de

cDNAs segue um procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA

genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o

DNA alvo so ligados e introduzidos em E. coli atravs de infeco ou em alguns casos, por

transformao direta (Figura 20).

1. BIBLIOTECA DE cDNA

A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de

RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese

in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reao o DNA

complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contriburam para grandes avanos na anlise da estrutura e

expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias

farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA,

construdas a partir da populao de RNAm isolada da clula ou do tecido de interesse.

Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so

enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da mensagem, ele no

contm introns e apresenta significativamente poucas seqncias que no codificam para

32

protenas (Figura 21). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de polipeptdios

importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm

facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subseqente deduo da

seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao

da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem

sido identificadas gentica ou bioquimicamente.

Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas.

Escolha doVetor

mRNA

Tecido

DNA

cDNA

Digerir o DNA,

Fracionar por tamanho

DNA clonvel

Titulao e caracterizaoda Biblioteca

Ligar DNA a um vetor

Introduzir o produto da ligao em E.coli

Parcial ou completamente

33

Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs

especficos envolve 4 etapas:

1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse.

2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido.

3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na

expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs.

4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes.

1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla

A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total

do tecido e subseqente seleo da frao de RNA poli(A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade

34

essencial, uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das

seqncias na biblioteca.

Uma vez obtida a frao de RNA poli(A)+, procede-se sntese dos cDNAs atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 22). Nos ltimos dez anos foram descritos vrios mtodos para sntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens

particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamente usado

para esse fim:

a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalisar in vitro a polimerizao de DNA a partir RNA e

requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a sntese. Na maioria das

vezes, a molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA.

b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hbrida RNA-DNA.

c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E. coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma

molcula de cDNA de fita dupla.

d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. Atravs da atividade 3'-5' exonuclesica dessa enzima remove-se possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3'.

e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de fita dupla, cpia exata da mensagem.

1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a insero em um vetor

de clonagem (Figura. 22). Para isso tambm existem vrios mtodos disponveis, que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmdio ou fago. O fago tem sido o vetor de escolha para a construo de bibliotecas de cDNA. A razo bsica desta

preferncia a eficincia. Em comparao com plasmdios, o fago requer cerca de 16

vezes menos cDNA por g do vetor para produzir nmero equivalente de clones

recombinantes. Alm disso, bibliotecas em fago so mais fceis de serem manipuladas do

35

que bibliotecas em plasmdios. Entretanto, uma desvantagem dos vetores que no so favorveis para procedimentos de seqenciamento do DNA e de mutagnese dirigida. Mais

recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficincias. Essa classe

de vetores compreende os fagemdios que, como o prprio nome sugere, so plasmdios

contendo pores do genoma de fago e que renem vantagens desses dois vetores.

Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla.

Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir

um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago .

metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de

S-adenosil metionina. Esse passo essencial para proteger os stios EcoRI que possam

existir no cDNA contra a ao da EcoRI em digesto a ser realizada subseqentemente

no processo de clonagem.

adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa reao

resulta em molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23).

36

um nico stio de EcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela digesto com EcoRI,

liberando o excesso de adaptadores ligados na molcula. A metilao prvia do cDNA

garante que no haja digesto interna do cDNA.

antes de ser inserido no vetor, o cDNA separado do excesso de molculas de

adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas de Sephadex.

as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4 ligase.

o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do capsdeo do fago.

os fagos obtidos so utilizados para infectar bactria de linhagem que favorece o

crescimento dos recombinantes.

aps a infeco da bactria com os cDNA recombinantes temos como produto uma

biblioteca de cDNA, que deve conter cpias de toda as seqncias de RNAm da

populao original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma

triagem em busca do clone de interesse.

2. BIBLIOTECA GENMICA

Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos

necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de

transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da

expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA

atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones portando fragmentos

de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questo. Deste modo, o

aspecto principal considerado na construo de uma biblioteca genmica est na obteno

de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O

tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse

esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas

genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de

fragmentos de DNA de maior tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem,

37

atravs da utilizao de vetores baseados no fago . Basicamente, a construo da biblioteca genmica envolve os seguintes passos:

a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem.

b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras.

Figura 23. Clonagem de cDNA em fago .

Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade da biblioteca.

1

5 6

2 3

4

7 8 9

Me

Me

Metilao do cDNA para protegeros stios internos de RIEco

Ligao dos adaptadores RIcom o cDNA

Eco Digesto com RI paragerar stios coesivos RI

EcoEco

Separao do cDNA do excesso deadaptadores

cDNA purificado Ligao do cDNA dos braosdo fago lambda

Empacotamento dos recombinantescom as protenas formadoras dapartcula viral

Infeco da bactria hospedeira o fago recombinante

Plaqueamento dos recombinantes

38

2.1. Preparo do DNA do inserto

A representatividade de uma biblioteca genmica depende grandemente da

aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados so gerados, para que no haja excluso sistemtica de nenhuma seqncia. O fracionamento mecnico do DNA o meio

de se obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse mtodo no

comumente adotado devido trabalhosa manipulao necessria para que os fragmentos

assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado possvel conseguir

fragmentao suficientemente aleatria atravs de digestes parciais do DNA com enzimas

de restrio. Uma vantagem em se utilizar a digesto parcial do DNA a produo de

fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser diretamente ligados ao vetor.

Para garantir que a digesto atinja todo o genoma so utilizadas enzimas de restrio que cortam freqentemente o DNA e que no apresentam desvios de distribuio de stios. A

enzima Sau3A I, que reconhece o stio de 4 bases GATC, e que gera fragmentos

compatveis com stios de clonagem de vrios fagos e cosmdios, tem provado ser bastante

til na produo de bibliotecas de DNA genmico digerido parcialmente. Aps a digesto

parcial, os fragmentos gerados precisam ser fracionados antes de serem ligados ao vetor.

Sem esse fracionamento, fragmentos pequenos podero ligar-se entre si produzindo falsos

recombinantes. Fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago

podero ligar-se aos braos do fago, alterando a relao entre as quantidades de DNA de

inserto e vetor.

Um mtodo de fracionamento freqentemente adotado o de centrifugao em

gradiente de sacarose. Aps a digesto parcial, a soluo de DNA aquecida para que

possveis fragmentos agregados se dissociem, e ento, aplicada sobre um gradiente de

sacarose de alta salinidade. Aps a centrifugao, so coletadas fraes desse gradiente.

Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As fraes contendo os

fragmentos de DNA de tamanho apropriado so utilizadas para a ligao com o vetor. A

figura abaixo ilustra esse procedimento.

39

Figura 24. Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao em gradiente de sacarose. O gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro.

Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, bastante razovel se

pensar que a probabilidade de uma dada seqncia de interesse estar presente em uma

biblioteca genmica possa ser estimada estatisticamente, com base na distribuio de

Poisson. Especificamente, o nmero de clone independentes (N) que precisam ser triados para uma probabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica dada por:

N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)]

onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G o tamanho do

genoma, em pares de base.

Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa

como vetor um fago , para termos 99% de chance de isolar qualquer dada seqncia presente em uma nica cpia em um genoma tpico de mamfero.

N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000

2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica

Fagos e cosmdeos so comumente usados na construo de bibliotecas genmicas.

Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentao aleatria so ligados

com o DNA do vetor para formar concatmeros que podem ento ser empacotados em

partculas de fago . As bibliotecas construdas em vetores so armazenadas e propagadas

1

Tubo de plsticoTubo capilar

Tubos de coleta

Bomba

Gradiente desacarose 2 3 4 5

40

na forma de fagos recombinantes. No caso de clonagem em cosmdios, entretanto, essas

partculas virais servem meramente como veculos para introduzir o DNA recombinante

dentro da bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdio se comporta como um plasmdio

grande. Os cosmdios podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb, quase duas vezes o

tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste modo, usando-se o cosmdio como vetor, necessrio gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma seqncia de cpia nica estar representada em uma biblioteca genmica de mamfero.

Entretanto, bibliotecas em cosmdios so mais difceis de se construir e manter do que as

bibliotecas de fagos. Cosmdios so ento usados quando o gene de interesse muito

grande ou quando uma regio extensa do DNA cromossomal desejada. No caso de isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias onde a biblioteca ser

usada muitas vezes, o uso de vetores mais recomendado.

Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo , bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas.

Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. BE=brao esquerdo; BD=brao direito; stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Conforme indicado no diagrama este vetor apresenta um fragmento central

flanqueado por dois fragmentos essenciais (direito e esquerdo). O fragmento esquerda, chamado de brao esquerdo, codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento direita,

chamado de brao direito, contm a origem de replicao do fago e promotores de outros

genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos encontram-se os stios de

restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientao inversa.

5'5'3'

3'BE

BE=brao esquerdo BD=brao direito

B BS E E S

BDFragmento centralcos cos

41

Como todo fago , a extremidade de cada brao apresenta um segmento de fita simples (cos). Esses segmentos so complementares entre si e permitem a recircularizao da molcula, e a conseqente replicao do DNA do fago dentro da clula hospedeira.

Esse tipo de vetor chamado de vetor de substituio por que no processo de

clonagem a parte central do DNA do fago substituda pelo fragmento de DNA a ser

clonado, originando a molcula recombinante.

Mais recentemente outros vetores com capacidade para grandes insertos foram

desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de levedura (YACs) so molculas lineares de DNA cuja arquitetura mimetiza a estrutura de um cromossomo autntico (Figura 26). Os YACs recombinantes so criados pela ligao de fragmentos grandes de DNA genmico

exgeno (at 2000 kb) com os dois "braos" do vetor YAC e o produto da ligao introduzido na levedura por transformao. Nos YACs recombinantes, o segmento de DNA

genmico exgeno flanqueado de um lado por um centrmero, uma origem de replicao

e uma marca de seleo e pelo outro lado, por uma segunda marca de seleo. As leveduras

transformantes com cromossomo artificial so selecionadas como colnias em meio com as

drogas de seleo.

Os cromossomos artificiais de bactrias (BAC) so molculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleo a antibitico. Os segmentos de DNA genmico

exgeno so clonados no vetor BAC in vitro e o produto da reao de ligao introduzido

por eletroporao em cepas de E. coli, onde mantido como um plasmdio de cpia nica.

Os vetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminao dos clones vazios e

cheios. A mdia de tamanho dos clones de BACs 120 kb, mas alguns clones podem

chegar 300kb.

Os vetores de bacterifago P1 acomodam fragmentos genmicos de 70 a 100Kb. Neste sistema, as molculas lineares recombinantes geradas a partir de seqncias do vetor

e do genoma so empacotadas in vitro em bacterifago P1. Aps a injeo em E. coli, as molculas se tornam circulares pela atividade de uma recombinase, que promove a

recombinao de seqncias especficas presentes no vetor. Estes vetores carregam marca

de seleo para antibitico, marca de seleo positiva para seleo dos clones com inserto

de DNA genmico exgeno e uma origem de replicao plasmdial P1, que mantm uma ou

duas cpias dos plasmdios recombinantes na clula. Uma segunda origem de replicao

pode ser ativada para amplificao dos plasmdios antes do isolamento do DNA.

42

Figura 26. Construindo um cromossomo artificial de levedura (YAC). O vetor YAC carrega uma origem de replicao (ORI), um centrmero (CEN), dois telmeros e marcas de seleo (X e Y). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-16, p. 1139.

Os cromossomos artificiais P1 combinam as caractersticas dos bacterifagos P1 e

dos BACs, incluindo a marca de seleo positiva e as origens de replicao do bacterifago

P1. Os clones circulares recombinantes de PACs gerados durante a reao de ligao in

vitro so introduzidos em E.coli por eletroporao e mantidos como um plasmdio de cpia

nica na clula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma humano em PACs variam de

60kb a 150kb.

43

IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o clone correto

na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confeco da biblioteca

genmica ou de cDNA. Embora seja relativamente fcil selecionar as colnias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistncia a antibiticos que esto

presentes nos vetores (Figura 27A), muito mais difcil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmdio devero ser examinadas

milhares de colnias de bactrias crescidas em placas de petri contendo agar, para a

deteco daquela(s) colnia(s) que produza(m) pequenas quantidades da protena expressa pelo gene de interesse ou ento que possua(m) o gene de interesse sem qualquer expresso protica que o caracterize (Figura 27B). Ser discutida inicialmente a situao na qual a protena expressa no hospedeiro. Em seguida ser discutida a situao mais comum onde a

protena no expressa e a anlise ser feita atravs da prpria presena do DNA de

interesse no fago ou na bactria.

1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO Se o gene de interesse capaz de se expressar na clula hospedeira pode-se

identificar o clone que carrega este gene pela presena desta protena entre as colnias

recombinantes. Para isto, o hospedeiro no deve produzir esta protena, a menos que ele

carregue o clone que a produza. Se esta protena for produzida normalmente pela clula

hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira defectiva ou mutante para

o gene de interesse. Quando este gene for incorporado ele pode ser detectado por complementao daquela funo. Se a protena a ser detectada for especfica de mamfero,

por exemplo, a clula hospedeira j ser naturalmente defectiva. Se a protena for uma enzima que catalisa uma reao mensurvel pode ser possvel triar as colnias por sua

atividade enzimtica.

Se a protena de interesse no for uma enzima com funo detectvel, uma outra

estratgia ser necessria para a identificao do clone correto, como por exemplo, o uso de

um anticorpo especfico para a protena de interesse. Anticorpo uma protena do soro

produzida pelos mamferos que se combina com alta especificidade com outra protena, o

antgeno. Neste caso, a protena de interesse o antgeno. Como o anticorpo se combina

especificamente com o antgeno, se o antgeno estiver presente em uma ou mais colnias de

44

uma placa de petri, a identificao destas colnias poder ser feita observando-se a reao

antgeno-anticorpo.

Figura 27. Em A, estrutura do plasmdio pBR322, um tpico vetor de clonagem. Em B, mtodo da inativao insercional para isolar plasmdios contendo DNA exgeno. A insero do DNA exgeno no plasmdio pBR322 causa inativao da resistncia tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126.

Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a biblioteca de cDNA ter de ser construda num vetor de expresso. Neste caso os cDNAs so inseridos nestes vetores em regies que promovam sua expresso em E.coli, normalmente em promotores

que possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como uma protena de fuso, ou seja, ser sintetizada subseqente a alguns aminocidos pertencentes protena do vetor bacteriano. Estas protenas de fuso so geralmente mais estveis que a

45

correspondente protena de eucarioto produzida em bactria e, portanto podem ser obtidas

em grande quantidade. Para visualizar a produo destas protenas, uma parte dos fagos de

cada placa de lise (ou bactrias) recombinantes desenvolvidos numa placa de Petri so transferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas e ento submetidos a uma soluo contendo um anticorpo especfico para a

protena desejada. Depois que os anticorpos livres so removidos, um segundo anticorpo adicionado para localizar a posio do primeiro. O segundo anticorpo normalmente

radioativo e pode ser identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se

uma colnia radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raios-X ser observada

depois que o filme for revelado (Figura 28). A localizao desta mancha no filme corresponde localizao da colnia que produziu aquela protena, na placa de petri

original. Esta colnia ser ento recuperada da placa original e cultivada.

Uma limitao deste procedimento que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa

ser especfico para a protena de interesse. A produo de anticorpos pode ser obtida pela

injeo da protena (antgeno) em um animal. No entanto, esta protena injetada deve ser pura, caso contrrio mais que um anticorpo ser formado.

2 O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE

Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colnias da biblioteca

genmica ou de cDNA, se este gene no expresso?

Quando o DNA em soluo aquosa aquecido 100C, ou exposto pH alto, as bases complementares que normalmente seguram as duplas hlices juntas so dissociadas em duas fitas simples. Este processo chamado de desnaturao. Estas mesmas fitas

simples podero se reassociar se forem conservadas 65C, por longos perodos, num

processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a associao ocorre entre cidos nuclicos de diferentes origens). Reaes de hibridao ocorrem entre quaisquer duas cadeias de cidos nuclicos de fita simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham seqncias de nucleotdeos complementares.

46

Figura 28. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver na orientao correta e na apropriada seqncia aberta de leitura traduzido em protena de fuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos.

Promotor

EcoRI lac

-Galactosidasegfll

EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRIlinker

cDNA

Proteina de Fuso

Empacotamento dos fagos e plaqueamento em

camada bacterianain vitro

Membrana denitrocelulose

Placas de lise

Nitrocelulosesobre as placasde lise

Remoo damembrana

Protenas se ligama nitrocelulose

Incuba membrana com anticorpo primrio

Lava membrana

Incuba membrana comanticorpo secundrio

anticorpo secundrio

anticorpo primrio

Filme de raio-X

""

47

Este princpio da hibridao molecular fundamental para caracterizar DNAs

recombinantes quando o gene de interesse no expresso. Sondas de cidos nuclicos

(fragmentos de cido nuclico marcados radioativamente, geralmente com 32P) so utilizadas para localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem

uma seqncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca genmica (ou de cDNA) os fagos carregando DNA recombinante so espalhados juntamente com uma suspenso de bactrias numa placa de petri contendo meio de cultura slido. Uma vez

visualizada as placas de lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdio) preparada uma rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. Este

processo permite a transferncia de uma poro de fagos de cada placa de lise (ou de bactrias de cada colnia) para a membrana, de tal maneira que o padro das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para expor e desnaturar o DNA das

colnias ali presentes e incubados com uma soluo de DNA ou RNA fita simples, marcada

radioativamente e complementar ao gene de interesse para permitir a hibridao. Dois

polinucleotdios simples fitas somente iro se hibridar se forem complementares. A

localizao da placa de lise que se hibridou sonda determinada aps a exposio da

membrana a um filme de Raios-X (autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio das colnias na placa de petri original (Figura 29).

Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse, pode ser o

RNA de genes que so expressos em tecidos especficos ou em estgios especficos do ciclo

celular, ou mesmo o gene de uma outra espcie que codifica para a mesma protena. Neste

ltimo caso, a reao de hibridao pode ser realizada em baixa temperatura (420C ao invs de 650C) e em baixa concentrao de sal (baixa estringncia) para permitir a hibridao mesmo entre DNAs que tenham algumas bases no complementares.

48

Figura 29. Triagem de uma biblioteca genmica ou de cDNA, construdas no fago , com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posio do clone recombinante de interesse identificada atravs de autoradiografia. O DNA isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e submetida a anlises posteriores.

Membrana denitrocelulose

Placas de lise Fagos absorvem anitrocelulose

Placa mestra

Membrana rplica

Sonda de cidonucleico marcadacom 32p

Sonda HibridizaDNA ligado ao filtro

Lavagem das sondasno incorporadas

Sonda hibridiza ao DNA do fagoque contem a sequncia complementar Filme de raio-X

Placa mestra

DNA lambdaisolado da placa delise

DNA clonado

Clone lambda purificado

49

Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao podem ser identificados

numa biblioteca de cDNA por hibridao diferencial. Isto , genes expressos em tecidos

especficos, em estgios especficos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes

regulados por fatores de crescimento so adequados para serem analisados por este tipo de

abordagem. Para esta identificao necessrio produzir duas populaes celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual eles no se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de clulas tratadas com fatores de crescimento. Esta biblioteca

plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrio reversa do RNA

das clulas tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros hibridado com cDNA preparado de clulas no tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar

mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzveis pelos fatores de

crescimento (Figura 30). Quando o DNA a ser clonado expressa uma protena cuja seqncia conhecida

pode-se inferir a seqncia de um trecho de DNA que lhe deu origem e sintetizar

oligonucleotdeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como sondas moleculares. Estes nucleotdeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotdeos de

comprimento para ser especfico para a seqncia procurada. Um problema enfrentado para

sintetizar estes oligonucleotdeos a degenerecncia do cdigo gentico. Alguns

aminocidos so codificados por quatro ou mesmo seis diferentes cdons e, portanto mesmo

um pequeno polipeptdio pode ter sido codificado por vrias seqncias de DNA. Para

contornar este problema as sondas oligonucleotdicas so algumas vezes sintetizadas como

uma mistura de todas as possveis combinaes dos cdons que so traduzidas naquela

seqncia protica (Figura 31). Uma destas seqncias correta e ir hibridar com o clone de interesse, mas a possvel hibridao dos outros oligonucleotdeos com seqncias sem

interesse pode levar a obteno de clones falsos positivos.

Uma variao deste mtodo utilizar o menor nmero possvel de oligonucleotdeos

como sonda, escolhendo a regio da protena que contm o menor nmero possvel de

cdons degenerados (por exemplo, metionina somente codificada pelo cdon AUG). Deve-se levar em conta tambm qual o cdon de uso mais freqente para cada

aminocido, na espcie que est sendo analisada.

50

Figura 30. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento atravs de hibridao diferencial. Esta estratgia utilizada para clonar uma famlia de genes que so induzidas quando clulas quiescentes so estimuladas a crescer pela adio dos fatores de crescimento.

AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA

Clulas com fatoresde crescimento

Clulas Quiescentes

Cresce em 3 hsIsola o mRNA poli(A)

Isola o mRNA poli(A)

mRNA induzido pelosfatores de crescimento

Oligo(dt)TranscritaseReversa32p-dNTPA

hibridao

Oligo(dt)TranscritaseReversa32p-dNTPA

hibridao

Prepara bibliotcade cDNA com fagolambda e infecta Ecoli

Placa mestra

Rplica em membrana de nitrocelulose

Autoradiogrfia Autoradiogrfia

Filmede raio-X

Filmede raio-X

cDNAcomum Clone de cDNAindusvel por

fatores de crescimento Isola o clone

do fago

Placa mestra

Hibridaonegligenciavel

51

Figura 31. Desenho de sondas oligonucleotdicas baseadas na seqncia protica. Como a maioria dos aminocidos especificada por dois ou mais cdons estes oligonucleotdeos so sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotdeos das posies ambguas. A seqncia correta estar representada entre os oligos. Uma outra possibilidade usar uma sonda tentativa cuja escolha baseada na freqncia de uso do cdon na espcie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer.

3 ANLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING Vrias tcnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridao dos

cidos nuclicos visando a triagem e isolamento de seqncias especficas destas molculas.

A maioria destas tcnicas, conforme j mencionado, trabalha com uma rplica do DNA de interesse imobilizado num suporte slido tal como uma membrana de nilon ou de

TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATTTC

CT

AG

AG

AG

CT

A

C

CGACGT

TGTATGGATGAAATGAA

TGTATGGACGAAATGAATGCATGGACGAAATGAA

TGCATGGATGAAATGAA

TGTATGGATGAGATGAA

TGTATGGATGAGATGAA

TGCATGGACGAGATGAATGCATGGATGAGATGAA

TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC

TGCATGGACGAAATGAA

TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC

---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG---

---ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG---

5'

5'

5'

3'

3'

3'G C

T A

Cys-Met-Asp-Glu-Met-Lys-Arg-Asn-Ile Sequncia Parcialde Aminocidos

Sequncias Possveisdo DNA

Parte da sequncia compouca ambigidade

Sondas contendotodas as possveis combinaes

de condons de parteda sequncia

Sonda tentativa

Hibridao com cDna

52

nitrocelulose. Um destes mtodos, desenvolvido na dcada de 70 por E. M. Southern,

tornou-se conhecido por "Southern blotting". Nesta tcnica o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de

agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita so visualizados por colorao com brometo de

etdio, desnaturados 'in situ' com hidrxido de sdio e transferidos para uma membrana por

capilaridade, com o auxlio de uma soluo de alta concentrao salina. Tais condies

permitem que o DNA seja retido na membrana no ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando uma rplica do gel. O DNA covalentemente ligado membrana

usando-se calor ou luz ultravioleta. Sondas de cidos nuclicos (DNA ou RNA marcados radioativamente) podem ser utilizadas para hibridar com o DNA fixado na membrana e a posio na qual a ligao especfica ocorrer pode ser detectada por autoradiografia da

membrana (Figura 32). O padro de hibridao pode ser comparado diretamente com a regio no gel original que contm a seqncia de DNA de interesse. Southern blotting

uma tcnica to poderosa que permite que as informaes obtidas sejam utilizadas para a construo de um mapa de restrio de uma determinada parte do DNA clonado, por

exemplo, para identificar a regio que contm o gene de interesse. Esta tcnica possibilita

tambm que as sondas de cidos nuclicos sejam utilizadas para diagnsticos de distrbios genticos, ensaiando-se o DNA genmico