Teknologi Fermentasi

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy

Insitut Teknologi Bandung

Pendahuluan

• Istilah Fermentasi• asal kata : “fervere” berarti mendidih• Penggunaan dalam bidang mikrobiologi

Proses umum fermentasi

Fermentasi

Pemisahan

Penghancuran sel

Isolasi & purifikasi

Formulasi

Raw Material

Sterilisasi

Sel mikroba

Penyiapan inokulum

By product

Pengolahan limbah

Parameter yang menentukan

• Mikroorganisme• Substrat• Produk• Kondisi fermentasi• Bioreaktor• Tahap Isolasi dan purifikasi• Pengolahan limbah

Mikroorganisme

•Fisiologi

•Morfologi

•Pertumbuhan

•Karakteristik pertumbuhan

•Kebutuhan lingkungan

•Pola produksi metabolit

•Stabilitas genetik

Substrat

• Komposisi• Sifat fisika dan kimia• Proses sterilisasi• Konversi• Rancangan formulasi media• Limbah post-fermentation process

Produk

• Intrasel, ekstrasel• Proses panen• Perhitungan hasil• Sensitivitas terhadap degradasi• By-product

Kondisi fermentasi•Lingkungan fisik

•Lingkungan kimia

•DO2, pCO2

•Mass transfer

•Kadar nutrisi

•Karakteristik mixing

•Aerasi dan agitasi

Bioreaktor

• Jenis bioreaktor• Komponen instrumen• Cara Sterilisasi• Parameter proses

Tahap Isolasi dan purifikasi

Proses aseptik

Pemisahan, fraksinasi, isolasi

Purifikasi

Pengolahan limbah

• Jenis limbah• Proses pengolahan• Parameter keamanan lingkungan

Jenis Fermentasi

• Fermentasi padat (Solid Substrate Fermentation)

• Fermentasi cair /bawah permukaan (Sub-merged Fermentation)

Metabolisme• Katabolisme : proses degradasi nutrien menjadi

fragmen-fragmen yang lebih kecil. Proses katabolisme menghasilkan ATP, proton motive force, menurunkan tenaga dan pengambilan nutrisi serta pembentukan rangka karbon dalam jalur metabolisme inti

• Jalur degradasi ini bisa pendek (misalnya pembentukan asetat) atau bisa pula panjang (misalnya pembentukan asam benzoat)

• Amphibolisme : proses pembentukan intermediate (senyawa antara)

• Terjadi pembentukan building blocks (senyawa pembangun), misalnya asam amino, purin, pirimidin, gula-gula fosfat, asam organik, dan metabolit lain

• Anabolisme : biosintesis polimer dari monomer (asam amino, nukleotida dan lipid) dari rangka karbon utama melalui pemanfaatan ATP dan NADPH

• Pertumbuhan sel dengan menggabungkan struktur makromolekul melalui proses polimerisasi monomer-monomer yang dihasilkan dari proses biosintesis, melibatkan berbagai nukleotida fosfat

• Polimer sel a.l. protein, asam nukleat, dinding sel, makanan cadangan, dll.

Tahap Utama Metabolisme

CO2

KH, Lemak, Protein

Katabolisme

Biosintesis

Tumbuh

Kerangka karbon

ADPATP

NADP

NADPH

NTP

NDP

Asam amino, asam nukleat, dll

Protein, lipid, struktur sel

Regulasi metabolisme

• Seluruh kegiatan metabolisme berlangsung sangat cepat dan harus bekerja di dalam sel

• Mikroorganisme memiliki potensi genetik untuk memproduksi lebih dari 1000 enzim

• Enzim ini harus dibentuk dalam jumlah yang tepat dan dalam sistem yang terkoordinasi dengan baik agar sel bekerja secara efisien

• Mikroorganisme dapat dengan cepat mengantisipasi perubahan lingkungan sehingga dapat dengan segera memperbaiki sistem metabolismenya

• Regulasi untuk sistem yang demikian terjadi pada level sintesis enzim atau pada level kerja enzim

Faktor yang mempengaruhi regulasi metabolisme

• Jenis dan jumlah enzim • Jenis dan jumlah substrat• Adanya induktor, aktivator, represor dan

inhibitor• Faktor lingkungan • Faktor genetik

Pemanfaatan mikroorganisme

• Biomassa• Enzim• Metabolit primer• Metabolit sekunder• Biotransformasi• Bioinformatik

Beberapa contoh metabolit sekunder mikroba dan manfaatnya

• Antibiotik : penisilin (Penicillium chrysogenum), sefalosporin (Cephalosporium acremonium),

• Imunosupresan : silosporin (Trichoderma polysoprum)

• Bidang pertanian : growth promoter Zearalonone (Gibberella zeae)

• Enzim : amilase (Aspergillus niger), lipase (Pseudomonas aeruginosa)

• Pigmen : ankaflavin (Monascus purpureus)

Pertumbuhan sel mikroba

• Pertumbuhan sel : bertambahnya jumlah sel atau massa sel

• Growth (pertumbuhan) merupakan hal yang penting dalam fungsi mikroba

• Bakteri membelah diri dalam waktu 20-90 menit

• Ragi : 90-120 menit• Kapang : 4-8 jam

Syarat mikroba tumbuh

• Ada sel hidup• Ada sumber energi• Ada nutrisi dan faktor pertumbuhan• Tidak ada inhibitor atau toksin• Kondisi fisiko-kimia yang mendukung

Kurva pertumbuhan mikroorganisme (sistem batch)

a

b

c

d e

Waktu (t)

Biomasa

(X)

Ket : a: fase lag ; b: fase log ; c:fase stasioner ; d:fase kriptik ; e:fase kematian

µ x = dX/dt

µ =laju pertumbuhan

X=konsentrasi sel

t=waktu

Sistem kultur untuk pertumbuhan dan produksi menggunakan mikroorganisme

• Sistem batch (kultur curah)• Sistem fed-batch (kultur curah umpan)• Sistem continuous (kultur sinambung)

Batch Fed-batch Continuous

Medium pertumbuhan

• Substrat organik dan non-organik• Kebutuhan hidup tergantung pada proses

metabolisme, kebutuhan akan oksigen, suhu, dll

• Menentukan jenis mikroba :– Mikroba aerob, an-aerob, obligat, fakultatif– Mikroba psikrofil, termofil– dll

Kebutuhan mikroorganisme

• Untuk tumbuh, mikroorganisme memerlukan nutrisi

• Medium untuk pertumbuhan mikroorganisme dapat berupa bahan alam (sifatnya kompleks) atau bahan kimia (sifatnya terukur)

Elemen dalam sel mikroorganismeElemen % brt.krng Fungsi fisiologis

C 50 komponen sel organikO 20 komponen sel organik,

Akseptor e- pd respirasiN 14 utk protein, as.nukleat,

Ko-enzimH 8 komponen sel organikP 3 Fosfolipid, as.nukleatS 1 as.amino, proteinK 1 kation dan kofaktor pd

reaksi enzimatisNa 1 kation dan membran

transporCa 0,5 kation dan kofaktorMg 0,5 kation dan kofaktorCl 0,5 anion

Komposisi rata-rata sel mikroba

Mikroba % C % N % Protein % KH %Lipid %As.Nukleat

%Abu

Bakteri 48 12 55 9 7 23 6

Ragi 48 57 40 38 8 8 6

Kapang 48 56 32 49 8 5 6

Komponen Medium untuk mikroorganisme

• Karbon : sebagai sumber energi dan komponen utama biomasaSumber karbon dapat berasal dari : Polisakarida atau monosakarida, contoh : Karbohidrat, glukosa, molase, amilum, malt extract, dll.

• Nitrogen : sebagai sumber pembentukan komponen utama selSumber nitrogen dapat berasal dari : garam ammonium, urea, asam amino, sumber kompleks seperti CSL (Corn Steep Liquor), Yeast Extract, Pepton, dll.

Komponen Medium untuk mikroorganisme

• Mineral : P, K, Na, Mg, S, Ca, dllP sebagai salah satu unsure penting dalam pembentukan asam nukleat (dalam bentuk Fosfat), S sebagai unsure pembentukan beberapa asam amino esensial, Mg sebagai kofaktor dalam proses fosforilasi.

• Unsur-unsur lain : trace elements misalnya : vitamin, EDTA, dll

Komponen Medium untuk mikroorganisme

• Air : komponen utama terbesar dalam medium

• Oksigen : kebutuhan utama mikroba aerob sebagai aksptor electron pada proses respirasi, yang umumnya diperoleh dari komponen air (H2O)

Hubungan antara pertumbuhan sel, penggunaan substrat dan pembentukan produk (metabolit)

• Laju pertumbuhan • Laju pertumbuhan vs konsentrasi nutrisi• Koefisien hasil (yield coefficient)• Nilai metabolit (metabolic quotient)• Persamaan Monod• Persamaan Michaelis-Menten• Pembentukan produk (type I, II dan III)

PRODUKSI ASAM SITRATSECARA FERMENTASI

Pendahuluan

• Asam sitrat merupakan asam organik• Berguna dalam industri makanan, farmasi

dan tambahan dalam makanan ternak• Dapat diproduksi secara kimiawi, atau

secara fermentasi menggunakan mikroorganisme

Sejarah Asam sitrat• Sebelum tahun 1800 asam sitrat diperoleh dari

tumbuhan (buah lemon)• 1893 : ditemukan diproduksi oleh jamur

berfilamen (filamentous fungi)• 1923 : produksi pertama asam sitrat

menggunakan mikroorganisme dengan cara fermentasi pada permukaan (surface culture)

• 1930 : produksi menggunakan fermentor diperoleh sebanyak 5000 ton

• 1979 : produksi menggunakan fermentor mencapai 220.000 ton dari 220 m3

Kegunaan asam sitrat

• Industri makanan : flavouring agent, ekstrak jus buah, perasa permen, es krim,dll

• Industri farmasi : dapar pH, pengawet dalam sediaan farmasi, perasa asam, dll

• Industri kimia : antifoam agent, softener, campuran warna tekstil, campuran deterjen, dll

Mikroba penghasil asam sitrat• Merupakan metabolit primer• Aspergillus niger• Aspergillus wentii• Penicillium luteum, P.citrinum• Mucor piriformis• Citromyces pfefferianus• Candida lipolytica• Trichoderma viridae• Corynebacterium sp.• dll

Biosintesis asam sitrat dalam mikroorganisme

• Asam sitrat (2-hidroksipropana-1,2,3-asam karboksilat) adalah produk metabolisme primer dan dibentuk dalam siklus asam trikarboksilat (TCA cycle)

• Sumber karbon utama adalah glukosa• Enzim dalam jalur EMP terlibat dalam

penguraian glukosa menjadi piruvat• Ketika piruvat mengalami dekarboksilasi

membentuk asetil koA, residu asetat masuk dalam siklus TCA

• Selama proses idiophase, enzim sitrat sintase meningkat 10 kali selama produksi asam sitrat, sedangkan enzim asonitase dan sitrat dehidrogenase berkurang

• Glukosa juga mengalami katabolisme melalui jalur pentosa fosfat. Enzim untuk siklus ini terdapat pada A.niger

Diagram biosintesis asam sitrat

PEP

Piruvat

Asetil coA

Sitrat

IsoSitratSuksinat

Fumarat

Malatoksaloasetat

Fermentasi asam sitrat• Dapat dilakukan menggunakan 2 macam

metode fermentasi : permukaan (surface process) dan bawah permukaan (submerged process)

• Pada tahap tropofase, sebagian dari glukosa digunakan untuk membentuk miselium dan respirasi

• Pada tahap idiofase, sisa glukosa diubah menjadi asam organik, termasuk asam sitrat

• Produksi berkisar antara 40-69% dalam bentuk asam sitrat-1-hidrat (123 g per 100 g sukrosa) atau asam sitrat anhidrat (112 g per 100 g sukrosa)

Medium untuk nutrisi• Sumber karbon : berbagai amilum dapat

digunakan (kentang, hidrolisat amilum, sirup glukosa, sukrosa, molase, dll)

• Penambahan trace elements (Cu, Mn, Mg, Fe, Zn, Mo) dalam skala ppm. Bila berlebih dapat berakibat toksik

• Fe merupakan faktor penentu, jumlahnya tergantung pada sumber karbon yang digunakan. Contoh : bila digunakan sukrosa murni, jumlah optimal Fe adalah 2.0 ppm, sedangkan bila hidrolisat amilum yg digunakan, jumlah optimal Fe adalah 0,2 ppm

• Komponen medium lainnya : sumber nitrogen, fosfat, juga diperlukan

• pH harus diatur < 3.0, untuk menekan pembentukan asam oksalat dan asam glukonat. Selain itu dapat mengurangi kemungkinan terkontaminasi

Proses produksi

• Penyiapan suspensi spora A.niger pada 25 °C, inkubasi selama 10-14 hari

• Inokulum dibuat dengan 15% gula (misalnya dari molase)

• Ditambahkan ion sianida untuk menginduksi pembentukan miselium dalam bentuk pelet dengan ukuran 0,2-0,5 mm

• Setelah 24 jam, pelet dapat digunakan untuk produksi dalam fermentor

Proses dengan metode permukaan (surface process)

• Medium untuk metode ini dapat berupa substrat padat atau cair

• Substrat padat : wheat bran, amilum ubi (sweet potato)

• Setelah disterilisasi, substrat ditaburkan dalam loyang setebal 3-5 cm lalu diinkubasi pada 28 °C

• Pertumbuhan dapat dipercepat dengan penambahan enzim amilase

• Proses fermentasi berlangsung 5-8 hari

• Substrat cair lebih banyak digunakan karena efisien. Spora inokulum sebanyak 2 – 5 x 107

spora/m2

• Komposisi medium : (g/L)– Sukrosa 160 – 200 – NH4NO3 1,6 – 3,2 – CaH2PO4 0,3 – 1,0– MgSO4.7 H20 0,2 – 0,5– ZnSO4 0,01 – 0,02– Ca heksasianoferat 0,4 – 2,0

Kondisi fermentasi

• Suhu inkubasi 30 – 40 °C• Ventilasi penting untuk pertukaran gas

karena produksi asam sitrat akan berkurang bila CO2 di atmosfir meningkat > 10%

• pH diatur supaya asam

Proses dengan metode bawah permukaan (submerged process)

• 80% produksi asam sitrat di dunia menggunakan metode ini

• Waktu fermentasi 8 hari• 3 parameter yang menentukan

keberhasilan proses : kualitas fermentor, struktur miselium, pasokan oksigen

• Fermentor harus terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam, misalnya SS (Stainless Steel)

• Bentuk miselium yang ideal adalah bentuk pelet dengan diameter kecil. Bila terjadi filamen dan tidak membentuk klamidospora, asam sitrat yang terbentuk menjadi sedikit

• Rasio jumlah Cu dan Fe mempengaruhi bentuk miselium ini

• Oksigen harus antara 20 – 25% jenuh, dengan laju aerasi 0,2 – 1 vvm

• Tidak perlu dilakukan pengadukan karena viskositasnya tidak tinggi

Perolehan kembali (product recovery)

• Jika asam oksalat terbentuk sebagai produk samping (side product), maka asam oksalat harus diendapkan dengan Ca agar membentuk endapan Ca-oksalat pada suasana asam. Asam sitrat akan tetap tertinggal dalam larutan sebagai mono-kalsium sitrat

• Asam sitrat selanjutnya diendapkan pada pH 7,2 dengan suhu 70 – 90 C

• Pemurnian selanjutnya dengan asam sulfat, lalu diendapkan sebagai kalsium sulfat

• Penambahan kabon aktif, atau ion exchange, dan kristalisasi sebagai asam sitrat atau asam sitrat monohidrat pada 36,5 C