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Tema 15. Métodos genéticos para la identificación microbiana
1. Introducción2. Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos
2.1. Marcado de la sonda2.2. Utilización de las sondas 2.3. Tipos de hibridación
2.3.1. Hibridación en solución3. Técnicas de amplificación
3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
1. Introducción
Utilidad de las técnicas genéticas:
• Detección directa de microorganismos en muestras clínicas
- Identifican un fragmento específico del genoma del microbio
• Identificación de microorganismos tras su aislamiento por métodosconvencionales
• Estudios de epidemiología molecular
- Permiten comparar cepas aisladas
Clasificación
• Técnicas de hibridación
• Técnicas de amplificación
2. Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos
Desnaturalización y renaturalización del ADN
Sonda de ADN: pequeño fragmento monocatenario (20-40 bases) marcado, utilizado para la detección de su secuencia complementaria por hibridación
2.1. Marcado de la sonda
Inicialmente con sustancias radiactivas 32P o 35S
Actualmente sustancias no radiactivas
• enzimas (peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina)
• sustancias lumínicas (ésteres de acridina)
• sustancias de captura (biotina, digoxigenina)
2.2. Utilización de las sondas
Son específicas
Insuficiente sensibilidad (microorganismos escasos en muestra clínica)
Excelente instrumento para identificar microorganismos aislado por cultivo (ADN en abundancia)
Muy útiles para microorganismos de identificación difícil o compleja (métodos convencionales)
2.3.1. Hibridación en solución
Extracción del ADN
Desnaturalización en solución (en tubo)
Adición de la sonda marcada con acridina
Si encuentra secuencia complementaria se une y forma fragmento bicatenario
Adición de álcali (inactiva acridina en sonda libre)
Medición de luminiscencia (luminómetro)
2.3. Tipos de hibridación
• en solución
• sobre soporte sólido (Investigación)
• in situ (Se realiza sobre un corte histológicoo tejido, lo que permite localizar elmicroorganismo en el contexto del tejido)
3. Técnicas de amplificación
3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
1983, Kary Mullis
Objetivo: amplificar región particular del ADN de un microorganismo quecontiene información útil desde el punto de vista del diagnóstico.
Mezcla de reacción para PCR:
• ADN diana (a amplificar)
• cebadores o “primers” (oligonucleótidos)
• nucleósidos trifosfatos
• polimerasa termoestable (Taq-polimerasa), obtenida de la bacteriatermófila Thermus aquaticus)
3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Cebadores:
• fragmentos cortos (12-20 nucleótidos) monocatenarios de ADN
• sintetizados artificialmente
• uno de ellos complementario de un fragmento de una cadena (5´- 3´)
• el otro complementario de un fragmento de la otra cadena (3´- 5´)situado entre 100 y 2.000 bases de distancia
3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Termociclador: repite las tres fases del proceso, variando la temperatura (según programa)
Procedimiento
A) Desnaturalización: calentar mezcla (95ºC, 15-60 segundos)
B) Hibridación: enfriar mezcla (30-65ºC, 30 segundos)
C) Polimerización o extensión del cebador: 72ºC,de 30 segundos a 5 minutos
Al final del primer ciclo, por cada dos cadenasiniciales existen cuatro
Se inicia un nuevo ciclo calentando a 95ºC
Tras 20-30 ciclos (2-3 horas) se consiguenmillones de copias del fragmento original
Calentar a 95ºCLas cadenas de ADN se separan
Enfriar a 30-65ºCLos cebadores se unen a las cadenas de ADN
Calentar a 72ºCLa Taq-polimerasa sintetiza nuevascadenas de ADN
Dos nuevas moléculasde ADN
3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Amplicón: fragmento de ADN amplificado
Electroforesis en gel de agarosa (determinación de tamaño y confirmación)
Soporte demetacrilato
Peine
Carga de lasolución deADN en los
pocillos
Gel deagarosa
Polo negativo
Polopositivo
Fuenteeléctrica
Bandasde ADN
(A)Se vierte la agarosa ensobrefusión sobre elsoporte de vidrio conel peine en posición
(B)Se quita el peine después de
que la agarosa solidifique y secoloca el gel en la cubeta
(C)Se enchufa la cubeta
a la corriente
(D)Se tiñe el gel con bromuro
de etidio y se fotografíabajo luz ultravioleta
Gel
Peine
Soporte demetacrilato
Cable del electrodo
Tampón
(A)
(D)
(B)
(C)
Esquema general deelectroforesis horizontal de ADN