The Pennsylvania State University

The Graduate School

College of Medicine

THE CONTRIBUTION OF AN IRON GENETIC MODIFIER, HFE,

TO ALZHEIMER’S DISEASE

A Dissertation in

Neuroscience

by

Eric Christopher Hall II

© 2009 Eric C. Hall II

Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of

Doctor of Philosophy

December 2009

The dissertation of Eric Christopher Hall II was reviewed and approved* by the following:

James R. Connor University Distinguished Professor and Vice Chair of Neurosurgery Dissertation Advisor Chair of Committee

Anne M. Andrews Associate Professor of Molecular Toxicology and Biomedical Sciences Jack T. Rogers Associate Professor of Psychiatry and Neuroscience

Jiyue Zhu Assistant Professor of Cellular and Molecular Physiology

Robert J. Milner Professor of Neural and Behavioral Sciences Director, Graduate Program in Neuroscience

*Signatures are on file in the Graduate School

iii

ABSTRACT

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder of the human central nervous 

system characterized by loss of memory that leads to dementia. The pathological characteristics 

of AD include an accumulation of amyloid‐β (Aβ) plaques and aggregated 

hyperphosphorylated tau protein, neurofibrillary tangles (NFT), throughout the brain. Multiple 

hypotheses have been proposed to explain AD etiology including the loss of brain iron 

regulation. Among the areas investigated are the of variant forms of the HFE gene as a risk 

factor or disease modifier.  HFE is an iron regulatory protein that limits cellular iron uptake. A 

mutation in the HFE gene can result in a loss of function. Epidemiological studies have 

investigated an association between HFE polymorphisms and AD risk; however these studies 

are not all in agreement. In order to determine more clearly how HFE could impact 

neurodegenerative processes, experiments in this thesis were designed to investigate the 

cellular contribution of the HFE H63D polymorphism in proposed AD pathogenic pathways. 

We utilized a novel stably transfected human neuroblastoma SH‐SY5Y cell model expressing 

HFE polymorphisms for our studies.  

The thesis focused on three main areas: 1) HFE and amyloid regulation, 2) HFE and tau 

phosphorylation and 3) HFE effects on potential drug treatment strategies in AD. To evaluate 

amyloid regulation, we determined amyloid precursor protein (APP) synthesis, processing, and 

cellular vulnerability to Aβ toxicity in the presence of different forms of HFE. APP levels 

increased with HFE expression, although no effect of HFE variants was observed. There was no 

iv

change in APP processing as determined by performing spectrofluorometric secretase‐specific 

activity assays. We discovered that cells expressing the H63D variant are more sensitive to Aβ 

peptide exposure determined by MTT assay [3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyl 

tetrazolium bromide]. There was an up‐regulation of the intrinsic apoptotic pathway as 

determined by increases in caspase‐9 expression, caspase‐3 activity, and early apoptosis based 

on detection of Annexin V. It appeared that these changes were a result of mitochondria 

dysfunction in the cells expressing H63D because we also observed an increase in Bax in the 

cellular mitochondrial fraction and cytochrome C levels were increased in the cytosolic fraction. 

Mitochondria dysfunction and oxidative stress can act as indirect mechanisms to impact tau 

phosphorylation. Tau phosphorylation is regulated by a homeostasis of tau kinase and 

phosphatase activity that can be impacted by cellular stressors. In cells expressing the H63D 

polymorphism, tau phosphorylation was increased at serine‐residues implicated in NFT 

generation. There was no change in phosphatase expression in H63D cells; yet there was an 

increase in glycogen synthase kinase‐3 beta (GSK‐3β) activity as determined by measuring GSK‐

3β phosphorylation at its serine‐9 residue. The genotype associated alterations in GSK‐3β 

activity with HFE expression prompted us to investigate the role of a novel intracellular 

regulator of amyloid and tau phosphorylation; the prolyl‐peptidyl cis/trans isomerase, Pin1. 

Oxidative stress has been shown to impact Pin1 expression and activity, thus we hypothesized 

that H63D cells would have altered Pin1 activity. Total Pin1 expression levels were not affected 

by HFE expression; however there was an increase in phosphorylation of Pin1 at its serine‐16 

v

residue suggesting a decrease in Pin1 activity in H63D cells. We also found that iron‐mediated 

oxidative stress could increase Pin1 phosphorylation.  

Overall, these data suggest that gene‐environment interactions are significant in 

elucidating disease etiology and identifying therapeutic targets to improve disease outcomes. 

Independent of HFE status, we discovered that GSK‐3β could be impacted by cellular iron. 

Thus, increased dietary iron intake could result in even higher GSK‐3β activity in individuals 

carrying an H63D allele. GSK‐3β is involved in numerous cellular processes including, but not 

limited to: protein phosphorylation, mitochondria function, and apoptosis, which were 

impacted by expression of the H63D HFE polymorphism. These data suggest GSK‐3β as a 

potential pharmacological target that could greatly improve cellular function in AD patients, 

especially those carrying the H63D allele.  

vi

TABLE OF CONTENTS

LIST OF FIGURES ................................................................................................................. ix

LIST OF ABBREVIATIONS ................................................................................................. xi

ACKNOWLEDGEMENTS ................................................................................................... xv

Chapter 1 ALZHEIMER’S DISEASE AND CONSEQUENCES OF IRON IMBALANCE ……………………………………………………………………………...1

Introduction ................................................................................................................... 1 Alzheimer’s disease pathway mechanisms ............................................................... 3 

  Amyloid Cascade ..................................................................................................... 3 Neurofibrillary Tangles…………………………………………………………...7 Neuroinflammation……………………………………………………………....12 Mitochondria Dysfunction…………………………………………………….....14 Oxidative Stress…………………………………………………………………...16 

Iron dyshomeostasis and AD……………………………………………......……....17 Iron and Amyloid………………………………………………………………....18 Iron and Neurofibrillary Tangles………………………………………………..19 Iron and Oxidative Stress, Mitochondria dysfunction, and inflammation….20 

  Iron Regulation……………………………………………………………………….22   HFE…………………………………………………………………………………….26     HFE polymorphisms and AD……………………………………………………29   Pin1…………………………………………………………………………………….41     Pin1 and AD……………………………………………………………………….42     Pin1 polymorphisms and AD……………………………………………………46   Summary……………………………………………………………………………....49   References for Chapter 1……………………………………………………………..51 

Chapter 2 THE INFLUENCE OF HFE POLYMORPHISMS ON AMYLOID REGULATION IN SH-SY5Y CELLS…………………………………………………………………..79

Abstract……………………………………………………………………………......79   Introduction…………………………………………………………………………...80   Materials and Methods……………………………………………………………....82 

Reagents…………………………………………………………………………..82   Cell Culture……………………………………………………………………...83   Western Blot…………………………………………………………………......83   ELISA assay………………………………………………………………….......84   Secretase Activity assays……………………………………………………….84 

vii

  Statistical analysis………………………………………………………………85   Results…………………………………………………………………………………85   Discussion……………………………………………………………………………..88   Figures…………………………………………………………………………………93   References for Chapter 2……………………………………………………………..99 

Chapter 3 THE H63D GENE VARIANT PROMOTES ACTIVATION OF THE INTRINSIC APOPTOSIS PATHWAY WITH Aβ EXPOSURE……………………..……........104

Abstract………………………………………………………………………………104   Introduction………………………………………………………………………….105   Materials and Methods…………………………………………………………......107     Reagents…………………………………………………………………………..107     Cell Culture……………………………………………………………………….109     Cell Viability Assay……………………………………………………………....109     Preparation of cell lysates………………………………………………………..110     Immunoblotting…………………………………………………………………..110     Caspase‐3 activity assay………………………………………………………….111     Annexin V/PI assay……………………………………………………………….111     Statistical analysis…………………………………………………………………112   Results………………………………………………………………………………....112   Discussion……………………………………………………………………………..117   Figures.………………………………………………………………………………...122   References for Chapter 3……………………………………………………………..129 

Chapter 4 EXPRESSION OF THE HFE ALLELIC VARIANT H63D IN SH-SY5Y CELLS AFFECTS TAU PHOSPHORYLATION ..................................................................... 139

Abstract………………………………………………………………………………...139   Introduction………………………………………………………………………..…..140   Materials and Methods……………………………………………………………….142     Reagents………………………………………………………………………….....142     Cell Culture………………………………………………………………………....143     ELISA assays………………………………………………………………………..144     Western Blot………………………………………………………………………...144     Statistical analysis…………………………………………………………………..145   Results…………………………………………………………………………………..145   Discussion………………………………………………………………………………149   Figures…………………………………………………………………………………..153   References for Chapter 4…………………………………………………………..…..162 

viii

Chapter 5 PROLYL-PEPTIDYL ISOMERASE, PIN1, ACTIVITY IS COMPROMISED IN ASSOCIATION WITH THE EXPRESSION OF THE HFE POLYMORPHIC ALLELE, H63D…………………………………………………………………………………….167

Abstract…………………………………………………………………………………167   Introduction………………………………………………………………...…………..168   Materials and Methods…………………………………………………………….….171     Reagents……………………………………………………………………………..171     Cell Culture………………………………………………………………………....171     Cell lysate preparation…………………………………………………….……….172     ELISA assays………………………………………………………………………..172     Western blot………………………………………………………………………...173     Statistical analysis…………………………………………………..………….…..174   Results……………………………………………………………………...…………..174   Discussion………………………………………………………………………….......176   Figures……………………………………………………………………………….....180   References for Chapter 5………………………………………………………….…..186 

Chapter 6 HFE IN PATHOGENIC DISCOVERY FOR ALZHEIMER’S DISEASE: THERAPEUTIC IMPLICATIONS ............................................................................... 192

Introduction…………………………………………………………………….……..192   What’s the value of current AD drugs?.....................................................................194   HFE, APP, and cell signaling; is there a link?...........................................................195   The impact of GSK‐3β drug discovery……………………………………………...198   Is iron removal the key to defeating AD pathology……………………………….199   Utility of an H63D mouse model……………………………………………………202   Conclusion……………………………………………………………………………..204   References for Chapter 6……………………………………………………………...206 

ix

LIST OF FIGURES

1.1. Amyloid Cascade…………………………………………………………………............6 

1.2. Neurofibrillary tangle formaion………………………………………………………..11 

1.3. Iron uptake and HFE function…………………………………………………….........25 

1.4. Pin1 function in Alzheimer’s disease…………………………………………………..45 

2.1. Total APP levels in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells. ..................................... …93 

2.2. Amyloid secretase activity in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells .................... …94 

2.3. Cellular iron effects on amyloid secretase activity……………………………………95 

2.4. Impact of cellular iron exposure on amyloid secretase activity in H63D variant 

cells..............................................................................................................................................97 

2.5. C83 APP levels in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells……………………………98 

3.1. Measurement of cell viability………………………………………………….……….122 

3.2. The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of Bax translocation to mitochondria.123 

3.3. The effect of Aβ25‐35 treatment on Cytochrome c release……………………………..124 

3.4. The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of caspase‐9 activation………………..125 

3.5. The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of caspase‐3 activity…………………..126 

3.6. The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of caspase‐8 activation………………..127 

3.7. The effect of Aβ25‐35 treatment on apoptosis………………………………………...…128 

4.1 Tau phosphorylation in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells………………..…....153 

4.2. Kinase and Phosphatase expression in SH‐SY5Y……………...……………………...155 

4.3. Inhibition of tau phosphorylation…………………………………………..…………..158 

x

4.4. Impact of cellular iron on GSK‐3β activity and tau phosphorylation………….....…159 

4.5. Tau phosphorylation in SH‐SY5Y cells with Trolox treatment………………………161  

5.1. Pin1 expression and activity……………………………………………………………..180 

5.2. Cellular iron effects on Pin1 expression and activity………………………………….181 

5.3. Iron chelation and Pin1 activity……………………………………………………...….183 

5.4. Trolox treatment and Pin1 activity………………………………………………….......184 

5.5. HFE effects on Alzheimer’s disease Pin1 substrates…………..…………………...….185 

6.1. Cellular impact of H63D HFE on AD pathways………………………………...…….193

xi

LIST OF ABBREVIATIONS 

aa        amino acid 

Aβ        amyloid‐beta 

AD        Alzheimer’s disease 

ADAM      a disintegrin and metalloprotease 

AKT        protein kinase B 

ALS        amyotrophic lateral sclerosis 

ApoE        Apolipoprotein E 

APH        anterior pharynx defective protein 

APP        amyloid precursor protein 

ATP        adenosine triphosphate 

BACE        β‐amyloid converting enzyme 

BBB        blood‐brain barrier 

Cdk        cyclin‐dependant kinase  

CNS        central nervous system 

DFO        desferrioxamine 

DMEM      Dulbecco’s modified Eagle’s medium 

DMT        divalent metal transporter 

DNA        deoxyribonucleic acid 

DS        Down syndrome 

ER        endoplasmic reticulum 

xii

ERK        extracellular signal‐regulated kinase 

FAC        ferric ammonium citrate 

FAD        familial Alzheimer’s disease 

Fe2+        ferrous iron 

Fe3+        ferric iron 

GFAP        glial fibrillary acidic protein 

GI        gastrointestinal 

GM‐CSF      granulocyte‐macrophage colony stimulating factor 

GSK        glycogen synthase kinase 

H2O2        hydrogen peroxide 

HFE        protein product of HFE gene 

HH        hereditary hemochromatosis 

HRP        horse radish peroxidase 

IL        interleukin 

IRE        iron responsive element 

IRP        iron regulatory protein 

kD        kilodalton 

LIP        labile iron pool 

LPS        lipopolysaccharides 

M‐CSF       macrophage colony stimulating factor 

MCI        mild cognitive impairment 

xiii

MHC        major histocompatibility complex 

MPT        mitochondrial permeability transition pore 

mRNA       messenger ribonucleic acid 

MRI         magnetic resonance imaging 

MS        multiple sclerosis 

MTT        [3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyl tetrazolium bromide] 

NeuN        neuron‐specific nuclear protein 

NFT        neurofibrillary tangles 

NMDA      N‐methyl D‐aspartate 

O2        oxygen 

OH∙        hydroxyl radical 

PD        Parkinson’s disease 

PDH        pyruvate dehydrogenase 

PEN‐2        presenilin enhancer‐2 

PS‐1/2        presenelin‐1 or presenilin‐2 

PVDF        polyvinylidene fluoride 

RIPA        radioimmunoprecipation assay 

ROS        reactive oxygen species 

sAPP        soluble amyloid precursor protein 

SH‐SY5Y      human neuroblastoma cells 

TCA        tricarboxylic acid 

xiv

Tf        transferrin 

TfR        transferrin receptor 

TLR        toll‐like receptor 

TNF        tumor necrosis factor 

VDAC       voltage‐dependant anion channel 

WT        wild type 

xv

 

ACKNOWLEDGEMENTS

To my doctoral thesis advisor, Dr. Connor; thank you for your guidance and challenging

me along my journey to become a better scientist. You have led by example in showing the

dedication and commitment required to be a successful scientist, which I admire. Thank you to

my thesis committee members: Drs. Anne Andrews, Robert Milner, Jack Rogers, and Jiyue Zhu.

I appreciate your willingness to serve and the sacrifice of your time in helping me to achieve my

goal.

To my wife, Ayanna, your tremendous support and love over the past few years has

been unrivaled; I appreciate all that you are in my life. Thanks Mom for your love and the

sacrifices made to position me to succeed. Thanks Dad for your support, friendship, and love

throughout my life. To my brother, Ian, thanks for all of your support and keeping me

connected to sports when I was swamped in science. To my grandmothers, thanks for inspiring

and believing in me since I was a young boy to achieve great things. There is still more to come,

I’m still climbing. Thank you to a host of aunts, uncles, cousins, friends, teachers and mentors

who were instrumental in keeping me on the path to succeed. To my Pastor, Dr. Ashe, I

appreciate your support and for showing me what it takes to be a mighty man of valor in my

marriage, relationships, and professional endeavors. Last, but not least, I want to acknowledge

my Lord and Savior, Jesus Christ, for His love and marvelous sacrifice that has enabled me to

achieve this goal and realize much more.

Chapter 1

Alzheimer’s Disease and Consequences of Iron Imbalance

Introduction 

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder of the human central nervous 

system primarily seen in an elderly population of patients suffering from a loss of memory that 

leads to dementia. AD was first discovered by Louis Alzheimer in 1906, in which he described a 

patient as having a progressive dementing illness (Alzheimer et al., 1995; Hardy, 2006). 

Alzheimer’s disease is progressive and clinically defined by stages based on the patient’s 

memory recall, the ability to learn new concepts, and completing assigned tasks to test 

executive brain function (Salloway and Correia, 2009). The diagnosis of AD patients is variable 

due to its unknown disease etiology. Currently, the most accurate diagnosis is confirmed upon 

death. AD is defined pathologically by the accumulation of extracellular amyloid‐beta (Aβ) 

plaques and intracellular neurofibrillary tangles (NFT) throughout the brain cortices along with 

the loss of neuronal cells, especially in the hippocampus (Masters et al., 1985; Selkoe, 1989).  

The etiology of AD appears to be impacted by multiple factors including, but not limited 

to: genetic mutations, protein alterations, and environmental factors. Early‐onset AD is 

attributed to patients under the age of 65 years who develop AD symptoms as early as 30 years 

2

old primarily due to mutations in the genes that code for amyloid precursor protein (APP), 

presenilin‐1 (PS1), and/or presenilin‐2 (PS2), which account for 5‐10% of total AD cases (Goate 

et al., 1991; Selkoe, 1996a; Thinakaran, 1999). APP is located on chromosome 21 and the 

presenilin genes, PS1 and PS2 are located on chromosome 14 and 1, respectively (Thinakaran, 

1999).  

Late‐onset or sporadic AD occurs in patients 65 years and older, which accounts for 90‐

95% of AD prevalence (Tanzi and Bertram, 2005). The sporadic AD cases are the most elusive in 

terms of disease etiology, diagnosis, and treatment. Environmental factors including diet and 

toxin exposure may greatly influence sporadic AD onset, which can be further impacted by 

genetic modifiers (Tanzi and Bertram, 2005). Apolipoprotein E (ApoE) is a candidate gene for 

late‐onset AD and is located on chromosome 19 (Tanzi and Bertram, 2005). Polymorphisms in 

the ApoE gene have been associated with increased late‐onset AD risk when the ApoE4 allele is 

expressed (Petersen et al., 1995; Tanzi and Bertram, 2005). However, ApoE4 is not a causative 

gene and due to the unknown cause(s) of the majority of late‐onset AD cases, therapeutic 

efficacy and options are limited. 

Current therapies temporarily improve memory loss primarily by treating symptoms of 

AD, but not the pathology based on the continued progression of the disease. The current AD 

therapy options are cholinesterase inhibitors: donepezil (Aricept ®), galantamine (Razadyne ®), 

and rivastigmine (Exelon ®), and a glutamate inhibitor via acting on NMDA receptors: 

memantine (Namenda ®) (Shah et al., 2008). All of these drugs act on indirect mechanisms 

implicated in AD and do not impact the amyloid and tau pathological markers. Since, AD 

3

appears to be a multi‐factorial neurodegenerative disease based on onset, symptoms, and 

severity; it would be valuable to further classify AD patients for improved therapeutic 

outcomes. This goal may be attained by identifying genetic and environmental factors that 

influence known pathological markers.  

 

Alzheimer’s disease pathology mechanisms 

Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that leads to 

learning and memory abnormalities. The disease etiology has eluded medical science experts 

for over a century, yet the pathology of AD is clear. Numerous histological pathology studies 

have revealed the accumulation of Aβ and NFTs to be the cellular hallmarks of an AD brain 

(Glenner and Wong, 1984; Masters et al., 1985; Mattson et al., 1999). Hence, investigators have 

focused on discovering the molecular and cellular mechanisms that yield the amyloid and tau 

protein pathology markers (Hardy and Allsop, 1991; Selkoe, 1994, 1996a). Ironically, the roles of 

these proteins in AD onset are not clearly defined, but much evidence suggests that their effects 

are toxic and detrimental to neuronal cells.  

 

‘Amyloid Cascade’   

A popular hypothesis regarding AD pathology is the ‘Amyloid Cascade’, which 

suggests that increased amyloid production, aggregation, and plaque formation leads to 

neuronal loss (Hardy and Higgins, 1992; Hardy and Selkoe, 2002). Amyloid was first isolated 

from amyloid filaments in the AD brain by Glenner and Wong in 1984 (Glenner and Wong, 

4

1984). It was described as the key protein in the hallmark Aβ plaque of AD brains by Masters 

and colleagues in 1985 (Masters et al., 1985). Amyloid precursor protein (APP) is a 110 kDa 

transmembrane protein that exists in different isoforms; 695 amino acids (aa) (APP695), 751 aa 

(APP751), and 771 aa (APP771) (Golde et al., 1990). APP695 is the predominant isoform and is 

highly expressed in neurons (Golde et al., 1990). APP has an extramembranous N‐terminal, 

transmembrane sequence, and a cytoplasmic C‐terminal tail (Kang et al., 1987; Selkoe, 1994, 

1996b).  

APP is processed in one of two cellular pathways: non‐amyloidogenic (α‐secretase) or 

amyloidogenic (β‐secretase) (Selkoe et al., 1996; Hardy and Selkoe, 2002). An illustration of this 

process can be seen in Figure 1.1. In the non‐amyloidogenic pathway, APP is cleaved by a 

disintegrin and metalloprotease (ADAM) within the Aβ sequence of APP (687‐ 688 aa) to 

generate soluble APPα (Selkoe et al., 1996; Buxbaum et al., 1998). The ADAM 10 and ADAM 17 

proteins compromise the α‐secretase complex (Selkoe et al., 1996; Buxbaum et al., 1998). Soluble 

APPα has been shown to offer cellular neuroprotection by improving glutamate transport, cell 

adhesion, positive modulation of K+ channels, increased resistance to oxidative stress, increased 

NFκB transcription, mitochondrial protection, cholesterol metabolism, synaptotrophic effect 

and enhancing cell adhesion (Rogers and Lahiri, 2004; Hardy, 2009). Also, a C‐terminal 

fragment, C83, is retained after α‐secretase cleavage (Selkoe et al., 1996; Buxbaum et al., 1998; 

Hardy, 2009). 

Alternatively, APP can be processed to generate the Aβ peptide in the amyloidogenic 

pathway. APP is cleaved at aa 671 by β‐secretase converting enzyme (BACE) (Selkoe et al., 1996; 

5

Vassar et al., 1999; Hardy and Selkoe, 2002; Hardy, 2009). There are two isoforms of BACE, 

BACE1 and BACE2; BACE1 can initiate the generation of the Aβ peptide by yielding a C‐

terminal fragment of APP containing the Aβ sequence that is 99 amino acids long (C99) (Vassar 

et al., 1999; Hardy, 2006, 2009). The cellular function of BACE2 is not known (Vassar et al., 1999; 

Hardy, 2006, 2009). 

Another enzyme complex known as gamma (γ) secretase cleaves the remaining APP 

fragments from the non‐amyloidogenic and amyloidogenic pathways. The γ‐secretase enzyme 

complex consists of presenilin‐1 (PS1), presenilin‐2 (PS2), anterior pharynx defective (APH), 

presenilin enhancer‐2 (PEN‐2), and Nicastrin (Edbauer et al., 2003; Hardy, 2006). The γ‐

secretase complex can act in the non‐amyloidogenic pathway by cleaving the remaining C83 

fragment of APP into P3 and P6 fragments (Edbauer et al., 2003; Hardy, 2006). Also, Aβ 

generation is completed by γ‐secretase activity by cleaving the C99 protein fragment at either aa 

711 or aa 713 that completes the production of Aβ into mostly a 40 or 42 amino acid length 

peptide and a P6 fragment (Vassar et al., 1999; Hardy, 2006, 2009).  

6

 

Figure 1.1: Amyloid Cascade. This diagram illustrates the cellular processing of amyloid precursor protein in either the non‐amyloid generating or amyloid generating (Aβ) cellular pathways.   

 

 

 

7

 

The Aβ peptides generated from the amyloidogenic pathway make up the key 

components of the senile Aβ plaque. According to the ‘Amyloid Cascade’, Aβ peptide 

production and subsequent plaque formation lead to the other pathological hallmark of AD, 

NFT (Hardy and Higgins, 1992; Hardy, 2009). Aβ has been shown to induce tau 

phosphorylation in many models supporting the idea that Aβ generation precedes NFT 

formation (Greenberg et al., 1994; Adalbert et al., 2007; De Felice et al., 2008).  

 

Neurofibrillary tangles 

  The neurofibrillary tangles (NFT) found in AD brains consist of paired helical tau 

filaments or straight tau filaments that are hyperphosphorylated resulting in a tauopathy 

disease (Lee and Trojanowski, 1999; Lee et al., 2001; Lee et al., 2005; Adalbert et al., 2007). Paired 

helical filaments were first discovered in NFT of the AD brain by electron microscopy in 1963 

(Kidd, 1963). Tau protein was later discovered as the major component of NFT in 1986 by 

Grundke‐Iqbal and colleagues (Grundke‐Iqbal et al., 1986; Iqbal and Grundke‐Iqbal, 2006). The 

paired helical filaments of tau in AD brains are phosphorylated at more than 30 residues, in 

which most are serine‐threonine‐proline residues (Morishima‐Kawashima et al., 1995; Buee et 

al., 2000; Wang et al., 2007a). Tau phosphorylation is directly regulated by kinase and 

phosphatase activity (Ballatore et al., 2007; Wang et al., 2007a). Indirect mechanisms proposed 

to contribute to NFT pathology are oxidative stress, Aβ toxicity, and inflammation (Ballatore et 

al., 2007). Several cellular kinases have been shown to phosphorylate tau, but glycogen synthase 

8

kinase 3‐beta (GSK‐3β) and cyclin‐dependant kinase 5 (Cdk‐5) are implicated in tau 

hyperphosphorylation leading to NFT formation (Lee et al., 2001; Ballatore et al., 2007; 

Mazanetz and Fischer, 2007). Thus, I will focus on reviewing the contributions of these kinases 

to the tau pathology found in AD.  

  Glycogen synthase kinase 3‐beta (GSK‐3β) was first discovered by Itarte and colleagues 

in 1979 and found to be involved in regulating cellular glycogen metabolism (Itarte and Huang, 

1979). Cellular functions of GSK‐3β have been further described and it regulates numerous 

cellular proteins including metabolic and signaling proteins, structural proteins, and 

transcription factors (Grimes and Jope, 2001; Juhaszova et al., 2004; Huang and Klein, 2006). The 

role of GSK‐3β in tau phosphorylation was not discovered until 1988 (Ishiguro et al., 1988) and 

it became recognized as tau kinase I until it was later discovered that it was the same protein as 

GSK‐3β (Hanger et al., 1992; Ishiguro et al., 1993; Goedert et al., 1995). The activity of GSK‐3β is 

regulated by its phosphorylation state at serine‐9 and tyrosine‐216 residues, which can be 

regulated by AKT (Grimes and Jope, 2001; De Sarno et al., 2002; Juhaszova et al., 2004). 

Transgenic mouse models over‐expressing GSK‐3β display tau hyperphosphorylation and have 

behavioral abnormalities (Lucas et al., 2001; Hernandez et al., 2002) suggesting GSK‐3β is a 

significant protein contributing to the NFT pathology found in AD brains. 

Cyclin‐dependant kinase‐5 (Cdk‐5) is a member of the cyclin‐dependant kinase family of 

proteins involved in regulating the cell cycle (Kesavapany et al., 2003). Active Cdk‐5 is only 

found in the central nervous system, despite being expressed in other cellular tissues (Nikolic et 

al., 1996; Tang and Wang, 1996; Kesavapany et al., 2003). Unlike most cyclin‐dependant kinases, 

9

which are activated by associating with cyclin, Cdk‐5 activity is regulated by calcium‐

dependant protease calpain, which cleaves p35 and p39 proteins to p25 and p29, which activate 

Cdk‐5 (Lew et al., 1994; Patzke and Tsai, 2002; Kesavapany et al., 2003). Baumann and 

colleagues were the first group to discover that Cdk‐5 could phosphorylate tau in AD brains 

(Baumann et al., 1993). Since then, numerous studies have gone on to investigate Cdk‐5 in cell 

and animal models to evaluate its role in phosphorylating tau. A key study using p25 

transgenic mice showed that Cdk‐5 is central to the development of tau aggregation and tangle‐

like formation (Noble et al., 2003). The authors also demonstrated that Cdk‐5 and GSK‐3β co‐

localized and GSK‐3β activity increased as well (Noble et al., 2003). However, a later 

investigation found that over‐activation of Cdk‐5 could inhibit GSK‐3β activity in p25 

transgenic mice (Plattner et al., 2006). Plattner and colleagues suggested that GSK‐3β is the key 

player in tau hyperphosphorylation and Cdk‐5 acts as a modulator based on its ability to inhibit 

GSK‐3β activity (Plattner et al., 2006). Additionally, Cdk‐5 has been shown to prime tau 

phosphorylation sites for GSK‐3β mediated tau phosphorylation (Sengupta et al., 1997; Li et al., 

2006; Li and Paudel, 2006). Thus, the role of Cdk‐5 continues to be debated regarding its role in 

phosphorylating tau in AD. 

The first cell culture model of tau hyperphosphorylation demonstrated the initial 

neurofibrillary‐like changes in SH‐SY5Y cells by discovering the involvement of phosphatases 

(Tanaka et al., 1995; Tanaka et al., 1998; Iqbal and Grundke‐Iqbal, 2006). This was achieved by 

culturing the cells in low serum conditions and subsequently inhibiting phosphatases by 

okadaic acid (Tanaka et al., 1995; Tanaka et al., 1998; Iqbal and Grundke‐Iqbal, 2006). There are 

10

a number of phosphatases (PP): PP1, PP2A, PP2B, PP2C, PP4, PP5, PP6, and PP7 that have been 

identified since these key experiments, but their roles under physiological conditions are not as 

clear as the kinase activity in regulating tau phosphorylation (Mansuy and Shenolikar, 2006; 

Ballatore et al., 2007). The PP2‐A and PP‐1 have been shown to regulate more than 90% of 

serine/threonine protein activity in mammalian cells, which suggest that these are the 

phosphatases to monitor in disease (Iqbal and Grundke‐Iqbal, 2006; Mansuy and Shenolikar, 

2006). Thus, an imbalance of kinase and phosphatase activity can impact NFT generation.  A 

diagram is provided to highlight the tau residues that are critical to NFT formation (Figure 1.2). 

Indirect mechanisms shown to alter the functions of kinases and phosphatases in regulating tau 

hyperphosphorylation will be discussed in the proceeding sections.  

11

 

Figure 1.2: Neurofibrillary tangle formation. This diagram illustrates the cellular homeostasis of regulating tau phosphorylation by kinases and phosphatases. Increased phosphorylation of tau at the residues shown increases the formation of neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease brains (Pei et al., 2003; Wang et al., 2007a). 

 

 

12

 

Neuroinflammation 

The excessive accumulation of Aβ peptides and plaques along with NFT formation can 

lead to neuroinflammation, which can cause neurodegeneration through its cytotoxic effects. 

Neuroinflammation is another leading hypothesis of AD pathogenesis as microglia dysfunction 

has been proposed to be a detrimental factor in the development of AD (Eikelenboom and van 

Gool, 2004; Streit, 2004; Streit et al., 2004). Microglia are the resident macrophages of the innate 

immune system in the CNS (Streit, 2004; Streit et al., 2004; Tahara et al., 2006). The microglia 

found surrounding Aβ plaques in AD brains suggests that Aβ is toxic and the numerous 

proinflammatory molecules released indicate an inflammatory process taking place leading to 

cell death (Bamberger and Landreth, 2001).  

Microglia can become activated by signals such as major histocompatibility complex 

(MHC) class I and II proteins, APP, interleukins (IL): IL‐1, IL‐2, IL‐3, IL‐6, mitogens M‐CSF and 

GM‐CSF, and TNF‐α that are released in response to cell injury or death (Kreutzberg, 1996). 

Proinflammatory cytokines released by microglia such as IL‐1 and IL‐6 can stimulate astrocytes 

to secrete more cytokines, as well to activate more microglia for cellular defense (Bamberger 

and Landreth, 2001, 2002). Ironically, cytokines have been shown to stimulate APP synthesis 

and tau production suggesting that microglia can close the loop in a feedback cycle that drives 

the AD pathological process (Hayes et al., 2002). Nonetheless, the presence of microglia and 

astrocytes neighboring Aβ plaques in AD brains suggests that these glial cells are scavenging 

13

the pathological markers (Bamberger and Landreth, 2001; Combs et al., 2001; Bamberger and 

Landreth, 2002; Hayes et al., 2002). 

There are three scavenger receptors expressed on microglia that can bind Aβ known as 

class A (types I, II, and III), class B (CD36 and SR‐BI), and mucin‐like receptors (Bamberger and 

Landreth, 2001; Bamberger et al., 2003). Additionally, toll‐like receptors (TLR) have been 

identified on microglia to function in the clearance of Aβ (Tahara et al., 2006). Through AD 

transgenic mouse studies of TLR4 mutations, Tahara and colleagues demonstrated that TLR4 

plays a significant role in the clearance of Aβ peptides (Tahara et al., 2006). They confirmed 

their findings using a LPS‐activated mouse microglia BV‐2 cell line showing that Aβ peptide 

exposure increased TLR2, TLR4 and TLR9 expression (Tahara et al., 2006).  

Astrocytes have also been shown to surround Aβ plagues and NFT based on be glial 

fibrillary acidic protein (GFAP)‐immunostaining (Wisniewski and Wegiel, 1991; Nagele et al., 

2004). Aβ uptake by astrocytes is supported by evidence of Aβ staining in astrocytes of AD 

brains (Wisniewski and Wegiel, 1991; Nagele et al., 2004). In the brain, apolipoprotein E (ApoE) 

is primarily produced and secreted by astrocytes that function to regulate the transport of 

cholesterol (Weisgraber, 1994; Weisgraber et al., 1994; Meda et al., 2001). ApoE can also bind Aβ 

to facilitate its degradation by glial cells in the nervous system (Meda et al., 2001; Nagele et al., 

2004). Notably, ApoE is compromised of three isoforms; E2, E3, and E4; E4 expression disrupts 

the functions of ApoE (Mahley, 1988). The ApoE4 polymorphism has been shown to be strongly 

associated with sporadic AD onset (Tanzi and Bertram, 2005). Thus, an ApoE4 allele may result 

in greater inflammation because ApoE cannot aid in clearing Aβ. 

14

Additionally, inflammation has been shown to lead to cell death by activating apoptotic 

mechanisms (Bamberger and Landreth, 2002). GSK‐3β activity has been shown to be important 

in inflammatory cell differentiation, inflammatory cell migration, and proinflammatory 

cytokine release (Woodgett and Ohashi, 2005; Jope et al., 2007; Rodionova et al., 2007; Hooper et 

al., 2008). These findings advocate for future investigations of GSK‐3β in inflammatory 

responses and pathways. The over activation of glial cells by AD pathological markers 

implicates neuroinflammation as a key contributor to exacerbating pathology, however, it 

would not appear as a causative agent for AD development. 

 

Mitochondria dysfunction 

As a cellular organelle, mitochondria are recognized as the ‘powerhouse’ of cells because 

of the abundant energy they produce in the form of adenosine triphosphate (ATP) (Mattson et 

al., 2008). Numerous mitochondrial proteins have been found to be altered in AD brains 

(Castellani et al., 2002; Sullivan and Brown, 2005). It is known that mitochondria exhibit more 

dysfunction through aging, but the specific contribution of mitochondria dysfunction to AD 

pathology is not as clear (Fukui and Moraes, 2008). 

The most compelling finding that mitochondrial dysfunction could cause the 

neurodegeneration found in AD is the role of mitochondrial permeability transition pores. The 

opening of these mitochondrial inner membrane channels results in the loss of the 

electrochemical gradient, caspase activation, and subsequent apoptosis (Wallace, 1999; 

Castellani et al., 2002). GSK‐3β, primarily regarded as a tau kinase, has been shown to regulate 

15

the activation of the mitochondrial permeability transition (Juhaszova et al., 2004; Murphy, 

2004) and apoptosis in numerous studies (Desagher and Martinou, 2000; Beurel and Jope, 2006).  

The intrinsic apoptosis pathway has been shown to be mediated by mitochondria 

dysfunction and GSK‐3β over activation leading to apoptosis (King and Jope, 2005). A study by 

King and Jope demonstrated that GSK‐3β is an intermediate between mitochondria dysfunction 

via altered bax oligomerization and apoptosis by caspase‐3 activation based on lithium 

inhibition of GSK‐3β (King and Jope, 2005). Additionally, GSK‐3β has been shown to 

phosphorylate bax and increase its translocation into mitochondria (Linseman et al., 2004). 

When bax oligomerizes at the mitochondrial membrane, a pore is formed that releases 

cytochrome c that leads to cytochrome c interacting with Apaf‐1 and pro‐caspase 9, generating a 

functional apoptosome that leads to the activation of downstream executioner caspases (Zou et 

al., 1999; Linseman et al., 2004). Kluck and colleagues demonstrated that bcl‐2, an inhibitor of 

apoptosis, regulates cytochrome c translocation and the release of cytochrome c impacts bcl‐2 

function without altering the mitochondrial membrane potential (Kluck et al., 1997). A 

deficiency in cytochrome c oxidation has consistently been found in AD brain tissue suggesting 

mitochondrial dysfunction (Kish et al., 1992; Mutisya et al., 1994; Castellani et al., 2002). 

Furthermore, a yeast two‐hybrid screen of a human brain cDNA library was used to 

search for GSK‐3β interacting proteins and pyruvate dehydrogenase (PDH) was identified 

(Hoshi et al., 1996). Since PDH is found in the mitochondria, an immunocytochemical study 

was done to confirm the presence of GSK‐3β in the mitochondria (Hoshi et al., 1996). GSK‐3β 

was shown to phosphorylate PDH implying that GSK‐3β can inactivate PDH. This was a 

16

significant finding because of the essential function of PDH converting pyruvate into acetyl 

CoA in the TCA cycle and acetylcholine synthesis in cholinergic neurons (Hoshi et al., 1996). 

Collectively, GSK‐3β activity appears to impact mitochondrial function through a variety of 

mechanisms and impacts other cellular mechanisms implicated in AD pathogenesis. 

 

Oxidative stress 

A leading hypothesis for the normal aging seen in humans has been attributed to the 

buildup of cellular oxidative stress over time resulting in ‘aging’ or getting older (Terman and 

Brunk, 2006). Oxidative stress occurs in a cellular environment when pro‐oxidants exceed 

antioxidants resulting in altered cellular metabolism. Oxidative stress can lead to the 

production of reactive oxygen species (ROS) in the mitochondria (Sullivan and Brown, 2005; 

Fukui and Moraes, 2008) leading to dysfunctional mitochondria mechanisms discussed in the 

preceding section. Protein oxidation, lipid peroxidation, and protein carbonyls serve as markers 

of cellular stress (Sullivan and Brown, 2005). The generation of hydroxyl radicals and 

superoxide can cause DNA damage through deletions and mutations leading to disrupted cell 

homeostasis (Sullivan and Brown, 2005). There are numerous antioxidants that the cell 

possesses to combat ROS including glutathione, glutathione peroxidase, glutathione 

transferases, heme oxygenase, and superoxide dismutases (Sullivan and Brown, 2005). 

Oxidative stress has been implicated as a type of cellular disruption that can lead to the 

onset of AD. Increased indices of oxidative stress have been found in MCI and AD brains 

(Markesbery et al., 2005; Lovell and Markesbery, 2007; Zhu et al., 2007). Protein oxidation and 

17

enhanced lipid peroxidation were seen upon immunohistological analysis of AD brains by 

Mattson and colleagues (Mattson et al., 1999). Additionally, numerous studies have shown 

oxidative stress to impact AD pathology (Sullivan and Brown, 2005; Fukui and Moraes, 2008). 

There is an idea that cellular oxidative stress precedes all the cellular mechanisms implicated in 

contributing to AD pathology (Maccioni et al., 2009).  

There is difficulty in determining whether oxidative stress is a causal agent in AD 

pathogenesis because cellular stress can impact virtually all cellular mechanisms discussed in 

the preceding sections. The capability of cellular mechanisms to respond to cell stress probably 

determines the impact of oxidative stress causing AD pathology. In the next section of this 

chapter, I will evaluate the contribution of mismanaged cellular iron levels and iron‐mediated 

oxidative stress that can impact numerous AD pathogenic mechanisms. The ability of iron to 

directly impact numerous proteins implicated in AD and the contribution of iron‐mediated 

oxidative stress may serve as an additional mechanism to impact the etiology of AD. 

 

Iron dyshomeostasis and AD 

In AD, there are changes in the cellular environment and modifications in specific 

proteins that can influence the pathological characteristics of the disease. Many of these proteins 

have been discussed in previous sections of this chapter and the next section of this chapter will 

highlight the importance of brain iron homeostasis in the context of AD pathology. It is 

important to emphasize that brain iron levels have been shown to increase with aging (Hallgren 

and Sourander, 1958; Connor and Menzies, 1995), which has been verified with magnetic 

18

resonance imaging studies (Bartzokis et al., 1997; Bartzokis et al., 2004). Elevated levels of iron 

have been observed throughout the cerebral cortex and hippocampus of the AD brain (Connor 

et al., 1992a; Connor et al., 1992b; Loeffler et al., 1995; Mattson et al., 1999; Sayre et al., 2000; 

Quintana et al., 2006). 

 

Iron and Amyloid 

  The discovery of a functional iron responsive element (IRE) in the 5’untranslated region 

of APP mRNA supported the notion of APP being a metalloprotein tightly regulated by 

intracellular iron levels affecting its synthesis (Rogers et al., 2002). Thus, it would be logical that 

increasing iron levels throughout human aging could lead to an increase in APP substrate for 

further generation of Aβ. Moreover, iron levels have been shown to regulate APP processing 

through its effects on α‐secretase activity at the cell surface (Bodovitz et al., 1995). It is important 

to note that increased iron levels lead to increased production of soluble APPα, but an 

accelerated production of this neuroprotective peptide can lead to it being rapidly broken down 

by the cell contributing to oxidative stress (Bodovitz et al., 1995). The complexity of such a 

system regulating APP processing relative to cellular iron status is very valuable in pursuing 

the underlying influence of iron dyshomeostasis throughout aging. 

Numerous metal binding sites have been identified on APP and Aβ, implying that 

biometals can directly influence amyloid homeostasis (Multhaup, 1997; Barnham et al., 2003; 

Barnham and Bush, 2008). Aβ has been shown to be aggregated with numerous biometals, 

including iron (Bush, 2003), suggesting that increased accumulation of iron could lead to 

19

elevated Aβ aggregation driving AD amyloid pathology via senile Aβ plaque formation. 

Potentially, this could place biometal homeostasis at the center of the ‘Amyloid Cascade’. In 

contrary to this hypothesis, there are theories regarding APP and Aβ as protective proteins, 

which attempt to rescue cells from metal‐induced oxidative stress and toxicity in AD cases 

through sequestering biometals (Lee et al., 2005; Castellani et al., 2006). The work of our 

laboratory and others revealing iron deposits in senile Aβ plaques and NFTs throughout the 

brain implicates a connection among iron dyshomeostasis and AD hallmark characteristics 

(Connor et al., 1992a; Connor et al., 1992b; Loeffler et al., 1995; Sayre et al., 2000; Quintana et al., 

2006). The continued investigation of cellular mechanisms impacted by iron and its relationship 

with AD pathological markers is warranted. 

 

Iron and Neurofibrillary tangles 

Numerous histological studies have shown the accumulation of iron and other biometals 

in NFT in AD brains (Good et al., 1992; Smith et al., 1997; Mattson et al., 1999; Shin et al., 2003). 

This provides strong circumstantial evidence that iron may be involved in generating NFT 

pathology similar to Aβ plaque deposition discussed earlier. A study by Yamamoto and 

colleagues demonstrated that iron could induce the aggregation of hyperphosphorylated tau in 

post‐mortem AD brains (Yamamoto et al., 2002). In hippocampal cell cultures, iron was shown 

to result in a significant decrease in p25, the activator of Cdk‐5, leading to a reduction in tau 

phosphorylation suggesting iron could limit NFT formation (Egana et al., 2003). The majority of 

these findings demonstrate that cellular iron is associated with NFT; however, the literature 

20

lacks mechanistic evidence of iron impacting tau phosphorylation beyond the study by Egana 

and colleagues. 

 

Iron and Oxidative Stress, Mitochondria Dysfunction, and Inflammation 

It is known that brain iron levels become elevated during the aging process and ferritin, 

an iron storage protein, increases to aid in managing intracellular iron levels (Hallgren and 

Sourander, 1958; Connor and Menzies, 1995; Thompson et al., 2001). However, this 

compensation is not sufficient in AD resulting in an altered iron to ferritin ratio whereby ferritin 

levels do not increase in parallel with increasing iron levels (Hallgren and Sourander, 1958; 

Connor et al., 1992a; Connor and Menzies, 1995). Thus, such iron mismanagement may cause or 

exacerbate AD via oxidative stress. There are numerous factors that allow iron to play a role in 

initiating oxidative stress. Any altered activity in the expression or function of iron management 

proteins can lead to iron dyshomeostasis whereby oxidative stress mechanisms can emerge to 

disrupt biological systems. Iron levels can accumulate throughout the brain potentially 

accelerating the aging process as a result of improper iron regulation.  The redox‐active state of 

iron in a cell can influence oxidative stress as seen in chemical reactions. The Fenton reaction 

generates hydroxyl radicals (OH∙) through altered iron regulation leading to the oxidation of 

proteins, lipids, and DNA (Thompson et al., 2001). Free radical accumulation via the Fenton 

reaction leads to inflammation, which causes cellular stress.  

  Fenton reaction:  Fe2+ + H2O2 → OH• + OH‐   

21

  It is thought that the breakdown of various biological mechanisms is due to oxidative 

stress, which may serve as the catalyst for neurodegeneration. Therefore, iron dyshomeostasis 

implicated to be causative of most oxidative stress may accelerate the aging process leading to 

the loss of neuronal cells and compromising many cellular functions resulting in complex 

disease pathologies. Energy disruption in the form of ATP production and oxygen transport can 

become altered through mitochondrial dysfunction where iron plays an important role as well. 

The human brain consumes approximately 25% of the total oxygen and mitochondria 

are major oxygen consumers (Thompson et al., 2001; Mattson et al., 2008), which makes the 

mitochondria critical organelles throughout the nervous system. It is important to note that iron 

is required for oxygen delivery and if this process is disrupted, this may lead to altered 

mitochondrial function (Thompson et al., 2001). Mitochondria also serve as the substrate for 

iron to incorporate into heme to deliver oxygen (Thompson et al., 2001). With mitochondria 

serving as the primary site of oxygen consumption for oxidative phosphorylation, oxidative 

stress can directly lead to the production of ROS including hydroxyl radicals and nitric oxide 

formation within cells (Thompson et al., 2001). ROS have been shown to disrupt numerous 

cellular functions and accelerate cellular senescence; probably accelerating the 

neurodegenerative process.    

Additionally, iron is required in the mitochondria to form iron‐sulfur (Fe‐S) clusters, 

which are integrated into proteins involved with many cellular functions (Rouault and Tong, 

2005). A key function of Fe‐S clusters is regulating gene expression and transcription, which 

have been shown to be critical components within generating the basis of neurodegenerative 

22

diseases (Rouault and Tong, 2005). The necessity of iron regulation in the mitochondria to 

protect against oxidative stress while allowing iron utilization in Fe‐S clusters and heme 

synthesis emphasizes the challenge and importance of mitochondrial iron homeostasis. It is 

possible that mitochondrial dysfunction may serve as a common pathway involved in 

neurodegeneration as this is the site where the majority of energy is produced along with ROS 

generation. Thus, mitochondrial iron regulation is critical to cellular function and may itself 

present a rational therapeutic target for ensuring normal cellular function.  

 

Iron regulation 

Since I have discussed how iron can impact the cellular pathways implicated in AD 

pathogenesis, it is important to understand how iron is regulated. Iron exists as two‐redox 

active forms: ferrous (Fe2+) and ferric (Fe3+), which contribute to make iron the most common 

biological transition metal in mammalian species (Andrews, 1999a; Andrews et al., 1999; 

Thompson et al., 2001). Importantly, iron serves as a cofactor for many biological functions 

including DNA synthesis via the ribonucleotide reductase enzyme, ATP production through 

interacting with succinate dehydrogenase and aconitase of the TCA cycle, myelin production 

via lipid and cholesterol biosynthesis in oligodendrocytes, monoamine neurotransmitter 

synthesis, and most importantly in the hemoglobin delivery of oxygen (O2) throughout the 

body. The brain is responsible for 25% O2 consumption (Pinero et al., 2000; Thompson et al., 

2001). Disruption of these mechanisms due to improper regulation of iron can lead to altered 

gene expression, energy disruption, compromised electrical and chemical neurotransmission, 

23

and interrupted oxygen transport. To ensure proper function of these mechanisms, iron is 

essential and its levels must be properly managed or regulated. 

Iron is typically obtained through one’s diet, where absorption occurs to meet internal 

requirements for numerous biological processes within the gastrointestinal (GI) tract.  The gut 

lumen possesses duodenal crypt cells that monitor an individual’s body iron requirements and 

absorb iron as needed (Andrews, 1999a; Andrews et al., 1999).  Iron is absorbed via enterocytes, 

which deliver iron directly into the blood stream bound to an iron transport protein or store it 

in an intracellular iron storage protein (Andrews, 1999a; Andrews et al., 1999). Cellular iron 

levels are tightly regulated by iron regulatory protein (IRP) activity where IRPs interact with an 

iron responsive element (IRE) in the messenger RNA (mRNA) sequences of cellular iron 

management proteins like transferrin (Tf), transferrin receptor (TfR), ferritin, and divalent metal 

transporter 1 (DMT1) (Andrews, 1999b; Andrews et al., 1999; Thompson et al., 2001).  

There are two IRP proteins known as IRP1 and IRP2, respectively. They bind to IREs, 

which are mRNA stem loops that post‐transcriptionally regulate cellular iron homeostasis 

(Pinero et al., 2000; Thompson et al., 2001; Rouault and Tong, 2005). Transferrin and ferritin are 

the iron transport and storage proteins, respectively.  Transferrin binds two molecules of iron 

through its two binding domains forming a complex that binds the transferrin receptor. 

Endocytosis of this complex occurs via clathrin‐coated vesicles and an acidic pH is achieved 

within the endosome to release iron through the divalent metal transporter 1 to ferritin or the 

mitochondria (Zecca et al., 2004). There is also another protein complex of HFE and β2 

microglobulin that can bind the transferrin complex to regulate iron uptake as well (Feder et al., 

24

1998).  A schematic of how HFE influences iron uptake is provided in Figure 1.3. Ferroportin is 

a transmembrane exporting protein that transports ferrous iron to ferritin (Dunn et al., 2007). 

Ceruloplasmin is another iron regulatory protein that has been shown to load iron into ferritin 

as well (Thompson et al., 2001). Ferritin is a 24‐mer subunit protein capable of storing 4500 iron 

atoms, which has two types of subunits: (H) and (L) chains; H‐chain oxidizes ferrous (Fe2+) iron 

to ferric (Fe3+) iron and the L‐chain contains an iron nucleation site (Lawson et al., 1989; Arosio 

and Levi, 2002). There is also a labile iron pool (LIP) that exists in the cell cytosol that contains 

free or redox active iron that is readily‐available to be used by the cell for required cellular 

mechanisms or cell damaging effects (i.e. Fenton reaction) (Petrat et al., 2000; Kruszewski and 

Iwanenko, 2003). Appropriate iron regulation and management are necessary to maintain 

normal cellular functions throughout various organ systems in the human body. If iron 

homeostasis is not achieved, biological systems are susceptible to oxidative stress potentially 

compromising function.   

25

Figure 1.3: Iron uptake and HFE function. This diagram illustrates the role of HFE variant 

proteins regulating cellular iron uptake at the membrane. Wild type HFE limits the amount of 

iron whereas H63D and C282Y HFE do not limit iron uptake. This figure was modified and 

adapted from (Connor and Lee, 2006). 

 

  

26

 

HFE 

  Since iron management protein expression is critical to cellular homeostasis, examining 

the impact of alterations in such proteins is important, especially in the context of 

neurodegenerative disease risk. A key iron regulatory protein was discovered in an iron 

overloading disorder known as hereditary hemochromatosis (HH) and known as HFE (name 

used to recognize the gene and protein). The HFE gene was mapped to chromosome 6 by Simon 

and colleagues in 1975 (Feder et al., 1996). The HFE gene is the most common genetic variation 

(1:200) among individuals of European Caucasian descent, which occupies a locus at 

chromosome 6p21.3 (Merryweather‐Clarke et al., 2000; Adams et al., 2005).  

The most prevalent HFE polymorphisms throughout the world are H63D, C282Y, and 

S65C variants (Merryweather‐Clarke et al., 2000; Le Gac et al., 2001). The H63D variant is 

caused by a substitution of histidine residue at the 63rd position to aspartic acid resulting in a 

minor structural change to HFE (Feder et al., 1996; Dupradeau et al., 2000). The C282Y variant 

was discovered due to its primary association with the pathological condition HH, where HH 

patients are homozygous for C282Y (Hanson et al., 2001). HH results in increased iron levels 

throughout the human body because of excessive absorption of dietary iron leading to the toxic 

release of iron (Andrews, 1999a; Levy et al., 1999). C282Y results in an amino acid change at the 

282nd position where a cysteine residue replaces the tyrosine residue (Feder et al., 1996). This 

results in a significant change in HFE protein structure as the mutation prevents the formation 

of disulphide bridges and impacts HFE cellular function (Feder et al., 1996). The S65C missense 

27

mutation leads to a serine to cysteine substitution at the 65th amino acid based on the 193 A>T 

change and has a population frequency ranging from 1.6 to 5.5% in Caucasians (Camaschella et 

al., 2002). S65C polymorphisms have not been found to cause physiological changes as this 

mutation has no evidence of affecting HFE protein structure (Le Gac et al., 2001).   

HFE encodes for an iron management protein of the same name that is recognized as a 

non‐classical major histocompatibility complex (MHC) class 1‐like molecule because it is not 

involved in antigen presentation like other MHC class 1 proteins (Ehrlich and Lemonnier, 2000). 

Protein crystallography studies of HFE revealed homology to MHC class 1 proteins; they share 

37% homology in their ectodomains (Lebron et al., 1998). HFE is a 49 kDa protein that consists 

of an α1‐α2 superdomain that forms a platform consisting of an eight‐strand anti‐parallel β 

sheet positioned on top of an Ig‐like domain α3 and beta‐2‐microglobulin (β2m) (Lebron et al., 

1998). The narrow MHC class I peptide groove of HFE prevents its function in antigen 

presentation (Feder et al., 1997). However, a study by Rohrlich and colleagues showed direct 

recognition of human HFE by αβ cytolytic T cells without antigen‐presenting function 

suggesting HFE may still function in specific immune responses (Rohrlich et al., 2005). 

Furthermore, a study by Roy and colleagues suggested that HFE is involved in the immune 

response by treating HFE ‐/‐ mice with lipopolysaccharides (LPS) to generate an inflammatory 

response that led to hyposideremia, low serum iron levels, due to insufficient hepcidin 

expression (Roy et al., 2004).  

The most‐recognizable reported function of HFE protein is its role in regulating cellular 

iron uptake. The interactions between HFE and transferrin receptor (TfR) are thought to differ 

28

based on mutations in the HFE protein (Lebron and Bjorkman, 1999; Lebron et al., 1999; 

Ramalingam et al., 2000). Wild‐type HFE is thought to restrict TfR binding so that only one 

mole of Tf can bind. The H63D allele HFE protein migrates to the membrane to form a complex 

with TfR, but does not restrict Tf binding resulting in greater iron uptake because it does not 

decrease the affinity for diferric transferrin (Feder et al., 1997; Waheed et al., 2002). The C282Y 

HFE protein does not reach the membrane due to incorrect folding of the HFE α3 domain 

preventing β2m binding, and hence, does not form a complex with TfR resulting in increased 

cellular iron uptake (Feder et al., 1997; Waheed et al., 1999; Ramalingam et al., 2000; Waheed et 

al., 2002). This was further confirmed based on data showing that the C282Y HFE protein is 

retained in the trans‐Golgi complex and endoplasmic reticulum (Feder et al., 1997; Waheed et 

al., 1999; Ramalingam et al., 2000; Waheed et al., 2002). Ultimately, it appears that the known 

HFE mutations lead to increased cellular iron levels. 

In the brain, HFE expression is present in the choroid plexus, blood vessels, and 

ependymal cells (Connor et al., 2001), which line the ventricles of the brain. This would further 

implicate HFE in regulating iron uptake based on concurrent expression of TfR within the 

vascular endothelium of the brain. The HFE protein is expressed in neurons surrounding Aβ 

plaques and NFTs in AD brains (Connor et al., 2001; Connor and Lee, 2006). Since HFE 

expression was minimal in control tissue compared to AD brains, the idea that HFE may be 

induced was proposed (Connor et al., 2001). Evidence of HFE induction was further seen in a 

BV‐2 microglia cell line when exposed to toxic agents (Lee and Connor, 2005). There is evidence 

of HFE function in innate immunity (Ehrlich and Lemonnier, 2000; Salter‐Cid et al., 2000; de 

29

Almeida et al., 2005; Porto and De Sousa, 2007), which suggests that it has diverse functions and 

may play a significant role in regulating cellular iron and cellular stress. Genome‐wide studies 

have identified a genetic locus on chromosome 6 as a risk factor for sporadic AD and HFE is a 

candidate gene (Tanzi and Bertram, 2005).   

 

HFE Polymorphisms and AD 

HFE variants have been examined in association with neurological diseases including 

Alzheimer disease (AD) (Connor and Lee, 2006), amyotrophic lateral sclerosis (ALS) (Wang et 

al., 2004; Yen et al., 2004; Goodall et al., 2005; Restagno et al., 2007; Sutedja et al., 2007), 

Parkinsons disease (PD) (Borie et al., 2002; Dekker et al., 2003; Guerreiro et al., 2006), multiple 

sclerosis (MS) (Rubio et al., 2004; Ristic et al., 2005; Ramagopalan et al., 2008), and stroke 

(Ellervik et al., 2007). The presence of the HFE polymorphisms, H63D and C282Y, has been 

evaluated in studies to determine their effects on disease risk. All studies investigating AD and 

HFE polymorphism associations examined the frequency of HFE polymorphisms between AD 

patients and healthy participants, and/or neurological disease controls (neurological pathology, 

but not AD). Additionally, some of the studies examined the impact of HFE polymorphisms on 

AD age at onset, effects of gender, and additional gene variants that may influence AD risk as 

well. It is important to note the diverse populations of patients these studies cover 

geographically, which should be considered in the context of gene‐environment interactions. 

There are thirteen genetic association studies that were conducted over eight years 

investigating the role of HFE polymorphisms and AD risk. I will examine each study 

30

individually and summarize the significant findings in chronological order of publication. A 

meta‐analysis of HFE polymorphisms and AD risk can be found at (http://www.alzgene.org). In 

summary, the majority of epidemiological studies did not find an overall association of HFE 

polymorphisms with AD development. This is not alarming because my interest is centered on 

how an HFE polymorphism such as H63D may modify AD onset and progression. Eight studies 

showed a positive association between age at AD onset and HFE polymorphisms with or 

without ApoE4 polymorphisms, three studies did not evaluate age at onset, and the two studies 

that did not show an effect were not clear on their methodology for not finding an effect. These 

findings are encouraging because it shows that HFE polymorphisms can impact AD onset and 

warrant further investigation. Thus, it is logical to pursue the potential functional consequences 

of expressing HFE polymorphisms such as H63D on cellular mechanisms implicated in AD 

pathogenesis to discover possible causes for increased age of AD onset with HFE 

polymorphisms.  

In the year 2000, Moalem and colleagues published the first study investigating the 

possible association of HFE polymorphisms with AD (Moalem et al., 2000). This study 

examined familial AD cases, adult Down syndrome (DS) patients, and younger and healthy 

adult controls. All samples were Caucasians from Toronto, Canada, except samples from DS 

cases, which were obtained from New York. The study also considered the risk of the ApoE 

gene variant and gender determinants on AD risk. H63D had a frequency of 0.38 in male AD 

cases compared to 0.15 in younger controls and 0.21 in older controls. There was a 0.14 

frequency of H63D in female AD patients and a much higher frequencies in female controls of 

31

0.50 and 0.27 in the younger and older controls, respectively. ApoE4 frequency was 0.83 in AD 

males and 0.79 in AD females compared to control frequencies of approximately 0.30, which is 

consistent with ApoE4 being associated with AD. 41.7% of AD cases were HFE polymorphism‐

positive (H63D and/or C282Y) and ApoE4‐postive compared to 16.6% of cases of HFE 

polymorphism‐positive and ApoE4‐negative. The authors conclude that HFE polymorphisms 

are associated with AD in males, but are somewhat protective in females. They also note the 

over‐representation of male AD cases that are H63D‐postive and ApoE4‐positive suggesting 

this combination to increase AD risk. 

Sampierto and colleagues published the first study to examine the role of HFE 

polymorphisms on the age at onset of AD and the frequency of HFE variants in AD cases 

(Sampietro et al., 2001). An Italian population of subjects was investigated in this study 

consisting of sporadic AD cases and age‐matched healthy controls. The frequency of H63D in 

AD cases was 0.11 and 0.14 in controls showing that there was not an association with this HFE 

polymorphism and AD. ApoE4 expression was also determined and found to have a frequency 

of 0.24 in AD versus an allelic frequency of 0.09 in control patients. The authors’ state there is no 

effect of sex on the distribution of HFE and ApoE polymorphisms in the patients (data not 

shown). All patient groups were stratified according to 60‐69 years age at onset, 70‐79, and 

greater than 80. The frequency of the H63D allele was 0.22 in the 60‐69 AD group (n = 23), which 

was almost double the 0.12 frequency of H63D in the 70‐79 AD group (n = 47), and five times 

more than the 0.04 frequency of the greater than 80 years of age AD group (n=37). The authors 

note that they could not determine an increased AD risk with ApoE4 and H63D, but noted that 

32

the oldest mean age at onset of 77.3 years was observed in a subset of 51 patients that were 

wild‐type HFE positive and ApoE4 negative providing indirect evidence that a synergistic effect 

may still exist. In summary, the H63D polymorphism increased the age at onset by five years in 

AD cases. 

Another study investigated HFE polymorphisms and AD risk along with the frequency 

of the C2 transferrin allele in a Spanish population (Lleo et al., 2002). The frequency of the H63D 

allele was 0.26 in AD patients and 0.20 in healthy controls, C2 allele frequency was 0.17 and 0.18 

in controls, and C282Y frequency was 0.02 in both groups. Thus, there was not an association 

between HFE polymorphisms and AD risk. The authors noted that there was an increase in 

H63D in male AD patients (53.6%) versus 33.3% in control patients (data not shown). They also 

commented that ApoE frequency or age at onset did not yield any significant difference (data 

not shown). I agree with the authors that HFE polymorphisms are not associated with AD in 

their patient population, but they do not explicitly state that HFE polymorphisms do not 

influence age at onset, nor do they provide their methodology for such a conclusion.   

A study by Combarros and colleagues investigated the role of HFE polymorphisms in 

AD risk, age at onset, and gender contributions (Combarros et al., 2003). The AD patients and 

healthy controls were from a geographical region in northern Spain similar to the Lleo et al. 

study discussed above. The frequency of the H63D allele was 0.27 in all patients indicating that 

this HFE polymorphism is not associated with AD. However, the authors evaluated the impact 

of H63D polymorphisms on age at onset. The age groups were stratified accordingly to the 

Sampierto et al. study and they did not find the expression of the H63D allele alone was not 

33

able to impact age at onset. They also mentioned that there was no difference in the distribution 

of H63D in males and females (data not shown). Importantly, they evaluated ApoE4 status and 

found that H63D and ApoE4 positive patients increased the age at onset by at least four years. I 

conclude that there may be a synergistic effect of H63D and ApoE4 increasing AD age at onset 

despite the lack of association of HFE polymorphisms and AD risk. 

The first North American study investigating HFE polymorphisms and AD association 

was led by Pulliam and colleagues (Pulliam et al., 2003).  AD, mild cognitive impairment (MCI), 

and neurological high pathology and low pathology control patients from Kentucky were 

evaluated. This study is challenging to evaluate because the data are presented as HFE 

mutations (could be H63D, C282Y, or S65C variants), which does not allow a detailed analysis 

of HFE variants for an association with AD. The authors state the frequency of HFE 

polymorphisms in the entire study population (not group‐specific) to be 0.183 for H63D, 0.073 

for C282Y, 0.034 for S65C, and 0.710 for the wild type HFE variant, which fit the expected 

Hardy‐Weinberg frequency. They found an increased proportion of homozygous or compound 

heterozygous HFE polymorphisms in the AD group compared to the low pathology controls 

suggesting an increased association of HFE variants with AD. The group also evaluated ApoE4 

and the found the presence of ApoE4 and an HFE mutant to significantly increase the risk of 

cognitive impairment based on mental status test battery and neurological examination. Since 

HFE polymorphisms are associated with increased oxidative stress, this group measured CSF 

F2‐Isoprostance levels to measure brain lipid peroxidation as indices of oxidative stress in the 

AD group as a mechanism contributing to the HFE polymorphism association with AD. CSF F2‐

34

Isoprostance levels were approximately 75 pg/ml in patients with HFE mutations and 50 pg/ml 

in wild type HFE carrying individuals confirming the increased cellular stress associated with 

the HFE mutants. The authors conclude that HFE mutations were significantly increased with 

AD and cognitively impaired subjects. This study showed an association of HFE 

polymorphisms with AD; however, the specific contributions of the HFE variants were not 

reported. Also, there was not an evaluation of age at onset provided either.  

An Italian group evaluated the association between AD and HFE polymorphisms to 

confirm and extend the findings of the studies presented above. The H63D, C282Y, S65C HFE 

variants and the ApoE4 polymorphism were evaluated in AD patients and healthy controls 

from Northern Italy (Candore et al., 2003). In the AD patient population, C282Y had an allelic 

frequency of 0.2%, H63D‐13.8%, and S65C‐1.6% compared to similar values for the control 

population: C282Y‐0.3%, H63D‐11.2%, and S65C‐2.0% implying there is not an association 

between HFE polymorphisms and AD risk. The group also notes that gender was not a factor 

during analyses either. Upon evaluating age at AD onset, no significant differences were found 

based on HFE polymorphisms or gender. I would argue that it would be difficult to confirm this 

finding when the data were not stratified into age ranges like the Sampierto et al. (2000) and 

Combarros et al. (2003) studies to be evaluated. To further support my viewpoint, the 

variability of age range was quite different in AD patients with wild type HFE (67.93 ± 2.54) 

compared to H63D HFE (67.79 ± 9.14), which argues for the age at onset stratification by decade 

(i.e. 60‐69 years, 70‐79 years, and 80 years and above). Also, Candore and colleagues state 

35

ApoE4 status did not impact AD risk in combination with H63D, but no ApoE data is provided 

to assess a potential impact on the age at AD onset. 

HFE polymorphisms were evaluated as genetic modifiers in AD, MCI, and elderly 

healthy controls from Montreal, Canada in a study by Berlin and colleagues (Berlin et al., 2004). 

ApoE and HFE variants H63D and C282Y frequency was determined. H63D was found in 33% 

AD patients, 26% in MCI, and 34% in normal elderly controls showing no association between 

H63D variants and AD. The C282Y HFE variant did not shown an association either as it was 

found in 5% of AD patients, 6% MCI, and 10% in the control patients. ApoE4 allele frequency 

was 54% in AD, 31% in MCI, and 21% in normal controls. There were no gender effects. 

Additionally, this group displayed an excellent effort in investigating the effect of HFE 

polymorphisms on age at AD onset. They presented a Kaplan‐Meier survival curve showing the 

effect of H63D on age at AD onset based on symptoms first reported by relatives. An overall 

statistically significant difference was not shown based on median age, but if one observes the 

age ranges from 55 to 70 years there is an increase in AD age at onset in H63D homozygotes 

based on the shift of the survival curve. Furthermore, the authors describe the impact of H63D 

HFE on the onset of AD and MCI subjects combined that revealed an over‐representation of 

H63D in presentation of cognitive impairment in patients ranging from 55 to 75 years similar to 

the age at onset effect I observed. The authors state that there were no associations between 

ApoE4 and the HFE polymorphisms (data not shown). It would be of value if the HFE/ApoE4 

patient data were accessible to assess the impact of age at AD onset, not just the AD association 

analysis or age at AD onset independently, especially given my viewpoint on the age at onset 

36

data in their study with the H63D homozygotes. Nonetheless, the authors conclude that HFE 

polymorphisms do not increase AD risk, but suggest that the trends of accelerated cognitive 

decline in H63D homozygotes they observed should be investigated further.  

Robson and colleagues investigated the transferrin C2 allele, HFE polymorphisms, and 

ApoE4 variant expression on the development of AD (Robson et al., 2004). AD, MCI, and 

control patients were Caucasians from the Oxford region previously evaluated as a cohort of the 

Oxford Project to Investigate Memory and Ageing (OPTIMA) study (Petersen et al., 1999). The 

transferrin C2 allele was found in 42.4% AD, 28.9% MCI, and 33.5% control patients. C282Y 

variants were expressed in 15.7% AD, 24.6% MCI, and 11.9% control patients. The H63D variant 

was found in 27.8% of AD cases, 24.6% MCI, and 27.9% in control patients. Thus, none of the 

HFE polymorphisms or the C2 allele was associated with AD risk. The Robson group 

performed logistic regression and synergy factor analysis to examine the interactions of gene 

variants in AD risk. They discovered an association of AD with both the expression of the C2 

allele and C282Y variant suggesting a five times greater risk of developing AD. The authors 

comment that either the C282Y or C2 variant affects age of AD onset based on the overall mean 

age (data not shown). Again, I would emphasize that their conclusion cannot be confirmed 

based on their methodology of comparing the mean age and not evaluating independent age 

ranges. ApoE4 allele frequency data was not shown, but the authors state ApoE4 only increased 

risk of C282Y/C2 bi‐carriers making them tri‐carriers increasing overall AD risk. They also state 

that HFE polymorphism bi‐carriers of H63D and C282Y along with C2 allele expression 

increases AD risk. The only issue I have with these conclusions is the frequency of these tri‐

37

carriers throughout the population and how relevant it could be. I conclude that there is not an 

association of HFE polymorphisms and AD in this Northern European population, but the age 

at onset effects cannot be fully evaluated with the data provided. 

HFE polymorphisms and AD risk were investigated in a Portuguese population by 

Guerreiro and colleagues (Guerreiro et al., 2006). They also examined the potential association 

of HFE polymorphisms and Parkinson’s disease, which will not be discussed as the focus of this 

discussion is with AD risk. The HFE polymorphisms, H63D and C282Y, were evaluated in AD, 

MCI, and healthy controls. The H63D allele was found in 34.6% of AD, 38.9% MCI, and 35.6% 

control patients supporting the notion that H63D is not associated with AD risk. C282Y was 

present in 4.6% AD cases, 5.5% MCI, and 4.3% in controls suggesting no effect on AD 

development. This group also investigated the impact of HFE polymorphisms on age at AD 

onset using Kaplan‐Meier survival curves. They failed to find a statistically significant overall 

association between HFE polymorphisms and age at onset. I would like to point out the 

trending increase of age at AD onset in H63D homozygotes at approximately 70 years of age 

and younger similar to the previous findings of Moalem et al. (2000), Berlin et al. (2004), and 

Combarrros et al. (2003). They authors also commented that stratifying the effects of HFE 

polymorphisms with ApoE4 variants did not reveal any significant differences in AD 

frequency, but they did not comment on a possible synergistic effect of an HFE polymorphism 

and ApoE4 on age at AD onset. 

A population‐based cohort study of almost 8,000 persons aged 55 years or older known 

as the Rotterdam Study in the Netherlands was used to select a random group of patients to 

38

evaluate AD risk with HFE polymorphisms and the ApoE4 allele (Alizadeh et al., 2009). The 

data are reported as HFE carriers, which could consist of heterozygosity or homozygosity for 

either the H63D or C282Y variant. Hence, there were 20.8% of AD men with a HFE 

polymorphism versus 28.8% of control men and 15.8% of AD women with a HFE 

polymorphism compared to 26.5% of control women. Based on these data, HFE polymorphisms 

are not associated with AD risk. Interestingly, the group evaluated the bi‐carrier effects of 

having an HFE polymorphism with an ApoE4 polymorphism and assessed AD association. 

There were 18.1% of AD men that were bi‐carriers for HFE and ApoE4 variants compared to 

10.7% of control men leading to a trending, but not a statistically significant increased risk for 

AD. 16.9% AD women expressed an HFE polymorphism and ApoE4 with respect to 11.2 % in 

the women control patients, which was not statistically significant regarding an association with 

AD development. Alizadeh and colleagues commented that the age at AD onset was earlier in 

H63D homozygotes compared to wild‐type HFE carriers, which is consistent with previous 

studies and my perspective on the trending data in earlier studies. Furthermore, they stated that 

AD men who were bi‐carriers for H63D and ApoE4 (73.2 ± 2.1) displayed an average of 5.5 

years earlier at AD age onset with respect to AD non‐carriers (78.7 ± 1.6). The authors conclude 

by stating that HFE polymorphisms are not strong determinants of AD, but the H63D variant 

may accelerate the age of AD onset. 

Blazquez and colleagues evaluated HFE polymorphisms, transferrin C2 allele, and 

ApoE4 variants with AD susceptibility in an area known as Basque Country in Spain (Blazquez 

et al., 2007). The H63D polymorphism was present in 18% of AD patients and 29.9% of control 

39

patients, which prompted the authors to suggest that the H63D variant may serve a protective 

role in preventing AD. Since, no other group has shown or suggested such an idea; the authors 

suggest that genetic linkage disequilibrium may be responsible for such an effect. I believe these 

data are informative from the standpoint of geographic region and possible environment agents 

that may be different from other regions. The C282Y variant was found in 4.5% of AD patients 

and 3.3% of control patients, which is consistent with many of the other studies. The C2 allele 

was present in 14.5% of AD patients and 15.0% of control subjects. ApoE4 polymorphisms were 

increased in AD patients (27.2%) with respect to control patients (10.5%). The authors suggest 

that an increase of age at AD onset was not affected by the H63D variant as shown by others, 

which would be consistent with their H63D and AD association data. Gender was not 

considered in their analysis of data either which could provide additional information as well 

given the data they obtained that was inconsistent with all other studies of HFE polymorphisms 

and AD. Nonetheless, this study does not support an association of HFE polymorphisms and 

AD risk nor an effect on age at AD onset. 

An investigation by Avila‐Gomez and colleagues assessed the association of HFE 

polymorphisms with early‐onset familial AD cases (Avila‐Gomez et al., 2008). The familial AD 

patients in this study had a mutation in the preseninlin‐1 gene known as E280A were evaluated 

in comparison to non‐demented controls that were not relatives of the AD patients. H63D allele 

frequency was 18.1% in AD patients and 16.14% in control subjects, which is very similar 

indicating that there is not association with AD. The allelic frequency of the C282Y variant was 

non‐existent in AD patients (0%) and 0.23% in the control patients. The authors evaluated the 

40

age at onset by comparing the median age of AD patients stratified by H63D presence and did 

not find an effect. The age range of the familial AD patients was 33‐55 years, so I would 

recommend evaluating an HFE effect by examining the patients in five year subgroups (i.e. 35 

years and younger, 36‐40 yrs, etc.) to better evaluate a possible effect. Nevertheless, the authors 

noted that the AD patient population in Colombia from the Antioquia region studied within 

this investigation is rather large given that the community is a genetic isolate population 

(Arcos‐Burgos and Muenke, 2002). This notion introduces the idea that the environmental 

changes that could impact HFE polymorphisms in AD risk may be absent in such an isolated 

environment.  

It is also noteworthy to mention a study by Percy and colleagues examining the role of 

ApoE4 and H63D variants in sporadic AD cases with folate‐supplementation in Ontario, 

Canada (Percy et al., 2008). Folic acid fortification has been mandatory since 1998 and the 

authors investigated HFE polymorphism effects on blood markers of iron, red cell folates, and 

serum B12 levels. They found the H63D variant to be associated with lowering red cell folate 

concentration, which they note that this is probably due to the increased oxidative stress 

associated with the H63D allele. The group also examined the synergistic effect of ApoE4 and 

H63D polymorphisms on AD risk and found gender differences. In females, they found that 

ApoE4 predisposition to AD was increased in combination with the H63D allele. In males, they 

found the predisposition to AD with ApoE4 expression to be lowered with expression of the 

H63D allele. In contrast, Moalem et al. (2000) found that bi‐carriers of H63D and ApoE4 

polymorphisms increased AD risk. It is also important to note that this was a pilot study with 

41

only twenty AD males, which increases the likelihood that this may be a false negative finding 

due to a low sample number. Nevertheless, this group’s findings that H63D lowers folate 

concentration due to oxidative stress supports the cellular impact that H63D may have in 

increasing neurodegenerative risk.  

 

Pin1 

Pin1 has garnered much attention for its role in AD and other diseased states (Wulf et 

al., 2005; Balastik et al., 2007; Takahashi et al., 2008). The discovery of Pin1, a peptidyl‐prolyl 

cis/trans isomerase (PPI), by Lu and colleagues was a pivotal finding with respect to known PPI 

functions because Pin1 was shown to regulate mitosis (Lu et al., 1996). PPI proteins including 

Pin1 have been shown to be involved in protein assembly, protein folding, protein localization, 

protein‐protein interactions, protein phosphorylation, and enzymatic activity (Wulf et al., 2005; 

Lu and Zhou, 2007). There are numerous Pin1 substrate proteins that are involved in mitosis, 

cytoskeleton structure, transcription, and cell cycle regulation; for a thorough review see (Lu et 

al., 2002a; Wulf et al., 2005; Lu and Zhou, 2007). The nature of Pin1 interactions with its cellular 

targets is a unique mechanism that is required for cellular homeostasis. 

Protein substrate binding of Pin1 occurs through its N‐terminal WW domain (Lu et al., 

1999a; Lu et al., 2002b). Pin1 function is impacted by its phosphorylation state at its serine 16 

residue, which is located at the center of the phosphorylated serine/threonine‐proline binding 

pocket (Verdecia et al., 2000; Lu et al., 2002b). Thus, if there is increased phosphorylation of Pin1 

at its serine 16 residue, Pin1 activity is impaired. The phosphorylation of serine/threonine‐

42

proline motifs of Pin1 substrate proteins is required for Pin1 to bind its targeted protein 

substrates and facilitate the cis to trans isomerization to regulate the respective cellular 

mechanisms (Schutkowski et al., 1998; Lu et al., 1999a). The cis and trans orientations of proteins 

can impact their cellular function based on their protein interactions. Brown and colleagues 

discussed how most cellular kinases and phosphates are trans‐specific (Brown et al., 1999), 

which suggest that if a cis protein conformation is needed to regulate a specific mechanism a 

PPI such as Pin1 is essential to the cell. Some conformational consequences include alterations 

in protein dephosphorylation, enzymatic activity, and protein interactions (Lu et al., 2002a).  

 

Pin1 and AD 

  Pin1 was implicated in AD when Lu and colleagues discovered that Pin1 co‐purified 

with paired helical filaments of tau in AD brains and soluble Pin1 levels were minimal (Lu et 

al., 1999b). They discovered that Pin1 binds the serine/threonine‐proline motif of tau at the 

threonine 231 residue to complex with the NFT pathology found in the AD brain. The authors 

suggested that Pin1 may be trapped in the tangles of phosphorylated tau protein resulting in 

the depletion of soluble Pin1 levels. The significance of these findings was that an essential cell 

cycle regulator also appeared to dephosphorylate a hallmark AD marker, but may be ineffective 

due to AD pathology. This group concluded that a depletion of Pin1 as seen in AD could induce 

mitotic arrest and promote apoptotic cell death contributing to neurodegeneration, yet 

restoration of Pin1 can promote microtubule assembly along with tau binding to microtubules 

43

(Lu et al., 1999b). Thus, there is evidence that Pin1 may be able to act as a cellular defense 

mechanism to combat tau pathology of AD. 

To assess the role of Pin1 in an age‐dependant manner as it relates to the aging 

associated with AD, a Pin1 knockout mouse model was utilized (Liou et al., 2003). Previous 

studies have shown these Pin1 knockout mice to develop testicular atrophy, body weight loss, 

mammary gland proliferative impairment, and retinal degeneration based on a significant 

decrease in cyclin D1 indicative of cell cycle disruption (Fujimori et al., 1999; Liou et al., 2002). 

Since many of the abnormalities found in the mice appeared to be impacted by age (Liou et al., 

2002), Pin1 knockout mice seemed suitable to investigate with respect to pathological 

abnormalities found in AD. Therefore, Pin1 knockout mice were examined at 2‐3 months, 4‐8 

months, and 9‐14 months of age to characterize their phenotype. As the Pin1 knockout mice 

grew older they developed hunched posture and reduced mobility based on their ability to 

remain on a hanging bar (Liou et al., 2003). A significant decrease of neuron‐specific nuclear 

protein in the parietal cortex, autophagic vacuoles in neurons, and degenerating lysosomes of 

older Pin1 knockout mice showed there was age‐dependent neuronal death. 

Hyperphosphorylated tau and conformations of NFT were found in the older Pin1 knockout 

mice (Liou et al., 2003). The authors suggest cross‐breeding this model with AD transgenic 

models to recapitulate the pathology seen in humans as this was the first study to show 

endogenous mouse tau to form NFT pathology (Liou et al., 2003).   

The role of Pin1 in AD pathology was strengthened when Pin1 was shown to regulate 

APP processing and Aβ production (Pastorino et al., 2006). Pin1 had never been shown before 

44

to bind APP although previous studies found APP to have a serine/threonine‐proline directed 

motif and increased phosphorylation of APP at threonine 668 during mitosis (Suzuki et al., 

1994; da Cruz e Silva and da Cruz e Silva, 2003; Lee et al., 2003). Therefore, Pastorino and 

colleagues sought to determine the role of Pin1 in regulating APP phosphorylation. They 

showed that Pin1 binds APP at the threonine 668 residue and co‐localizes with APP at the 

plasma membrane (Pastorino et al., 2006). Pin1 was found to impact amyloid processing by 

decreasing soluble APPα levels and increasing Aβ generation in Pin1 ‐/‐ breast cancer cells 

(Pastorino et al., 2006). These data were confirmed by cross‐breeding Pin1 knockout mice with 

Tg2576 mice (overexpress Swedish APP mutation; K670N/M671L). The collective findings of 

Pin1 effects in AD pathways involving amyloid and tau implicate it as novel intracellular 

regulator that should be targeted for therapeutic intervention. A schematic of how Pin1 exerts 

its affect on amyloid and tau proteins confirmation to impact AD pathology is provided (Figure 

1.4). 

45

Figure 1.4: Pin1 function in Alzheimer’s disease. This schematic shows the role of Pin1 on amyloid and tau proteins in healthy neurons (A) and AD neurons (B). Pin1 catalyzes the cis to trans protein confirmation in healthy neurons to prevent pathogenesis. In AD, Pin1 is unable to facilitate these conformational changes resulting in the AD pathology characteristics of Aβ and NFT generation (Balastik et al., 2007). 

 

 

46

 

Pin1 polymorphisms and AD 

The Pin1 gene maps to human chromosome 19p13.2 (Lu et al., 1996; Campbell et al., 

1997). Thus, the discovery of a novel late‐onset AD locust on human chromosome 19p13.2 

prompted an investigation of Pin1 variants regarding AD risk (Wijsman et al., 2004). Armed 

with known evidence of Pin1 impacting proposed AD pathogenesis mechanisms (Liou et al., 

2003; Pastorino et al., 2006; Balastik et al., 2007); genetic variants in Pin1 emerged to be a 

candidate gene for sporadic AD. For this reason, four genetic studies have examined Pin1 

polymorphism since 2005 (Poli et al., 2005; Lambert et al., 2006; Nowotny et al., 2007; Segat et 

al., 2007). 

The first published study on Pin1 gene variants and AD risk was performed by Poli and 

colleagues (Poli et al., 2005). Their subject population was an Italian group of AD patients (n 

=120) and age‐matched controls (n =134). At the time there was no information available on Pin1 

allele frequency in the population. This group identified single nucleotide polymorphisms in 

exon 2 (c+99G>A) and exon 3 (c+370G>T) in the entire study population. There were four AD 

patients and two controls that possessed the +99G>A polymorphism. The +370G>T 

polymorphism was found in two AD patients and three controls. Thus, an association of Pin1 

variants and AD was not found in this study. The authors state that the low number and 

frequency of DNA sequence variations in Pin1 suggest the Pin1 gene is highly conserved among 

humans (Poli et al., 2005). ApoE genotyping was performed as well, but due to the low 

frequency of Pin1 variants, any interaction with ApoE was not observed. Since this was the first 

47

study investigation an association between Pin1 and AD, these data were very meaningful, 

especially in identifying single nucleotide polymorphisms.  

A similar study was conducted by Segat and colleagues examining Pin1 polymorphisms 

and AD risk (Segat et al., 2007). This study utilized an Italian population of patients as well, 

which included AD patients (n =111) and age‐matched controls (n =73). Two new single 

nucleotide polymorphisms were identified in the promoter region of Pin1 (‐842G/C and ‐

667C/T). A significant increase in the ‐842G/C Pin1 polymorphism was found in 30% of AD 

patients compared to 12% in the control subjects (Segat et al., 2007) supporting an association 

with AD risk. The ‐667C/T Pin1 polymorphism was found in 58.5% of AD patients and 48% of 

controls, suggesting there was not an association with this polymorphism and AD (Segat et al., 

2007). This was the first study showing an association of a Pin1 polymorphism and AD risk by 

identifying additional Pin1 polymorphisms in its promoter region. Furthermore, the c+99G/A 

and c+370G/T were not found in many carriers in the study similar to the Poli study (Poli et al., 

2005).  

A third investigation performed by Lambert and colleagues did not find an association 

with Pin1 polymorphisms and AD risk (Lambert et al., 2006). There was an extremely large 

group of French‐population based patients examined in this study that included 601 AD 

patients and 655 controls. The Pin1 polymorphisms, ‐842G/C and ‐667T/C, expression was 

determined among the study participants. The ‐842G/C polymorphism was found in 17% of AD 

patients with respect to 20% in the control group suggesting that there was not association with 

AD (Lambert et al., 2006). 51% of AD patients carried the ‐667T/C polymorphism compared to 

48

53% in control subjects further supporting that Pin1 polymorphisms were not associated with 

AD (Lambert et al., 2006). Furthermore, the group evaluated Pin1 polymorphisms with age of 

AD onset and did not find an effect (data not shown). The methodology or data were not 

provided to evaluate if there was an association with AD onset or not. 

The most recent study evaluating Pin1 gene variants and AD risk was led by Nowotny 

and colleagues (Nowotny et al., 2007). This group analyzed a total of six Pin1 polymorphisms in 

750 AD patients and 658 controls in an American population of Caucasians from the WashU‐

ADRC study (Morris et al., 1997). There were no significant differences found in the allelic and 

genotype frequencies of the six Pin1 polymorphisms in AD patients (Nowotny et al., 2007). 

Moreover, no differences were found when study participants were stratified for ApoE4 

expression (Nowotny et al., 2007). This group went on to perform a meta‐analysis of their data 

and the two previous studies that examined Pin1 promoter polymorphisms (Lambert et al., 

2006; Segat et al., 2007), ‐842G/C and ‐667C/T, and did not find an association with AD risk. 

They conclude by stating that rare Pin1 polymorphisms that increase Pin1 expression may exert 

an effect on late‐onset AD development (Nowotny et al., 2007). 

Similar to the HFE polymorphisms and AD epidemiological studies, the majority of 

genetic analyses of Pin1 polymorphisms and AD risk have only focused on an association with 

AD. Pin1 polymorphisms may be putative risk factors or genetic modifiers that impact age of 

AD onset such as the H63D HFE variant. Only one out of four studies attempted to examine the 

effect of Pin1 polymorphisms and the age of AD onset (Lambert et al., 2006). Oxidative stress 

can impact Pin1 expression and function (Butterfield et al., 2006; Sultana et al., 2006; Kap et al., 

49

2007), thus consideration of Pin1 polymorphisms in the context of gene‐environment 

interactions is warranted since many disease causing agents are unknown. Moreover, the 

cellular effects of expressing Pin1 polymorphisms need to be elucidated with respect to Pin1 

function. Unlike HFE, Pin1 has been widely studied and has multiple cellular functions that 

may impact disease risk (Hamdane et al., 2002; Lim and Lu, 2005; Lu and Zhou, 2007; Wang et 

al., 2007b). Thus, identifying Pin1 polymorphisms that have increased incidence in diseases 

such as AD may impact disease onset, disease progression, and therapeutic outcomes. 

  

Summary 

The challenge of discovering the etiology of AD has proved to be an insurmountable 

task. Cellular pathological hallmarks of AD have centered primarily on Aβ plaque deposits and 

neurofibrillary tangles, which were initially discovered and described by Louis Alzheimer in 

1906. It has been over a century and post‐mortem analysis of AD brains have not revealed any 

other abundant protein markers, which strengthens the argument that amyloid and tau are 

involved in AD development and progression. Research efforts have succeeded in identifying 

familial cases of AD with genetic variants in the APP, PS1, and PS2 genes; however, only 5‐10% 

of the AD patients possess such a mutation. Thus, approximately 90% of the AD cases remain 

unresolved and are recognized as sporadic regarding their etiology of AD.  

  Since the large number of late‐onset or sporadic AD cases are poorly defined, it is 

important to consider how gene variations and/or environmental factors can impact amyloid 

and tau pathogenic pathways. The ApoE4 polymorphism is the strongest genetic risk factor 

50

associated with late‐onset AD, but it is not a causative agent. A cellular environmental factor 

such as iron can significantly impact many of the proposed AD pathogenic pathways if cellular 

iron homeostasis is not achieved. Genetic variants such as HFE polymorphisms may alter the 

intracellular levels of iron that can accelerate the disruption of cellular mechanisms leading to 

neurodegeneration seen in AD and other neurological diseases. The central working hypothesis 

of the thesis research in the following chapters is that the H63D HFE polymorphism promotes 

AD pathogenic pathways primarily mediated through iron mismanagement. By investigating 

the cellular contribution of a putative risk factor for AD onset and progression, a unique 

opportunity to identify therapeutic targets and predict therapeutic outcomes may be achieved 

to elucidate the disease etiology. 

51

References 

Adalbert R, Gilley J, Coleman MP (2007) Abeta, tau and ApoE4 in Alzheimerʹs disease: the 

axonal connection. Trends Mol Med 13:135‐142. 

Adams PC, Reboussin DM, Barton JC, McLaren CE, Eckfeldt JH, McLaren GD, Dawkins FW, 

Acton RT, Harris EL, Gordeuk VR, Leiendecker‐Foster C, Speechley M, Snively BM, 

Holup JL, Thomson E, Sholinsky P (2005) Hemochromatosis and iron‐overload 

screening in a racially diverse population. N Engl J Med 352:1769‐1778. 

Alizadeh BZ, Njajou OT, Millan MR, Hofman A, Breteler MM, van Duijn CM (2009) HFE 

variants, APOE and Alzheimerʹs disease: findings from the population‐based Rotterdam 

study. Neurobiol Aging 30:330‐332. 

Alzheimer A, Stelzmann RA, Schnitzlein HN, Murtagh FR (1995) An English translation of 

Alzheimerʹs 1907 paper, ʺUber eine eigenartige Erkankung der Hirnrindeʺ. Clin Anat 

8:429‐431. 

Andrews NC (1999a) Disorders of iron metabolism. N Engl J Med 341:1986‐1995. 

Andrews NC (1999b) The iron transporter DMT1. Int J Biochem Cell Biol 31:991‐994. 

Andrews NC, Fleming MD, Levy JE (1999) Molecular insights into mechanisms of iron 

transport. Curr Opin Hematol 6:61‐64. 

Arcos‐Burgos M, Muenke M (2002) Genetics of population isolates. Clin Genet 61:233‐247. 

Arosio P, Levi S (2002) Ferritin, iron homeostasis, and oxidative damage. Free Radic Biol Med 

33:457‐463. 

52

Avila‐Gomez IC, Jimenez‐Del‐Rio M, Lopera‐Restrepo F, Velez‐Pardo C (2008) Association 

between HFE 187 C>G (H63D) mutation and early‐onset familial Alzheimerʹs disease 

PSEN‐1 839A>C (E280A) mutation. Ann Hematol 87:671‐673. 

Balastik M, Lim J, Pastorino L, Lu KP (2007) Pin1 in Alzheimerʹs disease: multiple substrates, 

one regulatory mechanism? Biochim Biophys Acta 1772:422‐429. 

Ballatore C, Lee VM, Trojanowski JQ (2007) Tau‐mediated neurodegeneration in Alzheimerʹs 

disease and related disorders. Nat Rev Neurosci 8:663‐672. 

Bamberger ME, Landreth GE (2001) Microglial interaction with beta‐amyloid: implications for 

the pathogenesis of Alzheimerʹs disease. Microsc Res Tech 54:59‐70. 

Bamberger ME, Landreth GE (2002) Inflammation, apoptosis, and Alzheimerʹs disease. 

Neuroscientist 8:276‐283. 

Bamberger ME, Harris ME, McDonald DR, Husemann J, Landreth GE (2003) A cell surface 

receptor complex for fibrillar beta‐amyloid mediates microglial activation. J Neurosci 

23:2665‐2674. 

Barnham KJ, Bush AI (2008) Metals in Alzheimerʹs and Parkinsonʹs diseases. Curr Opin Chem 

Biol 12:222‐228. 

Barnham KJ, McKinstry WJ, Multhaup G, Galatis D, Morton CJ, Curtain CC, Williamson NA, 

White AR, Hinds MG, Norton RS, Beyreuther K, Masters CL, Parker MW, Cappai R 

(2003) Structure of the Alzheimerʹs disease amyloid precursor protein copper binding 

domain. A regulator of neuronal copper homeostasis. J Biol Chem 278:17401‐17407. 

53

Bartzokis G, Tishler TA, Shin IS, Lu PH, Cummings JL (2004) Brain ferritin iron as a risk factor 

for age at onset in neurodegenerative diseases. Ann N Y Acad Sci 1012:224‐236. 

Bartzokis G, Beckson M, Hance DB, Marx P, Foster JA, Marder SR (1997) MR evaluation of age‐

related increase of brain iron in young adult and older normal males. Magn Reson 

Imaging 15:29‐35. 

Baumann K, Mandelkow EM, Biernat J, Piwnica‐Worms H, Mandelkow E (1993) Abnormal 

Alzheimer‐like phosphorylation of tau‐protein by cyclin‐dependent kinases cdk2 and 

cdk5. FEBS Lett 336:417‐424. 

Berlin D, Chong G, Chertkow H, Bergman H, Phillips NA, Schipper HM (2004) Evaluation of 

HFE (hemochromatosis) mutations as genetic modifiers in sporadic AD and MCI. 

Neurobiol Aging 25:465‐474. 

Beurel E, Jope RS (2006) The paradoxical pro‐ and anti‐apoptotic actions of GSK3 in the intrinsic 

and extrinsic apoptosis signaling pathways. Prog Neurobiol 79:173‐189. 

Blazquez L, De Juan D, Ruiz‐Martinez J, Emparanza JI, Saenz A, Otaegui D, Sistiaga A, 

Martinez‐Lage P, Lamet I, Samaranch L, Buiza C, Etxeberria I, Arriola E, Cuadrado E, 

Urdaneta E, Yanguas J, Lopez de Munain A (2007) Genes related to iron metabolism and 

susceptibility to Alzheimerʹs disease in Basque population. Neurobiol Aging 28:1941‐

1943. 

Bodovitz S, Falduto MT, Frail DE, Klein WL (1995) Iron levels modulate alpha‐secretase 

cleavage of amyloid precursor protein. J Neurochem 64:307‐315. 

54

Borie C, Gasparini F, Verpillat P, Bonnet AM, Agid Y, Hetet G, Brice A, Durr A, Grandchamp B 

(2002) Association study between iron‐related genes polymorphisms and Parkinsonʹs 

disease. J Neurol 249:801‐804. 

Brown NR, Noble ME, Endicott JA, Johnson LN (1999) The structural basis for specificity of 

substrate and recruitment peptides for cyclin‐dependent kinases. Nat Cell Biol 1:438‐443. 

Buee L, Bussiere T, Buee‐Scherrer V, Delacourte A, Hof PR (2000) Tau protein isoforms, 

phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev 

33:95‐130. 

Bush AI (2003) The metallobiology of Alzheimerʹs disease. Trends Neurosci 26:207‐214. 

Butterfield DA, Poon HF, St Clair D, Keller JN, Pierce WM, Klein JB, Markesbery WR (2006) 

Redox proteomics identification of oxidatively modified hippocampal proteins in mild 

cognitive impairment: insights into the development of Alzheimerʹs disease. Neurobiol 

Dis 22:223‐232. 

Buxbaum JD, Liu KN, Luo Y, Slack JL, Stocking KL, Peschon JJ, Johnson RS, Castner BJ, Cerretti 

DP, Black RA (1998) Evidence that tumor necrosis factor alpha converting enzyme is 

involved in regulated alpha‐secretase cleavage of the Alzheimer amyloid protein 

precursor. J Biol Chem 273:27765‐27767. 

Camaschella C, Roetto A, De Gobbi M (2002) Genetic haemochromatosis: genes and mutations 

associated with iron loading. Best Pract Res Clin Haematol 15:261‐276. 

55

Campbell HD, Webb GC, Fountain S, Young IG (1997) The human PIN1 peptidyl‐prolyl 

cis/trans isomerase gene maps to human chromosome 19p13 and the closely related 

PIN1L gene to 1p31. Genomics 44:157‐162. 

Candore G, Licastro F, Chiappelli M, Franceschi C, Lio D, Rita Balistreri C, Piazza G, Colonna‐

Romano G, Grimaldi LM, Caruso C (2003) Association between the HFE mutations and 

unsuccessful ageing: a study in Alzheimerʹs disease patients from Northern Italy. Mech 

Ageing Dev 124:525‐528. 

Castellani R, Hirai K, Aliev G, Drew KL, Nunomura A, Takeda A, Cash AD, Obrenovich ME, 

Perry G, Smith MA (2002) Role of mitochondrial dysfunction in Alzheimerʹs disease. J 

Neurosci Res 70:357‐360. 

Castellani RJ, Lee HG, Zhu X, Nunomura A, Perry G, Smith MA (2006) Neuropathology of 

Alzheimer disease: pathognomonic but not pathogenic. Acta Neuropathol (Berl) 111:503‐

509. 

Combarros O, Garcia‐Roman M, Fontalba A, Fernandez‐Luna JL, Llorca J, Infante J, Berciano J 

(2003) Interaction of the H63D mutation in the hemochromatosis gene with the 

apolipoprotein E epsilon 4 allele modulates age at onset of Alzheimerʹs disease. Dement 

Geriatr Cogn Disord 15:151‐154. 

Combs CK, Karlo JC, Kao SC, Landreth GE (2001) beta‐Amyloid stimulation of microglia and 

monocytes results in TNFalpha‐dependent expression of inducible nitric oxide synthase 

and neuronal apoptosis. J Neurosci 21:1179‐1188. 

56

Connor JR, Menzies SL (1995) Cellular management of iron in the brain. J Neurol Sci 134 

Suppl:33‐44. 

Connor JR, Lee SY (2006) HFE mutations and Alzheimerʹs disease. J Alzheimers Dis 10:267‐276. 

Connor JR, Menzies SL, St Martin SM, Mufson EJ (1992a) A histochemical study of iron, 

transferrin, and ferritin in Alzheimerʹs diseased brains. J Neurosci Res 31:75‐83. 

Connor JR, Snyder BS, Beard JL, Fine RE, Mufson EJ (1992b) Regional distribution of iron and 

iron‐regulatory proteins in the brain in aging and Alzheimerʹs disease. J Neurosci Res 

31:327‐335. 

Connor JR, Milward EA, Moalem S, Sampietro M, Boyer P, Percy ME, Vergani C, Scott RJ, 

Chorney M (2001) Is hemochromatosis a risk factor for Alzheimerʹs disease? J 

Alzheimers Dis 3:471‐477. 

da Cruz e Silva EF, da Cruz e Silva OA (2003) Protein phosphorylation and APP metabolism. 

Neurochem Res 28:1553‐1561. 

de Almeida SF, Carvalho IF, Cardoso CS, Cordeiro JV, Azevedo JE, Neefjes J, de Sousa M (2005) 

HFE cross‐talks with the MHC class I antigen presentation pathway. Blood 106:971‐977. 

De Felice FG, Wu D, Lambert MP, Fernandez SJ, Velasco PT, Lacor PN, Bigio EH, Jerecic J, 

Acton PJ, Shughrue PJ, Chen‐Dodson E, Kinney GG, Klein WL (2008) Alzheimerʹs 

disease‐type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. 

Neurobiol Aging 29:1334‐1347. 

De Sarno P, Li X, Jope RS (2002) Regulation of Akt and glycogen synthase kinase‐3 beta 

phosphorylation by sodium valproate and lithium. Neuropharmacology 43:1158‐1164. 

57

Dekker MC, Giesbergen PC, Njajou OT, van Swieten JC, Hofman A, Breteler MM, van Duijn 

CM (2003) Mutations in the hemochromatosis gene (HFE), Parkinsonʹs disease and 

parkinsonism. Neurosci Lett 348:117‐119. 

Desagher S, Martinou JC (2000) Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends 

Cell Biol 10:369‐377. 

Dunn LL, Rahmanto YS, Richardson DR (2007) Iron uptake and metabolism in the new 

millennium. Trends Cell Biol 17:93‐100. 

Dupradeau F, Altenberg‐Greulich B, Warin R, Fuentes V, Monti J, Rochette J (2000) A 3‐

dimensional model building by homology of the HFE protein: molecular consequences 

and application to antibody development. Biochim Biophys Acta 1481:213‐221. 

Edbauer D, Winkler E, Regula JT, Pesold B, Steiner H, Haass C (2003) Reconstitution of gamma‐

secretase activity. Nat Cell Biol 5:486‐488. 

Egana JT, Zambrano C, Nunez MT, Gonzalez‐Billault C, Maccioni RB (2003) Iron‐induced 

oxidative stress modify tau phosphorylation patterns in hippocampal cell cultures. 

Biometals 16:215‐223. 

Ehrlich R, Lemonnier FA (2000) HFE‐‐a novel nonclassical class I molecule that is involved in 

iron metabolism. Immunity 13:585‐588. 

Eikelenboom P, van Gool WA (2004) Neuroinflammatory perspectives on the two faces of 

Alzheimerʹs disease. J Neural Transm 111:281‐294. 

58

Ellervik C, Tybjaerg‐Hansen A, Appleyard M, Sillesen H, Boysen G, Nordestgaard BG (2007) 

Hereditary hemochromatosis genotypes and risk of ischemic stroke. Neurology 68:1025‐

1031. 

Feder JN, Penny DM, Irrinki A, Lee VK, Lebron JA, Watson N, Tsuchihashi Z, Sigal E, Bjorkman 

PJ, Schatzman RC (1998) The hemochromatosis gene product complexes with the 

transferrin receptor and lowers its affinity for ligand binding. Proc Natl Acad Sci U S A 

95:1472‐1477. 

Feder JN, Tsuchihashi Z, Irrinki A, Lee VK, Mapa FA, Morikang E, Prass CE, Starnes SM, Wolff 

RK, Parkkila S, Sly WS, Schatzman RC (1997) The hemochromatosis founder mutation in 

HLA‐H disrupts beta2‐microglobulin interaction and cell surface expression. J Biol 

Chem 272:14025‐14028. 

Feder JN et al. (1996) A novel MHC class I‐like gene is mutated in patients with hereditary 

haemochromatosis. Nat Genet 13:399‐408. 

Fujimori F, Takahashi K, Uchida C, Uchida T (1999) Mice lacking Pin1 develop normally, but 

are defective in entering cell cycle from G(0) arrest. Biochem Biophys Res Commun 

265:658‐663. 

Fukui H, Moraes CT (2008) The mitochondrial impairment, oxidative stress and 

neurodegeneration connection: reality or just an attractive hypothesis? Trends Neurosci 

31:251‐256. 

59

Glenner GG, Wong CW (1984) Alzheimerʹs disease: initial report of the purification and 

characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res 

Commun 120:885‐890. 

Goate A, Chartier‐Harlin MC, Mullan M, Brown J, Crawford F, Fidani L, Giuffra L, Haynes A, 

Irving N, James L, et al. (1991) Segregation of a missense mutation in the amyloid 

precursor protein gene with familial Alzheimerʹs disease. Nature 349:704‐706. 

Goedert M, Spillantini MG, Jakes R, Crowther RA, Vanmechelen E, Probst A, Gotz J, Burki K, 

Cohen P (1995) Molecular dissection of the paired helical filament. Neurobiol Aging 

16:325‐334. 

Golde TE, Estus S, Usiak M, Younkin LH, Younkin SG (1990) Expression of beta amyloid 

protein precursor mRNAs: recognition of a novel alternatively spliced form and 

quantitation in Alzheimerʹs disease using PCR. Neuron 4:253‐267. 

Good PF, Perl DP, Bierer LM, Schmeidler J (1992) Selective accumulation of aluminum and iron 

in the neurofibrillary tangles of Alzheimerʹs disease: a laser microprobe (LAMMA) 

study. Ann Neurol 31:286‐292. 

Goodall EF, Greenway MJ, van Marion I, Carroll CB, Hardiman O, Morrison KE (2005) 

Association of the H63D polymorphism in the hemochromatosis gene with sporadic 

ALS. Neurology 65:934‐937. 

Greenberg SM, Koo EH, Selkoe DJ, Qiu WQ, Kosik KS (1994) Secreted beta‐amyloid precursor 

protein stimulates mitogen‐activated protein kinase and enhances tau phosphorylation. 

Proc Natl Acad Sci U S A 91:7104‐7108. 

60

Grimes CA, Jope RS (2001) The multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular 

signaling. Prog Neurobiol 65:391‐426. 

Grundke‐Iqbal I, Iqbal K, Quinlan M, Tung YC, Zaidi MS, Wisniewski HM (1986) Microtubule‐

associated protein tau. A component of Alzheimer paired helical filaments. J Biol Chem 

261:6084‐6089. 

Guerreiro RJ, Bras JM, Santana I, Januario C, Santiago B, Morgadinho AS, Ribeiro MH, Hardy J, 

Singleton A, Oliveira C (2006) Association of HFE common mutations with Parkinsonʹs 

disease, Alzheimerʹs disease and mild cognitive impairment in a Portuguese cohort. 

BMC Neurol 6:24. 

Hallgren B, Sourander P (1958) The effect of age on the non‐haemin iron in the human brain. J 

Neurochem 3:41‐51. 

Hamdane M, Smet C, Sambo AV, Leroy A, Wieruszeski JM, Delobel P, Maurage CA, Ghestem 

A, Wintjens R, Begard S, Sergeant N, Delacourte A, Horvath D, Landrieu I, Lippens G, 

Buee L (2002) Pin1: a therapeutic target in Alzheimer neurodegeneration. J Mol Neurosci 

19:275‐287. 

Hanger DP, Hughes K, Woodgett JR, Brion JP, Anderton BH (1992) Glycogen synthase kinase‐3 

induces Alzheimerʹs disease‐like phosphorylation of tau: generation of paired helical 

filament epitopes and neuronal localisation of the kinase. Neurosci Lett 147:58‐62. 

Hanson EH, Imperatore G, Burke W (2001) HFE gene and hereditary hemochromatosis: a HuGE 

review. Human Genome Epidemiology. Am J Epidemiol 154:193‐206. 

Hardy J (2006) A hundred years of Alzheimerʹs disease research. Neuron 52:3‐13. 

61

Hardy J (2009) The amyloid hypothesis for Alzheimerʹs disease: a critical reappraisal. J 

Neurochem. 

Hardy J, Allsop D (1991) Amyloid deposition as the central event in the aetiology of 

Alzheimerʹs disease. Trends Pharmacol Sci 12:383‐388. 

Hardy J, Selkoe DJ (2002) The amyloid hypothesis of Alzheimerʹs disease: progress and 

problems on the road to therapeutics. Science 297:353‐356. 

Hardy JA, Higgins GA (1992) Alzheimerʹs disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 

256:184‐185. 

Hayes A, Thaker U, Iwatsubo T, Pickering‐Brown SM, Mann DM (2002) Pathological 

relationships between microglial cell activity and tau and amyloid beta protein in 

patients with Alzheimerʹs disease. Neurosci Lett 331:171‐174. 

Hernandez F, Borrell J, Guaza C, Avila J, Lucas JJ (2002) Spatial learning deficit in transgenic 

mice that conditionally over‐express GSK‐3beta in the brain but do not form tau 

filaments. J Neurochem 83:1529‐1533. 

Hooper C, Killick R, Lovestone S (2008) The GSK3 hypothesis of Alzheimerʹs disease. J 

Neurochem 104:1433‐1439. 

Hoshi M, Takashima A, Noguchi K, Murayama M, Sato M, Kondo S, Saitoh Y, Ishiguro K, 

Hoshino T, Imahori K (1996) Regulation of mitochondrial pyruvate dehydrogenase 

activity by tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3beta in brain. Proc Natl Acad 

Sci U S A 93:2719‐2723. 

62

Huang HC, Klein PS (2006) Multiple roles for glycogen synthase kinase‐3 as a drug target in 

Alzheimerʹs disease. Curr Drug Targets 7:1389‐1397. 

Iqbal K, Grundke‐Iqbal I (2006) Discoveries of tau, abnormally hyperphosphorylated tau and 

others of neurofibrillary degeneration: a personal historical perspective. J Alzheimers 

Dis 9:219‐242. 

Ishiguro K, Ihara Y, Uchida T, Imahori K (1988) A novel tubulin‐dependent protein kinase 

forming a paired helical filament epitope on tau. J Biochem 104:319‐321. 

Ishiguro K, Shiratsuchi A, Sato S, Omori A, Arioka M, Kobayashi S, Uchida T, Imahori K (1993) 

Glycogen synthase kinase 3 beta is identical to tau protein kinase I generating several 

epitopes of paired helical filaments. FEBS Lett 325:167‐172. 

Itarte E, Huang KP (1979) Purification and properties of cyclic AMP‐independent glycogen 

synthase kinase 1 from rabbit skeletal muscle. J Biol Chem 254:4052‐4057. 

Jope RS, Yuskaitis CJ, Beurel E (2007) Glycogen synthase kinase‐3 (GSK3): inflammation, 

diseases, and therapeutics. Neurochem Res 32:577‐595. 

Juhaszova M, Zorov DB, Kim SH, Pepe S, Fu Q, Fishbein KW, Ziman BD, Wang S, Ytrehus K, 

Antos CL, Olson EN, Sollott SJ (2004) Glycogen synthase kinase‐3beta mediates 

convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition 

pore. J Clin Invest 113:1535‐1549. 

Kang J, Lemaire HG, Unterbeck A, Salbaum JM, Masters CL, Grzeschik KH, Multhaup G, 

Beyreuther K, Muller‐Hill B (1987) The precursor of Alzheimerʹs disease amyloid A4 

protein resembles a cell‐surface receptor. Nature 325:733‐736. 

63

Kap YS, Hoozemans JJ, Bodewes AJ, Zwart R, Meijer OC, Baas F, Scheper W (2007) Pin1 levels 

are downregulated during ER stress in human neuroblastoma cells. Neurogenetics 8:21‐

27. 

Kesavapany S, Lau KF, Ackerley S, Banner SJ, Shemilt SJ, Cooper JD, Leigh PN, Shaw CE, 

McLoughlin DM, Miller CC (2003) Identification of a novel, membrane‐associated 

neuronal kinase, cyclin‐dependent kinase 5/p35‐regulated kinase. J Neurosci 23:4975‐

4983. 

Kidd M (1963) Paired helical filaments in electron microscopy of Alzheimerʹs disease. Nature 

197:192‐193. 

King TD, Jope RS (2005) Inhibition of glycogen synthase kinase‐3 protects cells from intrinsic 

but not extrinsic oxidative stress. Neuroreport 16:597‐601. 

Kish SJ, Bergeron C, Rajput A, Dozic S, Mastrogiacomo F, Chang LJ, Wilson JM, DiStefano LM, 

Nobrega JN (1992) Brain cytochrome oxidase in Alzheimerʹs disease. J Neurochem 

59:776‐779. 

Kluck RM, Bossy‐Wetzel E, Green DR, Newmeyer DD (1997) The release of cytochrome c from 

mitochondria: a primary site for Bcl‐2 regulation of apoptosis. Science 275:1132‐1136. 

Kreutzberg GW (1996) Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci 

19:312‐318. 

Kruszewski M, Iwanenko T (2003) Labile iron pool correlates with iron content in the nucleus 

and the formation of oxidative DNA damage in mouse lymphoma L5178Y cell lines. 

Acta Biochim Pol 50:211‐215. 

64

Lambert JC, Bensemain F, Chapuis J, Cottel D, Amouyel P (2006) Association study of the PIN1 

gene with Alzheimerʹs disease. Neurosci Lett 402:259‐261. 

Lawson DM, Treffry A, Artymiuk PJ, Harrison PM, Yewdall SJ, Luzzago A, Cesareni G, Levi S, 

Arosio P (1989) Identification of the ferroxidase centre in ferritin. FEBS Lett 254:207‐210. 

Le Gac G, Mura C, Ferec C (2001) Complete scanning of the hereditary hemochromatosis gene 

(HFE) by use of denaturing HPLC. Clin Chem 47:1633‐1640. 

Lebron JA, Bjorkman PJ (1999) The transferrin receptor binding site on HFE, the class I MHC‐

related protein mutated in hereditary hemochromatosis. J Mol Biol 289:1109‐1118. 

Lebron JA, West AP, Jr., Bjorkman PJ (1999) The hemochromatosis protein HFE competes with 

transferrin for binding to the transferrin receptor. J Mol Biol 294:239‐245. 

Lebron JA, Bennett MJ, Vaughn DE, Chirino AJ, Snow PM, Mintier GA, Feder JN, Bjorkman PJ 

(1998) Crystal structure of the hemochromatosis protein HFE and characterization of its 

interaction with transferrin receptor. Cell 93:111‐123. 

Lee HG, Castellani RJ, Zhu X, Perry G, Smith MA (2005) Amyloid‐beta in Alzheimerʹs disease: 

the horse or the cart? Pathogenic or protective? Int J Exp Pathol 86:133‐138. 

Lee MS, Kao SC, Lemere CA, Xia W, Tseng HC, Zhou Y, Neve R, Ahlijanian MK, Tsai LH (2003) 

APP processing is regulated by cytoplasmic phosphorylation. J Cell Biol 163:83‐95. 

Lee SY, Connor JR (2005) Regulation of Hfe by stress factors in BV‐2 cells. Neurobiol Aging 

26:803‐812. 

Lee VM, Trojanowski JQ (1999) Neurodegenerative tauopathies: human disease and transgenic 

mouse models. Neuron 24:507‐510. 

65

Lee VM, Goedert M, Trojanowski JQ (2001) Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev 

Neurosci 24:1121‐1159. 

Levy JE, Montross LK, Cohen DE, Fleming MD, Andrews NC (1999) The C282Y mutation 

causing hereditary hemochromatosis does not produce a null allele. Blood 94:9‐11. 

Lew J, Huang QQ, Qi Z, Winkfein RJ, Aebersold R, Hunt T, Wang JH (1994) A brain‐specific 

activator of cyclin‐dependent kinase 5. Nature 371:423‐426. 

Li T, Paudel HK (2006) Glycogen synthase kinase 3beta phosphorylates Alzheimerʹs disease‐

specific Ser396 of microtubule‐associated protein tau by a sequential mechanism. 

Biochemistry 45:3125‐3133. 

Li T, Hawkes C, Qureshi HY, Kar S, Paudel HK (2006) Cyclin‐dependent protein kinase 5 

primes microtubule‐associated protein tau site‐specifically for glycogen synthase kinase 

3beta. Biochemistry 45:3134‐3145. 

Lim J, Lu KP (2005) Pinning down phosphorylated tau and tauopathies. Biochim Biophys Acta 

1739:311‐322. 

Linseman DA, Butts BD, Precht TA, Phelps RA, Le SS, Laessig TA, Bouchard RJ, Florez‐

McClure ML, Heidenreich KA (2004) Glycogen synthase kinase‐3beta phosphorylates 

Bax and promotes its mitochondrial localization during neuronal apoptosis. J Neurosci 

24:9993‐10002. 

Liou YC, Ryo A, Huang HK, Lu PJ, Bronson R, Fujimori F, Uchida T, Hunter T, Lu KP (2002) 

Loss of Pin1 function in the mouse causes phenotypes resembling cyclin D1‐null 

phenotypes. Proc Natl Acad Sci U S A 99:1335‐1340. 

66

Liou YC, Sun A, Ryo A, Zhou XZ, Yu ZX, Huang HK, Uchida T, Bronson R, Bing G, Li X, 

Hunter T, Lu KP (2003) Role of the prolyl isomerase Pin1 in protecting against age‐

dependent neurodegeneration. Nature 424:556‐561. 

Lleo A, Blesa R, Angelopoulos C, Pastor‐Rubio P, Villa M, Oliva R, Bufill E (2002) Transferrin 

C2 allele, haemochromatosis gene mutations, and risk for Alzheimerʹs disease. J Neurol 

Neurosurg Psychiatry 72:820‐821. 

Loeffler DA, Connor JR, Juneau PL, Snyder BS, Kanaley L, DeMaggio AJ, Nguyen H, Brickman 

CM, LeWitt PA (1995) Transferrin and iron in normal, Alzheimerʹs disease, and 

Parkinsonʹs disease brain regions. J Neurochem 65:710‐724. 

Lovell MA, Markesbery WR (2007) Oxidative damage in mild cognitive impairment and early 

Alzheimerʹs disease. J Neurosci Res 85:3036‐3040. 

Lu KP, Zhou XZ (2007) The prolyl isomerase PIN1: a pivotal new twist in phosphorylation 

signalling and disease. Nat Rev Mol Cell Biol 8:904‐916. 

Lu KP, Hanes SD, Hunter T (1996) A human peptidyl‐prolyl isomerase essential for regulation 

of mitosis. Nature 380:544‐547. 

Lu KP, Liou YC, Zhou XZ (2002a) Pinning down proline‐directed phosphorylation signaling. 

Trends Cell Biol 12:164‐172. 

Lu PJ, Zhou XZ, Shen M, Lu KP (1999a) Function of WW domains as phosphoserine‐ or 

phosphothreonine‐binding modules. Science 283:1325‐1328. 

Lu PJ, Wulf G, Zhou XZ, Davies P, Lu KP (1999b) The prolyl isomerase Pin1 restores the 

function of Alzheimer‐associated phosphorylated tau protein. Nature 399:784‐788. 

67

Lu PJ, Zhou XZ, Liou YC, Noel JP, Lu KP (2002b) Critical role of WW domain phosphorylation 

in regulating phosphoserine binding activity and Pin1 function. J Biol Chem 277:2381‐

2384. 

Lucas JJ, Hernandez F, Gomez‐Ramos P, Moran MA, Hen R, Avila J (2001) Decreased nuclear 

beta‐catenin, tau hyperphosphorylation and neurodegeneration in GSK‐3beta 

conditional transgenic mice. Embo J 20:27‐39. 

Maccioni RB, Rojo LE, Fernandez JA, Kuljis RO (2009) The role of neuroimmunomodulation in 

Alzheimerʹs disease. Ann N Y Acad Sci 1153:240‐246. 

Mahley RW (1988) Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell 

biology. Science 240:622‐630. 

Mansuy IM, Shenolikar S (2006) Protein serine/threonine phosphatases in neuronal plasticity 

and disorders of learning and memory. Trends Neurosci 29:679‐686. 

Markesbery WR, Kryscio RJ, Lovell MA, Morrow JD (2005) Lipid peroxidation is an early event 

in the brain in amnestic mild cognitive impairment. Ann Neurol 58:730‐735. 

Masters CL, Simms G, Weinman NA, Multhaup G, McDonald BL, Beyreuther K (1985) Amyloid 

plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc Natl Acad Sci U S 

A 82:4245‐4249. 

Mattson MP, Gleichmann M, Cheng A (2008) Mitochondria in neuroplasticity and neurological 

disorders. Neuron 60:748‐766. 

68

Mattson MP, Pedersen WA, Duan W, Culmsee C, Camandola S (1999) Cellular and molecular 

mechanisms underlying perturbed energy metabolism and neuronal degeneration in 

Alzheimerʹs and Parkinsonʹs diseases. Ann N Y Acad Sci 893:154‐175. 

Mazanetz MP, Fischer PM (2007) Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for 

neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov 6:464‐479. 

Meda L, Baron P, Scarlato G (2001) Glial activation in Alzheimerʹs disease: the role of Abeta and 

its associated proteins. Neurobiol Aging 22:885‐893. 

Merryweather‐Clarke AT, Pointon JJ, Jouanolle AM, Rochette J, Robson KJ (2000) Geography of 

HFE C282Y and H63D mutations. Genet Test 4:183‐198. 

Moalem S, Percy ME, Andrews DF, Kruck TP, Wong S, Dalton AJ, Mehta P, Fedor B, Warren 

AC (2000) Are hereditary hemochromatosis mutations involved in Alzheimer disease? 

Am J Med Genet 93:58‐66. 

Morishima‐Kawashima M, Hasegawa M, Takio K, Suzuki M, Yoshida H, Titani K, Ihara Y 

(1995) Proline‐directed and non‐proline‐directed phosphorylation of PHF‐tau. J Biol 

Chem 270:823‐829. 

Morris JC, Ernesto C, Schafer K, Coats M, Leon S, Sano M, Thal LJ, Woodbury P (1997) Clinical 

dementia rating training and reliability in multicenter studies: the Alzheimerʹs Disease 

Cooperative Study experience. Neurology 48:1508‐1510. 

Multhaup G (1997) Amyloid precursor protein, copper and Alzheimerʹs disease. Biomed 

Pharmacother 51:105‐111. 

69

Murphy E (2004) Inhibit GSK‐3beta or thereʹs heartbreak dead ahead. J Clin Invest 113:1526‐

1528. 

Mutisya EM, Bowling AC, Beal MF (1994) Cortical cytochrome oxidase activity is reduced in 

Alzheimerʹs disease. J Neurochem 63:2179‐2184. 

Nagele RG, Wegiel J, Venkataraman V, Imaki H, Wang KC (2004) Contribution of glial cells to 

the development of amyloid plaques in Alzheimerʹs disease. Neurobiol Aging 25:663‐

674. 

Nikolic M, Dudek H, Kwon YT, Ramos YF, Tsai LH (1996) The cdk5/p35 kinase is essential for 

neurite outgrowth during neuronal differentiation. Genes Dev 10:816‐825. 

Noble W, Olm V, Takata K, Casey E, Mary O, Meyerson J, Gaynor K, LaFrancois J, Wang L, 

Kondo T, Davies P, Burns M, Veeranna, Nixon R, Dickson D, Matsuoka Y, Ahlijanian M, 

Lau LF, Duff K (2003) Cdk5 is a key factor in tau aggregation and tangle formation in 

vivo. Neuron 38:555‐565. 

Nowotny P, Bertelsen S, Hinrichs AL, Kauwe JS, Mayo K, Jacquart S, Morris JC, Goate A (2007) 

Association studies between common variants in prolyl isomerase Pin1 and the risk for 

late‐onset Alzheimerʹs disease. Neurosci Lett 419:15‐17. 

Pastorino L, Sun A, Lu PJ, Zhou XZ, Balastik M, Finn G, Wulf G, Lim J, Li SH, Li X, Xia W, 

Nicholson LK, Lu KP (2006) The prolyl isomerase Pin1 regulates amyloid precursor 

protein processing and amyloid‐beta production. Nature 440:528‐534. 

Patzke H, Tsai LH (2002) Calpain‐mediated cleavage of the cyclin‐dependent kinase‐5 activator 

p39 to p29. J Biol Chem 277:8054‐8060. 

70

Pei JJ, Gong CX, An WL, Winblad B, Cowburn RF, Grundke‐Iqbal I, Iqbal K (2003) Okadaic‐

acid‐induced inhibition of protein phosphatase 2A produces activation of mitogen‐

activated protein kinases ERK1/2, MEK1/2, and p70 S6, similar to that in Alzheimerʹs 

disease. Am J Pathol 163:845‐858. 

Percy M et al. (2008) Involvement of ApoE E4 and H63D in sporadic Alzheimerʹs disease in a 

folate‐supplemented Ontario population. J Alzheimers Dis 14:69‐84. 

Petersen RC, Smith GE, Waring SC, Ivnik RJ, Tangalos EG, Kokmen E (1999) Mild cognitive 

impairment: clinical characterization and outcome. Arch Neurol 56:303‐308. 

Petersen RC, Smith GE, Ivnik RJ, Tangalos EG, Schaid DJ, Thibodeau SN, Kokmen E, Waring 

SC, Kurland LT (1995) Apolipoprotein E status as a predictor of the development of 

Alzheimerʹs disease in memory‐impaired individuals. JAMA 273:1274‐1278. 

Petrat F, de Groot H, Rauen U (2000) Determination of the chelatable iron pool of single intact 

cells by laser scanning microscopy. Arch Biochem Biophys 376:74‐81. 

Pinero DJ, Hu J, Connor JR (2000) Alterations in the interaction between iron regulatory 

proteins and their iron responsive element in normal and Alzheimerʹs diseased brains. 

Cell Mol Biol (Noisy‐le‐grand) 46:761‐776. 

Plattner F, Angelo M, Giese KP (2006) The roles of cyclin‐dependent kinase 5 and glycogen 

synthase kinase 3 in tau hyperphosphorylation. J Biol Chem 281:25457‐25465. 

Poli M, Gatta LB, Dominici R, Lovati C, Mariani C, Albertini A, Finazzi D (2005) DNA sequence 

variations in the prolyl isomerase Pin1 gene and Alzheimerʹs disease. Neurosci Lett 

389:66‐70. 

71

Porto G, De Sousa M (2007) Iron overload and immunity. World J Gastroenterol 13:4707‐4715. 

Pulliam JF, Jennings CD, Kryscio RJ, Davis DG, Wilson D, Montine TJ, Schmitt FA, Markesbery 

WR (2003) Association of HFE mutations with neurodegeneration and oxidative stress in 

Alzheimerʹs disease and correlation with APOE. Am J Med Genet B Neuropsychiatr 

Genet 119B:48‐53. 

Quintana C, Bellefqih S, Laval JY, Guerquin‐Kern JL, Wu TD, Avila J, Ferrer I, Arranz R, Patino 

C (2006) Study of the localization of iron, ferritin, and hemosiderin in Alzheimerʹs 

disease hippocampus by analytical microscopy at the subcellular level. J Struct Biol 

153:42‐54. 

Ramagopalan SV, Cukjati M, Cernilec M, DeLuca GC, Dyment DA, Degenhardt A, Sadovnick 

AD, Serbec VC, Ebers GC, Duquette P (2008) Mutations in the hemochromatosis gene 

and the clinical outcome of multiple sclerosis. J Neuroimmunol 203:104‐107. 

Ramalingam TS, West AP, Jr., Lebron JA, Nangiana JS, Hogan TH, Enns CA, Bjorkman PJ (2000) 

Binding to the transferrin receptor is required for endocytosis of HFE and regulation of 

iron homeostasis. Nat Cell Biol 2:953‐957. 

Restagno G, Lombardo F, Ghiglione P, Calvo A, Cocco E, Sbaiz L, Mutani R, Chio A (2007) HFE 

H63D polymorphism is increased in patients with amyotrophic lateral sclerosis of Italian 

origin. J Neurol Neurosurg Psychiatry 78:327. 

Ristic S, Lovrecic L, Brajenovic‐Milic B, Starcevic‐Cizmarevic N, Jazbec SS, Sepcic J, Kapovic M, 

Peterlin B (2005) Mutations in the hemochromatosis gene (HFE) and multiple sclerosis. 

Neurosci Lett 383:301‐304. 

72

Robson KJ, Lehmann DJ, Wimhurst VL, Livesey KJ, Combrinck M, Merryweather‐Clarke AT, 

Warden DR, Smith AD (2004) Synergy between the C2 allele of transferrin and the 

C282Y allele of the haemochromatosis gene (HFE) as risk factors for developing 

Alzheimerʹs disease. J Med Genet 41:261‐265. 

Rodionova E, Conzelmann M, Maraskovsky E, Hess M, Kirsch M, Giese T, Ho AD, Zoller M, 

Dreger P, Luft T (2007) GSK‐3 mediates differentiation and activation of 

proinflammatory dendritic cells. Blood 109:1584‐1592. 

Rogers JT, Lahiri DK (2004) Metal and inflammatory targets for Alzheimerʹs disease. Curr Drug 

Targets 5:535‐551. 

Rogers JT, Randall JD, Cahill CM, Eder PS, Huang X, Gunshin H, Leiter L, McPhee J, Sarang SS, 

Utsuki T, Greig NH, Lahiri DK, Tanzi RE, Bush AI, Giordano T, Gullans SR (2002) An 

iron‐responsive element type II in the 5ʹ‐untranslated region of the Alzheimerʹs amyloid 

precursor protein transcript. J Biol Chem 277:45518‐45528. 

Rohrlich PS, Fazilleau N, Ginhoux F, Firat H, Michel F, Cochet M, Laham N, Roth MP, Pascolo 

S, Nato F, Coppin H, Charneau P, Danos O, Acuto O, Ehrlich R, Kanellopoulos J, 

Lemonnier FA (2005) Direct recognition by alphabeta cytolytic T cells of Hfe, a MHC 

class Ib molecule without antigen‐presenting function. Proc Natl Acad Sci U S A 

102:12855‐12860. 

Rouault TA, Tong WH (2005) Iron‐sulphur cluster biogenesis and mitochondrial iron 

homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol 6:345‐351. 

73

Roy CN, Custodio AO, de Graaf J, Schneider S, Akpan I, Montross LK, Sanchez M, Gaudino A, 

Hentze MW, Andrews NC, Muckenthaler MU (2004) An Hfe‐dependent pathway 

mediates hyposideremia in response to lipopolysaccharide‐induced inflammation in 

mice. Nat Genet 36:481‐485. 

Rubio JP, Bahlo M, Tubridy N, Stankovich J, Burfoot R, Butzkueven H, Chapman C, Johnson L, 

Marriott M, Mraz G, Tait B, Wilkinson C, Taylor B, Speed TP, Foote SJ, Kilpatrick TJ 

(2004) Extended haplotype analysis in the HLA complex reveals an increased frequency 

of the HFE‐C282Y mutation in individuals with multiple sclerosis. Hum Genet 114:573‐

580. 

Salloway S, Correia S (2009) Alzheimer disease: time to improve its diagnosis and treatment. 

Cleve Clin J Med 76:49‐58. 

Salter‐Cid L, Peterson PA, Yang Y (2000) The major histocompatibility complex‐encoded HFE in 

iron homeostasis and immune function. Immunol Res 22:43‐59. 

Sampietro M, Caputo L, Casatta A, Meregalli M, Pellagatti A, Tagliabue J, Annoni G, Vergani C 

(2001) The hemochromatosis gene affects the age of onset of sporadic Alzheimerʹs 

disease. Neurobiol Aging 22:563‐568. 

Sayre LM, Perry G, Harris PL, Liu Y, Schubert KA, Smith MA (2000) In situ oxidative catalysis 

by neurofibrillary tangles and senile plaques in Alzheimerʹs disease: a central role for 

bound transition metals. J Neurochem 74:270‐279. 

74

Schutkowski M, Bernhardt A, Zhou XZ, Shen M, Reimer U, Rahfeld JU, Lu KP, Fischer G (1998) 

Role of phosphorylation in determining the backbone dynamics of the serine/threonine‐

proline motif and Pin1 substrate recognition. Biochemistry 37:5566‐5575. 

Segat L, Pontillo A, Annoni G, Trabattoni D, Vergani C, Clerici M, Arosio B, Crovella S (2007) 

PIN1 promoter polymorphisms are associated with Alzheimerʹs disease. Neurobiol 

Aging 28:69‐74. 

Selkoe DJ (1989) Molecular pathology of amyloidogenic proteins and the role of vascular 

amyloidosis in Alzheimerʹs disease. Neurobiol Aging 10:387‐395. 

Selkoe DJ (1994) Normal and abnormal biology of the beta‐amyloid precursor protein. Annu 

Rev Neurosci 17:489‐517. 

Selkoe DJ (1996a) Amyloid beta‐protein and the genetics of Alzheimerʹs disease. J Biol Chem 

271:18295‐18298. 

Selkoe DJ (1996b) Cell biology of the beta‐amyloid precursor protein and the genetics of 

Alzheimerʹs disease. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 61:587‐596. 

Selkoe DJ, Yamazaki T, Citron M, Podlisny MB, Koo EH, Teplow DB, Haass C (1996) The role of 

APP processing and trafficking pathways in the formation of amyloid beta‐protein. Ann 

N Y Acad Sci 777:57‐64. 

Sengupta A, Wu Q, Grundke‐Iqbal I, Iqbal K, Singh TJ (1997) Potentiation of GSK‐3‐catalyzed 

Alzheimer‐like phosphorylation of human tau by cdk5. Mol Cell Biochem 167:99‐105. 

Shah RS, Lee HG, Xiongwei Z, Perry G, Smith MA, Castellani RJ (2008) Current approaches in 

the treatment of Alzheimerʹs disease. Biomed Pharmacother 62:199‐207. 

75

Shin RW, Kruck TP, Murayama H, Kitamoto T (2003) A novel trivalent cation chelator Feralex 

dissociates binding of aluminum and iron associated with hyperphosphorylated tau of 

Alzheimerʹs disease. Brain Res 961:139‐146. 

Smith MA, Harris PL, Sayre LM, Perry G (1997) Iron accumulation in Alzheimer disease is a 

source of redox‐generated free radicals. Proc Natl Acad Sci U S A 94:9866‐9868. 

Streit WJ (2004) Microglia and Alzheimerʹs disease pathogenesis. J Neurosci Res 77:1‐8. 

Streit WJ, Mrak RE, Griffin WS (2004) Microglia and neuroinflammation: a pathological 

perspective. J Neuroinflammation 1:14. 

Sullivan PG, Brown MR (2005) Mitochondrial aging and dysfunction in Alzheimerʹs disease. 

Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29:407‐410. 

Sultana R, Boyd‐Kimball D, Poon HF, Cai J, Pierce WM, Klein JB, Markesbery WR, Zhou XZ, Lu 

KP, Butterfield DA (2006) Oxidative modification and down‐regulation of Pin1 in 

Alzheimerʹs disease hippocampus: A redox proteomics analysis. Neurobiol Aging 

27:918‐925. 

Sutedja NA, Sinke RJ, Van Vught PW, Van der Linden MW, Wokke JH, Van Duijn CM, Njajou 

OT, Van der Schouw YT, Veldink JH, Van den Berg LH (2007) The association between 

H63D mutations in HFE and amyotrophic lateral sclerosis in a Dutch population. Arch 

Neurol 64:63‐67. 

Suzuki T, Oishi M, Marshak DR, Czernik AJ, Nairn AC, Greengard P (1994) Cell cycle‐

dependent regulation of the phosphorylation and metabolism of the Alzheimer amyloid 

precursor protein. Embo J 13:1114‐1122. 

76

Tahara K, Kim HD, Jin JJ, Maxwell JA, Li L, Fukuchi K (2006) Role of toll‐like receptor signalling 

in Abeta uptake and clearance. Brain 129:3006‐3019. 

Takahashi K, Uchida C, Shin RW, Shimazaki K, Uchida T (2008) Prolyl isomerase, Pin1: new 

findings of post‐translational modifications and physiological substrates in cancer, 

asthma and Alzheimerʹs disease. Cell Mol Life Sci 65:359‐375. 

Tanaka T, Iqbal K, Trenkner E, Liu DJ, Grundke‐Iqbal I (1995) Abnormally phosphorylated tau 

in SY5Y human neuroblastoma cells. FEBS Lett 360:5‐9. 

Tanaka T, Zhong J, Iqbal K, Trenkner E, Grundke‐Iqbal I (1998) The regulation of 

phosphorylation of tau in SY5Y neuroblastoma cells: the role of protein phosphatases. 

FEBS Lett 426:248‐254. 

Tang D, Wang JH (1996) Cyclin‐dependent kinase 5 (Cdk5) and neuron‐specific Cdk5 activators. 

Prog Cell Cycle Res 2:205‐216. 

Tanzi RE, Bertram L (2005) Twenty years of the Alzheimerʹs disease amyloid hypothesis: a 

genetic perspective. Cell 120:545‐555. 

Terman A, Brunk UT (2006) Oxidative stress, accumulation of biological ʹgarbageʹ, and aging. 

Antioxid Redox Signal 8:197‐204. 

Thinakaran G (1999) The role of presenilins in Alzheimerʹs disease. J Clin Invest 104:1321‐1327. 

Thompson KJ, Shoham S, Connor JR (2001) Iron and neurodegenerative disorders. Brain Res 

Bull 55:155‐164. 

Vassar R et al. (1999) Beta‐secretase cleavage of Alzheimerʹs amyloid precursor protein by the 

transmembrane aspartic protease BACE. Science 286:735‐741. 

77

Verdecia MA, Bowman ME, Lu KP, Hunter T, Noel JP (2000) Structural basis for phosphoserine‐

proline recognition by group IV WW domains. Nat Struct Biol 7:639‐643. 

Waheed A, Parkkila S, Saarnio J, Fleming RE, Zhou XY, Tomatsu S, Britton RS, Bacon BR, Sly 

WS (1999) Association of HFE protein with transferrin receptor in crypt enterocytes of 

human duodenum. Proc Natl Acad Sci U S A 96:1579‐1584. 

Waheed A, Grubb JH, Zhou XY, Tomatsu S, Fleming RE, Costaldi ME, Britton RS, Bacon BR, Sly 

WS (2002) Regulation of transferrin‐mediated iron uptake by HFE, the protein defective 

in hereditary hemochromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A 99:3117‐3122. 

Wallace DC (1999) Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283:1482‐1488. 

Wang JZ, Grundke‐Iqbal I, Iqbal K (2007a) Kinases and phosphatases and tau sites involved in 

Alzheimer neurofibrillary degeneration. Eur J Neurosci 25:59‐68. 

Wang S, Simon BP, Bennett DA, Schneider JA, Malter JS, Wang DS (2007b) The significance of 

Pin1 in the development of Alzheimerʹs disease. J Alzheimers Dis 11:13‐23. 

Wang XS, Lee S, Simmons Z, Boyer P, Scott K, Liu W, Connor J (2004) Increased incidence of the 

Hfe mutation in amyotrophic lateral sclerosis and related cellular consequences. J 

Neurol Sci 227:27‐33. 

Weisgraber KH (1994) Apolipoprotein E: structure‐function relationships. Adv Protein Chem 

45:249‐302. 

Weisgraber KH, Roses AD, Strittmatter WJ (1994) The role of apolipoprotein E in the nervous 

system. Curr Opin Lipidol 5:110‐116. 

78

Wijsman EM, Daw EW, Yu CE, Payami H, Steinbart EJ, Nochlin D, Conlon EM, Bird TD, 

Schellenberg GD (2004) Evidence for a novel late‐onset Alzheimer disease locus on 

chromosome 19p13.2. Am J Hum Genet 75:398‐409. 

Wisniewski HM, Wegiel J (1991) Spatial relationships between astrocytes and classical plaque 

components. Neurobiol Aging 12:593‐600. 

Woodgett JR, Ohashi PS (2005) GSK3: an in‐Toll‐erant protein kinase? Nat Immunol 6:751‐752. 

Wulf G, Finn G, Suizu F, Lu KP (2005) Phosphorylation‐specific prolyl isomerization: is there an 

underlying theme? Nat Cell Biol 7:435‐441. 

Yamamoto A, Shin RW, Hasegawa K, Naiki H, Sato H, Yoshimasu F, Kitamoto T (2002) Iron 

(III) induces aggregation of hyperphosphorylated tau and its reduction to iron (II) 

reverses the aggregation: implications in the formation of neurofibrillary tangles of 

Alzheimerʹs disease. J Neurochem 82:1137‐1147. 

Yen AA, Simpson EP, Henkel JS, Beers DR, Appel SH (2004) HFE mutations are not strongly 

associated with sporadic ALS. Neurology 62:1611‐1612. 

Zecca L, Youdim MB, Riederer P, Connor JR, Crichton RR (2004) Iron, brain ageing and 

neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci 5:863‐873. 

Zhu X, Su B, Wang X, Smith MA, Perry G (2007) Causes of oxidative stress in Alzheimer 

disease. Cell Mol Life Sci 64:2202‐2210. 

Zou H, Li Y, Liu X, Wang X (1999) An APAF‐1.cytochrome c multimeric complex is a functional 

apoptosome that activates procaspase‐9. J Biol Chem 274:11549‐11556. 

 

Chapter 2

The Influence of HFE Polymorphisms on Amyloid Regulation in 

Human Neuroblastoma SH‐SY5Y cells

Abstract 

Elevated levels of cellular iron are routinely seen in Alzheimer’s disease (AD) 

brains. HFE is the most common genetic polymorphism in Caucasians and its protein is 

reported to regulate cellular iron uptake. Several studies have shown an association 

between HFE polymorphisms and AD where some studies suggest that HFE 

polymorphisms decrease the age of onset of AD. The H63D HFE polymorphism is 

associated with altered iron homeostasis. HFE has been detected in cells associated with 

amyloid plaques, one of the hallmarks of AD. Thus, we evaluated the role of HFE 

polymorphisms in regulating amyloid cellular mechanisms. We created a stably 

transfected human neuroblastoma SH‐SY5Y cell model expressing HFE polymorphisms 

to investigate their effects on AD amyloid pathways. The SH‐SY5Y cell line does not 

express detectable levels of HFE (Wang et al., 2004; Lee et al., 2006). Upon evaluating 

APP synthesis, we found total APP levels to be increased in cells expressing WT and 

H63D HFE polymorphisms compared to the vector transfection control, but APP levels 

did not differ between cell lines expressing WT and H63D polymorphisms. APP is 

processed by secretase complexes and we determined the effects of HFE polymorphisms 

80

on secretase activity. There were no differences in α‐, β‐, or γ‐secretase activity among 

the cell lines. Aβ production was indirectly determined by measuring APP C‐terminal 

fragments and no differences were found. Our findings provide evidence that HFE itself 

may alter APP levels regardless of the alleles expressed and we conclude that HFE 

polymorphisms do not impact APP processing. 

 

Introduction

HFE has generated interest as a genetic modifier of neurodegenerative disease 

risk because of the iron mismanagement associated with neurological diseases (Bush, 

2003; Huang et al., 2004; Zecca et al., 2004). In Alzheimer disease (AD) cases, genetic 

association studies have supported or not supported an increased risk of AD onset with 

HFE polymorphisms (Connor and Lee, 2006). HFE is a major histocompatibility class 1‐

like protein that has been shown to regulate intracellular iron uptake by complexing 

with transferrin receptors (Feder et al., 1998). It is known that brain iron levels increase 

throughout aging and there is increased brain iron in AD patients (Connor et al., 1992b; 

Connor and Menzies, 1995; Smith et al., 1997). Therefore, HFE polymorphisms could 

impact AD risk based on alterations in brain iron metabolism, but their impact on AD 

pathogenic pathways is unknown.   

The underlying cause of AD is not known, but the amyloid hypothesis has been 

put forth to explain the pathological hallmarks associated with the disease (Hardy and 

Higgins, 1992; Mattson, 1997). Amyloid precursor protein (APP) processing occurs via 

81

non‐amyloid producing and amyloid producing secretase activity. The non‐amyloid α‐

secretase pathway involves “a disintegrin and metalloproteinase” (ADAM) that cleaves 

within the Aβ sequence of APP and the amyloid producing β‐secretase pathway utilizes 

the “beta amyloid converting enzyme” (BACE) (Hardy and Higgins, 1992; Mattson, 

1997; Vassar et al., 1999; Nixon, 2005). The gamma secretase complex cleaves the 

remaining APP peptide in either pathway to produce soluble APPα and the APP C‐

terminal fragment (CTF) C83 in the non‐amyloidogenic pathway or the Aβ peptide and 

APP CTF C99 fragment in the amyloidogenic pathway (Grbovic et al., 2003; Zhang et al., 

2006).  

A functional iron responsive element (IRE) was discovered in the 5’untranslated 

region of APP, thereby solidifying it as a metalloprotein tightly regulated by 

intracellular iron levels affecting its synthesis (Rogers et al., 2002). Cellular iron been 

shown to regulate APP processing through its effects on α‐secretase activity at the cell 

surface (Bodovitz et al., 1995). Increased activity of BACE 1 correlated with oxidative 

stress based on the products of lipid peroxidation in sporadic AD cases using autopsied 

brain tissue (Borghi et al., 2006) indicating that iron‐mediated oxidative stress may 

impact Aβ generation. The work of our laboratory and others revealing iron deposits in 

senile plaques and neurofibrillary tangles throughout the brain further implicate a 

connection of iron dyshomeostasis and AD hallmark characteristics (Connor et al., 

1992a; Sayre et al., 2000; Connor et al., 2001; Quintana et al., 2006). Iron has also been 

shown to be a key molecule in the aggregation of Aβ impacting subsequent plaque 

82

formation (Multhaup, 1997; Barnham et al., 2003; Liu et al., 2006). The expression of the 

H63D polymorphism may underlie these cellular iron and oxidative stress effects on 

amyloid proteins. 

We have developed a stably transfected HFE neuroblastoma SH‐SY5Y cell line to 

test the hypothesis that the H63D polymorphism will increase APP synthesis and Aβ 

production. There are numerous mechanisms that have shown that increased cellular 

iron levels to influence amyloid regulation. The H63D polymorphism has been shown to 

result in increased cellular iron levels and oxidative stress in our cell line (Wang et al., 

2004; Lee et al., 2006) and in humans (Pulliam et al., 2003). Therefore, we investigated 

the role of HFE polymorphisms on cellular amyloid regulation.  

Materials and methods 

Reagents ‐ Human neuroblastoma SH‐SY5Y cell lines were obtained from American Type 

Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cell culture reagents including DMEM/F12, 

DMEM, pen/strep/glutamine and Geneticin were purchased from Invitrogen (Carlsbad, 

CA, USA). Fetal bovine serum was purchased from Gemini Bio‐Products (West 

Sacramento, CA, USA). DC protein assay was obtained from Bio‐Rad (Hercules, CA, 

USA). A polyclonal rabbit anti‐β‐amyloid precursor protein was purchased from Zymed 

Laboratories (Carlsbad, CA, USA). 

 

83

Cell culture ‐ Human neuroblastoma SH‐SY5Y cells were stably transfected to express 

wild‐type and H63D HFE forms as previously reported along with a vector alone control 

(Wang et al., 2004). We have previously reported that these cells were chosen because 

endogenous expression of HFE in these cells could not be detected.  The transfected cells 

were maintained in DMEM/F12 media supplemented with 10% FBS, 1% antibiotics (pen‐

strep‐glutamine), 1x nonessential amino acids, and 1.8g/L sodium bicarbonate. Cells 

were differentiated with 10 μM all‐trans retinoic acid (Sigma‐Aldrich) over six days 

(Haque et al., 1999). To evaluate cellular iron effects, cells were treated with ferric 

ammonium citrate (FAC) or desferrioxamine (DFO) over 48 hours (Lee et al., 2006).  

 

Western blot ‐ Cells lysates were obtained as described above. Twenty‐five μg total 

protein was equally separated by electrophoresis in a 4‐20% 12‐well Criterion gel (Bio‐

Rad, Hercules, CA). Protein was then transferred to a nitrocellulose membrane and 

blocked for 1 hr at room temperature in TBS‐T with 5% nonfat milk or 1.5% BSA 

(phosphorylated protein detection). Membranes were probed with primary antibodies in 

TBS‐T with 5% nonfat milk overnight at 4°C. The membranes were incubated 

respectively with rabbit polyclonal anti‐β‐amyloid precursor protein (1:500) and β‐actin 

(1:2500). HRP‐conjugated secondary antibodies were added in 5% nonfat milk for 1 hr at 

room temperature. Protein signals were obtained by chemiluminescence and visualized 

by CCD camera. All western blot experiments were repeated at least twice with a 

minimum of four different cultures per genotype per experiment, resulting in a total of 

84

eight samples for analysis. The bands on the western blot were quantified by 

densitometry using Fuji MultiGauge analysis software. 

 

Enzyme linked immunoabsorbant assay (ELISA) ‐ Cells were lysed with RIPA buffer 

supplemented with 1% Triton X‐100 and protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, St. 

Louis, MO). Phosphatase inhibitor (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) was included in cell 

lysis buffer for phosphorylation protein detection. Cells extracts were spun at 8,000 × g 

for 10 min. Total protein levels were determined by Bio‐Rad DC protein assay. A 

monoclonal antibody specific for total APP was coated onto the wells of the microtiter 

strips provided (Invitrogen (BioSource)). Standards of known total APP protein were 

processed to achieve a standard curve to determine the specific amount of total APP 

protein in the unknown HFE cell samples. The ELISA assay plate was read at 450nm. 

The ELISA experiment was performed using samples in triplicate per genotype and/ or 

per treatment at two dilution concentrations along with the known standards for the 

specific proteins, resulting in a total of six samples for analysis.  

 

Secretase Activity Assays ‐ The enzymatic activity of the  ‐, β‐, and γ‐secretases in the cell 

lysates were detected spectrofluorometrically using secretase activity kits (R&D 

Systems). The protein sample (50 μL, 200 μg total protein) is added to a secretase specific 

( ‐, β‐, or γ‐) APP peptide conjugated to the reporter molecules EDANS and DABCYL; 

all samples were run in triplicate. In the un‐cleaved form, the fluorescent emissions from 

85

EDANS are quenched by the physical proximity of the DABCYL moiety. Cleavage of the 

peptide by the secretase physically separates the EDANS and DABCYL, allowing for the 

release of the fluorescent signal. The level of the secretase enzymatic activity in the 

sample is proportional to the fluorometric reaction. Excitation (345 nm) and emission 

(495 nm) filters were used to determine the secretase activity using a fluorescent 

microplate reader (Spectra Max Gemini, Molecular Devices).  

 

Statistical analysis ‐ The data were analyzed by one‐way ANOVA. Differences among the 

means were considered statistically significant when the p value was <0.05. If overall p 

<0.05, Tukey’s Multiple Comparison post hoc analysis was performed. Data are 

presented as the mean ± S.E. GraphPad Prism software (version 4.0) was utilized to 

perform the statistical analysis. 

 

Results 

  We measured total APP levels in human neuroblastoma SH‐SY5Y cells stably 

transfected with HFE variants to evaluate the role of HFE in APP production. APP levels 

were not different in cells expressing wild type or H63D HFE compared to each other 

(Figure 2.1). The absence of HFE in the vector transfection control cells resulted in 

approximately a 50% reduction in APP (p<0.01) compared to wild type HFE cells (Figure 

1). Also, there was no difference between vector and non‐transfected cells (data not 

86

shown). These data suggest that HFE protein expression may play a role in up‐

regulating APP by another mechanism other than cellular iron regulation. 

  APP conjugated reporter molecules for the specific (α‐, β‐, and γ‐) secretase 

complexes were used to determine secretase activity based on the release of a 

fluorescence signal when cleavage occurs. Upon performing this experiment, there were 

no changes in any of the amyloid secretase activities among the vector, wild type HFE, 

or the H63D HFE variant cells (Figure 2.2). 

We hypothesized that the cellular iron status would impact α‐secretase activity 

based on other studies showing that iron influences α‐secretase activity (Bodovitz et al., 

1995). To evaluate if cellular iron could impact α‐secretase activity, we treated the wild 

type HFE cells with iron. A 10 μM dose of iron increased (p<0.001) α‐secretase activity 

and 30 μM iron increased (p<0.01) α‐secretase activity as well (Figure 2.3A). Since an 

effect was seen, we treated the H63D expressing cells with desferrioxamine (DFO) to see 

if α‐secretase activity could be decreased by removing iron. Removing iron did not alter 

α‐secretase activity (Figure 2.3A). To determine if cellular iron levels could influence β‐ 

and γ‐secretase activity, we performed similar experiments since there is not published 

literature showing that iron does or does not impact their cellular activity. There were 

no changes in β‐secretase activity with either iron exposure or removal of iron (Figure 

3B). γ‐secretase activity also was not affected by iron treatment or iron chelation (Figure 

2.3C). 

87

  An additional genetic or environmental factor that can increase cellular iron 

intake in cells already expressing the H63D allele may result in additional cellular 

consequences based on the cellular stress that may occur. Increased oxidative stress has 

been shown to alter β‐ and γ‐secretase activity resulting in increased production of Aβ 

peptides (Vassar et al., 1999; Zhang et al., 2006). The H63D HFE cells possess a higher 

baseline of oxidative stress with respect to cells expressing WT HFE based on alterations 

in mitochondrial membrane potential and lipid peroxidation (Lee et al., 2006). To 

determine if β‐ and γ‐secretase activity could be impacted by increased cell stress, we 

treated the H63D cells with increasing amounts of iron. Increasing amounts of iron did 

not alter the activity of either β‐ or γ‐secretase (Figure 2.4). Alpha‐secretase activity was 

measured as well and did not result in a change (Figure 2.4). 

  Despite HFE polymorphism expression not impacting any of the amyloid 

secretase activities (Figure 2.2), total APP levels were increased in cells expressing HFE 

protein with respect to the vector control (Figure 2.1). With the increase in APP 

expression in WT and H63D HFE cells, we hypothesized that Aβ production would 

increase due to more APP availability for cellular processing. To test this hypothesis, we 

measured APP C‐terminal fragments as an indirect measure of Aβ generation. C83 is the 

fragment remaining after α‐secretase cleavage and the C99 fragment is indicative of β‐

secretase processing of APP (Hardy and Higgins, 1992). The data show that there is not a 

statistically significant difference of APP C83 expression among cell lines (Figure 2.5). 

APP C99 levels were weakly detected by the western blot method and could not be 

88

quantified. In fact, numerous reports have shown that endogenous Aβ production in the 

human SH‐SY5Y neuroblastoma cell lines is minimal without transfecting a familial AD 

mutation into the cells (Peraus et al., 1997; Takeda et al., 2004).

 

Discussion 

Aging is primarily associated with the onset of AD, but is not required as familial 

cases of AD impact younger individuals and there are older people that do not succumb 

to the dementia. Thus, there must be additional genetic and/or environmental factors 

that can influence sporadic AD onset and progression. Biometals have gained 

considerable interest in neurodegenerative disease because they are required to perform 

a vast array of cellular functions and impact key pathological proteins (Zecca et al., 

2004).  Brain iron levels are known to increase throughout aging (Connor and Menzies, 

1995; Bartzokis et al., 2004) and genes that influence cellular iron homeostasis could be 

an additional contributor to AD pathology. HFE is an iron regulatory gene that has been 

examined in epidemiological studies to determine their association with AD (Connor 

and Lee, 2006). Yet, the cellular effects of HFE variants on neuronal cell processes that 

could affect AD are not known. 

Amyloid homeostasis is thought to be disrupted in AD due to the excessive 

accumulation of Aβ plaques found throughout the brain cortices (Masters et al., 1985). 

APP yields Aβ peptides that are available to aggregate and generate the hallmark senile 

plaques (Hardy and Higgins, 1992; Mattson, 1997). Iron has been shown to directly 

89

regulate the production of APP through a novel 5’ IRE in APP mRNA (Rogers et al., 

2002); hence we hypothesized that the HFE variant, H63D, would increase APP 

synthesis. Our hypothesis was not supported as there was not a difference in total APP 

expression between cells expressing the wild type or H63D allele. Given the IRP/IRE 

mechanism requirement for regulating the translation of target proteins like APP, we 

considered this. A previous study performed by our group showed that total and active 

IRP/IRE binding was not significantly different between the WT and H63D cells (Lee et 

al., 2006) suggesting that the difference in cellular iron levels did not impact IRP/IRE 

mechanism supporting our findings. It would be valuable to determine APP levels in 

another model system expressing different HFE variants to better evaluate the effect of 

HFE on APP production. 

Furthermore, it is important to note that APP levels increased in WT and H63D 

HFE expressing cells compared to the vector (transfection control) cell line that does not 

express HFE. The finding that the presence of HFE increased APP is intriguing. This 

finding suggests an unknown signaling mechanism that may directly link HFE to APP at 

the cellular membrane regardless of cellular iron status. HFE has been suggested to play 

a role in innate immunity due to the homology it shares with other class I major 

histocompatibility proteins (Rohrlich et al., 2005). A histological analysis of post‐mortem 

AD brains revealed pronounced expression of HFE throughout the brain vasculature 

and surrounding the hallmark pathological markers Aβ and NFTs (Connor et al., 2001). 

These data support the notion that HFE may indeed play a role in immune responses 

90

since HFE is not highly expressed in healthy brains. Also, a study in a mouse BV‐2 

microglia cell line showed that HFE expression increased with Aβ peptide exposure (Lee 

and Connor, 2005) suggesting that HFE protein responds to cellular stress. APP 

synthesis has been shown to be impacted by cellular stress as well (Huang et al., 2004); 

including the interleukin‐1 acute box in its mRNA (Rogers et al., 1999; Rogers et al., 

2002).   

The cellular activity of all the secretases in all of the pathways were determined 

in cells expressing the HFE variants. There were no changes in secretase activity for any 

of the secretases involved in APP processing. This was surprising given the increased 

cellular iron and oxidative stress associated with expressing the H63D variant. 

Iron has been shown to impact α‐secretase activity (Bodovitz et al., 1995) and it 

would by reasonable to consider that HFE variants should have altered α‐secretase 

activity. To further examine the cellular effects of iron on α‐secretase activity, we treated 

the WT cells with increasing amounts of iron. Indeed, iron treatments elevated α‐

secretase activity. However, the removal of iron by chelation in cells expressing H63D 

did not have an effect on α‐secretase activity. Subsequent experiments treating WT HFE 

cells with iron and H63D cells with DFO did not affect either β‐ or γ‐secretase activity. 

Moreover, the idea that an environmental factor like diet could impact gene expression 

prompted us to treat H63D variant cells with increasing levels of iron. Increasing iron 

exposure in cells expressing the H63D polymorphism did not affect α‐, β‐, or γ‐secretase 

activity. We conclude that HFE variants do not impact amyloid secretase activity in our 

91

cellular model and that cellular iron levels may influence α‐secretase activity based on a 

specific cellular iron concentration. 

  Even though amyloid secretase activity was not altered by the expression of HFE 

variants, important knowledge was gained, especially the fact that cellular iron does not 

directly impact their function. The increase in APP with wild type and H63D HFE 

expression suggests there may be more APP available to be processed to generate in an 

in increase in downstream proteins like Aβ. Therefore, we measured the C‐terminal 

fragments to determine the impact of secretase activity on APP. C83, the fragment 

remaining after α‐secretase cleavage, was not changed in vector or H63D cells compared 

to cells expressing the WT HFE variant. C99 expression levels were undetectable by 

immunoblotting, which would have indicated the product of β‐secretase cleavage. The 

important caveat regarding this data is that an increase in total APP does not necessarily 

result in increased levels of soluble APPα or Aβ generation. 

  The most significant finding from this study is that APP levels increase with HFE 

expression regardless of the HFE variant. Our hypothesis that the H63D would result in 

increased APP was not supported since the H63D variant did not result in an elevation 

in APP synthesis, which highlights that HFE may have another cellular mechanism that 

can influence APP production independent of cellular iron regulation. Conversely, 

cellular iron is very important to amyloid regulation at the level of APP synthesis via the 

5’UTR IRE (Rogers et al., 2002) and Aβ plaque formation through binding Aβ facilitating 

fibril formation leading to senile plaque formation (Liu et al., 2006). Future studies 

92

should incorporate our findings and integrate them with cellular iron effects on amyloid 

regulation shown by others to understand the impact of HFE variants on amyloid 

homeostasis. 

93

 

Figure 2.1: Total APP levels in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells. Expression of total APP protein was measured in an HFE polymorphism stably transfected SH‐SY5Y cell line by ELISA. Total APP levels were significantly decreased in vector cells (p<0.01) compared to WT HFE expressing cells. There was no difference in total APP between cells expressing the H63D or WT variant. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E.M. The symbol ** (p<0.01) indicates a significance difference from wild type HFE. 

Total APP

Vector WT H63D0

25

50

75

100

***

% D

iffer

ence

of c

ontr

ol

94

Figure 2.2: Amyloid secretase activity in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells. Alpha (α)‐, beta (β), and gamma (γ)‐secretase enzymatic activity was determined using DNA probe‐based secretase activity assays. α‐Secretase activity was unaffected in any of the cell types compared to cells expressing the WT HFE variant. There was no change in β‐secretase activity either among the vector and HFE variant cells. γ‐secretase activity did not change with expression of HFE expressing wild type or H63D variants. These activity assays were performed with a minimum of four different cultures per genotype. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis if applicable. Data are represented as mean ± S.E.M. 

Alpha Secretase Activity

Vector WT H63D0

250

500

750

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uore

scen

ce @

495

nm

Beta Secretase Activity

Vector WT H63D0

250

500

750

1000En

zym

atic

Act

ivity

Fluo

rsce

ne @

495

nm

Gamma Secretase Activity

Vector WT H63D0

25

50

75

100

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

95

Figure 2.3: Cellular iron effects on amyloid secretase activity. Increasing amounts of ferrous ammonium citrate (FAC) to cells expressing wild type HFE, and increasing amounts of the iron chelator desferrioxamine (DFO) to cells expressing H63D HFE, and measured α‐, β‐, and γ‐secretase activity by secretase‐specific activity assays. Iron treatments increased α‐secretase activity at 10 μM (p<0.01) and 30 μM (p<0.01) compared to the non‐treated baseline WT HFE control levels (A). DFO exposure in H63D variant cells did not impact α‐secretase activity (A). There were no changes in β‐secretase activity with iron treatments in cells expressing the WT HFE variant (B). The removal of iron by chelation in H63D variant cells did not change β‐secretase activity either (B). γ‐secretase activity was not altered by iron or DFO treatments in wild type or H63D HFE variant cells, respectively (C). Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E.M. The symbols ** (p<0.01) and *** (p<0.001) indicates a significance difference from the respective non‐treated baseline control. 

96

A.

B.

C.

Alpha Secretase Activity

WT

WT 10 µM

iron

WT 30 µM

iron

0

250

500

750 *** **En

zym

atic

Act

ivity

Fluo

rsce

ne @

495

nm

Alpha Secretase Activity

H63D

H63D 5

µM D

FO

H63D 10

µM D

FO0

250

500

750

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

Beta Secretase Activity

WT

WT 10 µM

iron

WT 30 µM

iron

0

200

400

600

800

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

Beta Secretase Activity

H63D

H63D 5

µM D

FO

H63D 10

µM D

FO0

250

500

750En

zym

atic

Act

ivity

Fluo

rsce

ne @

495

nm

Gamma Secretase Activity

WT

WT 10 µM

iron

WT 30 µM

iron

0

25

50

75

100

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

Gamma Secretase Activity

H63D

H63D 5

µM D

FO

H63D 10

µM D

FO0

25

50

75

100

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

97

Figure 2.4: Impact of cellular iron exposure on amyloid secretase activity in H63D variant cells. H63D variant cells have a higher baseline of cellular iron compared to cells expressing WT HFE, therefore, additional iron exposure may impact amyloid secretase activity. We further challenged the H63D cells by treating them with iron in the form of ferric ammonium citrate (FAC). There were no effects of FAC on α‐, β‐, or γ‐secretase activity in the cells expressing the H63D variant. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis if applicable. Data are represented as mean ± S.E.M.   

Alpha Secretase Activity

H63D

H63D 10

µM ir

on

H63D 30

µM ir

on0

250

500

750

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

Beta Secretase Activity

H63D

H63D 10

µM ir

on

H63D 30

µM ir

on0

250

500

750En

zym

atic

Act

ivity

Fluo

rsce

ne @

495

nm

Gamma Secretase Activity

H63D

H63D 10

µM ir

on

H63D 30

µM ir

on0

25

50

75

100

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uors

cene

@ 4

95nm

98

Figure 2.5: C83 APP levels in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells. The intracellular C‐terminal fragment, C83, of APP was measured in an HFE polymorphism stably transfected SH‐SY5Y cell line by western blot. There was a not a statistically significant change in the expression of C83 in vector or H63D variant cells compared to cells expressing the wild type HFE variant. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis if applicable. Data are represented as mean ± S.E.M. C99 levels were undetectable for quantification.  

 

Vector WT H63D

APP (C83)

β- actin

APP (C99)

β- actin

Vector WT H63D

Undetectable C99 protein

levels for quantification

APP C83

Vector WT H63D0

20

40

60

80

100

120

% D

iffer

ence

of c

ontr

ol

99

References 

Barnham KJ, McKinstry WJ, Multhaup G, Galatis D, Morton CJ, Curtain CC, Williamson 

NA, White AR, Hinds MG, Norton RS, Beyreuther K, Masters CL, Parker MW, 

Cappai R (2003) Structure of the Alzheimerʹs disease amyloid precursor protein 

copper binding domain. A regulator of neuronal copper homeostasis. J Biol 

Chem 278:17401‐17407. 

Bartzokis G, Tishler TA, Shin IS, Lu PH, Cummings JL (2004) Brain ferritin iron as a risk 

factor for age at onset in neurodegenerative diseases. Ann N Y Acad Sci 

1012:224‐236. 

Bodovitz S, Falduto MT, Frail DE, Klein WL (1995) Iron levels modulate alpha‐secretase 

cleavage of amyloid precursor protein. J Neurochem 64:307‐315. 

Borghi R, Patriarca S, Traverso N, Piccini A, Storace D, Garuti A, Cirmena G, Odetti P, 

Tabaton M (2006) The increased activity of BACE1 correlates with oxidative 

stress in Alzheimerʹs disease. Neurobiol Aging. 

Bush AI (2003) The metallobiology of Alzheimerʹs disease. Trends Neurosci 26:207‐214. 

Connor JR, Menzies SL (1995) Cellular management of iron in the brain. J Neurol Sci 134 

Suppl:33‐44. 

Connor JR, Lee SY (2006) HFE mutations and Alzheimerʹs disease. J Alzheimers Dis 

10:267‐276. 

Connor JR, Menzies SL, St Martin SM, Mufson EJ (1992a) A histochemical study of iron, 

transferrin, and ferritin in Alzheimerʹs diseased brains. J Neurosci Res 31:75‐83. 

100

Connor JR, Snyder BS, Beard JL, Fine RE, Mufson EJ (1992b) Regional distribution of 

iron and iron‐regulatory proteins in the brain in aging and Alzheimerʹs disease. J 

Neurosci Res 31:327‐335. 

Connor JR, Milward EA, Moalem S, Sampietro M, Boyer P, Percy ME, Vergani C, Scott 

RJ, Chorney M (2001) Is hemochromatosis a risk factor for Alzheimerʹs disease? J 

Alzheimers Dis 3:471‐477. 

Feder JN, Penny DM, Irrinki A, Lee VK, Lebron JA, Watson N, Tsuchihashi Z, Sigal E, 

Bjorkman PJ, Schatzman RC (1998) The hemochromatosis gene product 

complexes with the transferrin receptor and lowers its affinity for ligand binding. 

Proc Natl Acad Sci U S A 95:1472‐1477. 

Grbovic OM, Mathews PM, Jiang Y, Schmidt SD, Dinakar R, Summers‐Terio NB, Ceresa 

BP, Nixon RA, Cataldo AM (2003) Rab5‐stimulated up‐regulation of the 

endocytic pathway increases intracellular beta‐cleaved amyloid precursor 

protein carboxyl‐terminal fragment levels and Abeta production. J Biol Chem 

278:31261‐31268. 

Haque N, Tanaka T, Iqbal K, Grundke‐Iqbal I (1999) Regulation of expression, 

phosphorylation and biological activity of tau during differentiation in SY5Y 

cells. Brain Res 838:69‐77. 

Hardy JA, Higgins GA (1992) Alzheimerʹs disease: the amyloid cascade hypothesis. 

Science 256:184‐185. 

101

Huang X, Moir RD, Tanzi RE, Bush AI, Rogers JT (2004) Redox‐active metals, oxidative 

stress, and Alzheimerʹs disease pathology. Ann N Y Acad Sci 1012:153‐163. 

Lee SY, Connor JR (2005) Regulation of Hfe by stress factors in BV‐2 cells. Neurobiol 

Aging 26:803‐812. 

Lee SY, Patton SM, Henderson RJ, Connor JR (2006) Consequences of expressing 

mutants of the hemochromatosis gene (HFE) into a human neuronal cell line 

lacking endogenous HFE. Faseb J. 

Liu G, Huang W, Moir RD, Vanderburg CR, Lai B, Peng Z, Tanzi RE, Rogers JT, Huang 

X (2006) Metal exposure and Alzheimerʹs pathogenesis. J Struct Biol 155:45‐51. 

Masters CL, Simms G, Weinman NA, Multhaup G, McDonald BL, Beyreuther K (1985) 

Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc 

Natl Acad Sci U S A 82:4245‐4249. 

Mattson MP (1997) Cellular actions of beta‐amyloid precursor protein and its soluble 

and fibrillogenic derivatives. Physiol Rev 77:1081‐1132. 

Multhaup G (1997) Amyloid precursor protein, copper and Alzheimerʹs disease. Biomed 

Pharmacother 51:105‐111. 

Nixon RA (2005) Endosome function and dysfunction in Alzheimerʹs disease and other 

neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging 26:373‐382. 

Peraus GC, Masters CL, Beyreuther K (1997) Late compartments of amyloid precursor 

protein transport in SY5Y cells are involved in beta‐amyloid secretion. J Neurosci 

17:7714‐7724. 

102

Pulliam JF, Jennings CD, Kryscio RJ, Davis DG, Wilson D, Montine TJ, Schmitt FA, 

Markesbery WR (2003) Association of HFE mutations with neurodegeneration 

and oxidative stress in Alzheimerʹs disease and correlation with APOE. Am J 

Med Genet B Neuropsychiatr Genet 119B:48‐53. 

Quintana C, Bellefqih S, Laval JY, Guerquin‐Kern JL, Wu TD, Avila J, Ferrer I, Arranz R, 

Patino C (2006) Study of the localization of iron, ferritin, and hemosiderin in 

Alzheimerʹs disease hippocampus by analytical microscopy at the subcellular 

level. J Struct Biol 153:42‐54. 

Rogers JT, Leiter LM, McPhee J, Cahill CM, Zhan SS, Potter H, Nilsson LN (1999) 

Translation of the alzheimer amyloid precursor protein mRNA is up‐regulated 

by interleukin‐1 through 5ʹ‐untranslated region sequences. J Biol Chem 274:6421‐

6431. 

Rogers JT, Randall JD, Eder PS, Huang X, Bush AI, Tanzi RE, Venti A, Payton SM, 

Giordano T, Nagano S, Cahill CM, Moir R, Lahiri DK, Greig N, Sarang SS, 

Gullans SR (2002) Alzheimerʹs disease drug discovery targeted to the APP 

mRNA 5ʹuntranslated region. J Mol Neurosci 19:77‐82. 

Rohrlich PS, Fazilleau N, Ginhoux F, Firat H, Michel F, Cochet M, Laham N, Roth MP, 

Pascolo S, Nato F, Coppin H, Charneau P, Danos O, Acuto O, Ehrlich R, 

Kanellopoulos J, Lemonnier FA (2005) Direct recognition by alphabeta cytolytic T 

cells of Hfe, a MHC class Ib molecule without antigen‐presenting function. Proc 

Natl Acad Sci U S A 102:12855‐12860. 

103

Sayre LM, Perry G, Harris PL, Liu Y, Schubert KA, Smith MA (2000) In situ oxidative 

catalysis by neurofibrillary tangles and senile plaques in Alzheimerʹs disease: a 

central role for bound transition metals. J Neurochem 74:270‐279. 

Smith MA, Harris PL, Sayre LM, Perry G (1997) Iron accumulation in Alzheimer disease 

is a source of redox‐generated free radicals. Proc Natl Acad Sci U S A 94:9866‐

9868. 

Takeda K, Araki W, Tabira T (2004) Enhanced generation of intracellular Abeta42 

amyloid peptide by mutation of presenilins PS1 and PS2. Eur J Neurosci 19:258‐

264. 

Vassar R et al. (1999) Beta‐secretase cleavage of Alzheimerʹs amyloid precursor protein 

by the transmembrane aspartic protease BACE. Science 286:735‐741. 

Wang XS, Lee S, Simmons Z, Boyer P, Scott K, Liu W, Connor J (2004) Increased 

incidence of the Hfe mutation in amyotrophic lateral sclerosis and related 

cellular consequences. J Neurol Sci 227:27‐33. 

Zecca L, Youdim MB, Riederer P, Connor JR, Crichton RR (2004) Iron, brain ageing and 

neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci 5:863‐873. 

Zhang M, Haapasalo A, Kim DY, Ingano LA, Pettingell WH, Kovacs DM (2006) 

Presenilin/gamma‐secretase activity regulates protein clearance from the 

endocytic recycling compartment. Faseb J 20:1176‐1178. 

 

 

104

Chapter 3

The H63D HFE Gene Variant Promotes Activation of the Intrinsic

Apoptosis Pathway with Aβ Peptide Exposure

Abstract

Numerous epidemiological studies suggest that the expression of the HFE allelic 

variant H63D may be a risk factor or genetic modifier for Alzheimer’s disease (AD). The 

H63D variant alters cellular iron homeostasis and increases baseline oxidative stress. 

The elevated stress milieu, we have proposed, may alter cellular responses to genetic 

and environmental determinants of AD. Accumulation of beta amyloid peptides (Aβ) is 

one of the most prominent pathogenic characteristics of AD. Several studies have 

demonstrated that Aβ can induce neuronal cell death through apoptosis. In this study, 

we provide evidence that an Aβ25–35 fragment, which contains the cytotoxic sequence of 

the amyloid peptide, activates the intrinsic apoptosis pathway in SH‐SY5Y human 

neuroblastoma cells expressing the HFE allelic variant H63D to a greater extent than in 

cells with wild type HFE. Specifically, Aβ25–35 peptide exposure significantly induced Bax 

translocation from the cytosol to the mitochondria in H63D expressing cells compared to 

WT cells. This translocation was associated with increased cytochrome C release from 

mitochondria and an increase in caspase‐9 and caspase‐3 activation in H63D cells. 

Consequently, there is increased apoptosis in cells expressing the H63D variant opposed 

105

to cells expressing wild type HFE. We also found increased amyloid precursor protein 

(APP) and Aβ peptide in the mitochondrial compartment, as well as increased 

mitochondrial stress in H63D expressing cells compared to WT cells. These findings 

support our hypothesis that the presence of the HFE H63D allele enables factors that 

trigger neurodegenerative processes associated with AD and predisposes cells to 

cytotoxcity.  These studies reveal a mechanism, activation of the mitochondrial apoptotic 

pathway, by which HFE H63D could serve as a disease modifier for AD. 

 

Introduction 

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease that afflicts the elderly 

resulting in memory loss and decline in cognitive abilities. AD histopathology is 

characterized by the accumulation of amyloid‐β (Aβ) plaques and intracellular 

neurofibrillary tangles (Nielsen et al., 1995; Jellinger and Bancher, 1998; Trojanowski and 

Lee, 2000; Jellinger, 2002). An important pathological finding of AD is the accumulation 

of iron in the same anatomical brain regions characterized by Aβ deposition (Zecca et al., 

2004). Although the pathogenesis of AD is still unclear, several findings suggest that 

altered iron metabolism in the brain contributes to changes in amyloid metabolism. Iron 

has been shown to impact Aβ plaque formation and amyloid processing, as well as to 

enhance neurotoxicity of Aβ (Lovell et al., 1998; Huang et al., 2000; Rottkamp et al., 

2001). Free iron also catalyzes the conversion of superoxide and hydrogen peroxide into 

hydroxyl radicals, which promote oxidative stress leading to cell death (Bishop et al., 

106

2002).  These observations make a compelling argument that iron status in the brain is a 

contributing factor to the pathogenesis of AD. It is logical to propose therefore, that 

mutations or variants in genes associated with maintaining iron homeostasis may be 

more prevalent in AD.  HFE is a protein that is associated with cellular iron uptake. The 

mutant H63D protein is associated with elevated intracellular iron levels, which 

enhances cell stress (Limdi and Crampton, 2004; Lee et al., 2007b).  

Magnetic resonance imaging has also shown increased iron accumulation in the 

brains  of  individuals with  hereditary  hemochromatosis, who  express HFE mutations 

(Nielsen et al., 1995; Berg et al., 2000). Several studies have investigated the relationship 

between  HFE  genetic  variants  and  neurodegenerative  diseases  including  AD, 

amyotrophic  lateral  sclerosis,  and  Parkinson’s  disease  because  loss  of  brain  iron 

homeostasis has  been  associated with proposed mechanisms  of neurodegeneration  in 

each  of  these  disorders  (Schenck  and  Zimmerman,  2004; Wallis  et  al.,  2008).  Several 

epidemiological  studies  have  found  an  association  between  HFE  variants  and  AD, 

however some studies did not report a genetic association with AD cases (Moalem et al., 

2000; Sampietro et al., 2001; Candore et al., 2003; Combarros et al., 2003; Pulliam et al., 

2003; Berlin et al., 2004; Connor and Lee, 2006; Guerreiro et al., 2006; Avila‐Gomez et al., 

2008; Percy et al., 2008; Alizadeh et al., 2009). Inconsistency in the populations studied, 

and the variability of iron availability in the environment (e.g. soil content, diet, water) 

are strongly suggestive of a gene/environment interaction for a risk factor.   

107

Thus, we have developed cell culture models to examine the role that HFE might 

play  in AD pathology mechanisms. Our hypothesis  for  these studies  is  that HFE gene 

variants  create  a  permissive  intracellular milieu  that  enables  pathogenic  events.  Aβ  

toxicity  is  theorized  to  play  a major  role  in AD  pathogenesis  because  it  is    toxic  to 

neurons  (Hardy and Selkoe, 2002). Aβ peptides can  increase  the generation of reactive 

oxygen  species  (ROS),  as well  as  evoke  a  cascade  of  oxidative  damage    in    neurons 

(Miranda et al., 2000) resulting in the induction of  caspase‐3‐like activity and cell death 

by apoptosis (Richardson et al., 1996; Nicotera et al., 1999; Fifre et al., 2006). Moreover, it 

has been reported that Aβ induces neuronal apoptosis. Aβ can promote translocation of 

pro‐apoptotic members  of  the Bcl‐2 protein  family  (for  example, Bak  and  bax)  to  the 

mitochondria.  Bcl‐2  family  proteins  can  stimulate  the  opening  of  voltage  dependent 

anion channels, (VDAC), and cause release of cytochrome c into the cytosol. This latter is 

a key initiation step in the apoptotic process (Sola et al., 2002) activating caspase‐9 and 

effector caspase‐3 (Ferreiro et al., 2007). Finally,  in support of the hypothesis that there 

will be an HFE association, the addition of Aβ peptide and exogenous iron significantly 

promoted neuronal cell death via  the apoptotic pathway  (Kuperstein and Yavin, 2003; 

Wallis et al., 2008). 

 

Materials and Methods 

Reagents ‐ Cell culture reagents including DMEM/F12, DMEM, pen/strep/glutamine and 

Geneticin were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fetal bovine serum 

108

was purchased from Gemini Bio‐Products (West Sacramento, CA, USA). Hydrogen 

peroxide/peroxidase assay kit was ordered from Molecular Probes (Eugene, OR, USA). 

Reactive oxygen species were from Calboichem (CA, USA), respectively. Mitochondria 

activity assay (Cytochrome c oxidase activity assay kit) was purchased from BioChain 

Institute (Hayward, CA, USA). Aβ25‐35 and β‐actin monoclonal antibody and beta tubulin 

antibody be were ordered from Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). Caspase‐9, Caspase‐8, 

Bax, cytochrome c, cytochrome oxidase subunit IV antibodies were ordered from Cell 

Signaling Technology (Beverly, MA, USA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, 

USA), Upstate (Temecula, CA, USA), Clontech (Mountain View, CA, USA) and 

Molecular Probes (Eugene, OR, USA) respectively. Amyloid precursor protein antibody 

was ordered from Signet (Emeryville, CA, USA).Secondary anti‐rabbit antibody or anti‐

mouse antibody and ECL detection kits were obtained from Amersham Pharmacia 

Biotech (Piscataway, NJ, USA). Apoptosis assay kit was purchased from Molecular 

Probes. Caspase‐3 Fluorometric assay was ordered from R&D Systems (Minneapolis, 

MN, USA). Human beta amyloid 1‐42 colorimetric ELISA kit was purchased from 

Biosource (Camarillo, CA, USA). Nitrocellulose membrane was ordered from Pall Life 

Sciences (Pensacola, FL, USA), RIPA buffer and phosphates inhibitor (Sigma Aldrich, St. 

Louis, MO). Cell fractionation buffer was purchased from Clontech (Mountain View, 

CA, USA). BCA protein assay (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA). All of the other 

chemicals used were purchased from Sigma Co (St. Louis, MO, USA). 

 

109

Cell Culture ‐ SH‐SY5Y human neuroblastoma cell lines were obtained from American 

Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Human neuroblastoma SH‐SY5Y cells 

were stably transfected to express wild‐type or H63D HFE as previously reported (Lee et 

al., 2007b). Vector alone stably transfected cells were used as a control; however the 

SHSY5Y cells were chosen because they did not express detectable levels of HFE protein 

or mRNA (Lee paper) and thus the appropriate control for the H63D is the wt HFE cells. 

The transfected cells were maintained in DMEM/F12 media supplemented with 10% 

FBS, 1% antibiotics (pen‐strep‐glutamine), 1x nonessential amino acids, and 1.8g/L 

sodium bicarbonate at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere. 

 

Cell  viability  assay  ‐  Cells  were  plated  at  a  density  (2x104  cells/well)  in  96‐well  flat‐

bottomed microtiter plates and then cultured for 48 hours (h). After 48 h, the cells were 

exposed to Aβ25‐35 peptides at the concentrations of 10, 20 and 50 μM for 24 h. After 24 h 

treatment, 50 μl of 2 mg/ml MTT (Sigma Co St. Louis, MO, USA) was added to 200 μl of 

medium present in each well and incubated at 37°C for 2 h. After the incubation period, 

an aliquot  (220 μL) of  the resulting solution was removed  from each well  followed by 

the  addition  of  150 μL  dimethyl  sulfoxide.  After  the  precipitate  in  each  well  was 

resuspended  on  a  microplate  mixer  for  10 min,  an  optical  density  (OD)  reading  at 

540 nm  was  measured  using  a  plate  reader  (Spectramax  340PC).  All  results  were 

normalized  to OD values measured  from an  identically  conditioned well without  cell 

culture. 

110

 

Preparation of cell  lysates  ‐ After Aβ  treatment  (4 h  for caspase‐8, bax and cytochrome c 

and 9 h for caspase‐9), the cells were washed twice in cold PBS and were then removed 

by using cell scraper. The cell suspension was centrifuged at 300 x g for 3 min. The cell 

pellets were resuspended in lysis buffer (1% Triton X‐100, 1% phosphates inhibitor, 1% 

protease inhibitor cocktail and RIPA buffer) and incubated for 10 min. The lysate were 

cleared  by  centrifugation  at  10,000xg  for  20 min  at  4°C.  The  supernatant  was  then 

assayed  for  caspase‐8  and  caspase‐9.  For  evaluation  of  cytochrome  c,  bax  and 

cytochrome c oxidase subunit IV (COX IV) levels, the cells suspension were centrifuged 

at 300 x g for 3 min and then the cell pellets were resuspended in a fractionation buffer 

mix,  left  on  ice  for  10 min  and  homogenized  by  50  strokes  in  an  ice‐cold  Dounce 

homogenizer. The cells extract was centrifuged at 700 x g for 10 min at 4°C, resulting in a 

pellet  containing  nuclei  and  supernatant  retaining  mitochondria  and  cytosol.  The 

supernatant was further centrifuged at 10,000 x g for 25 min at 4°C to collect the pellet 

enriched‐mitochondria  fraction.  The  resulting  supernatant  containing  the  cytosolic 

fraction was  collected  and  the  enriched mitochondria  pellet was  lysed  by  incubation 

with  fractionation  buffer mix.  The  protein  concentrations  were  determined  by  BCA 

protein assay. 

 

Immunoblotting ‐ For western blot analysis, 50 μg of total protein from each sample was 

performed  on  gradient  gels  4–20%  (Bio‐Rad, Hercules,  CA. USA)  and  transferred  to 

111

nitrocellulose  membranes.  The  membranes  were  blocked  with  5%  skim  milk  and 

incubated  with  specific  antibodies  for  caspase‐8  (1:200),  cleaved  (activated  form) 

caspase‐9  (1:1000),  cytochrome  c  (1:100),  bax  (1:2000),  cox  (1:1000), APP  (1:1000)  and 

beta‐tubulin (1:2000).  The membranes were washed with Tris buffered saline containing 

0.05% Tween‐20 (TBST) and processed with an HRP‐conjugated anti‐rabbit antibody or 

anti‐mouse antibody for ECL detection. The probing for internal control molecules such 

as  cytochrome  c  oxidase  subunit  IV  (COX)  (1:1000)  and  actin  (1:3000)  was  always 

performed by re‐hybridization after stripping the primary antibodies. 

 

Capase‐3 activity assay  ‐ A caspase‐3  fluorometric assay kit was utilized. Briefly, after 8 

and 12 h Aβ treatment the cells were collected by centrifugation at 300 x g for 3 min. The 

cell  pellets  were  lysed  upon  addition  of  the  cold  lysis  buffer  (provided  by  the 

manufacturer) and  incubated on  ice  for 10 min.   The protein content of  the cell  lysate 

was  estimated using  a  protein determination  assay.  100  μg  of  total protein was  then 

mixed with  2X  reaction  buffer  (provided  by  the manufacturer)  and  5  μl  of  caspase‐3 

fluorogenic substrate (DEVD‐AFC) in a 96‐well plate. The reaction was incubated at 37 

°C  for  1.30 h  followed by  fluorescence  analysis using  a  fluorescent microplate  reader 

with light excitation at 400nm and light emission at 505 nm. 

 

Cytofluorometric determination of apoptotic cells by Annexin V/PI (propidium iodide)‐staining ‐ 

HFE cells were exposed to 20 μM Aβ25‐35 for 24 h and then  labeled with Annexin V/PI. 

112

Briefly,  Aβ‐treated  and  ‐untreated  HFE  cells  (5×105)  were  washed  in  PBS  and  then 

incubated with  5  μl  of  0.2  μg/ml Annexin V‐FITC  and  1  μl  of  100  μg/ml  propidium 

iodide  for 15 min at room temperature, prior to flowcytometry analysis. Annexin V+/PI− 

cells were  identified as early apoptotic, whereas Annexin V+/PI+ cells were classified as 

late apoptotic cells. 

 

Statistical analysis ‐ The data were analyzed by one‐way ANOVA. Differences among the 

means were considered statistically significant when the p value was <0.05. If overall p 

<0.05,  Tukey’s  Multiple  Comparison  post  hoc  analysis  was  performed.  A  two‐way 

ANOVA with genotype (Vector, WT, H63D) and Aβ25‐35 concentration (10 μM, 20 μM, 50 

μM) as grouping factors was performed where appropriate. Bonferroni post tests were 

performed  if p<0.05. Data are presented as  the mean ± S.E.; GraphPad Prism software 

(version 4.0) was utilized to perform the statistical analysis. 

 

Results 

  To  evaluate  the viability  of  cells  following Aβ25‐35  treatment  (toxic  fragment  of 

Aβ), HFE  cells were  incubated with Aβ25‐35  (0,  10,  20  or  50  μM)  for  24  hours. After 

incubation,  cell viability was measured by  an MTT  reduction  assay. Following Aβ25‐35 

treatment,  cell  viability  for  each  genotype  was  significantly  decreased  compared  to 

untreated control cultures.   At 10 μM Aβ25‐35 exposure, vector cells  that do not express 

HFE  had  significantly  more  viable  cells  compared  to  wild  type  HFE  and  H63D 

113

expressing  cells  (p<0.001)  but  there  was  not  a  significant  difference  between  cells 

expressing H63D or WT HFE at  this concentration (Figure 3.1). Upon  treating  the cells 

with 20 μM Aβ25‐35, there was a significant decrease  in H63D cell viability compared to 

WT HFE cells (p<0.05). The vector control was less vulnerable than either WT or H63D 

cells  (p<0.01).  A  similar  profile  of  toxicity  was  seen  in  cell  types  at  50  μM  Aβ25‐35 

exposure. Because there was a significant difference between H63D expressing cells and 

WT  at  20  μM  Aβ,  20  μM  was  selected  as  the  Aβ25‐35  concentration  for  subsequent 

experiments.  Also,  a  significant  interaction  of  genotype  by  Aβ25‐35  concentration was 

detected (p=0.0005) by two‐way ANOVA. 

  To  investigate potential mediators of apoptosis, we measured Bax  translocation 

into  the mitochondria. Mitochondrial  stress  and dysfunction have been  shown  to up‐

regulate Bax translocation (Vila et al., 2001; Perier et al., 2007) and we have shown that 

H63D cells have decreased mitochondria membrane potentials (Lee et al., 2007b). Thus, 

we tested the hypothesis that Bax translocation will increase with H63D expression and 

will be further enhanced by Aβ exposure compared to WT cells. Indeed, the ratio of Bax 

found in the mitochondrial fraction compared to the cytosolic fraction was increased in 

vector  (p<0.01) and H63D  (p<0.001)  cells  compared  to WT HFE  cells  (Figure 3.2). The 

purity  of  both  fractions was  validated  by  immunoblotting  for marker proteins, using 

tubulin  and  cytochrome  c  oxidase  subunit  IV (COX) as  markers  for  cytosol  and 

mitochondria fractions, respectively. Densitometric analysis of Bax  in the mitochondria 

was normalized to the level of COX IV (A) and the expression of Bax in the cytosol was 

114

normalized to the level of tubulin (B). After a 4 hour exposure to 20 μM Aβ25‐35, the ratio 

of  Bax  in  the mitochondria  to  cytosol was  significantly  increased  in  cells  expressing 

H63D  (p<0.001)  and  vector  (p<0.05)  compared  to WT  cells  (Figure  3.2).  There was  a 

greater  than  two‐fold  increase  in  the  ratio  of mitochondrial  to  cytosolic Bax  in H63D 

cells compared to WT, regardless of whether or not the cells were exposed to  Aβ. 

  Based on enhanced Bax translocation to the mitochondria in H63D cells at 

baseline and upon Aβ exposure, we evaluated cytochrome C release as another potential 

modulator of apoptosis. Cytochrome C is released from the mitochondria under cellular 

stress and its release can promote apoptosis similar to Bax (Kluck et al., 1997; Li et al., 

1997; Slee et al., 1999; Desagher and Martinou, 2000). Therefore, cellular fractions of the 

mitochondria and cytosol were obtained to evaluate cytochrome C levels among the 

various cell types. The data show a two‐fold increase of cytochrome C release in vector 

cells (p<0.001) compared to WT and a greater than two‐fold increase of cytochrome C 

release in H63D cells (p<0.001) with respect to WT (Figure 3.3). When the cells were 

treated with 20 μM Aβ peptide to investigate the cellular response to this stress agent, 

there was a greater than two‐fold increase of cytochrome C release in vector cells 

(p<0.001) compared to WT.  There was a greater than three‐fold increase of cytochrome 

C release in H63D cells (p<0.001) versus WT cells (Figure 3.3). It also important to note 

that there was three times as much cytochrome C release in H63D cells upon exposure to 

Aβ compared to baseline release of cytochrome C; whereas WT cells had only twice as 

much cytochrome C release when treated with Aβ. 

115

  Caspase‐9, an initiator caspase activator of the intrinsic apoptosis pathway, can 

be regulated by alterations in mitochondria and is responsive to changes in Bax 

translocation and cytochrome C release (Earnshaw et al., 1999; Gervais et al., 1999; 

Weidemann et al., 1999). Thus, we evaluated caspase‐9 activation by measuring cleaved 

caspase‐9 in our cellular model. There is a two‐fold increase of caspase‐9 activation in 

vector (p<0.001) and H63D (p<0.001) cells compared to wild type (Figure 3.4). Numerous 

studies have shown that Aβ toxicity can be mediated by activation of caspase‐9, and the 

downstream executioner, caspase‐3 (Chan and Mattson, 1999; Allen et al., 2001; Fan et 

al., 2005). Our previous experiment showed that cytochrome c release was changed at 4 

hours after Aβ25‐35 treatment. Since, caspase‐9 is downstream of cytochrome c, we 

expected that caspase‐9 would be changed after 4 hour of Aβ25‐35 treatment. Therefore, 

we treated the cells for 9 hours in order to detect caspase‐9. Upon treating the cells with 

20 μM Aβ25‐35 for 9 hours, levels of the active form of caspase‐9 increased two‐fold in WT 

cells compared to its control expression level, but the levels were still at least 25% less 

than those seen in the vector and H63D Aβ‐treated cells (Figure 3.4). Aβ exposure 

increased caspase‐9 activation more than 25% in vector and H63D cells compared to 

their baseline untreated levels. 

  Caspase‐3 is an executioner caspase and it has been demonstrated to be a major 

protease in apoptosis, especially in response to cellular stress (Earnshaw et al., 1999; 

Gervais et al., 1999; Weidemann et al., 1999; Yuan and Yankner, 2000). Given the 

preceding data in this study revealing alterations of upstream proteins in the intrinsic 

116

apoptotic pathway, we hypothesized that there would be increased caspase‐3 activity in 

cells expressing the H63D allele versus wild‐type HFE cells. Caspase‐3 activity is 

elevated in vector (p<0.001) and H63D cells (p<0.01) compared to WT HFE cells (Figure 

3.5). Our previous experiment showed that caspase‐9 was changed after 9 hours of Aβ25‐

35 treatment. Since, caspase‐3 is downstream of caspase‐9; we expected that caspase‐3 

would be changed after 9 hours of Aβ25‐35 treatment.  In this experiment, we treated the 

cells for 8 and 12 hours in order to detect caspase‐3 activation.  Subsequent treatment of 

the cells with Aβ25‐35 led to an increase of caspase‐3 activation for all cell types compared 

to baseline. At 8 hours of Aβ exposure, caspase‐3 activity increased in vector (p<0.001) 

and H63D (p<0.001) cells compared to WT HFE cells (Figure 3.5). It is also important to 

note that there was greater activation of caspase‐3 in H63D cells upon 8 hours exposure 

to Aβ compared to its baseline than was seen with either vector or WT cells. Exposure 

for 12 hours to Aβ exposure did not result in any additional increase in caspase‐3 

activity than seen at 8 hours exposure. 

  The initial findings of Aβ exposure leading to a greater loss of viable cells in WT 

HFE and H63D HFE compared to the vector control (Figure 1.1) is not fully explained by 

activation of the apoptotic  intrinsic pathway. Therefore, the extrinsic pathway may be 

involved. Caspase‐8 is the key initiator of the extrinsic apoptosis signaling pathway 

(Nijhawan et al., 2000). Thus, we evaluated the expression of activated caspase‐8 and 

found WT HFE expression to result in an 11% increase compared to vector and a 45% 

increase with respect to H63D expressing cells (Figure 3.6). Moreover, there was a 23% 

117

increase of caspase‐8 activation in WT HFE cells compared to H63D and a 17% increase 

compared to vector (Figure 3.6). 

Previous findings suggest that the Aβ peptide is neurotoxic and pro‐apoptotic 

(Yankner et al., 1989; Pike et al., 1991; Loo et al., 1993). To determine the effect of Aβ 

peptide on neuronal apoptosis in HFE transfected human neuroblastoma SH‐SY5Y cell 

lines, an Annexin V‐FITC/PI flow cytometry assay was performed. In evaluating early 

apoptosis, there was a 15% decrease of early apoptotic cells in the vector cells (p<0.001) 

compared to WT cells; there was no significant difference between WT and H63D cells 

(Figure 3.7). All cell types were exposed to Aβ25‐35 peptide for 24 hours and apoptosis 

increased across all genotypes.  There were fewer early vector apoptotic (p<0.001) cells 

compared to WT HFE early apoptotic cells (Figure 3.7). However, there were more early 

apoptotic cells that expressed the H63D (p<0.01) allele compared to cells expressing WT 

HFE (Figure 3.7). Importantly, there were more early H63D apoptotic cells than either 

vector or WT HFE expressing cells with Aβ peptide exposure.  

 

Discussion 

  The results of this study indicate that the H63D HFE gene variant is associated 

with increased cell stress and mitochondrial dysfunction. Exposure of neuroblastoma 

cells to Aβ peptide results in greater cell stress and cell death in those cells carrying 

H63D HFE allele. The evidence of elevated oxidative stress associated with the H63D 

allele and apparent heightened activity of the intrinsic apoptotic pathway under resting 

118

conditions, prompted us to evaluate apoptotic signaling pathways to understand the 

mechanisms through which Aβ toxity was mediated. It is well established that Bax 

translocation to the mitochondria plays a central role in intrinsic apoptosis signaling 

(Sharpe et al., 2004). Bax is a BH3‐ only member of the Bcl‐2 family that mainly resides in 

the cytosol in healthy cells and translocates to the mitochondria following exposure to 

apoptotic stimuli. In this study, we discovered an increased baseline level of Bax in the 

mitochondria in H63D cells compared to WT cells and the levels of Bax in the 

mitochondria increased even further with Aβ exposure. It has been reported that Bax 

can release cytochrome C by interacting with the mitochondrial permeability transition 

(MPT) pore component, in particular the voltage‐dependant anion channels (VDAC). In 

addition, Bax also caused mitochondrial alterations typical of MPT, such as loss of 

mitochondrial membrane potential (Narita et al., 1998). Therefore, an increased baseline 

level of Bax in the mitochondria in H63D cells might be associated with the decreased 

mitochondrial membrane potential that we have observed (Lee et al., 2007b). 

Glycogen synthase kinase‐3β (GSK‐3β) is a critical activator of neuronal 

apoptosis that can phosphorylate Bax and promote its mitochondrial localization during 

neuronal apoptosis (Linseman et al., 2004). GSK‐3β activity is increased in cells 

expressing the H63D allele and increasing cellular iron can up‐regulate GSK‐3β activity 

(Hall et al. in press). Thus, the elevated Bax protein expression in mitochondria in H63D 

cells is consistent with increased GSK‐3β activity. The increase in Bax translocation to 

119

mitochondria following Aβ exposure may also involve increased GSK‐3β activity 

(Linseman et al., 2004).  

The increase in Bax in the mitochondria suggests activation of the intrinsic 

(mitochondrial) death pathway which is also consistent with the increased cytochrome C 

release from mitochondria that was observed in H63D HFE cells. Upon its translocation 

to the mitochondria, Bax can form oligomers with other Bax and Bcl‐2 family proteins 

generating pores in the mitochondria membrane that stimulate the release of 

cytochrome C from the mitochondria (Zong et al., 2001). The subsequent cytosolic 

cytochrome C then interacts with Apaf‐1 and pro‐caspase‐9 to form a functional 

apoptosome that ultimately activates downstream executioner caspases like caspase‐3 

(Zou et al., 1999). Cytochrome C levels, caspase‐9, and caspase‐3 expression were 

increased in H63D expressing cells compared to cells expressing wild type HFE and 

were further elevated with Aβ peptide exposure. These findings are consistent with the 

Bax expression findings and implicate the intrinsic apoptotic pathway to be altered in 

cells expressing the H63D variant of HFE.  

Additionally, increased cytosolic Ca2+ has been shown to activate the 

mitochondrial apoptotic pathway via the opening of the mitochondrial transition pore, 

resulting in the release of apoptogenic factors, including cytochrome c (Kroemer et al., 

1998; Rizzuto et al., 1998; Csordas et al., 1999; Duchen, 2000). We found that H63D HFE 

variant is associated with elevated cytosolic Ca2+ levels (Mitchell et al. in press), which 

may be a mechanism for increased cytochrome C release with expression of  the H63D 

120

HFE variant. Moreover, it has been reported that Aβ induces the release of Ca2+ from the 

endoplasmic reticulum leading to activation of the mitochondrial apoptotic pathway 

resulting in a disruption of mitochondrial membrane potential and Bax translocation 

into the mitochondria (Ferreiro et al., 2008). This mechanism might also contribute to the 

translocation of Bax into the mitochondria and enhanced cytochrome C release under 

the H63D HFE variant. 

To complete our analysis of the apoptotic pathways, we measured caspase‐8 

activation to evaluate the extrinsic apoptotic pathway. Cells expressing H63D HFE 

displayed a reduction in caspase‐8 activation compared to WT HFE cells. Aβ25‐35 

treatment also resulted in a decrease of caspase‐8 expression in the H63D cells compared 

to cells expressing WT HFE. Importantly, GSK‐3β activity has been reported to influence 

the two major pathways of apoptosis, but in opposite directions; directly enhancing the 

intrinsic pathway while inhibiting the extrinsic pathway (Beurel and Jope, 2006). 

Collectively, these findings support the idea that Aβ exposure further elevates GSK‐3β 

activity in H63D cells leading to an up‐regulation of the intrinsic apoptotic pathway and 

inhibition of the extrinsic apoptotic pathway resulting in a greater rate of apoptosis.  

In summary, the present study demonstrates that Aβ peptide exposure induces 

apoptosis in the H63D cells by promoting the translocation of Bax to the mitochondria 

leading to activation of the mitochondrial intrinsic pathway, which subsequently causes 

cytochrome c release and the activation of caspase‐9 and caspase‐3. The results of this 

study suggest there is greater vulnerability of H63D cells to Aβ toxicity due to a pre‐

121

existing up‐regulation of the intrinsic apoptotic pathway. Our findings suggest that 

mitochondria dysfunction associated with the H63D variant is a key finding that might 

accelerate the onset and/or exacerbation of neurodegeneration. The cellular response to 

an environmental toxin like Aβ may impact AD progression and the expression of HFE 

variants can impact neuronal cell survival. Thus, over the course of a lifetime, a 

difference in cell sensitivity to Aβ exposure might greatly influence AD pathogenesis 

and subsequent cognitively ability due to mitochondria dysfunction and cellular 

oxidative stress associated with the H63D HFE allele. This observation provides further 

support for our conceptual framework for studies into HFE polymorphisms in 

neurodegenerative diseases and our overall working hypothesis that the H63D allelic 

variant establishes a permissive milieu in which environmental factors can promote 

neurodegeneration.  

122

Figure 3.1: Measurement of cell viability.  HFE cells were treated with Aβ25‐35 (0, 10, 20 or 50 μM) for 24 h. After incubation, cell viability was measured with an MTT assay. The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments. Two‐way ANOVA with genotype and Aβ25‐35 concentration as grouping factors. *P<0.05 when compared with WT; **P<0.01 when compared with WT; **P<0.01 when compared with WT.   

25-35

β

0µM A

25-35

β

10µM

A 25

-35

β

20µM

A 25

-35

β

50µM

A

0102030405060708090

100110

VectorWTH63D**

******

Cel

l Via

bilit

y (%

of W

T co

ntro

l)

*

   

 

 

 

 

 

123

Figure 3.2: The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of Bax translocation to mitochondria. Cells were treated with 20 μM Aβ25‐35 for 4 h, then the cells were fractionated to cytosolic and mitochondria‐enriched fractions. Mitochondria and cytosolic fractions were immunoblotted with protein marker for each fraction, tubulin for cytosol and COX IV for mitochondria, to verify purity of fractions. The levels of Bax in cytosol and mitochondria were analyzed by western blotting. Densitometric analysis of the level of Bax in mitochondria was normalized to the level of COX IV (A) and the level of Bax in cytosol was normalized to the level of tubulin (B) (the product is the ratio between A and B). The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments.*P<0.05 when compared with WT; **P<0.01 when compared with WT; ***P<0.001 when compared with WT. 

Vec WT H63

D β

Vec A

β

WT Aβ

H63D A

0

1

2

3

4

5

6

7

8

*****

***

Rat

io o

f Bax

(mito

chon

dria

/cyt

osol

)

*

124

Figure 3.3: The effect of Aβ25‐35 treatment on Cytochrome c release. Cells were treated with 20 μM Aβ25‐35 for 4 h. subsequently, cytosolic and mitochondria‐enriched fractions were prepared. Mitochondria and cytosolic fractions were immunoblotted with protein marker for each fraction, tubulin for cytosol and COX IV for mitochondria, to verify purity of fractions. Cytochrome c level in cytosol fraction) and mitochondria were measured by western blotting. Densitometric analysis of the level of cytochrome c in cytosol was normalized to the level of tubulin (A) and the level of cytochrome c in mitochondria was normalized to the level of  COX IV (B) (the product is the ratio between A and B. The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments. ***P<0.001 when compared with WT.   

Vec WT H63

D β

Vec A

β

WT Aβ

H63D A

0

1

2

3

4

5

*** ***

******

Rat

io o

f Cyt

ochr

ome

C(c

ytos

ol/m

itoch

ondr

ia)

125

Figure 3.4: The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of caspase‐9 activation. Cells were treated with 20 μM Aβ25‐35 for 9 h. Cells were collected and the levels of active form of caspase‐9 were analyzed by immunoblotting. Densitometric analysis of the level of active caspase‐9 was normalized to the level of actin (product: actin, ratio from each treatment is further compared with WT control). The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments. ***P<0.001 when compared with WT.

Vec WT H63

D β

Vec A

β

WT Aβ

H63D A

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

*** ***

*** ***

% D

iffer

ence

126

Figure 3.5: The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of caspase‐3 activity. Cells were treated for 8, and 12h with 20 μM of Aβ25‐35. Cells were collected and the caspase‐3 activity was determined using a caspase‐3 flourometric assay. The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments. **P<0.01 when compared with WT and ***P<0.001 when compared with WT.   

Caspase-3 Activity

Vecto

rW

T H63

D 8

hβ

Vec A

8hβ

WT A

8h

β

H63D A

12h

β

Vec A

12

h

β

WT A

12

h

β

H63D A

0

300

600

900

1200

*****

*** *** *** ***

Enzy

mat

ic A

ctiv

ityFl

uore

scen

ce @

505

nm

 

127

Figure 3.6: The effect of Aβ25‐35 treatment on induction of caspase‐8 activation. Cells were treated with 20 μM Aβ25‐35 for 4 h. Cells were collected and the levels of active form of caspase‐8 were analyzed by immunoblotting. Densitometric analysis of the level of active caspase‐8 was normalized to the level of actin (product: actin, ratio from each treatment is further compared with WT control).  The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments. **P<0.01 when compared with WT and ***P<0.001 when compared with WT.   

Vec WT H63D β

Vec A

β

WT Aβ

H63D A

0.0

0.5

1.0

***** **

% D

iffer

ence

 

128

Figure 3.7: The effect of Aβ25‐35 treatment on apoptosis. Cells were treated with 20 μM Aβ25‐35  for  24  hr  as  described  in  Materials  and  Methods.  Cells  were  collected  and apoptosis assay were analyzed by using Annexin V‐FITC/PI flow cytometry assay. The data represent the mean ±SEM of at least three independent experiments.*P<0.05 when compared with WT; **P<0.01 when compared with WT; ***P<0.001 when compared with WT.  

Vec WT

H63D β

Vec A

β

WT A

β

H63D A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

******

**

Early

Apo

ptos

is (%

)

129

References 

Alizadeh BZ, Njajou OT, Millan MR, Hofman A, Breteler MM, van Duijn CM (2009) HFE 

variants,  APOE  and  Alzheimerʹs  disease:  findings  from  the  population‐based 

Rotterdam study. Neurobiol Aging 30:330‐332. 

Allen JW, Eldadah BA, Huang X, Knoblach SM, Faden AI (2001) Multiple caspases are 

involved in beta‐amyloid‐induced neuronal apoptosis. J Neurosci Res 65:45‐53. 

Anandatheerthavarada HK, Biswas G, Robin MA, Avadhani NG  (2003) Mitochondrial 

targeting  and  a novel  transmembrane  arrest of Alzheimerʹs  amyloid precursor 

protein impairs mitochondrial function in neuronal cells. J Cell Biol 161:41‐54. 

Avila‐Gomez  IC,  Jimenez‐Del‐Rio  M,  Lopera‐Restrepo  F,  Velez‐Pardo  C  (2008) 

Association  between HFE  187  C>G  (H63D) mutation  and  early‐onset  familial 

Alzheimerʹs disease PSEN‐1 839A>C (E280A) mutation. Ann Hematol 87:671‐673. 

Berg D, Hoggenmuller U, Hofmann E, Fischer R, Kraus M, Scheurlen M, Becker G (2000) 

The basal ganglia in haemochromatosis. Neuroradiology 42:9‐13. 

Berlin  D,  Chong  G,  Chertkow  H,  Bergman  H,  Phillips  NA,  Schipper  HM  (2004) 

Evaluation of HFE (hemochromatosis) mutations as genetic modifiers in sporadic 

AD and MCI. Neurobiol Aging 25:465‐474. 

Beurel E, Jope RS (2006) The paradoxical pro‐ and anti‐apoptotic actions of GSK3 in the 

intrinsic and extrinsic apoptosis signaling pathways. Prog Neurobiol 79:173‐189. 

Bishop  GM,  Robinson  SR,  Liu  Q,  Perry  G,  Atwood  CS,  Smith  MA  (2002)  Iron:  a 

pathological mediator of Alzheimer disease? Dev Neurosci 24:184‐187. 

130

Candore G, Licastro F, Chiappelli M, Franceschi C, Lio D, Rita Balistreri C, Piazza G, 

Colonna‐Romano G, Grimaldi LM, Caruso C (2003) Association between the HFE 

mutations and unsuccessful ageing: a study in Alzheimerʹs disease patients from 

Northern Italy. Mech Ageing Dev 124:525‐528. 

Cardoso SM, Santos S, Swerdlow RH, Oliveira CR  (2001) Functional mitochondria are 

required for amyloid beta‐mediated neurotoxicity. Faseb J 15:1439‐1441. 

Chan SL, Mattson MP (1999) Caspase and calpain substrates: roles in synaptic plasticity 

and cell death. J Neurosci Res 58:167‐190. 

Combarros O, Garcia‐Roman M,  Fontalba A,  Fernandez‐Luna  JL,  Llorca  J,  Infante  J, 

Berciano J (2003) Interaction of the H63D mutation in the hemochromatosis gene 

with the apolipoprotein E epsilon 4 allele modulates age at onset of Alzheimerʹs 

disease. Dement Geriatr Cogn Disord 15:151‐154. 

Connor  JR,  Lee  SY  (2006) HFE mutations  and Alzheimerʹs  disease.  J Alzheimers Dis 

10:267‐276. 

Csordas G, Thomas AP, Hajnoczky G (1999) Quasi‐synaptic calcium signal transmission 

between endoplasmic reticulum and mitochondria. Embo J 18:96‐108. 

Desagher S, Martinou JC (2000) Mitochondria as  the central control point of apoptosis. 

Trends Cell Biol 10:369‐377. 

Devi  L,  Prabhu  BM,  Galati  DF,  Avadhani  NG,  Anandatheerthavarada  HK  (2006) 

Accumulation  of  amyloid  precursor  protein  in  the  mitochondrial  import 

131

channels of human Alzheimerʹs disease brain  is  associated with mitochondrial 

dysfunction. J Neurosci 26:9057‐9068. 

Duchen MR (2000) Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death. J Physiol 

529 Pt 1:57‐68. 

Earnshaw  WC,  Martins  LM,  Kaufmann  SH  (1999)  Mammalian  caspases:  structure, 

activation,  substrates,  and  functions  during  apoptosis.  Annu  Rev  Biochem 

68:383‐424. 

Fan TJ, Han LH, Cong RS, Liang J (2005) Caspase family proteases and apoptosis. Acta 

Biochim Biophys Sin (Shanghai) 37:719‐727. 

Ferguson M, Mockett RJ,  Shen Y, Orr WC,  Sohal RS  (2005) Age‐associated decline  in 

mitochondrial  respiration  and  electron  transport  in  Drosophila melanogaster. 

Biochem J 390:501‐511. 

Ferreiro E, Oliveira CR, Pereira CM (2008) The release of calcium from the endoplasmic 

reticulum  induced  by  amyloid‐beta  and  prion  peptides  activates  the 

mitochondrial apoptotic pathway. Neurobiol Dis 30:331‐342. 

Ferreiro  E,  Eufrasio A,  Pereira C, Oliveira CR,  Rego AC  (2007)  Bcl‐2  overexpression 

protects  against  amyloid‐beta  and  prion  toxicity  in  GT1‐7  neural  cells.  J 

Alzheimers Dis 12:223‐228. 

Fifre A, Sponne I, Koziel V, Kriem B, Yen Potin FT, Bihain BE, Olivier JL, Oster T, Pillot 

T (2006) Microtubule‐associated protein MAP1A, MAP1B, and MAP2 proteolysis 

132

during  soluble  amyloid  beta‐peptide‐induced  neuronal  apoptosis.  Synergistic 

involvement of calpain and caspase‐3. J Biol Chem 281:229‐240. 

Gervais FG, Xu D, Robertson GS, Vaillancourt JP, Zhu Y, Huang J, LeBlanc A, Smith D, 

Rigby M, Shearman MS, Clarke EE, Zheng H, Van Der Ploeg LH, Ruffolo SC, 

Thornberry  NA,  Xanthoudakis  S,  Zamboni  RJ,  Roy  S,  Nicholson  DW  (1999) 

Involvement  of  caspases  in  proteolytic  cleavage  of  Alzheimerʹs  amyloid‐beta 

precursor protein and amyloidogenic A beta peptide formation. Cell 97:395‐406. 

Guerreiro RJ, Bras JM, Santana I, Januario C, Santiago B, Morgadinho AS, Ribeiro MH, 

Hardy  J, Singleton A, Oliveira C  (2006) Association of HFE common mutations 

with Parkinsonʹs disease, Alzheimerʹs disease and mild cognitive impairment in 

a Portuguese cohort. BMC Neurol 6:24. 

Hardy J, Selkoe DJ (2002) The amyloid hypothesis of Alzheimerʹs disease: progress and 

problems on the road to therapeutics. Science 297:353‐356. 

Huang X, Cuajungco MP, Atwood CS, Moir RD, Tanzi RE, Bush AI (2000) Alzheimerʹs 

disease, beta‐amyloid protein and zinc. J Nutr 130:1488S‐1492S. 

Jellinger  KA  (2002)  Alzheimer  disease  and  cerebrovascular  pathology:  an  update.  J 

Neural Transm 109:813‐836. 

Jellinger KA, Bancher C (1998) Neuropathology of Alzheimerʹs disease: a critical update. 

J Neural Transm Suppl 54:77‐95. 

133

Kluck RM, Bossy‐Wetzel E, Green DR, Newmeyer DD (1997) The release of cytochrome 

c  from mitochondria:  a  primary  site  for  Bcl‐2  regulation  of  apoptosis.  Science 

275:1132‐1136. 

Kroemer G, Dallaporta B, Resche‐Rigon M (1998) The mitochondrial death/life regulator 

in apoptosis and necrosis. Annu Rev Physiol 60:619‐642. 

Kuperstein  F, Yavin E  (2003) Pro‐apoptotic  signaling  in  neuronal  cells  following  iron 

and amyloid beta peptide neurotoxicity. J Neurochem 86:114‐125. 

Lee KY, Koh SH, Noh MY, Park KW, Lee YJ, Kim SH (2007a) Glycogen synthase kinase‐

3beta  activity  plays  very  important  roles  in  determining  the  fate  of  oxidative 

stress‐inflicted neuronal cells. Brain Res 1129:89‐99. 

Lee  SY,  Patton  SM,  Henderson  RJ,  Connor  JR  (2007b)  Consequences  of  expressing 

mutants  of  the  hemochromatosis  gene  (HFE)  into  a  human  neuronal  cell  line 

lacking endogenous HFE. Faseb J 21:564‐576. 

Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X (1997) 

Cytochrome  c  and  dATP‐dependent  formation  of  Apaf‐1/caspase‐9  complex 

initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91:479‐489. 

Limdi JK, Crampton JR (2004) Hereditary haemochromatosis. Qjm 97:315‐324. 

Linseman DA, Butts BD, Precht TA, Phelps RA, Le SS, Laessig TA, Bouchard RJ, Florez‐

McClure  ML,  Heidenreich  KA  (2004)  Glycogen  synthase  kinase‐3beta 

phosphorylates Bax and promotes its mitochondrial localization during neuronal 

apoptosis. J Neurosci 24:9993‐10002. 

134

Loo  DT,  Copani  A,  Pike  CJ, Whittemore  ER, Walencewicz  AJ,  Cotman  CW  (1993) 

Apoptosis  is  induced  by  beta‐amyloid  in  cultured  central  nervous  system 

neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 90:7951‐7955. 

Lovell MA, Robertson  JD, Teesdale WJ, Campbell  JL, Markesbery WR  (1998) Copper, 

iron and zinc in Alzheimerʹs disease senile plaques. J Neurol Sci 158:47‐52. 

Lustbader  JW  et  al.  (2004)  ABAD  directly  links  Abeta  to  mitochondrial  toxicity  in 

Alzheimerʹs disease. Science 304:448‐452. 

Miranda S, Opazo C, Larrondo LF, Munoz FJ, Ruiz F, Leighton F,  Inestrosa NC  (2000) 

The  role of oxidative  stress  in  the  toxicity  induced by amyloid beta‐peptide  in 

Alzheimerʹs disease. Prog Neurobiol 62:633‐648. 

Moalem S, Percy ME, Andrews DF, Kruck TP, Wong S, Dalton AJ, Mehta P, Fedor B, 

Warren  AC  (2000)  Are  hereditary  hemochromatosis  mutations  involved  in 

Alzheimer disease? Am J Med Genet 93:58‐66. 

Narita M, Shimizu S, Ito T, Chittenden T, Lutz RJ, Matsuda H, Tsujimoto Y (1998) Bax 

interacts with the permeability transition pore to  induce permeability transition 

and  cytochrome  c  release  in  isolated mitochondria. Proc Natl Acad  Sci U  S A 

95:14681‐14686. 

Nicotera P, Leist M, Manzo L (1999) Neuronal cell death: a demise with different shapes. 

Trends Pharmacol Sci 20:46‐51. 

135

Nielsen  JE,  Jensen LN, Krabbe K  (1995) Hereditary haemochromatosis:  a  case  of  iron 

accumulation  in  the  basal  ganglia  associated with  a parkinsonian  syndrome.  J 

Neurol Neurosurg Psychiatry 59:318‐321. 

Nijhawan  D,  Honarpour  N,  Wang  X  (2000)  Apoptosis  in  neural  development  and 

disease. Annu Rev Neurosci 23:73‐87. 

Percy M et al. (2008) Involvement of ApoE E4 and H63D in sporadic Alzheimerʹs disease 

in a folate‐supplemented Ontario population. J Alzheimers Dis 14:69‐84. 

Perier  C,  Bove  J, Wu  DC,  Dehay  B,  Choi  DK,  Jackson‐Lewis  V,  Rathke‐Hartlieb  S, 

Bouillet P,  Strasser A,  Schulz  JB,  Przedborski  S, Vila M  (2007) Two molecular 

pathways  initiate mitochondria‐dependent dopaminergic neurodegeneration  in 

experimental Parkinsonʹs disease. Proc Natl Acad Sci U S A 104:8161‐8166. 

Pike CJ, Walencewicz AJ, Glabe CG, Cotman CW (1991) In vitro aging of beta‐amyloid 

protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Res 563:311‐314. 

Pulliam  JF,  Jennings  CD,  Kryscio  RJ, Davis DG, Wilson D, Montine  TJ,  Schmitt  FA, 

Markesbery WR  (2003) Association  of HFE mutations with  neurodegeneration 

and  oxidative  stress  in Alzheimerʹs  disease  and  correlation with APOE. Am  J 

Med Genet B Neuropsychiatr Genet 119B:48‐53. 

Richardson JS, Zhou Y, Kumar U (1996) Free radicals  in the neurotoxic actions of beta‐

amyloid. Ann N Y Acad Sci 777:362‐367. 

136

Rizzuto R, Pinton P, Carrington W, Fay FS, Fogarty KE, Lifshitz LM, Tuft RA, Pozzan T 

(1998)  Close  contacts  with  the  endoplasmic  reticulum  as  determinants  of 

mitochondrial Ca2+ responses. Science 280:1763‐1766. 

Rottkamp CA, Raina AK, Zhu X, Gaier E, Bush AI, Atwood CS, Chevion M, Perry G, 

Smith MA  (2001) Redox‐active  iron mediates amyloid‐beta  toxicity. Free Radic 

Biol Med 30:447‐450. 

Sampietro M, Caputo L, Casatta A, Meregalli M, Pellagatti A, Tagliabue  J, Annoni G, 

Vergani C (2001) The hemochromatosis gene affects the age of onset of sporadic 

Alzheimerʹs disease. Neurobiol Aging 22:563‐568. 

Schenck JF, Zimmerman EA (2004) High‐field magnetic resonance imaging of brain iron: 

birth of a biomarker? NMR Biomed 17:433‐445. 

Sharpe  JC, Arnoult D, Youle RJ  (2004) Control of mitochondrial permeability by Bcl‐2 

family members. Biochim Biophys Acta 1644:107‐113. 

Slee EA, Harte MT, Kluck RM, Wolf BB, Casiano CA, Newmeyer DD, Wang HG, Reed 

JC,  Nicholson  DW,  Alnemri  ES,  Green  DR,  Martin  SJ  (1999)  Ordering  the 

cytochrome c‐initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases‐2, ‐3, ‐

6, ‐7, ‐8, and ‐10 in a caspase‐9‐dependent manner. J Cell Biol 144:281‐292. 

Sola S, Diogenes MJ, Brites D, Rodrigues CM (2002) [Release of cytochrome C with the 

interaction of bilirubin, amyloid beta‐peptide and glycochenodeoxycholate from 

isolated mitochondria]. Acta Med Port 15:269‐275. 

137

Sullivan  PG,  Brown MR  (2005) Mitochondrial  aging  and  dysfunction  in Alzheimerʹs 

disease. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29:407‐410. 

Trojanowski  JQ,  Lee  VM  (2000)  ʺFatal  attractionsʺ  of  proteins.  A  comprehensive 

hypothetical  mechanism  underlying  Alzheimerʹs  disease  and  other 

neurodegenerative disorders. Ann N Y Acad Sci 924:62‐67. 

Vila M, Jackson‐Lewis V, Vukosavic S, Djaldetti R, Liberatore G, Offen D, Korsmeyer SJ, 

Przedborski S  (2001) Bax ablation prevents dopaminergic neurodegeneration  in 

the  1‐methyl‐  4‐phenyl‐1,2,3,6‐tetrahydropyridine mouse model  of  Parkinsonʹs 

disease. Proc Natl Acad Sci U S A 98:2837‐2842. 

Wallis LI, Paley MN, Graham  JM, Grunewald RA, Wignall EL,  Joy HM, Griffiths PD 

(2008) MRI assessment of basal ganglia  iron deposition  in Parkinsonʹs disease. J 

Magn Reson Imaging 28:1061‐1067. 

Weidemann A, Paliga K, Durrwang U, Reinhard FB, Schuckert O, Evin G, Masters CL 

(1999)  Proteolytic  processing  of  the  Alzheimerʹs  disease  amyloid  precursor 

protein within  its  cytoplasmic  domain  by  caspase‐like  proteases.  J  Biol Chem 

274:5823‐5829. 

Yankner BA, Dawes LR, Fisher S, Villa‐Komaroff L, Oster‐Granite ML, Neve RL (1989) 

Neurotoxicity  of  a  fragment  of  the  amyloid  precursor  associated  with 

Alzheimerʹs disease. Science 245:417‐420. 

Yuan J, Yankner BA (2000) Apoptosis in the nervous system. Nature 407:802‐809. 

138

Zecca L, Youdim MB, Riederer P, Connor JR, Crichton RR (2004) Iron, brain ageing and 

neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci 5:863‐873. 

Zong WX, Lindsten T, Ross AJ, MacGregor GR, Thompson CB (2001) BH3‐only proteins 

that  bind  pro‐survival  Bcl‐2  family  members  fail  to  induce  apoptosis  in  the 

absence of Bax and Bak. Genes Dev 15:1481‐1486. 

Zou H, Li Y, Liu X, Wang X  (1999) An APAF‐1.cytochrome c multimeric complex  is a 

functional apoptosome that activates procaspase‐9. J Biol Chem 274:11549‐11556. 

 

Chapter 4

Expression of the HFE Allelic Variant H63D in SH-SY5Y Cells Affects Tau

Phosphorylation

Abstract  

A number of genetic association studies have appeared that address HFE gene variants 

in neurodegenerative disorders. However, the cellular impact of HFE in the nervous system has 

received little attention. To begin to address the role of the HFE allelic variants on cellular 

events associated with neurodegeneration, we examined the hypothesis that HFE 

polymorphisms are associated with alterations in tau phosphorylation in a human 

neuroblastoma cell line (SH‐SY5Y). The results show that in a cell culture model, the H63D 

allele is associated with increased tau phosphorylation. The mechanisms responsible for these 

changes appear related to increased glycogen synthase kinase (GSK)‐3β activity. GSK‐3β 

activity is up‐regulated in the cells expressing H63D HFE and can be modified by the addition 

of iron or treatment with an iron chelator in SH‐SY5Y cells expressing wild type HFE. Oxidative 

stress, also associated with elevated cellular iron, is associated with increased tau 

phosphorylation at the same sites as seen in H63D cells and treatment with Trolox, an anti‐

oxidant, lowered tau phosphorylation. These results suggest H63D HFE increases tau 

phosphorylation via GSK‐3β activity and iron‐mediated oxidative stress. 

 

 

140

Introduction 

  Numerous neurodegenerative diseases are associated with loss of brain iron 

homeostasis (Zecca et al., 2004). An imbalance of iron leads to an increase in oxidative stress 

which has been tied to cell death and synapse loss (Bush, 2003). Mutations that affect proteins 

that regulate cellular iron uptake can be expected to increase oxidative stress and impact 

neurodegeneration. Recently, there has been substantial interest in the HFE gene, specifically 

the H63D variant as a risk factor or disease modifier in many neurodegenerative diseases 

including Alzheimer’s disease (AD) (reviewed in Connor and Lee, 2006; Percy et al., 2008), 

amyotrophic lateral sclerosis (ALS) (Wang et al., 2004; Yen et al., 2004; Goodall et al., 2005; 

Restagno et al., 2007; Sutedja et al., 2007), Parkinson’s disease (PD) (Borie et al., 2002; Dekker et 

al., 2003; Guerreiro et al., 2006) and ischemic stroke (Ellervik et al., 2007). HFE has been studied 

within the paradigm of the iron overload disorder hereditary hemochromatosis, but the 

frequency of HFE gene variants are much more prevalent than this disease (Waalen et al., 2005). 

The HFE protein has been shown to form a complex with transferrin receptors (TfR) at the 

cellular membrane and decrease its affinity for transferrin (Tf) resulting in only one transferrin 

complexing with the transferrin receptor and thus limiting cellular iron uptake (Feder et al., 

1998). The mutant form of the protein (H63D, rs1799945; www.alzgene.org), fails to complex 

with the TfR and subsequently is  associated with increased cellular iron (Feder et al., 1998). 

Thus, even in the absence of clinical disease, we propose that chronic subclinical iron loading at 

the cellular level over many years can provide a permissive milieu that enables 

neurodegenerative disease processes, and thus the HFE mutations are a disease modifier. In 

141

addition, the function of HFE may expand beyond limiting iron uptake or there may be a gain 

of function associated with the mutant protein (Lee et al., 2006).  

As mentioned, a host of epidemiological studies have investigated the genetic 

association of HFE polymorphisms and AD, ALS, and PD. A consistent underlying pathological 

characteristic of these diseases is the hyperphosphorylation of tau. Tau is a microtubule 

associated protein primarily responsible for binding microtubules such as tubulin to stabilize 

the neuronal cytoskeleton (Lee et al., 2001; Iqbal and Grundke‐Iqbal, 2006). Cytoskeletal 

stabilization is vital to axonal transport ensuring adequate neuronal communication. The 

hyperphosphorylation of tau by various kinases, primarily glycogen synthase kinase 3β (GSK‐

3β), cyclin‐dependant kinase 5 (Cdk5), and extracellular regulating kinase 2 (ERK‐2) is thought 

to be responsible for the pathological lesions containing hyperphosphorylated tau seen in AD, 

ALS, and PD (Lee et al., 2001; Mazanetz and Fischer, 2007). Protein phosphatases PP1, PP2A, 

and PP2B are responsible for tau dephosphorylation (Lee et al., 2001). Thus, the opposing 

actions of kinases and phosphatases provide a balance to achieve a tau phosphorylation 

homeostasis.  

The impact of iron status, and specifically the presence of the HFE gene variants on this 

homeostatic mechanism, may provide insights into how the HFE gene variants contribute to 

neurodegenerative disease. Although it has traditionally been thought that the brain is 

protected from iron overload,  HFE protein is expressed on the blood vessels, choroid plexus 

and ependymal surface in the brain and is therefore in a position to impact iron uptake into the 

brain (Connor et al., 2001).  Patients expressing an HFE polymorphism were found to have a 

142

greater amount of oxidative stress determined by their cerebrospinal fluid (CSF) F2‐isoprostane 

levels (Pulliam et al., 2003) and patients with ALS who have an HFE mutation have a different 

CSF biomarker profile than those with wild type HFE (Mitchell et al., 2008). Also, magnetic 

resonance imaging (MRI) has shown increased brain iron levels in patients possessing HFE 

polymorphisms (Bartzokis et al., 2006, 2007). Thus, given the frequency of HFE polymorphisms 

in HFE and neurodegenerative diseases, the presence of HFE in the brain, and the recent data 

that HFE mutations alter brain iron status and oxidative stress, the development of a cellular 

model to interrogate the effects of HFE gene variants is timely.  

  We have developed a stably transfected HFE neuroblastoma SH‐SY5Y cell line to test the 

hypothesis that the H63D polymorphism will increase tau phosphorylation. There are 

numerous indirect mechanisms that have been shown to influence tau hyperphosphorylation 

including, but not limited to: oxidative stress and glutamate toxicity, both of which we have 

shown to be altered in our cellular model (Wang et al., 2004; Lee et al., 2006). Thus, in the study 

herein, we sought to directly examine tau phosphorylation in our cell model and the associated 

mechanisms. 

 

Materials and methods 

Reagents ‐ Cell culture reagents including DMEM/F12, DMEM, pen/strep/glutamine and 

Geneticin were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fetal bovine serum was 

purchased from Gemini Bio‐Products (West Sacramento, CA, USA). DC protein assay was 

obtained from Bio‐Rad (Hercules, CA, USA). Mouse monoclonal Tau (Tau‐5) and rabbit 

143

polyclonal anti‐tau (serine 404) was purchased from Biosource International (Camarillo, CA, 

USA). Mouse monoclonal PHF‐Tau (AT8; serine 202) was purchased from Pierce Biotechnology 

(Rockford, IL, USA). Rabbit polyclonal AKT was purchased from Cell Signaling Technology 

(Beverly, MA, USA).  Mouse monoclonal Cdk5 (J‐3), rabbit polyclonal p35/p25 (C‐19), PP1 (E‐9), 

and PP2A (FL‐309) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). 

Rabbit polyclonal ERK1/2 and rabbit polyclonal phospho‐ERK1/2 was purchased from 

Chemicon International (Temecula, CA, USA). Horseradish peroxidase‐conjugated secondary 

antibodies were purchased from GE Healthcare (Princeton, NJ). All other reagents were 

purchased from Sigma‐Aldrich (St. Louis, MO). 

 

Cell culture ‐ Human neuroblastoma SH‐SY5Y cell lines were obtained from American Type 

Culture Collection (Manassas, VA, USA). Human neuroblastoma SH‐SY5Y cells were stably 

transfected to express wild‐type and H63D HFE forms as previously reported along with a 

vector alone control (Wang et al., 2004). We have previously reported that these cells were 

chosen because endogenous expression of HFE in these cells could not be detected.  The 

transfected cells were maintained in DMEM/F12 media supplemented with 10% FBS, 1% 

antibiotics (pen‐strep‐glutamine), 1x nonessential amino acids, and 1.8g/L sodium bicarbonate. 

Cells were differentiated with 10 μM all‐trans retinoic acid (Sigma‐Aldrich) over six days 

(Haque et al., 1999). To evaluate cellular iron effects, cells were treated with ferric ammonium 

citrate (FAC) or desferrioxamine (DFO) over 48 hours (Lee et al., 2006). 

 

144

Enzyme linked immunoabsorbant assay (ELISA) ‐ Cells were lysed with RIPA buffer supplemented 

with 1% Triton X‐100 and protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). 

Phosphatase inhibitor (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) was included in cell lysis buffer for 

phosphorylation protein detection. Cells extracts were spun at 8,000 × g for 10 min. Total protein 

levels were determined by Bio‐Rad DC protein assay. A monoclonal antibody specific for 

human tau phosphorylated residues, total tau, total GSK‐3β, and GSK‐3β (ser‐9) was coated 

onto the wells of the microtiter strips provided (Invitrogen (BioSource)). Standards of known 

total and phosphorylated proteins were processed to achieve a standard curve to determine the 

specific amount of total or phosphorylated protein in the unknown HFE cell samples. Twenty‐

five μg total protein of the unknown HFE samples were diluted 1:100 and 1:1000 to achieve the 

desired linear range of specific standard protein concentration (pg/ml) as per the 

manufacturer’s recommendation. The ELISA assay plates were read at 450nm. All ELISA 

experiments were performed using samples in triplicate per genotype and/ or per treatment at 

two dilution concentrations along with the known standards for the specific proteins, resulting 

in a total of six samples for analysis. 

 

Western blot ‐ Cells lysates were obtained as described above. Twenty‐five to forty μg total 

protein was equally separated by electrophoresis in a 4‐20% 12‐well Criterion gel (Bio‐Rad, 

Hercules, CA). Protein was then transferred to a nitrocellulose membrane and blocked for 1 hr 

at room temperature in TBS‐T with 5% nonfat milk or 1.5% BSA (phosphorylated protein 

detection). Membranes were probed with primary antibodies in TBS‐T with 5% nonfat milk 

145

overnight at 4°C. The membranes were incubated respectively with Tau‐5 (1:1000), Tau AT8 

(1:500), Tau pS404 (1:500), Cdk5 (1:1000), p35/p25 (1:1000), AKT (1:1000), ERK1/2 (1:1000), 

pERK1/2 (1:1000), PP1 (1:1000), and PP2A (1:1000). HRP‐conjugated secondary antibodies were 

added in 5% nonfat milk for 1 hr at room temperature. Protein signals were obtained by 

chemiluminescence and visualized by CCD camera. All western blot experiments were repeated 

at least twice with a minimum of four different cultures per genotype per experiment, resulting 

in a total of eight samples for analysis. The bands on the western blot were quantified by 

densitometry using Fuji MultiGauge analysis software. 

 

Statistical analysis ‐ The Student’s t‐test was used for analyzing HFE variant comparisons when 

one variable was being determined. Experimental data where samples were treated with 

various agents (i.e. iron, desferrioxamine, or Trolox) and compared with controls were analyzed 

by one‐way analysis of variance. If overall p <0.05, Tukey’s Multiple Comparison post hoc 

analysis was performed. Differences among the means were considered statistically significant 

when the p value was <0.05.  Data are presented as the mean ± S.E.; GraphPad Prism software 

(version 4.0) was utilized to perform the statistical analysis. 

 

Results 

To begin to determine if there is an association of HFE variants with changes in tau and 

tau phosphorylation, we determined the expression levels of total tau and phosphorylated tau 

in HFE variant cells. No significant differences were detected in total tau protein among H63D‐

146

expressing cells compared to the wild‐type and vector controls (Figure 4.1A). Subsequently, the 

major tau phosphorylation sites related to neurofibrillary tangle formation (Lee et al., 2001; 

Mazanetz and Fischer, 2007): Thr‐181, Serine‐199, Serine‐202, Thr‐205, Serine‐214, Thr‐231, 

Serine‐396, and Serine‐404 were evaluated to obtain a tau phosphorylation profile in cells 

expressing the H63D allele. 

As shown in Figure 4.1B, tau phosphorylation was unchanged at Serine‐214 between the 

cells expressing the wild type or H63D allele. Phosphorylation at the Thr‐181 and Thr‐231 sites 

was significantly decreased (p< 0.05) in cells expressing H63D versus wild‐type HFE‐expressing 

cells. An increase in tau phosphorylation at the Serine‐199 (p < 0.01), Serine‐202 (p< 0.01), 

Serine‐396 (p< 0.001), and Serine‐404 (p<0.05) sites was present in H63D expressing cells 

compared to wild‐type expressing cells (Figures 4.1B and 4.1C). 

Based on the increase of phosphorylation at the majority of tau phosphorylation sites in 

H63D‐expressing cells, we sought to determine the direct mechanisms responsible for these 

observations. Protein kinase and phosphatase activity are the primary regulators for 

maintaining equilibrium of tau phosphorylation (Lee et al., 2001; Jamsa et al., 2004; Ballatore et 

al., 2007; Mazanetz and Fischer, 2007). Therefore, we measured the protein expression and 

activity of Cdk5, ERK‐1 and ERK‐2, and GSK‐3β along with phosphatases PP2A and PP1. 

Cdk5 protein levels are decreased in H63D cells (p<0.05) as well as its activity (p<0.01) 

based on p25 expression levels compared to wild‐type cells (Figure 4.2A). ERK‐2 protein levels, 

but not ERK‐1, were increased in H63D‐expressing cells compared to wild‐type cells (p<0.05) 

(Figure 4.2A). The activity of ERK‐1 and ERK‐2 was not affected by either the expression of 

147

wild‐type or H63D‐expressing forms of HFE (Figure 4.2A). Total GSK‐3β expression levels were 

unaffected by the expression of H63D compared with wild‐type cells (Figure 4.2B), but GSK‐3β 

activity was increased (p<0.05) based on the dephosphorylation of the serine‐9 residue of GSK‐

3β (Figure 4.2B). Because, GSK‐3β phosphorylation and hence activation is inhibited by AKT, 

AKT levels were determined and found to be decreased in H63D cells (p<0.05), which is 

consistent with GSK‐3β activity in H63D cells (Figure 4.2C). Protein phosphatase expression 

(PP2A and PP1) levels were unchanged in the presence of either HFE allele (Figure 4.2D). PP2B 

levels have not been detected in this cell line (Haque et al., 1999). 

To validate that increased GSK‐3β activity is responsible for the increased tau 

phosphorylation in H63D‐expressing cells, we treated the cells with lithium chloride to decrease 

GSK‐3β activity. Lithium treatment decreased tau phosphorylation at the serine‐199 and serine‐

202 in both wild‐type and H63D cells (Figure 4.3). Moreover, tau serine‐396 site was 

significantly decreased in H63D cells only (Figure 4.3). Thus, it appears that GSK‐3β is 

influencing three of the four tau phosphorylation increases seen in H63D variant cells. 

The data on the H63D cells are compelling that GSK‐3β activation is the primary 

mechanism for increasing tau phosphorylation at the Serine‐199, Serine‐202, and Serine‐396 

sites. To elucidate the consequence of the H63D allele on GSK‐3β activity; the effect of changing 

cellular iron status on GSK‐3β was determined. To mimic the effect of increased intracellular 

iron with the H63D allele (Lee et al., 2006), wild‐type expressing cells were treated with ferric 

ammonium citrate (FAC). Addition of FAC was associated with an increase in GSK‐3β activity 

as evidenced by decreased GSK‐3β phosphorylation, 10μM (p<0.01) (Figure 4.4A). To validate 

148

our finding that GSK‐3β activity is iron sensitive, we treated the H63D‐expressing cells with an 

iron chelator, desferrioxamine (DFO), which produced a dose‐dependent decrease in GSK‐3β 

activity, 5μM (p<0.01) and 10μM (p<0.001), (Figure 4.4A). 

The differences in baseline tau phosphorylation between the cells expressing H63D and 

wt HFE raised the possibility that iron exposure, as an environmental agent, could lead to even 

greater levels of tau phosphorylation in the H63D cells. Therefore, we measured tau 

phosphorylation after exposure to iron in the form of FAC. Iron exposure increased tau 

phosphorylation at serine‐199, serine‐396, serine‐202, and serine‐404 (Figure 4.4B). The majority 

of tau phosphorylation sites in wild‐type expressing cells required exposure of 30μM FAC to 

reach the baseline level of tau phosphorylation seen in the H63D‐expressing cells. The already 

elevated levels of tau phosphorylation in the untreated H63D cells increased by 29 and 33% at 

the serine 199 and serine 396 sites, respectively with further FAC exposure (Figure 4.4B). The 

data from the wt cells indicate that the increases in tau phosphorylation in H63D‐expressing 

cells can be attributed to increased cellular iron levels leading to increased GSK‐3β activity. 

Increases in intracellular iron are commonly associated with increased oxidative stress, 

and we have reported an increase in oxidative stress in the cells expressing the H63D allele 

(Wang et al., 2004; Lee et al., 2006). Thus, an additional series of experiments were designed to 

determine if oxidative stress can contribute to the tau phosphorylation changes seen based on 

HFE genotype. Hence, we treated the cells with Trolox, a vitamin E analog to decrease cellular 

oxidative stress. Trolox treatment was associated with decreased tau phosphorylation at serine‐

199 (p<0.05), serine‐202 (p<0.05), and serine‐396 (p<0.01) (Figure 4.5). Tau phosphorylation at 

149

serine‐404 was not affected by Trolox treatment. These data further support the concept of 

increased oxidative stress in H63D‐expressing cells, leading to increased tau phosphorylation. 

Discussion 

H63D gene variants are among the most common gene variants in the human 

population; with estimates of frequency ranging from 6 to 26% differing by population ethnicity 

(Adams et al., 2005). Therefore, if the presence of the HFE H63D variant alters baseline cell 

stress levels, then disease agents, whether genetic or environmental, can expect to find a 

permissive milieu for initiation and progression of disease processes in a significant percentage 

of the general population. Because of the multiple sources of iron in the environment, including 

dietary exposure, the study of HFE polymorphisms and adult onset neurodegenerative disease 

is an attractive model for gene and environment interaction.   

Tau hyperphosphorylation is a common pathological pathway in neurodegenerative 

disorders reported to have an association with HFE gene variants which provided the impetus 

for the cellular studies herein. There is an overall increase in total tau with specific increases in 

tau phosphorylation at the serine‐199, serine‐202, serine‐396 and serine‐404 sites in cells 

expressing the H63D gene variant compared to wild type. GSK‐3β and Cdk5 are the primary 

kinases responsible for these phosphorylation sites mentioned. Therefore, GSK‐3β and Cdk5 

expression and activity was evaluated as a possible mechanism for the increased tau 

phosphorylation. Neither GSK‐3β nor Cdk5 total protein expression was increased; but GSK‐3β 

activity was increased as determined by decreased phosphorylation at its serine 9 residue 

(Grimes and Jope, 2001). The increase in GSK‐3β activity is consistent with increased tau 

150

phosphorylation at the serine‐199, serine‐202, and serine‐396 residues. Cdk‐5 activity was 

decreased as evidenced by decreased expression of its cofactor, p25. The decrease in Cdk‐5 

activity may explain the decreased tau phosphorylation at threonine‐181 and threonine‐231 

because Cdk‐5 is an important priming kinase for these residues (Li et al., 2006; Sengupta et al., 

2006). 

Furthermore, Cdk5 has been shown to inhibit GSK‐3β activity (Plattner et al., 2006). 

Thus, the data from our model are consistent and suggest that decreased expression of Cdk5 

may allow for increased GSK‐3β activity. To further support that increased GSK‐3β activity 

caused the increased tau phosphorylation in H63D expressing cells, we treated the cells with 

lithium chloride. Lithium chloride inhibits GSK‐3β activity and subsequently tau 

phosphorylation (Jamsa et al., 2004). Indeed this compound  has been used clinically in some 

neurodegenerative diseases in which tau phosphorylation is part of the pathogenic profile 

(Fornai et al., 2008). In our study, lithium treatment decreased tau phosphorylation at the 

serine‐199, serine‐202, and serine‐396 sites.  

The primary phenotype of expressing the H63D allele is thought to be an increase in the 

labile iron pool (Feder et al., 1998; Lee et al., 2006) and an associated potential increase in 

oxidative stress (Pulliam et al., 2003; Lee et al., 2006); both of which occur in our model. 

Therefore, we determined if cellular iron levels and oxidative stress were influencing tau 

phosphorylation. Because GSK‐3β dephosphorylation levels and subsequent activation appears 

to be the primary direct mechanism responsible for increased tau phosphorylation sites seen in 

our model, we determined if GSK‐3β expression and activity are iron‐sensitive. Indeed, iron 

151

treatment increased GSK‐3β activity and treating the cells with an iron chelator decreased GSK‐

3β activity. GSK‐3β has been shown to be regulated by Cdk5 and a previous study showed that 

increasing iron levels are associated with decreased Cdk5 expression (Egana et al., 2003). Thus, 

it is consistent with our findings that the H63D expressing cells have higher amounts of labile 

iron and increased GSK‐3β activity.  

An additional mechanism that can lead to tau hyperphosphorylation is oxidative stress 

(Ballatore et al., 2007). Iron imbalance can contribute to cellular oxidative stress primarily 

through the classical Fenton chemistry reaction producing hydroxyl radicals (Arosio and Levi, 

2002; Zecca et al., 2004). The H63D allelic variant of HFE has been associated with evidence of 

increased oxidative stress in patients carrying the mutant allele (Pulliam et al., 2003) and in our 

cellular model based on increased protein oxidation and decreased mitochondrial membrane 

potential (Lee et al., 2006). Hence, we evaluated if oxidative stress could be contributing to the 

increased tau phosphorylation seen in the H63D cells. Treatment with the anti‐oxidant, Trolox, 

a vitamin‐E analog; decreased tau phosphorylation indicating that iron‐mediated oxidative 

stress could be driving the increase in tau phosphorylation seen in the presence of H63D HFE. 

In summary, there is a fundamental difference in the baseline of tau phosphorylation in 

cells that carry the H63D variant of the HFE gene. This observation is consistent with the 

conceptual framework for this line of research that HFE gene variants are a risk factor or disease 

modifier in neurodegenerative diseases. We do not propose that the H63D gene is a causative 

agent in neurodegenerative disease, but rather is a major factor in establishing a permissive 

intracellular milieu that enables that causative agent. In this case, H63D allelic variants promote 

152

tau phosphorylation by nature of increased intracellular iron and oxidative stress. Additionally, 

environmental factors that increase iron exposure or oxidative stress could be anticipated to 

exacerbate the hyperphosphorylation and effects on cellular enzyme activity related to tau 

phosphorylation as was demonstrated in this study by the addition of iron to the H63D cells. 

These data further suggest that a combination of environmental factors and the H63D gene 

variants could explain in inconsistent findings on the association between H63D and 

Alzheimer’s disease. Furthermore, based on the fundamental cell differences in extent of tau 

phosphorylation, stratification of patients according to HFE polymorphisms may be useful 

when evaluating treatment strategies. 

 

Acknowledgements 

  Copyrighted material from this chapter appears in the Neurobiology of Aging journal 

(Hall et al. Expression of the HFE allelic variant H63D in SH‐SY5Y cells affects tau 

phosphorylation at serine residues. Neurobiol Aging 2009). 

 

153

Total Tau

Vector WT H63D0

1.0×105

2.0×105

3.0×105

4.0×105

tau

pg/m

l

Tau pT181

Vector WT H63D0

1.0×104

2.0×104

p< 0.05

p< 0.01

p< 0.001

tau

pg/m

l

Tau pS199

Vector WT H63D0

2.5×104

5.0×104

7.5×104

1.0×105

p< 0.01

tau

pg/m

l

p< 0.05

Tau pT231

Vector WT H63D0

2.0×104

4.0×104

6.0×104

p< 0.05

tau

pg/m

l

p< 0.01

Figure 4.1: Tau Phosphorylation in HFE stably transfected SH‐SY5Y cells. Expression of total tau protein was measured in an HFE polymorphism stably transfected SH‐SY5Y cell line by ELISA (A); no significant differences were found. Specific tau phosphorylation sites were determined by ELISA (B) and western blot (C). This figure shows that tau phosphorylation patterns differ in comparing wild type and H63D HFE cell expression. Tau phosphorylation was found to be increased in H63D cells at the serine‐199 (p<0.01), serine‐202 (p<0.01), serine 396 (p<0.001), and serine 404 (p<0.05) residues. Decreased phosphorylation was found in cells expressing H63D HFE at the threonine‐181 (p<0.05) and threonine‐231 (p<0.05) sites as well. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. Representative western blot images are shown with graphs displaying differences in expression determined by densitometric analysis. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E.  A. 

B.

Tau pS214

Vector WT H63D0

2.0×103

4.0×103

6.0×103

p< 0.05p< 0.05

tau

pg/m

l

154

Tau pS404

Vector WT H63D0

4.0×100

8.0×100

p< 0.05p< 0.01

p< 0.001

AU

B.

C.

Tau pS396

Vector WT H63D0

5.0×104

1.0×105

1.5×105

p< 0.001p< 0.01

tau

pg/m

l

pS202

β-actin

Vector WT H63D

pS404

Vector WT H63D

β-actin

Tau pS202

Vector WT H63D0

4.0×105

8.0×105

p< 0.01p< 0.01

AU

155

ERK 1

Vector WT H63D0

4.0×105

8.0×105

1.2×106

1.6×106

AU

ERK 2

Vector WT H63D0

1.0×106

2.0×106

3.0×106 p< 0.05

p< 0.05

AU

Figure 4.2: Kinase and Phosphatase expression in SH‐SY5Y cells. Expression of major kinases shown to impact tau phosphorylation was measured by western blot and ELISA. In figure A, Cdk5 expression (p<0.05) and activity levels based on p25 expression levels (p<0.01) were decreased in cells expressing H63D compared to wild type expressing cells (A). ERK 1 and ERK 2 expression levels where unchanged and increased (p<0.05), respectively. ERK 1 and ERK 2 activity were found to be unchanged based on phosphorylated ERK 1 and ERK 2 expression levels (A). Total GSK‐3β expression levels and GSK‐3β activity determined by dephosphorylation of the serine‐9 site was measured by ELISA (B). Total GSK‐3β levels were unchanged. GSK‐3β serine‐9 levels were decreased in H63D expressing cells compared to wild type (p<0.05) indicating increased GSK‐3β activity. AKT is an upstream kinase of GSK‐3β that has been shown to modulate GSK‐3β activity. Total AKT expression levels were measured by western blot (C). Total AKT levels were decreased (p<0.05) in H63D expressing cells. Phosphatase expression was measured by western blot (D). PP1 and PP2A expression levels were found unchanged. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. 

A.

Cdk-5

Vector WT H63D

p35

p25

Vector WT H63D

CDK5

Vector WT H63D0

3.0×105

6.0×105

9.0×105

p< 0.05p< 0.001

AU

p25

Vector WT H63D0

1.0×105

2.0×105

3.0×105p< 0.01

p< 0.001

AU

β-actinβ-actin

ERK 1

ERK 2

Vector WT H63D

β-actin

156

pERK1

Vector WT H63D0

5.0×105

1.0×106

AU

pERK2

Vector WT H63D0

5.0×105

1.0×106

AU

A.

B.

C.

pERK 1

pERK 2

Vector WT H63D

β-actin

Total GSK-3beta

Vector WT H63D0.00

0.15

0.30

p< 0.01

OD

450

nm

p< 0.01

GSK-3beta (ser-9)

Vector WT H63D0

1.5×10-1

3.0×10-1

4.5×10-1

p< 0.05

p< 0.01O

D 4

50 n

m

AKT

Vector WT H63D

β-actin

Total AKT

Vector WT H63D0

2.0×106

4.0×106

p< 0.05p< 0.01

AU

157

PP2A

Vector WT H63D0

2.0×106

4.0×106

AU

D.

PP1

Vector WT H63D

β-actin

PP2A

β-actin

Vector WT H63D

PP1

Vector WT H63D0

2.0×106

4.0×106

AU

158

Tau pS202

WTH63

D

WT 10mM

H63D 10

mM

WT 20mM

H63D 20

mM0.0

0.5

1.0

1.5 b

a, ^ ^^ *%

Diff

eren

ce

Tau pS404

WTH63

D

WT 10mM

H63D 10

mM

WT 20mM

H63D 20

mM0.0

0.5

1.0

% D

iffer

ence

Figure 4.3: Inhibition of tau phosphorylation. GSK‐3β inhibition was performed by treating the cells with increasing amounts of lithium chloride. The tau phosphorylation sites found to be increased in H63D cells were treated based on evidence of GSK‐3β being shown to be the primary kinase responsible for increased tau phosphorylation in our cell model system. Lithium treatment decreased tau phosphorylation at the serine‐199, serine‐202, and serine‐396 sites determined by ELISA and western blot. The phosphorylation at the serine‐404 site was unaffected. Lithium treatment decreased tau phosphorylation at the serine‐396 site only in H63D cells. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The letters a (p<0.05), b (p<0.01), and c (p<0.001) indicate significance from baseline wild type HFE. The symbols # (p<0.05), * (p<0.01), and ^ (p<0.001) indicate significance from wild type HFE. 

  

Tau pS199

WT H63

D

WT 10m

M

H63D 10

mM

WT 20m

M

H63D 20

mM0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

b, ^

b

*#

a, ^% D

iffer

ence

 

Tau pS396

WT

H63D

WT 1

0mM

H63D 10

mM

WT 2

0mM

H63D 20

mM0.0

0.5

1.0

1.5

2.0a

c

#

% D

iffer

ence

159

GSK-3beta (ser-9)

WT-contro

l

WT-10µM

iron

WT-30µM

iron

0.0

0.5

1.0

p< 0.01

% D

iffer

ence

Tau pS202

WT

H63D

WT 10

µM

H63D 10

µM

WT 30

µM

H63D 30

µM

0.0

0.5

1.0

ab b

% D

iffer

ence

Figure 4.4: Impact of cellular iron on GSK‐3β activity and tau phosphorylation. We added increasing amounts of ferrous ammonium citrate to cells expressing wild type HFE, and increasing amounts of the iron chelator desferrioxamine (DFO) to cells expressing H63D HFE, and measured GSK‐3β activity (A). GSK‐3 activity increased with iron treatment (p<0.01) and decreased GSK‐3β activity with DFO treatment (p<0.001) determined by ELISA.  Tau phosphorylation sites increased with iron treatments (10μM, 30μM) at the serine‐199, serine‐396, serine‐202, and serine‐404 determined by ELISA and western blot (B). One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The letters a (p<0.05), b (p<0.01), and c (p<0.001) indicate significance from baseline wild type HFE. The symbols # (p<0.05), * (p<0.01), and ^ (p<0.001) indicate significance from baseline H63D. 

A.

B.

GSK-3beta (ser-9)

H63D-co

ntrol

H63D-5µ

M DFO

H63D-10

µM D

FO0.0

0.5

1.0

1.5 p< 0.01

p< 0.001

% D

iffer

ence

Tau pS199

WT

H63D

WT 1

0µM

H63D 10

µM

WT 3

0µM

H63D 30

µM0.0

0.5

1.0

1.5

2.0b

a

c, #c, *

% D

iffer

ence

Tau pS396

WT

H63D

WT 1

0µM

H63D 10

µM

WT 3

0µM

H63D 30

µM0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

b

c, * c, #

a a

% D

iffer

ence

Tau pS404

WT

H63D

WT 1

0µM

H63D 10

µM

WT 3

0µM

H63D 30

µM0.0

0.5

1.0

1.5a

b, #

% D

iffer

ence

B.

161

Tau pS202

WTH63

D

WT trolox

H63D tro

lox0.0

0.5

1.0

1.5

*

a#

% D

iffer

ence

Tau pS404

WTH63

D

WT trolox

H63D tr

olox0.0

0.5

1.0

1.5a a

% D

iffer

ence

Figure 4.5: Tau Phosphorylation in SH‐SY5Y cells with Trolox treatment. Increased tau phosphorylation sites were treated for 72 hours with 200 μM Trolox, a water‐soluble vitamin E analog to assess the effect of oxidative stress on tau phosphorylation. Trolox treatment decreased tau phosphorylation at serine‐199 (p<0.05), serine‐202 (p<0.05), and serine‐396 (p<0.01) in H63D cells compared to wild‐type determined by ELISA and western blot. One‐way ANOVA was performed to analyze the data, followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The letters a (p<0.05), b (p<0.01), and c (p<0.001) indicate significance from baseline wild type HFE. The symbols # (p<0.05), * (p<0.01), and ^ (p<0.001) indicate significance from baseline H63D.

Tau pS199

WT

H63D

WT tro

lox

H63D tro

lox0.0

0.5

1.0

1.5a

* #

% D

iffer

ence

Tau pS396

WT

H63D

WT tro

lox

H63D tro

lox0.0

0.5

1.0

1.5a

*#

% D

iffer

ence

162

References 

Adams, P. C., D. M. Reboussin, et al. (2005). ʺHemochromatosis and iron‐overload screening in 

a racially diverse population.ʺ N Engl J Med 352(17): 1769‐78. 

Arosio, P. and S. Levi (2002). ʺFerritin, iron homeostasis, and oxidative damage.ʺ Free Radic Biol 

Med 33(4): 457‐63. 

Ballatore, C., V. M. Lee, et al. (2007). ʺTau‐mediated neurodegeneration in Alzheimerʹs disease 

and related disorders.ʺ Nat Rev Neurosci 8(9): 663‐72. 

Bartzokis, G., T. A. Tishler, et al. (2006). ʺBrain ferritin iron may influence age‐ and gender‐

related risks of neurodegeneration.ʺ Neurobiol Aging. 

Bartzokis, G., T. A. Tishler, et al. (2007). ʺBrain ferritin iron may influence age‐ and gender‐

related risks of neurodegeneration.ʺ Neurobiol Aging 28(3): 414‐23. 

Borie, C., F. Gasparini, et al. (2002). ʺAssociation study between iron‐related genes 

polymorphisms and Parkinsonʹs disease.ʺ J Neurol 249(7): 801‐4. 

Bush, A. I. (2003). ʺThe metallobiology of Alzheimerʹs disease.ʺ Trends Neurosci 26(4): 207‐14. 

Connor, J. R. and S. Y. Lee (2006). ʺHFE mutations and Alzheimerʹs disease.ʺ J Alzheimers Dis 

10(2‐3): 267‐76. 

Connor, J. R., E. A. Milward, et al. (2001). ʺIs hemochromatosis a risk factor for Alzheimerʹs 

disease?ʺ J Alzheimers Dis 3(5): 471‐477. 

163

De Sarno, P., X. Li, et al. (2002). ʺRegulation of Akt and glycogen synthase kinase‐3 beta 

phosphorylation by sodium valproate and lithium.ʺ Neuropharmacology 43(7): 1158‐64. 

Dekker, M. C., P. C. Giesbergen, et al. (2003). ʺMutations in the hemochromatosis gene (HFE), 

Parkinsonʹs disease and parkinsonism.ʺ Neurosci Lett 348(2): 117‐9. 

Egana, J. T., C. Zambrano, et al. (2003). ʺIron‐induced oxidative stress modify tau 

phosphorylation patterns in hippocampal cell cultures.ʺ Biometals 16(1): 215‐23. 

Ellervik, C., A. Tybjaerg‐Hansen, et al. (2007). ʺHereditary hemochromatosis genotypes and risk 

of ischemic stroke.ʺ Neurology 68(13): 1025‐31. 

Feder, J. N., D. M. Penny, et al. (1998). ʺThe hemochromatosis gene product complexes with the 

transferrin receptor and lowers its affinity for ligand binding.ʺ Proc Natl Acad Sci U S A 

95(4): 1472‐7. 

Fornai, F., P. Longone, et al. (2008). ʺLithium delays progression of amyotrophic lateral 

sclerosis.ʺ Proc Natl Acad Sci U S A 105(6): 2052‐7. 

Goodall, E. F., M. J. Greenway, et al. (2005). ʺAssociation of the H63D polymorphism in the 

hemochromatosis gene with sporadic ALS.ʺ Neurology 65(6): 934‐7. 

Grimes, C. A. and R. S. Jope (2001). ʺThe multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in 

cellular signaling.ʺ Prog Neurobiol 65(4): 391‐426. 

164

Guerreiro, R. J., J. M. Bras, et al. (2006). ʺAssociation of HFE common mutations with 

Parkinsonʹs disease, Alzheimerʹs disease and mild cognitive impairment in a Portuguese 

cohort.ʺ BMC Neurol 6: 24. 

Haque, N., T. Tanaka, et al. (1999). ʺRegulation of expression, phosphorylation and biological 

activity of tau during differentiation in SY5Y cells.ʺ Brain Res 838(1‐2): 69‐77. 

Iqbal, K. and I. Grundke‐Iqbal (2006). ʺDiscoveries of tau, abnormally hyperphosphorylated tau 

and others of neurofibrillary degeneration: a personal historical perspective.ʺ J 

Alzheimers Dis 9(3 Suppl): 219‐42. 

Jamsa, A., K. Hasslund, et al. (2004). ʺThe retinoic acid and brain‐derived neurotrophic factor 

differentiated SH‐SY5Y cell line as a model for Alzheimerʹs disease‐like tau 

phosphorylation.ʺ Biochem Biophys Res Commun 319(3): 993‐1000. 

Lee, S. Y., S. M. Patton, et al. (2006). ʺConsequences of expressing mutants of the 

hemochromatosis gene (HFE) into a human neuronal cell line lacking endogenous HFE.ʺ 

Faseb J. 

Lee, V. M., M. Goedert, et al. (2001). ʺNeurodegenerative tauopathies.ʺ Annu Rev Neurosci 24: 

1121‐59. 

Li, T., C. Hawkes, et al. (2006). ʺCyclin‐dependent protein kinase 5 primes microtubule‐

associated protein tau site‐specifically for glycogen synthase kinase 3beta.ʺ Biochemistry 

45(10): 3134‐45. 

165

Mazanetz, M. P. and P. M. Fischer (2007). ʺUntangling tau hyperphosphorylation in drug design 

for neurodegenerative diseases.ʺ Nat Rev Drug Discov 6(6): 464‐79. 

Mitchell, R., W. Freeman, et al. (2008). ʺA CSF Biomarker Panel for Identification of Patients 

with Amyotrophic Lateral Sclerosis.ʺ Neurology (in press). 

Percy, M., S. Moalem, et al. (2008). ʺInvolvement of ApoE E4 and H63D in sporadic Alzheimerʹs 

disease in a folate‐supplemented Ontario population.ʺ J Alzheimers Dis 14(1): 69‐84. 

Plattner, F., M. Angelo, et al. (2006). ʺThe roles of cyclin‐dependent kinase 5 and glycogen 

synthase kinase 3 in tau hyperphosphorylation.ʺ J Biol Chem 281(35): 25457‐65. 

Pulliam, J. F., C. D. Jennings, et al. (2003). ʺAssociation of HFE mutations with 

neurodegeneration and oxidative stress in Alzheimerʹs disease and correlation with 

APOE.ʺ Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 119B(1): 48‐53. 

Restagno, G., F. Lombardo, et al. (2007). ʺHFE H63D polymorphism is increased in patients with 

amyotrophic lateral sclerosis of Italian origin.ʺ J Neurol Neurosurg Psychiatry 78(3): 327. 

Sengupta, A., M. Novak, et al. (2006). ʺRegulation of phosphorylation of tau by cyclin‐

dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase‐3 at substrate level.ʺ FEBS Lett 

580(25): 5925‐33. 

Sutedja, N. A., R. J. Sinke, et al. (2007). ʺThe association between H63D mutations in HFE and 

amyotrophic lateral sclerosis in a Dutch population.ʺ Arch Neurol 64(1): 63‐7. 

166

Waalen, J., B. G. Nordestgaard, et al. (2005). ʺThe penetrance of hereditary hemochromatosis.ʺ 

Best Pract Res Clin Haematol 18(2): 203‐20. 

Wang, X. S., S. Lee, et al. (2004). ʺIncreased incidence of the Hfe mutation in amyotrophic lateral 

sclerosis and related cellular consequences.ʺ J Neurol Sci 227(1): 27‐33. 

Yen, A. A., E. P. Simpson, et al. (2004). ʺHFE mutations are not strongly associated with 

sporadic ALS.ʺ Neurology 62(9): 1611‐2. 

Zecca, L., M. B. Youdim, et al. (2004). ʺIron, brain ageing and neurodegenerative disorders.ʺ Nat 

Rev Neurosci 5(11): 863‐73. 

167

Chapter 5

Prolyl‐Peptidyl Isomerase, Pin1, Activity is Compromised in Association with 

the Expression of the HFE Polymorphic Allele, H63D

Abstract  

There is substantial interest in HFE gene variants as putative risk factors in 

neurodegenerative diseases such as Alzheimer disease (AD). Previous studies in cell models 

have shown the H63D HFE variant to result in increased cellular iron, oxidative stress, 

glutamate dyshomeostasis, and an increase in tau phosphorylation; all processes thought to 

contribute to AD pathology. Pin1 is a prolyl‐peptidyl cis/trans isomerase that regulates the 

dephosphorylation of the amyloid and tau proteins implicated in AD. Previous reports have 

shown Pin1 function to be altered by oxidative stress, thus it was logical to hypothesize that 

expressing the H63D polymorphism would decrease Pin1 activity. To test our hypothesis, we 

utilized stably transfected human neuroblastoma SH‐SY5Y cell lines expressing the different 

HFE polymorphisms. Under resting conditions, total Pin1 levels were unchanged between the 

wild type and H63D HFE cells, yet there was a significant decrease in Pin1 activity in H63D 

variant cells as determined by phosphorylation of Pin1 at its serine 16 residue. To evaluate 

whether cellular iron status could influence Pin1, we treated the WT HFE cells with exogenous 

iron in the form of ferric ammonium citrate and found Pin1 phosphorylation increased with 

increasing levels of iron. Iron exposure to H63D variant cells did not impact Pin1 

phosphorylation. Removal of iron with desferrioxamine increased Pin1 activity in H63D cells, 

168

but had no effect in cells expressing WT HFE. Collectively, these data suggest that Pin1 can be 

altered by cellular iron and that H63D gene variants alter the activity of Pin1 in a direction 

predicted by changes in iron status. The data also indicate there is a cellular equilibrium 

mechanism of Pin1 activity in cells that is reset by the presence of H63D. The HFE H63D cells 

have been shown to be more susceptible to oxidative stress, which can also impact Pin1 

function. Therefore we treated the HFE cells with the antioxidant Trolox. Pin1 phosphorylation 

decreased in H63D cells and was unaffected in WT HFE cells with Trolox treatment. These data 

further support that H63D impacts Pin1 function in the cell. Thus, we have shown another 

cellular mechanism that HFE polymorphisms can influence regarding their putative role as risk 

factors for neurodegenerative diseases. 

 

Introduction 

Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disease that results in cognitive 

deficiencies presumably resulting from neuropathological changes including accumulation of 

amyloid‐beta (Aβ) plaques and neurofibrillary tangles (NFT) (Selkoe, 1989; Mandelkow and 

Mandelkow, 1993; Trojanowski et al., 1995). Numerous studies have discovered that biometals 

such as iron, copper, zinc, and aluminum can directly impact AD pathological markers (Bush, 

2003; Huang et al., 2004; Zecca et al., 2004). Iron has been shown to directly regulate amyloid 

precursor protein (APP) synthesis via an iron responsive element in the 5’ UTR of APP mRNA 

(Rogers et al., 2002). Furthermore, iron and other metals have been found in neuritic plaques 

and also influence amyloid‐beta (Aβ) aggregation (Connor et al., 1992a; Connor et al., 1992b; 

169

Huang et al., 2004; Liu et al., 2006) and metal chelators have been shown to be effective in 

removing Aβ plaques in a AD transgenic mouse model (Cherny et al., 2001). The aggregation of 

tau protein leading to NFT pathology is also impacted by iron (Sayre et al., 2000; Egana et al., 

2003). It is clear from these data that metal homeostasis in the brain is essential for healthy brain 

aging and that identification of  genetic and environmental factors that may disrupt the 

biometal homeostasis is critical to identifying pathogenic mechanisms leading to 

neurodegenerative processes.    

One such factor that combines gene and environment interaction is HFE.  The gene is 

located on chromosome 6 and has been investigated in numerous genetics studies as a possible 

risk factor for developing or modifying AD onset (Connor and Lee, 2006). HFE protein is a 

major histocompatibility class‐1 like molecule that is reported to be involved in iron regulation 

(Feder et al., 1998) and innate immunity (Ehrlich and Lemonnier, 2000; Rohrlich et al., 2005). 

One of the reported functions of HFE protein is to complex with transferrin receptor (TfR) at the 

cell membrane to decrease TfR affinity for iron uptake (Feder et al., 1998). When the H63D HFE 

variant is expressed, the ability to limit iron uptake is lost, resulting in increased cellular iron 

(Feder et al., 1998; Lee et al., 2007). The elevated cellular iron levels associated with the H63D 

can lead to oxidative stress (Pulliam et al., 2003; Lee et al., 2007) and exacerbate the 

inflammatory response of macrophages (Mitchell et al., 2009). Recently, we have reported that  

cells carrying the H63D HFE have alterations in glutamate homeostasis and tau 

phosphorylation (Hall II et al., in press; Mitchell et al., in press). These proposed functions of 

170

HFE and the data on H63D HFE are directly relevant to AD pathogenesis mechanisms that 

involve iron, oxidative stress, and neuroinflammation.  

The prolyl‐peptidyl isomerase Pin1 can affect numerous cellular mechanisms, such as 

protein localization, protein interactions, protein dephosphorylation, transcription activity, 

enzymatic activity, protein stability, and cell cycle regulation (Wulf et al., 2005; Lu and Zhou, 

2007; Takahashi et al., 2008). Pin1 has two domains, an N‐terminal WW domain and a C‐

terminal PPIase domain, that represent its unique ability to bind specific serine/threonine‐

proline substrates and alter their conformation, respectively (Lu et al., 2002; Lu and Zhou, 2007). 

The ability of Pin1 to alter the cis‐ and trans‐confirmation of its substrate proteins is the direct 

mechanism that affects the phosphorylation status of its targeted proteins (Lu et al., 2002; Lu 

and Zhou, 2007). Pin1 interacts with protein phosphatase 2A (PP2A) to dephosphorylate its 

protein substrates (Hamdane et al., 2006; Balastik et al., 2007; Lu and Zhou, 2007).  

A study investigating mild cognitively impaired (MCI) patients found Pin1 to be an 

oxidatively modified protein that could impact future AD development (Butterfield et al., 2006). 

Pin1 can regulate the phosphorylation of APP and tau at the Threonine 668 and Threonine 231 

residues, respectively (Hamdane et al., 2002; Hamdane et al., 2006; Pastorino et al., 2006; 

Balastik et al., 2007). A deficiency in Pin1 expression and/or activity appears to lead to the 

accumulation of Aβ fragments and NFT formation suggesting this enzyme could be a key 

regulator of proteins involved in AD pathology (Liou et al., 2003; Hamdane et al., 2006; 

Pastorino et al., 2006).  Thus, we hypothesized that cells expressing H63D would have 

171

decreased Pin1 activity due to the increased oxidative stress associated with expressing the 

H63D allele. 

 

Materials and methods

Reagents ‐ Cell culture reagents including DMEM/F12, DMEM, pen/strep/glutamine and 

Geneticin were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fetal bovine serum was 

purchased from Gemini Bio‐Products (West Sacramento, CA, USA). DC protein assay was 

obtained from Bio‐Rad (Hercules, CA, USA).  A rabbit   polyclonal Pin1 antibody was 

purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). A rabbit polyclonal Pin1 

(serine 16) antibody was purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). 

 

Cell culture ‐ Human neuroblastoma SH‐SY5Y cell lines were obtained from American Type 

Culture Collection (Manassas, VA, USA). Human neuroblastoma SH‐SY5Y cells were stably 

transfected to express wild‐type and H63D HFE forms as previously reported along with a 

vector alone control (Wang et al., 2004). We have previously reported that these cells were 

chosen because endogenous expression of HFE could not be detected.  The transfected cells 

were maintained in DMEM/F12 media supplemented with 10% FBS, 1% antibiotics (pen‐strep‐

glutamine), 1x nonessential amino acids, and 1.8g/L sodium bicarbonate. Cells were 

differentiated with 10 μM all‐trans retinoic acid (Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO, USA) over six 

days (Haque et al., 1999). To evaluate cellular iron effects, cells were treated with ferric 

172

ammonium citrate (FAC) or desferrioxamine (DFO) over 48 hours (Sigma‐Aldrich, St. Louis, 

MO, USA) (Lee et al., 2007). 

Cell lysate preparation ‐ Cells were lysed with RIPA buffer supplemented with 1% Triton X‐100 

and protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Phosphatase inhibitor (Sigma 

Aldrich, St. Louis, MO) was included in cell lysis buffer for phosphorylation protein detection. 

Cells extracts were spun at 8,000 × g for 10 min. Total protein levels were determined by Bio‐

Rad DC protein assay. 

 

Enzyme linked immunoabsorbant assay (ELISA) ‐ The phosphorylation of APP at threonine 668 was 

determined using a DuoSet IC ELISA assay (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). An 

immobilized capture antibody for multiple APP isoforms that binds phosphorylated and 

unphosphorylated protein was used to coat the wells of a 96 well microplate overnight. 

Phosphorylated APP threonine 668 protein standards were added to achieve a standard curve 

to determine the specific amount of phosphorylated APP in unknown HFE cell samples. A 

biotynalated detection antibody recognizing APP threonine 668 was used to detect 

phosphorylated APP using standard streptavidin‐HRP.  The ELISA assay plates were read at 

450nm and 540nm to correct for optical imperfections. All solutions used throughout were 

provided or prepared according to the manufacturer’s recommendations. This ELISA 

experiment was performed using samples in triplicate per genotype at two dilution 

173

concentrations along with the known standards for the phosphorylated APP threonine 668 

proteins, resulting in a total of six samples for analysis. 

A monoclonal antibody specific for human tau phosphorylated residue threonine 231 

was coated onto the wells of the microtiter strips provided (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 

Standards of known phosphorylated tau threonine 231 proteins were processed to achieve a 

standard curve to determine the specific amount of phosphorylated protein in the unknown 

HFE cell samples. The ELISA assay plate was read at 450nm. This ELISA experiment was 

performed using samples in triplicate per genotype at two dilution concentrations along with 

the known standards for the phosphorylated tau threonine 231 proteins, resulting in a total of 

six samples for analysis.  

 

Western blot ‐ Cells lysates were obtained as described above. Twenty‐five to forty μg total 

protein was equally separated by electrophoresis in a 4‐20% 12‐well Criterion gel (Bio‐Rad, 

Hercules, CA). Protein was then transferred to a nitrocellulose membrane and blocked for 1 hr 

at room temperature in TBS‐T with 5% nonfat milk or 1.5% BSA (phosphorylated protein 

detection). Membranes were probed with primary antibodies in TBS‐T with 5% nonfat milk 

overnight at 4°C. The membranes were incubated with antibodies specific for total Pin1 (1:1000), 

Pin1 serine‐16 (1:500), and β‐actin (1:5000). HRP‐conjugated secondary antibodies were added 

in 5% nonfat milk for 1 hr at room temperature. Protein signals were obtained by 

chemiluminescence and visualized by CCD camera. All western blot experiments were repeated 

at least twice with a minimum of four different cultures per genotype per experiment, resulting 

174

in a total of eight samples for analysis. The bands on the western blot were quantified by 

densitometry using Fuji MultiGauge analysis software. 

 

Statistical analysis ‐ The Student’s t‐test was used for analyzing HFE variant comparisons when 

one variable was being determined. Experimental data where samples were treated with 

various agents (i.e. iron or desferrioxamine) and compared with controls were analyzed by one‐

way analysis of variance. Differences among the means were considered statistically significant 

when the p value was <0.05. If overall p <0.05, Tukey’s Multiple Comparison post hoc analysis 

was performed. Data are presented as the mean ± S.E.; GraphPad Prism software (version 4.0) 

was utilized to perform the statistical analysis. 

 

Results 

The first study was designed to examine total Pin 1 protein expression as a function of 

genotype.  No significant differences were found (Figure 1). The phosphorylation of Pin1 at its 

serine 16 residue, a measure of Pin1 activity, was significantly increased (30%) in cells 

expressing the H63D variant (p<0.01) compared to the vector and wild type HFE cells (Figure 

5.1). These data would suggest that there is approximately a 30% decrease in the activity of Pin1 

in H63D cells.  

Because HFE is involved in regulating cellular iron status and we have shown that there 

is more iron in the labile iron pool in cells carrying the H63D variant, the second study was to 

determine if iron could impact Pin1 phosphorylation status. Upon, treating the wild type HFE 

175

cells with ferric ammonium citrate (FAC), total Pin1 protein expression was unaffected (Figure 

5.2A) but the phosphorylation of Pin1 at serine 16 increased in a dose dependent manner (10 

μM FAC, (p<0.01); 30 μM FAC, p<0.001) compared to the non‐treated wild type control (Figure 

5.2B). However, differences in Pin1 phosphorylation in the H63D carrying cells treated with 

FAC did not reach statistical significance at p<0.05 cutoff at the same concentrations of iron 

provided to WT cells (Figure 5.2B). 

To continue to evaluate the sensitivity of Pin1 phosphorylation to iron availability, the 

WT and H63D cells were treated with the iron chelator desferrioxamine (DFO). Pin1 

phosphorylation was unaffected in the wt HFE cells by iron chelation but was decreased with 

10 μM DFO treatment (p<0.01) in the H63D HFE cell lines (Figure 5.3).  

Increased cellular iron can result in oxidative stress. There is evidence of oxidative stress 

impacting the cellular activity of Pin1 (Butterfield et al., 2006; Sultana et al., 2006; Kap et al., 

2007) and we have shown increased indices of oxidative stress in H63D expressing cells (Lee et 

al., 2007). Therefore, we treated the cells expressing the HFE variants with Trolox, a vitamin E 

analog to decrease cellular oxidative stress. Pin1 phosphorylation decreased approximately 20% 

with Trolox treatment in H63D cells (p=0.0257), but was unchanged in the control wt expressing 

cells treated with Trolox (Figure 5.4). 

  Pin1 has been shown to regulate the phosphorylation of AD related proteins (Hamdane 

et al., 2006; Pastorino et al., 2006; Balastik et al., 2007). Therefore, APP phosphorylation at its 

threonine 668 residue was measured in HFE cells by enzyme‐linked immunoabsorbant assay 

(ELISA). APP phosphorylation was increased in vector cells by approximately 65% (p<0.01) 

176

compared to cells expressing wild type HFE (Figure 4). Cells expressing the H63D variant had 

50% less APP threonine 668 phosphorylation (p<0.05) with respect to WT HFE cells (Figure 5). 

Tau threonine 231 phosphorylation was evaluated by ELISA and was decreased in vector cells 

(p<0.01) by 42% and H63D expressing cells (p<0.05) by 33% compared to cells expressing WT 

HFE (Figure 5.5). 

 

Discussion  

The H63D variant of HFE gene is under examination as a risk factor for 

neurodegenerative diseases. We have established a cell model in which to directly examine the 

impact of HFE polymorphisms on an otherwise homogenous genetic background in a 

controlled culture condition. The controlled conditions are essential to understanding the 

contribution of HFE gene variants to neurodegenerative disease because of the likelihood of 

gene/environment interaction given the availability of iron in the environment. Our working 

hypothesis for H63D HFE gene variants and neurodegenerative disorders is that the H63D 

allelic variants does not in itself cause disease but creates a permissive or enabling cellular 

milieu for pathogenic agents. We have previously reported that expression of the H63D HFE 

variant in stably transfected SH‐SY5Y cells results in increased cellular stress (Lee et al., 2007), 

altered glutamate homeostasis (Mitchell et al., in press), and increased tau phosphorylation 

(Hall II et al., in press). Oxidative stress and glutamate excitotoxicity are indirectly thought to 

contribute to neurodegeneration in AD whereas tau phosphorylation is more directly 

implicated as part of the pathogenesis of AD (Doble, 1999; Ballatore et al., 2007). In this study, 

177

we extend these observations to show that Pin1, an enzyme responsible for regulating 

phosphorylation of amyloid and tau, is altered in cells expressing H63D HFE.   

  H63D HFE cells have more labile iron in the cytosol (Lee et al., 2007; Mitchell et al., 2009) 

than wt HFE cells. Therefore, we treated the wt cells with increasing amounts of iron which 

resulted in a dose‐dependent increase in phosphorylation of Pin1 at its serine 16 residue.  We 

also challenged the H63D HFE cells with more iron to determine if we could further increase 

the phosphorylation of Pin1 but increasing amounts of iron did not significantly increase Pin1 

phosphorylation. To further evaluate the sensitivity of Pin1 to iron and the influence of 

genotype on the sensitivity, we limited iron via chelation. Chelating iron resulted in a reduction 

of Pin1 phosphorylation in the H63D HFE cells but not in the WT HFE expressing cells. These 

findings suggest that there is a threshold for Pin1 activity that is maintained in the cells and that 

the H63D genotype has pushed the activity to a higher level that can be achieved by elevating 

iron levels in the WT cells.   

The iron effect on Pin1 could be indirect due to oxidative stress through the Fenton 

reaction (Thompson et al., 2001; Bush, 2003). To determine the role of oxidative stress, we 

treated the HFE polymorphism carrying cells with the antioxidant Trolox, a vitamin E analog. 

In the WT HFE cells, there was not a change in Pin1 phosphorylation. Trolox treatment in the 

H63D cells resulted in an a decrease in Pin1 serine 16 phosphorylation indicating that Pin1 

activity  is effected under resulting conditions in the presence of H63D HFE by oxidative stress and 

can be improved by antioxidant treatment, whereas the treatment has no effect on the wt cells. 

178

Our data are consistent with the findings of other groups (Butterfield et al., 2006; Sultana et al., 

2006; Kap et al., 2007) showing that Pin1 can be impacted by oxidative stress.  

To further evaluate a potential genetic influence on Pin1, we examined the impact of the 

H63D variant on Pin1 expression and function. Total Pin1 expression levels were found to be 

unchanged between the HFE polymorphisms and the transfection vector control. Pin1 activity 

was significantly decreased in cells that expressed the H63D variant compared to wild type 

HFE cells based on an increase in phosphorylation of Pin1 at serine 16 shown in the results 

section. This finding is consistent with the idea of the H63D variant being associated with iron‐

mediated oxidative stress that can disrupt the activity of Pin1. 

  The reduction in Pin1 activity in association with the H63D HFE mutation could lead to 

cellular changes associated with AD, specifically the inability to dephosphorylate APP and tau 

proteins (Hamdane et al., 2002; Etzkorn, 2006; Balastik et al., 2007). Pin1 is an intracellular 

regulator of amyloid and tau protein phosphorylation at the APP threonine 668 and tau 

threonine 231 amino acid residues, which appear to be important to the pathological generation 

of Aβ plaques and tangles (Liou et al., 2003; Hamdane et al., 2006; Pastorino et al., 2006). To 

evaluate the consequence of altered Pin1 function in H63D variant cells, we determined the 

phosphorylation of APP threonine 668 and tau threonine 231 levels in HFE expressing cells. 

Surprisingly, we found a significant decrease in APP phosphorylation in H63D cells compared 

to cells expressing wild type HFE. Furthermore, a significant reduction at the tau threonine 231 

residue occurred in the H63D expressing cells, consistent with previous findings (Hall II et al., 

in press). These data are not consistent with the reduction in Pin1 activity in H63D variant cells. 

179

The apparent inconsistency may be explained by our previous report of a reduction in cdk‐5 

expression and activity in H63D polymorphism expressing cells (Hall II et al., in press). Cdk‐5 

has been shown to regulate the phosphorylation of these proteins at the threonine 668 and 

threonine 231 specific sites of APP and tau, respectively (Iijima et al., 2000; Liu et al., 2003; 

Ryder et al., 2003; Li et al., 2006; Ballatore et al., 2007). Furthermore, the decreased Pin1 activity 

data in the H63D cells are consistent with the increased GSK‐3β activity associated with 

expressing the H63D variant (Hall II et al., in press). Min and colleagues showed that lithium 

inhibition of GSK‐3β resulted in an increase in Pin1 activation suggesting that regulating GSK‐

3β may affect Pin1’s ability to dephosphorylate its substrates such as tau (Min et al., 2005).  

  These data, in association with our findings that Trolox effects on Pin1 in this study are 

affected by H63D HFE expression are compelling evidence that the HFE polymorphism should 

be considered when evaluating treatment strategies in neurodegenerative diseases. We 

conclude that the discovery of HFE, implicated as putative risk factor for neurodegenerative 

disease such as AD can impact Pin1 is clinically meaningful and given the abundance of iron in 

the diet and environment, further investigation is warranted into the gene‐environment 

interaction between HFE polymorphisms and iron. 

180

Figure 5.1: Pin1 expression and activity. Expression of total Pin1 protein and Pin1 activity determined by its serine 16 phosphorylation was measured in an HFE polymorphism stably transfected SH‐SY5Y cell line by western blot. The data show that there were no significant differences in total Pin1 protein levels. Pin1 phosphorylation was significantly increased in H63D expressing cells (p<0.01) compared to cells containing wild type HFE. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. Representative western blot images are shown with graphs displaying differences in expression determined by densitometric analysis. One‐way ANOVA was performed to analyze the data followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The symbol ** (p<0.01) indicates a significance difference from wild type HFE. 

Pin1 (ser-16)

Vector WT H63D0

25

50

75

100

125

150 **

% D

iffer

ence

Pin1 Pin1 (ser 16)

β-actin β-actin

Total Pin1

Vector WT H63D0

25

50

75

100

% D

iffer

ence

Vector WT H63D Vector WT H63D

181

Figure 5.2: Cellular iron effects on Pin1 expression and activity. We added increasing amounts of ferrous ammonium citrate (FAC) to cells expressing wild type and H63D HFE. Total Pin1 protein levels were not changed with iron treatments (A). Pin1 activity decreased with increasing amounts of iron in a dose‐dependent fashion in wild type cells (10 μM, p<0.01) and (30 μM, p<0.001) as indicated by an increase in Pin1 serine 16 phosphorylation (B). Additionally, we further challenged the H63D cells by treating them with iron in the form of FAC. H63D expressing cells did not achieve a statistical significant increase in Pin1 serine 16 phosphorylation with iron treatments (B). Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. Representative western blot images are shown with graphs displaying differences in expression determined by densitometric analysis. One‐way ANOVA was performed to analyze the data followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The symbols ** (p<0.01) and *** (p<0.001) indicate significance from the respective non‐treated group.  A.  

Pin1 Pin1

H63D 10 µM 30 µM WT 10 µM 30 µM

β-actin β-actin

Total Pin1

WT 0µM iro

n

WT 10µM

iron

WT 30µM

iron

0

25

50

75

100

% D

iffer

ence

Total Pin1

H63D 0µ

M iron

H63D 10

µM iro

n

H63D 30

µM iro

n0

25

50

75

100

% D

iffer

ence

182

Pin1 (ser-16)

H63D 0µ

M iron

H63D 10

µM iro

n

H63D 30

µM iro

n0

25

50

75

100

125

% D

iffer

ence

B.

  

WT 10 µM 30 µM

Pin1 (ser 16)

H63D 10 µM 30 µM

β-actin β-actin

Pin1 (ser 16)

Pin1 (ser-16)

WT 0 µM

iron

WT 10 µM

iron

WT 30 µM

iron

0

25

50

75

100

125

150

175

*****

% D

iffer

ence

183

Pin1 (ser-16)

H63D 0

µM DFO

H63D 5

µM DFO

H63D 10

µM DFO0

25

50

75

100

**

% D

iffer

ence

Figure 5.3: Iron chelation and Pin1 activity. Increasing amounts of the iron chelator desferrioxamine (DFO) were added to cells expressing wild type and H63D HFE. Pin1 activity was measured by western blot via phosphorylation of Pin1 at serine 16. Pin1 activity was not altered when WT cells were treated with DFO. DFO treatment of H63D cells resulted in an increase in Pin1 activity as indicated by a decrease in phosphorylation of Pin1 at serine 16. At 5 μM DFO, there was not a significant difference compared to the non‐treated H63D group. Upon treating the H63D cells with 10 μM DFO, there was a significant decrease (p<0.01) in Pin1 phosphorylation. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. Representative western blot images are shown with graphs displaying differences in expression determined by densitometric analysis. One‐way ANOVA was performed to analyze the data followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The symbol ** (p<0.01) indicate significance from the respective non‐treated group.

WT 5 µM 10 µM

Pin1 (ser 16) Pin1 (ser 16)

H63D 5 µM 10 µM

β-actin β-actin

PIn1 (ser-16)

WT 0µM D

FO

WT 5µM D

FO

WT 10µM

DFO

0

25

50

75

100

% D

iffer

ence

184

Pin1 (ser-16)

H63D H63D Trolox0

25

50

75

100

*

% D

iffer

ence

Figure 5.4: Trolox treatment and Pin1 activity. HFE polymorphism stably transfected SH‐SY5Y cells expressing wild type and H63D variant were treated for 72 hours with 200 μM Trolox, a water‐soluble vitamin E analog to assess the effect of oxidative stress on Pin1 activity determined by western blot. Trolox treatment had no effect on WT HFE cells. There was an increase in Pin1 activity upon treating H63D cells with Trolox as evidenced by a decrease in Pin1 serine 16 phosphorylation (p=0.0257). Student’s t‐test was performed to analyze the data; data are represented as mean ± S.E. The symbol * (p<0.05) indicates a significance difference from baseline H63D HFE.

Pin1 (ser 16) Pin1 (ser 16)

β-actin β-actin

WT Trolox H63D Trolox

Pin1 (ser-16)

WT WT Trolox0

25

50

75

100

% D

iffer

ence

185

Figure 5.5: HFE effects on Alzheimer disease Pin1 substrates. The phosphorylation of amyloid and tau proteins at threonine 668 (t668) and threonine 231 (t231), respectively, has been shown to be impacted by Pin1 activity. APP t668 protein levels were increased in vector cells (p<0.01) compared to wild type HFE cells determined by an ELISA assay. APP t668 levels were decreased in H63D expressing cells (p<0.05) compared to WT HFE cells. Tau t231 protein levels were decreased in vector (p<0.01) and H63D cells (p<0.01) with respect to cells expressing wild type HFE. Experiments were performed with a minimum of four different cultures per genotype. One‐way ANOVA was performed to analyze the data followed by Tukey’s post‐hoc analysis. Data are represented as mean ± S.E. The symbols * (p<0.05) and ** (p<0.01) indicates a significance difference from wild type HFE.

Tau pT231

Vector WT H63D0

20

40

60

80

100

** *

% D

iffer

ence

APP pT668

Vec WT H63D0

50

100

150

200**

*% D

iffer

ence

186

References 

Balastik M, Lim J, Pastorino L, Lu KP (2007) Pin1 in Alzheimerʹs disease: multiple substrates, 

one regulatory mechanism? Biochim Biophys Acta 1772:422‐429. 

Ballatore C, Lee VM, Trojanowski JQ (2007) Tau‐mediated neurodegeneration in Alzheimerʹs 

disease and related disorders. Nat Rev Neurosci 8:663‐672. 

Bush AI (2003) The metallobiology of Alzheimerʹs disease. Trends Neurosci 26:207‐214. 

Butterfield DA, Poon HF, St Clair D, Keller JN, Pierce WM, Klein JB, Markesbery WR (2006) 

Redox proteomics identification of oxidatively modified hippocampal proteins in mild 

cognitive impairment: insights into the development of Alzheimerʹs disease. Neurobiol 

Dis 22:223‐232. 

Cherny RA, Atwood CS, Xilinas ME, Gray DN, Jones WD, McLean CA, Barnham KJ, Volitakis I, 

Fraser FW, Kim Y, Huang X, Goldstein LE, Moir RD, Lim JT, Beyreuther K, Zheng H, 

Tanzi RE, Masters CL, Bush AI (2001) Treatment with a copper‐zinc chelator markedly 

and rapidly inhibits beta‐amyloid accumulation in Alzheimerʹs disease transgenic mice. 

Neuron 30:665‐676. 

Connor JR, Lee SY (2006) HFE mutations and Alzheimerʹs disease. J Alzheimers Dis 10:267‐276. 

Connor JR, Menzies SL, St Martin SM, Mufson EJ (1992a) A histochemical study of iron, 

transferrin, and ferritin in Alzheimerʹs diseased brains. J Neurosci Res 31:75‐83. 

Connor JR, Snyder BS, Beard JL, Fine RE, Mufson EJ (1992b) Regional distribution of iron and 

iron‐regulatory proteins in the brain in aging and Alzheimerʹs disease. J Neurosci Res 

31:327‐335. 

187

Doble A (1999) The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. 

Pharmacol Ther 81:163‐221. 

Egana JT, Zambrano C, Nunez MT, Gonzalez‐Billault C, Maccioni RB (2003) Iron‐induced 

oxidative stress modify tau phosphorylation patterns in hippocampal cell cultures. 

Biometals 16:215‐223. 

Ehrlich R, Lemonnier FA (2000) HFE‐‐a novel nonclassical class I molecule that is involved in 

iron metabolism. Immunity 13:585‐588. 

Etzkorn FA (2006) Pin1 flips Alzheimerʹs switch. ACS Chem Biol 1:214‐216. 

Feder JN, Penny DM, Irrinki A, Lee VK, Lebron JA, Watson N, Tsuchihashi Z, Sigal E, Bjorkman 

PJ, Schatzman RC (1998) The hemochromatosis gene product complexes with the 

transferrin receptor and lowers its affinity for ligand binding. Proc Natl Acad Sci U S A 

95:1472‐1477. 

Hall II E, Lee S, Mairue N, Simmons Z, Connor J (in press) Expression of the HFE allelic variant 

H63D in SH‐SY5Y cells affects tau phosphorylation at serine residues. Neurobiology of 

Aging in press. 

Hamdane M, Dourlen P, Bretteville A, Sambo AV, Ferreira S, Ando K, Kerdraon O, Begard S, 

Geay L, Lippens G, Sergeant N, Delacourte A, Maurage CA, Galas MC, Buee L (2006) 

Pin1 allows for differential Tau dephosphorylation in neuronal cells. Mol Cell Neurosci 

32:155‐160. 

Hamdane M, Smet C, Sambo AV, Leroy A, Wieruszeski JM, Delobel P, Maurage CA, Ghestem 

A, Wintjens R, Begard S, Sergeant N, Delacourte A, Horvath D, Landrieu I, Lippens G, 

188

Buee L (2002) Pin1: a therapeutic target in Alzheimer neurodegeneration. J Mol Neurosci 

19:275‐287. 

Haque N, Tanaka T, Iqbal K, Grundke‐Iqbal I (1999) Regulation of expression, phosphorylation 

and biological activity of tau during differentiation in SY5Y cells. Brain Res 838:69‐77. 

Huang X, Moir RD, Tanzi RE, Bush AI, Rogers JT (2004) Redox‐active metals, oxidative stress, 

and Alzheimerʹs disease pathology. Ann N Y Acad Sci 1012:153‐163. 

Iijima K, Ando K, Takeda S, Satoh Y, Seki T, Itohara S, Greengard P, Kirino Y, Nairn AC, Suzuki 

T (2000) Neuron‐specific phosphorylation of Alzheimerʹs beta‐amyloid precursor 

protein by cyclin‐dependent kinase 5. J Neurochem 75:1085‐1091. 

Kap YS, Hoozemans JJ, Bodewes AJ, Zwart R, Meijer OC, Baas F, Scheper W (2007) Pin1 levels 

are downregulated during ER stress in human neuroblastoma cells. Neurogenetics 8:21‐

27. 

Lee SY, Patton SM, Henderson RJ, Connor JR (2007) Consequences of expressing mutants of the 

hemochromatosis gene (HFE) into a human neuronal cell line lacking endogenous HFE. 

Faseb J. 

Li T, Hawkes C, Qureshi HY, Kar S, Paudel HK (2006) Cyclin‐dependent protein kinase 5 

primes microtubule‐associated protein tau site‐specifically for glycogen synthase kinase 

3beta. Biochemistry 45:3134‐3145. 

Liou YC, Sun A, Ryo A, Zhou XZ, Yu ZX, Huang HK, Uchida T, Bronson R, Bing G, Li X, 

Hunter T, Lu KP (2003) Role of the prolyl isomerase Pin1 in protecting against age‐

dependent neurodegeneration. Nature 424:556‐561. 

189

Liu F, Su Y, Li B, Zhou Y, Ryder J, Gonzalez‐DeWhitt P, May PC, Ni B (2003) Regulation of 

amyloid precursor protein (APP) phosphorylation and processing by p35/Cdk5 and 

p25/Cdk5. FEBS Lett 547:193‐196. 

Liu G, Huang W, Moir RD, Vanderburg CR, Lai B, Peng Z, Tanzi RE, Rogers JT, Huang X (2006) 

Metal exposure and Alzheimerʹs pathogenesis. J Struct Biol 155:45‐51. 

Lu KP, Zhou XZ (2007) The prolyl isomerase PIN1: a pivotal new twist in phosphorylation 

signalling and disease. Nat Rev Mol Cell Biol 8:904‐916. 

Lu KP, Liou YC, Zhou XZ (2002) Pinning down proline‐directed phosphorylation signaling. 

Trends Cell Biol 12:164‐172. 

Mandelkow EM, Mandelkow E (1993) Tau as a marker for Alzheimerʹs disease. Trends Biochem 

Sci 18:480‐483. 

Min SH, Cho JS, Oh JH, Shim SB, Hwang DY, Lee SH, Jee SW, Lim HJ, Kim MY, Sheen YY, Kim 

YK (2005) Tau and GSK3beta dephosphorylations are required for regulating Pin1 

phosphorylation. Neurochem Res 30:955‐961. 

Mitchell R, Lee S, Simmons Z, Connor J (in press) Impact of HFE Polymorphisms on Cellular 

Glutamate Regulation. Neurobiology of Aging in press. 

Mitchell RM, Lee SY, Randazzo WT, Simmons Z, Connor JR (2009) Influence of HFE variants 

and cellular iron on monocyte chemoattractant protein‐1. J Neuroinflammation 6:6. 

Pastorino L, Sun A, Lu PJ, Zhou XZ, Balastik M, Finn G, Wulf G, Lim J, Li SH, Li X, Xia W, 

Nicholson LK, Lu KP (2006) The prolyl isomerase Pin1 regulates amyloid precursor 

protein processing and amyloid‐beta production. Nature 440:528‐534. 

190

Pulliam JF, Jennings CD, Kryscio RJ, Davis DG, Wilson D, Montine TJ, Schmitt FA, Markesbery 

WR (2003) Association of HFE mutations with neurodegeneration and oxidative stress in 

Alzheimerʹs disease and correlation with APOE. Am J Med Genet B Neuropsychiatr 

Genet 119B:48‐53. 

Rogers JT, Randall JD, Cahill CM, Eder PS, Huang X, Gunshin H, Leiter L, McPhee J, Sarang SS, 

Utsuki T, Greig NH, Lahiri DK, Tanzi RE, Bush AI, Giordano T, Gullans SR (2002) An 

iron‐responsive element type II in the 5ʹ‐untranslated region of the Alzheimerʹs amyloid 

precursor protein transcript. J Biol Chem 277:45518‐45528. 

Rohrlich PS, Fazilleau N, Ginhoux F, Firat H, Michel F, Cochet M, Laham N, Roth MP, Pascolo 

S, Nato F, Coppin H, Charneau P, Danos O, Acuto O, Ehrlich R, Kanellopoulos J, 

Lemonnier FA (2005) Direct recognition by alphabeta cytolytic T cells of Hfe, a MHC 

class Ib molecule without antigen‐presenting function. Proc Natl Acad Sci U S A 

102:12855‐12860. 

Ryder J, Su Y, Liu F, Li B, Zhou Y, Ni B (2003) Divergent roles of GSK3 and CDK5 in APP 

processing. Biochem Biophys Res Commun 312:922‐929. 

Sayre LM, Perry G, Harris PL, Liu Y, Schubert KA, Smith MA (2000) In situ oxidative catalysis 

by neurofibrillary tangles and senile plaques in Alzheimerʹs disease: a central role for 

bound transition metals. J Neurochem 74:270‐279. 

Selkoe DJ (1989) Molecular pathology of amyloidogenic proteins and the role of vascular 

amyloidosis in Alzheimerʹs disease. Neurobiol Aging 10:387‐395. 

191

Sultana R, Boyd‐Kimball D, Poon HF, Cai J, Pierce WM, Klein JB, Markesbery WR, Zhou XZ, Lu 

KP, Butterfield DA (2006) Oxidative modification and down‐regulation of Pin1 in 

Alzheimerʹs disease hippocampus: A redox proteomics analysis. Neurobiol Aging 

27:918‐925. 

Takahashi K, Uchida C, Shin RW, Shimazaki K, Uchida T (2008) Prolyl isomerase, Pin1: new 

findings of post‐translational modifications and physiological substrates in cancer, 

asthma and Alzheimerʹs disease. Cell Mol Life Sci 65:359‐375. 

Thompson KJ, Shoham S, Connor JR (2001) Iron and neurodegenerative disorders. Brain Res 

Bull 55:155‐164. 

Trojanowski JQ, Shin RW, Schmidt ML, Lee VM (1995) Relationship between plaques, tangles, 

and dystrophic processes in Alzheimerʹs disease. Neurobiol Aging 16:335‐340; 

discussion 341‐335. 

Wang XS, Lee S, Simmons Z, Boyer P, Scott K, Liu W, Connor J (2004) Increased incidence of the 

Hfe mutation in amyotrophic lateral sclerosis and related cellular consequences. J 

Neurol Sci 227:27‐33. 

Wulf G, Finn G, Suizu F, Lu KP (2005) Phosphorylation‐specific prolyl isomerization: is there an 

underlying theme? Nat Cell Biol 7:435‐441. 

Zecca L, Youdim MB, Riederer P, Connor JR, Crichton RR (2004) Iron, brain ageing and 

neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci 5:863‐873. 

 

 

192

Chapter 6

HFE in Pathogenic Discovery for Alzheimer’s Disease: Therapeutic

Implications

Introduction 

This thesis has focused on the HFE gene and the contribution of the H63D HFE variant 

as a putative risk factor for Alzheimer disease (AD). A schematic of the thesis findings with 

respect to the pathogenic pathways implicated in AD is provided (Figure 6.1).  In the first aim of 

this thesis, we described the role of HFE variants on amyloid regulation. We discovered that 

APP levels increased with HFE expression and Aβ peptide exposure led to increased apoptosis 

with the H63D polymorphism presumably due to mitochondria dysfunction. The second thesis 

objective focused on the involvement of HFE polymorphisms in tau phosphorylation. Elevated 

GSK‐3β activity with expression of the H63D HFE variant resulted in increased tau 

phosphorylation. The third aim of the thesis explored the impact of HFE polymorphisms on 

Pin1 expression and activity. Pin1 phosphorylation was compromised with expression of the 

H63D polymorphism.  

There is an urgent need to eliminate this debilitating disease as its impact transcends 

patients, families, and communities alike around the world. The greatest difficulty may lie in 

the unknown pathogenesis of AD, which limits the pharmacological options to substantially 

disrupt this progressive disease. Yet, current knowledge of biological mechanisms altered in 

AD must be applied to generate new medicines in a timely manner as time is of the essence.

193

Figure 6.1: Cellular impact of H63D HFE on AD pathways. This is a schematic illustrating the

role of H63D HFE on amyloid homeostasis, Aβ toxicity effects, mitochondrial dysfunction, tau

phosphorylation, Pin1 regulation, apoptosis, and ultimately neurodegeneration.

194

What’s the value of current AD drugs?  

There are four FDA‐approved drugs indicated for the treatment of AD available today; 

cholinesterase inhibitors: donepezil (Aricept ®), galantamine (Razadyne ®), and rivastigmine 

(Exelon ®) and glutamate inhibitor: memantine (Namenda ®) (Shah et al., 2008). Cholinergic 

dysfunction has been associated with cognitive impairment (Farlow, 1998; Farlow and Evans, 

1998; Shah et al., 2008). Thus, the cholinergic drugs are designed to improve cholinergic 

homeostasis through a variety of cellular mechanisms (Shah et al., 2008). Glutamate 

excitotoxicity has been shown to impact cellular function in neurodegenerative diseases (Doble, 

1999) and there is indirect evidence that glutamate dyshomeostasis can disrupt tau pathology in 

AD (Ballatore et al., 2007). As a glutamate‐gated NMDA channel, Namenda has been effective 

in treating advanced stage cases of AD (Shah et al., 2008). Collectively, these medications are the 

only prescribed medications for AD and have been shown to provide therapeutic benefit by 

limiting cognitive decline. 

However, the benefits are short‐lived, usually lasting up to six months before patients 

succumb to the dementia due to neuron loss (Giacobini, 2001, 2002). Hence, it would seem that 

these drugs are not impacting AD pathogenesis as the disease continues to run its course. 

Nevertheless, the drugs are effective in limiting cognitive decline if only for a limited time. 

Thus, the following discussion in this chapter intends to utilize the significant findings of this 

thesis to propose therapeutic interventions in AD and promote the significance of gene‐

environment interactions in pathogenic discovery. 

 

195

HFE and APP; is there a link? 

In the first aim of this thesis, HFE expression resulted in an increase of total APP 

compared to the vector control (no HFE expression), but APP levels did not differ between the 

WT and H63D polymorphisms. Similar to most iron management proteins (not including HFE), 

APP is regulated by iron regulatory protein (IRP) activity (Rogers et al., 2002). IRP 1 and IRP 2 

bind to iron responsive elements (IRE) in the mRNA of targeted proteins based on 

environmental conditions of cellular iron levels to control the expression of the iron 

management proteins (Connor et al., 1992b; Thompson et al., 2001). Previous data showed that 

the active and total IRP/IRE binding was not significantly different in our model based on HFE 

polymorphism expression (Lee et al., 2007) suggesting that this may impact IRP/IRE interaction 

in the 5’ UTR of APP mRNA (Rogers et al., 2002). Nonetheless, our HFE APP data highlight the 

importance of investigating HFE beyond its iron regulatory role and to further consider its 

function since its expression elevated APP. HFE has been thought to play a unique role in 

innate immunity (de Almeida et al., 2005; Porto and De Sousa, 2007).  

It is known that major histocompatibility complex (MHC) class 1 molecules are involved 

in antigen recognition and receptor interaction (Fehlmann et al., 1985; Ehrlich and Lemonnier, 

2000). HFE, a MHC class 1‐like protein, and MHC class‐1 molecules share 37% homology 

(Lebron et al., 1998). HFE has a fold in its α1 and α2 domain helices that constricts its groove to 

bind peptides that is thought to disrupt its ability in antigen recognition (Feder et al., 1998; 

Ehrlich and Lemonnier, 2000). Yet, a study by Rohrlich and colleagues showed direct 

recognition of human HFE by αβ cytolytic T cells without antigen‐presenting function (Rohrlich 

196

et al., 2005). Receptor interaction is another function of MHC class 1 molecules that HFE may 

possess, even though HFE presumably doesn’t interact with T cell antigen receptors due to 

constriction of its peptide binding groove. HFE has been reported to bind beta‐2 (β2) 

microglobulin and complex with transferrin receptor at the cell membrane (Bennett et al., 2000). 

These protein binding interactions of HFE may be altered with HFE variants as binding with 

the transferrin receptor complex are modified with H63D HFE (Waheed et al., 1997; Feder et al., 

1998; Waheed et al., 1999; Waheed et al., 2002).  There is also evidence of APP being involved in 

receptor interaction/binding. 

The cellular function of APP, a type 1 transmembrane protein, is not fully known 

(Thinakaran and Koo, 2008; Hardy, 2009). The cytoplasmic domain sequence of APP was shown 

to promote transferrin internalization by transplanting APP cytoplasmic sequences into the 

cytoplasmic domain of transferrin receptor (Lai et al., 1995). The two cytoplasmic sequence 

motifs in APP are related to lipoprotein receptor internalization and tyrosine‐based 

internalization (Lai et al., 1995), which imply that APP may act as an integral membrane 

receptor. Furthermore, the APP cytoplasmic domain sequence has been shown to serve as a 

docking site for numerous proteins involved in cell signal transduction (Venezia et al., 2004a; 

Venezia et al., 2004b; Venezia et al., 2007).  

The capabilities of HFE and APP may play a role in these proteins responding to 

external stimuli. In AD brains, HFE expression was found to be induced throughout the brain 

vasculature and in the surrounding plaques and tangles (Connor et al., 2001). These data 

suggest HFE may function in the innate immunity response to AD pathology. Our data 

197

showing an increase in total APP expression with HFE expression may be due to an unknown 

mechanism that occurs with the ‘induction’ of HFE at the cell membrane that may involve 

crosstalk with APP. APP is expressed on the plasma membrane as well and can respond to 

oxidative stress by up‐regulating its expression as well (Huang et al., 2004). Furthermore, there 

is an interleukin‐1 (IL‐1) translational enhancer in APP mRNA establishing that APP translation 

can be influenced by IL‐1 release from immune cells in the brain (Rogers et al., 1999; 

Bandyopadhyay et al., 2006). Such reported mechanisms of APP and others have suggested that 

APP may also be involved in innate immunity (Campbell, 2001). 

So is there a link between HFE and APP that goes beyond iron regulation in response to 

cellular environmental challenges? The MHC class 1‐like properties of HFE suggest it may have 

an immune function, HFE protein interactions imply it possesses the ability to complex with 

other proteins, and HFE can impact cell signal transduction pathways as a signaling molecule 

based on its induction. APP has been shown to be involved in cell signaling through its 

cytoplasmic domain sequence, APP synthesis can regulated by iron and cytokines, and it has 

been shown to possess neurotrophic characteristics that propose it may be involved in immune 

response. Iron regulation has been shown to impact immunological mechanisms (Ehrlich and 

Lemonnier, 2000; Salter‐Cid et al., 2000; Porto and De Sousa, 2007; Maccioni et al., 2009) HFE 

and APP may orchestrate a convergence of iron and immunological pathways in neurons that 

substantially impacts AD pathogenesis. 

 

 

198

The impact of GSK‐3β drug discovery 

In the latter part of aim 1, we found that H63D cells were more vulnerable to Aβ toxicity 

because of mitochondria dysfunction and demonstrated that this lead to increased apoptosis. 

The mitochondrial dysfunction discovered may be a result of the increased GSK‐3β activity in 

cells expressing the H63D variant. GSK‐3β has been shown to regulate the opening of the 

mitochondrial permeability transition pores, where increased opening of these channels can 

lead to a loss of the electrochemical gradient and result in apoptosis (Juhaszova et al., 2004; 

Murphy, 2004). Moreover, in the second aim of this thesis, tau phosphorylation increased at the 

serine (ser)‐199, ser‐202, ser‐396, and ser‐404 sites implicated in NFT generation. The increased 

GSK‐3β activity associated with the H63D was found to be responsible for the increase in tau 

phosphorylation. The diverse role of GSK‐3β functions in amyloid processing, tau 

phosphorylation, mitochondria function, and apoptosis‐promoting mechanisms makes it a very 

attractive therapeutic target for neurodegenerative diseases (Grimes and Jope, 2001; Juhaszova 

et al., 2004; Huang and Klein, 2006; Uemura et al., 2007). Drug discovery for GSK‐3β inhibition 

has gained momentum in many neurological diseases, diabetes, and cancer, but there are 

limitations to specificity, efficacy, and therapeutic delivery (Martinez et al., 2002; Cohen and 

Goedert, 2004; Avila and Hernandez, 2007; Mazanetz and Fischer, 2007; Martinez, 2008). 

While drug development continues for novel GSK‐3β drugs to combat AD, lithium 

treatments should be considered for AD treatment since it’s FDA‐approved for other 

indications and is readily‐available. Lithium has been shown to be a selective inhibitor of GSK‐

3β (Klein and Melton, 1996; Hong et al., 1997; De Sarno et al., 2002). Numerous studies have 

199

shown lithium to impact amyloid regulation and/or tau phosphorylation in cell and animal 

models (Munoz‐Montano et al., 1997; Alvarez et al., 1999; Noble et al., 2005; Caccamo et al., 

2007). Research efforts in this thesis have also shown that lithium exposure could reduce tau 

phosphorylation in cells expressing the H63D variant. Recently, a 10‐week clinical study found 

that lithium treatment increased brain derived neurotrophic factor levels in AD patients and 

improved their cognition suggesting longer studies are needed to see the long‐term benefits of 

lithium (Leyhe et al., 2009). I would also propose that lithium AD clinical trials should stratify 

outcomes based on HFE polymorphisms since baseline GSK‐3β activity is different. 

 

Is iron removal the key to defeating AD pathology?  

Cellular iron mismanagement may cause or exacerbate AD through a variety of cellular 

mechanisms (Qian and Shen, 2001; Thompson et al., 2001; Bush, 2003; Zecca et al., 2004). Iron 

has been shown to regulate APP synthesis and processing (Bodovitz et al., 1995; Rogers et al., 

2002) and tau phosphorylation based on the experiments performed in this thesis. We also 

know that iron accumulates in AD brains and is thought to contribute to senile plaques and 

NFT (Connor et al., 1992a; Connor et al., 1992b; Sayre et al., 2000; Quintana et al., 2006). Iron and 

other biometals can aggregate Aβ peptides (Bush, 2003) and tau aggregation (Yamamoto et al., 

2002); which emphasize the potential utility of chelators to remove iron and inhibit AD 

pathology markers. Henceforth, I will review chelator compounds that have been shown to be 

effective, are actively being evaluated in trials, and a prospective chelator that has not been fully 

characterized. 

200

The iron chelator, desferrioxamine (DFO) has proved to be effective in cellular models, 

animal models, and human trials to alter AD pathology and improve cognitive performance 

(Crapper McLachlan et al., 1991; Savory et al., 1998; Huang et al., 2004). DFO can reduce APP 

expression through the 5’ UTR mRNA of APP (Huang et al., 2004; Venti et al., 2004) further 

implicating it as a viable therapeutic option that may be more effective with drug targeting 

technology. Currently, DFO is FDA‐approved to treat iron overload disorders (Cahill et al., 

2008). Some limitations of DFO therapy include the route of administration, intramuscular or 

intravenous injections twice daily, that can lead to inflammation and poor absorption in the GI 

tract, which leads to rapid degradation and excretion (Crapper McLachlan et al., 1991; Savory et 

al., 1998; Cahill et al., 2008).  

Clioquinol (CQ) is a member of the quinoline drug family. It is a hydrophobic 

compound that can cross the BBB and chelate iron and other metals (Lynch et al., 2000; Cherny 

et al., 2001; Finefrock et al., 2003; Kaur et al., 2003). CQ has been shown to inhibit Aβ 

aggregation and H2O2 formation, thereby decreasing cellular stress via iron and copper 

chelation (Bush, 2003; Huang et al., 2004). Also, CQ has proven to be efficacious in decreasing 

Aβ deposits in cell culture and an AD transgenic mouse model (Cherny et al., 2001; Huang et 

al., 2004). In a Phase II clinical trial evaluating CQ for AD patient treatment, CQ was found to 

improve cognition, but was withdrawn because of drug quality preparation (Ritchie et al., 2003; 

Cahill et al., 2008).  

An improved second generation quinoline, an 8‐hydroxy quinoline analog recognized as 

PBT‐2 has been developed to overcome the limitations of CQ (Adlard et al., 2008; Barnham and 

201

Bush, 2008). Adlard and colleagues demonstrated that PBT‐2 was more effective than CQ in 

treating AD transgenic mice by substantially decreasing brain Aβ levels within days and 

improving spatial learning and memory. Recently, PBT‐2 has been evaluated for safety and 

efficacy in a double‐blind, randomized, placebo‐controlled phase IIa clinical trial for treating 

AD patients (Lannfelt et al., 2008). The safety of PBT‐2 was favorable and it lowered CSF Aβ42, 

but there was no effect on plasma AD biomarkers (Aβ40 and Aβ42) (Lannfelt et al., 2008).  

Cognitive performance improved with PBT‐2 based on two executive function component tests 

of a neuropsychological test battery (Lannfelt et al., 2008). Further testing in clinical trials will 

determine if PBT‐2 emerges as additional therapy to treat AD.  

Another chelator has been shown to be effective in removing iron and aluminum from 

hyperphosphorylated tau in AD (Shin et al., 2003). This trivalent chelator known as Feralex was 

synthesized using three naturally occurring products: glycine, maltol, and glucosamine (Kruck 

and Burrow, 2002). Upon comparing Feralex to DFO, the authors tested these compounds on 

AD brain sections and found no differences in the ability to chelate iron, but Feralex also 

removed aluminum (Shin et al., 2003). They conclude that Feralex may provide greater 

medicinal effects in treating AD patients (Shin et al., 2003), however, this compound has yet to 

be tested in an animal model. The potential toxic effects of Feralex and its ability to penetrate 

the BBB have yet to be determine and will warrant whether or not it can become an effective 

therapy for AD. 

It is clear that the chelators discussed show cellular and cognitive benefits; however, the 

absorption, toxicity, and ability to cross the BBB are the significant hurdles. Iron is essential for 

202

numerous physiological functions throughout the body and excess removal can disrupt cellular 

function, which emphasizes the importance of targeting chelators to their desired cellular 

destination. Thus, the pursuit for finding effective chelators to impact biometals, amyloid, and 

tau homeostasis continues for AD intervention. PBT‐2 appears promising because it has 

superior function with respect to CQ and does not have the safety issues CQ presented. It 

would be interesting to evaluate the PBT‐2 compound on Pin1and GSK‐3β function since they 

can regulate both AD pathological hallmarks (Butterfield et al., 2006; Balastik et al., 2007). In the 

third aim of this thesis work we found that DFO treatment improved Pin1 function and the 

ability of PBT‐2 to disrupt existing plaque formation and possibly chelate iron (data not shown) 

may be another mechanism of therapeutic intervention for AD. Also, the novel finding that 

GSK‐3β activity can be impacted by cellular iron discovered in this thesis work further 

emphasizes the importance of brain iron homeostasis in managing AD risk. 

 

Utility of an H63D mouse model 

To better examine the functional contributions of gene variants associated with AD risk, 

like HFE; improved model systems need to be developed. Recently, our group developed a 

mouse model to investigate the contribution of the H63D variant to neurodegenerative diseases, 

an H67D knock‐in (homologous to human H63D). The model developed is very similar to the 

transgenic line developed by Tomatsu and colleagues that became unavailable (Tomatsu et al., 

2003). Our research group plans to substantiate the findings of my thesis and other published 

work by our laboratory (Mitchell et al., 2009; Mitchell et al., in press), further examine 

203

pathological cellular pathways, and evaluate therapeutic compounds with this mouse model. 

  The H67D mice can be utilized to investigate the numerous cellular effects of the H63D 

variant in the AD pathogenic pathways discussed in the preceding sections of this chapter. As 

an example, I will describe my strategy for investigating tau phosphorylation and 

neurodegeneration. I hypothesize that homozygous H67D mice will have increased GSK‐3β 

activity and decreased Pin1 function, which will lead to NFT‐like pathology and cell death. This 

will be determined by evaluating the mice at 4, 8, 12, and 16 months of age to monitor the 

impact of aging on the development of pathology and neurodegeneration compared to wild 

type HFE and heterozygous H67D littermates. Morris water‐maze and rotorod behavioral 

paradigms should be performed to assess learning and memory along with motor coordination, 

respectively. Upon sacrifice at the time points, the brain should be removed and each 

hemisphere should be used for either immunohistochemical or biochemical analysis. GSK‐3β 

expression and phosphorylation, Pin1 expression and phosphorylation, total tau expression and 

phosphorylation (PHF‐1 Ab: ser‐396 and ser‐404; AT8 Ab: ser‐199 and ser‐202; AT180 Ab: thr‐

231), and caspase‐3 expression should be determined using both methods with the appropriate 

antibodies. NFT‐like pathology would be determined by performing Thioflavin‐S and Gallyas 

silver staining, which bind tau filament aggregates; positive staining with either marker detects 

NFTs (Liou et al., 2003). NeuN (neuron‐specific nuclear protein) histological staining should be 

performed and the NeuN positive neurons should be counted; a reduction in staining would 

indicate neuronal death (Liou et al., 2003).  

204

Previous studies of GSK‐3β transgenic mice and Pin1 knockout mice have been shown 

to result in tau pathology independent of each other (Lucas et al., 2001; Hernandez et al., 2002; 

Liou et al., 2003). Thus, the elevation in GSK‐3β activity and reduction in Pin1 function 

associated with expressing the H63D variant, which alters cellular iron regulation, should result 

in a model of neurodegeneration. If my hypothesis is not supported, I would propose to feed 

the mice iron via oral gavage (Kaur et al., 2007) to invoke a gene‐environment interaction that 

should result in increased cellular stress to alter the proposed pathogenic mechanisms outlined. 

Future investigations with the H67D mouse model could test therapeutic compounds to combat 

the pathology proposed. 

 

Conclusion 

In summary, this dissertation has established the importance of the role of the H63D 

variant in the hallmark AD pathogenic pathways and highlighted therapeutic targets to alter 

AD pathology. We have proposed that H63D does not cause AD, but acts as a putative risk 

factor that impacts disease onset and progression through altering numerous cellular 

mechanisms implicated in AD. Independent of HFE status, we discovered that GSK‐3β could be 

impacted by cellular iron. Regulating brain iron levels continues to be paramount because iron 

dyshomeostasis can impact numerous biological mechanisms resulting in a profile of complex 

pathological changes in AD. We have shown that a single genetic variation can modify AD 

associated cellular pathways in a controlled environment, which emphasizes the importance of 

identifying causative agents that trigger AD. The continued development of genetic, 

205

biochemical, and imaging biomarker profiles will significantly aid in identifying and treating 

AD patients. 

206

 

References: 

Adlard PA et al. (2008) Rapid restoration of cognition in Alzheimerʹs transgenic mice with 8‐

hydroxy quinoline analogs is associated with decreased interstitial Abeta. Neuron 59:43‐

55. 

Alvarez G, Munoz‐Montano JR, Satrustegui J, Avila J, Bogonez E, Diaz‐Nido J (1999) Lithium 

protects cultured neurons against beta‐amyloid‐induced neurodegeneration. FEBS Lett 

453:260‐264. 

Avila J, Hernandez F (2007) GSK‐3 inhibitors for Alzheimerʹs disease. Expert Rev Neurother 

7:1527‐1533. 

Balastik M, Lim J, Pastorino L, Lu KP (2007) Pin1 in Alzheimerʹs disease: multiple substrates, 

one regulatory mechanism? Biochim Biophys Acta 1772:422‐429. 

Ballatore C, Lee VM, Trojanowski JQ (2007) Tau‐mediated neurodegeneration in Alzheimerʹs 

disease and related disorders. Nat Rev Neurosci 8:663‐672. 

Bandyopadhyay S, Hartley DM, Cahill CM, Lahiri DK, Chattopadhyay N, Rogers JT (2006) 

Interleukin‐1alpha stimulates non‐amyloidogenic pathway by alpha‐secretase (ADAM‐

10 and ADAM‐17) cleavage of APP in human astrocytic cells involving p38 MAP kinase. 

J Neurosci Res 84:106‐118. 

Barnham KJ, Bush AI (2008) Metals in Alzheimerʹs and Parkinsonʹs diseases. Curr Opin Chem 

Biol 12:222‐228. 

207

Bennett MJ, Lebron JA, Bjorkman PJ (2000) Crystal structure of the hereditary 

haemochromatosis protein HFE complexed with transferrin receptor. Nature 403:46‐53. 

Bodovitz S, Falduto MT, Frail DE, Klein WL (1995) Iron levels modulate alpha‐secretase 

cleavage of amyloid precursor protein. J Neurochem 64:307‐315. 

Bush AI (2003) The metallobiology of Alzheimerʹs disease. Trends Neurosci 26:207‐214. 

Butterfield DA, Abdul HM, Opii W, Newman SF, Joshi G, Ansari MA, Sultana R (2006) Pin1 in 

Alzheimerʹs disease. J Neurochem 98:1697‐1706. 

Caccamo A, Oddo S, Tran LX, LaFerla FM (2007) Lithium reduces tau phosphorylation but not 

A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. 

Am J Pathol 170:1669‐1675. 

Cahill CM, Lahiri DK, Huang X, Rogers JT (2008) Amyloid precursor protein and alpha 

synuclein translation, implications for iron and inflammation in neurodegenerative 

diseases. Biochim Biophys Acta. 

Campbell A (2001) beta‐amyloid: friend or foe. Med Hypotheses 56:388‐391. 

Cherny RA, Atwood CS, Xilinas ME, Gray DN, Jones WD, McLean CA, Barnham KJ, Volitakis I, 

Fraser FW, Kim Y, Huang X, Goldstein LE, Moir RD, Lim JT, Beyreuther K, Zheng H, 

Tanzi RE, Masters CL, Bush AI (2001) Treatment with a copper‐zinc chelator markedly 

and rapidly inhibits beta‐amyloid accumulation in Alzheimerʹs disease transgenic mice. 

Neuron 30:665‐676. 

Cohen P, Goedert M (2004) GSK3 inhibitors: development and therapeutic potential. Nat Rev 

Drug Discov 3:479‐487. 

208

Connor JR, Menzies SL, St Martin SM, Mufson EJ (1992a) A histochemical study of iron, 

transferrin, and ferritin in Alzheimerʹs diseased brains. J Neurosci Res 31:75‐83. 

Connor JR, Snyder BS, Beard JL, Fine RE, Mufson EJ (1992b) Regional distribution of iron and 

iron‐regulatory proteins in the brain in aging and Alzheimerʹs disease. J Neurosci Res 

31:327‐335. 

Connor JR, Milward EA, Moalem S, Sampietro M, Boyer P, Percy ME, Vergani C, Scott RJ, 

Chorney M (2001) Is hemochromatosis a risk factor for Alzheimerʹs disease? J 

Alzheimers Dis 3:471‐477. 

Crapper McLachlan DR, Dalton AJ, Kruck TP, Bell MY, Smith WL, Kalow W, Andrews DF 

(1991) Intramuscular desferrioxamine in patients with Alzheimerʹs disease. Lancet 

337:1304‐1308. 

de Almeida SF, Carvalho IF, Cardoso CS, Cordeiro JV, Azevedo JE, Neefjes J, de Sousa M (2005) 

HFE cross‐talks with the MHC class I antigen presentation pathway. Blood 106:971‐977. 

De Sarno P, Li X, Jope RS (2002) Regulation of Akt and glycogen synthase kinase‐3 beta 

phosphorylation by sodium valproate and lithium. Neuropharmacology 43:1158‐1164. 

Doble A (1999) The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. 

Pharmacol Ther 81:163‐221. 

Ehrlich R, Lemonnier FA (2000) HFE‐‐a novel nonclassical class I molecule that is involved in 

iron metabolism. Immunity 13:585‐588. 

Farlow MR (1998) New treatments in Alzheimer disease and the continued need for placebo‐

controlled trials. Arch Neurol 55:1396‐1398. 

209

Farlow MR, Evans RM (1998) Pharmacologic treatment of cognition in Alzheimerʹs dementia. 

Neurology 51:S36‐44; discussion S65‐37. 

Feder JN, Penny DM, Irrinki A, Lee VK, Lebron JA, Watson N, Tsuchihashi Z, Sigal E, Bjorkman 

PJ, Schatzman RC (1998) The hemochromatosis gene product complexes with the 

transferrin receptor and lowers its affinity for ligand binding. Proc Natl Acad Sci U S A 

95:1472‐1477. 

Fehlmann M, Peyron JF, Samson M, Van Obberghen E, Brandenburg D, Brossette N (1985) 

Molecular association between major histocompatibility complex class I antigens and 

insulin receptors in mouse liver membranes. Proc Natl Acad Sci U S A 82:8634‐8637. 

Finefrock AE, Bush AI, Doraiswamy PM (2003) Current status of metals as therapeutic targets in 

Alzheimerʹs disease. J Am Geriatr Soc 51:1143‐1148. 

Giacobini E (2001) Do cholinesterase inhibitors have disease‐modifying effects in Alzheimerʹs 

disease? CNS Drugs 15:85‐91. 

Giacobini E (2002) Long‐term stabilizing effect of cholinesterase inhibitors in the therapy of 

Alzheimerʹ disease. J Neural Transm Suppl:181‐187. 

Grimes CA, Jope RS (2001) The multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular 

signaling. Prog Neurobiol 65:391‐426. 

Hardy J (2009) The amyloid hypothesis for Alzheimerʹs disease: a critical reappraisal. J 

Neurochem. 

210

Hernandez F, Borrell J, Guaza C, Avila J, Lucas JJ (2002) Spatial learning deficit in transgenic 

mice that conditionally over‐express GSK‐3beta in the brain but do not form tau 

filaments. J Neurochem 83:1529‐1533. 

Hong M, Chen DC, Klein PS, Lee VM (1997) Lithium reduces tau phosphorylation by inhibition 

of glycogen synthase kinase‐3. J Biol Chem 272:25326‐25332. 

Huang HC, Klein PS (2006) Multiple roles for glycogen synthase kinase‐3 as a drug target in 

Alzheimerʹs disease. Curr Drug Targets 7:1389‐1397. 

Huang X, Moir RD, Tanzi RE, Bush AI, Rogers JT (2004) Redox‐active metals, oxidative stress, 

and Alzheimerʹs disease pathology. Ann N Y Acad Sci 1012:153‐163. 

Juhaszova M, Zorov DB, Kim SH, Pepe S, Fu Q, Fishbein KW, Ziman BD, Wang S, Ytrehus K, 

Antos CL, Olson EN, Sollott SJ (2004) Glycogen synthase kinase‐3beta mediates 

convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition 

pore. J Clin Invest 113:1535‐1549. 

Kaur D, Peng J, Chinta SJ, Rajagopalan S, Di Monte DA, Cherny RA, Andersen JK (2007) 

Increased murine neonatal iron intake results in Parkinson‐like neurodegeneration with 

age. Neurobiol Aging 28:907‐913. 

Kaur D, Yantiri F, Rajagopalan S, Kumar J, Mo JQ, Boonplueang R, Viswanath V, Jacobs R, Yang 

L, Beal MF, DiMonte D, Volitaskis I, Ellerby L, Cherny RA, Bush AI, Andersen JK (2003) 

Genetic or pharmacological iron chelation prevents MPTP‐induced neurotoxicity in 

vivo: a novel therapy for Parkinsonʹs disease. Neuron 37:899‐909. 

211

Klein PS, Melton DA (1996) A molecular mechanism for the effect of lithium on development. 

Proc Natl Acad Sci U S A 93:8455‐8459. 

Kruck TP, Burrow TE (2002) Synthesis of feralex a novel aluminum/iron chelating compound. J 

Inorg Biochem 88:19‐24. 

Lai A, Sisodia SS, Trowbridge IS (1995) Characterization of sorting signals in the beta‐amyloid 

precursor protein cytoplasmic domain. J Biol Chem 270:3565‐3573. 

Lannfelt L, Blennow K, Zetterberg H, Batsman S, Ames D, Harrison J, Masters CL, Targum S, 

Bush AI, Murdoch R, Wilson J, Ritchie CW (2008) Safety, efficacy, and biomarker 

findings of PBT2 in targeting Abeta as a modifying therapy for Alzheimerʹs disease: a 

phase IIa, double‐blind, randomised, placebo‐controlled trial. Lancet Neurol 7:779‐786. 

Lebron JA, Bennett MJ, Vaughn DE, Chirino AJ, Snow PM, Mintier GA, Feder JN, Bjorkman PJ 

(1998) Crystal structure of the hemochromatosis protein HFE and characterization of its 

interaction with transferrin receptor. Cell 93:111‐123. 

Lee SY, Patton SM, Henderson RJ, Connor JR (2007) Consequences of expressing mutants of the 

hemochromatosis gene (HFE) into a human neuronal cell line lacking endogenous HFE. 

Faseb J. 

Leyhe T, Eschweiler GW, Stransky E, Gasser T, Annas P, Basun H, Laske C (2009) Increase of 

BDNF serum concentration in lithium treated patients with early Alzheimerʹs disease. J 

Alzheimers Dis 16:649‐656. 

212

Liou YC, Sun A, Ryo A, Zhou XZ, Yu ZX, Huang HK, Uchida T, Bronson R, Bing G, Li X, 

Hunter T, Lu KP (2003) Role of the prolyl isomerase Pin1 in protecting against age‐

dependent neurodegeneration. Nature 424:556‐561. 

Lucas JJ, Hernandez F, Gomez‐Ramos P, Moran MA, Hen R, Avila J (2001) Decreased nuclear 

beta‐catenin, tau hyperphosphorylation and neurodegeneration in GSK‐3beta 

conditional transgenic mice. Embo J 20:27‐39. 

Lynch T, Cherny RA, Bush AI (2000) Oxidative processes in Alzheimerʹs disease: the role of 

abeta‐metal interactions. Exp Gerontol 35:445‐451. 

Maccioni RB, Rojo LE, Fernandez JA, Kuljis RO (2009) The role of neuroimmunomodulation in 

Alzheimerʹs disease. Ann N Y Acad Sci 1153:240‐246. 

Martinez A (2008) Preclinical efficacy on GSK‐3 inhibitors: towards a future generation of 

powerful drugs. Med Res Rev 28:773‐796. 

Martinez A, Castro A, Dorronsoro I, Alonso M (2002) Glycogen synthase kinase 3 (GSK‐3) 

inhibitors as new promising drugs for diabetes, neurodegeneration, cancer, and 

inflammation. Med Res Rev 22:373‐384. 

Mazanetz MP, Fischer PM (2007) Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for 

neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov 6:464‐479. 

Mitchell R, Lee S, Simmons Z, Connor J (in press) Impact of HFE Polymorphisms on Cellular 

Glutamate Regulation. Neurobiology of Aging in press. 

Mitchell RM, Lee SY, Randazzo WT, Simmons Z, Connor JR (2009) Influence of HFE variants 

and cellular iron on monocyte chemoattractant protein‐1. J Neuroinflammation 6:6. 

213

Munoz‐Montano JR, Moreno FJ, Avila J, Diaz‐Nido J (1997) Lithium inhibits Alzheimerʹs 

disease‐like tau protein phosphorylation in neurons. FEBS Lett 411:183‐188. 

Murphy E (2004) Inhibit GSK‐3beta or thereʹs heartbreak dead ahead. J Clin Invest 113:1526‐

1528. 

Noble W, Planel E, Zehr C, Olm V, Meyerson J, Suleman F, Gaynor K, Wang L, LaFrancois J, 

Feinstein B, Burns M, Krishnamurthy P, Wen Y, Bhat R, Lewis J, Dickson D, Duff K 

(2005) Inhibition of glycogen synthase kinase‐3 by lithium correlates with reduced 

tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102:6990‐6995. 

Porto G, De Sousa M (2007) Iron overload and immunity. World J Gastroenterol 13:4707‐4715. 

Qian ZM, Shen X (2001) Brain iron transport and neurodegeneration. Trends Mol Med 7:103‐

108. 

Quintana C, Bellefqih S, Laval JY, Guerquin‐Kern JL, Wu TD, Avila J, Ferrer I, Arranz R, Patino 

C (2006) Study of the localization of iron, ferritin, and hemosiderin in Alzheimerʹs 

disease hippocampus by analytical microscopy at the subcellular level. J Struct Biol 

153:42‐54. 

Ritchie CW, Bush AI, Mackinnon A, Macfarlane S, Mastwyk M, MacGregor L, Kiers L, Cherny 

R, Li QX, Tammer A, Carrington D, Mavros C, Volitakis I, Xilinas M, Ames D, Davis S, 

Beyreuther K, Tanzi RE, Masters CL (2003) Metal‐protein attenuation with 

iodochlorhydroxyquin (clioquinol) targeting Abeta amyloid deposition and toxicity in 

Alzheimer disease: a pilot phase 2 clinical trial. Arch Neurol 60:1685‐1691. 

214

Rogers JT, Leiter LM, McPhee J, Cahill CM, Zhan SS, Potter H, Nilsson LN (1999) Translation of 

the alzheimer amyloid precursor protein mRNA is up‐regulated by interleukin‐1 

through 5ʹ‐untranslated region sequences. J Biol Chem 274:6421‐6431. 

Rogers JT, Randall JD, Cahill CM, Eder PS, Huang X, Gunshin H, Leiter L, McPhee J, Sarang SS, 

Utsuki T, Greig NH, Lahiri DK, Tanzi RE, Bush AI, Giordano T, Gullans SR (2002) An 

iron‐responsive element type II in the 5ʹ‐untranslated region of the Alzheimerʹs amyloid 

precursor protein transcript. J Biol Chem 277:45518‐45528. 

Rohrlich PS, Fazilleau N, Ginhoux F, Firat H, Michel F, Cochet M, Laham N, Roth MP, Pascolo 

S, Nato F, Coppin H, Charneau P, Danos O, Acuto O, Ehrlich R, Kanellopoulos J, 

Lemonnier FA (2005) Direct recognition by alphabeta cytolytic T cells of Hfe, a MHC 

class Ib molecule without antigen‐presenting function. Proc Natl Acad Sci U S A 

102:12855‐12860. 

Salter‐Cid L, Peterson PA, Yang Y (2000) The major histocompatibility complex‐encoded HFE in 

iron homeostasis and immune function. Immunol Res 22:43‐59. 

Savory J, Huang Y, Wills MR, Herman MM (1998) Reversal by desferrioxamine of tau protein 

aggregates following two days of treatment in aluminum‐induced neurofibrillary 

degeneration in rabbit: implications for clinical trials in Alzheimerʹs disease. 

Neurotoxicology 19:209‐214. 

Sayre LM, Perry G, Harris PL, Liu Y, Schubert KA, Smith MA (2000) In situ oxidative catalysis 

by neurofibrillary tangles and senile plaques in Alzheimerʹs disease: a central role for 

bound transition metals. J Neurochem 74:270‐279. 

215

Shah RS, Lee HG, Xiongwei Z, Perry G, Smith MA, Castellani RJ (2008) Current approaches in 

the treatment of Alzheimerʹs disease. Biomed Pharmacother 62:199‐207. 

Shin RW, Kruck TP, Murayama H, Kitamoto T (2003) A novel trivalent cation chelator Feralex 

dissociates binding of aluminum and iron associated with hyperphosphorylated tau of 

Alzheimerʹs disease. Brain Res 961:139‐146. 

Thinakaran G, Koo EH (2008) Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function. J 

Biol Chem 283:29615‐29619. 

Thompson KJ, Shoham S, Connor JR (2001) Iron and neurodegenerative disorders. Brain Res 

Bull 55:155‐164. 

Tomatsu S, Orii KO, Fleming RE, Holden CC, Waheed A, Britton RS, Gutierrez MA, Velez‐

Castrillon S, Bacon BR, Sly WS (2003) Contribution of the H63D mutation in HFE to 

murine hereditary hemochromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A 100:15788‐15793. 

Uemura K, Kuzuya A, Shimozono Y, Aoyagi N, Ando K, Shimohama S, Kinoshita A (2007) 

GSK3beta activity modifies the localization and function of presenilin 1. J Biol Chem 

282:15823‐15832. 

Venezia V, Nizzari M, Carlo P, Corsaro A, Florio T, Russo C (2007) Amyloid precursor protein 

and presenilin involvement in cell signaling. Neurodegener Dis 4:101‐111. 

Venezia V, Russo C, Repetto E, Nizzari M, Violani E, Carlo P, Marchetti B, Schettini G (2004a) 

Apoptotic cell death and amyloid precursor protein signaling in neuroblastoma SH‐

SY5Y cells. Ann N Y Acad Sci 1030:339‐347. 

216

Venezia V, Russo C, Repetto E, Salis S, Dolcini V, Genova F, Nizzari M, Mueller U, Schettini G 

(2004b) Apoptotic cell death influences the signaling activity of the amyloid precursor 

protein through ShcA and Grb2 adaptor proteins in neuroblastoma SH‐SY5Y cells. J 

Neurochem 90:1359‐1370. 

Venti A, Giordano T, Eder P, Bush AI, Lahiri DK, Greig NH, Rogers JT (2004) The integrated 

role of desferrioxamine and phenserine targeted to an iron‐responsive element in the 

APP‐mRNA 5ʹ‐untranslated region. Ann N Y Acad Sci 1035:34‐48. 

Waheed A, Parkkila S, Saarnio J, Fleming RE, Zhou XY, Tomatsu S, Britton RS, Bacon BR, Sly 

WS (1999) Association of HFE protein with transferrin receptor in crypt enterocytes of 

human duodenum. Proc Natl Acad Sci U S A 96:1579‐1584. 

Waheed A, Grubb JH, Zhou XY, Tomatsu S, Fleming RE, Costaldi ME, Britton RS, Bacon BR, Sly 

WS (2002) Regulation of transferrin‐mediated iron uptake by HFE, the protein defective 

in hereditary hemochromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A 99:3117‐3122. 

Waheed A, Parkkila S, Zhou XY, Tomatsu S, Tsuchihashi Z, Feder JN, Schatzman RC, Britton 

RS, Bacon BR, Sly WS (1997) Hereditary hemochromatosis: effects of C282Y and H63D 

mutations on association with beta2‐microglobulin, intracellular processing, and cell 

surface expression of the HFE protein in COS‐7 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 94:12384‐

12389. 

Yamamoto A, Shin RW, Hasegawa K, Naiki H, Sato H, Yoshimasu F, Kitamoto T (2002) Iron 

(III) induces aggregation of hyperphosphorylated tau and its reduction to iron (II) 

217

reverses the aggregation: implications in the formation of neurofibrillary tangles of 

Alzheimerʹs disease. J Neurochem 82:1137‐1147. 

Zecca L, Youdim MB, Riederer P, Connor JR, Crichton RR (2004) Iron, brain ageing and 

neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci 5:863‐873. 

 

VITA

Eric Christopher Hall II

EDUCATION The Pennsylvania State University, College of Medicine, Hershey, PA PhD in Neuroscience Program Completed in June 2009. Xavier University of Louisiana, New Orleans, LA Bachelor of Science in Biology, Minor in Chemistry Completed in May 2004. Southfield Christian High School, Southfield, MI Completed in June 2000. TEACHING EXPERIENCE Teaching assistant in Physiological Psychology and Physiological Lab at Lebanon

Valley College. Fall Semester, 2005.

ACTIVITIES AND LEADERSHIP AT PSU Institutional Review Board, Member, 2005-2009 Graduate Student Association – Vice-President, 2005-2006; President, 2006-2007

Penn State Hershey Diversity Office Task Force, Member; 2007-2008 Children’s Miracle Network Fundraising Committee, Member; 2006-2007 Intramural Basketball League-Penn State Hershey, Director; 2004-2005

HONORS Neuroscience Scholars Fellowship, Society for Neuroscience; 2007-2009 PSU College of Medicine Alumni Society Endowed Scholarship; 2007 Minority Leadership Fellowship, Biotechnology Institute; 2006 PSU Schreyer Institute, Teaching Certificate; 2006 Minority Scholars Fellowship, Biotechnology Institute; 2005 Huck Institutes of the Life Sciences Fellowship, PSU; 2004-2006 PUBLICATIONS

Hall II EC, Lee SY, Mairue N, Simmons Z, and Connor JR (2009). Expression of the HFE allelic variant H63D in SH-SY5Y cells affects tau phosphorylation. In Press. Neurobiology of Aging

Mairue N, Hall II EC, Lee SY, Cheepsunthorn P, and Connor JR (2009). The HFE

polymorphism H63D enhances activation of the intrinsic pathway of apoptosis. Submitted.

Hall II EC, Lee SY, and Connor JR (2009). Pin1 activity is compromised when

expressing the H63D allele of the HFE gene. Submitted.