the fasciola hepatica
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THE FASCIOLA HEPATICA TEGUMENTAL ANTIGEN SUPPRESSES DENDRITIC CELLMATURATION AND FUNCTION
Clare M. Hamilton,1 David J. Dowling,1 Christine E. Loscher,2 Russell M. Morphew,3Peter M. Brophy,3 and Sandra M. O’Neill1*Parasite Immune Modulation Group, School of Nursing,1 and Immunomodulation Group, School of Biotechnology,2Dublin City University, Glasnevin, Dublin 9, Ireland, and Institute of Biological Sciences, Aberystwyth University,Aberystwyth, Ceredigion, Wales, United Kingdom3 (2009)
Yenny Maylin Aybar Flores.
ANTECEDENTES Y *OBJETIVO:
Helmintos propiedades antiinflamatorias.
De forma significativa: Teg de Fasciola H. IFN-γ & IL-
12p70 Ag de Parásitos con efectos
inmunomoduladores en Dcs afectando prod. de citoquinas proinflam.
* Investigar los efectos de Teg en la activación y función de las DC.
¿POR QUÉ CÉLULAS DENDRÍTICAS?
Buena fuente de IL-12p70. Fundamentales en la inmunidad
adaptativa. Generan respuestas inflamatorias
asociadas a inmunopatología.
CONCEPTOS: IL-12p70: Una IL-12 en la forma activa del
heterodímero (p40 & p35), promueve la diferenciación hacia Th1 / Favorece al Th1 por producir TNF-α e IFN-γ. Dcs.
IFN-γ: Importante en la activación de los macrófagos. ( Th2)
CD 40, 80 & 86: Moléculas coestimuladoras en la activ. De LPS- TLR (4) que desencadena una cascada de señaliz. de Mapks y NF-KB.
Activación de TLR asociado a desórdenes inflamatorios.
PAMPS
Maduración DC prod. de citoquinas (así como de factores
proinflamatorios)¿Respuesta inmune?
*Alteración de función por: Capacidad fagocítica (IFN-γ & otras
citoquinas)Activar cél. T
Las respuestas Th2 ejercen un papel clave en la resistencia a helmintos.
Actividad anti-inflamatoria
Th2:
Más oportunidadesDe sobrevivir.
¿QUÉ HACE FASCIOLA HEPÁTICA?
La respuesta Th1 debería ocurrir en condiciones normales pero el parásito la burla.
¿Cómo? Modulan a las células presentadoras de
antígeno (CD.) Regulan la producción de Th2 en el tracto
digestivo e inducen la producción de células T reguladoras que pueden
controlar células T autorreactivas => Limitan la inflamación.
MATERIALES & MÉTODOS:
Ratones: C57BL/6j, BALB/c & DO11.10 TCR transgenic mice.
Balb/c: Son cepas europeas que generan tumores.
C57BL/6j: La más usada para ser manipulada genéticamente en el estudio de las enfermedades humanas.
DO11.10 TCR: TCR que reconoce OVA como PAMP.
MATERIALES & MÉTODOS:
Gusanos adultos de F. hepática en PBS->incubación en Nonidet P-40-> colectar sobrenadante -> aire comprimido para: filtrar & concentrar => centrifugación
=> guardar a 20°C.
MATERIALES & MÉTODOS:
Estudios de MAPK: incubadas con ERK, p38 o JNK I (1 hora antes) del TLR-Lig. Stim.; Control: Teg solo, medio, LPS solo (+ inhibidores).
No se muestran resultados.
RESULTADOS:
Shock séptico: 4 grupos C57BL/6j
Finalidad: Inducir al organismo a una rpta. Inflamatoria.
En el modelo en ratones de shock séptico in vivo:
Teg suprime IFN-γ & IL-12p70 (ELISA)
• Sacrificio 6 horas después.
Potente efecto antinflamatorio.
-/+ 2.5 hrs
LeveL
Dcs excelentes productoras de citoq. proinflamatorias ¿Teg
estaría alterando sus funciones?
ILs medidas por ELISA.Nitrito: Rctivo de Griess
IL-6: Citoquina proinflamatoriaIL-10: interviene en la regulación de la respuesta inflamatoria.
Teg modula la producción de citoquinas en Dcs estimuladas por LPS.
1: LPS (1h)2: Teg + LPS (1h)3: LPS (4h)4: Teg+LPS (4h)
*Teg inhibe la transcripción al comienzo. Pero no es constante.
Con RNA extraído de Dcs.
La subunidad p35 está siendo regulada.
a) Línea gruesa: Cél estimuladas con LPS.b) Línea delgada: Cél estimuladas con Teg + LPSc) Sombreado: Controles de isotipos.
*Hay menos cantidad de las Cds en membranas pero no llega a concentraciones basales.
Expresión, típico de maduración en DCs inducidas por LPS.
a)
Teg modula la expresión
de marcadores de superficie
Cél vivas
Cél muertas
Cél Apopt.Tempranas
Cél Apopt.tardías
Viabilidad celular con un ensayo de Anexina V ~ Cuantificación: sorting celular de fluorescencia activada.
Teg modula la producción de citoquinas de DC estimuladas por LPS & de marcadores
de superficie (Cds) sin afectar la viabilidad celular.
La dif. entre prod. de citoquinas y menor expresión de Cds no se debe a muerte celular.
Evaluación de crecimiento y viabilidad celular:
Ensayos colorimétricos para medir la actividad de enzimas que reducen MTT o tintes cercanos.
La supresión de producción de citoquinas en DC inducidas por LPS por Teg no depende del tiempo de exposición y no es mediado por TLR4.
Dif. significativa con el control, mas no entre sí. T de
exposición NO importa.
control MutanteTLR4
Cepas de ratones
Ratones knock-out
Es independiente de TLR 4
Teg antes
A: No compite con LPS
por binding.
¿Estaría afectando a otras vías? ¿Tiene un efecto supresor
más amplio y complejo que atacar a una sola vía?
Med: Ausencia
Teg ataca a múltiples vías de TLR en Dcs.
*En todos los casos se cultivó con 2.5 hrs antes d stima)ELISA sandwich, 18 hrs luego de la stim. TLR-L=> maduración (sobrenadante)b) Citometría de flujo
TLR 2
TLR 5 TLR 9TLR 3TLR 2
Beta glucano.PGNFlagelina Polyinosinic:polycytidylic acid (vir –stim)Moléc. DNA Synth Single-stranded
¿Atacaría a otras vías independientes de TLR?
Teg afecta a una vía
diferente a la del TLR.
Dcs cultivadas con Teg 2.5 hrs antes de ser estimuladas con PMA para producir tales citoquinas y los CDs respectivos.
A:Se usó ELISA sándwich para medirlasB: Citometría de flujo.
X stimulation
Teg suprime fagocitosis de cél dendríticas.
Eritrocitosfagocitados
Fueron tratados por 2.5 horas para luego exponer al cultivo de Dcs a eritrocitos opsonizados por IgG.
CytoSelect 96-well phagocytosis assay para medir la habilidad fagocítica, ensayo colorimétrico usando una absorbancia de 610 nm.
Teg afecta la habilidad de las DCs para activar a Células T.Se usaron ratones DO11.10. virgen Se cultivaron las Dcs con OVA en presencia o ausencia de Teg antes de inocularlas. En SDLNs la activación de cél T se midió 7 días después por reestim. con OVA o PMA/antiCD3. Medición con un ensayo comercial.
Estimulación:
Prod:
Dcs expuestas a Teg suprimen la rpta Th1 in vivo.
Teg tiene un efecto supresivo
en rptas no específicas
de cél T
(Especif)
2x DNA
Uso de un isótopo:
[3H]thymidine
FIG. 8. F. hepatica Teg suprime la activación de NFK- Bp65, pero la activación de JNK, p38, o ERK no puede explicar el efecto total de supresión de F. hepatica Teg (FhTeg) en DCs.
Cultivadas después de 2 horas de stimul- LPS, se determinó NF-kB por lisis celular en western blot.
Medium (lane 1), FhTeg (lane 2), LPS for 15 min (lane 3),FhTeg plus LPS for 15 min (lane 4), LPS for 30 min (lane 5),
FhTegplus LPS for 30 min (lane 6), LPS for 1 h (lane 7), and FhTeg
plus LPSfor 1 h (lane 8).
Incremento
momentáneo
Análisisdensitométri
co
CONCLUSIONES POR RESULTADOS:
¿QUÉ OCURRÍA?
Teg NO inducía producción de citoquinas ni expresión de
marcadores en superficie celular si no…
Teg significativamente suprimió la producción de citoquinas (IL-12p70, IL-6, IL-10, tumor necrosis factor alpha & nitrite) y la expresión de marcadores de superficie (CD80, CD86, and CD40) en DC maduras => Supresión de los CD indica falla en la activación de linfocitos T.
Teg tiene un mecanismo de acción = al del reconocimiento por TLR-4 ({LPS) debido a que aún funcionaba en CD generadas a partir de TLR-4 mutante & knock out .
Parece no atacar los componentes comunes de la vía de TLR. En DC madura suprime al la subunidad p65 activa de NF- KB => Explicando la alteración de la producción de citoquinas proinflamatorias.
** P50 & P65 del heterodímero NF-KB. Entre las respuestas celulares involucradas con la activación de NF-kB se encuentran: la activación de células del sistema inmune a través de la inducción de citoquinas, la migración celular y reparación de tejidos a través de la inducción de moléculas de adhesión, inflamación a través de la inducción de proteínas de fase aguda, inhibición de la apoptosis y tumorigénesis a través de la regulación de protooncogenes. (Th1 & proc. proinflamatorios)
Expresados en la superficie de:CD40: Linfocitos BCD 80 & 86: DC.
IL-6:, TNF-α Citoquina proinflamatoriaIL-10: interviene en la regulación de la respuesta inflamatoria.Nitrito: Producto final del NO. (Defensa parás.)IL-12p70: Estimula TNF-α y (IFN-γ => IL – 4)
Favorece Th1
No induce a maduración DCs, aún así son capaces de inducir a una rpta potente mediadas por Th2.
La supresión de citoquinas fue selectiva.
Faltan estudios para determinar de forma concluyente si Teg deriva a una rpta.
Th2 o respuesta T-regulatorias.
Teg mantiene a las DCs inmanduras, alterando su función y su habilidad para rpta adaptativa.
CONCLUSIÓN FINAL:
En suma, los resultados obtenidos demuestran las potentes propiedades
anti-inflamatorias del Teg de F. hepática y su potencial terapéutico como un
agente anti-inflamatorio.