these de doctorat de l'universite pierre et marie
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THESE DE DOCTORAT DE
L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité
Génétique
(Complexité du vivant)
Présentée par
M. LOIRE Etienne
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE
Sujet de la thèse : Évolution des microsatellites codants chez les primates Soutenue le : le 25 Novembre 2009 Devant le jury composé de : M. DUJON Bernard Président du Jury
M. RADMAN Miroslav Rapporteur
M. GALTIER Nicolas Rapporteur
M. RAES Jeroen Examinateur
M. DEPAULIS Frantz Examinateur
M. NETTER Pierre Directeur de thèse
M. ACHAZ Guillaume Directeur de thèse
Université Pierre & Marie Curie - Paris 6 Bureau d’accueil, inscription des doctorants et base de données Esc G, 2ème étage 15 rue de l’école de médecine 75270-PARIS CEDEX 06
Tél. Secrétariat : 01 42 34 68 35 Fax : 01 42 34 68 40
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Table des matières
Résumé ..................................................................................................................................5
Introduction............................................................................................................................7
1. Mécanismes de mutation des microsatellites.................................................................13
1. 1 Les erreurs au cours de la réplication...................................................................14
1.2.1. La sélection de base assurée par la fidélité de la polymérase.........................15
1.2.2. La correction d’épreuves de la polymérase («Proofreading»)........................15
1.2.3. le glissement de l’ADN polymerases sur les microsatellites.............................18
1.3. Les erreurs au cours de la transcription ..................................................................20
1.4. Les erreurs au cours de la recombinaison ...............................................................23
1.5. Les insertions d’éléments mobiles de type Alu.......................................................28
1.6. L’importance du système MMR pour limiter l’instabilité des microsatellites..........30
1.6.1. Le système de correction des mésappariements ...............................................30
1.6.2. Le système MMR chez les procaryotes............................................................30
1.6.3. Le système MMR chez les eucaryotes .............................................................32
1.6.3 MMR et séquences répétées .............................................................................36
1.7. L’importance du système NMD pour limiter les conséquences des mutations des microsatellites...............................................................................................................37
1.8. Les facteurs intrinsèques qui influencent l’instabilité des mirosatellites..................39
2. Microsatellites au sein des gènes...................................................................................41
2.1. Abondance.............................................................................................................41
2.2. Impact fonctionnel des microsatellites codants.......................................................46
2.2.1. Régions 5’ non traduites..................................................................................47
2.2.2. Introns.............................................................................................................50
2.2.3. Régions 3’ non traduites..................................................................................52
2
2.2.4. régions codantes..............................................................................................53
2.2.4.1 Maladies neurodégénératives.....................................................................55
2.2.4.2 Instabilité des microsatellites et cancer ......................................................56
2.2.4.3 Loci de contingences chez les bactéries .....................................................57
2.3. Sélection................................................................................................................59
2.3.4. Sélection négative des microsatellites codants.................................................60
2.3.5. L’hypothèse d’une sélection positive des microsatellites codants.....................64
3. Questions adressées au cours de la thèse .......................................................................67
Résultats...............................................................................................................................69
1. Hypermutabilité des gènes chez H. sapiens...................................................................71
1.1. Article....................................................................................................................75
1.2. Résumé des résultats ..............................................................................................87
2. Évolution des microsatellites codants chez les primates ................................................89
2.1. Article (en préparation)..........................................................................................93
2.2. Résumé des résultats et discussion .......................................................................116
3) Impact du système NMD sur la progression des cancers colorectaux .........................119
Discussion..........................................................................................................................121
1. Résumé des résultats...................................................................................................122
2. Les groupes fonctionnels de gènes ne sont pas égaux devant les microsatellites codants.......................................................................................................................................123
3. Quantification de la force de sélection s’exerçant sur les microsatellites codants.........129
4. Le taux de substitution exceptionnel des microsatellites codants.................................133
5. Les contraintes imposées par les protéines, « produits » des gènes .............................135
Conclusion .........................................................................................................................137
Références..........................................................................................................................140
Annexe 1 : Article ..........................................................................................................156
3
Remerciements
La liste est longue, les sentiments sont forts, l’espace comme le temps sont réduits. Je ferais
de mon mieux, mais l’exhausitivité est impossible. L’ellipse recèle beaucoup.
Le jury qui a accepté de considerer attentivement cette thèse est evidemment à mettre en haut,
car il est constitué de personnes avec qui je n’ai pas de liens personnels. Ils se sont donc
chargés de cette tâche non par amitié ou pour me rendre service, mais bien par le sentiment du
devoir qu’ont les scientifiques de juger objectivement du travail de chacun.
Pierre et Guillaume sont également à placer dans la section la plus formelle de ces
remerciements. Je dois à leur confiance et leur soutien sans faille parmi les plus belles années
de ma vie. Dominique et Françoise m’ont également mis le pied à l’étrier. Vous m’avez
souvent aidé à me relever. Merci à vous, ainsi qu’à tous les collègues de l’équipe génétique et
évolution.
Jamais je ne me feliciterai assez (après tout j’ai bien le droit de me remercier un peu) d’avoir
poussé la porte de l’ABI, troisième étage droite, rue Cuvier. C’était comme un secret bien
gardé, un privilège. J’y ai beaucoup appris dans le domaine scientifique et tout a changé là-
bas. Quand je pense à vous tous, ce sont des détails qui m’émeuvent le plus. Le premier café
pris avec Eduardo et Marie, un jour de novembre. Le partage de cette boisson avec vous avait
un goût de rite intiatique. J’ai appris beaucoup : Pourquoi il faut se méfier des étiquettes,
surtout sur les vestes (merci Isabelle) ; Pouquoi il faut se méfier des étiquettes, surtout sur les
pulls (Merci Joel) ; Quelle est la différence entre un flic (Il ne sait ni lire, merci Henry) ;
Comment voler mon propre vélo (et pourquoi pas de mes propres ailes, merci Anne) ; Que
certaines flammes ne s’éteignent jamais (Merci Martine) ; Qu’un disque est parfois mou tout
en contenant des pépites (merci Sophie); Que Mars pourrait bien changer de couleur (Merci
Bernard) ; Comment encercler les étoiles et Charles de Gaulle (merci Cyril) ; Comment faire
un rocket-jump (merci Alex) ; Que certaines bombes se manient avec précaution, tout comme
les voitures (merci Sara !) ; Qu’on peut avoir la gentillesse sobrement chevillée au corp
(Merci Anne-laure) ; Ou manger les meilleurs tapas de Barcelone (Thanks Todd) ; Que le joe-
bar-team illustre les probabilités à merveille (merci Guillaume S.) ; Que la craie et le noir
vont si bien ensemble (merci Christine) ; Que le sourire est terriblement contagieux et se
pratique tout les jours (merci Manue, ‘MO’ et Mathilde).
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Si on ne peut pas prétendre battre Cthulhu, on peut tordre le coup à bien des livres, même
remplis d’équation. Merci Guillaume, pour les aventures dans le monde de l’imaginaire.
Grâce à toi, j’ai aussi saisi pourquoi Hugo avait écrit :
« Il n'est pas de brouillards, comme il n'est point d'algèbres,
! Qui résistent, au fond des nombres ou des cieux,!
À la fixité calme et profonde des yeux ;!
Je regardais ce mur d'abord confus et vague,!
Où la forme semblait flotter comme une vague,
!Où tout semblait vapeur, vertige, illusion ;!
Et, sous mon œil pensif, l'étrange vision!
Devenait moins brumeuse et plus claire, à mesure!
Que ma prunelle était moins troublée et plus sûre. »
Mais celui qui m’a appris ces vers, la license poétique, je la dois à Julien, comme beaucoup
d’autres choses. Merci à toi, ainsi qu’à Luc, pour toutes ces soirées durant lesquelles nous
nous sommes elevés ensemble.
Tristan, ta-rie, Pierre, Gael, Thomas, Elvire, Mickael, Sylvie, Fabien. Vous n’avez pas besoin
que je l’écrive ici pour savoir combien je vous aime, mais après tout c’est l’occasion.
Toi non plus Marie. Merci ma muse, amuse et m’use encore, longtemps si tu veux, toujours si
tu peux.
Mes frères, guides et modèles.
Ma mère. Présente. Toujours à mes cotés
Mon père. Présent. Toujours dans ma mémoire.
Elise, ma fille. Chaque heure avec toi m’est infiniment plus précieuse que les battements du
temps qui passe autour.
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Résumé
Les microsatellites sont des séquences qui présentent des mécanismes mutationnels propres à
leur nature répétée et qui aboutissent à de fréquents changements du nombre d’unité qui les
composent. Cette nature hypermutable des microsatellites, extrêmement abondants dans les
génomes eucaryotes, est responsable de leur polymorphisme élevé au sein des populations.
Ces répétitions sont soumises à une force de sélection qui tend à les purger hors des gènes, en
raison de l’instabilité qu’ils confèrent à ces derniers.
Nous avons caractérisé les gènes humains qui contiennent un microsatellite codant instable et
sont pour cette raison qualifiés d’hypermutables. Ces gènes hypermutables sont
spécifiquement impliqués dans un nombre restreint de fonctions cellulaires. La pression de
sélection négative qui s’exerce à l’encontre des répétitions n’est pas homogène selon les
groupes fonctionnels considérés.
Au sein du phylum des primates, les microsatellites codants évoluent par insertion et délétion,
mais également par substitution et ce à un rythme deux fois élevé que celui du reste des
séquences codantes. Ces substitutions créent ou interrompent les répétitions. La distribution
des effectifs reste à l’équilibre dans toutes les espèces considérées. En nous penchant sur un
type particulier de microsatellite, nous avons pu estimer le coefficient de sélection. L’effet
d’un microsatellite sur la valeur adaptative d’un individu est relativement faible, mais
suffisant pour biaiser la distribution de ces répétitions.
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7
Introduction
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Cette thèse s’inscrit dans un domaine d’étude, l’évolution moléculaire, bien trop vaste pour
permettre une introduction complète. Nombreux sont les objets et concepts qui l’ont enrichi
depuis que les lois de l’hérédité ont trouvé une base moléculaire avec la découverte du rôle
de la molécule d’ADN dans cette hérédité.
L’édifice des connaissances acquises sur ce sujet par l’humanité en un peu plus d’un siècle est
un monument qui n’en finira pas de fasciner un individu curieux des phénomènes naturels.
Car, niché derrière la stupéfiante diversité des formes prises par le vivant sur notre planète,
repose une unité fondamentale qui les rassemble toute. Les êtres vivants utilisent une classe
de biomolécules, les acide nucléiques, comme vecteur transmissible et persistant de
l’information génétique (Griffith 1928; Avery, MacLeod, and McCarty 1944). Ces molécules
sont constituées d’un enchaînement de monomères : les nucléotides. L’enchaînement
séquentiel de ces nucléotides permet de coder l’information nécessaire à l’accomplissement
du cycle vital des cellules qui constituent les organismes. Une fraction des molécules d’ADN,
les gènes, est spécifiquement décodée en fonction du contexte physiologique de la cellule et
en réponse à son environnement afin de produire des molécules (ARN ou protéines) qui
participent activement au maintien de son homéostasie. Chez les organismes pluricellulaires,
cette « expression » spécifique des gènes permet d’assurer le développement, la
différentiation des types cellulaires, et la coordination de leurs fonctions pour le maintien de
leurs homéostasies. Elle sous-tend la partie « visible » des organismes, forme et capacité,
appelée phénotype.
L’ensemble des molécules d’ADN, appelé génome, est recopié pour être transmis aux cellules
filles à chaque division cellulaire. À chaque génération, des nucléotides changent, s’ajoutent
ou disparaissent de manière aléatoire, altérant ainsi subtilement le patrimoine génétique des
individus. Ces mutations de la molécule d’ADN peuvent modifier sensiblement – ou pas du
9
tout - le phénotype des individus chez qui elles apparaissent. Ces variations sont alors
susceptibles de connaître plusieurs types de destin. Être perdues si l’individu qui les porte n’a
pas l’occasion de les transmettre, être transmises aux descendants et ensuite maintenues dans
une partie de la population, ou bien complètement l’envahir pour devenir la nouvelle « norme
». L’étude rigoureuse du destin des variations au sein des organismes d’une même espèce est
appelée génétique des populations. La conséquence, pour les populations d’organismes, de
l’existence de ces mutations et de leurs transmissions – ou non – à la génération suivante est
l’évolution dite moléculaire, trame de fond de l’évolution biologique.
Ces variations sont un matériau brut qui, raffiné par les processus évolutifs, a permis
permettant l’émergence de l’innombrable variété de forme des êtres vivants passés et présents,
des différences phénotypiques que l’on observe entre espèces comme de celles qui existent
entre individus d’une même espèce.
Dobzhansky a écrit que « Rien en biologie n’a de sens si ce n’est à la lumière de l’évolution ».
Cet adage est couramment cité par les biologistes pour expliquer que l’adaptation des
organismes à leur environnement est le résultat d’un processus d’évolution. Les mécanismes
qui sous-tendent l’évolution sont cependant trop souvent réduits à des explications simplistes.
En effet, l’adaptation des organismes à leur environnement est parfois interprétée comme le
seul résultat d’une sélection retenant les mutations qui modifient de façon avantageuse le
phénotype des individus qui les portent. Pourtant, ce qui compte ultimement en évolution,
c’est le nombre de descendants que laissera un individu. Être transmis à la génération suivante
est l’unique condition de la pérennité d’une variation. Si la variation influence de manière
directe le succès reproductif de l’individu qui la porte, la sélection peut alors être invoqué
comme une force évolutive à l’œuvre. Mais, parmi les forces évolutives susceptibles
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d’influencer la transmission d’une variation, on en reconnaît d’autres : Par exemple la dérive
et la démographie. Ces deux forces sont subtiles et difficiles à modéliser car non
déterministes. Elles intègrent les effets du hasard dans la transmission des variations. Par
exemple, le choix que font deux individus de se reproduire ensemble n’est pas forcément
dicté par la sélection, surtout quand les tailles de populations sont réduites. Nous devons cette
reconnaissance des effets stochastiques dans l’évolution à Wright et Fisher, dès les années
1930, puis à Motoo Kimura qui a posé dans les années 1970 les bases de ce qu’on appelle
aujourd’hui la théorie neutraliste de l’évolution.
Alors comment, aujourd’hui, mesurer les effets relatifs de ces différentes forces qui façonnent
l’évolution du patrimoine génétique ? Comment identifier les variations qui se sont fixées au
sein des espèces pour des raisons adaptatives (sélection) de celles qui l’ont été au hasard ?
Répondre à cette question est loin d’être uniquement un jeu intellectuel. Un exemple classique
d’application est de distinguer les variations qui, chez une bactérie résistante à un
antibiotique, ont été retenues dans son génome pour cette résistance qu’elles lui confèrent de
toutes les autres qui se sont fixées de façon neutre. D’autres aspirations moins pragmatiques
peuvent être évoquées, comme de savoir ce qui fait la spécificité du genre Homo.
La structure de la molécule qui porte notre patrimoine génétique est maintenant accessible.
Depuis quelques dizaines d’années, les techniques de séquençage permettent de lire l’exact
enchaînement des nucléotides qui composent les molécules d’ADN. Nous disposons donc à
présent des génomes d’un certain nombre d’individus appartenant à diverses espèces.
Ces génomes ne sont pas composés uniquement de ces unités informatives contraintes que
sont les gènes. Ils contiennent par exemple : des régions qui permettent d’attacher les
chromosomes à la matrice nucléaire, d’assurer leurs cohésions lors de la division cellulaire
11
(satellites centromériques), ou de terminer leur réplication (télomères), des interruptions au
sein même des gènes (introns), des gènes ayant perdus toutes fonctions (pseudo-gènes), des
séquences capables de se disséminer de façon autonome (éléments mobiles) et des répétitions
de motifs (mini- et microsatellites). Tout un « bestiaire » de séquences d’ADN dont
l’énumération rapide qui en est faite ici ne fait pas honneur aux nombreux travaux qui ont
permis de les identifier et de comprendre leur structure et leur évolution. Mais le propos est
moins d’introduire la complexité de la structure des génomes que d’appuyer le fait que pour
tout un pan de ceux-ci, le hasard a tenu un rôle prépondérant. l’évolution moléculaire n’est
pas seulement l’évolution des gènes.
Utiliser l’évolution de ces éléments comme un modèle « nul » à comparer avec l’évolution
des gènes pour comprendre les effets de la sélection sur ces derniers est une approche
possible. Toutefois les indices d’un rôle fonctionnel de ces éléments se sont accumulés, leur
valant d’être qualifiés aujourd’hui de « fraction non codantes » plutôt que d’ADN poubelle
(sic).
Dans le cadre des travaux présentés dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à une
classe particulière de ces éléments : Les microsatellites. Ces microsatellites sont des
répétitions de courts motifs que l’on observe disséminées dans les génomes de tous les
organismes étudiés. Ces répétitions sont soumises à un processus de mutation qui aboutit à
l’addition ou la soustraction du motif qui les composent au cours de la réplication. Évoluant
de façon neutre et présentant de nombreux variants au sein des populations, les microsatellites
sont des marqueurs de choix qui permettent de réaliser des études d’association, d’identifier
des individus ou de réaliser des tests de paternité. L’originalité de nos travaux tient dans la
localisation particulière des microsatellites étudiés : Les gènes. Ces derniers sont, comme on
12
l’a évoqué, la fraction exprimée du génome. Leur implication majeure dans le phénotype fait
qu’ils font partie des éléments les plus stables au cours de l’évolution La stabilité des gènes
peut-être mise en lumière par la simple constatation que certains sont restés, malgré des
millions d’années d’évolution, quasi-identiques au sein d’espèces si diverses que ces gènes
sont les seules preuves identifiables de leur ascendance commune. Cette relative immuabilité
des gènes pourrait nous amener à penser que l’évolution a favorisé la forme la plus stable
possible pour ces gènes. Et pourtant, parmi ces gènes, on observe la présence de
microsatellites. Ces microsatellites présentent la particularité d’être à la fois peu complexes,
c’est-à-dire porteurs de peu d’information, et mutagènes, c’est-à-dire de subir à une fréquence
importante des modifications de leur forme.
L’existence de ces microsatellites au sein des gènes est donc paradoxale. Peu complexe et
instables, ils existent pourtant au sein de la fraction la plus informative et parfois la mieux
conservée de notre patrimoine génétique.
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1. Mécanismes de mutation des
microsatellites
Nous définirons dans ce manuscrit les microsatellites comme des répétitions en tandem d’un
motif dont la longueur varie entre 1 et 6 nucléotides (Tautz 1994). On distinguera les
microsatellites « purs » des microsatellites interrompus, ces derniers présentant une ou
plusieurs interruptions au sein de la répétition. Le nombre minimal de répétition du motif
nécessaire pour considérer que la répétition constitue un microsatellite est une question pour
laquelle aucune réponse simple ne peut être apporté. Cependant, notre étude étant motivée par
la propriété d’instabilité des microsatellites, nous présenterons plus loin les valeurs du nombre
minimal de répétitions qui doivent, d’après différentes sources de la littérature, constituer un
microsatellites pour que ces derniers puissent être considérés comme instables.
Cette instabilité est la conséquence de mécanismes mutationnels particulièrement susceptibles
d’affecter ou de générer des microsatellites : les erreurs de réplication, les erreurs au cours de
la transcription, les erreurs au cours de la recombinaison, ainsi que les insertions d’éléments
mobiles du type Alu chez les primates. Nous présenterons un mécanisme de réparation de
l’ADN capable de juguler l’instabilité des microsatellites : le système de réparation des
mésappariements et le NMD, qui permet d’atténuer l’impact des mutations de microsatellites
codants. Enfin nous présenterons les facteurs susceptibles d’influencer l’instabilité des
microsatellites.
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1. 1 Les erreurs au cours de la réplication La réplication consiste à produire à chaque division une copie des millions ou milliards de
paires de bases qui composent le génome des organismes uni- ou multicellulaires. Cette
réplication est un processus très fidèle mais malgré tout imparfait. Depuis la description
originelle de la structure en double hélice de l’ADN par Watson et Crick (Watson and Crick
1953), plusieurs études ont montré que des systèmes multiples assurent la sauvegarde et la
stabilité de l’information génétique en limitant la fixation des mutations (Kunkel 1992). Grâce
à ces systèmes de réparation ou de correction, le taux net de mutation, des microbes jusqu’aux
mammifères, est très faible et varie généralement entre 10-8 et 10-11 mutations par base
répliquée et par génome (Drake et al. 1998).
La fidélité de la réplication de l’ADN détermine en grande partie la stabilité du génome. Le
faible taux de mutation observé durant la synthèse nucléotidique n’est pas la conséquence
intrinsèque de la seule précision de la réplication de l’ADN, mais reflète aussi l’existence de
mécanismes capables de corriger les erreurs de l’ADN polymérase (Umar and Kunkel 1996;
Kunkel and Bebenek 2000). La fidélité de la réplication, aussi bien chez les bactéries que chez
les cellules eucaryotes, est déterminée à trois niveaux agissant de manière séquentielle
(Kunkel 1992; Schaaper 1993; de Wind and Hays 2001). Premièrement, une importante
contribution à la fidélité de la réplication est conférée par la sélection de base par voie de
complémentarité assurée par l’ADN polymérase durant la polymérisation nucléotidique.
Deuxièmement, les erreurs faites par l’ADN polymérase peuvent être corrigées par une
activité exonucléolytique associée à la polymérase, appelée «proofreading» ou édition.
Finalement, un système post-réplicatif de réparation des mésappariements (ou MMR, de
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l’anglais « mismatch repair ») corrige les erreurs de réplication ayant échappé au
« proofreading ».
1.2.1. La sélection de base assurée par la fidélité de la polymérase
La sélection de base est le mécanisme qui permet à l’ADN polymérase de discriminer entre un
nucléotide et un autre durant la polymérisation selon l’appariement par complémentarité des
bases. En 1953, Watson et Crick ont montré que des liaisons hydrogène entre les bases A et T
et les bases G et C offrent une spécificité assurant une réplication fidèle de l’ADN. L’ADN
polymérase assure la sélection de base en fonction de la géométrie des paires de bases
formées. Le site actif de l’enzyme est modelé de manière à accepter l’équivalent géométrique
des paires de bases selon le modèle Watson et Crick et de rejeter les paires de bases qui
diffèrent de cette géométrie (Goodman, 1997). Cependant, des paires de bases non conformes
au modèle Watson et Crick peuvent aussi se former; d’où le rôle de l’ADN polymérase à
empêcher ce type de liaison. La fidélité de la réplication dépend donc de l’efficacité de l’ADN
polymérase à incorporer la base exacte. Ainsi plus l’ADN polymérase est fidèle, plus
l’appariement de bases se fait correctement et sans erreurs (Schaaper 1993; Echols and
Goodman 1991).
1.2.2. La correction d’épreuves de la polymérase («Proofreading»)
La fidélité de la réplication dépend non seulement de la sélection de base de l’ADN
polymérase, mais aussi de son activité exonucléolytique 3’->5’. L’ADN polymérase génère
deux types d’erreurs au cours de la réplication : les substitutions survenant lorsqu’un
nucléotide mal apparié est incorporé, et l’insertion ou la délétion d’un nucléotide
supplémentaire. Ces erreurs peuvent être repérées et corrigées par l’ADN polymérase elle-
même grâce à son activité de correction d’épreuves, ou « proofreading ». Il en résulte ainsi
16
une augmentation de la fidélité de la réplication. Au cours de l’élongation nucléotidique dans
le sens 5’->3’, si une erreur est commise par la polymérase, l’enzyme repart en sens contraire
(3’->5’) et excise la dernière base ajoutée, créant un site libre qui pourra être occupé par un
autre nucléotide (Figure 1.1) (Kunkel 1990; Kroutil et al. 1996).
Cette fonction « proofreading » de l’enzyme devient particulièrement importante en présence
de séquences répétées car l’ADN polymérase génère alors plus fréquemment des erreurs
d’insertion et de délétion de bases. Durant la réplication des microsatellites, l’activité
exonucléolytique de la polymérase est très sollicitée. Malgré cela, sa capacité à corriger ses
propres erreurs diminue lorsque le nombre de répétitions augmente (Kroutil et al. 1996).
17
Figure 1.1 : L’ADN polymérase et son activité exonucléolytique de correction d’épreuves
1 . L’ADN polymérase incorpore un nucléotide selon la sélection de base par complémentarité. 2. Le nucléotide entre et une liaison se forme. 3 . L’enzyme avance d’un nucléotide . 4 . Un mauvais appariement entraîne le retrait du nucléotide et l’enzyme recule de 1 pb (tiré de Lewin, 1999).
18
1.2.3. le glissement de l’ADN polymerases sur les microsatellites
La fidélité de la réplication de l’ADN est aussi fonction de la nature de la séquence d’ADN à
répliquer.
Les données disponibles chez la levure, les mammifères et la drosophile suggèrent que les
altérations dans les microsatellites, particulièrement les répétitions simples, reflètent le
dérapage de l’ADN polymérase qui produit des mésappariements entre une ou plusieurs bases
répétées (Levinson and Gutman 1987; Strand et al. 1993; Harfe and Jinks-Robertson 2000b).
Au fur et à mesure que l’ADN polymérase progresse le long de la séquence répétée, une
transition a lieu entre le brin natif et le brin complémentaire. Les deux brins peuvent se
réassocier dans une configuration de mésappariement. Si la base mésappariée est sur le brin
natif, le microsatellite s’allonge par addition d’une unité répétée, alors que le mésappariement
d’une base sur le brin complémentaire servant d’amorce entraîne une délétion (Figure 1.3)
(Strand et al. 1993; Umar and Kunkel 1996; Sia et al. 1997).
19
Figure 1.2: Schéma illustrant l’instabilité d’un microsatellite (GT)5.
Si les nucléotides mésappariés sont sur le brin natif, il en résulte une insertion transitoire, alors que les nucléotides mésappariés sur le brin complémentaire entraînent une délétion transitoire. Ces intermédiaires peuvent êtres corrigés, en présence d’un système de réparation fonctionnel, par un réalignement ou une excision 3’—> 5’ du brin natif avant que la synthèse ne continue. Si la correction n’a pas lieu durant la réplication, le brin nouvellement synthétisé peut être réparé une fois la réplication achevée en utilisant le brin parental comme gabarit complémentaire. Cependant, la continuation de la polymérisation de ces intermédiaires sans « proofreading» ni réparation provoque une insertion ou une délétion dans le brin nouvellement synthétisé (adapté de (Umar and Kunkel 1996)).
20
1.3. Les erreurs au cours de la transcription
Il existe maintenant de nombreuses évidences mettant en lumière le rôle de la transcription
comme source d’instabilité des microsatellites chez de nombreux organismes modèles (voir
Lin, 2009). En clonant un microsatellites au sein du gène rapporteur lacZ dans un plasmide,
Bowater et ses collègues (Bowater et al. 1997) ont pu mettre en évidence chez Escherishia
coli que l’instabilité du microsatellite – une répétition de CAG – était augmentée d’un facteur
10 quand la transcription du gène était induite. Chez la levure, une expérience similaire menée
sur une répétition du nucléotide CG a mis en évidence une augmentation d’un facteur 9 de
l’instabilité suite à l’activation de la transcription de cette séquence (Wierdl, Dominska, and
Petes 1997). Le modèle que ces derniers proposent pour rendre compte de cette instabilité est
le suivant : Au cours de la transcription, les brins complémentaires d’ADN sont séparés par
les hélicases du complexe de polymérisation de l’ARN. Des structures secondaires (épingles à
cheveux ou boucles) sont alors susceptibles de se former au cours de la réassociation des brins
d’ADN, notamment si les répétitions qu’ils contiennent sont constituées du tri-nucleotides
CTG. En l’absence de réparation, la longueur des microsatellites au cours des transcriptions
suivantes est affectée (voir figure 1.3).
Il est à noter que ce mécanisme ne s’applique qu’aux microsatellites susceptibles d’être
transcrits, c’est-à-dire présents dans l’environnement d’un gène. Les microsatellites concernés
sont ceux qui sont susceptibles d’adopter des structures secondaires. Ceci restreint le rôle de
ce mécanisme dans l’évolution des microsatellites de manière générale, mais est d’un intérêt
tout particulier car il implique que les mutations de microsatellites dans l’environnement d’un
21
gène peuvent survenir de façon somatique, c’est-à-dire au sein de chaque cellule, et
indépendamment de la réplication.
22
Figure 1.3 Modèle de l’instabilité des microsatellites dûs à la transcription.
Une répétition de CAG est présente sur le brin du haut et une répétition de CTG sur le brin du bas, dans la direction de la transcription. La transcription se réalise de la gauche vers la droite. Le passage de l’ARN pol2 (en bleu clair) entraîne la formation de structure secondaire au niveau des microsatellites. L’épingle à cheveux est stabilisée par la fixation du complexe mutS (en vert et bleu). L’ARN pol2 suivante est arrêté par la présence de ce complexe, ce qui induit une réponse de type NER (nucleotide excision repair). Le déplacement de l’ARN pol2 permet d’initier la réparation par le système du NER (XPG, ERCC1 et XPF). La réparation entraîne une expansion ou une contraction du microsatellite. Adapté de Lin et al, 2006(Lin, Dion, and Wilson 2006).
23
1.4. Les erreurs au cours de la recombinaison
La recombinaison est un mécanisme qui permet de transférer directement un fragment d’une
molécule d’ADN vers une autre. Ce transfert peut-être réciproque ou être effectué dans une
seule direction. Ce transfert nécessite que les molécules d’ADN soient capables de s’apparier,
et donc partage une certaine identité de séquences pour amorcer le processus. Cette identité
peut-être très localisée, entre des molécules de taille et d’origines très diverses. On parle alors
de recombinaison non-homologue. Différents processus effectués par les êtres vivants
haploïdes sont initiés par une phase de recombinaison non-homologue : Le transfert
horizontal de matériel génétique, la rétro-transposition d’éléments mobiles ou encore
l’insertion de phages (Insertion Sequences). Ces mécanismes sont fondamentaux chez ces
organismes car ils permettent une dispersion des variations génétiques au sein d’une même
population, de population différentes ou même d’espèces différentes.
Chez les organismes diploïdes, de nombreux événements de recombinaison réciproques
s’effectuent lors de la formation des gamètes entre les chromosomes homologues, permettant
de briser la liaison génétique existant entre des variations portées par une même molécule
d’ADN parentale (i.e. de permettre à un individu de produire des gamètes contenant des
variations hérités des molécules d’ADN paternelles et maternelles). La recombinaison est
dites homologue car elle s’effectue entre des molécules très ressemblantes, ayant une forte
identité et au niveau d’un même locus. D’autres part, des mécanismes de recombinaison sont
à l’œuvre lors de la réparation d’un certain nombre de dommages faits à une des molécules
d’ADN, en utilisant la molécule d’ADN homologue comme matrice.
24
Les longues répétitions génomiques sont susceptibles d’altérer la spécificité de la
recombinaison homologue. Chaque exemplaire de la répétition, disséminé au sein du génome,
est susceptible d’être reconnu comme une zone homologue au cours de la recombinaison. Il
en résulte une recombinaison dite ectopique car effectuée entre deux segments d’ADN situés
à des loci différents avec comme conséquence un remaniement important de la structure des
génomes (Achaz et al. 2002).
Toutefois, ce qui nous intéresse ici est de savoir s’il existe un lien entre recombinaison et
mutation des microsatellites. Certaines observations suggèrent en effet que la recombinaison
est une cause majeure de l’évolution des microsatellites et qu’inversement les microsatellites
sont susceptibles d’être à l’origine des sites de recombinaison (Treco and Arnheim 1986;
Kirkpatrick et al. 1999; Gendrel, Boulet, and Dutreix 2000). L’étude mené par Bagshaw et ses
collègues (Bagshaw, Pitt, and Gemmell 2006) à mis en évidence chez la levure
Saccharomyces cerevisiae une association entre les hot-spots de recombinaison (des sites
récurrents d’initiation de la recombinaison au cours de la méiose) et densité de microsatellites.
Toutefois, cette association entre microsatellites et hot-spots de recombinaison ne s’observe
qu’avec certains types de microsatellites (des répétitions de mono-, di- et tri-nucléotides
intergéniques), et sur une fraction réduite des hot-spots (117) mis en évidences chez la levure.
Cette association n’est pas significative pour tous les autres microsatellites et pour les hot-
spots situés aux abords des régions géniques.
Cette association n’a pas pu être détectée dans les génomes de primates, probablement car les
sites d’initiation de la recombinaison sont trop labiles pour que cette association soit
détectables (Myers et al. 2005).
25
Dans une autre étude menée sur S. cereviasiae, Richard et Pâques ont proposé un modèle
permettant de rendre compte du lien entre recombinaison et instabilité des répétitions
(Richard and Paques 2000). Ce modèle a pour base le SDSA (pour synthesis-dependant strand
annealing, qu’on pourrait traduire par association de brins dépendant d’une étape de
synthèse). La recombinaison est initiée par une cassure double-brin. Après invasion du brin 3’
au niveau de la molécule homologue, les étapes de synthèse se font sur les deux brins ont eu
lieu la cassure. Ensuite, une ou plusieurs étapes de dissociations (unwinding) du brin
synthétisé puis de réassociations peuvent se produire. Entre chaque étape, une ré-invasion de
la molécule patron a lieu. C’est au cours de chacune de ces étapes de ré-invasion, si une
répétition est présente au niveau de la cassure initiale, qu’un mésappariement est susceptible
de se produire entre les différentes unités qui constituent la répétition (voir figure 1.4). Ce
mécanisme mutationnel est donc susceptible de modifier drastiquement le nombre de
répétition.
26
Figure 1.4 : Modèle de réarrangement de répétition par SDSA.
L’initiation se fait suite à une cassure double-brin et l’invasion par l’extrémité 3’ de la matrice homologue. Les flèches représentent les étapes de synthèse d’ADN. La molécule cassée ou « donneuse » est en bleu, la molécule matrice ou « receveuse » est en rouge, les brins néo-synthétisées en orange. Les répétitions en tandem sont hachurées. Les brins néosynthétisées contiennent tout deux la répétition et leur mésappariements peuvent entraîner une contraction ou une expansion de la répétition. Alternativement, (sur la droite), les brins néo-synthétisés peuvent se dissocier et se « mésapparier » lors de la ré-invasion. Expansion et contraction peuvent alors se produire, plusieurs fois au cours d’un même événement de recombinaison.
27
Une autre observation suggère cependant un lien faible entre recombinaison et mutation des
microsatellites. En effet toute une portion du chromosome Y, qui détermine le genre sexuel de
l’individu, n’est jamais en présence d’un homologue au cours du cycle vital. De ce fait, cette
portion n’est pas soumise à la recombinaison homologue méiotique. Or la fréquence observée
de mutation de microsatellites dans cette portion du chromosome Y n’est pas
significativement inférieure à celle observée dans les autosomes (Gusmao et al. 2005)
28
1.5. Les insertions d’éléments mobiles de type Alu
Les séquences Alu sont des éléments mobiles de type SINE (short interspersed elements),
c’est-à-dire de moins de 500 paires de bases (Schmid 1996). Ces éléments sont qualifiés de
mobile en vertu de leur capacité à se transposer. Le mécanisme de transposition s’apparente
une forme de copier-coller. Un ARN messager de type Alu est transcrit par l’ARN
polymérase III. La rétro-transcription de l’ARN sous forme d’ADN au sein d’un site
d’insertion (voir figure 1.5) est réalisée par une enzyme de type reverse transcriptase produite
par d’autres classes d’éléments mobiles (Mathias et al. 1991). Les séquences Alu représentent
à elle seule environ 10% du génome humain, soit plus d’un million de copies (Lander et al.
2001). Différentes études ont mis en évidence une association chez les primates entre les
éléments Alu et des séquences de faibles complexités (Economou et al. 1990; Jurka and
Pethiyagoda 1995; Toth, Gaspari, and Jurka 2000). Deux séquences de faibles complexité
accompagnent les élements Alu lors de leurs insertions. La région centrale qui contient la
séquence A5TACA6 et la queue poly-A qui contient jusqu’à 100 adénines consécutives. (voir
figure 1.6). L’association observée entre éléments Alu et microsatellites n’est donc pas
étonnante. Mais cette association peut également être due à la présence de microsatellites au
sein du site d’insertion des éléments Alu (Arcot et al. 1995). Au total, il a été estimé que les
éléments Alu pouvaient potentiellement générer 2.2 millions de sites microsatellites (Batzer
and Deininger 2002). L’influence des éléments Alu sur la présence des microsatellites codants
reste toutefois soutenue par peu d’observations (Mais voir par exemple le microsatellite
intronique du gène de la frataxine (Justice et al. 2001).
29
Figure 1.5 : Structure et retrotranspostion d’un élément Alu humain.
a) La longueur totale d’un élément Alu est d’environ 300 paires de bases (variant avec la longueur de la queue poly-A). Ils sont composés d’une région centrale riche en adénines et flanqués de deux répétitions directes dérivées du site d’insertion (flèches noires). La région 5’ contient un promoteur (boites A et B). La région 3’ est constituée d’une répétition directe d’Adénine.
b) La transcription est réalisée par l’ARN polymérase III, initiée au niveau de la région promotrice (A et B). Les séquences Alu ne comportant pas de signal de terminaison, la transcription se poursuit en aval de la région 3’ jusqu’à rencontré une région poly-T.
c) La coupure au site d’insertion (TTAAAA) par l’endonucléase L1 permet l’invasion et la rétro-transcription (flèche mauve) du transcrit.
d) Deux nouvelles répétitions directes sont crées au niveau du site d’insertion (flèches rouges)
Adapté de Batzer et Deiniger, 2002 (Batzer and Deininger 2002).
30
1.6. L’importance du système MMR pour limiter l’instabilité
des microsatellites
1.6.1. Le système de correction des mésappariements
Le système de correction des mésappariements (MMR) participe au maintien de l’intégrité du
génome chez les organismes vivants. Ce système reconnaît et corrige les bases mésappariées
et les petites insertions/délétions. C’est donc un système de réparation ou de correction post-
réplicatif. En plus de ce rôle majeur, le système MMR est également impliqué dans la
restriction de la recombinaison entre les séquences d’ADN divergentes par inhibition de leur
interaction, de manière à maintenir l’intégrité des espèces en réduisant la fréquence des
recombinaisons (Modrich and Lahue 1996,Kolodner 1996; Harfe and Jinks-Robertson 2000a;
Schofield and Hsieh 2003).
1.6.2. Le système MMR chez les procaryotes
Les protéines «Mut» du système MMR ont été initialement identifiées chez l'organisme
procaryote Escherichia coli (Radman and Wagner 1986). Trois protéines majeures, MutS,
MutL et MutH, sont impliquées dans la correction des mésappariements. Comme nous
l’avons expliqué plus haut, les mésappariements résultent soit d’une mauvaise incorporation
nucléotidique soit d’un dérapage de la polymérase ayant échappé à la correction d’épreuves.
La première étape de la correction des erreurs de réplication implique l’homodimère MutS,
qui reconnaît le mésappariement et se lie à la base incorrecte afin d’initier la cascade des
événements du système MMR. L’hydrolyse de l’ATP assure le mouvement bi-directionnel de
31
l’ADN vers MutS afin de former une structure en boucle. En présence d’ATP et d’un
mésappariement, MutS recrute un homodimère constitué de la protéine MutL. L’assemblage
de ce complexe formé au niveau de la structure en boucle de l’ADN stimule l’activité
endonucléolytique de MutH, laquelle clive le brin d’ADN nouvellement synthétisé à partir
d’une séquence voisine GATC non-méthylée. Le brin clivé est ensuite dégradé par une
exonucléase, puis la correction du mésappariement est complétée par une nouvelle synthèse
d’ADN effectuée par une polymérase spécifique (polymérase III) suivie d’une ligature qui
assure la continuité de la restauration du brin (Modrich and Lahue 1996; Jiricny 1998;
Schofield and Hsieh 2003).
32
1.6.3. Le système MMR chez les eucaryotes
Chez les eucaryotes, les caractéristiques générales du système MMR sont conservées, mais le
nombre de gènes MMR est supérieur à celui retrouvé chez les bactéries et variable selon les
espèces (Harfe, Minesinger, and Jinks-Robertson 2000). À titre d’exemple il existe six
homologues de MutS (MSH1-MSH6) et quatre homologues de MutL (MLH1, MLH2, MLH3
et PMS1) dans le génome de S. cerevisiae. Parmi les homologues de MutS, seules les
protéines MSH2, MSH3 et MSH6 interviennent dans la correction de mésappariments. MSH1
est impliquée dans la réparation et le maintien de l’ADN mitochondrial (Reenan and
Kolodner 1992) pour leur part, MSH4 et MSH5 interviennent dans les processus de
recombinaison méiotique (Hollingsworth, Ross-Macdonald et Roeder 1994; Ponte, and
Halsey 1995).
33
Figure 1.6 : Représentation schématique du système de correction des
mésappariements post-réplicatifs dans des cellules humaines.
L’erreur est ici un mésappariement de type G/T à corriger en G/C. Le processus démarre par la liaison du complexe hMSH2/hMSH6 qui recrute le dimère hMLH1/hPMS2. Ce complexe possède alors la capacité de se déplacer dans les deux directions sur la molécule d’ADN (flèche verte). Lorsqu’il rencontre une discontinuité sur un brin, par exemple un gap entre deux fragments d’okazaki, il se lie à l’anneau PCNA (cercle bleu) et recrute une exonucléase (EXO1, en rouge) initiant ainsi la dégradation du brin néo-synthétisé. Ce processus est ré-initié par des fixations secondaires de complexes hMSH2/hMSH6/hMLHl/hPMS2 au niveau du mésappariement. Des protéines de type RPA (losanges bleus) viennent stabiliser le simple brin. Une polymérase puis une ligase assurent la re-synthèse du brin et sa ligation. Adapté de Stojic et al, 2004 (Stojic, Brun, and Jiricny 2004).
Parmi les autres eucaryotes, la drosophile possède le plus faible nombre de gènes MMR, où
seuls les homologues de MSH2 (spel1), MSH6, MLH1 et PMS1 ont été identifiés. La
drosophile ne dispose d’aucun homologue de MSH1, MSH3, MSH4, MSH5, MLH2 ou
MLH3 (Flores, 2001). De tous ces gènes, le gène MSH2 joue un rôle central dans le système
34
MMR car son altération entraîne une augmentation importante du taux de mutation (Reenan
and Kolodner 1992).
Contrairement aux procaryotes, où les protéines MutS et MutL fonctionnent en homodimères,
les protéines MMR agissent en hétérodimères chez les eucaryotes. Des études génétiques et
biochimiques indiquent que le complexe MSH2-MSH6 (appelé MutS!) répare les bases
mésappariées et les petites insertions/délétions constituées d’un ou deux nucléotides, alors que
le complexe MSH2-MSH3 (MutS") joue un rôle majeur dans la correction de plus grandes
boucles d’insertions/délétions, ayant entre 2 et 8 nucléotides.
Pareillement, chez les eucaryotes, il existe plusieurs homologues de MutL, lesquels forment
également des hétérodimères. La toute première protéine MMR identifiée chez la levure fut
PMS1, un homologue de MutL (Williamson, Game, and Fogel 1985). En l’absence de ce
gène, un phénotype particulier avait été observé, une ségrégation post-méiotique, c’est-à-dire
la présence de deux allèles différents d’un gène au sein d’un produit haploïde de la méiose.
C’est ce phénotype qui a donné son nom (« post-meiotic segregation », PMS) à cet
homologue de MutL. Les autres homologues eucaryotes de MutL (MLH1-MLH3) ont été
identifiés sur la base de la conservation de la séquence d’acides aminés (Prolla, Christie, and
Liskay 1994; Modrich and Lahue 1996; Flores-Rozas and Kolodner 1998). Parmi ces
homologues, MLH1 est le composant central puisqu’il forme des hétérodimères avec les trois
autres homologues de MutL (Wang, Kleckner, and Hunter 1999). Les complexes MutL!
(MLH1-PMS1) et MutL# (MLH1-MLH2) interviennent dans la correction des
mésappariements, alors que l’hétérodimère MutL" (MLH1-MLH3) intervient dans la
recombinaison méiotique et supprime les mutations (Harfe and Jinks-Robertson 2000a). La
mutation des gènes PMS1 ou MLH1 chez la levure entraîne une augmentation du taux de
35
mutation comparable à celle observée chez les mutants msh2 (Prolla, Christie, and Liskay
1994), d’où l’importance de ces gènes dans la correction des mésappariements.
Jusqu’à présent, aucun homologue de la protéine MutH n’a été trouvé chez les eucaryotes. Il
est généralement postulé que la discrimination du brin à réparer se fait par un mécanisme
autre que par la méthylation de l’ADN. Les coupures au niveau du brin nouvellement
synthétisé constituerait une cible à la réparation (Figure 1.6). Les étapes de la resynthèse et de
la ligature achèveraient le processus de correction de façon analogue à ce qui se passe chez les
procaryotes (Harfe and Jinks-Robertson 2000a).
36
1.6.3 MMR et séquences répétées
Les gènes MMR participent donc au maintien de l’intégrité du génome chez les organismes
vivants. De nombreux travaux antérieurs (Strand et al. 1993; Kolodner and Alani 1994; Sia et
al. 1997; Strauss, Sagher, and Acharya 1997; Tran et al. 1997; Flores and Engels 1999) ont
montré que ces gènes jouent un rôle important dans la stabilité des séquences répétées aussi
bien chez les procaryotes que chez divers eucaryotes (levure, drosophile, mammifère). Il a été
montré que, chez la S. cerevisiae, l’inactivation du gène MSH2 provoque une augmentation
de 350 fois de l’instabilité du dinucléotide (GT)17 (Strand et al. 1993), une augmentation de
plus de 1000 fois de l’instabilité d’un mononucléotide (C)8 (Strauss, Sagher, and Acharya
1997) et un accroissement de près de 10,000 fois de l’instabilité d’une répétition simple (A)14
(Tran et al. 1997). Chez la drosophile, une mutation du gène Spel1 (l’homologue de MSH2 de
levure) provoque une réduction de la stabilité des dinucléotides (Flores and Engels 1999).
Ce qui est vrai pour MSH2 l’est également pour d’autres gènes MMR. Plusieurs travaux
permettent d’illustrer un effet semblable suite à la mutation du gène PMS1 de levure (ou son
homologue chez d’autres eucaryotes). Par exemple, Strand et al. (1993) ont montré qu’une
mutation dans le gène PMS1 de levure se traduisait par une augmentation de l’instabilité du
microsatellite (GT)17 d’environ 700 fois. Chez la souris déficiente en PMS2, Yao et ses
collègues (Yao et al. 1999). ont noté une augmentation de 50 fois de l’instabilité du
mononucléotide (A)24 ainsi qu’un accroissement de 24 fois du dinucléotide (CA)33 par rapport
aux souris sauvages.
37
1.7. L’importance du système NMD pour limiter les
conséquences des mutations des microsatellites
Le système NMD, pour Non-sens Mediated Decay, permet la détection de transcrits contenant
un codon stop prématuré et d’induire leur dégradation (Baker and Parker 2004).
Les acteurs principaux de cette reconnaissance sont les protéines UPF1, UPF2 et UPF3. Ces
trois protéines, découvertes chez S. cerevisiae (Lelivelt and Culbertson 1999), sont conservées
chez un grand nombre d’espèces eucaryotes, y compris chez les mammifères et jouent un rôle
similaire chez tous ces organismes (Maquat 2004). Un des modèles actuels de
reconnaissances des codons stop prématuré (PTC) fait intervenir le complexe de jonction des
exons (EJC). Ce complexe se met en place au cours de l’étape d’épissage des introns, à 22
nucléotides en amont de la jonction entre deux exons. Lorsque le ribosome rencontre un
codon stop en amont d’un de ces complexes, il recrute UPF1 via les protéines TRF1 et TRF3
(facteur d’arrêt de la traduction). UPF2 et UPF3, liés au complexe EJC, sont alors
susceptibles d’interagir avec UPF1 et d’entraîner la dégradation du messager via l’exosome,
le complexe Ski et l’exonucléase XRN1 (voir figure 1.7).
L’interaction entre UPF2 et UPF3 se fat avec le complexe de jonction exon-exon, le système
NMD n’est donc capable de détecter un codon stop prématuré que si celui-ci est situé avant le
dernier intron du messager. Ceci revient à dire qu’un codon stop prématuré dans le dernier
exon d’un messager n’induira pas la dégradation de ce dernier par la voie du NMD.
38
Chez les organismes ne présentant pas d’interruption des séquences codantes (notamment la
levure, chez qui les introns sont peu fréquents), l’activation du NMD se réalise grâce aux
interactions entre les protéines UPF liées à la queue poly-A (PABP) et au ribosome en arrêt.
L’existence de ce mécanisme est d’importance dans le cadre de nos travaux, car les
microsatellites présents dans les phases codantes des gènes sont, du fait de leur mécanisme de
mutation par insertion/délétion, sont particulièrement susceptible d’introduire un décalage de
la phase de lecture et donc d’induire une réponse du complexe NMD.
Figure 1.7: Schéma illustrant le système NMD chez les mammifères :
a) lors de l’arrêt du ribosome au cours de la traduction sur le codon stop prématuré (PTC), les protéines TRF1 et TRF2 recrutent UPF1. Cette dernière se lie aux protéines UPF2 et UPF3 liées au complexe de jonction exon-exon (EJC) en aval.
b) Une fois le complexe NMD formé, le messager est entraîné vers une voie de dégradation dépendante de la nucléase XRN1, de l’exosome et du complexe Ski.
Adapté de Conti and Izaurralde, 2005 et de Wen and Brogna 2008.
39
1.8. Les facteurs intrinsèques qui influencent l’instabilité
des mirosatellites
Le taux d’instabilité est affecté par plusieurs caractéristiques du microsatellite lui-même: la
longueur de l’unité répétée, la composition de l’unité répétée, le nombre de répétitions de
cette unité de base, le taux de transcription du microsatellite, la pureté de la séquence répétée
(ex. présence d’interruptions dans la répétition) et la composition de la séquence flanquante.
Ces différents paramètres seront développés dans les paragraphes suivants.
Il a été observé que des suites mononucléotidiques sont plus instables que les dinucléotides,
qui sont à leur tour plus instables que les trinucléotides, etc... Ceci a été rapporté chez E. coli
(Bichara, Wagner, and Lambert 2006), S. cerevisiae (Henderson and Petes 1992; Sia et al.
1997), ainsi que chez dans des cultures de cellules de mammifères (Boyer et al. 2002). Il s’en
dégage une tendance : pour un nombre égal de répétitions, plus l’unité répétée est longue, plus
le microsatellite sera stable.
La composition en bases influence également le taux de mutation des microsatellites. Les
répétitions de G ou de C sont plus instables que celles composées de A ou de T (Boyer et al.
2002). Chez S. cerevisiae, par exemple, des mononucléotides constitués de 10 C ou 10 G sont
de trois à 19 fois plus instables que ceux composés de 10 A ou de 10 T (Harfe and Jinks-
Robertson 2000b).
Une étude chez E. coli (Morel et al. 1998) a montré que l’instabilité d’un microsatellite d’une
longueur donnée dépend de son orientation par rapport au sens de la réplication, l’instabilité
40
d’un poly(TG) étant deux fois plus élevée que celle d’un poly(AC) de même longueur.
D’autres travaux ont aussi montré que l’instabilité d’un trinucléotide est affectée par son
orientation (Kang et al. 1995; Maurer, O'Callaghan, and Livingston 1996). Par contre, une
étude chez S. cereviae a montré que le taux d’instabilité d’un poly(GT) est indépendant de
cette orientation (Henderson and Petes 1992).
Enfin, la longueur de la séquence répétée, c’est-à-dire le nombre de fois qu’est répétée l’unité
de base, affecte l’instabilité des microsatellites (Wierdl, Dominska, and Petes 1997; Yamada
et al. 2002a ; Ellegren 2004). La fréquence de dérapage de l’ADN polymérase dans les
mononucléotides est d’autant plus élevée que le microsatellite est long (Kroutil et al. 1996).
Chez S. cerevisiae, un microsatellite de 14 adénines est par exemple 400 fois plus instable que
son homologue contenant 4 adénines (Tran et al. 1997). Une étude effectuée chez Arabidopsis
thaliana a montré que l’instabilité d’un mononucléotide constitué de guanine est positivement
corrélée à sa longueur (Leonard, Bollmann, and Hays 2003).
L’étude de l’importance relative des facteurs influençant les microsatellites à pu être
déterminé récemment en examinant des loci de microsatellites homologues dans les génomes
du chimpanzé et de l’homme (Kelkar et al. 2008). Il se dégage de cette étude que :
- Les facteurs intrinsèques (nombre de répétitions, longueur du microsatellite,
composition du motif) sont de meilleurs prédicteurs de la mutabilité que les facteurs
extrinsèques (localisation génomique, niveau de transcription)
- le nombre de répétitions du motif est le facteur intrinsèque qui influence le plus la
mutabilité (i.e. explique 73 % de la variance dans leur modèle de régression).
41
2. Microsatellites au sein des gènes
2.1. Abondance
La mesure de l’abondance des séquences microsatellites au sein des gènes à été largement
explorée par de nombreuses études, plus au moins exhaustives selon la disponibilité des
séquences génomiques à l’époque où elles ont été conduites. Chez les eucaryotes modèles
séquencés, un certain nombre de microsatellites ont été observés dans les phases ouvertes de
lecture, notamment dans les génomes de D. melanogaster, A. thaliana, C. elegans, H.sapiens
et S. cerevisiae (Toth, Gaspari, and Jurka 2000; Katti, Ranjekar, and Gupta 2001; Kantety et
al. 2002; Morgante, Hanafey, and Powell 2002).
Il existe également aujourd’hui des bases de données qui permettent d’accéder, pour les
espèces eucaryotes modèles dont le génome complet a été séquencé, à l’ensemble des loci
microsatellites (essentiellement dédiées à la recherche de marqueurs génétiques pour conduire
des études d’association). Par exemple : la Microsatellites Repeats Database for genomes à
l’adresse http://www.ccmb.res.in/mrd/ (Subramanian, et al. 2002), Satellog à
http://satellog.bcgsc.ca (Missirlis, et al. 2005), EuMicroSatdb à
http://ipu.ac.in/usbt/EuMicroSatdb.htm (Aishwarya, et al. 2007) et UgMicroSatdb à
http://ipu.ac.in/usbt/UgMicroSatdb.htm (Aishwarya, et al. 2008).
Chez de nombreuses espèces, les exons – contrairement aux autres régions génomiques –
contiennent de rares répétitions de di- et de tetra- nucléotides, mais présentent plus de tri- et
d’hexa-nucléotide répétés que tout autres type de motifs répétés (Edwards et al. 1998;
Metzgar, Bytof, and Wills 2000; Wren et al. 2000; Young, Sloan, and Van Riper 2000;
42
Cordeiro et al. 2001; Morgante, Hanafey, and Powell 2002; Falcon and Gentleman 2007).
Chez tous les chromosomes humains, les répétitions de triplets sont approximativement deux
fois plus abondantes dans les exons que dans les autres régions génomiques (Subramanian,
Mishra, and Singh 2003).
Les exons et les transcrits de manière plus générale contiennent une plus grande proportion de
di-nucléotides GA/CT que de d’AT chez Arabidopsis thaliana (Morgante, Hanafey, and
Powell 2002) et dans les génomes des céréales étudiés (Kantety et al. 2002).
Parmi les différentes répétitions de triplets possibles (10 sous-classes ayant des propriétés
physico-chimiques comparables, voir (Jurka and Pethiyagoda 1995), AGC est le motif le plus
fréquent chez les animaux (40.9%-60.9%). Chez les plantes, c’est la sous-classe AAG qui est
dominante (28.3% - 42.1%), sauf chez les céréales où le triplet CCG est le plus abondant
(32%-49%).
Les différences observées selon les régions génomiques peuvent être interprétées comme
résultant soit d’un biais mutationnel (par exemple dans les régions transcrites ou au niveau
des points chauds de recombinaison voir d’une efficacité de réparation différentielle des
régions codantes), soit d’une sélection en faveur - ou à l’encontre – des microsatellites pour
des raisons fonctionnelles au sein d’une région génomique donnée.
Les différences observées entre type de motifs répétés au sein d’une même région génomique
peuvent être interprétés soit en terme mutationnel (capacité à adopter des structures
secondaires plus ou moins stable durant les glissement des brins en cours de réplication), soit
en terme sélectif avec par exemple pour les régions codantes les biais en composition en
acides aminés des protéines influant sur la représentation des différents type de
microsatellites.
43
Une des études comparative entre les différentes taxons les plus complètes est celle menée par
Toth, Gaspari et Jurka en 2000 (Toth, Gaspari, and Jurka 2000). Cette étude est un
recensement de l’ensemble des microsatellites dont la longueur en paires de bases est au
moins égale à 12. Elle à été conduite sur les données présentes sur le site genbank du NCBI à
une époque ou les génomes complets étaient peu nombeux. Les biais dans cette banque ont
été pris en considération et corrigés dans une certaines mesure par l’examen du chromosome
22 humain, entièrement séquencés à l’époque. L’analyse de ce chromosome a mis en évidence
une sous-estimation de la présence des répétitions de A/T, vraisemblablement due à sous
représentation des éléments Alu parmi les séquences étudiées.
Chaque type de motifs répétés est considéré séparément. Les comptages sont effectués dans
différentes régions génomiques : intergénique, intronique, ou exonique. Les différences
d’abondance selon les types de motifs répétés, la région génomique, le taxon (primates,
mammifères, muridés, vertébrés, embryophytes, arthropodes, champignons, annélides) et les
différentes espèces qui les représentent sont présentée sous forme de tables. Il se dégage de
cette analyse les points suivants :
- Dans les exons, les répétitions de tri-nucléotides sont invariablement les plus
abondants dans tous les taxons, suivis par les répétitions d’héxanucléotides. Dans les
introns et les régions intergéniques, les répétitions d’hexanucléotides sont plus
abondantes que dans les exons, sauf chez S. cerevisiae et les embryophytes.
- Chez les primates, les répétitions de mononucléotides sont les plus abondantes. Dans
les introns et les régions intergéniques, elles sont deux fois plus abondantes que les
répétitions de di-, de tri- de tétranucléotides ( qui sont présentes en quantités
similaires).
44
- Chez les muridés, les répétitions de di-nucléotides sont environ trois fois plus
fréquentes que les répétitions de mono-nucléotides. Les répétitions de tri-nucléotides
sont rares en comparaison des répétitions de di et de tetra-nucléotides.
- Les répétitions de dinucléotides sont les plus abondantes dans les régions introniques
et intergéniques de tous les taxons à l’exception des primates, des embryophytes et des
champignons.
- Chez les vertébrés, les répétitions de tétra-nucléotides sont plus abondantes que les
répétitions de triplets dans les introns et les régions intergéniques et dans ces mêmes
régions, chez les mammifères, les répétitions de pentanucléotides sont plus abondantes
que les répétitions de triplets.
- Chez les arthropodes et les champignons, les répétitions de tétra-nucléotides
constituent la classe de microsatellites la moins fréquente dans les régions inter-
géniques et les introns.
- De manière générale, les muridés sont les êtres vivants dont le génome contient le plus
de microsatellites, tandis que C. elegans est celui qui en contient le moins.
Ces quelques différences significatives observées doivent nous convaincre de la grande
hétérogénéité de la représentation des différents type de microsatellites selon l’espèce
considérée. Ces variations peuvent avoir pour origine un certain nombre de biais mutationnels
influant soit la composition de ces génomes, et donc celle des microsatellites qu’ils
contiennent, soit le taux de mutation des microsatellites per se, par exemple si des différences
d’efficacité du système de réparation de mésappariement existent entre ces différentes
45
espèces. La taille effective des populations et le temps de générations sont également
susceptibles de moduler le taux apparent de mutation.
Indubitablement, pour les microsatellites codants, un certain nombre de contraintes
fonctionnelles sont susceptibles d’influencer leur représentation.
Cette sélection ne peut être envisagée que si ces séquences ont un impact fonctionnel et sont
donc susceptibles d’influencer le succès reproductif des individus.
46
2.2. Impact fonctionnel des microsatellites codants
L’idée que les séquences répétées en général et les microsatellites en particulier ne peuvent
être qualifiée de neutres lorsqu’elles évoluent dans l’environnement d’un gène est aujourd’hui
bien documentée (Kashi, King, and Soller 1997 ; Trifonov, 2003 ; Li et al. 2004). L’impact
sur le phénotype des individus peut-être très différent selon la portion du gène considérée.
Dans les régions régulatrices, non traduites ou introniques, l’effet des microsatellites peut-être
relativement complexe. On trouve un certain nombre de fonctions associées à la présence de
microsatellites géniques non-codants et des processus perturbés par leurs variations (voir
figure 2.1).
47
Figure 2.1 : Fonctions régulatrices observées des microsatellites au sein des exons, des introns et des régions non-traduites (UTR) en 5’ et 3’. Adapté de (Li et al. 2004).
2.2.1. Régions 5’ non traduites
Des études ont mis en évidence qu’un microsatellite présent dans les régions 5’ non-traduites
peut influer sur le niveau de transcription ou de traduction du gène.
Une étude du gène humain codant pour la calmoduline-1 a montré qu’une délétion complète
de la séquence répétée (CAG)7 présente dans la région 5’ ce gène entraîne une diminution de
48
50% du taux de transcription (Toutenhoofd et al. 1998). Une modification du nombre de
répétition constituant le microsatellite n’avait par contre pas d’effet notable.
Dans une expérience menée sur un gène rapporteur, il a été montré que l’expansion d’une
répétition (CTG)n situé dans la région 5’ diminuait le niveau de traduction du gène, et ont lié
la formation d’une structure de type épingle à cheveux à une inhibition de la fixation des
complexes d’initiation de la traduction au transcrit (Raca et al. 2000).
L’impact fonctionnel d’une variation de longueur d’un microsatellite au sein de la région 5’
du gène codant pour le récepteur de la vasopressine (AV1) a pu être mis en évidence sur des
populations naturelles de campagnols (Hammock and Young 2004). Dans cette étude, un
polymorphisme de longueur de ce microsatellite génique non-codant a pu être lié à un niveau
d’expression différentiel du récepteur de ce neuropeptide, et même, par extension à un trait
comportemental de ces animaux. Les données recueillies en laboratoire suggéraient en effet
que le caractère monogame ou non-monogame des mâles de cette espèce était lié à la
longueur de ce microsatellite.
Cette preuve d’un lien entre polymorphisme de longueur d’un microsatellite « régulateur » et
différentiation comportementale d’un petit mammifère a toutefois été remise en cause lors
d’investigations de terrains menées par des écologistes, qui ont confirmé le lien entre
longueur du microsatellite et niveau d’expression du récepteur à la vasopressine, mais pas
avec le caractère monogame des mâles campagnols (Ophir et al. 2008).
D’un point de vue strictement mécanistique, ces répétitions en 5’ semblent pouvoir servir de
site de fixation pour des facteurs de transcription et / ou de traduction. Une expérience a été
menée sur le facteur de transcription CCAAT/enhancer binding protein ! (C/EBP! ), qui joue
un rôle dans la régulation de la croissance et la différentiation des hépatocytes. Ce gène peut
49
produite deux isoformes différentes, selon le site d’initiation de la traduction utilisé
(Calkhoven et al. 1994). Le choix du site d’initiation est dépendant de la fixation de la
protéine de liaison aux répétition de CUG (CUGBP1). Cette protéine a la capacité de se lier
aux répétitions CUG présentes en 5’ et dans le début de la séquence codante de la C/EBP! .
Cette liaison entraîne la production de l’isoforme de la C/EBP! présentant le plus petit poids
moléculaire. Il a été suggéré cette fixation de la CUGBP1 sur les répétitions de CUG permet
de stabiliser la structure qui favorise le démarrage de la traduction à partir du site d’initiation
situé le plus en amont.
Une autre étude (Lawson and Zhang 2008) a mis en évidence que le distribution des
microsatellites dans les régions 5’ des gènes était significativement biaisée lorsque l’on
distingue les gènes dit de ménage, exprimés de façon ubiquitaire, et les gènes dit « tissus-
spécifiques » qui présentent des patrons d’expression différents selon les types cellulaires. Les
gènes tissus-spécifiques présentent plus de microsatellites en 5’, ces derniers sont plus longs
et enrichis en GC. Ces différences observées entre ces deux groupes de gènes ne sont
marqués que si l’on considère les régions 5’ (non significatif dans les exons, les introns et les
régions 3’ non traduites). Cette étude suggère fortement que le rôle des microsatellites en 5’
dans la régulation de l’expression des gènes n’est pas anecdotique, et que leur présence dans
ces régions est le reflet de l’implication de ces répétitions dans la chorégraphie subtile de
l’expression spatiotemporelle des gènes.
50
2.2.2. Introns
Plusieurs mécanismes sont susceptibles d’être influencé par la présence de microsatellites au
sein de introns.
La transcription du gène codant pour la tyrosine hydroxylase chez l’homme est influencé par
une répétition du tetra-nucléotide TCAT présente dans le premier intron. Le caractère
interrompu/pur de ce microsatellite, conservé dans le phylum des primates (Meyer et al.
1995), gouverne le niveau d’expression de ce gène (Meloni et al. 1998).
L’expansion d’une répétition de GAA intronique dans le gène FRDA – impliqué dans l’ataxie
de Friedreich - inhibe son expression de façon pathologique (Sakamoto et al. 2001).
Un phénomène de co-régulation d’une répétition de GT dans le premier intron et d’une
répétition de CA dans la région 5’ UTR a été mise en évidence pour le gène COL1A2 qui
code pour la sous-unité alpha2 du collagène de type 1 chez l’homme (Akai, Kimura, and Hata
1999). L’activité transcriptionnelle de ce gène est accrue par la présence de ces deux
microsatellites, mais pas par l’un des deux.
La répétition de CA présente dans le premier intron du gène codant pour le récepteur au
facteur de croissance de l’épiderme (EGRF) présente un polymorphisme de longueur dans les
populations humaines qui module le niveau d’expression du gène (Gebhardt, Burger, and
Brandt 2000b). Plus le microsatellite est court, plus le niveau de transcription du gène
augmente, favorisant l’apparition de certain type de cancer (Brandt et al. 2006). La courbure
de l’ADN entraînée par la présence de cette répétition permettrait la liaison d’un répresseur au
complexe de transcription (Gebhardt, Burger, and Brandt 2000a).
51
L’épissage, qui permet d’exciser spécifiquement certaines parties du transcrit avant la
production de la protéine, est également susceptible d’être influencé par la présence de
microsatellite intronique. Des signaux activateurs de ce mécanisme (enhancers) sont
généralement assez complexe (Gabellini 2001), mais dans plusieurs cas un microsatellites
peut être reconnu par le machinerie du splicosome (complexe de protéine assurant le
déroulement correct et spécifique de l’épissage), notamment des répétitions du motif GGG
(Sirand-Pugnet et al. 1995). Des inclusions d’exons tissus-spécifiques sont modulée par la
nombre de répétition de microsatellites introniques. Dans le gène CFTR, qui code pour le
régulateur de la conductance transmembranaire du flux d’ions chlorure (dont les mutations
sont responsables de fibrose kystique aussi appelée mucoviscidose), contient deux
microsatellites introniques (TG)n et (T)n localisé au site accepteur d’épissage (jonction intron
8/ exon9). Des variations du nombre de répétitions sont impliqué dans l’inclusion
conditionnelle de l’exon 9 dans le transcrit épissé (Pagani et al. 2000).
La localisation sub-cellulaire des transcrits est également susceptible d’être influencée par la
présence d’un microsatellite intronique. Dans le cas du gène ZNF9, qui code pour une
protéine présentant des motifs en doigts de zinc (permettant la liaison à l’ADN), une
expansion du motif CCTG répété de l’intron 1 entraîne la séquestration nucléaire des
transcrits, malgré une maturation – épissage et poly-adenylation - apparemment correcte de
ces derniers (Liquori et al. 2001). Ce phénomène est à l’origine de la dystrophie myotonique
de type 2.
52
2.2.3. Régions 3’ non traduites
La présence de microsatellites dans les régions 3’ non-traduites a été liée au mécanisme de
glissement lors de la transcription. Dans une expérience menée sur le gène rapporteur URA3
chez S. cerevisiae, un phénomène d’élongation du transcrit à pu être mis en évidence, et un
mécanisme à été proposé pour rendre compte de ce phénomène (Fabre, Dujon, and Richard
2002). Les conséquences de ce glissement ont été mises en évidence par l’étude de certaines
pathologies humaines. L’expansion de la répétition de CTG situé dans la région 3’ du gène
DMPK entraîne une dystrophie myotonique de type 1 (Ranum and Day 2002). Les transcrits
s’accumulent alors dans noyau de la cellule et présentent des aberrations dans leur processus
maturation.
La toxicité pour les cellules semble provenir de l’accumulation de ces transcrits aberrants au
sein du noyau, et de leur interaction avec les protéines de liaisons aux répétitions de CUG
(Roberts et al. 1997).
Enfin, un autre mécanisme susceptible d’être affecté par la présence de microsatellites dans
les régions géniques est l’atténuation transcriptionnelle ou « silencing ». Ce mécanisme est dit
épigénétique car il ne met pas en jeu un changement quelconque de la séquence nucléotidique,
mais diverses modifications chimiques de la molécule d’ADN ou des protéines capables de la
lier. Ces modifications (par exemple des methylations de nucléotides ou des ajouts de divers
groupements chimiques sur les protéines histones) sont susceptibles de modifier l’accessibilité
de l’ADN aux complexes d’initiation de la transcription. Lorsque cette accessibilité est quasi-
nulle, on peut parler de « silencing ». La description de ce mécanisme dépasse largement le
53
cadre de l’introduction à notre étude, mais le lien avec la présence de répétitions est à
signaler.
En effet les modifications épigénétique sont capables d’entraîner une condensation régionale
de l’ADN. La région en question est alors qualifiée d’hétérochromatine (à opposer à
l’euchromatine, forme moins condensée de l’ADN et donc accessible). Des expérience menée
en 2003 ont démontré (Saveliev et al. 2003) que les variants de la répétition de CUG situé en
3’ de la séquence codante du gène FRDA qui présentent un grand nombre de motif répétés
sont susceptibles d’induire la transition d’un état euchromatinien vers un état
hétérochromatinien dans la région génomique dans lequel est inséré ce gène. Cette induction
semble être permise par le biais d’interaction avec la protéine HP1, acteur reconnu des
modifications épigénétiques entraînants la formation d’hétérochromatine (Kellum 2003).
2.2.4. régions codantes
En sus des régions non-codantes énumérées ci-dessus, un gène codant pour une protéine
contient également une phase ouverte de lecture, ou séquence codante. Cette séquence
codante est formée d’une succession de codons. Les codons sont des groupes de trois
nucléotides qui sont associés spécifiquement et séquentiellement à un acide aminé lors du
processus de traduction afin de former une protéine. Chaque modification d’un nucléotide de
la séquence codantes peut entraîner une modification de cette protéine. L’insertion (ou la
délétion) d’un nombre de nucléotide non multiple de trois va entraîner un déphasage dans la
séquence codante (voir figure 2.2). Dans le cas des répétitions de triplets (ou d’hexa-
nucléotides), des acides aminés identiques sont insérés ou supprimés dans la séquence
codante.
54
Les mutations de microsatellites codants ont donc potentiellement un impact très important
sur la structure de la protéine codée par le gène dans lequel ils sont enchâssés. Les
expansions/contraction de triplets créent des succession d’acide aminés qui sont à l’origine
chez l’homme de nombreuses maladies neuro-dégénératives. Les mutations de microsatellites
non-multiples de trois aboutissent à la production d’une protéine tronquée, un phénomène
observé dans certain type de cancer.
Figure 2.2 : Conséquence d’une substitution non silencieuse et de l’insertion d’une adenine au sein d’une séquence codante sur la protéine correspondante.
La substitution - en vert - d’un G (guanine) par un C (cytosine) transforme le codon GCA (acide aminé correspondant : Alanine ) en un codon CCA (acide aminé correspondant : Proline). L’insertion d’un A au niveau de la répétition – en rouge - décale d’un nucléotide la phase de tous les codons en aval, et donc les acides aminés incorporés. Rapidement apparaît un codon TGA, signal d’arrêt de la traduction de la protéine.
55
2.2.4.1 Maladies neurodégénératives
L’impact fonctionnel des microsatellites codants probablement le mieux connu est le rôle que
joue les répétitions de triplet dans un certain nombre de maladies neuro-dégénératives
susceptibles d’affecter les humains (Cummings and Zoghbi 2000; Masino and Pastore 2002).
La majorité de ces maladies sont causées par l’expansion de répétition codantes du
trinucléotide CAG, qui se traduit par une répétition de Glutamine au sein de la proteine
correspondante. Les exemples les mieux connus sont la maladie de Huntington (HD),
l’atrophie dentato-rubro-pallido-luysienne (DRPLA), l’atrophie spino-bulbaire musculaire
(SBMA), et différentes ataxies spinocerebelleuses (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7). Ces
maladies partagent un certain nombre de caractéristiques cliniques : Elles sont héréditaires,
progressives, touchant généralement des adultes d’une quarantaine d’années, causent une
perte de fonction neuronale et finalement un décès suite à la destruction de ces cellules 10 à
20 ans après le début des symptômes. Plus le nombre de répétitions de CAG héritées est
grand, plus l’apparition des symptômes est précoce. Les répétitions présentent une instabilité
somatique et germinale. Chez les familles atteintes, la transmission entre générations
s’accompagne d’une diminution du temps de latence avant l’apparition des symptômes.
On considère que l’expansion des poly-glutamines subséquentes à celle des répétitions de
CAG confère aux protéines un gain de fonction (Galvao et al. 2001; Ranum and Day 2002).
Dans la plupart des cas, la toxicité de ce gain de fonction a été démontrée. Dans des cellules
en culture et sur des modèles animaux, il a été montré que les poly-Glutamine sont
susceptibles de former des aggrégats toxiques pour les neurones et les cellules périphériques.
Il est également possible que les ARN messagers contenant la répétition de CAG interfère
avec les processus d’epissage et de traduction, aboutissant à une perte de la proteine, ou à son
interaction anormale avec des protéines liant l’ARN (Galvao et al. 2001). D’autres
56
expériences suggèrent que les protéines mutantes (contenant une expansion de poly-
Glutamine) interagissent de façon anormale avec la voie ubiquitine/proteasome et lysosomal
(Yamada, Tsuji, and Takahashi 2002).
Une autre classe de triplet est responsable de pathologies humaine, créant des poly-alanines
au sein des gènes concernés. Au niveau génomique, ce sont des répétitions de codons CGN
(le N désignant n’importe lequel des quatre nucléotides), qui peuvent être dégénérées et donc
potentiellement moins instables. Pourtant, neuf pathologies sont associées à des expansions de
ces répétitions (pour une revue, voir Albrecht and Mundlos 2005), affectant le développement
et entraînant par exemple des retards mentaux sévères sont documentées.
2.2.4.2 Instabilité des microsatellites et cancer
L’instabilité des microsatellites est le nom d’un phénotype associé a environ 90% des cancers
colorectaux sans polypes héréditaires (HNPPC – hereditary non polyposis colorectal cancer)
et d’environ 15% des formes sporadiques de cancers du côlon (Redston 2001), de tumeurs
gastriques (Yamada et al. 2002b), du poumon (Zienolddiny et al. 1999) ou encore de cancer
endometriaux (Vassileva et al. 2002). Ce phénotype ne décrit pas l’instabilité intrinsèque des
microsatellites telle que nous l’avons décrite jusqu’ici, mais le fait que dans ces cellules
tumorales, l’inactivation d’un corpus de gènes du MMR entraîne une augmentation drastique
du taux de mutation apparent des microsatellites (voir 1.6). Cette inactivation est
généralement causée par la mutation d’une répétition de mononucléotide An exonique au sein
de ces gènes (Duval and Hamelin 2002). Les répétition de mononucléotides codants sont en
effet des séquences beaucoup plus délétères pour les gènes qui les contiennent que les
répétitions de triplets, car les mutations qui les affectent entraîne systématiquement (sauf
57
insertion multiple de 3) un décalage de phase de lecture et donc la production d’une protéine
tronquée.
Dans les cancers présentant un phénotype MSI, l’ensemble des gènes contenant un
microsatellite codant se trouve alors susceptible d’être inactivés. Tout comme les gènes du
MMR, un grand nombre de gènes impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire
contiennent une répétition de mononucléotides (Duval and Hamelin 2002)). Dans les cas de
cancer à MSI, on retrouve généralement une mutation non-sens générée par la mutation d’une
de ses répétitions dans les gènes BAX, IGFIIR, TGFbetaR2, E2F4 et BRCA2 (Johannsdottir
et al. 2000).
2.2.4.3 Loci de contingences chez les bactéries
Chez les bactéries, le nombre de microsatellites est généralement assez réduit comparé aux
autres organismes (van belkum et al, 1998). Les bactéries qui en contiennent sont
généralement pathogènes. Ce biais à été étudié chez Haemophilus influenza, bactérie qui
colonise les voies respiratoires supérieures de l’homme. Cet organisme est capable d’échapper
à la surveillance du système immunitaire de son hôte grâce en faisant varier la phase de
lecture des lipopolysacharraide (LPS) (Weiser, Love, and Moxon 1989; Roche and Moxon
1995), constituants de sa paroi susceptibles de déclencher une réponse immunitaire. Cette
variation de phase de lecture est permise par l’expansion ou la contraction de répétition du
tetra-nucléotide CCAT, ce qui aboutit à la production de différentes forme de LPS (voir figure
2.2). L’idée qu’un certain nombre de gènes, non-essentiels, peuvent contenir des séquences
répétées instables et ainsi être capable de s’adapter plus facilement aux contingences d’un
environnement fluctuant a été notamment popularisée par Moxon, en 1994 (Moxon et al.
58
1994). Ces loci de contingences semblent être distribué parmi les gènes codant pour des
protéines susceptibles d’être reconnues par le système immunitaire de l’hôte .
La réponse à des stress environnementaux, par essence imprévisibles, est également une des
raisons de promouvoir une certaine forme de variabilité. Chez E. coli, il a pu être démontré
que les gènes impliqués dans la réponse aux stress environnementaux sont enrichis en
microsatellites (Rocha, Matic, and Taddei 2002). Ces gènes (e.g. mutT, dam, mutY, vsr, dinJ,
ruvC …) sont dévolus de différentes manière à la maintenance de l’intégrité du génome. La
perte de leur fonction aboutit chez l’organisme à l’émergence d’un phénotype dit
« mutateur », c’est-à-dire présentant un taux de mutation plus élevé que la moyenne. La
fonction des microsatellites dans ces gènes serait donc de produire régulièrement au sein des
colonies bactériennes des individus présentant un taux de mutation plus élevés. Ces individus
sont défavorisés dans des conditions optimales de croissance, mais seraient capables, lors de
changements environnementaux, d’explorer plus rapidement l’espace des phénotypes
possibles (Taddei et al. 1997).
59
2.3. Sélection
Les différents rôles fonctionnels assurés par les microsatellites géniques sont susceptibles de
modifier ce qu’on appelle la valeur adaptative des organismes (ou fitness). En effet, chaque
microsatellite génique peut se voir sélectionné si sa présence au sein du gène modifie les
chances de succès reproductif de l’individu qui le porte par rapport a celui qui en est dépourvu
(ou si la longueur, et donc l’instabilité du microsatellite, est différente entre ces deux
individus). Les différents rôles fonctionnels mis en exergue précédemment suggèrent que les
microsatellites n’évoluent effectivement pas de façon neutre, mais sont soumis à une forme de
sélection.
L’implication de ces répétitions dans des processus comme la régulation de l’expression des
gènes ou la création de variabilité dans les phénotypes au sein des colonies de micro-
organisme est susceptible d’engendrer une sélection positive des microsatellites géniques ou
de l’instabilité qu’ils confèrent.
Chez l’homme, les observations qui ont été faites sont généralement liées à l’étude de
pathologies. On considère donc que les microsatellites enchâssés dans les régions codantes
sont délétères et que la sélection qui s’exerce sur eux est négative. On s’attend donc à ce que
les microsatellites codants soient purgés par la sélection car les individus qui contiennent ces
répétitions se reproduisent moins souvent que les autres.
L’examen des données d’abondances des microsatellites géniques, chez toutes les espèces
eucaryotes étudiées, semblent corroborer cette hypothèse. En effet, les microsatellites sont
bien moins nombreux au sein des régions codantes que des régions non-codantes (voir 2.1).
De plus, parmi ces microsatellites codants, ceux qu’on observe en majorité sont ceux dont la
60
mutation par insertion/délétion n’entraîne pas de déphasage du cadre de lecture, mais
seulement des ajouts d’acides aminés au sein de la protéine (répétition de triplet et d’hexa-
nucléotides). Enfin, la distribution des microsatellites capables de perturber la phase codante
des gènes n’est pas non plus aléatoire. Les versions les plus longues, et donc les plus instables
(voir 1.8) sont moins bien représentées que les autres au sein des séquences codantes. Nous
présenterons successivement des études dont les résultats sont en accord avec cette intuition,
puis celles qui proposent des arguments en faveur d’une vision plus nuancée de cette
problématique.
2.3.4. Sélection négative des microsatellites codants
Faire la preuve qu’une forme de sélection s’exerce réellement sur un locus donné n’est pas
une routine triviale (Sharp et al. 1995; Otto 2000). Quantifier la valeur sélective d’un allèle,
c’est-à-dire estimer le rapport entre le nombre moyen de descendants produit par la fraction
de la population qui possède cet allèle et celui produit par ceux qui possèdent un allèle
différentes peut même se relever impossible pour ceux qui s’intéressent a un organisme
comme celui de l’humain pour lequel des expériences classiques de génétiques sont
impossibles.
Toutefois, certaines approximations peuvent être faites comme par exemple mesurer
l’exceptionnalité statistique d’un motif au sein d’un génome. Le nombre attendu de répétition
d’un motifs au sein d’une séquence d’ADN a été dérivé par De Wachter en 1981 (de Wachter
1981). Sachant la fréquence d’un motif M égale à f(M) dans une séquence de longueur N, le
nombre attendu de répétition en tandem de t fois le motif M dans cette séquence vaut :
!
E(Mt ) = f (M)t[1" f (M)]
2[N
|(1" f (M)) + 2r]
61
avec
!
N|= N t # r 2# r +1
Cette approximation fait l’hypothèse que la séquence est à l’équilibre mutationnel, que les
seules mutations possibles sont des substitutions et qu’elles sont indépendantes.
La comparaison des effectifs observés avec ceux attendus selon ce modèle sur un panel de
séquence eucaryotes (Cox and Mirkin 1997; Metzgar, Bytof, and Wills 2000) a permis de
mettre en évidence le fait que :
1) On observe significativement plus de microsatellites dans les régions non-codantes
que dans les régions codantes et ce quel que soit le type de microsatellites considérés.
Cette tendance est d’autant plus marquée que les microsatellites sont long. Cette
observation est interprétée comme résultant d’une neutralité des microsatellites non-
codants tandis que les microsatellites codants sont soumis à une force de sélection
négative.
2) La densité de microsatellites non-codants est significative plus importante que celle
attendue par ce modèle. Un biais mutationnel en faveur de l’expansion de
microsatellites expliquerait cette observation
3) La densité de microsatellites codants dont le motif a une longueur multiple de trois est
également plus importante qu’attendue, car la sélection à l’encontre de ce type de
microsatellites qui ne produisent pas de déphasage du cadre de lecture est moins forte
62
4) La densité en microsatellites codants susceptible de créer un décalage de phase de
lecture est inférieure à celle attendue. Cette observation est un argument en faveur
d’une sélection négative de ces microsatellites.
D’autres type d’approche se base sur les marches aléatoires, des modèles dit de
naissance/disparition ou des chaînes de Markov (Kruglyak et al. 1998; Bell 1996). Ces
approches sont séduisantes car elles se basent, pour quantifier la probabilité d’observer un
microsatellite donné, sur un scénario évolutif. Les microsatellites sont créés à partir d’une
graine (en général deux répétitions) qui a une probabilité de subir des expansions, des
contractions ou des mutations ponctuelles qui viennent l’interrompre (Buschiazzo and
Gemmell 2006). La principale limitation de ces modèles est l’estimation de ses paramètres à
partir des données. En utilisant des simulations – ces modèles ne se prêtant pas à des
approches analytiques – Borstnick et Pumpernik (Borstnik and Pumpernik 2002) ont montré
qu’au sein des régions codantes de primates, les répétitions de mononucléotides et de
dinucléotides sont sous-représentés. D’autres résultats intéressants ont été produits lors de
cette étude, avec notamment des estimations du rapport entre taux de mutations par
expansion/contraction et taux d’interruption par substitutions au sein des répétitions de
triplets.
Dans une étude plus récente, Ackermann et Chao (Ackermann and Chao 2006) se sont
spécifiquement penché sur la sélection des répétitions de mononucléotide codants (qui sont
chez l’homme les microsatellites codants les plus abondants parmi ceux capable d’induire des
déphasage du cadre de lecture). La principale vertu de leur approche est de respecter la
composition en acide aminé des protéines étudiées. En effet, les répétitions de mono-
nucléotides codent pour des répétitions d’acides aminés (Lysine, Glycine, Phénylalanine et
63
Proline) . Ces répétitions d’acides aminés sont susceptibles de jouer un rôle dans la fonction
de la protéine (Alba and Guigo 2004). La présence de répétitions au niveau des séquences
codantes peut donc être le reflet de la nécessité de coder des répétitions d’acides aminés.
Toutefois, la redondance du code génétique permet d’utiliser différents codons pour un même
acide aminé. Par exemple, deux lysine consécutives sur une protéine peuvent êtres codés par
les codons AAA-AAA ou par les codons AAG-AAA. Dans le premier cas, une répétition est
codée au niveau génomique, dans l’autre, non. D’autres part, il est connu que les organismes
et les régions génomique sont soumis à un usage des code, c’est au choix préférentiel de
certains codons parmi tous ceux codants pour le même acide aminé (Sharp and Li 1987).
À partir de la séquence d’acides aminés, les auteurs ont généré un millier de séquences
aléatoires. Pour chaque acide aminé, un des codon possible était choisi aléatoirement mais en
respectant l’usage du code spécifique à la protéine.
Les comptages des répétitions de mono-nucléotides observés au sein du groupe de séquences
aléatoires permettent d’obtenir une distribution théorique de leur nombre attendus, dans le
cadre d’un modèle qui respecte l’enchaînement des acides aminés sur les protéines et l’usage
préférentiel du code au sein du gène.
Leurs résultats confirment la sous-représentation des répétitions de mononucléotide au sein
des gènes et présentent un argument fort en faveur d’une sélection négative de ces séquences
hypermutables au sein des gènes. Cette conclusion est par ailleurs renforcée par le fait que la
sous-représentation est encore plus marquée dans le groupe des gènes dit essentiels (c’est-à-
dire dont les pertes de fonctions entraînent une létalité des individus) et dans le groupe –
recouvrant du premier - de ceux qui sont fortement exprimés et sont donc susceptibles de
subir des erreurs de transcriptions.
64
2.3.5. L’hypothèse d’une sélection positive des microsatellites codants
En dépit des études précédemment cités, certains auteurs ont postulés que des gènes peuvent
conserver des microsatellites au sein de leur séquence codantes en raison de la mutabilité que
leur confèrent ces répétitions (Kashi, King, and Soller 1997; Moxon and Wills 1999; Metzgar
and Wills 2000; Verstrepen, Reynolds, and Fink 2004; Kashi and King 2006). Toutes se
basent sur le raisonnement suivant : Une variabilité des gènes est utile car elle permet
l’émergence d’individus capable de s’adapter à un nouvel environnement. Évidemment, la
sélection ne peut agir en prévision d’un changement futur de l’environnement. Par ailleurs,
augmenter le taux de mutation global des individus est contre-productif pour l’organisme car
les mutations sont plus susceptibles d’être délétères que bénéfiques. La sélection doit donc a
priori tendrent à réduire le taux de mutation global des organismes dans un environnement
stable.
Des mutations affectant le taux de mutation global (généralement affectant des gènes
impliqués dans la réparation de l’ADN) peuvent toutefois persister dans une population par
auto-stop avec les mutations bénéfiques qu’elles ont pu contribuer à faire émerger chez les
individus mutateurs. Ce phénomène s’observe au sein de colonies de bactéries (Taddei et al.
1997).
D’autres type de mutateurs peuvent exister au sein des populations naturelles : ce sont des
mutateurs locaux, qui augmentent le taux de mutation à un locus particulier grâce à une
mutabilité intrinsèque accrue. Les microsatellites entrent parfaitement dans le cadre de cette
définition. Ils sont susceptibles d’augmenter très localement le taux de mutation, et de ce fait
65
ont été sélectionnées au sein de gènes de contingence bactériens pour leurs capacités à
allumer et éteindre la fonction de ces gènes ou à modifier leur forme (voir 2.2.4.3).
Les mutateurs globaux sont peu susceptibles d’êtres conservés au sein d’espèces sexuées. En
effet, la recombinaison va rapidement briser la liaison génétique existant entre le mutateur et
la mutation bénéfique.
En revanche, rien n’exclut l’existence de mutateur locaux. Evoquer les mécanismes
permettant de générer, à partir de quelque loci, l’immense répertoire de récepteurs des cellules
somatiques du système immunitaire permet de se convaincre que la sélection est capable de
retenir des mécanismes générant de la variabilité locale chez l’homme.
Il est intéressant d’évoquer l’étude menée par Chang et col. (Chang et al. 2001). L’examen
des gènes du système de réparation des mésappariements révèle au sein de leur séquence
codantes la présence de nombreuse répétitions de mononucléotide suffisamment longue pour
être qualifiée d’instables. L’examen des mêmes gènes chez d’autres espèces modèles (A.
thaliana, M. musculus, S. cerevisiae, C. elegans et E. coli) révèlent que ces microsatellites ne
sont pas conservés, mais que la majorité des gènes du système de réparation des
mésappariements de ces espèces en contiennent également, à différentes positions.
Cette observation (qui est toutefois peu soutenue par des arguments statistiques) a conduit les
auteurs à postuler que ces séquences mutatrices locales ont pu être sélectionnée positivement,
de façon récurrente au sein des clades étudiés, pour leur capacité à créer, potentiellement de
façon transitoire, des mutateurs globaux.
Cette hypothèse est à mettre en rapport avec l’observation qui a été faite lors d’étude des
cancers à MSI (instabilité des microsatellites) que de nombreux gènes impliqués dans le
66
maintien de la stabilité du génome contiennent ce type de répétitions de mono-nucléotides
codants (voir 2.2.4.2).
Cette hypothèse a été un des points de départ de nos investigations, dont nous pouvons à
présent introduire les objectifs, évidemment définis a postériori.
67
3. Questions adressées au cours de la
thèse
Les microsatellites sont des séquences présentant des processus de mutations particuliers.
Comme nous l’avons vue, la présence de ces répétitions au sein des gènes représente pour ces
derniers un fardeau, en altérant notamment leurs robustesses aux mutations non-sens. De
nombreuses études se sont intéressées à la présence de ces microsatellites au sein de gènes
connus pour leur implication dans des processus particuliers ou responsables de certaines
pathologies, et le rôle tenu par les microsatellites au sein de ces gènes dans ces phénomènes
est maintenant clairement établi. D’autres part, la modélisation de l’évolution des séquences
répétées à permis de rendre compte de la sélection négative à laquelle sont soumises ces
dernières dans les séquences codantes. Toutefois, l’examen à l’échelle fonctionnelle de ces
répétitions au sein des gènes qui les portent n’a pas été réalisé de manière exhaustive chez
l’homme. La question de l’existence d’une forme de sélection positive des microsatellites
pour la mutabilité accrue qu’ils confèrent aux gènes qui les portent mérite d’être examinée
avec plus de détail, avec notamment la prise en compte de certains biais mutationnels.
D’autres part, il nous semble intéressant de pouvoir quantifier la force de la sélection qui
s’exerce sur les microsatellites codants, que celle-ci soit négative ou positive, car chaque gène
scruté au niveau génomique pour tenter de déterminer les forces évolutives qui l’ont façonné
(ou le façonne encore) est susceptible de présenter des traces de sélection ayant pour origine
la présence de ces microsatellites codants.
68
D’une manière plus généraux, ces travaux s’inscrivent dans une problématique liée à la
robustesse et à la mutabilité relative des gènes. En effet, nous nous intéressons à caractériser
ces qualités par le biais de l’étude attentive de leur contenu en séquence répétés, en
recherchant des indices permettant de tester l’hypothèse d’une sélection pour la stabilité des
gènes qui serait modulée selon les fonctions auxquelles elles participent.
69
Résultats
70
Les résultats sont présentés ici en trois parties, correspondant aux deux articles que nous
avons rédigés au cours de ma thèse, et à un troisième auquel j’ai contribué. La première partie
correspond à un article publié en 2008 dont le sujet est la recherche et l’analyse fonctionnelle
de l’ensemble des gènes qui, chez l’homme, présentent un microsatellite codant. La deuxième
partie s’intéresse aux mêmes microsatellites codants, mais dans la perspective de leur
évolution au sein des séquences codantes de quatre espèces de primates pour lesquels les
génomes complets étaient disponibles en 2008. Il est axé autour d’un article actuellement en
préparation. Enfin, l’article supplémentaire auquel j’ai participé est décrit afin de détailler ma
contribution.
71
1. Hypermutabilité des gènes chez H.
sapiens
Ainsi qu’il a été présenté en introduction, les gènes impliqués dans le système de réparation
des mésappariements présentent de nombreuses répétitions de mononucléotides codants
(Chang et al. 2001). Ces répétitions étant instables au cours de la réplication, il a été suspecté
que ces séquences avaient été sélectionnées pour la mutabilité qu’elles confèrent à ces gènes,
augmentant ainsi ponctuellement le taux de mutation global du génome. Comme il avait été
démontré par ailleurs que ces répétitions sont généralement sous l’influence d’une sélection
négative (Metzgar, Bytof, and Wills 2000; Borstnik and Pumpernik 2002, Ackermann et Chao
2006), nous avons voulu tester plus en avant cette hypothèse.
A cette fin, nous avons tout d’abord produit un catalogue exhaustif des séquences codantes
présentant un microsatellites codants suffisamment long pour que le gène correspondant
puisse être à cet égard qualifié d’hypermutable. L’ensemble des séquences codantes annotées
chez l’homme ont été récupérés sur la base de donnés Ensembl, dans sa version 37 (Birney et
al. 2006). Chaque exon à été considéré indépendamment, et l’union des coordonnées des
exons recouvrants dans les différents transcrits à été utilisée pour définir une seule séquence
codantes par gène. Les jonctions exons/exons ont été signalées dans la séquence afin d’éviter
la détection de répétitions artificiellement créés lors de la concaténation des exons. La même
méthode à été appliquée aux séquences introniques, cette fois en concaténant les régions non-
exoniques, afin de disposer d’un témoin.
72
Les microsatellites codants recherchés sont formés de la répétition d’un motif dont la
longueur n’est pas un multiple de trois, de façon à s’assurer que les événements
d’insertion/délétion au sein des ces microsatellites aboutissent à la production d’une protéine
tronquée, et donc à la perte de la fonction du gène. Le nombre minimal de répétition du motif
à partir duquel ces événements d’insertion/déletion peuvent se produire fait encore débat.
Nous nous sommes appuyés sur des données présentes dans la littérature pour définir ces
seuils respectivement à 8, 5,4 et 4 unités pour les répétitions de mono-, di-, tetra- et penta-
nucléotides. Notons ici que des seuils de longueurs plus élevés (9,6,4 et 4) ont également été
utilisés de façon à tester la robustesse des résultats à la définition de ces seuils. Les résultats
restent qualitativement identiques.
Rechercher des surreprésentations fonctionnelles au sein du groupe de gènes contenant ces
microsatellites dans leurs séquences codantes a requis de traiter les informations disponibles
dans la banque de données Gene Ontology (Ashburner et al. 2000). Cette base de données
propose une ontologie - c’est-à-dire un vocabulaire hiérarchique dédié à la description d’un
phénomène - constituée de GO-terms, des unités de vocabulaire décrivant les processus
biologiques, les fonctions moléculaires ou la localisation cellulaires des gènes. Ces GO-terms
présentent différents niveaux de description et sont recouvrants. En effet, les GO-terms les
plus précis sont englobés par d’autres, plus généraux. Chaque gène annoté par un GO-term
précis et donc également annotés par tous les GO-terms englobants. D’autres part, les gènes
sont annotés par plusieurs GO-terms, reflétant leurs éventuelles polyvalences moléculaires ou
localisations plurielles. L’architecture particulière de cette ontologie nous a mené à porter une
attention toute particulière au problème des tests multiples. En effet, le grand nombre de tests
effectués (autant que de GO-terms qu’annotés sur les gènes humains) augmente
statistiquement la proportion de résultats positifs. Une des procédures classiques permettant
73
de corriger pour les tests multiples – la correction de Bonfferoni – est sensible à
l’indépendance des tests. Or, la structure hiérarchique de l’ontologie entraîne une dépendance
entre chaque test réalisé sur des GO-terms situés à des niveaux différents mais décrivant la
même fonction (e.g. les gènes annotés « Mismatch repair » sont également annoté « DNA
repair »). Nous avons donc segmenté les tests de surreprésentation par niveau de complexité
de description, et présenté les résultats sous cette forme.
Le fait que certaines fonctions présentent un nombre élevé de microsatellites codants n’est pas
indépendant de la structure de ces gènes. Suivant le modèle proposé originalement par de
Wachter en 1981, nous avons ensuite calculé, pour chaque gène, une probabilité de contenir
une répétition de mononucléotide codants – ces dernières étant les plus abondantes et les plus
biaisées dans leur distribution au sein des fonctions – qui se base sur la longueur et la
composition en nucléotide de ce gène.
Enfin, nous avons à partir du même modèle calculé une fraction attendue de gènes
hypermutables – c’est-à-dire contenant une répétition de mononucléotide d’une longueur
supérieure à 8 ou 9 nucléotides – pour chaque groupe fonctionnel. Cette fraction « attendue »
de gènes hypermutables à été comparés à la fraction observée, afin de déterminer si les
fonctions présentent plus, moins ou autant de gènes hypermutables que l’on peut le prédire
sur la base de la longueur et de la composition en nucléotide des gènes participant à cette
fonction. Un intervalle de confiance à été estimé par simulation, permettant de séparer les
groupes fonctionnels présentant un nombre de gènes hypermutables significativement plus
grand ou plus petit qu’attendu.
74
75
1.1. Article
H yper mutability of G enes in Homo sapiens Due to the H osting of LongM ono-SSR
Etienne Loire,*!"§k { #** Francxoise Praz,!!"" Dominique Higuet,§k { # Pierre Netter,*!" andGuillaume Achaz§k { #***Universite Pierre et Marie Curie-Paris 6, Unite M ixte de recherche (U MR) 7592, Institut Jacques Monod, Paris, France; !CentreNational de la Recherche Scientifique (C NRS), U MR 7592, Institut Jacques Monod, Paris, France; "Universite Denis D iderot-Paris7,U MR 7592, Institut Jacques Monod, Paris, France; §Universite Pierre et Marie Curie Paris 6, U MR 7138, Systematique, Adaptation,Evolution, Paris, France; kC NRS, U MR 7138, Systematique, Adaptation Evolution, Paris, France; { Museum National d’ H istoireNaturelle, U MR 7138, Systematique Adaptation Evolution, Paris, France; #Institut National de al Saute et de la Recherche M edicale,U MR 7138, Systematique, Adaptation Evolution, Paris, France; **Universite Pierre et Marie Curie-Paris 6, A telier deB ioinformatique, Paris, France; !!Universite Pierre et Marie Curie-Paris 6, U MR_S 893, CdR Saint-Antoine, Paris, France; and""INSERM , U MR_S 893, CdR Saint-Antoine, Paris, France
Simple sequence repeats (SSRs) are very common short repeats in eukaryotic genomes. ‘‘ Long’’ SSRs are considered‘‘hypermutable ’’ sequences because they exhibit a high rate of expansion and contraction. Because they are potentiallydeleterious, long SSRs tend to be uncommon in coding sequences. However, several genes contain long SSRs in theirexonic sequences. Here, we identify 1,291 human genes that host a mononucleotide SSR long enough to be prone toexpansion or contraction, being called hypermutable hereafter. On the basis of Gene Ontology annotations, we show thatonly a restricted number of functions are overrepresented among those hypermutable genes including cell cycle andmaintenance of D N A integrity. Using a probabilistic model, we show that genes involved in these functions are expectedto host long SSRs because they tend to be long and/or are biased in nucleotide composition. F inally, we show that foralmost all functions we observe fewer hypermutable sequences than expected under a neutral model. There are howeverinteresting exceptions, for example, genes involved in protein and RN A transport, as well as meiosis and mismatch repairfunctions that have as many hypermutable genes as expected under neutrality. Conversely, there are functions (e.g.,collagen-related genes) where hypermutable genes are more often avoided than in other functions. Our results show that,even though several functions harbor unusually long SSR in their exons, long SSRs are deleterious sequences in almostall functions and are removed by purifying selection. The strength of this purifying selection however greatly varies fromfunction to function. We discuss possible explanations for this intriguing result.
Int roduction
M icrosatellites or simple sequence repeats (SSRs) arearrays of D N A with short motifs—1–6 nt—repeated in tan-dem (Tautz 1994). SSRs are ubiquitous in all genomes ex-plored so far and are especially abundant in eukaryotegenomes (Toth et al. 2000). Strikingly, the number andthe sizes of SSRs in genomes are typically much larger thanexpected from simple substitution models (Pupko andGraur 1999). This overabundance of SSRs is, most likely,a consequence of their specific mutational properties; theserepeats are prone to expansion and contraction throughpolymerase strand slippage (Levinson and Gutman 1987)and, to a lesser extent, to recombination (L i et al. 2002).For strand slippage, after the replication fork has run, tem-plate and neosynthesized strands can be reannealed with theslippage of one (or more) motifs. If the ‘‘mismatch repair’’(M M R) complex does not correct the resulting loop, a sub-sequent round of replication changes the number of re-peated units by a specific amount. This translates into aninsertion or a deletion of one (or more) motifs in the SSR.
V arious factors have been shown to modulate the rate ofSSR expansion/contraction, although their relative strengthvaries from species to species (Toth et al. 2000). It appearsthat, for ‘‘ long’’ SSRs, contraction prevails over expansion(Xu et al. 2000). This bias in favor of contraction, along witha higher chance of being interrupted by a substitution for
even longer SSRs, prevents their infinite growth (Kruglyaket al. 1998; E llegren 2000; D ieringer and Schlotterer 2003).The nature of the motif itself also greatly modulates the mu-tation rate. For example, G C-rich SSRs are more unstablethan others (Sagher et al. 1999; Gragg et al. 2002), and longmotifs are more stable than short ones (Rose and Falush1998; Legendre et al. 2007). Overall, the relative role ofall these factors makes difficult to predict a mutation ratefor a given SSR. However, it remains true that the SSR mu-tation rate is typically several orders of magnitude higherthan the average substitution rate (Drake et al. 1998).
A number of studies in a wide range of organisms haveattempted to delimit characteristics of SSRs that are predictiveof the variability of the repeats. They concluded that the num-ber of repeats was among the strongest predictors of the slip-page probability during replication (Rose and Falush 1998; Laiand Sun 2003b; Legendre et al. 2007; K elkar et al. 2008). Re-peat variability is not an all-or-nothing phenomenon but ratherincreases exponentially with increasing number of repeatunits, as initially established in yeast (Sia et al. 1997).
A t what length should SSRs be deemed ‘‘hypermuta-ble ’’? Using a simple probabilistic model, Rose and Falush(1998) proposed a threshold size for slippage mutationsaround 8 bp for mono-, di-, and tetranucleotide SSRs.Based on a different model, similar thresholds were pro-posed: 9 units for mononucleotide SSRs (mono-SSRs)and 4 units for dinucleotide (8 bp) and tetranucleotide(16 bp) SSRs (Lai and Sun 2003a). Using a human/chim-panzee complete genome comparison, it appears that, in thislineage, a mononucleotide of 9 units exhibit a similar mu-tability than a dinucleotide of 6 units or a tetranucleotideSSR of 5 units (K elkar et al. 2008). A lternatively, wecan also infer that a mononucleotide of 8 units exhibit
K ey words: microsatellites, SSR, evolution, mutability, Homosapiens.
E-mail: [email protected]. Biol. Evol. 26(1):111–121. 2009doi:10.1093/molbev/msn230Advance A ccess publication October 8, 2008
! The Author 2008. Published by Oxford University Press on behalf ofthe Society for Molecular B iology and Evolution. A ll rights reserved.For permissions, please e-mail: [email protected]
a similar mutability than a dinucleotide of 5 units or a tet-ranucleotide SSR of 4 units.
Interestingly, similar threshold sizes for mononucleo-tide and dinucleotide SSRs instability were observed in vi-tro during polymerase chain reaction (Lai and Sun 2003a;Shinde et al. 2003). For mono-SSRs, the observation of hu-man oncogenesis associated with microsatellite instability(MSI) also highlights 8 units as an instability threshold.MSI has been shown to underlie hereditary nonpolyposiscolorectal cancer (H NPC C) (A altonen et al. 1993). H NPC Cpatients carry a germ-line mutation in one of the postrepli-cative M MR genes, mainly M L H1 or MSH2 (Jacob andPraz 2002; Woerner et al. 2006). Once the correspondingnormal allele is lost through somatic inactivation, cells be-come totally devoid of M MR activity and are left with un-repaired polymerase errors that arise during replication.Rates of mutation arising in microsatellite repeats are dras-tically enhanced by mutations affecting postreplicativeD N A M MR (Strand et al. 1993). In this context, only geneswith an SSR of at least 8 nt have been reported to exhibita significant instability (Duval and Hamelin 2003; Woerneret al. 2006; M iquel et al. 2007). A ltogether, these resultssuggest common features of microsatellite mutation mech-anisms both in vivo and in vitro with evidence of a slippagemutation threshold at around 8 or 9 units for mono-SSRs.
SSRs tend to be less common in coding sequences(Metzgar et al. 2000; A ckermann and Chao 2006) asa change in nucleotide number often has disastrous func-tional consequences. If the unit length is a multiple of three,there will be an expansion or a contraction of the particularamino acids encoded by the 3-mer (codon). It is well estab-lished that long expansions of such coding microsatellitesare responsible for many neurodegenerative disorders(E verett and Wood 2004). When the unit length is not a mul-tiple of three, a change in unit number produces a frameshift(Strauss 1999). If the slippage occurs during the replicationprocess, it may create an allele that contains a prematurestop codon either in somatic cells or in the germ line. Slip-page can also occur during transcription (Fabre et al. 2002),leading to abnormal messenger RN A that is usually de-graded by the nonsense-mediated mRN A decay system(Conti and Izaurralde 2005). Because SSRs in coding se-quences are typically associated with deleterious effects,they tend to be subject to purifying selection. We want toemphasize that SSRs that have unit lengths that are not a mul-tiple of three have a direct, harmful potential in coding se-quences because no slippage can be tolerated; therefore,they should be even less common within exons. Intriguingly,it has been observed that many genes involved in D N A re-pair, including M MR, carry a long mono-SSR in their codingsequences (Mori et al. 2001; M iquel et al. 2007). If these par-ticular SSR experience an expansion or a contraction, theM MR system will become deficient and will lead to a highermutation rate (as observed in some H NPC C-associated tu-mors). It has been postulated that a deficient M MR systemcould be advantageous when the environment is stressful. Inthis case, organisms with a higher mutation rate could adaptmore easily to environmental challenges. Consequently,mono-SSRs in these genes could have been positively se-lected for their mutational potential (Moxon and W ills1999; Chang et al. 2001; K ashi and K ing 2006).
In the present study, we have detected all strictSSRs—that is perfect repeats without any ‘‘ interruption’’in the pattern—in all human genes. We used the presenceof a long SSR (with at least 8 [or 9] units for mono-SSR, 5[or 6] units for di-SSR, and 4 [or 5] units for tetra- and pen-ta-SSRs) as a proxy for the hypermutability of genes (Roseand Falush 1998; Lai and Sun 2003b). Even though manyother factors can influence the mutability of genes, the pres-ence of a long SSR greatly increases the chances for a geneto be inactivated. Indeed, the probability of a nonsense sub-stitution is several orders of magnitude lower than the rateof slippage of a long enough SSR. We found mono-SSRs tobe the most abundant unstable SSR as well as the most bi-ased in term of hosting genes’ function. Consequently, wefocused our study on mono-SSR and used the term ‘‘hyper-mutable genes’’ to refer to genes that carry a long (andtherefore potentially unstable) mono-SSR in their codingsequence hereafter.
Using annotations from the Gene Ontology (G O) da-tabase (Ashburner et al. 2000), we performed an in silicofunctional analysis of all genes that are a priori hypermu-table. We found a cohesive restricted subset of functionsthat are overrepresented among hypermutable genes. Totake into account differences due to the length and the com-position of genes, we computed for each gene the probabil-ity to host a long mono-SSR. In this statistical framework,we observe less hypermutable genes than expected in al-most all functions, including the ones we found overrepre-sented. This shows that, typically, hypermutable genes areremoved by purifying from the human genome because oftheir deleterious potential. Interestingly, we observe that thestrength of the purifying selection, that removes long mono-SSR, varies from function to function.
M ate r ials and M ethodsM icrosatellites in Human-Coding Sequences
We extracted all exons and introns from all transcriptsof the 22,218 genes from the human genome of the databaseEnsembl v37. Each gene sequence was then reduced to itsexonic sequences only. When exons of different transcriptswere overlapping, we merged them into an artificial exonic-like sequence. For each gene, we then concatenated all itsnonredundant exonic-like sequences into a single sequenceand inserted an ‘‘X’’ at each junction. The X tag ensures thatno microsatellite can be detected astride two differentexons. The same procedure was applied to introns to buildup a unique intronic sequence for each gene. We built twosets, each composed of 22,218 artificial exonic sequencesand 18,384 artificial intronic sequences derived from alltranscripts.
We detected all strict SSRs (no interruption in thepattern) of a motif whose length ranges from 1 to 5.
Statistics on Mono-SSR
The following model is very similar to previous mod-els that were used to describe the probability of observinga given SSR in sequences (de Wachter 1981).
Interestingly, the functional bias of hypermutability isonly driven by mono-SSR. Therefore, the statistical
112 Loire et al.
framework focused on mono-SSR exclusively. Extensionsfor longer motifs are given in Robin et al. (2005).
Probability of a G iven Mono-SSR
We will give here an approximation of the probabilityto observe at least one occurrence of an X-SSR of size m!
(m or more) in a random sequence of L independent lettersof the { A , T , G , and C } alphabet. Px will denote the prob-ability to generate a nucleotide X in such random sequence.
Let us first note that the number of occurrences of anX-SSR of size m!, denoted by Nx, is exactly the number ofclumps of the m-mer (X)m. A clump of a motif is definedhere as the maximal set of overlapping occurrences of thismotif in the sequence (Robin et al. 2005). The expectationof Nx is thus given by
E"NX#5 "1 $ PX# % "PX#m %"L $ m ! 1#;
and Nx can be approximate by a Poisson random variable(Robin et al. 2005). Therefore, we have
P"NX & 1#5 1 $ P"NX 5 0#;
where
P"NX 5 0#5 e$E"NX#:
Expected Size of a Mono-SSR
We first computed, for each sequence and for each typeof nucleotide, the m value that corresponds to P(Nx & 1)& 0.5. This value will be named m1/2. If the model fits
the data, a given gene has 50% chance of having its longestSSR larger than m1/2. We can then affect all genes to eithera ‘‘ larger’’ or a ‘‘smaller’’ category depending whether itslongest mono-SSR is larger or smaller than its m1/2. Becausethese are independent Bernoulli trials, we expect for a set ofgenes that half of it should be in the larger category. We canthen test if the genes tend to have a smaller/larger mono-SSRthan expected using a v2 test.
Expected Fraction of Hypermutable Genes
We also computed the expected fraction of genes car-rying a long mono-SSR (m fixed) in their coding sequencesfor a set of genes. To do so, we calculated, for each gene ofthis set, the probability of observing at least one mono-SSRof length m! of any type of nucleotide (with m 5 8 or 9).We assume that the probability for each type of SSR is in-dependent. Because m is not very small, this approximationis reasonable. In a given gene, the probability to find at leastone mono-SSR of length m! is
P!NA;C;G;T & 1
"5 1 $ P"NA 5 0# % P"NC 5 0#% P"NG 5 0# % P"NT 5 0#:
The average of all these probabilities for a given func-tion is an unbiased estimator of the expected fraction of hy-permutable genes in this function.
F inally, using this model, we can compute the confi-dence interval (CI) associated with its expected fraction ofhypermutable gene. To do so, one needs to compute theprobability that, among N genes, each having a probabilityP(NA , C , G , T & 1) to host a mono-SSR at size m!, n geneshave such an SSR. These are N independent Bernoulli trialswith different probabilities of success. We estimate theprobability to obtain at least n hypermutable genes fora given term by simulations. For each term, we randomlyrun N Bernoulli trials with respect to the individual prob-ability of each gene. This procedure is repeated 105 timesfor a given term. The empirical distribution is then used tocompute a 95% CI for a given set of genes.
Functional Group of Human Genes
We used G O (Ashburner et al. 2000) as well as PantherOntology (M i et al. 2005) to assign human genes to func-tional groups. Both databases are based on organized ontol-ogies, a controlled vocabulary for the description of geneproducts. More precisely, there are constituted of terms(i.e., G O term or PantherID) that describe a ‘‘biological pro-cess’’ (BP), a ‘‘molecular function’’ (M F), or a ‘‘cellularcomponent ’’ (C C) (although this latter category does notexist in Panther Ontology). For all genes, we consideredall available annotations. We retrieved G O terms from En-sembl (http://www.ensembl.org/biomart/martview/) andPanther IDs from the Panther database Web page (http://www.pantherdb.org/).
Here, we defined the level of a term as the number ofnodes that exists between this term and the root of the graph(level 0). In the cases of multiple paths, we keep the shortestone. We decided to compare only terms lying at the samelevel. We used the annotated term of a gene to browse theontologies and collect all its parental terms. For each level,we considered only genes that have at least one definedterm.
Representation of Gene Functions among the Data Set
We wanted to test if any function were overrepre-sented among genes carrying a long SSR. For that purpose,we used a cumulative hypergeometric law (see e.g., Castillo-Davis and Hartl 2003 as suggested Rivals et al. 2007).
We perform our tests level by level to compare com-parable terms. For each level of the ontologies, we per-formed one test per term. To correct for multiple tests,we considered that terms lying at the same level of the on-tology were independent and therefore can be corrected us-ing the Bonferroni correction. On the contrary, weconsidered that tests between levels were fully dependentbecause they use the same annotations but with differentaccuracies.
Results
In this study, we restricted ourselves to strict SSRs thatcontain no nucleotide interruption, which tend to stabilizemicrosatellites (E llegren 2004) and thus lower their intrin-sic mutability. For each of the 22,218 annotated genes in the
SSR-Based Hypermutability of Human Genes 113
human genome, we detected all strict SSRs in concatenatedexonic and intronic sequences. Because we were interestedin studying genes that are susceptible to direct inactivationby SSR contraction or expansion, we excluded SSR thathad a unit length that was a multiple of three.
Long SSRs in Coding Sequences Are Mononucleotideand D inucleotide SSRs
For each gene, we identified the largest mono-, di-,tetra-, and pentanucleotide SSR (frameshifting SSR) in ex-onic and, when available, in intronic sequence. Because therate of insertion/deletion grows exponentially with thenumber of repeat units (Tran et al. 1997; Legendre et al.2007), the longest SSR in the exons of a given gene pro-vides a good approximation for gene hypermutability.
Results (fig. 1) show that all types of SSRs are smallerin exons than in introns. Indeed, intronic SSRs are fourtimes longer than exonic SSR for mono-SSR (5.8 vs.21.9) and 2.5 times longer for pentanucleotide SSR (1.3vs. 3.4). One could relate this observation to the purifyingselection that acts against the expansion of SSR in codingsequence; however, intronic sequences are much longerthan exonic sequences (i.e., on average 30 times). Both fac-tors contribute to this difference, as it will be shown below.
As mentioned above, mono-SSRs are estimated to beunstable when they reach a length of 8 units (Rose andFalush 1998) or 9 units (Lai and Sun 2003b). If we considera threshold of 8 units, the corresponding mutabilities arereached for di-, tetra-, and penta-SSRs for 5, 4 and 4 units,respectively. In this case, the numbers of genes, in the hu-man genome, having an SSR longer or equal than thethreshold, are 1,291 for mono-SSR (5.8% of all genes),678 for di-SSR (3.1%), 39 for tetra-SSRs (0.2%), and 11for penta-SSRs (,0.1%) and a total of 1,935 (8.7%) genes.Using thresholds of 9, 6, 5, and 5 units for mono-, di-, tetra-,and penta-SSRs yields to 417 for mono-SSR (1.9%), 116for di-SSR (0.52%), 8 for tetra-SSRs (,0.1%), and 1 forpenta-SSRs (,,0.1%) and a total of 475 (2.1%) genes.
If we assume that those thresholds represent the min-imum numbers of units to observe instability, the SSRs thatmostly participate to gene hypermutability are clearlymono-SSR and di-SSR.
Hypermutable Genes Are Overrepresented ina Restricted Subset of Functions
Using either the lower (8 units for mono-SSRs) or thehigher (9 units for mono-SSRs) threshold, we define a set ofgenes that have, a priori, a high probability to be disruptedby a nonsense mutation due to the expansion/contraction ofthe SSR they host. We then searched for overrepresentedterms of G O (Ashburner et al. 2000) among the set of genes.
We worked on the subset of 15,385 genes (69% of to-tal) that had at least one term in one of the three graphs.Note that 57% of all genes have one term in BP, 63% inM F , 54% in C C , and 48% in the three. The fraction of geneswith a long SSR within each subset is identical (data notshown). It is however important to note that more specificlevels are made up of fewer annotated genes.
From all terms that were annotated at least once in thehuman genome (supplementary table S1, SupplementaryMaterial online), only a few were found overrepresented.No function was overrepresented if only genes hostinga long tetra- or a penta-SSR were considered, and their re-moval has no impact on the results. More surprisingly, thereis no function overrepresented among genes with long di-SSR, and their removal leaves the results almost unchanged(supplementary table S2, Supplementary Material online).Therefore, the only SSRs that are not uniformly distributedamong functions are the mono-SSRs.
F igure 2 shows all terms we found overrepresented inhypermutable genes when mono-SSRs of 8 bp or more areconsidered. Results with mono-SSR of 9 bp are consistentwith the former and are presented in supplementary table S2(Supplementary Material online). Among the 3,122 BPterms, only 10 were statistical ly overrepresented(fig. 2a). Interestingly, genes with mono-SSRs are enrichedfor functions involved in either ‘‘cell cycle ’’ or ‘‘response toD N A damage stimulus. ’’ Many of these hypermutablegenes carry both types of annotations or related ones.The overrepresented terms are more or less precise descrip-tions of the same subset of functions. Following A lexa et al.(2006), if we remove the 12 genes that are annotated asfunctioning in meiosis (the most specific overrepresentedterm), no BP terms are found to be overrepresented. There-fore, genes with this function are responsible for the moregeneral terms found to be overrepresented. Because there isno reason to believe that the most precise terms are mostinformative, we present results for all levels.
The same trend is observed for M F (fig. 2b) and C C(fig. 2c). In M F , out of the 2,600 terms, only 15 highly
F IG. 1.—D istribution of SSR length in human genes. Counts ofhuman genes that contain an SSR which size is equal or larger than thevalue given in x axis. The size is expressed in number of units. We onlyreport the results for SSRs whose motif length is not a multiple of three.In the top panel, we report results for exonic sequences, whereas resultsfor intronic sequences are displayed on the bottom panel. This figureillustrates that introns carry larger SSRs than exons do and that long SSRsin exons are mostly mono- or di-SSRs.
114 Loire et al.
connected terms are found overrepresented. These terms allrelate to ‘‘hydrolase ’’ (especially ‘‘ A TPase ’’), ‘‘helicase, ’’‘‘ G TPase regulator, ’’ and ‘‘ A TP binding. ’’ Removing A T-Pase and G TPase regulator genes from the data set sup-presses other overrepresentations in M F . As for C C , onlyfive terms (out of 583) are overrepresented and all are re-lated to ‘‘nucleus. ’’ The ‘‘ intracel lular nonmembrane-boundorganelle ’’ term encompasses intracellular molecular com-ponents such as the kinetochores, the chromosomes, and thenucleosome. Ignoring genes from nucleus does not alter theoverrepresentation in intracellular nonmembrane-bound or-ganelle and vice versa. Obviously, removing genes anno-tated by the latter suppresses the overrepresentations ofshallower related terms.
Among Overrepresented Functions, Genes Are Longerand/or More B iased in Composition
Only a restricted number of functions are overrepre-sented in hypermutable genes. In the three graphs, thesefunctions all relate to cell cycle and ‘‘ D N A maintenance. ’’We wanted to test whether genes involved in these func-tions have a higher chance of hosting a long mono-SSR.In this respect, we computed, for each gene, the probabilityof finding a long mono-SSR (8 bp or more) given its lengthand composition. The probability model we used hereassumes that mono-SSRs are only generated by severalindependent substitutions that keep the average nucleotidecontent of the gene unchanged. It is therefore used tocheck whether the presence of a given mono-SSR in a givengene can be explained by random point mutations only.This model does not include the possibility of slippagefor modifying the size of coding mono-SSR. Indeed,insertion or deletion of 1 or 2 units in a coding SSRwhose motif length is not a multiple of three leads toa frameshift mutation. Thus, fixation of such events mustbe extremely rare.
The average probability of having a mono-SSR of 8units or more in genes involved in the function we findoverrepresented is 0.184, that is higher than 0.142, the av-erage for the other annotated genes (P ,, 10$16, W ilcox-on U test). This shows that, on average, genes involved inthe function we found overrepresented have a higher prob-ability to host a long mono-SSR.
Mono-SSRs Are Typically Shorter than Expected inExons
Because this model assumes that all substitutions canoccur freely with respect to the gene nucleotide composi-tion, this model can be used as a neutral model. Indeed, thismodel corrects for local composition and therefore for po-tential local mutation biases. Furthermore, it assumes thatall substitutions occur freely within the sequence, whichimplies the neutrality of substitutions. From the comparisonof what is expected under the model to what we observe, weare able to test for the neutrality of mono-SSR.
We first tested whether the length of mono-SSR, weobserve in genes, is expected under the neutral model.To do so, we computed for each gene, m1/2, the size of
the SSR that corresponds to a probability P 5 0.5. Ifan SSR originates from several independent selectivelyneutral substitutions, half of the genes will have a mono-SSR larger than m1/2, the other half will have a mono-SSR smaller than m1/2. We counted all genes that were host-ing a smaller or a larger SSR than m1/2. Results are given intable 1.
In exons, we find that all types of SSRs are smallerthan expected (v2 test; P , 10$16), which agrees with pre-vious studies (Metzgar et al. 2000; A ckermann and Chao2006). For introns, we find that G-SSR and C-SSR are small-er than expected (v2 test; P , 10$16), whereas A-SSR andT-SSR are longer than expected (v2 test; P , 10$16). Inter-estingly, introns where ‘‘ A lu’’ were removed by Repeat-Masker (Smit 1999) show the same pattern. A ctually,masking A lu reduces the length of intronic sequence andincreases the number of sequences that host larger than ex-pected G-SSR or C-SSRs.
There Are Less Hypermutable Genes than Expected inA lmost A ll Functions
If we find as many hypermutable genes (i.e., geneswith a mono-SSR of 8 bp or more) as the neutral modelpredicts, we will have to acknowledge that long mono-SSRs are virtually neutral for these genes. If we findmore hypermutable genes than expected, it suggeststhat mono-SSRs were positively selected in these genes. In-deed, in exons, mono-SSRs are created by the accumulationof substitutions and if they improve the fitness of theirhost genome, they will be selected for. If we find less longmono-SSR than expected, it suggests that mono-SSRsare removed by purifying selection from the codingsequences.
In all, 1,291 genes (5.8% of the total) contain a mono-SSR of 8 units or more. Using the model, we expect 14.2%of such genes (with a 95% conservative CI of [13.8%,14.7%]). This again highlights that, on average, there areless long mono-SSR in genes than expected by chance,most likely due to their removal by purifying selection.
We further wanted to test if this trend is shared by allfunctions taken individually. Therefore, we compared foreach term of G O , the expected fraction of genes withlong mono-SSR to the expected one. Results are shownin figure 3. Overall, among the functions that have at least20 genes, 734/1,238 functions (59.3%) exhibit a fraction ofhypermutable genes outside the 95% CI that was computedunder the neutral model—406/679 (59.8%) in BP, 233/404(57.7%) in M F , and 95/155 (61.3%) in C C . These functionsare colored in blue in figure 3. For all, except one, there areless hypermutable genes than predicted by the neutralmodel. Taking into account also the terms with less than20 genes, we observe a lower, though significant, numberof terms outside the 95% CI: 788/6,305 terms (12.5%). Thisdemonstrates that for almost all functions, hypermutablegenes are removed by purifying selection. Consideringmono-SSR of 9 bp or more (instead of 8 bp or more) leadsto identical results (supplementary fig. S1, SupplementaryMaterial online).
The functions that we found overrepresented amonghypermutable genes (colored in red)—the functions given
SSR-Based Hypermutability of Human Genes 115
in figure 2—have a larger observed fraction than the aver-age. They, however, exhibit usually less hypermutablegenes than expected from neutrality. This shows that eventhough we find them overrepresented, hypermutable genes
are also avoided in these functions. It is noteworthy to men-tion that the hypergeometric statistics we used to estimatethe overrepresentation among hypermutable genes dependson the number of genes within a term. Therefore, we
FIG. 2.—G O terms overrepresented among hypermutable genes. Here, we report for all three branches of the ontology, the functions we foundoverrepresented among hypermutable genes in the human genome. Results are given for (a) BP, (b) M F , and (c) C C . Each column is a level in theontology (the higher the level, the more precise the annotation). It contains ellipses representing overrepresented functions lying at this level. Theencapsulated numbers are the numbers of hypermutable genes in these functions. Genes shared by several functions are given in the intersection ofellipses. Arrows indicate a complete inclusion into another term at a shallower adjacent level. We also give, under the picture, the total number ofhypermutable genes that is annotated at this level as well as the number among them that is embedded in the functions we found overrepresented.
116 Loire et al.
observed terms with a high fraction of hypermutable genesthat are not significantly overrepresented (e.g., M MR withan observed fraction of 26.1%) and, conversely, terms wefound significantly overrepresented even though they ex-hibit a moderate fraction of hypermutable genes (e.g., ‘‘bio-polymer metabolism, ’’ which has an observed fraction of7.3%). This latter case happens when the number of genesis very large for a given function, which improves thepower of the statistical test we used.
Generally, the comparison between the observed andthe expected fraction of hypermutable genes for all terms(fig. 3) reveals a weak though positive correlation betweenthe observed and the expected values (r 5 0.35 for BP,r 5 0.56 for M F , and r 5 0.43 for C C , P ,, 10$4 forall regressions). This implies that typically the presenceof long mono-SSR in genes can be partially explainedby their length and their nucleotide composition.
The Strength of Purifying Selection V aries fromFunction to Function
Results highlight interesting functions that appear dif-ferent from the others. F irst, we observed some functionswith a particularly small observed/expected ratio. The moststriking example is the ‘‘collagen’’ term (fig. 3c) for whichthe ratio is 0.075. Even though one would expect a largeproportion (40.0%) of hypermutable genes within this term,we found only very few (3.1%). Conversely, there are 36terms with a ratio observed/expected larger than 1 (e.g.,‘‘endoplasmic reticulum to Golgi transport ’’ as well as mei-osis and M MR in fig. 3a).
This variation could be solely due to the random sam-pling of genes within functions. Modeling the probability ofhaving long mono-SSR under purifying selection may al-low the test for this hypothesis. As a first approximation, weused the observed density of long mono-SSR in coding se-quences to compute an average rate of SSR per base. If allgenes were under the same selective constraints, the num-ber of SSR per gene should be Poisson distributed with thisaverage rate multiplied by their length. A ccordingly, wecomputed the probability to host at least one long mono-SSR (i.e., to be an hypermutable gene) for all genes. Wethen computed, for each function, a 95% CI for the expectednumber of hypermutable genes. Among terms with morethan 20 genes, we found 171/1,238 (13.8%) terms outside
the CI; this is larger than the 5% we expected if codingmono-SSRs were under the same selective pressure in allfunctions.
Discussion
In this study, we assumed that all genes hosting a longenough mono-SSR can be considered as hypermutablegenes. Whatever the chosen threshold for hypermutability,we show that only a cohesive restricted set of functions areoverrepresented among hypermutable genes. Interestingly,we show that this is only due to the mono-SSR withingenes, the other type of SSRs being uniformly distributedamong functions. Using a probabilistic model, we were ableto show that mono-SSRs are shorter than expected bya model of neutral substitution (which is coherent with pre-vious studies, e.g., Metzgar et al. [2000]; A ckermann andChao [2006]) and that hypermutable genes are avoided inalmost all functions. F inally, our study shows that thestrength of purifying selection, that removes hypermutablegenes from the human genomes, varies greatly from func-tion to function.
SSRs Are K ept Small by Purifying Selection in Exons
The comparison between introns and exons suggeststhat frameshifting SSRs are subject to a strong purifyingselection in coding sequences. Indeed, if one considersthat intron evolution is almost neutral, then the length ofintronic SSRs must be solely the consequence of their mu-tation process. The differences observed between length ofexonic and intronic SSRs reflect the existence of selectionthat acts against free expansion of those SSRs in codingsequence.
Indeed, using a model that predicts the size of the lon-gest mono-SSR expected in a coding sequence of a givenlength and composition, we showed that, in exons, mono-SSR length is globally smaller than expected. In introns, G/C-SSRs are also shorter than expected but A /T-SSRs areusually longer than expected. This is consistent with theobservation that G/C-SSRs are generally smaller than A /T-SSRs (L i et al. 2002). This suggests that A /T- and G/C-SSRs should be considered separately. Insertion ofA lu sequences in introns contributes to the abundance oflong A/T-SSRs but is not sufficient to explain their
Table 1M ono-SSR P robability in H uman E xons and Int rons
Exons Introns A lu-masked Introns
Mono-SSR Smaller Larger Smaller Larger Smaller Larger
A 20,271 1,947 3,441 1,4943 5,045 13,339T 20,279 1,939 3,254 1,5130 4,458 13,926G 21,660 558 16,059 2,325 13,651 4,733C 21,342 976 15,139 3,245 12,484 5,900Number expected 11,109 11,109 9,192 9,192 9,192 9,192
N O T E.—For each type of mono-SSRs (A , C , G , and T), we compute for each human gene an expected length value (m1/2) beyond which there is a 50% chance offinding an SSR of size m1/2 or longer. Each gene was then assigned to the larger or the smaller category depending on the comparison of the length of its longest mono-SSRto m1/2. If the neutral model were fitting, we would expect half of the genes to host a mono-SSR larger than m1/2. This table shows the results for exonic and intronicsequences and for each type of repeat nucleotide. We also examined intronic sequences masked for A lu sequences because their presence in an intron adds A/T repeats tothese sequences. Dev iation from the expectation (0.5 vs. 0.5) is significant for all types of sequences and mono-SSRs (v2 test, P , 10$16 for all tests).
SSR-Based Hypermutability of Human Genes 117
abundance. Because there is no reading frame, one couldimagine that A /T-SSRs can undergo free expansion. Themodel we used as a reference assumes that all SSRs are cre-ated by an accumulation of substitutions. Beyond a thresh-
old size, SSRs experience expansions through replicationslippage (or recombination) and then become longer thanexpected. Obviously, there are additional factors that pre-vent G/C-SSRs to expand. As for coding sequences, we
FIG. 3.—Expected and observed fractions of hypermutable genes for all G O terms. Here we represent for each term, the observed proportion ofgenes that contain a mono-SSR larger than eight as a function of its expected fraction. The terms are extracted from (a) BP, (b) M F , and (c) C Contologies. The size of each dot is proportional to the total number of genes that term encompasses (taken as discrete intervals: [20, 50], [50, 100], [100,500], [500, 103], and [103, infinity]). Terms with less than 20 genes were not represented. Terms we found statistically overrepresented amonghypermutable genes (terms from fig. 2) are colored in red. The line represents the ratio observed/expected 5 1. Terms that are significantly outside the95% CI predicted under neutrality are colored in blue. This figure shows that almost all functions contain less genes carrying a long mono-SSR thanexpected. This again illustrates that most, if not all, long mono-SSR tends to be removed by purifying selection. A lthough, it also shows that somefunctions (e.g., meiosis, M MR, and ‘‘condensed chromosome’’) encompass many genes with long mono-SSR along with an observed/expected ratioclose to 1. This suggests that genes involved in those functions are under relaxed purifying selection.
118 Loire et al.
suspect that G/C-SSRs are kept short by purifying selectionin introns. Two molecular evidences are compatible withthis hypothesis. F irst, G-rich tracts are known to adopt un-usual D N A structure (parallel quadruplex) involved in dif-ferent biological functions (Sen and G ilbert 1988). Second,G-rich tracts are also prone to electron transfer that causesoxidative damage (Hall et al. 1996). For one or the other (orboth) reasons, there is a good chance that G/C-SSRs havean impact on fitness even in introns. This effect shouldequally apply in exons. Those deleterious effects certainlyadd up with those previously highlighted (selection againstframeshifts).
Functions of Hypermutable Genes
Despite this global underrepresentation of SSRs in ex-onic sequences, several genes still host a long SSR. Defin-ing a threshold for long SSRs is not trivial. Thus, we usedtwo sets of values that are relevant for the minimum sizebeyond which SSRs are subject to expansion and contrac-tion. It is important to mention that both sets of thresholdslead to extremely similar results. This highlights the robust-ness of our results to the choice of a threshold for hyper-mutability. Among the very large number of terms thatwere annotated in the human genes, only a restricted num-ber exhibits an overrepresentation of hypermutable genes.
Legendre et al. (2007) conducted a similar analysis ona data set that includes all genes that contain any type ofSSR. BP overrepresented among this data set is differentfrom the ones we report here. An analysis of the 1,266genes hosting a long tri-SSR reveals a similar set of func-tions (data not shown), with the exception of neurogenesisand related terms. We suspect that the difference in metricfor hypermutability explains this difference. Because manyneurological disorders are caused by the presence of a cod-ing tri-SSR, we conclude that the overrepresentation of thefunctions described by Legendre et al. is mainly driven bygenes hosting a tri-SSR that we ignored in our study.
Importantly, one could argue that this is a consequenceof large duplicate families that share often the same anno-tations. However, using Ensembl definition of gene family(Enright et al. 2002), we computed for each function thefraction of genes that contain a duplicate within the func-tion. No differences were observed between the overrepre-sented functions and the others (0.35 vs. 0.41, P 5 0.18when considering all genes, 0.25 vs. 0.31, P 5 0.32 whenconsidering genes with mono-SSR, Mann–Whitney U test).Therefore, this overrepresentation is not an artifact of largeduplicate families. Our analysis shows that those functionsare generally devoted to cell cycle and maintenance ofgenome integrity (D N A repair, meiosis, cell cycle, helicasedomain–containing genes, nuclear localized genes, etc.). Itshould be mentioned that a similar set of functions is over-represented among genes that host at least two long mono-SSRs (data not shown). Furthermore, the same analysiswith annotations from PantherD B (M i et al. 2005)also leads to a similar set of functions (data not shown).Overall, we think that our results are robust to the most ob-vious artifacts and that the restricted cohesive set of func-tions we find overrepresented in hypermutable genes aremeaningful.
The Strength of Purifying Selection againstHypermutable Genes V aries from Function to Function
We computed an expected fraction of hypermutablegenes in all functional groups of genes and compared it withthe observed fraction. We show that almost all functionsclearly harbor less hypermutable genes than expected underneutrality. This strongly suggests that the vast majority oflong mono-SSRs are kept out of coding sequences by pu-rifying selection.
Functions overrepresented among the hypermutablegenes (i.e., those dedicated to genomic stability and cell cy-cle) are expected to contain a large fraction of hypermutablegenes. They are longer and/or more biased in compositionthan the average genes. Therefore, the overrepresentation ofhypermutable genes in those functions can be explained bythe length and the nucleotide composition of genes amongthose functions. This points out the importance of usinga statistical framework that tests for the effect of lengthand composition of the genes.
An overestimation of the expected number of longmono-SSRs would diminish the strength of the purifyingselection we observe. A t least three properties of D N A -coding sequences were neglected in our model. F irst, slip-page process was ignored, although almost none is expectedin coding sequence. Slippage, however, leads to largermono-SSR than what is observed in coding sequence. There-fore, ignoring slippage lowers the expected number and sizeof mono-SSR. Second, we also ignored the dependency ofnucleotide context in coding sequences. We estimated theprobabilities of mono-SSR in coding sequences using a sim-ulated data set of random sequences modeled by a Markovmodel of size 2 (using the frequency of the 3-mers). Usingthese probabilities instead of the one given by the Poissonmodel does not qualitatively changes our results. F inally, weignored the amino acid sequences of the genes. A ckermannand Chao (2006) fixed the amino acid sequences of genesand showed that mono-SSRs are underrepresented.
There are few functions for which we observed asmany hypermutable genes as expected under a neutralmodel. For these functions, long mono-SSRs are virtuallyneutral. On another extreme, we shall consider functionsthat are expected to contain long mono-SSR but do not(e.g., cytoskeleton- and collagen-related genes). Overall,we have to acknowledge that the strength of the purifyingselection that acts against long mono-SSR varies from func-tion to function, from very strong (e.g., for collagen) up toits complete absence (e.g., for ER to Golgi transport). Wecan propose several hypotheses to explain this observation.
F irst, the rate of instability for SSR within the samegenome may greatly vary from one locus to another. There-fore, we can imagine that the hypermutable genes are lo-cated in peculiar loci in the genome where SSRs arestabilized.
A lternatively, it is possible that the functions wheremono-SSRs are apparently neutral could be composed ofgenes that are more ‘‘dispensable ’’ than others. Here weused dispensable to refer to a low cost in fitness whenthe gene is not properly expressed. For the human genome,we however do not have a list of phenotype associated withthe absence of all genes. The use of Online Mendelian
SSR-Based Hypermutability of Human Genes 119
Inheritance in Man (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)seems inappropriate because although half of the genescarry an entry, the entries clearly do not have the samemeaning in terms of individual fitness and the genes withno annotation cannot be considered as dispensable.
F inally, it is possible that the apparent neutrality ofSSR could be the result of a balance between positiveand negative selection. If the expression of a gene is asso-ciated to sometimes positive, sometimes negative fitness,one could imagine that the evolution of such a gene wouldlook neutral even though it is always under selection. Here,we find that genes that host a long SSR are devoted to themaintenance of D N A integrity. Why did such genes retainhypermutable motifs in their coding sequences? Previousstudies (Moxon and W ills 1999; Chang et al. 2001;Rocha et al. 2002; K ashi and K ing 2006) reported thepresence of long mono-SSR in M MR genes and proposedthat these genes tune the global mutation rate of the organ-ism by switching on and off after a loss-of-frame mutationcaused by replication slippage. Mutator phenotypes, gener-ally caused by a mutated M MR gene (Rosenberg et al.1998), have been shown to be evolutionary advantageousin bacteria facing an environmental challenge (Taddei et al.1997). Among a population under stress, individualswith a new advantageous mutation (most likely individualsbearing the mutator allele) will improve in fitness. Thus,this advantageous mutation will increase in frequency alongwith the mutator (by hitchhiking). If genetic linkage islikely to be strong in bacteria, it is not in eukaryotes. There-fore, the possibility of mutators in the human lineageseems difficult. We can nonetheless intuitively suspect thatselection could favor a premutator state (i.e., unstablemono-SSR hosted in coding sequence) in some function(e.g., genes devoted to genomic stability), although it wouldrequire more theoretical investigations that will not beconducted here.
It seems difficult at this stage to definitely support orreject one of the hypotheses. However, we would like tomention that the last hypothesis (hidden positive selection)should be regarded with caution. If long mono-SSR looksneutral in these genes, the most parsimonious explanation isthat they are neutral.
As a consequence, we do not favor this ‘‘oscillatingmode of selection’’ hypothesis and challenge the existenceof mutator genes in human and more generally ineukaryotes.
Conclusion
The hypermutability of the human genes (when con-sidering only potentially unstable SSR) is typically a conse-quence of their length and/or nucleotide composition. Mostlong SSRs are removed from coding sequence by purifyingselection. However, a restricted set of functions seems to beinsensitive to the presence of a priori deleterious long SSR.The mystery of this apparent relaxed purifying selectionneeds more thought and data. In that respect, we think thatthere is a need for more theory along with a phylogeneticperspective on the evolution of coding SSR to gather furtherinsight in this unclosed debate.
Supplementa r y M ate r ial
Supplementary figure S1 and tables S1 and S2 areavailable at Molecular Biology and Evolution online(http://www.mbe.oxfordjournals.org/).
A cknowledgments
Authors would like to thank S. Schbath, E . Rocha, I.Goncxalves, S. Baulac, E . Leguern, and C . Castillo-Davis forcomments on previous versions of the manuscript.
L ite r atu re C ited
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Naruya Saitou, Associate Editor
A ccepted October 5, 2008
SSR-Based Hypermutability of Human Genes 121
87
1.2. Résumé des résultats
Le catalogue de gènes hypermutables selon la définition que nous en donnons atteint une
proportion de 8.7% des 22 218 gènes étudiés. Parmi ces gènes, 1 291 contiennent une
répétition de mononucléotides codants d’une longueur supérieure ou égale à 8 nucléotides.
C’est dans ce groupe que les biais fonctionnels atteignent une valeur significative. Dix
processus biologiques (GO-terms) y sont surreprésentés : Méiose, Phase M, Phase M du cycle
cellulaire méiotique, Métabolisme des biopolymères, Cycle cellulaire, reponse aux stimuli de
dommages à l’ADN, Processus physiologique de la cellule, et Réponse aux stimuli
endogènes.
L’emboîtement de ces fonctions, qui sont directement liées les unes aux autres au sein de
l’ontologie, justifie la méthodologie utilisée pour détecter les surreprésentations. La
surreprésentation des plus précises d’entre elles entraîne également la surreprésentation de
celles qui les englobent, et une correction statistique pour les tests multiples qui n’aurait pas
été effectuée par niveau masquerait artificiellement certains résultats.
On trouve deux grandes classes de processus biologiques cohérents : Les fonctions liées au
contrôle du cycle cellulaire et les processus de réparation de l’ADN.
Il est intéressant de noter que les fonctions moléculaires surreprésentées sont également
cohérentes avec les fonctions de réponses aux stimulus : Les hélicase, la liaison aux acides
nucléiques et les activités ATPasiques, sont caractéristiques des protéines liées à la
maintenance de l’intégrité de l’ADN. De même leur localisation cellulaire : Le noyau
cellulaire. La présence des organelles non-membranaires est liée à la présence dans ce groupe
88
du kinétochore, organelle lié au centromère durant les phases de divisions cellulaires
mitotiques et méiotiques.
Le modèle que nous avons proposé pour évaluer la probabilité, pour chaque gène, de contenir
une répétition de mononucléotide (mono-SSR) nous à permis de mettre en évidence que :
1) Les séquences codantes contiennent moins de mono-SSR qu’attendus par ce modèle, tout
type de nucléotide confondus.
2) Les introns contiennent plus de mono-SSR qu’attendus, sauf les répétitions de G et de C
qui restent sous-représentées dans ces séquences.
3) Les biais fonctionnels observés sont en partie imputables au fait que les gènes dédiés à ces
fonctions (Contrôle du cycle cellulaire ; Réponse aux simuli de dommages à l’ADN) sont
longs et/ou biaisées dans leur composition nucléotidiques, et présentent de ce fait une
probabilité plus forte de contenir ce type de répétitions.
4) Pris dans leur globalité, les groupes fonctionnels présentent généralement un nombre
observé de gènes contenant un mono-SSR différents de celui attendus, avec un continuum
allant de très inférieur à l’attendu, ce qui peut être interprété comme résultant d’une sélection
négative forte de ces répétitions instables, à identique à l’attendus, ce qui pourrait être
interprété comme résultant d’une relaxation de cette même sélection négative dans ces
fonctions. Les fonctions dans lesquelles les mono-SSR sont surreprésentés le sont donc
probablement en raison de cette relaxation, et non d’une hypothétique sélection positive
promouvant l’hypermutabilité de gènes par le biais de ces répétitions.
89
2. Évolution des microsatellites codants
chez les primates
Les observations faites lors des travaux précédents méritaient que l’on porte une attention
plus particulière au devenir des microsatellites codants au cours de l’évolution humaine. Nous
avons donc choisi une approche de génomique comparative afin d’acquérir des données sur
les patrons de mutations des microsatellites codants au sein des gènes de primates.
La première étape a été l’obtention d’un jeu d’alignements d’orthologues. Nous avons
collecté ces derniers dans la base de données Homolens (Penel et al. 2009), en nous
restreignant aux groupes qui contenaient une séquence unique pour chacune des quatre
espèces considérées (H. sapiens, Pan troglodytes, Pongo pygmae et Macaca mulatta). De
nombreux groupes contiennent en effet un ou plusieurs paralogues, et ce pour une ou
plusieurs des espèces. Ces paralogues, issus de duplications apparues sur différentes branches
de l’arbre phylogénétique des espèces considérées, sont susceptibles d’avoir été soumis à des
pressions de sélections différentielles. Notre but étant ultimement d’analyser les forces de
sélections qui s’appliquent sur les microsatellites codants, nous avons restreint notre jeu de
données à 6888 alignements d’orthologues présents en copies uniques dans chaque génome.
Ces alignements contenaient des régions non-homologues, notamment du fait de l’inclusion
d’exons dans certaines séquences qui n’étaient pas annotées dans les gènes des autres espèces.
Nous avons donc filtré ces alignements sur la base de l’identité de séquences avec une
procédure adaptée.
90
Au sein des ces alignements, nous avons recherché l’ensemble des loci de microsatellites, en
recherchant les répétitions de motif d’une longueur de un à six nucléotides dans chaque
séquence individuelle, en utilisant les seuils d’instabilité précédemment décrits (Loire et al.
2009). Lorsque les coordonnées étaient recouvrantes, nous avons défini un locus comme
l’ensemble des bases contenues entre l’union de ces coordonnées.
Nous avons ensuite réalisé des comptages de mutations (substitution et insertion/déletion) sur
trois type de séquences : Les microsatellites formés de la répétition d’un motif d’une longueur
multiple de trois (3n-SSR), les autres types de microsatellites (!3n-SSR) et le reste des
séquences codantes. La concaténation de l’ensemble de ces loci a été utilisée pour estimer la
divergence génétique au sein du phylum des primates pour chacun de ces types de séquences
séparément.
Pour chaque groupe d’orthologues, les séquences ancestrales ont été reconstruites en utilisant
le programme codeml (Yang 2007). Ces séquences nous ont permis d’orienter les mutations
au sein des loci de microsatellites codant, et ainsi de dénombrer les mutations créant ou
interrompant une répétition au sein de chaque branche (à l’exception la branche menant à M.
mulatta, qui sert de groupe externe).
Les probabilités d’observer ces patrons de mutations peuvent s’avérer complexes à calculer en
raison des événements de substitutions multiples et de l’absence de modèles rendant compte
de façon satisfaisante des événements d’insertion/déletion.
Nous avons donc décidé d’examiner plus particulièrement les répétitions de mononucléotides
d’une longueur exactement égale à 8 et pour lesquels au maximum un événement de
substitution est observé. Une répétition non interrompue est désignée comme un mono-8.
Lorsqu’une substitution interrompt la répétition, on parle alors de proto-SSR. Nous avons
91
évalué le rapport attendu entre nombre mono-8 et nombre de proto-8 en estimant le taux de
mutation de l’un vers l’autre et considérant un état d’équilibre, puis l’avons comparé au
rapport observé dans l’ensemble des séquences codantes du génome humain. Pour rendre
compte de la différence entre ces rapports, nous avons utilisé un modèle de
mutation/sélection/dérive, en suivant les travaux de Bulmer (Bulmer 1991). Le principe est de
considérer que chaque locus est indépendant, et a deux allèles possibles : proto- et mono-8. La
fréquence p des mono-8 à un locus dans la population est estimée à partir de la fréquence des
mono-8 à chaque locus dans le génome.
Les proto-8 sont considérés comme neutres, et les mono-8 comme sélectionnés négativement.
Le coefficient de sélection s’obtient en dérivant les équations classiques de génétique des
populations (Rice 2004; Hartl and Clark 2006).
Enfin les valeurs p, fréquence de l’allèle mono-8, ont été estimé pour chaque groupe
fonctionnel défini par Gene Ontology (Ashburner et al. 2000). Les groupes fonctionnels pour
lesquels la valeur de p s’écarte significativement de la valeur moyenne ont été identifié à
l’aide d’un test basé sur des distributions binomiales ayant comme paramètre la valeur
moyenne de p et le nombre de loci présents dans chaque groupe fonctionnel.
92
93
2.1. Article (en préparation)
94
Evolution of coding microsatellites
in primate genomes.
Etienne Loire
a,b, Dominique Higuet
a, Pierre Netter
a and Guillaume Achaz
a,b
a: UMR 7138, Systématique, Adaptation, Evolution (UPMC, CNRS, MNHN,
IRD). 4, place Jussieu. 75005 PARIS
b: Atelier de Bioinformatique (UPMC). 4, place Jussieu. 75005 PARIS
Keywords: SSR, Microsatellites, Phylogeny, Primate genomes
Running head: coding microsatellites in primates
Corresponding author:
Etienne Loire
BP 1202
75252 paris Cedex 05
tel : 33 1 44 27 68 91
fax: 33 1 44 27 63 12
95
Abstract
Microsatellites (SSR) are typically avoided in coding sequences because of their
deleterious potential. Indeed, an insertion or a deletion event in any coding SSR, which unit
size is not a multiple of 3, induces a frameshift in the hosting gene. Here we study the
evolution of coding SSR in a phylogenetic context using four primate genomes: human,
chimpanzee, orangutan and macaque. In our set of 6,888 orthologous genes unambiguously
aligned among the four species, we show that, except for tri- and hexa-SSR in which
insertions and deletions are frequently observed, coding SSR evolves mainly through
substitutions. We show that the rate of substitution in coding SSR is typically two times
higher than in the rest of the coding sequences. Furthermore, although numerous coding SSR
are created and lost in the lineages, their numbers remains constant. This last observation
suggests that the coding SSR have reached equilibrium. We hypothesize that this equilibrium
involves a combination of mutation, drift and selection. We then estimated the average
selective cost of a mono-SSR of 8bp and show that its fitness impact is only moderate.
Although coding mono-SSR of 8 units are only slightly deleterious, their fitness impact
greatly varies from function to function, suggesting that the strength of the selection that acts
to remove them from the sequence can be tuned by gene functions.
96
Introduction
Any genome from any organism is filled with rerepepetitive sequences of low-
complexity. One of the most encountered low-complexity sequences is the microsatellite, also
known as SSR -Simple Sequence Repeat-. An SSR is a small motif, which size ranges from 1
to 6 bp, that is repeated in tandem. The most striking feature of an SSR is its very high rate of
mutation. Although, some results indirectly suggest that the substitution rate may be increased
in SSR (Shankar et al. 2007; Pumpernik, Oblak, and Borstnik 2008), it is well established that
SSR exhibit a very high insertion/deletion rate (Levinson and Gutman 1987; Schlotterer and
Tautz 1992; Tautz 1994). A typical insertion/deletion event will add/remove one unit,
however one can observe changes of several units (Henderson and Petes 1992). In that regard,
SSR can be regarded as mutational hot spots.
Whenever a SSR is hosted by a coding sequence, any insertion or deletion event
would alter the amino-acid sequence. When the unit size is a multiple of 3, it would add or
remove one (or several) amino acid. On the contrary, when the unit size is not a multiple of 3,
an insertion or a deletion event induces a frameshift that results typically in a premature
STOP codon. The resulting messenger RNA is then degraded by the Non-sense Mediated
Decay pathway (Ruiz-Echevarria, Gonzalez, and Peltz 1998), which prevents abnormal
transcripts to be translated. A gene with a frameshift can be therefore assimilated to a null
allele for the gene (i.e. a pseudogene).
This implies that SSR are potentially harmful in coding sequence because of their high
propensity to turn a wild type allele into a null allele. Indeed, the probability that an SSR is
targeted by a mutation is several orders of magnitude higher than a reference locus: the
insertion/deletion rate in an SSR ranges from 10-6 to 10-2 per replication (Schlotterer 2000),
whereas the average substitution rate is, in mammals, 10-10 per site per replication (Drake
1999). Scaled at a gene size (e.g. 1kb for the sake of the argument), the none-sense
substitution rate can be approximated to 3/64*1000*10-10=5*10-9 per replication. Therefore,
the presence of a single SSR in a coding sequence enhances, by several order of magnitude,
the probability of being targeted by a non-sense mutation.
Obviously, each SSR locus exhibits its own instability --its propensity of being
targeted by an insertion or a deletion event--. Several factors including, for example, the
97
species genome in which the locus is hosted (Toth, Gaspari, and Jurka 2000), the composition
of the repeated motif (Jurka and Pethiyagoda 1995) can greatly modulate the mutability of a
given SSR. However, the best predictor of the SSR mutability is its number of repeated units
(Lai and Sun 2003; Kelkar et al. 2008). Indeed, it seems that the mutability m, is a geometric
function of the number of repeated units n. This can be mathematically expressed as
!
m" pn
(de Wachter 1981; Cox and Mirkin 1997; Metzgar, Bytof, and Wills 2000). This suggests that
there is an independent probability p for each unit to be targeted by an insertion or a deletion
event.
The mutability of a locus will become important enough only when the number of
units reached a minimum. Based on the literature, we previously decided to set this minimum
at 8 units for the mono-nucleotides SSR (mono-SSR), 5 units for the di-SSR, 4 units for the
tri-SSR and 4 units for the tetra-SSR. An extensive discussion about this particular choice can
be viewed in Loire et al. ((Loire et al. 2009)) and will not be further address here.
We would like to emphasize that coding SSR not only carry a long-term impact on
fitness but also, and maybe more importantly, show an immediate fitness cost at each
generation. Indeed the coding SSR can be the target of an insertion or a deletion event in the
germline (long-term cost) but also in the somatic cell lines (immediate cost). Examples of
such generational consequence of hosting a coding SSR are their implication in several tumor
genesis ((Zienolddiny et al. 1999; Vassileva et al. 2002; Yamada et al. 2002; Duval and
Hamelin 2003)). Furthermore, this instability plays also an important during transcription
where an SSR loci will induce several abnormal transcripts with an altered number of units
(Jacques and Kolakofsky 1991; Fabre, Dujon, and Richard 2002). Last but not least, it has
been shown that transcription enhances the genomic rate of insertion and deletion in SSR
((Lin, Dion, and Wilson 2006).
These observations suggest that SSR have an extremely harmful potential in coding
sequence when their unit size is not a multiple of 3. In accordance, several previous studies
found less SSR than expected by chance in coding sequences ((Metzgar, Bytof, and Wills
2000; Ackermann and Chao 2006; Loire et al. 2009)). At least two classes of models give
expectations for the number of SSR within a gene. A first approach is to take the frequency of
each nucleotide into account and to predict what would be the probability of finding an SSR
of a given size in a gene ((de Wachter 1981; Metzgar, Bytof, and Wills 2000; Loire et al.
2009). Improvements that takes frequencies of overlapping di- or tri-nucleotide frequencies
can be obtained analytically ((Robin, Rodolphe, and Schbath 2005)) or by simulation but does
98
not alter the results (Loire unpublished results). Another methodological approach is to
consider the amino-acid sequence as given. In that respect, one can compute, on this sequence
and on a given codon usage, an expected number of SSR. This second approach corrects for
any over- or under-representation of tracts of lysine (that can be encoded by a poly-A),
phenylalanine (poly-T), proline (poly-C) or glycine (poly-G). For example, contrarily to what
intuition suggests, tracts of prolines are extremely common in proteins (Rubin et al. 2000).
Whatever is the chosen approach, results are quite clear: long enough SSR, which
units number is not a multiple of 3 (i.e. neither tri-SSR nor hexa-SSR), are fewer and/or
smaller than expected in coding sequences. This unambiguously shows that SSR are typically
avoided in coding sequences; this observation fits a model in which coding SSR are
associated with a negative selective coefficient. An analysis of the human genome show that
this results can be extended to almost all functional categories ((Loire et al. 2009)) as defined
by Gene Ontology annotations (Ashburner et al. 2000).
Importantly our previous results ((Loire et al. 2009)) do not support the hypothesis
under which the coding SSR of the mismatch repair system can be selected for as modulators
of the genome mutation rate ((Chang et al. 2001; Li et al. 2004)). These so-called modulators
are reminiscent of bacterial mutators, which importance in evolutionary process has been
emphasized ((Taddei et al. 1997)). However, theory clearly shows that mutators cannot
increase in frequency whenever the mutator locus is genetically independent from the
beneficial mutations it generates ((Ninio 1991; Rosenberg, Thulin, and Harris 1998; Tenaillon
et al. 2000)) --as it would be the case of a mutator in a diploid sexual organism--. However,
this does not rule out that positive selection can favor null alleles in genes, as long as the
benefit is bounded to the null allele. Also, it does not exclude that the strength of the purifying
selection that acts against coding SSR varies from gene to gene, some showing more relaxed
selection than others.
Here, using comparative genomics, we depict the dynamic of coding SSR in four
genomes of the primate lineages: human (Homo sapiens), chimpanzee (Pan troglodytes),
orang-utan (Pongo pygmaeus) and macaque (Macaca mulatta). We show that, even though
many coding SSR appear and disappear through substitutions, their number in the coding
sequences remains constant. This suggests that their abundance results from a balance
between mutation, selection and drift. Using two alternate models, we propose estimates of
the selective cost of mono-SSR of 8bp.
99
Material and Methods
DATASET
Alignments of orthologs from human (H. sapiens), chimpanzee (P. troglodytes),
orang-Utan (P. pygmaeus) and macaque (M. mulatta) were retrieved from the Homolens
database (Penel et al. 2009). Primary alignments were performed with protein sequences and
were then back-translated into coding sequences (CDS) alignments using pal2nal ((Suyama,
Torrents, and Bork 2006)).
When more than one transcript were reported for a gene, only the largest was kept. We
devised a method to exclude regions of the alignment that exhibit a high divergence in at least
one sequence. Visual inspection of these regions shows that typically one sequence is very
divergent and therefore obviously not homologous to the other ones. This may be due to
either different splicing variants or incorrect annotations of the exons. Anyway, these regions
have to be excluded from the alignments. To set the boundaries of the regions that have to be
excluded, we computed, for each CDS alignment, a cumulative score that starts at the 5’ of
the CDS. The score is increased by +1 when the four sequences were identical, and decreased
by -1 otherwise. Because the four primate genomes are highly similar, the cumulative score
typically increases when the regions are homologous and decreases when at least one of the
four sequences differs from the other (Figure 1). The regions with a decreasing cumulative
score were then discarded if their length was more than 30 nucleotides. Filtered alignments
were checked manually for accuracy.
Ancestral sequences were reconstructed using codeml (Yang 2007), which parameters
were set to: seqtype = codons, NSsites = 0 and ncatG = 4. All ancestral sequences show a
posterior probability above 0.8.
The evolutionary distance between the species sequence were computed using an
HKY model (Hasegawa, Kishino, and Yano 1985) along with a gamma correction. Tree
reconstruction was done with neighbor joining (Saitou and Nei 1987) using tree-puzzle
(Schmidt et al. 2002).
ESTIMATION OF THE SELECTION COEFFICIENT
To compute an estimate of the coefficient of selection (s) associated with a coding
SSR, we use a two-alleles model. For that purpose, we focused on mono-8 (mono-SSR of
8bp) along with the sequences that can be turned into a mono-8 by a single substitution. These
later sequences will be named hereafter proto-8. In the following, S represents the SSR allele
and P the paired proto-SSR alleles. Any of the two alleles can be changed into the other one
100
by a single substitution. Following Bulmer (Bulmer 1991), we estimated the average
coefficient of selection associated with the S allele under two different models.
Model 1: Infinite population size
In the first model, the population size is infinite and all SSR evolve identically but
independently. This corresponds to a case where all S alleles have the same selection
coefficient (s) and where free recombination occurs between loci. At each locus, the
frequency p of the S allele is the same and consequently, a single genome has an expected
fraction of loci with an S allele equal to p. p is predicted by a mutation-selection equilibrium.
If we define µ as the substitution rate per site, a P allele mutates in an S allele at a rate aµ;
reciprocally an S allele mutates to a P allele at a rate dµ. Please note that “a” stands for
apparition (of the SSR) and “d” for disappearance. The fitness function is wP/P = 1, wP/S = 1-
hs, wS/S = 1-s. Following standard derivations (e.g. (Hartl and Clark 2006)), the frequency
after one generation of random mating is:
!
pt+1 =[pt
2+ pt (1" pt )(1" hs)](1" dµ) + [pt (1" pt )(1" hs) + (1" pt )
2]
pt2
+ 2pt (1" pt )(1" hs) + (1" pt )2
At equilibrium (
!
pt+1 = pt ), when
!
µ << p , we have:
!
s ~ µa " p(a + d)
p(1" p)[p + h(1" 2p)] (1)
Model 2: Finite population size
In the second model (Bulmer 1991), the population size, N, is finite and small enough
so that any polymorphic state is only transient. At each locus one of the two alleles is fixed
and a fraction p of the loci is fixed for the S allele. When a new mutant is generated, it has a
probability !(") to be fixed, with " = 2Nes. Providing that the fitness function is, as in the
previous model, 1:(1-hs):(1-s) the probability of fixation can be approximated to
!
"(#) = h# /N(1$ e$2h#) , if h ! 0 (Rice 2004). The number of P allele loci that mutate to an S
allele and become fixed is N(1-p)aµ!(-"). Reciprocally, the number of S allele loci that
mutate to a P allele and become fixed is Npdµ!("). At equilibrium, these two numbers are
equal, which leads to:
!
" =1
2hln(1# P)
P
a
d
$
% & '
( ) (2)
101
FUNCTIONAL ANALYSIS
GO-terms associated with human genes were downloaded from Ensembl database
(http://www.ensembl.org/index.html). We have estimated that among all mono-8 (S allele)
and proto-8 (P allele), the frequency of S alleles is p. Most genes of the human genome are
annotated by one or several Gene-Ontology terms (GO terms). Using the structure of the
ontology, we collected for each gene all the GO-terms that are parent of the annotated ones
and add them to the gene annotation. Then, for each GO-term, we tested whether, among the
set of genes that are annotated by the GO-term under consideration can be assimilated to a
random sample of genes. For that purpose, we computed the probability that, given n the
number of loci (loci with both P and S alleles) in the set of gene, we observed at least this
number of S alleles. The probability was computed using a cumulative Binomial of
parameters p and n.
We perform our tests level by level to compare comparable terms. Here, we defined
the level of a term as the number of nodes that exists between this term and the root of the
graph (level 0). In the cases of multiple paths, we keep the shortest one. For each level of the
ontology, we performed one test per term. To correct for multiple tests, we considered that
terms lying at the same level of the ontology were independent and therefore can be corrected
using the Bonferroni correction. On the contrary, we considered that tests between levels were
fully dependant since they use the same annotations but with different accuracies.
Results
We analyzed 6,888 alignments of orthologs from human, chimpanzee, orang-utan and
macaque that represents 11,085,687 sites.
We define an SSR as a tandem exact repeat (no gap, no mismatch) of a unit, which
size ranges from 1 to 6bp. The minimum number of repeated units differs for each type of
SSR. We selected the following minima: mono-SSR must have "8 units, di-SSR "5 units and
tri- , tetra-, penta- and hexa-SSR "4 units. The union of all sites spanned by an homologous
SSR in the different species defines an SSR locus. As a consequence, a mono-SSR locus is a
section of the alignment of 8 sites or more. Accordingly, we found 525 mono-SSR loci (40.3
% of all SSR loci), 238 di-SSR loci (18.3 %), 378 tri-SSR loci (29 %), 58 tetra-SSR loci (4.5
%), no penta-SSR loci (0%) and 102 hexa-SSR loci (7.8 %). In total, it sums to 1,301 SSR
loci, hosted by 1,112 genes, which span 20,523 sites (0.122 % of all sites).
102
CODING SSR DIVERGE FASTER THAN THE REST OF THE CODING SEQUENCE
We split the sites of the alignments between three classes. The first class encompasses
all tri- and hexa-SSR loci. We analyzed these SSR on their own because an insertion or a
deletion of one unit does not alter the reading frame and is therefore more likely to be
observed. The second class contains mono-, di-, and tetra-SSR loci. The last one is composed
of all the rest of the coding sequences. For each class, we counted the number of sites that
contain at least 1 substitution or at least 1 gap.
Results (Table 1) clearly show that, for the tri- and hexa-SSR, there are as many sites
with gaps than with substitutions. For the two other classes, there are about ten times less sites
with gaps than with substitution. This has to be interpreted as a consequence of the
frameshifts produced when the length of an insertion/deletion event is not a multiple of 3.
Results also show that SSR sequences diverge two times faster than does the rest of
the coding sequence. A distance tree, based on substitution only, show a concordant pattern
among all lineages (Figure 2). From this, it is clear that, in all lineages, the substitution rate is
about two times higher in SSR than in the rest of the coding sequences.
THE NUMBER OF CODING SSR IS AT EQUILIBRIUM.
In order to test whether there was a tendency to loose or gain coding SSR in the
different primate lineages, we reconstructed the ancestral sequences of the human-
chimpanzee ancestor as well as the human-chimpanzee-orangutan ancestor and catalogued all
SSR loci within the 6 genomes. In figure 3, we report the number of coding SSR in each of
the 6 genomes along with the number of gain and loss in each branch. These latter numbers
were computed by comparing the state of each SSR loci in each genome (presence or absence
of the SSR allele). Because the ancestral state of the root is unknown, we cannot sort apart
gains and losses in the macaque lineage.
Results show that there are as many creations than losses in the primate lineages. It
also shows that the number of SSR is similar in all genomes, suggesting that the number of
SSR results from an equilibrium between gains and losses. Indeed, the number of gains is not
statistically different losses in mono-SSR (91 vs 73), di-SSR (44 vs 36) or in all SSR pooled
together (200 vs 228). However, we observe more losses (111) than gains (65) for tri-SSR (P
< 10-3 ; !2 test). With the exception of the tri-SSR, we can hypothesize that SSR have reached
103
an equilibrium where gains of new SSR balance with losses. To further investigate this
equilibrium, we decided to focus more specifically on the mono-SSR of exactly 8 units. These
sequences are 10bp long, since their edge cannot be of the same nucleotide than the SSR
itself. Complementarily, we also analyzed the related proto-SSR, which we define here as
sequences of 10bp that can be turned into a mono-SSR of 8 units by a single mutation. Please
note that we excluded from these proto-SSR all the mono-SSR of 9 or more units.
A mono-SSR of 8 units (hereafter an S allele) and a proto-SSR (hereafter a P allele)
are two alternative alleles for an SSR locus. Clearly other alleles can be observed for an SSR
locus, our focus will be only on S and P alleles. Because SSR are at equilibrium, other states
should not change the following reasoning. Although the P alleles are presumably neutral, the
S alleles are presumably negatively selected because of their intrinsic mutability//Loire, 2009
#385\\(Metzgar, Bytof, and Wills 2000; Ackermann and Chao 2006).
The numbers of loci with an S allele and with a P allele are reported on the nodes of a
cladogram (Figure 4). On the branches of the cladogram, we also report the number of
mutation from P to S (hereafter named “apparition”) and the reverse mutation (hereafter
named “disappearance”). It is important to clarify that many mutations other than apparition
or disappearance are expected to happen. As a consequence, the number of S and P allele loci
cannot be deduced from only counting the number of apparitions and disappearances and
from the ancestral state.
As for SSR in general, the total number of apparition (28) is not statistically different
from the number of disappearance (32) (!2 test). This shows that S and P alleles have reached
an equilibrium value in the primate lineages. There is, on average, 11,632 loci with a P allele
and 320 loci with an S allele. This translates into an average frequency of the S allele of
p = 0.027.
MUTATIONS ONLY CANNOT EXPLAIN THE DATA
A first model that should be tested is that pS simply results from the rates of apparition
and disappearance. In this model, we would expect the frequency of S to be µa/(µa+ µd), where
µa is the rate of apparition and µd the rate of disappearance. Because apparition and
disappearance are both substitutions they can be expressed as a function of µ, the average
substitution rate: µa = a µ and µd = d µ. In that respect the frequency of S is expected to be
a/(a+d).
Because for a given proto-SSR only a single substitution makes an apparition, we will
set a = 1/3. Even if one corrects for rates of transitions and transversions, this does not change
104
the average apparition rate as long as the average composition of P alleles is identical to the
one of S alleles (both being A: 0.72, T: 0.13, G: 0.05, C: 0.10). As for the disappearance, any
of the 8 nucleotides can be changed into any different nucleotide. We thus set d = 8. Given
this, we would expect under this “mutation only” model a frequency of the S allele of 0.04.
This is 1.47 higher than the observed frequency. We hypothesize that this difference is
explained by the selective advantage of the P allele over the S allele.
ESTIMATION OF THE FITNESS IMPACT OF S ALLELES.
Then, we considered models where the S alleles are underrepresented because their
fitness value is lower than the one from P alleles. In this model, both apparitions and
disappearances occur and selection acts against the S alleles. The expected frequency of the S
alleles then depends on the mutation rate and on the fitness function. Depending on the
assumption one is ready to make for the effective size of the populations, two alternative
models could be used to estimate the average fitness cost of the S alleles (Bulmer 1991). In
both models, there is the implicit assumption that the fitness cost associated with the S allele
is equal at every loci.
In the first model, the population size is assumed to be infinite and all SSR loci evolve
independently. In such a model, all loci are polymorphic and the frequency of the S alleles is
equal at each locus. The expected frequency is given by the mutation-selection equilibrium. In
this model, the fitness functions is as follow: wP/P = 1, wP/S = 1-hs, wS/S = 1-s. In the fitness of
the heterozygotes, h represents the degree of dominance of the S alleles. When h=0, the S
alleles are completely recessive and when h=1, it is completely dominant. Please note that we
used µ = 2.10-8 per generation (two times the average mutation rate in primates (Drake 1999)
and Ne=10,000, the estimated human effective size (Hill 1981). Results (Table 2) show that, if
the first model is correct, the selection coefficient associated with the S alleles is extremely
small. Scaled with the human effective population size, it remains much smaller than 1 unless
h~0. This would imply that the S alleles are effectively neutral unless they are completely
recessive. Even in this last case, the selective disadvantage remains small (" is still smaller
than 1).
In the second model, the population size is assumed to be finite enough, so that the
time in which a loci is polymorphic is very small. In this second model, the loci are all fixed
for one or the other allele. The proportion of the loci that are fixed for the S alleles results
from an equal number of fixation events in one way and in the other. The fixation
probabilities are given by standard diffusion results, which are not available for the case of
105
h ~ 0. Estimation of selective coefficients show that the fitness cost is small, in the order of 1.
Even though, no value are available for h ~ 0, one could imagine by comparing it to the model
1 that it would be around 8. This again suggests that mono-8 have a moderate impact on
fitness when compared to their counterpart (proto-8). In that regard, S alleles can be viewed as
slightly deleterious alleles.
FITNESS COST VARIES FROM FUNCTION TO FUNCTION
Although the average p can be computed for all mono-8/proto-8 loci, we wanted to
further tests if some functional groups (as define by Gene Ontology annotations) show more
or less selective constraint than others. The frequency of S allele, computed among the 21,416
annotated human genes, is the same than in our restricted set of orthologous genes (i.e. p =
0.027). Therefore, we tested, for each functional category, as defined by a GO-term, whether
the observed number of S alleles is significantly over or under the expectation.
Results are given in supplementary table 1. As one could expect, some functional
groups of genes (development related genes) show less S alleles than expected while others
show a significant enrichment (genes involved in DNA maintenance, cell death and lipid
degradation). It is tempting to hypothesize that a deprivation in S alleles is a consequence a
stronger purifying selection against the S alleles whereas enrichment suggest a relaxed
purifying selection.
Discussion
In this study, we have investigated the evolution of coding SSR in phylogenetic
framework. This strategy revealed several interesting features of the evolutionary dynamics of
coding SSR in the primate lineages.
First, to our surprise, it shows that pre-computed alignments of orthologs that can be
retrieved from databases should be carefully checked, especially when several species are
included. This may be the consequence of several reasons, some being artefactual (e.g.
erroneous annotations of exons), others being biologically relevant (e.g. losses and gains of
exons though evolution). Whatever are the correct explanations, there is a need for checking
the homology of all sites in a given alignment. The method we proposed here is to trim out
the suspicious regions. In its current formulation, it can only be applied to closely related
genomes. However, one could think of obvious extensions, where the score would be
computed using matrices that measure degeneracy (DNA or protein score matrices) instead of
the currently used identity matrix.
106
We show that, except for tri- and hexa-SSR, the evolution of SSR in the primate
lineages occurs mostly by substitution. This has to be interpreted as the deleterious effect of
an insertion/deletion event in a coding sequence. Whenever the length of an insertion or a
deletion event is not a multiple of 3 (as it would be for tri- and hexa-SSR), it generates a null
allele for the gene. As a consequence, it is very likely that, even though insertion/deletion do
occur frequently, they are filtered out by selection. Inspection of polymorphisms among
population may help confirming this hypothesis.
This study shows that coding SSR are often created and lost in the course of evolution.
Interestingly, their absolute numbers remain constant in the different lineage. This strongly
supports that coding SSR have reached equilibrium. It is possible that the tri-SSR are an
exception in the primate lineage (more losses than creation are observed). However, the
codeml software, used to reconstruct the ancestral states, set the ancestral codon to AAA
when it cannot reach a decision. We therefore suspect that the enrichment in tri-SSR in
ancestral states may be an artifact of the reconstruction.
Because mono-SSR have reached an equilibrium in the lineages we analyzed, we
made an attempt to estimate the fitness cost (s) associated with a mono-8 SSR (S allele) when
compared to a proto-8 sequence (P allele). We show that under a simple mutation model, we
would expect 1.5 more S alleles than observed. Because the total number of mono-8/proto-8
loci are so large, we assume that this difference cannot be caused by sampling. In the light of
previous studies (Metzgar, Bytof, and Wills 2000; Borstnik and Pumpernik 2002; Ackermann
and Chao 2006; Loire et al. 2009), we conclude that this difference is very likely due to the
purifying selection that acts to remove the SSR from the coding sequences. Therefore, using
two alternate models, we estimated the selective cost of mono-8 as well as " = 2Nes, the
effective strength of selection. The first model (infinite population size) suggests that the
fitness cost of such an allele can be neglected unless it is completely recessive whereas the
second one (finite population) suggests that S alleles are slightly deleterious (the more
recessive the more deleterious). Because mono-SSR are underrepresented in coding sequence
and because we think that the primate populations are far from being infinitely large, we
favour the hypothesis under which mono-8 are slightly deleterious when compared to proto-8.
The strength of selection that acts to remove mono-SSR from coding sequence is very
likely to vary from gene to gene and even from function to function. Many factors will
influence the fitness cost of a mono-8. Some factors will be a consequence of the SSR
structure itself (e.g. its composition (Jurka and Pethiyagoda 1995)) or of its genomic
107
environment (Li et al. 2002). Others will be related to the gene that host the SSR. The
transcriptional activity of the gene is one obvious factor (Fabre, Dujon, and Richard 2002);
another one could the class of function of the gene. To address this last point, we analyzed all
functions defined by Gene Ontology annotations that are annotated in the human genome. We
show that among all these functions, a set of functions show less proto-8 than expected, which
are part of the developmental process. It is tempting to postulate that these genes are under
strong purifying selection because of the strong impact early mutations in the somatic line
may have. However, the analysis of the exact nature of the factors that explain the range of
the selective cost deserves an entire study. Here we emphasized that the estimate of the
selective coefficient we report here is only an average and that many factors will influence its
value. The exact nature of what factors are the most important on the fitness cost of coding
SSR remains to be unraveled.
Finally, one of the most unexpected results from this study is the accelerated
substitution rate in coding SSR when compared to the rest of the coding sequence. This
accelerated substitution rate may be the consequence of either a higher mutation rate or a
higher fixation rate. In the light of the observation that repetitive sequences seem to show an
accelerated evolution in non-coding regions (Pumpernik, Oblak, and Borstnik 2008), we tend
to favor the first hypothesis. Indeed, it is possible that SSR are epigenetically modified (Libby
et al. 2008), which would then change their intrinsic mutation rate. However, although the
accelerated substitution rate is a robust observation, the proposed explanation remains, at this
stage, only hypothetical.
Acknowledgments
We would like to thank xxx for constructive comments on the manuscript. We would
also like to thank B Boeda for pointing to us the unexpected abundance of poly-proline in
protein sequences.
108
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111
TABLES
TABLE 1
Sequence type Number of sites with "1 substitution with "1 gap
3-SSR + 6-SSR 11,869 1,028 (8.6%) 1,042 (8.7%)
Other SSR 8,654 718 (8.3%) 66 (0.7%)
Rest of the coding
sequence
11,073,128 449,776 (4.1%) 23,222 (0.2%)
Table 1: Fraction of sites spanned by substitutions and gaps
3-SSR and 6-SSR were analyzed independently from the other SSR because insertion-
deletion in these SSR does not alter the reading frame. Both types of SSR diverge two times
faster than the rest of the coding sequences.
TABLE 2
Model 1
(selection and mutation)
Model 2
(selection, mutation and drift)
h s " = 2Nes " s = " /(2Ne)
0 3.0 10-6 0.12 ? ?
0.1 6.8 10-7 0.03 2.03 5.1 10-5
0.5 1.6 10-7 0.006 0.40 1.0 10-5
1 8.5 10-8 0.003 0.20 5.1 10-6
Table 2: Estimation of the fitness cost of a 1-SSR of 8 units
In the first model, population is assumed to be infinite. In such a case, drift is neglected and
the coefficient of selection s is computed using equation 1. In the second model, population is
finite and " is computed under the equilibrium between selection, mutation and drift using
equation 2. The following values were used in the equations: a = 1/3, d = 8, µ = 2.10-8, p =
0.027, Ne = 2.104.
112
FIGURES
Figure 1: Exemple of alignement filtering.
Cumulative core was sequentially calculated along alignment with +1 for identity and -1 for
mismatch. The regions with a decreasing cumulative score were discarded if their length was
at least 30 nucleotides
113
Figure 2: Genetic distance estimated on non-repeated coding sequence and on coding
SSR.
Distances were computed on the concatenated alignments of coding SSR on one hand and on
the rest of the coding sequence in the other. Distance were computed using an HKY model
and a Gamma Law by TreePuzzle and the tree was constructed using neighbour joining.
Branches length of coding SSR exhibit a two-fold increase when compared to the rest of the
coding sequences.
114
Figure 3: Distribution of SSR loci among primate lineage.
The evolution of SSR loci are represented on a cladogram of the four primate lineages. The
number of loci are figured on nodes, while gains (+) and losses (-) are figured on the
branches. We report counts for mono-, di- and tri-SSR are given as well as all SRR pooled.
Because the genome at the root cannot be reconstructed, gains and losses cannot be sorted
apart in the macaque lineage. Except for tri-SSR, the number of gain and loss SSR is not
different among species (c2 test). For tri-SSR, there is a significant difference between gain
(+65) and loss (-111) (P < 10-3 ; !2 test) Therefore, one can conclude that, except for tri-SSR,
the number of SSR loci has reached equilibrium in all branches.
115
Figure 4: Dynamics of S and P alleles.
At each node, are reported the numbers of S alleles (mono-SSR of size 8) in the smaller dark
disc and the number of P alleles (a sequence that can be turned into a mono-8 by a single
substitution) in the larger clearer disc. In the branches, are reported the number of apparition
(number of P alleles that were turned into a S alleles) and the number of disappearance. The
total number of apparition (28) and disappearance (32) do not differ significantly (!2 test)
suggesting that the dynamics is at equilibrium.
116
2.2. Résumé des résultats et discussion
L’étude des patrons de mutations au sein des microsatellites codants révèlent des différences
importantes selon que l’on considèrent les 3n-SSSR ou les !3n-SSR. Alors que les premiers
présentent fréquemment des insertions ou des délétions, les !3n-SSR évoluent essentiellement
par substitution. Ces !3n-SSR également soumis aux mutations de type expansion/contraction,
ceci peut donc s’interpréter comme une conséquence de l’impact important des insertions ou
des délétions de ce type de motif sur les phases codantes des gènes qui aboutit à la disparition
par sélection des gènes dans lesquels ces événements se produisent.
Nos résultats indiquent également que les SSR, toutes classes confondues, apparaissent et
disparaissent dans chacune des lignées étudiées à un rythme constant. Ceci suggère que bien
que ces créations et disparitions sont quantitativement nombreuses, les effectifs restent à un
équilibre constant dans toutes les branches. Un biais est possibles pour ce qui est des
répétitions de triplets qui semblent plus abondants dans les séquences ancestrales. Nous
soupçonnons un artefact créé par la méthode de reconstruction.
Le fait que les distributions de répétitions de mononucléotides semblent avoir atteint un
équilibre nous a permis de montrer que :
1) En considérant un modèle de mutation simple qui permet de passer d’un mono-8 à un
proto-8 (son équivalent stabilisé par une interruption), on peut estimer que le rapport
mono-8/proto-8 attendu est de 1/24. Le rapport observé est en fait de 1/35. La
fréquence de proto-8 est donc une fois et demi plus importante qu’attendue. Cette
117
observation suggère que les mono-8 sont soumis à une sélection négative qui tend à
les purger hors des séquences codantes. Cette conclusion, qui est cohérente avec les
résultats antérieurs (Metzgar, Bytof, and Wills 2000; Borstnik and Pumpernik 2002;
Ackermann and Chao 2006; Loire et al. 2009), est conditionnée par le modèle
mutationnel utilisé. Toutefois ce dernier est robuste à un certain nombre de biais de
mutation, car les mono-8 et les proto-8 sont de composition quasi-identique.
2) En utilisant un premier modèle de mutation/sélection, nous avons pu estimer un
coefficient de sélection s’appliquant aux mono-8. Ce dernier, et surtout la valeur
"=2Nes – force efficace de sélection – se révèle négligeable sauf à considérer un
impact nul des mono-8 à l’état hétérozygote (récessivité complète). En utilisant un
modèle plus réaliste incluant les effets de la dérive (population de taille finie), les
mono-8 sont légèrement délétères (et ce d’autant plus que ces dernières sont
récessives).
3) En segmentant les gènes par groupe fonctionnel, nous avons pu mettre en évidence
que la fréquence des allèles mono-8 varie selon ces groupes, avec certaines fonctions
présentant moins de mono-8 qu’attendus par rapport à la moyenne, avec notamment
les gènes liés au processus de développement. Cette sous-représentation pourrait être
liée à une plus forte sélection en faveur de la robustesse des gènes, mais d’autres biais
affectant la mutabilité des microsatellites pourrait être évoqués, comme par exemple le
niveau de transcription des gènes.
Enfin, un autre résultat de notre analyse est la mise en évidence de l’accélération du taux de
substitution au sein des microsatellites codants vis-à-vis de celui du reste des séquences
codantes. Cette accélération, déjà notée par Pumpernik et coll (Pumpernik, Oblak, and
118
Borstnik 2008) suggèrent que les microsatellites sont des hot-spots de mutation par
insertion/déletion mais aussi, dans une moindre mesure, en terme de substitution. Les origines
de cette observation restent à élucider. Un effet de la sélection qui retiendrait les mutations
stabilisant les microsatellites codants pourrait être invoqué, mais la précédente étude a été
réalisée sur des régions codantes et laisse donc suggérer que cette observation est liée à une
augmentation du taux de mutation par substitutions aux niveau de ces séquences.
119
3) Impact du système NMD sur la
progression des cancers colorectaux
Dans le cadre de leurs travaux sur les cancers colorectaux présentant un phénotype
d’instabilité des microsatellites, l’équipe d’Alex Duval (INSERM, UMR S893, Team 13
“Microsatellite Instability and Cancers”) s’est intéressé à l’impact du système NMD sur la
réponse immunitaire anti-tumorale. Leurs travaux étaient motivés par les observations
suivantes.
- Le phénotype MSI est en général conféré par la perte de fonction d’un ou plusieurs gènes du
système de réparation des mésappariement. Cette perte de fonction entraîne une augmentation
drastique du taux de mutation apparent des microsatellites. De ce fait, les gènes qui
contiennent un microsatellite codants sont susceptibles de présenter une mutation non-sens, et
des transcrits présentant un codon stop prématuré (PTC) s’accumulent.
- Un des rôles du système NMD est justement de catalyser la dégradation des transcrits
présentant un PTC afin de limiter la production de protéines tronquées (Sken et Maquat,
2007).
- Ces proteines tronquées seraient à même d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale
qui permet de juguler la progression des cancers (Saeterdal et al, 2001; Ishikawa et al, 2003).
L’expérience a consisté à inactiver in vivo le fonctionnement du système NMD (en utilisant
un système de type si-RNA visant le gène UPF1, acteur majeur de ce système), puis à
surveiller l’activité transcriptionnelle des cellules à l’aide de puce à ADN.
120
Notre collaboration à ce projet a été de produire la liste exhaustive des gènes qui, chez
l’homme, contiennent un microsatellites instables –selon la méthode précédemment décrites
(Loire et al, 2008) et sont de ce fait susceptible de subir un déphasage du cadre de lecture.
Parmi les transcrits surexprimés lors d’une inactivation du gène UPF1, nous avons montré
qu’il existe sur-représention de ceux qui sont produits à partir des gènes présents dans cette
liste. Les gènes contenant une répétition de mononucléotides instable représentent 6% du
nombre total de gènes chez H. sapiens et 38% des 1215 gènes dont la quantité de transcrit
était augmentée dans l’expérience (Test exact de Fisher, p < 2.10-16).
Cette étude a ainsi mis en évidence le fait que le système NMD, s’il permet d’éviter au
cellules non-tumorales de subir le coût de la production de protéines tronquées, peut
potentiellement avoir un impact négatif sur la possibilité de juguler la progression des cancers
MSI grâce à une forme d’immunité anti-tumorale induite par ces même protéines tronquées.
121
Discussion
122
1. Résumé des résultats
Le corpus de connaissances nouvelles obtenues lors de nos travaux peut être présenté de façon
concise :
Des différences significatives existent quant à l’intensité de la sélection qui s’exerce à
l’encontre des microsatellites codants selon la fonction des gènes concernés. La sélection en
faveur de la robustesse n’est donc pas une constante mais peut être plus ou mois relaxée selon
les groupes fonctionnels considérés.
Des modèles dérivés de l’étude d’un locus dans une population, appliqués à l’ensemble des
loci d’un même type au sein d’un seul génome permettent de quantifier la force de la sélection
s’exerçant sur les microsatellites codants. La mesure de cette sélection est très dépendante des
hypothèses faites par les modèles.
Comparés aux régions non répétés de séquences codantes, les microsatellites codants
accumulent deux fois plus de substitutions nucléotidiques, que ces substitutions créent où
interrompent ces répétitions.
Ces trois points me semblent mériter une discussion, et certaines études complémentaires
peuvent êtres envisagés pour répondre aux questions soulevées par ces travaux. Je
m’efforcerai donc de présenter ces quelques éléments de réflexion dans les paragraphes
suivants.
123
2. Les groupes fonctionnels de gènes ne
sont pas égaux devant les microsatellites
codants
Il a été avancé que les gènes impliqués dans le système de réparation des mésappariements
(MMR) sont enrichis en répétitions de mononucléotides codants (Chang et al. 2001).
L’examen attentif de l’ensemble des groupes fonctionnels montre que cette observation est en
fait parcellaire. En effet, le nombre et la nature des fonctions enrichies est plus large que ce
qui était avancé. D’une part, elles ne sont pas uniquement impliquées uniquement dans le
maintien de l’intégrité du génome (e.g. Métabolisme des biopolymère). D’autre part
l’enrichissement en répétitions de mononucléotides codants des fonctions de réparation de
l’ADN et de contrôle du cycle cellulaire indique que le système de réparation des
mésappariement n’est qu’une partie des voies métaboliques impliquées dans le maintien de
l’intégrité du génome qui présentent une telle surreprésentation.
Cette observation est intéressante car les gènes qui contiennent une telle répétition sont
fréquemment inactivées dans un certains type de cancers présentant une instabilité des
microsatellite (Duval and Hamelin 2003). Nous apportons donc un argument statistique à un
enrichissement qui était suspecté.
D’autre part, un modèle prenant en compte la longueur et la composition nucléotidique des
séquences codantes pour estimer la probabilité de voir apparaître ces répétitions de
mononucléotides permet de mettre en évidence que ces répétitions sont plus abondantes dans
les gènes longs et biaisés dans leur composition en bases. Les gènes impliqués dans la
réparation de l’ADN et le contrôle du cycle cellulaire appartiennent justement à cette
124
catégorie. Il n’est donc pas nécessaire d’invoquer une forme de sélection positive de ces
répétitions de mononucléotides au sein de ces gènes pour rendre compte de leur présence.
Nous pourrions donc envisager la présence de ces répétitions comme résultant d’un équilibre
en une pression mutationnelle qui tend à créer ces répétitions et une sélection en faveur de la
robustesse de ces gènes. Cette sélection en faveur de la robustesse de ces gènes n’est peut-être
pas suffisante pour purger ces répétitions car l’impact négatif que la perte de ces gènes peut
avoir sur l’individu se manifeste après l’age de la reproduction.
Cette conclusion remet en cause le modèle de mutateur eucaryote qui a été proposé (Chang et
al. 2001; Kashi and King 2006). Ce modèle postule que les microsatellites contenus dans les
séquences codantes des gènes du MMR sont retenus par la sélection car l’instabilité qu’ils
confèrent à ces gènes permet d’augmenter ponctuellement le taux de mutation global du
génome. Cette augmentation du taux de mutation ponctuelle permet alors de générer de la
variabilité génétique et potentiellement de nouvelles mutations bénéfiques aux individus qui
les portent. Ceci impliquerait une sélection conjointe des modificateurs du taux de mutations
(les microsatellites au sein des gènes du MMR) et des mutations bénéfiques générées. Ceci est
possible lorsque les modificateurs (ou mutateurs) sont liés génétiquement avec les mutations
bénéfiques générées chez l’individu. Il faut toutefois noter que, chez les eucaryotes sexués, la
liaison génétique décroît à chaque génération par le biais de la recombinaison méiotique. De
ce fait, nos résultats vont à l’encontre de l’hypothèse de mutateurs eucaryotes, mais cette
dernière souffrait déjà d’une contradiction mécanistique. Notons toutefois que nous
n’excluons pas l’hypothèse qu’une sélection des microsatellites pour leur mutabilité soit
possible. Mais cette sélection ne peut agir que si la mutation du microsatellite est bénéfique
niveau local, par exemple pour les loci de contigences (Sniegowski and Murphy 2006; King
and Kashi 2007) où la variabilité créée par la variation des répétitions est directement
125
sélectionnée pour des raisons adaptatives. La liaison génétique est alors complète, et c’est une
élévation locale du taux de mutation qui est alors sélectionnée positivement.
Nos résultats sur l’abondance des répétitions de mono-nucléotides dans les régions codantes
suggèrent que la sélection négative de ces séquences est plus ou moins forte selon la fonction
du gène considéré. Nous avons vu que, contrairement à ce qui avait pu être avancé dans des
études précédentes, ce biais fonctionnel est du, au moins en partie, à un effet de composition
et de longueur des séquences codantes. Mais en utilisant ce même modèle pour estimer une
fraction attendue du nombre de gènes contenant une répétition de mononucléotide (appelés
hypermutables par la suite), et en la comparant à la fraction observée, des différences
significatives sont observées entre groupes fonctionnels. Si la majorité d’entre eux présente
des effectifs observés inférieurs à ceux qui sont attendus, d’autres présentent autant de gènes
hypermutables observés qu’attendus. Cette apparente neutralité suggère que dans ces groupes
fonctionnels, la sélection négative des microsatellites codants est relâchée. Incidemment, on
considère que la relaxation de la sélection contre les microsatellites codants peut être le reflet
d’une relaxation de la sélection pour la robustesse des gènes, ces premiers influençant
négativement cette dernière.
La relaxation de la sélection pour la robustesse d’un gène pourrait être influencée par son
essentialité. Difficile à évaluer, l’essentialité d’un gène peut être envisagée par l’impact de la
perte de sa fonction sur la valeur adaptive de l’individu chez qui cette perte intervient.
Dans le cas de familles de paralogues capables d’assurer – au moins partiellement - la même
fonction, la perte de l’un d’entre eux suite à la mutation d’un microsatellite codant aura un
impact moins fort sur la valeur adaptative. L’examen des familles de paralogues nous a
permis de démontrer que les groupes fonctionnels enrichis en microsatellites codants ne sont
126
pas ceux qui présentent une telle redondance génétique. Il faut toutefois admettre que notre
approche n’écarte pas définitivement cette hypothèse, car le critère de définition de la
redondance génétique est ici l’identité de séquence. Or, des séquences homologues sont
susceptibles d’assurer des fonctions différentes tout comme des fonctions identiques peuvent
être assurées par des gènes dont la séquence est très différente.
La perte de certains gènes qui sont connus pour être responsable de pathologies pourraient
également avoir un impact plus fort sur la valeur adaptative. Notre approche a consisté à
estimer l’essentialité des gènes en se basant sur leur présence dans la base de données OMIM.
Cette base de donnée rassemble des informations sur les gènes connus pour être impliqué
dans diverses pathologies. Cette approche n’a pas non plus permis d’expliquer les résultats
obtenus, car au contraire les groupes fonctionnels enrichis en répétitions de mononucléotides
contiennent un grand nombre de gènes qualifiables d’essentiel selon ce critère. Reconnaissont
toutefois que cette approche n’est pas aussi satisfaisante que si l’organisme choisi avait été un
de ceux pour lesquels l’essentialité des gènes est expérimentalement mesurable (e.g. S.
cerevisiae ou E. coli ).
Enfin, il est également important de préciser que considérer l’essentialité des gènes comme le
seul facteur susceptible d’influencer la sélection de la robustesse génétique de ces derniers est
réducteur.
La capacité à conserver une fonction malgré l’apparition de mutation est un des aspect de la
robustesse phénotypique, aussi appelée canalisation (Waddington 1942). La robustesse d’un
trait phénotypique dont le déterminisme génétique est multifactoriel peut être imaginée
comme résultant de la possibilité, au sein d’un réseau génétique, de perdre certains de ces
acteurs sans modifier visiblement le phénotype. Ainsi, l’essentialité de chaque gène est
127
conditionnée par le rôle que ce dernier joue au sein d’un réseau de gènes en interaction. Les
gènes les moins « essentiels » sont ceux dont l’absence au sein de ce réseau n’empêche pas ce
dernier de conférer à l’individu son phénotype. Les gènes qui présentent le plus de connexion
(aussi appelé « Hubs ») sont alors les plus indispensables au réseau. Des exemples sont
connus, par exemple le réseau de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (Levy
et Siegal, 2008). Une analyse détaillée des réseaux de gènes en interaction et de l’impact de
leur perte sur le trait phénotypique correspondant serait une des pistes permettant d’expliquer
nos observations.
Enfin, les choix que nous avons faits pour évaluer le taux de mutations des microsatellites
sont critiquables à plusieurs égards, et les biais fonctionnels observés peuvent trouver leur
origine dans nos hypothèses de travail. Comme nous l’avons vu en introduction, les facteurs
influençant la mutabilité des microsatellites codants sont nombreux et complexes à modéliser.
La littérature nous a fourni des longueurs seuil à partir desquels considérer qu’un
microsatellites est susceptible de muter par insertion/délétion. Il est certain qu’une forme de
continuité existe dans ce phénomène. Pour ces seuils, des événements de mutation sont
observés expérimentalement, mais nous ne pouvons pas exclure que ces mêmes événements
se produisent dans des microsatellites plus courts, même si leur fréquence est trop faible pour
être en permettre l’observation (Leclercq, ).
Le niveau d’expression des gènes est également susceptible d’influencer la mutabilité des
microsatellites. En effet, le taux de mutation génomique des microsatellites est susceptible
d’augmenter avec le niveau de transcription (Fabre, Dujon, and Richard 2002). Les gènes les
plus transcrits sont de ce fait également les plus susceptibles de subir une mutation de leurs
microsatellites codants et ainsi de perdre ou altérer leur fonction.
128
129
3. Quantification de la force de sélection
s’exerçant sur les microsatellites codants
Afin d’évaluer la force de la sélection négative des microsatellites codants, nous avons
examiné les événements de substitution qui venaient interrompre ou créer une répétition de
mononucléotide au sein des orthologues de quatre espèces de primates. Pour distinguer les
apparitions des disparitions, nous sommes passés par une étape de reconstruction des
séquences ancestrales. La méthode par maximum de vraisemblance qui permet cette
reconstruction a donné de bons résultats, du fait de la relative proximité génétique des
organismes étudiés (la divergence homme-macaque est estimée à 30 millions d’années). De
ce fait, les probabilités postérieures sont élevées (supérieure à 80% pour chaque séquence
codante reconstruite). Ainsi, nous avons pu orienter chaque substitution au sein des
microsatellites et dans le reste des séquences codantes.
L’examen de ces événements de substitution nous a permis de faire les observations
suivantes :
- Le nombre d’apparition et de disparition est sensiblement comparable dans toutes les
branches, ce qui suggère un état d’équilibre pour ces séquences répétées.
- Ces événements sont nombreux, car le taux de substitution au sein de ces séquences répétées
est élevé (voir Discussion, section 4). Cet état d’équilibre est donc fortement dynamique, avec
des apparitions et des disparitions fréquentes.
130
Ces observations suggèrent un modèle de mutation/sélection/dérive assez simple, avec une
pression de mutation qui tend à faire apparaître ces répétitions et disparaître ces répétitions, et
une force de sélection qui favorise la rétention des substitutions qui les font disparaître.
Afin de tester un tel modèle, nous avons donc considéré un modèle de génétique des
populations avec un locus et deux allèles (microsatellites et proto-microsatellites). La
fréquence de chaque allèle au sein de l’ensemble des loci existant dans chaque génome nous a
permis d’estimer la fréquence des allèles à un seul locus dans une population d’individus.
Cette démarche nous a été inspirée de travaux antérieurs (Bulmer 1991) qui avaient de cette
façon caractérisé la sélection s’opérant sur l’usage des codons alternatifs. Cette démarche fait
l’hypothèse d’une indépendance des loci et donc néglige la liaison génétique entre loci.
Toutefois, cette hypothèse peut être considérée comme raisonnable au vu de la taille des
génomes considérés et de la fréquence de recombinaison chez les eucaryotes strictement
sexués qui tend à supprimer cette liaison génétique à chaque génération.
Nous avons examiné les loci présentant soit une répétition de mononucléotides d’une
longueur strictement égale à 8 interrompus par une seule substitution, soit dans la séquence
ancestrale (apparition), soit dans la séquence actuelle (disparition). Ceci nous a permis
d’estimer les taux de mutations d’un allèle vers l’autre.
Dans un premier modèle, aucun allèle n’est fixé. Le taux de sélection calculé avec ce modèle
est quasiment nul, ce qui est en contradiction totale avec les résultats précédents. Le problème
vient probablement de nos hypothèses sous-jacentes, et en premier lieu de celles que les
populations de primates pourrait évoluer comme une population de taille infinie. Cette
hypothèse est peu crédible.
131
Nous avons donc estimé l’intensité de la sélection négative de nos répétitions à l’aide d’un
modèle qui tient compte de la taille des populations. Nous nous sommes basés sur une
estimation de l’effectif efficace chez l’homme égale à 10000 (Hill 1981). Cette taille est
probablement surestimée à cause des différents goulots d’étranglements par lesquels sont
passés les populations d’homininés (Tenesa et al. 2007). De plus, nous avons supposé un
effectif efficace équivalent pour les autres primates, n’ayant pas à notre disposition un modèle
permettant de faire l’hypothèse de plusieurs populations de tailles différentes pour chaque
espèce ayant contribué à l’analyse. À l’aide de ce modèle, nous estimons que la force de
sélection contre les répétitions est décelable si l’effet délétère de ces dernières est de type
récessif, c’est-à-dire si la sélection ne s’applique que sur les homozygotes. Pourtant il est
probable que des effets délétères dominants existent à cause de la toxicité des transcrits
présentant un décalage de phase de lecture ou de leurs produits.
Enfin nous avons dû, pour ces répétitions de mononucléotides codants, ne considérer que
celles dont la longueur était strictement égale à 8 nucléotides. La force de la sélection
négative qui s’exercent à l’encontre des répétitions plus grandes est probablement plus
importante car ces longues répétitions sont également plus susceptibles de muter par
insertion/deletion. Toutefois, il s’avère que les effectifs au sein d’un génome sont trop réduits
pour mesurer la sélection de ce type de répétition avec notre méthode, qui montre ainsi ses
limites.
In fine, vu la dynamique importante de ces répétitions codantes, il est probable que l’étude de
l’évolution des microsatellites gagnerait à être conduite sur une échelle de temps plus réduite.
Nous gageons que l’étude des polymorphismes qui ségrégent au sein d’une population
132
particulière permettra une évaluation plus fine de la sélection qui s’exerce sur les
microsatellites codants.
133
4. Le taux de substitution exceptionnel des
microsatellites codants
Nous nous sommes efforcés de quantifier la force de sélection qui s’exerce sur les
microsatellites codants. À cette fin, nous avons examiné des loci de microsatellites
homologues au sein des orthologues de quatre espèces de primates.
La quantification des événements de mutation au sein de ces microsatellites codants nous a
amené à faire cette observation surprenante : l’ensemble des microsatellites codants évolue
par substitution en moyenne deux fois plus rapidement que le reste des séquences codantes.
Cette observation pourrait résulter d’un biais de composition des microsatellites, mais la
méthode utilisées prend en compte certains biais de substitution (modèle HKY). Il faut
toutefois noter ici que les modèles de substitutions utilisés ne tirent pas parti du fait que nos
mutations sont ici orientées. Cet aspect mériterait que l’on y porte plus d’attention.
L’hypermutabilité des microsatellites en termes de substitution a été observée au niveau des
régions situés deux kilobases en amont des gènes dit ‘de ménage’ chez l’homme (Shankar et
al. 2007) et dans les régions non codantes orthologues homme/chimpanzé (Pumpernik, Oblak,
and Borstnik 2008)
Cette hypermutabilité pourrait résulter d’une activité accrue des système de réparation de
l’ADN au niveau des séquences repetées, hypothèse qui avait déjà été avancée pour expliquer
que le taux de substitution des séquences flanquantes des microsatellites était plus important
que la moyenne (Santibanez-Koref, Gangeswaran, and Hancock 2001).
134
L’hypothèse alternative est que les substitutions qui viennent interrompre un microsatellite
sont plus fréquemment fixées que la moyenne. Ce taux de fixation résulterait alors de la
sélection négative des microsatellites, qui se traduit par une sélection positive des mutations
qui viennent les interrompre. Cette hypothèse est plutôt en accord avec notre intuition et les
résultats précédents qui suggèrent une sélection négative assez forte de ces séquences
hypermutables, mais les résultats obtenus sur des régions non-codantes (Pumpernik, Oblak,
and Borstnik 2008) laissent soupçonner que ce taux élevé de substitution des microsatellites a
une origine structurelle.
135
5. Les contraintes imposées par les
protéines, « produits » des gènes
Les séquences codantes dans lesquelles nous avons recherché des microsatellites sont
traduites en séquences d’acides aminés. De ce fait, les microsatellites sont également traduits
en séquences peptidiques. La sélection agit au niveau du phénotype des individus et ce
phénotype est conféré pour une part par la protéine. C’est donc sur la séquence de cette
dernière que la sélection que l’on pourrait qualifier de « fonctionnelle » peut agir. Cette
sélection va donc agir en faveur ou en défaveur de la présence des répétitions d’acide aminé.
Toutefois, la sélection agit également sur la robustesse des gènes. Il a été démontré que pour,
pour coder une répétition d’acide aminé, la séquence nucléotidiques utilisées est généralement
non répétitive, c’est-à-dire qu’un codon alternatif est sélectionné (AAG plutôt que AAA dans
le cas des répétitions de lysine, voir (Ackermann and Chao 2006)). La présence d’un
microsatellite ne peut donc être uniquement le fait de la présence d’une répétition d’acide
aminé, bien que l’existence de cette dernière augmente la probabilité d’observer cette
première. C’est là un des principaux reproches qui pourrait être fait au modèle que nous avons
choisi pour estimer la probabilité des répétitions de mononucléotides.
Mais de fait, pour chaque mutation qui vient interrompre ou créer un microsatellite, la
question se pose de savoir si cette substitution est sélectionnée car elle modifie la séquence
d’acide aminés ou si elle est sélectionnée car elle modifie la stabilité du gène. Si cette
substitution est synonyme, elle est neutre au niveau de son impact sur la séquence d’acide
aminé, mais sélectionnés positivement si elle interrompt un microsatellite (et négativement si
elle créé une telle répétition). Si cette substitution n’est pas synonyme, elle est susceptible
136
d’être soumise à une forme de sélection en raison de la modification de la séquence protéique
qu’elle induit, tout en étant également soumise à une sélection agissant sur la stabilité
génomique.
Cette constatation, qui peut sembler triviale, me semble toutefois mériter une attention
particulière. En effet, les tests de sélection qui consistent à mesurer des biais dans le ratio
substitutions synonymes/substitutions non-synonymes font en général l’hypothèse de la
neutralité des substitutions synonymes et celle de l’impact sur la séquence de la séquence en
acide aminé des substitutions non-synonymes. De manière plus générale, j’ai acquis la
conviction que l’interprétation d’un signal de sélection à un site codant donné devrait toujours
être examiné en considérant les séquences flanquantes de ce site, de façon à pouvoir exclure
que la sélection détectée ne résulte pas de l’interruption d’une répétition.
137
Conclusion
Les microsatellites sont des séquences très étudiées, car leur utilisation courante de marqueur
hypervariable en génétique ne saurait se satisfaire d’une compréhension superficielle de leur
modalité évolutive. Ils existent actuellement des modèles mutationnels qui rendent compte de
façon satisfaisante de l’évolution de ces séquences dans un contexte neutre. Le schéma est
plus complexe dans un environnement génétique contraint, et les quelques observations que
nous avons pu faire apportent plus de questions que de réponses. L’idée que leur présence est
fortement délétère dans les séquences codantes est à la fois intuitive et directement observée
expérimentalement ou dans le cadre de pathologies. Nos résultats abondent dans ce sens, mais
pour des microsatellites présentant à priori une mutabilité intrinsèque équivalente, la sélection
qui s’exerce à leur encontre est différente. Nous devons reconnaître que certains facteurs
n’ont pas été pris en compte dans notre étude, comme les liens avec les taux de
recombinaison, le niveau d’expression ou encore l’influence des éléments transposables. Il
n’en reste pas moins que la robustesse et l’évolution des gènes est certainement modulée par
ces séquences codantes instables, qui n’ont ni révélé tous leurs secrets, ni obtenus toute la
considération qu’elles méritent lors de l’étude de l’évolution des séquences codantes qui les
contiennent.
138
139
Références
Achaz G, Rocha EP, Netter P, and Coissac E. 2002. Origin and fate of repeats in bacteria.
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Annexe 1 : Article
Nonsense-Mediated mRNA Decay Impacts MSI-DrivenCarcinogenesis and Anti-Tumor Immunity in ColorectalCancersJamila El-Bchiri1,2, Agathe Guilloux1,2, Peggy Dartigues1,2, Etienne Loire3,4, Dominique Mercier1,2, Olivier
Buhard1,2, Iradj Sobhani5, Pierre de la Grange6, Didier Auboeuf6, Francoise Praz1,2, Jean-Francois
Flejou1,2, Alex Duval1,2*
1 INSERM, UMR S893, Team 13 ‘‘Microsatellite Instability and Cancers’’, Paris, France, 2UPMC Univ Paris 06, UMR S893, Paris, France, 3UPMC Univ Paris 06, Atelier de
Bioinformatique, Paris, France, 4UPMC Univ Paris 06, UMR 7592, Institut Jacques Monod, Paris, France, 5Departement de Gastro-Enterologie, CHU Henri Mondor, Creteil,
France, 6 INSERM, U685, Hopital Saint-Louis, Paris, France
Abstract
Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD) degrades mutant mRNAs containing premature termination codon (PTC-mRNAs).Here we evaluate the consequence of NMD activity in colorectal cancers (CRCs) showing microsatellite instability (MSI)whose progression is associated with the accumulation of PTC-mRNAs encoding immunogenic proteins due to frameshiftmutations in coding repeat sequences. Inhibition of UPF1, one of the major NMD factors, was achieved by siRNA in theHCT116 MSI CRC cell line and the resulting changes in gene expression were studied using expression microarrays. Theimpact of NMD activity was also investigated in primary MSI CRCs by quantifying the expression of several mRNAs relativeto their mutational status and to endogenous UPF1 and UPF2 expression. Host immunity developed against MSI cancer cellswas appreciated by quantifying the number of CD3e-positive tumor-infiltrating lymphocytes (TILs). UPF1 silencing led to theup-regulation of 1251 genes in HCT116, among which a proportion of them (i.e. 38%) significantly higher than expected bychance contained a coding microsatellite (P,2610216). In MSI primary CRCs, UPF1 was significantly over-expressedcompared to normal adjacent mucosa (P,0.002). Our data provided evidence for differential decay of PTC-mRNAscompared to wild-type that was positively correlated to UPF1 endogenous expression level (P= 0.02). A negative effect ofUPF1 and UPF2 expression on the host’s anti-tumor response was observed (P,0.01). Overall, our results show that NMDdeeply influences MSI-driven tumorigenesis at the molecular level and indicate a functional negative impact of this systemon anti-tumor immunity whose intensity has been recurrently shown to be an independent factor of favorable outcome inCRCs.
Citation: El-Bchiri J, Guilloux A, Dartigues P, Loire E, Mercier D, et al. (2008) Nonsense-Mediated mRNA Decay Impacts MSI-Driven Carcinogenesis and Anti-TumorImmunity in Colorectal Cancers. PLoS ONE 3(7): e2583. doi:10.1371/journal.pone.0002583
Editor: Cathal Seoighe, University of Cape Town, South Africa
Received April 2, 2008; Accepted May 28, 2008; Published July 9, 2008
Copyright: ! 2008 El-Bchiri et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was partly supported by grants from the Association pour la Recherche contre le Cancer (credit number 3946). JEB, EL and PDLG wererecipients of a fellowship from the Ministere Francais de la Recherche (MRT).
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
Introduction
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is an evolutionarilyconserved mRNA surveillance mechanism that recognizes andeliminates aberrant mRNAs harboring premature terminationcodons (PTC), thereby preventing the accumulation of potentiallydeleterious truncated proteins in eukaryotic cells [1]. Following pre-mRNA splicing, NMD targets are recognized via a multiproteinexon-junction complex (EJC) that is deposited 24 nucleotidesupstream of each exon-exon junction. As a general rule, it has beenestablished that aberrant mRNAs containing PTC located eitherless than 50–55 nucleotides upstream of the last exon-exon junctionor in the last exon are not degraded by NMD (NMD-irrelevant) [2].The core of NMD effectors comprises the evolutionary-conservedUPF proteins, UPF1/RENT1, UPF2/RENT2, and two paralogsof UPF3, UPF3 (also called UPF3a) and UPF3X (also calledUPF3b). UPF1 is an RNA helicase whose activity is regulated bycycles of phosphorylation/dephosphorylation. Phosphorylation of
UPF1 requires UPF2 and UPF3 and is catalyzed by SMG1, aprotein kinase related to the phosphoinositide-3-kinase family.UPF1 phosphorylation by SMG1 has been shown to be the rate-limiting step in NMD [3,4]. It is noteworthy that SMG1 activity isnot only devoted to NMD but also plays a role in DNA damagesignaling and repair, notably by phosphorylating p53 [5].Dephosphorylation of UPF1 is mediated by SMG5, SMG6 andSMG7, three proteins that act as adaptors between phosphorylatedUPF1 and protein phosphatase 2A [3]. UPF1 function is crucial inNMD, while UPF3 and UPF3X are partially redundant [6] andUPF2 is dispensable in some cases suggesting the existence of aUPF2-independent NMD pathway [7]. UPF1 acts not only inNMD-mediated degradation of aberrant transcripts but also in thephysiological decay of various mRNAs, regulating the expression of3–10% of the transcriptome [8,9]. Silencing of UPF1 and to a lesserextent UPF2 has been reported to modulate the expression level ofa number of physiological substrates of NMD, including transcriptswith upstream open reading frames in the 59-untranslated region,
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transcripts containing an intron within their 39-untranslated regionas well as transcripts derived from transposon or endogenousretrovirus [8,10]. NMD has also been proposed to play a role in theregulation of alternative splicing events, since sequence-basedanalyses predict that about 35% of mammalian alternative splicingevents produce PTC-containing spliced variants. Nevertheless, ithas recently been reported that most PTC-containing splicevariants are produced at low levels in human cells, independentlyof the action of NMD, suggesting that the majority of such PTC-introducing events are not under positive selection pressure andtherefore are not expected to contribute important functionalroles [11].To date, the consequences of NMD activity have been mostly
investigated in monogenic hereditary diseases, including heredi-tary tumors [12]. NMD has been reported to protect heterozygouscarriers from the deleterious effects of some aberrant PTC-mRNAs encoding truncated proteins with dominant-negativeactivity [12]. Conversely, NMD inability in degrading NMD-irrelevant transcripts has been proposed to favor the phenotypicexpression of dominant hereditary diseases [12]. Because cancercells are genetically unstable and accumulate numerous somaticframeshift mutations in genes with an expected role in celltransformation, the NMD system has been proposed to play a rolein tumor development [12]. However, the assessment of its overallimpact on this process has been poorly described and remainshard to define since it depends on the nature and the number ofmutants accumulated in cancer cells during tumor progression. Todate, NMD inhibition has been successfully used as an in vitrostrategy to discover new cancer-related genes harboring truncatingmutations, suggesting that it may indeed have a role in favoringthe selection of some frequent mutational events in various tumortypes [13]. It is noteworthy that NMD activity has been shown tobe highly variable, leading to incomplete and differential decay ofputatively NMD-relevant mRNAs containing a PTC (referred toas NMD-escape) [14,15,16].MSI tumors harboring mismatch repair (MMR) deficiency are
frequent in humans. They represent about 15% of sporadiccolorectal, gastric and endometrial tumors and include neoplasmsarising in the Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer(HNPCC) syndrome. Dozens of mutations affecting genescontaining coding repeat sequences have been reported in thesetumors, defining the so-called mutator pathway whose role issuspected to be crucial in MSI-driven tumorigenesis [17]. To date,a large number of publications have reported frameshift mutationsin genes involved in various biological pathways such as cell cycleregulation (e.g. TGFBR2, IGF2R, TCF4, AXIN2, PTEN, RIZ),apoptosis (e.g. BAX, CASP5, BCL10, APAF1, FAS), DNA damagerepair (e.g. ATR, DNA-PKcs, RAD50, MSH3, MSH6, MBD4,MLH3, BLM, CHK1) and others [17]. We recently reported thatthe decay of frameshift mutation-derived mRNAs following in vitrosilencing of UPF1 and/or UPF2 in a panel of MSI CRC cell lineswas differential and incomplete [14]. If not fully degraded,frameshift mutant mRNAs encode proteins containing aberrant C-terminal tails, among which some have been shown to displayimmunogenic properties [18,19]. Several studies have emphasizedthe fact that, in keeping with this process, MSI tumors weremarkedly infiltrated by cytotoxic intra-epithelial tumor-infiltratingT lymphocytes (TILs) and that such a cellular immune responsewas predictive of a relatively favorable outcome independently ofthe initial tumor stage and other clinical factors [20]. Therefore,NMD activity may interfere with anti-tumor immunity by limitingthe expression of some of these aberrant proteins. Using MSIcolorectal cancer as a model, we aimed here at furtherinvestigating the role of NMD in oncogenesis.
Results
Transcriptome changes secondary to UPF1 silencing inHCT116 CRC cells and their relationship to microsatelliteinstabilityUsing Affymetrix GeneChipH Human Exon 1.0 ST gene
expression arrays, the expression of 1363 genes was found to besignificantly deregulated upon UPF1 silencing in the HCT116 (MSI)CRC cell line, with a fold change$1.5 compared to untreated cells(Table S1). With 111 others, UPF1 was, as expected, one of the genesto be significantly down-regulated. The level of inhibition wassignificant (.75%) and agreed well with our data obtained by real-time quantitative RT-PCR (data not shown). Overall, 1251 geneswere up-regulated upon UPF1 silencing (1251/1363, i.e. 92% of allderegulated genes under these conditions), amongst which 472 (38%)contained a mononucleotide repeat sequence of at least 7 base pairsin the coding region (Table S2). Of interest, the total number of genesin the human genome with a coding repeat tract$7N is lower (4470/22218 ; 20%. Data not shown), making significantly higher thanexpected by chance the overall number of such target genes up-regulated in HCT116 upon UPF1 silencing (P,2610216; Chi2 test).Amongst the aforementioned 472 genes in HCT116 cells, 22
genes containing a coding mononucleotide repeat of 7 to 10nucleotides were chosen because of their putative role in colorectalcarcinogenesis and screened for insertion/deletion mutations inthese cells (Table 1). All these genes but 3 (MBD4, MSH3,TGFBR2) had never been reported to be mutated in MSI CRCs(Table 1). Using this approach, we detected or confirmedhomozygous mutations in the SLC35F5, TGFBR2, ARV1, MSH3,SMAP1 genes and heterozygous mutations in the MBD4, EFHC1,TTC3, and WDR19 genes (Figure 1a). All the correspondingmutant mRNAs harbored a PTC located in coding regions thatmay be prone to NMD. In addition, we observed that 4 othertarget genes with previously described heterozygous frameshiftmutations in HCT116 (BAX, RECQL, RAD50 andMSH6) were notsignificantly re-expressed following UPF1 silencing (Figure 1a).The re-expression rates for PTC-mRNAs induced by UPF1silencing in HCT116 are shown in Figure 1a and highlight the factthat, as described [14], UPF1-mediated mRNA decay is highlyvariable within a series of endogenously mutated PTC-mRNAsalthough allele specific expression assays were not used todifferentiate between mutated and wild-type mRNAs in the caseof heterozygous frameshift alterations.
Frameshift mutations in MSI primary CRCs according totheir NMD statusAll the target genes mutated in HCT116 for which the impact
of NMD had previously been determined were screened forframeshift mutations in coding microsatellite sequences in a seriesof primary MSI CRCs (n = 44). This includes genes whosemutated mRNAs are more or less sensitive to NMD (TGFBR2,SLC35F5, ARV1, MSH3, TTC3, EFHC1, MBD4, SMAP1, WDR19,BAX, RECQL, RAD50, MSH6) (Figure 1a). The mutationfrequencies of these 13 genes representing possible targets forMSI-driven instability were highly variable in these tumors(Figure 1b). Based on their high mutation frequency, SLC35F5,ARV1, TTC3, and SMAP1 represent new target genes in whichframeshift mutations have not previously been reported in MSICRC. They were mutated in 48% (21/44), 23% (10/44), 32%(14/44) and 73% (32/44) of tumors, respectively (Figure 1b).
Over-expression of UPF1 mRNA in MSI primary CRCsBy measuring the levels of UPF1 and UPF2 mRNAs by real-
time quantitative RT-PCR in another independent series of MSI
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primary CRCs for which we also obtained the samplescorresponding to matching normal mucosa, we observed anapproximately 7-fold over-expression of UPF1 in tumors (n = 25)compared to normal mucosa (P=0.0015; paired t-test) (Figure 2).Since the quantification (7-fold) of the over-expression has to betaken with cautiousness due to the small amount of data, weverified that UPF1 mRNA was indeed over-expressed in MSIprimary CRCs by performing a qualitative chi-square test, whichis robust to extreme values. Using this approach, the number ofcases in which UPF1 expression was higher in tumors compared tomatching normal mucosa (N=20/25) was significantly differentthan expected by chance (P=0.009; chi-square test). These dataare illustrated on Figure 2, in which 20 and 5 open circlesrepresenting MSI tumor samples over-expressing UPF1 or not,respectively, are represented above a doted line symbolizing theexpression of this NMD factor in normal mucosa. Of interest, atrend for over-expression of this factor was also observed in non-MSI (MSS) CRCs (n= 31) in the same conditions (P=0.08; pairedt-test) (Figure 2). In contrast, UPF2 was not differentially expressedin either MSI or MSS CRCs compared to matching normalmucosa (P=0.56 and 0.83, respectively; paired t-test) (Figure 2).
Significant decay of frameshift mutation-derived mRNAsthat depend on UPF1 expression in MSI primary CRCsIn our series of 44 primary MSI CRCs, we further determined
the relative in vivo expression of 18 MSI target genes by real-timequantitative RT-PCR using experimental conditions that we
previously determined in a series of CRC cell lines (ATR, BAX,BLM, CBF2, CDX2, GRB14, GRK4, IGF2R, MBD4, MSH3, MSH6,RAD50, RBBP8, RECQL, RIZ, TCF4, TFDP2, TGFBR2) (Figure 3and also Table S3 for the mutational status of these 18 genes inMSI CRCs) [14]. For all genes except 3 (CDX2, GRB14, TFDP2), atrend for decay of mutant compared to wild-type mRNAs wasobserved. The decay of mutant mRNAs compared to wild-typeswas significant for MSH6 (P=0.02; Student’s t-test) and nearlysignificant for a few others only, e.g. BAX (P=0.08), CDX2(P=0.10), MSH3 (P=0.10), RIZ (P=0.10) and TFDP2 (P=0.10),providing evidence for differential decay of PTC-mRNAscompared to wild-type in our series of primary CRCs, as alreadydescribed in a series of MSI CRC cell lines [14] (Figure 3).Overall, there was a highly significant decay of PTC-mRNAs inthe MSI primary CRCs (P,1024, Student’s t-test; see the‘‘Materials and Methods’’ section for Statistical analyses). Asindirect proof of the contribution of NMD, the overall intensity ofthis process in MSI primary CRCs was positively correlated to theendogenous UPF1 expression level (P=0.02, Student’s t-test; seethe ‘‘Materials and Methods’’ section for statistical analyses),whereas the impact of UPF2 was not significant (P=0.72,Student’s t-test) (data not shown).
UPF1 and UPF2 are negative predictive factors of thehost’s immune response against MSI CRCsWith the exception of TCF4, no significant positive correlations
were found between the endogenous expression of PTC-mRNAs
Table 1. List of 22 Target genes up-regulated following UPF1 silencing in HCT116 and their mutational status.
Gene Symbol Ensembl Human Gene Fold Change Repeat Repeat Position in cDNA Type of Mutation in HCT116
ARV1 ENSG00000148926 2.08 9A 539 hmz
CDC23 ENSG00000094880 1.99 7A 411 wt
CSPG2 ENSG00000038427 2.17 7A 7874 wt
EFHC1 ENSG00000096093 1.94 7A 1316 htz
MBD4* ENSG00000129071 1.89 10A 930 htz
MSH3* ENSG00000113318 1.6 8A 1394 hmz
NR3C1 ENSG00000113580 1.87 7A 1974 wt
ORC6L ENSG00000091651 2.24 7A 561 wt
PIGB ENSG00000069943 1.85 8T 1086 wt
PSD3 ENSG00000156011 1.6 8A, 8A 737, 2333 wt
PSEN1 ENSG00000080815 2.02 7T 774 wt
REV3L ENSG00000009413 1.91 8A 1481 wt
RIF1 ENSG00000080345 1.75 7T, 8A 1538, 4637 wt
SHPRH ENSG00000146414 1.69 8A 887 wt
SLC35F5 ENSG00000115084 2.2 10T 1157 hmz
SMAP1 ENSG00000112305 1.6 10A 550 hmz
TBC1D23 ENSG00000036054 1.66 9A 1901 wt
TFE3 ENSG00000068323 2.39 8G 1676 wt
TGFBR2* ENSG00000163513 2.45 10A 831 hmz
TMEM161B ENSG00000164180 1.57 8T 651 wt
TTC3 ENSG00000182670 2.42 8A, 7A 1867, 2432 htz
WDR19 ENSG00000157796 1.54 8T 788 htz
The threshold for re-expression was considered significant when the fold change was .1.5 (see the Materials and Methods section). Newly described target genes forinstability in MSI CRCs are indicated in bold characters. Hmz: homozygously mutated at the coding repeat tract in HCT116. Htz: heterozygously mutated at the codingrepeat tract in HCT116. wt: not mutated at the coding repeat tract in HCT116. Target genes that have been already described to be mutated in MSI CRCs are indicatedwith an *.doi:10.1371/journal.pone.0002583.t001
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and the presence of CD3e-positive TILs in tumors (PTCF4 = 0.06;Bootstrapped t-test) (data not shown). The link between thenumber of TILs and the expression of UPF1 and UPF2 was notlinear but log-linear. Thus, the influence of UPF1 and UPF2expression on the numbers of TILs was investigated via a Wald testand the coefficients in the Poisson regression model were estimatedvia iteratively re-weighted least squares. Based on these observa-tions, a negative effect of UPF1 and UPF2 expression on theoverall number of CD3e-positive TILs was demonstrated (P,0.01for UPF1 and UPF2; Wald test). A mathematical modelcorrelating the number of CD3e-positive TILs with the expressionof these NMD factors in MSI CRCs was established, predictingthat TILs increased by about 30% when the expression of UPF1was halved.These data are illustrated for UPF1 and UPF2 in Figure 4; tumor
samples in which UPF1 and UPF2 expression are low (below theaverage) presented with variable rates of CD3e positive-TILs whiletumor samples in which UPF1 and UPF2 expression are high(above the average) were found to be nearly always characterized bya lowCD3 count, making UPF1 and UPF2 possible markers of pooranti-tumor immunity in MSI primary CRCs.
Discussion
By evaluating a large number of target genes that were mutatedat variable rates in their coding repeat sequences, we show asignificant decay of the corresponding mutant mRNAs comparedto wild-type in MSI primary CRCs with a significant impact ofendogenous expression of UPF1 in this process, with UPF2 playinga minor role in the process, as recently described by our group in aseries of MSI CRC cell lines [14]. Taken one by one, we observeda significant or nearly significant decay of only some mutantmRNAs compared to wild-types and this is not surprising since: (i)as recently published by our group, NMD impact on theexpression of frameshift mutation-derived mRNAs is highlyvariable from one mutant to another [14]; (ii) frequencies oftarget gene alterations were highly variable and sometimes verylow in our tumor series; (iii) some mutants in particular (TCF4) areNMD-irrelevant. In this study, we also investigate large scale geneexpression changes in MSI CRC cells in the context of NMDinhibition using a specific method, showing that it led to the up-regulation of 1251 genes in HCT116, among which a proportionof them significantly higher than expected by chance contained a
Figure 1. a. Impact of UPF1 on the decay of PTC-mRNAs in HCT116 cells. TGFBR2, SLC35F5, ARV1, MSH3, SMAP1, TTC3, EFHC1, MBD4, WDR19,BAX, RECQL, RAD50 and MSH6 harbor homozygous or heterozygous frameshift mutations in the HCT116 MSI CRC cell line. Using expression array, foldchanges in the expression of the corresponding mRNAs relative to UPF1 silencing were determined (fold change= EmRNA in cells treated with a UPF1siRNA / EmRNA in cells treated with control siRNA). Genes that are underlined are those whose re-expression was significant in these conditions (1.5fold-change up with a p-value #0.005). Evidence for variable sensitivity to UPF1-mediated decay of such PTC-mRNAs could therefore be obtained,although allele specific expression assays were not used to differentiate between mutated and wild-type mRNAs in the case of heterozygousframeshift alterations. b. Coding frameshift mutations in target genes relative to NMD-status in MSI primary CRCs. Frequencies of frameshiftmutations of the same series of 13 target genes for instability in 44 MSI primary CRCs are represented. Target genes whose frameshift mutations arefrequently selected for during MSI CRC progression harbor different sensitivities to UPF1-mediated decay.doi:10.1371/journal.pone.0002583.g001
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coding microsatellite. Although not all of them are expected to bemutated in MSI CRC cells, as shown here on a short series of up-regulated target genes, it can be advanced that UPF1 isparticularly relevant for modulating the expression of dozens ofgenes mutated in MSI CRC cells. Overall, these data confirm forthe first time, both in vitro and in vivo, that NMD deeply influencesMSI-driven tumorigenesis at the molecular level.As a possible functional consequence of NMD activity in vivo in
MSI tumorigenesis, we investigated whether the activity of thissystem modulates anti-tumor immunity. Of interest, the onlyframeshift mutation whose presence was significantly associatedwith a higher number of TILs in MSI CRCs was in TCF4, theonly NMD-irrelevant target gene studied in our series as its codingrepeat sequence is located within its last exon. Moreover, aninverse correlation between UPF1 and UPF2 expression and thenumber of CD3e-positive TILs was observed in MSI CRCs, and amathematical model linking the number of CD3e-positive TILs tothe expression of NMD factors in MSI CRCs predicted that TILsincreased by about 30% when the expression of UPF1 or UPF2was halved. These data indicate that NMD may impact negativelythe host’s immunity against MSI tumor cells in a cumulativemanner via the contrasted and incomplete degradation of mutatedtranscripts encoding immunogenic peptides. It could be speculatedin this context that UPF factors may be specific markers of poorimmunity in MSI primary CRCs. In light of these results, it canthus be advanced that the aforementioned negative impact ofNMD on the immune process developed by the host against MSItumor cells would be efficient only when NMD factors are over-expressed and highly active in degrading the numerous PTC-
mRNAs encoding for immunogenic peptides that are synthesizedin MSI CRCs. In contrast, it can be assumed that, when expressedat lower rates, NMD factors would be inefficient in preventing thedevelopment of an anti-tumor immune response whose intensitywould depend on the number and the nature of frameshiftalterations accumulated in MSI cancer cells. These findings maybe of clinical interest since, as mentioned earlier, anti-tumorimmunity is generally considered as an independent factor whoseintensity has been consistently demonstrated to be predictive offavorable outcome independently of the initial colon tumor stageand other clinical factors [20].Since the efficiency of NMD for degrading mutant mRNAs
from target genes is highly variable, we recently proposed thatNMD may therefore play an important role in the selection oftarget gene mutations with a functional role in MSI carcinogenesis[14]. It is noteworthy that among the genes up-regulated uponUPF1 silencing, four not yet reported target genes (SLC35F5,TTC3, ARV1 and SMAP1) are here demonstrated to be frequentlymutated in our series of MSI primary CRCs. Amongst them,SMAP1, for Stromal Membrane Associated Protein-1, haspreviously been reported to participate in chromosomal rear-rangements with MLL in hematological malignancies [21]. With a73% frequency of frameshift alterations in MSI primary CRCs,including homozygous mutations in five CRC samples (data notshown), it is one of the most frequently mutated target genes inMSI CRCs together with TGFBR2 and ACVR2 [17]. In keepingwith our previous results and those obtained by Ionov et al. usingemethine as a nonspecific inhibitor of the NMD system [14,22],we confirmed in this study that TGFBR2 PTC-mRNA is degraded
Figure 2. Expression of UPF1 and UPF2 in MSI and non-MSI (MSS) primary CRCs relative to matched normal colonic mucosa. In 25MSI and 31 MSS CRCs we compared the expression of UPF1 and UPF2 between the tumors and matched normal colonic mucosa by real-timequantitative RT-PCR. In all but 5 cases, over-expression of UPF1 was observed in MSI CRC tumors. Considering all samples, the over-expression ofUPF1 in MSI tumors was statistically significant (P=1.561023; paired t-test). In MSS CRCs, a trend for over-expression of this factor was observedunder the same conditions (P= 0.08; paired t-test). In patients with MSI or MSS CRCs, UPF2 was not differentially expressed between tumor andmatching normal mucosa (P=0.56 and P= 0.83, respectively; paired t-test).doi:10.1371/journal.pone.0002583.g002
NMD Role in Colorectal Cancers
PLoS ONE | www.plosone.org 5 July 2008 | Volume 3 | Issue 7 | e2583
through NMD in MSI CRC cells. In a recent paper, You et al.[23] reported contradictory data, claiming that this target gene aswell as MSH3 escape NMD in the HCT116 cell line. Theypresented results on a series of PTC-mRNAs showing thesetranscripts were either completely sensitive or completely resistantto NMD in MMR-deficient cells. Their data were obtained byperforming expression assays that were neither quantitative norallele-specific. In the same study, these authors also suggested asystematic translational repression of truncated proteins fromframeshift mutation-derived mRNAs that escaped NMD (NMTRfor ‘‘Nonsense Mediated Translational Repression’’) [23]. Weverified by western blotting that expression of the correspondingproteins for both of the homozygously mutated target genes(TGFBR2, MSH3) was not detectable in HCT116 cells (data notshown). Contrary to You et al, we propose that loss of TGFBR2and MSH3 expression is mainly due to NMD rather than to anhypothetical NMTR pathway. It is noteworthy that the existenceof an NMTR pathway does not suit well with the immunogenicproperties of MSI cancer cells that depend directly on theaccumulation of immunogenic peptides derived from numerousframeshift-related proteins whose PTC-mRNAs are NMD-rele-vant in most cases [18,19,20]. Regardless of discrepancies, all thesedata argue for a role of NMD in modulating the expression ofseveral genes whose mutations have been already demonstrated
(TGFBR2, MSH3, MBD4) or are expected to play an importantrole during MSI CRC progression [17]. UPF1 depletion withshRNA in non-MSI HeLa cells was recently reported to inducecell cycle arrest in early S phase due to the involvement of thisfactor in DNA repair [24]. In contrast, transient silencing of UPF1and/or UPF2 in MSI and MSS colorectal cancer cells (HCT116,LoVo, Co115, LS174T, SW480, COLO320) did not lead tosignificant alterations of cell growth and/or death in our hands(data not shown). Further studies are now required to determinehow NMD activity may change the repertoire of genes involved inMSI carcinogenesis and impact tumor progression using MMRdeficient mouse models in which UPF1 activity is modified.Our observations concern the most frequent primary tumor
location associated with MSI in human, i.e. colon. They indicatethat NMD deeply influences the expression of numerous mutantswith an expected crucial role in MSI-driven tumorigenesis andnegatively impacts the host immunity against MSI cancer cells.Such a putative oncogenic function of NMD in MSI carcinogen-esis fits well with the fact that we also report here for the first timethat UPF1 is significantly over-expressed in MSI CRCs comparedto matching normal mucosa. This last observation was based onthe measure of the UPF1 mRNA level. As a perspective, it has nowto be confirmed at the protein level through a quantitativeapproach such as Western Blotting that was here not performed
Figure 3. Target gene-related mRNA expression according to mutational status in 44 MSI primary CRC. hCt values are indicated relativeto the mutational status of each gene in the 44 MSI primary CRCs (wild-type and mutated tumor samples are indicated by white circles and blacktriangles, respectively). For each gene, medium values of hCt related to wild-type (white arrow) or mutated (black arrow) tumor samples werecalculated. For all genes except 3 (CDX2, GRB14, TFDP2), a trend for decay of mutant compared to wild-type mRNAs was observed (hCt values areinversely proportional to gene expression). Overall, the data provide evidence for significant decay of PTC-mRNAs compared to wild-type mRNAs invivo in MSI primary CRCs (P,1024, student t-test).doi:10.1371/journal.pone.0002583.g003
NMD Role in Colorectal Cancers
PLoS ONE | www.plosone.org 6 July 2008 | Volume 3 | Issue 7 | e2583
because of the lack of available additional tumor material. Thedevelopment of clinical trials should now be developed to lookwhether NMD may be considered as a factor of poor prognosis inMSI CRCs or not. Small molecules inhibiting NMD are nowavailable [25] and may be used to gain further insight into theNMD role in cancers. We now plan to use these drugs in MMR-deficient mice developing MSI neoplasms to evaluate whether itmay constitute a new therapeutic target for the treatment of suchtumors.
Materials and Methods
Tumor samples and cell linesThe CRC cell line HCT116 was purchased from the American
Type Culture Collection and maintained in DMEM (LifeTechnologies) containing 10% fetal calf serum (Invitrogen) andGlutamine without antibiotics to allow transient transfectionexperiments with siRNA. Forty-four MSI primary tumors wereobtained from patients undergoing surgery for colorectal cancer;all cases were histopathologically confirmed as being adenocarci-nomas. Collected tumors were systematically formalin-fixed,paraffin-embedded and frozen after surgery without any prior
embedding in liquid nitrogen. The MSI status was determined byfluorescent multiplex PCR comprising 5 quasimonomorphicmononucleotide repeats (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 andNR-27), as described [26]. Only tumors with instability at three ormore of these markers were included in the study. The amount ofnormal contaminating DNA was estimated as previously described[27]. In addition, an independent series of 25 MSI and 31 MSSprimary CRC samples were collected in the same conditionstogether with their matching normal mucosa and used to compareUPF1 and UPF2 expression in tumor and normal colonic tissues.
Multiplex PCR and mutation analysisTumor DNA from fromzen samples was extracted using
QIAamp DNA Tissue Kit (Qiagen) according to the manufactur-er’s instructions. A total of 24 genes containing mononucleotiderepeat sequences were chosen either because they were alreadydescribed as targets for MSI-driven mutations in MSI tumors (e.g.ATR, BAX, BLM, CBF2, CDX2, GRB14, GRK4, IGF2R, MBD4,MSH3, MSH6, RAD50, RBBP8, RECQL, RIZ, TCF4, TFDP2, andTGFBR2) or because they were significantly up-regulated in MSIHCT116 cells following UPF1 silencing and mutated in theHCT116 MSI CRC cell line (SLC35F5, ARV1, EFHC1, TTC3,
Figure 4. Relationship between endogenous UPF1 and UPF2 mRNA expression in MSI CRCs and the number of TILs. The overallnumber of CD3e positive-TILs was significantly related to the endogenous expression of UPF1 and UPF2 in this series of 44 MSI primary CRCs (P,0.01;Wald test). Of interest, while tumor samples in which UPF1 and UPF2 expression was low (below the average) presented with variable rates of CD3epositive-TILs, tumor samples in which UPF1 and UPF2 expression was high (above the average) were almost always characterized with low CD3 count(poorly immunogenic CRCs). These data make UPF1 and UPF2 specific markers of poor anti-tumor immunity in MSI primary CRCs. CD3 proteinimmunostaining are presented for 2 MSI primary CRC samples showing either low CD3 count and high UPF1 and UPF2 expression (left) or high CD3count together with low UPF1 and UPF2 expression (right).doi:10.1371/journal.pone.0002583.g004
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PLoS ONE | www.plosone.org 7 July 2008 | Volume 3 | Issue 7 | e2583
SMAP1, WDR19). Specific primers for each target gene weredesigned using e-primer3 (http: // bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/eprimer3.html) so that short fragments (,200 bp) couldbe simultaneously amplified by 6 PCRs using 6-FAM or HEXlabeled primers. PCR reactions were performed in a final volumeof 20 ml containing 100 ng of genomic DNA, 0.15–0.40 mM ofeach pair of primers and 1 unit of HotStarTaq DNA polymerase(Qiagen) (Table S4). Adequate dilutions of the fluorescent PCRproducts were mixed with formamide and GeneScanTM 400HDROXTM Size Standard (Applied Biosystems), heat-denatured andrun on a short capillary containing GS Performance OptimizedPolymer 4, on the ABI 3130 Genetic Analyzer using theGeneMapper 3.7 software (Applied Biosystems).
Real-time Quantitative RT-PCR analysis in primary CRCsDNA and RNA extractions were performed on closely related
regions of each frozen tumor sample. Total RNA was isolatedusing Trizol reagent according to the manufacturer’s instructions(Invitrogen). RNA integrity was evaluated on a 2100 Bioanalyzerusing the RNA 6000 Nano LabChip kit (Agilent). Only sampleswith intact RNAs were used for gene expression analysis (28S/18SRNA ratio .1.6 and absence of aberrant pick on the RNAprofile). cDNAs were synthesized using the High Capacity cDNAArchive Kit according to the manufacturer’s instructions (AppliedBiosystems). For quantitative RT-PCR experiments, expressionvalues of each mRNAs were calculated relatively to 18S ubiquitousRNA as described [14]. Briefly, expression values were obtainedfrom the Ct number at which the increase in signal associated withexponential amplification of PCR products starts to be detectedusing the Applied SDS Biosystems analysis software according tothe manufacturer. Quantification of the 18S ubiquitous RNA wasused as the endogenous reference. Results were expressed as N-fold difference in target gene expression relative to 18S expression(hCt), where hCt was determined in each case by subtracting theaverage Ct value of the target gene from the average Ct value ofthe 18S gene. hCt is inversely correlated to the relative expressionvalues by the formula:
Relative Gene Expression E! "~2{LCt
Primers and internal probes for 18S and the target genes werethose proposed on demand by Applied Biosystems (TaqMan geneexpression assays on demand). For each set of primers, a no-template control and a no-reverse transcriptase control (reversetranscriptase-negative) assays produced negligible signals (usuallyCt .35), and were used to confirm the absence of primer-dimerformation and genomic DNA contamination. PCR reactions wereperformed in triplicate using an ABI Prism 7900 SequenceDetection System and the TaqMan PCR master mix (AppliedBiosystems). The thermal cycling conditions comprised an initialdenaturation step at 95uC for 10 min and 40 cycles at 95uC for15 s and 60uC for 1 min.
Transient transfection assays of cell lines and micro-arrayanalysesThe HCT116 CRC cell line was transiently transfected as
described [14]. Microarray experiments were performed by thePartnerChip Company (Evry-France) on Affymetrix GeneChipHHuman Exon 1.0 ST arrays. Preparation of single-strandbiotinylated cDNA was done according to protocols from themanufacturer (Affymetrix). Briefly, 1 mg of total RNA wassubjected to mRNA enrichment using magnetic beads before
reverse transcription. Double-stranded cDNA was generated usingT7-promoter coupled random hexamers and the Superscript IIReverse Transcriptase. In vitro transcription was then carried out inthe presence of T7 RNA Polymerase for complementary RNAamplification. At the end, cRNA was reverse-transcribed intosingle-strand sense cDNA, fragmented and finally biotinylatedusing terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) before over-night hybridization on Human Exon 1.0 ST arrays. Washes andstreptavidin-phycoerythrin (SAPE) staining procedures wereperformed using Affymetrix Fluidics Station 450 and arrays werefinally scanned into Affymetrix Scanner 3000.
ImmunohistochemistryTissue from 44 MSI tumors was available. Paraffin-embedded
stored tissue was retrieved and fresh 4-mm sections were mountedon silanised slides. Immunohistochemical analysis of CD3 wasperformed using a CD3 antibody (clone SP7, 1:300 fromNeomarkers, Freemont CA) and the commercially available Bondautomated system (BondTM). Quantification of the relativenumber of CD3+ positive cells was performed in all cases byusing a video-assisted measuring system in combination with asoftware package for quantification (Mercator, exploranova).When assessing TILs, a region of interest was established in anarea with cancerous glands which contained the maximal amountof neoplastic cell with minimal stroma or necrotic debris.Automated exploration was done in the region after savingparameters necessary to recognize lymphocytes that reactedpositively to the antibodies. The ratio of TILs to epithelialcancerous cells was based on 500 minimal epithelial cells and theresult was edited in Microsoft Excel.
Statistical analysisNormalization of micro-array data and analyses. Quantile
normalization was performed using the ExACT software fromAffymetrix. Background was calculated and subtracted from mainprobe intensities using the antigenomic probes, as already described[28]. Only probes with a low DAPG p-value in at least oneexperimental was selected [28]. Probes that are tagged as ‘‘cross-hybridizing’’ on the Affymetrix design files were eliminated. A pairedT-test on the corrected intensities of the selected probes between theUPF1 depletion experiment and the control experiment wasperformed. Only gene expression alterations above a 1.5 fold-change (up or down) with a p-value#0.005 were selected.
Testing the effect of the presence of frameshift mutationsin target genes on the relative expression of theircorresponding mRNAs in MSI primary colorectaltumors. For the 18 target genes (ATR, BAX, BLM, CBF2,CDX2, GRB14, GRK4, IGF2R, MBD4, MSH3, MSH6, RAD50,RBBP8, RECQL, RIZ, TCF4, TFDP2, TGFBR2), the hCt valuesmeasured in the 44 primary tumor samples were standardized.The fitted linear mixed-effects model can be expressed, for eachgene g and each tumor sample s, as: hCtStandgs= a+b+ms+egs formutated genes and hCtStandgs = b+ms+egs for wild-type genes,where hCtStand denotes the standardized value of the hCt, ms is arandom effect depending only on the tumor sample s and egs is arandom error depending on the tumor sample s and the gene g.The variance component of the random effect has been estimatedby restricted maximum likelihood, via the EM algorithm, while thevalues of a and b were computed by standard maximum likelihoodestimation. In addition, a Student’s t-test for the null hypothesisH0: the presence of the mutation has no effect on the expression ofthe corresponding mRNA (a=0) versus the alternative H1:a?0was performed.
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Testing the influence of the endogenous expression ofUPF1 or UPF2 on the overall decay of mutant mRNAs in MSIprimary CRCs. In each tumor sample, the mean of standardizedhCt values of mutated genes, denoted by hCtStand(mut)s, and themean of standardized hCt values of wild-type genes, denoted byhCtStand(wild)s, were computed. To test the effect of the preliminarystandardized hCt values of UPF1 and UPF2, denoted respectively byhCtStand(UPF1)s and hCtStand(UPF2)s, on the difference betweenthe means for mutated genes and for wild-type genes, the followinglinear model has been fitted : hCtStand(mut)s2hCtStand(wild)s = a+b?hCtStand(UPF1)s+c?hCtStand(UPF2)s+es, where againes is a random error depending on the tumor samples. The values ofaand b and c were computed by least-square estimation. Two Studenttests were performed: a test for the null hypothesisH0 : the expressionof UPF1 has no effect on the difference of the means (b=0) versus thealternative H1 : b?0 and a test for the null hypothesis H0 : theexpression of UPF2 has no effect on the difference of the means (c=0)versus the alternativeH1 : c?0.
Testing the influence of the endogenous expression ofUPF1 or UPF2 on the overall number of Tumor InfiltratingLymphocytes (TILs) in MSI primary CRCs. As theresponse variable ‘‘the number of TILs’’ is discrete, a classicallinear model would not have been appropriated to investigate aneffect of UPF1 or UPF2 on it. The most common model in thisparticular case is the Poisson regression with a log link function.We checked that the log was the best link function. As aconsequence, the link between the number of TILs and theexpression of UPF1 and UPF2 is not linear but log-linear and thePearson correlation coefficient is not appropriate. The influenceof UPF1 and UPF2 expression on the numbers of TILs was thusinvestigated via a Wald test. Furthermore, the coefficients in thePoisson regression model were estimated via iteratively re-weighted least squares.
Supporting Information
Table S1 Genes expression data concerning HCT116 cells uponinhibition of UPF1 expression by siRNA. Only genes for which asignificant de-regulation was observed (1.5 fold-change up or downwith a p-value #0.005) in these conditions are listed.Found at: doi:10.1371/journal.pone.0002583.s001 (0.25 MBXLS)
Table S2 List of the target genes containing coding microsat-ellite sequences and up-regulated following UPF1 silencing inHCT116. In each case, the number of the exon containing thelonger coding repeat tract is indicated.Found at: doi:10.1371/journal.pone.0002583.s002 (0.09 MBXLS)
Table S3 Frameshift mutations in 18 target genes whosemRNAs were quantified in 44 MSI primary CRCs. WT: WildType; M: Mutated.Found at: doi:10.1371/journal.pone.0002583.s003 (0.04 MBXLS)
Table S4 List of the primers used for the screening of frameshiftmutations at coding microsatellite sequences contained in 24target genes for MSI in CRCs.Found at: doi:10.1371/journal.pone.0002583.s004 (0.03 MBPDF)
Acknowledgments
We thank Dr. Barry Iacopetta and Francois Petit for critical reading of themanuscript.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: AD. Performed the experiments:JE PD OB. Analyzed the data: AD JE AG FP. Contributed reagents/materials/analysis tools: JF AG EL DM IS Pd DA. Wrote the paper: AD FP.
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