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THÈSE

En vue de l'obtention du

DOCTORAT EN CO-TUTELLE

Délivré par l'Université Paul Sabatier - Toulouse III et l�Université Mohammed V-Faculté des sciences Rabat / Maroc

Spécialité : Chimie-Biologie-Santé

Présentée et soutenue par Mme ASMAE ZANZOUL Le 19 juin 2014

Titre : synthèse de ligands hétérocycliques polyaromatiques dérivés de quinoxaline pour le

ciblage de l�ADN G-quadruplex

JURY

Pr BENCHIDMI Mohammed, Professeur de l�Université Mohammed V-Agdal, Examinateur Dr BOMBARD Sophie, Chargé de recherche CNRS, l�Université Paris Descartes, Rapporteur Pr ESSASSI El Moktar, Professeur de l�Université Mohammed V-Agdal, co-Directeur de thèse Pr KANDRI RODI Youssef, Professeur de l'Université Sidi Mohammed Ben Abbdellah, Fès, Rapporteur Pr MALFANT Isabelle, Professeur de l�Université Paul Sabatier, Examinateur Dr PRATVIEL Geneviève, Directeur de recherche CNRS, Toulouse, co-Directeur de thèse

Ecole doctorale : Sciences de la matière Unité de recherche : Laboratoire de Chimie de Coordination-CNRS, Toulouse et le

Laboratoire de Chimie Organique Hétérocyclique-Faculté des sciences, Rabat Directeur(s) de Thèse : Pr ESSASSI El Mokhtar, Dr PRATVIEL Geneviève

Rapporteurs : Dr BOMBARD Sophie, Pr KANDRI RODI Youssef

A mon cher papa

En reconnaissance des sacrifices qu�il a toujours consentis pour moi, de son encouragement, son soutien, et de son aide morale et matérielle permanente. Que ce modeste travail soit pour lui un témoignage de mon infini respect et mon profond amour.

A ma famille, mon mari et mes amis

Aucune dédicace ne saurait vous exprimer mon grand attachement, vous trouverez ici la reconnaissance pour tous les services que vous avez pu me rendre.

A tous ceux qui me sont chers.

Remerciement

Le travail présenté dans ce mémoire a été réalisé en co-tutelle entre le Laboratoire

de Chimie Organique Hétérocyclique de la faculté des sciences, Université Med V à

Rabat et le Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS de Toulouse.

Je remercie vivement Mr Jean-Jacques BONNET, Professeur émérite de l'Université

Paul Sabatier de Toulouse, responsable du Laboratoire International Associé

(Laboratoire en Chimie Moléculaire Maroco-Français) de m'avoir permis de réaliser

cette thèse.

Je tiens à remercier tout particulièrement Mr Youssef KANDRI RODI et Mme Sophie

BOMBARD, pour avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs. Leur

présence à ce jury est un honneur et je leur en suis très reconnaissante.

Mr Mohammed BENCHIDMI et Mme Isabelle MALFANT, m'ont également fait

l'honneur de participer à ce jury de thèse. Je tiens à leurs adresser mes

remerciements pour leur implication dans l'évaluation de ce travail.

Ces travaux ont été effectués au sein de l'équipe de Mme Geneviève PRATVIEL,

Directeur de Recherche au CNRS, qui a assuré la co-direction de cette thèse. Je la

remercie de m'avoir accueille au sein de son équipe et en me proposant un sujet à

l'interface de la chimie et de la biologie, je la remercie aussi de m'avoir fait partager

ses larges connaissances scientifiques lors de nos discussions. Sa détermination et

sa rigueur scientifique ont été indispensables au bon déroulement de mes

recherches. Enfin, je la remercie chaleureusement pour ses encouragements et

surtout sa disponibilité, ayant toujours pris le temps de répondre à mes questions.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Mr El Mokhtar ESSASSI, Professeur à la

faculté des sciences à Rabat, qui m�a accordé l�occasion de faire une thèse en co-

tuttelle et qui a assuré aussi sa co-direction. Je le remercie de m'avoir fait partager

ses compétences et ses conseils ont été précieux tout au long de ces trois années

de travail.

J'adresse aussi mes remerciements aux différents services du LCC grâce auxquels

ce travail a pu être réalisé dans de très bonnes conditions : le service RMN et en

particulier Mr Yannick COPPEL, le service de spectrométrie de masse, Mme Laure

VENDIER pour les structures aux rayons X et le service de documentation.

Je souhaite également adresser de chaleureux remerciements aux membres de

l�équipe K : Jean, Anne, Marguerite, Vania, Jean-Luc, Céline, Michel, Aurélien. Je

remercie aussi Mr Christophe DROUER mon parrain de thèse, Mr ZARZOUF

professeur à l�ENS de Rabat et Mr RAMLI. Merci à vous pour vos conseils, vos aides

morale et matérielles et pour votre gentillesse.

Pour terminer, mes remerciements les plus forts reviennent à mon papa qui m�a

encouragée et soutenue pendant toutes ces années d'études et sans qui je n'aurais

pu aller au bout de mes projets.�

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I.��Les dérivés de la quinoxaline en biologie��

1.� Activité antimicrobienne��

2.� Activité anti-inflammatoire��

3.� Activité antivirale��

4.� Activité anti tumorale��

II.��Ciblage des G-quadruplex de l�ADN��

1.� Télomères et G-quadruplexes télomériques ; structures et rôles biologiques��

2.� Télomérase��

III.��Ligands de G-quadruplex��

1.� Principaux ligands d�ADN quadruplex��

2.� Les méthodes biophysiques pour évaluer l�affinité d�un ligand pour l�ADN quadruplex��

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2.1� La mesure de dénaturation thermique par FRET��

2.2� La méthode G4-FID (G-quadruplex Fluorescent Intercalator Displacement assay)��

2.3� Autres méthodes pour mesurer l�affinité et la sélectivité des ligands��

IV.��Objectifs : Synthèse et caractérisation des nouveaux ligands d�ADN quadruplex à base

de quinoxaline��

V.��References bibliographiques��

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��ntroduction��

II.��Synthèse du noyau pentacyclique dérivé du benzimidazole��

��Quaternarisation��

��Conclusion��

��Références bibliographiques��

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I.��Introduction��

II.��Synthèse des noyaux tetracyclique dérivés du 6H-indolo[2,3-b]quinoxaline��

1.� Alkylation d�indole-2,3-dione (isatine)��

2.� Condensation d�isatine N-substituée avec l�o-phénylènediamine non substituée��

III.��Quaternarisation��

IV.��Conclusion��

V.��Références bibliographiques��

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I.��Introduction��

II.��Synthèse du noyau polycyclique dérivé du triazoloquinoxaline��

III.��Conclusion��

IV.��Références bibliographiques :��

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I.��Etude de l�interaction des ligands avec les G-quadruplex de l�ADN télomérique par la

méthode de FRET��

II.��tests sur l�enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis��

III.��Conclusions et perspectives��

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INTRODUCTION GENERALE

1

Le présent travail a été réalisé au Laboratoire de Chimie de Coordination, CNRS

de Toulouse sous la direction du docteur PRATVIEL Geneviève et au Laboratoire de

Chimie Organique Hétérocyclique du département de chimie de la Faculté des

Sciences de l�Université Mohammed V-Rabat Agdal sous la direction du professeur

ESSASSI El Mokhtar, concerne la synthèse de dérivés de quinoxaline susceptibles

de présenter des propriétés pharmacologiques potentielles.

Ce mémoire est composé de cinq chapitres:

Le premier chapitre présente un rappel bibliographique sur les différentes

activités pharmacologiques des dérivés de la quinoxaline. L�objectif principal de la

thèse étant la synthèse de nouveaux ligands d�ADN quadruplex à base de

quinoxaline, une présentation de l�ADN G-quadruplex, des ligands existant suit.

Le chapitre deux, intitulé « Synthèse et caractérisation d�une molécule de la

famille benzimidazopyridoquinoxaline », explore la synthèse et la caractérisation d�un

produit pentacyclique de structure plane qui présente une fluorescence très

importante, ainsi que sa quaternarisation dans le but d�augmenter l�hydrophilie de ce

composé et l�affinité pour l�ADN quadruplex.

Le chapitre trois est relatif à la synthèse et la caractérisation des molécules de la

famille indoloquinoxaline en deux étapes : une alkylation de l�isatine suivie d�une

condensation avec l�o-phénylènediamine non substituée, ainsi que la

quaternarisation de ces molécules pour améliorer la solubilité dans l�eau et l�affinité

pour l�ADN quadruplex.

Le quatrième chapitre concerne la synthèse et la caractérisation de molécules de

la famille triazoloquinoxaline.

2

Le chapitre cinq est intitulé : « tests biologiques ». Il comprend d�une part une

étude sur l�interaction des produits synthétisés avec les G-quadruplex de l�ADN

télomérique par la méthode de FRET et d�autre part des tests sur l�enzyme InhA de

Mycobacterium tuberculosis.

Enfin, nous terminerons par une conclusion générale.

Chapitre I

INTRODUCTION bibliographique

3

I. Les dérivés de la quinoxaline en biologie

La quinoxaline, également appelée un benzopyrazine en chimie organique, est un

composé hétérocyclique contenant un complexe d�anneau composé d�un anneau de

benzène et d�un anneau de pyrazine (Figure 1).

N

N

1

2

3

4

4a

5

6

7

88a

Figure 1 : structure de la quinoxaline (benzopyrazine)

Les dérivés de quinoxaline constituent une classe de composés hétérocycliques

présentant diverses applications dans divers domaines. Ils ont été étudiés de

manière intensive pour la synthèse de composés biologiquement actifs allant

d'herbicides et de fongicides à des médicaments utilisables en thérapeutique. Ces

études ont conduit à la découverte d'une grande variété de composés qui sont d'un

grand intérêt du point de vue antimicrobien, antifongique, antiviral, anti-inflammatoire

et des effets anti-tumoraux, entre autres.

1. Activité antimicrobienne

Les agents antimicrobiens sont essentiels pour le traitement d'un certain nombre de

maladies d'origine bactérienne ou fongique. Récemment, cependant, les bactéries

ont acquis une résistance aux médicaments et ainsi le développement de nouveaux

agents antimicrobiens est nécessaire[1].

Citons à titre d�exemple :

Les composés A, B, C et D (Figure 2) possèdent une activité antimicrobienne [2] et

la 9,10-diméthyl-2-méthoxy-6-oxo-7,12-dihydro-chromo-[3,4-b]quinoxaline, composé

E (Figure 2), possède deux activités, antibactériens et antifongiques[3].

4

NH

NF3C CH2Br

O

A

NH

N

O

Cl

F3C

CH3

CH3

B

NH

N CH2Br

CH2Br

Cl

F3C NH

N CF3

O

Cl

F3C

C D

HN

NH

OCH3

CH3

OCH3

O

E

Figure 2 : structure chimique des composés A, B, C, D et E

Il existe aussi les dérivés de thiadiazolo[2,3]imidazo[4,5 b]quinoxaline, composé F

(Figure 3), qui ont montré aussi une bonne activité antibactérienne et antifongique[4].

HN

NH

N

N

O

O

O

O

N

NS

N R

F

Figure 3 : structure chimique du composé F

2. Activité anti-inflammatoire

Dans la recherche de nouveaux agents anti-inflammatoires, 2 (1H)-quinoxalinones et

leurs dérivés hexahydro ont été préparés[5]. Le 2 (1H)-quinoxalin 4-chloro-phényl-2

,3-dihydro thiazole, composé G (Figure 4), présentait la plus forte activité anti-

inflammatoire sans provoquer d'effets secondaires de l'ulcère comme la COX-2

sélectifs inhibiteur célécoxib.

5

N

HN O

NH

O

N

S

Cl

S

G

Figure 4 : structure chimique du composé G

Burguete et al.[6] ont étudié l'activité anti-inflammatoire et antioxydante de

plusieurs quinoxalines pour trouver que le composé H (Figure 5) présentait

l'activité la plus intéressante.

N

N O

OH

O

O

O

H

Figure 5 : structure chimique du composé H

3. Activité antivirale

Depuis 2005, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime que dans le monde

entier plus de 40 millions de personnes ont été infectées par le virus de

l'immunodéficience humaine (VIH). En particulier l�Amérique du Sud est confrontée à

un nombre croissant d'infections par le VIH qui ont besoin d'un traitement antiviral

efficace, sélectif, disponible et avec une production à grande échelle et à faible coût

pour les rendre accessibles aux patients des pays en développement.

Plusieurs dérivés de quinoxaline présentent une activité contre le VIH plus

intéressante que les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (RT)[7, 8].

Certains de ces dérivés synthétisés par Gris et al.[9] présentent une bonne activité

inhibitrice contre des cellules tumorales humaines et le lymphome lié au VIH-1.

De grands efforts ont été consacrés à la conception de composés qui agissent

comme inhibiteurs sélectifs du VIH-1, dans le cas présent une série de nouveaux

dérivés de N4-(hétéro) arylsulfonylquinoxalinone, (Figure 6I), ont été préparés par Xu

et al.[10].

6

Parmi tous les composés synthétisés, cinq composés présentaient des activités anti-

réplication de VIH-1 puissants avec une valeur de CI50, au niveau de 10-7 mol / L.

NH

N

Ia-h

F

S

R

O

O

Ar

O

Figure 6 : structure chimique du composé Ia-h

Compound R ArSO2 IC50b (µM)

Ia H Quinoline-8-sulfonyl 0.98

Ib H 3-Cyanobenzene-1-sulfonyl >100

Ic H 2-Methyloxycarbonylthiophene-3-sulfonyl 2.02

Id CH3 Quinoline-8-sulfonyl 7.0

Ie CH3 4-Nitrobenzene-1-sulfonyl >100

If CH3 3-Cyanobenzene-1-sulfonyl 55

Ig CH3 2-Methyloxycarbonylthiophene-3-sulfonyl 0.2

Ih CH3 2,5-Dichlorothiophene-3-sulfonyl >100

Tableau 1: Activité antivirale des composés Ia-h[10].

De même, d'autres dérivés de quinoxalinone ont des propriétés antivirales[11, 12].

De nombreuses études ont montré l'activité de quelques composés de quinoxaline

pour le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1), y compris le 6,7- diméthyl-2-

(pent-4-ényloxy)quinoxaline, composé J (Figure 7)[13] et le composé K (Figure 7),

qui inhibent le VIH-1 RT[14].

N

N

J

ON

HN

Cl

OO

S

K

Figure 7 : structure chimique des composés J et K

4. Activité anti tumorale

La multirésistance (MDR) est un problème critique dans le traitement

chimiothérapique du cancer. La glycoprotéine transmembranaire (P-gp) est la raison

la plus fréquente de cette résistante. La P-gp est un transporteur ATP dépendant qui

7

effectue un transport unilatéral des médicaments de l�intérieur vers l�extérieur des

cellules, ce qui rend les cellules cancéreuse résistantes au traitement

médicamenteux.

Une gamme d'agents qui peuvent inverser le phénotype MDR et restaurer la

sensibilité aux médicaments pour les cellules cancéreuses ont été développés[15,

16]. Cependant, la plupart de ces agents se sont révélés être toxique ou présentent

des effets indésirables.

Sun et al.[17] ont conçu et synthétisé une série de dérivés de 1,3-diméthyl-1H-

quinoxalin-2-ones. Ils ont constaté que certains des composés ont un effet potentiel

d'inhibition sur le phénotype MDR du cancer.

Piras et al.[18] ont pris en compte en tant que modèles d�antifoliques soit le classique

méthotrexate (améthoptérine) ou le non-classique trimetrexate (dérivé de

quinazoline) ainsi que les dérivés dideazafoliques correspondants. Dans ce contexte

ils ont montré que le remplacement bioisostérique de cycle ptéridine avec

6(7)trifluoromethylquinoxaline offre un bon substrat pour l'activité biologique dans la

série des analogues d�antifoliques classiques.

Il existe de nombreux dérivés de quinoxaline qui ont montré une activité

antitumorale[19] ont montré que la 5,7-diamino-3-phényl-2-[(3,5-diméthoxy) phénoxy]

quinoxaline, composé L (Figure 8), a une activité antitumorale in vitro. De plus, le 3-

(4-bromo-phényl)-2-(éthylsulfonyl)-6 méthylquinoxalin-1,4-dioxyde, composé M

(Figure 8), présente une activité contre la tumeur dans l'étape de l'hypoxie, qui est

une phase où la tumeur présente une résistance au cours de la chimiothérapie et la

radiothérapie[20].

N

N

L

OH2N

N

N

O

M

H3CO OCH3

NH2

O

S

O

O

Br

Figure 8 : structure chimique des composés L et M

8

D�autres composés, dérivés de quinoxalinone, ont été soumis à un dépistage

primaire d�activité anticancéreuse dans le programme de dépistage anti-tumorale in

vitro, contre un groupe de 60 lignées cellulaires tumorales humaines[21]. L'activité de

chaque composé testé a été déduite par une courbe dose-réponse en fonction des

données fournies par l�Institut National du Cancer (NCI). Le composé N (Figure 9) a

été trouvé comme ayant une activité anticancéreuse in vitro encourageante à une

concentration de 10-4 M.

Des sélectivités intéressantes ont également été enregistrées entre 10-8 et 10-6 M

pour les composés O et P (Figure 9).

N

HN

N O

O

N

Cl

CH2Br N

N COOH

OO

OH

N

N 2-Th

O

NH-gluEt

O

P

Figure 9 : structure chimique des composés N, O et P

Au cours des dernières années, les dérivés de la quinoxaline ont un énorme succès

dans les domaines biologiques et pharmacologiques.

En conclusion, l�étude de ces dérivés a montré que la modification structurale peut

améliorer son profil pharmacologique conférant un potentiel antibactérien,

anticancéreux, anti-VIH, et anti-inflammatoire.

II. Ciblage des G-quadruplex de l�ADN

1. Télomères et G-quadruplexes télomériques ; structures et rôles

biologiques

Les télomères, complexes nucléoprotéiques constituent les extrémités des

chromosomes, ils existent chez toutes les espèces eucaryotes et ont un rôle de

protection contre les événements provoquant une instabilité génétique, entrainant

des dégradations, des recombinaisons, ou encore des fusions inter-

chromosomiques. L�extrémité 3� des télomères est simple brin sur quelques

centaines de bases (la longueur varie selon les organismes et les types de cellules),

9

sur cette extrémité on retrouve des copies répétées de séquences de type TTGGGG

(retrouvées chez un protozoaire cilié : Tetrahymena) ou TTAGGG (retrouvées chez

l�Homme) (Figure 10).

Figure 10 : ADN télomérique humain.

Dans une cellule normale, à chaque réplication cellulaire, les télomères sont

raccourcis, du fait de l�incapacité de l�ADN polymérase à les répliquer complètement.

Quand l�extrémité télomérique a atteint une certaine taille, la cellule arrête de se

diviser puis meurt. Par contre dans les cellules cancéreuses il a été constaté que les

télomères ne raccourcissent pas et la cellule devient immortelle.

Les mécanismes de maintenance de la longueur des télomères sont de deux sortes.

Dans 85% des cellules cancéreuses le maintien des télomères est assuré par une

enzyme spécifique : la télomérase. Dans les 15% restants la longueur des télomères

est maintenue, en absence de télomérase, par un mécanisme appelé alternative

lengthening of telomeres (ALT)[22].

Nous nous intéresserons ici aux structures G-quadruplex intramoléculaires formées

par l�ADN télomérique humain. Une structure d�ADN quadruplex a été caractérisée in

vitro par cristallographie, diffraction des rayons X par Parkinson et al.[23]. Elle

présente une structure dite « parallèle » où tous les brin sont parallèles (Figure 11B).

Les conditions de cristallisation pourraient influencer la formation d�un tel repliement.

Enfin deux autres structures formées par la séquence télomérique modifiée à ses

10

extrémités ont été déterminées par spectroscopie RMN par Wang et Patel[24]. C�est

une structure « antiparallèle » avec deux brins orientés dans un sens et les deux

autres en sens inverse (Figure 11A). Une structure dite « hybride » pour laquelle trois

brins sont parallèles et le quatrième inversé ont été décrites par Luu et al.[25] (Figure

11C), Phan et al.[26] (Figure 11D).

La structure d�ADN quadruplex a également été mise en évidence in vivo au niveau

des télomères du cilié stylonychia lemnae à l�aide d�anticorps par Schaffitzel et

al.[27].

A B C D

Figure 11 : structure des quadruplexes intramoléculaires pour la séquence télomérique humaine : A. forme antiparallèle (RMN / Na+)[23]. B. forme parallèle (RX / K+)[22]. C. forme hybride (RMN /

K+)[24]. D. forme hybride (RMN / K+)[25].

Les brins d�ADN riches en G peuvent ainsi former des structures à 4 brins appelées

quadruplexes de guanine ou G-quadruplexes, résultant de l�empilement de plusieurs

G- quartets. Ces G-quartets résultent de l�association de quatre guanines coplanaires

par des liaisons hydrogène de type Hoogsteen (Figure 12A).

L�empilement de ces quadruplexes de guanine est stabilisé par interaction de !-

stacking (Figure 12B) et les G-quadruplexes ne peuvent se former qu�en présence de

cations qui sont piégés entre deux tétrades de guanine par coordination avec huit

atomes d�oxygène des groupements carbonyles des guanines à condition que leur

rayon ionique corresponde bien à la taille de la cavité entre les deux tétrades de

guanine[28, 29]. Ainsi, les ions de potassium K+, présents en milieu biologique,

induisent la plus grande stabilité des quadruplexes de guanine. Les ions Na+, eux

aussi présents en milieu biologique, stabilisent cette structure mais dans une

moindre mesure, alors que la présence d�ion Li+ n�induit pas de stabilisation[29].

11

Figure 12 : A. Tétrade de guanines. M+ est un cation, métallique ou non. B. G-quadruplexe : les guanines constituant les tétrades sont représentées en jaune, les acides nucléiques constituant les

boucles en bleu et le cation en rouge[30].

La structuration des acides nucléiques riches en guanines sous forme de quadruplex

a été mise en évidence dans les cellules initialement au niveau des télomères[27].

Cependant, il a pu être montré par la suite que ces structurations particulières

peuvent également se rencontrer dans des zones d�ADN non télomérique[31]ainsi

qu�au niveau des ARNs[32]. La connaissance précise des structures et du rôle

biologique de ces acides nucléiques G-quadruplex in vivo constitue une aire de

recherche très active à l�heure actuelle[33, 34].

2. Télomérase

La réplication de l�ADN à l�extrémité des chromosomes eucaryotes fait donc

intervenir une enzyme particulière appelée télomérase qui permet de maintenir la

longueur des télomères, en luttant contre leur érosion naturelle.

La télomérase est une reverse transcriptase, mise en évidence en 1985 dans le

microorganisme cilié Tetrahymena par Greider et al.[35]. Elle est constituée d�une

sous unité catalytique hTERT et d�une séquence d�ARN hTR servant de matrice pour

l�addition de nucléotides à l�extrémité simple brin du télomère[36]. Il a été montré que

A B

12

l�inhibition de la télomérase entraîne un arrêt de croissance des cellules tumorales

par raccourcissement des télomères[37]. De façon intéressante, l�activité télomérase

est très significative dans la majorité des cellules cancéreuses et faible voire

inexistante dans la plupart des cellules somatiques normales. De plus, les télomères

de la plupart des cellules cancéreuses sont plus courts que ceux des cellules

germinales. Cette enzyme constitue donc un marqueur du cancer chez l�homme et

c�est une cible intéressante en stratégie anticancéreuse.

Les structures en G-quadruplex apparaissent très particulières et totalement

différentes des cibles pharmacologiques habituelles comme l�ADN ou les protéines.

Elles offrent la possibilité de concevoir des petites molécules capables de les

reconnaître et les stabiliser spécifiquement in vivo. Elles constituent des cibles

pharmacologiques nouvelles. Donc la stabilisation de ces structures au niveau des

télomères par des ligands synthétiques spécifiques, va entrainer la perturbation de la

fixation de plusieurs protéines télomériques et aussi la modification de la

conformation du substrat de l�enzyme télomérase. Cette stabilisation a démontré une

capacité à inhiber la télomérasse in vitro[38-41].

Les G-quadruplexes sont donc susceptibles de jouer un rôle dans plusieurs

processus biologique. Cette activité biologique a conduit a la recherche des ligands

reconnaissant ces structures et au développement de techniques qui permettant

l�évaluation d�affinité et la sélectivité d�un ligand potentiel pour l�ADN quadruplex.

III. Ligands de G-quadruplex

Dans ce paragraphe, nous présenterons d�abord les ligands d�ADN G-quadruplex les

plus efficaces connus à ce jour puis les différentes techniques utilisées pour l�étude

de leur interaction avec l�ADN quadruplex.

1. Principaux ligands d�ADN quadruplex

Les molécules capables de reconnaître les structures G-quadruplex d�acides

nucléiques appelées « ligands de G4 » sont actuellement considérées comme de

potentiels composés anticancéreux[42-46]. Le ciblage de l�ADN télomérique par des

ligands de G-quadruplex interfère avec le bon fonctionnement des télomères[47-49]

et le ciblage des séquences capables de se structurer en G-quadruplex dans les

promoteurs de gènes ou dans les régions 5�-UTR des ARN messagers inhibe la

biosynthèse des protéines correspondantes[50-55]. Il est frappant de trouver des

13

structures quadruplex dans les promoteurs de certains gènes responsables du

cancer comme c-kit, c-myc et bcl-2[53-55]. Une activité antitumorale in vivo a été

reportée pour deux composés, le BRACO-19[47] et le RHPS4[48-57] et une molécule

ligand de G-quadruplex, la quarfloxin CX-3543, est le seul composé entré récemment

en phase clinique (Figure 13)[58].

N

NH

N

NH

NH

O

NH

NH

O

N

N

F

FO

N

NH

N

N

N N

F

O O

CX3543RHPS4BRACO-19

Figure 13 : structures des composés ligands de G-quadruplex possédant une activité antitumorale.

On peut citer aussi des macrocycles tel que la télomestatine[41, 47, 54, 59-62], un

produit naturel isolé chez Streptomyces anulatus, caractérisé en 2001 par Kazuo

Shin-Ya et al.[60]. La porphyrine tetra-cationique TMPyP4, malgré sa faible

sélectivité[63] est utilisée régulièrement comme ligand de G-quadruplex en raison de

sa disponibilité commerciale. La récente structure cristalline de cette molécule avec

un G-quadruplex formé par la séquence télomérique humaine[64] montre qu�il n�y a

pas de contact direct de ligand avec les G-tétrades (pas d�intercalation de TMPyP4

entre les G-tétrades adjacentes). Dans ce complexe G-quadruplex-TMPyP4, deux

modes de liaison assez différents sont observés avec deux molécules de TMPyP4

liées en contact seules avec les basses TTA au niveau des boucles.

Une molécule TMPyP4 est empilée sur une paire de bases AT qui est formée à partir

de la thymine de l�extrémité 5� et l�autre molécule est empilée à l�extérieur sur les

bases thymine au niveau des boucles TTA (Figure 14).

14

A B

Figure 14 : A. schéma de la structure d�un complexe quadruplex-TMPyP4, montrant la topologie de

repliement, la numérotation des nucléotides, la géométrie de la boucle TTA étendu, et deux

molécules TMPyP4 liés par unité asymétrique. Bases de guanine sont de couleur verte, adénines

rouge et thymines bleu. B. structure cristalline le long des colonnes du complexe quadruplex-

TMPyP4, montrant les molécules de porphyrine en mode de remplissage d'espace (de couleur

orange), le squelette désoxyribose-phosphate de quadruplex (de couleur jaune), et les ions de

potassium (couleur bleu)[64]

Le macrocycle BOQ1[65] est utilisé aussi comme ligand de G-quadruplex (Figure

15).

S

N N

O

N

O

N O

N

ON

O

N

O

NO

Telomestatin

N

N HN

N N

NH N

CH3

CH3H3C

N

CH3

TmPyP4

N N

NHHN

NH

NH

HN

HN

N N

BOQ1

Figure 15 : Exemples de ligands macrocycliques de G-quadruplexes.

15

Il existe d�autre part plusieurs ligands possédant une large surface aromatique plane

(Figure 16), tels que le pérylène diimide ou PIPER, molécule très aromatique

condensée, un ligand inhibiteur de la télomèrase[66], les dibenzophénanthrolines ou

quinacridines par exemple le MMQ3, mono-méta-quinacridine[38, 67].Les triazines

telles que la 12459, bisquinolinium triazine[68] et les pyridodicarboxamide 360A[67]

sont deux molécules qui stabilisent le G-quadruplex intramoléculaire formé par la

séquence télomérique humaine en test de dénaturation thermique suivie par FRET.

Récemment, Neidle et al. ont montré que le complexe de nickel Ni(II)-salphen

stabilisait fortement la structure quadruplexe[69].

N

NH

N

NN

NH

N

NH2

12459

N

NH

N

HN

N

O O

360A

N

N

RH2N

NH2R

MMQ3

NNN

N

O

O

O

O

PIPER

N

O

N

O

X

R R

Ni

N

R=

X= H, F

Ni(II)-salphen

Figure 16 : Exemples de ligands d�ADN G-quadruplex.

La métalloporphyrine de manganèse(III), synthétisée au laboratoire[70], est un

composé combinant un c�ur aromatique et quatre bras cationiques flexibles qui

s�est avéré capable de discriminer par un facteur de 104 entre l�ADN quadruplex et

16

l�ADN duplex (Figure 17).

N

N

N

N

HNNH

NH HN

O

OO

O

N

NN

N

Mn5Cl

Figure 17 : Métalloporphyrine de manganèse (III)

Le dérivé phénanthroline bisquinolinium, Phen-DC3, est un composé qui cible

spécifiquement l�ADN G-quadruplex et qui montre des effets biologiques in vivo.

L�analyse RMN de la structure d�un complexe de ce composé avec l�ADN quadruplex

dérivé de la séquence c-myc a révélé que Phen-DC3 interagit par un large �-

stacking avec la G-tétrade extérieure du quadruplex[71] (Figure 18).

NH HN

N N

O O

Figure 18 : structure de la molécule Phen-DC3

La pyridostatin (PDS) (Figure 19) est un autre ligand spécifique de quadruplex

récent. Ce composé a permis de mettre en évidence les structures d�ADN

quadruplex intracellulaires[72, 73].

17

N

NH HN

N N

O O

O

H2N

O

NH2

O

NH2

Figure 19 : structure de la molécule PDS

Les molécules ligands de G-quadruplex doivent posséder une forte constante

d�affinité pour l�ADN quadruplex mais ne doivent pas interagir avec l�ADN double brin

constituant les chromosomes.

Ces molécules doivent donc être planes, étendues, aromatiques pour interagir par

p-p stacking avec les tétrades de guanines, chargées positivement pour avoir une

bonne affinité avec les charges négatives de l�ADN et enfin être incapables de

s�intercaler entre les plateaux de bases de l�ADN double brin.

Cependant, très peu de molécules décrites s�avèrent sélectives des structures

quadruplex d�ADN par rapport à l�ADN double-brin[67, 70, 74, 75] ce qui explique

peut-être le nombre restreint de composés actuellement en clinique.

2. Les méthodes biophysiques pour évaluer l�affinité d�un ligand pour

l�ADN quadruplex

L�objectif de ce paragraphe est d�exposer les méthodes biophysiques les plus

communément utilisées jusqu�à présent pour l�étude des ligands d�ADN quadruplex.

2.1 La mesure de dénaturation thermique par FRET

C�est une méthode décrite par Mergny et al.[76] à moyen haut débit pour identifier

rapidement de nouvelles molécules ligands des ADNs G-quadruplex et tester leur

sélectivité vis-à-vis d�autres structures d�ADN.

Cette technique se base sur la dénaturation thermique d�un oligonucléotide structuré

en quadruplex d�une séquence télomérique humaine liée de façon covalente à des

fluorophores.

18

Le chauffage de cette séquence télomérique entraine la perte de sa structure

secondaire par rupture des liaisons hydrogènes. La température de fusion T1/2 est

définie comme la température de demi-dissociation de l�ADN. L�ajout à la solution

d�ADN étudiée d�un composé se fixant préférentiellement sur sa structure entraine le

retard de la fusion de l�ADN structuré. Donc plus l�affinité du composé est importante,

plus l�effet stabilisant (!T1/2, différence entre les températures de fusion de l�ADN en

présence du composé et de l�ADN seul), est grand. On peut donc évaluer par cette

méthode des affinités relatives de composés pour une structure d�ADN donnée

(Figure 20).

Figure 20 : dénaturation thermique de l�ADN quadruplex seul (courbe rouge) et en présence d�un composé (courbe bleu)

La méthode de dénaturation thermique suivie par FRET (Fluorescence Resonance

Energy Transfer ou Transfert d�énergie de fluorescence par résonance), développée

par Mergny et al, utilise l�oligonucléotide F21T. C�est un 21-mer contenant 3

répétitions de la séquence télomérique humaine (GGGTTA)3GGG), susceptible de se

structurer en G-quadruplex et portant deux fluorophores : la fluorescéine (donneur,

"abs 490 nm, "ems 520 nm) en 5� et la tétraméthylrhodamine (accepteur, "abs 515 nm,

"ems 588 nm) en 3� (Figure 21(A et B)). Cette dénaturation s�effectue en présence de

cation lithium qui stabilisent peu l�ADN quadruplex, de façon à obtenir une

température de fusion accessible (dans un tampon cacodylate lithium 10 mM,10 mM

KCl et LiCl 90 mM, la température de fusion T1/2 de l�oligonucléotide F21T est de

43,2°C)[76].

Lorsque l�oligonucléotide est sous forme simple brin, les deux fluorophores sont trop

éloignés l�un de l�autre pour que le FRET ait lieu. Lorsque l�oligonucléotide est

structuré en G-quadruplex, la distance entre les deux fluorophores est suffisamment

�T1/2

Fluorescence at 515 nm

Temperature (°C)

19

faible et l�excitation de la fluorescéine entraîne la fluorescence de la

tétraméthylrhodamine. La mesure est effectuée en excitant le système à 470 nm et

en suivant la restauration de la fluorescence de la fluorescéine (515 nm) avec

l�augmentation de la température. La température de fusion (T1/2) est définie comme

la température où l�intensité relative de fluorescence est de 0,5.

Pour pouvoir étudier l�affinité d�un ligand pour l�ADN quadruplex par la méthode de

FRET, un ligand potentiel ne doit pas fluorescer dans la même zone que la

fluorescéine. La plupart des ligands de quadruplex connus à ce jour ne posent pas

ce problème.

La dénaturation thermique par FRET peut être réalisée aussi en présence d�un

duplex compétiteur non marqué. Si le ligand est peu sélectif de l�ADN quadruplex, il

va se répartir entre les deux espèces, donc stabilise moins le quadruplex et le !T1/2

va diminuer.

Figure 21: A. principe de la mesure de !T1/2 par FRET, B. phénomène de FRET

2.2 La méthode G4-FID (G-quadruplex Fluorescent Intercalator Displacement

assay)

C�est une méthode simple et rapide qui permet d'évaluer l'affinité d'un composé pour

l'ADN G-quadruplex et sa sélectivité vis-à-vis de l'ADN double brin. C�est un dosage

basé sur la perte de fluorescence de thiazole orange (TO) (Figure 22) lors de son

déplacement compétitif par un ligand.

FRET Pas de FRET

20

N

N

S

Figure 22: Structure de thiazole orange (contre-ion : p-CH3(C6H4)SO3- ).

Le TO est très fluorescent lorsqu�il se trouve en interaction avec l'ADN G-quadruplex

et non fluorescent quand il est libre en solution. Des études préliminaires ont

démontré que le TO se lie à l'oligonucléotide 22AG-quadruplex (22-mer, 5�-

A(G3TTA)3G3-3�) de manière à site unique avec une forte affinité (Ka = 3x106 M-

1)[77]. La capacité de déplacement du TO d'un ligand donné peut être aisément

suivie par la diminution de la fluorescence de TO (lmax = 539 nm lors de l'excitation

sélective à 501 nm).

Le test est réalisé avec un mélange de 22AG-quadruplex pré-structuré (0,25 µM) et

TO (0,50 µM), dans un tampon cacodylate de sodium 10 mM, pH 7,3, 100 mM K+.

L�addition d'une quantité croissante de ligand (de 0,5 à 10 équiv.) est suivie par une

période d'équilibrage de 3 min avant la mesure du spectre de fluorescence[77].

Les résultats du test sont présentés sous forme d�une courbe qui présente le

pourcentage de TO déplacé en fonction de la concentration de ligand ajouté qui

permet de quantifier précisément le déplacement TO induite par le ligand. Une valeur

de G4DC50 a été définie comme la concentration nécessaire de ligand 22AG pour

déplacer 50% de TO. De même que pour le test de FRET melting, il est possible de

mesurer avec le test G4-FID, l�influence de l�ajout d�un excès d�ADN double-brin sur

la capacité de déplacement du TO par un ligand et d�évaluer ainsi la sélectivité du

ligand testé pour l�ADN G-quadruplex.

De manière remarquable, dans la plupart des cas, les résultats de G4-FID sont en

bon accord avec les données de FRET. A titre d�exemple, la TMPyP4, ligand d'ADN

G-quadruplex connu pour interagir par �-staking avec les tétrade extérieures de

21

guanines, présente une haute capacité pour le déplacement du TO, G4DC50 = 0,106

µM[77].

En conclusion, ce test «facile à utiliser» offre comme le test de FRET melting, la

possibilité de tester un grand nombre de ligand potentiels sur tout G-quadruplex

d'intérêt biologique. Il représente donc un outil intéressant.

2.3 Autres méthodes pour mesurer l�affinité et la sélectivité des ligands

Il existe d�autres méthodes communément utilisées pour évaluer l�affinité et la

sélectivité quadruplex/duplex d�un ligand potentiel. Parmi ces méthodes on peut citer,

la résonance plasmonique de surface (SPR), la spectrométrie de masse à ionisation

par electrospray (ESI-MS), la dialyse à l�équilibre et les titrations en spectroscopie de

fluorescence et d�absorbance. Ces techniques permettent en théorie d�accéder aux

nombre de sites de fixation des molécules et à leurs valeurs de constantes d�affinité

mais elles possèdent en même temps des inconvénients majeurs :

- Un débit limité

- Des contraintes de tampon pour l�ESI-MS (NH4+)

- Des interactions des molécules avec la surface de la puce en SPR et les

difficultés rencontrées avec cette technique lorsque les molécules sont

solubilisées dans des solvants organiques tels que le DMSO

- La nécessité de propriétés spectrales exploitables des molécules.

Toutes ces méthodes peuvent être utilisées non seulement pour estimer une

sélectivité quadruplex/duplex mais aussi pour comparer l�affinité d�un composé pour

plusieurs formes quadruplexes. Or la méthode de FRET reste la méthode à moyen-

haut débit nécessaire pour identifier rapidement de nouvelles molécules liant les G-

quadruplex et tester leur sélectivité vis-à-vis d�autres structures d�ADN.

IV. Objectifs : Synthèse et caractérisation des nouveaux ligands d�ADN

quadruplex à base de quinoxaline

Comme nous l�avons présenté plus haut, les structures en G-quadruplex constituent

une cible biologique extrêmement étudiée pour laquelle de nombreux ligands ont été

développés dans le but de les stabiliser. Ce contexte nous a conduit à nous

22

intéresser à la synthèse de nouveaux ligands de l�ADN quadruplex à base de

quinoxaline qui comportent 4 à 5 cycles aromatiques contigus constituant une forte

base d�interaction par p-p stacking avec les tétrades de guanines (Figure 23). Ces

composés quinoxaliniques sont susceptibles de présenter des propriétés

pharmacologiques potentielles[78-80], des propriétés anti-inflammatoires[6, 81], anti-

bactériennes[2, 3], antivirales[7, 8, 12] et aussi anticancéreuses[18].

N

N

N N

N N

N

N

N N

N

R3

R1

R2

R3 R4

R1

R2

R3

R4R1

R2

A- benzymidazopyridoquinoxaline B- indoloquinoxaline C- triazoloquinoxaline

R

Figure 23: structure des ligands de G-quadruplex préparés et testés sur le F21T par la méthode de

FRET

Ces macrocycles seront ensuite quaternarisés pour améliorer la solubilité dans l�eau

et l�affinité vers l�ADN quadruplex. Quelques exemples d�aromatiques azotés

quaternisés ligands G-quadruplex peuvent être trouvés dans la littérature tels que la

bis-quinoléine dérivé 360A[67], des dérivés de bromure d'éthidium[82], des dérivés

d'acridine pentacycliques comme le RHPS4[83, 84] et le dérivé berbérine[85-87].

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Chapitre II

Synthèse et caractérisation d�une

molécule de la famille

benzymidazopyridoquinoxaline

27

I. Introduction

Une seule méthode a été décrite, à notre connaissance, pour la synthèse de ce

produit. Elle a été décrite par Zniber et al.[1]. Il s�agit d�une condensation de la

sérine 1 avec l�o-phénylènediamine 2 en milieu HCl (5,5 N) à reflux pendant trois

jours (Schéma 1).

Cette réaction conduit à deux types de produits :

ü Un système bicyclique de type 3-méthyl-quinoxaline 3

ü une structure pentacyclique dérivée du benzimidazole 4

N

N

NN

NH2

NH2

+

HO CO2H

NH2 NH

N

O+

HCl 5.5N

a reflux / 3j

21

43

Schéma 1 : synthèse du produit 4 dérivé du benzimidazole

L�obtention du produit 3 peut s�expliquer selon le schéma réactionnel suivant

(Schéma 2) :

La sérine subit, en milieu acide, une déshydratation, conduisant ainsi, à la 2-

méthylidène glycine qui peut exister sous la forme tautomère de structure acide 2-

imino propionique. Ce dernier, en milieu acide et sous l�action du groupe amino de

l�o-phénylènediamine, donne un intermédiaire qui subit une cyclisation

intramoléculaire suivie de la perte d�une molécule d�eau et d�ammoniac pour

conduire à la 3-méthyl-quinoxalin-2-one 3

28

HO NH2

COOH +H

-H2O

COOH

H2NCOOH

HN

COOH

H2N

+H

NH2

NH2

+

NH

N

O

-NH3

3

1

2

HN

NH2

O

OH

NH2

-H+

-H2O

Schéma 2 : mécanisme réactionnel pour obtenir le produit 3

La formation du composé pentacyclique 4, peut être expliquée selon le mécanisme

suivant :

En milieu acide les 2 formes tautomères précédemment obtenues, après

déshydratation de la sérine, réagissent entre elles. La 2-méthylidène glycine

intervient comme une énamine mettant en jeu le caractère nucléophile du carbone

du groupe méthylidène, pour attaquer le carbone du groupe iminium issu de la

protonation du groupe imino de l�acide 2-imino-propionique. L�intermédiaire, ainsi

formé, perd une molécule d�ammoniac pour donner 1� (Schéma 3) :

OH

NH2 O

OH

H+

- H2O

NH2O

OH

1

NHO

OH

H+ NHO

OH

serine 1 en milieu acide

NH2

O

HO+

NO

OH

HOOC

NH2

COOH

NH

H H

HOOC

- NH3 H+

HOOCNH2

dimere de serine 1'

NH

HOOC HOOC

1'

Schéma 3: mécanisme réactionnel pour obtenir le produit 1�

29

Le groupe amino de l�o-phénylènediamine réagit sur la carbone iminium de 1� pour

conduire à un intermédiaire qui subit une cyclisation intramoléculaire, induisant la

formation de la quinoxalinone, suivie de la perte d�une molécule d�ammoniac. Le

composé obtenu réagit avec l�o-phénylènediamine, en engageant le groupe

carboxyle afin de former le noyau benzimidazole. L�intermédiaire formé, subit une

cyclisation intramoléculaire mettant en jeu le groupe NH du benzimidazole et le

carbonyle de la fonction lactame de la quinoxaline, pour conduire finalement au

composé pentacyclique 4 (Schéma 4).

NH2

NH2

HN

NH2

COOH

- NH3

- H2O

N

NH

O

H2N

H2N

+

+

NH

N

NHO

H2N

HO- H2O

NH

N

N

H2N

O

NH

N

N

HNO

- H2ON

N

N N

COOH

NH2

COOH

OH

4

O

OH

H2N

2 O

OH

2

1'


Dans ce travail, a été reproduite la synthèse décrite par Zniber et al.[1]. pour obtenir

le produit pentacyclique 4 à partir de l�o-phénylènediamine non substituée (Schéma

30

4). Ensuite la quaternarisation de ce produit a été réalisée pour rendre la molécule

finale chargée positivement dans le but d�augmenter sa solubilité dans l�eau.

II. Synthèse du noyau pentacyclique dérivé du benzimidazole

Cette réaction de condensation était auparavant réalisée avec 1 équivalent de

sérine 1 et 1 équivalent d�o-phénylènediamine 2 dans HCl 5,5 N à reflux pendant 3

jours ; cependant, dans ces conditions expérimentales, seul le produit 3 est obtenu.

L�augmentation du nombre d�équivalents de la sérine 1 (3,5 et 10 équivalents) nous a

permis d�obtenir le produit pentacyclique 4 comme un produit minoritaire de cette

réaction avec un rendement de 4% [2].

Pour augmenter ce rendement, nous avons essayé de changer l�ordre de l�ajout des

deux réactifs ; premièrement nous avons laissé la sérine 1 incuber dans l�acide

chlorhydrique à reflux pendant 2h pour former le composé 1� (voir Schéma 3),

ensuite nous avons ajouté progressivement le deuxième réactif l�o-phénylènediame

et laissé l�ensemble à reflux 3 jours pour obtenir à la fin le même rendement.

Nous avons alors tenté de former ce dimère autrement par une réaction de

condensation entre la sérine 1 et l�acide pyruvique 5 dans un milieu acide (HCl 5,5 N)

à reflux pendant 24h (Schéma 5), la réaction a été contrôlée par CCM sur silice sous

UV et aussi par révélation à la ninhydrine après neutralisation du milieu réactionnel

avec Na2CO3. Les plaques de CCM ne mettent pas en évidence de nouveaux

produits.

OH

O

ONH2

O

HO

HO

1 5

+HCl 5,5 N

a reflux 24 hNH

O

HOO

HO

6

Schéma 5

Nous nous sommes tournés vers d�autres conditions pour augmenter le rendement

du produit 4 qui nous intéresse en faisant réagir le quinoxalin-2-one produit 3

majoritaire de la réaction dans le même solvant HCl 5,5 N à reflux avec 1, 4 et 10

31

équivalents de la sérine 1 (Schéma 6). Au bout de 3 jours il ne s�est produit aucune

réaction.

NH

N

O HO NH2

COOH+

3 1

5,5 N HCl

a reflux 3 j

Schéma 6

Nous avons ensuite changé le solvant en réalisant la réaction dans un mélange

constituée de 50% de DMF et 50% soit d�HCl dans du 2-propanol 5 à 6 N, soit d�HCl

dans l�acide acétique, ou soit d�HCl dans le dioxane et de 10 équivalents de sérine 1

à 90°C pendant 3 jours. Le changement de solvant n�a pas permis non plus

d�améliorer la réaction. Il est à noter que les produits de départ sont partiellement

soluble dans ces conditions expérimentales.

Un dernier essai a consisté à utiliser la méthode de micro-onde à 170°C et 170W

avec 3,5 équivalents de sérine 1 dans HCl 5,5 N pendant 4h. Cette méthode ne

permet pas d�augmenter le rendement du produit pentacyclique 4 mais par contre

permet de diminuer le temps de la réaction de 3 jours à 4h. Cette méthode semble

prometteuse. Un seul essai ayant été réalisé, une étude plus approfondie devrait être

entreprise pour confirmer ce résultat.

L�analyse du spectre de RMN du produit 4 montre la présence de deux familles A

(H1-H4) et E (H7-H10) des protons aromatiques (Figure 1) et deux signaux sous forme

d�un singulet, l�un relatif au proton H13 et l�autre qui intègre pour trois protons du

groupement CH3 en position 12a (Annexe A, spectre 1). Le spectre de masse haute

résolution permet de confirmer la structure de la molécule, il donne un m/z pour

C18H13N4 ([M + H]+) = 285.1138. Ce composé possède deux maxima d�absorption

UV-visible à 255 et 401 nm dans le méthanol (Annexe A, spectre 2), ainsi qu�un

maximum d�émission à 490 nm (excitation à 390 nm dans le méthanol) (Annexe A,

spectre 3).

32

N

N

NN

9,28/116,69

7,64/124,88 7,60/125,32

8,09/120,63

8,25/129,22

7,85/129,15

7,92/130,88

8,31/128,37

2,84/18,11

7,77/128,72139,91

140,84

148,50

141,32

138.74

135,06

144,17130,94

1

2

4

34a 5a

6a

7

8 9

10

10a

11a

12

1313a14a

12a

A B C

D

E

Figure 1 : caractérisation du produit 4 par RMN 1H,

13C, HMBC, HMQC, Cosy

III. Quaternarisation

Le produit pentacyclique 4 que nous avons synthétisé est une molécule plane,

aromatique et qui présente une fluorescence très importante. Nous avons introduit

une charge positive directement sur le noyau aromatique par quaternarisation d�un

atome d�azote cyclique afin d�améliorer la solubilité dans l�eau et l�affinité pour l�ADN

quadruplex.

Pour quaternariser le produit 4 nous avons utilisé l�iodure de méthyle pour obtenir le

produit 4� avec un contre ion iodure et un rendement de 56% (schéma 7)[2].

N

N

N NN

N

N NMeI

DMF / 80 °C / 48h

44'

I

Schéma 7: quaternarisation du produit 4 avec MeI

L�analyse du spectre de RMN 1H du produit 4� (Annexe A, spectre 4) montre la

présence d�un troisième signal sous forme d�un singulet qui intègre pour trois protons

du groupement CH3 de la quaternarisation et un changement de déplacement

chimique très remarquable du proton H13 ainsi que des autres protons de la

molécule.

33

La position de la méthylation du ce produit a été déterminée par une analyse RMN

2D ainsi que par étude des NOESY 2D intramoléculaires (Figure 2).

N

N

NN

9,88/118,90

8,10/129,00 8,11/128,91

8,57/113,81

8,51/129,82

8,24/132,07

8,32/133,73

8,71/128,37

3,36/19,79

8,79/138,58142,89

140,83

144,62

139,70

137.03

128,88

134,00129,33

1

2

4

34a 5a

6a

7

8 9

10

10a

11a

12

1313a14a

12a

A B C

D

E

11 4,89/34,2I

Figure 2 : caractérisation du produit 4� par RMN 1H,

13C, HMBC, HMQC, Cosy et Noesy 2D

Le produit 4� de cette réaction de quaternarisation est un produit soluble seulement

dans le DMSO. Nous n�avons pas réussi à échanger le contre ion iodure pour obtenir

un produit soluble dans l�eau. Nous nous sommes tournés donc vers un autre agent

de methylation pour apporter d�autre propriétés de solubilité, il s�agit du triflate de

méthyle pour obtenir le produit avec un contre ion triflate soluble dans le méthanol

(Schéma 8). Le changement du contre ion par un ion chlorure (Cl-) sur une résine

DOWEX 1x8(Cl-) nous a permis d�obtenir un produit 4�� sous forme d�une poudre

verte avec un rendement de 86% et totalement soluble dans l�eau[2].

N

N

N NN

N

N N(CH3O)SO2(CF3)

CH2Cl2 / 12hTamb

4

(CF3)SO3

DOWEX 1x 8 (Cl-)N

N

N N

4''

Cl

Schéma 8: quaternarisation du produit 4 avec (CH3O)SO2(CF3)

Le produit 4�� a été identifié par une analyse RMN 1H (Annexe A, spectre 5) et une

analyse en spectrométrie de masse haute résolution qui a donné un m/z pour

NOE

NOE

NOE

NOE

34

C19H15N4 ([M+]) = 299.1289. L�absence du contre ion triflate a été vérifiée par

ionisation electrospray négatif (-ESI).

Ce composé possède deux maxima d�absorption UV-visible à 256 et 397 nm dans

l�eau (Annexe A, spectre 6).

IV. Conclusion

La réaction de condensation de 3,5 équivalents de sérine avec 1 équivalent d�o-

phényléndiamine dans un milieu acide (HCl 5,5 N) à reflux pendant 3 jours reste

pour l�instant la plus efficace. Elle permet d�obtenir le produit pentacyclique 4 avec un

rendement de 4%. Par contre l�utilisation de la méthode de micro-onde semble

apporter un plus en terme de temps de réaction.

La réaction de quaternarisation du produit 4 avec le triflate de méthyle permet

l�échange du contre ion pour obtenir un produit 4�� soluble dans l�eau avec un contre

ion chlorure.

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Chapitre III

Synthèse et caractérisation des

molécules de la famille

indoloquinoxaline

35

I. Introduction

Les indole-2,3-diones, composé A (Figure 1), représentent une grande famille de

composés hétérocycliques qui ont été largement étudiées pour le développement de

molécules importantes sur le plan pharmaceutique. Les isatines N-substitués[1]. en

particulier présentent un large éventail d'activités biologiques telles que

antifongique[2]. antivirale[3]. anti-VIH[4]. et anticancéreuse[5].

Plusieurs dérivés tetracycliques du système 6H-indolo[2,3-b]quinoxaline (Figure 1B),

sont synthétisé par condensation d�isatine (indole-2,3-diones) (Figure 1A) et d�o-

phénylènediamine.

N N

N

R2

R3

R3

B R2 = R3 = H

N

O

O

R1

AR1 = H

Figure 1: structure chimique des composés A et B

Certain de ces dérivés avec des chaines latérales en position 6, tel que le 2,3-

diméthyl-6-(2-diméthylaminoéthyl)-6H-indolo[2,3-b]quinoxaline, appelé aussi B-220,

composé C (Figure 2), présentent une activité antivirale puissante[6, 7]. contre, par

exemple le virus de l'herpès simplex de type 1HSV-1, le cytomégalovirus CMV et le

virus varicelle-zona VZV.

N N

N

N C, B-220

Figure 2: structure chimique du composé C

L�Ellipticine (Figure 3D) et plusieurs de ces dérivés ont été rapportés comme

possédant une activité antinéoplasique potentielle[8-10]. Une comparaison entre D et

C a montré que ces deux composés se lient à l'ADN ou des polynucléotides

synthétiques par intercalation, mais à la différence de l�ellipticine (compose D), le

36

composé C présentait une spécificité de liaison significative pour les séquences

alternées A-T[11].

NH

N

N N

N

N

D, ellipticine C, B-220

Figure 3: structure chimique des composés D et C

Dans cette partie du travail, nous allons synthétiser quatre dérivés tetracyclique du

système 6H-indolo[2,3-b]quinoxaline par alkylation d�isatines non substituées avec

différents agents d�alkylation, ensuite la condensation de ces isatines N-substituées

avec l�o-phénylènediamine.

La quaternarisation de ces produits a été réalisée pour rendre les molécules finales

chargées positivement dans le but d�augmenter la solubilité dans l�eau.

II. Synthèse des noyaux tetracyclique dérivés du 6H-indolo[2,3-

b]quinoxaline

Une synthèse a été auparavant réalisée en trois étapes à partir de deux

intermédiaires ; le 1-(2-bromoéthyl)-indole-2,3-dione et le 6-(2-

bromoéthyl)indoloquinoxaline pour obtenir des dérivés tetracyclique du 6H-

indolo[2,3-b]quinoxaline[12]. (Schéma 1).

37

NH

O

OBr

Br

K2CO3, DMFTamb, 2h

80%

N

O

O

Br

N

N

N

Br

O-phenylene-diamine

CH3COOHreflux, 4h

80%

N

N

N

R

RH

bemzene, reflux, 6-8 h(composès 2-19)DMF, Tamb(composè 1)

80-9-%

1 - 12

N N N N N

N N N N N

N

N

O

N

R =

1 2 3 4 5

6 7 8 910

11 12

; ; ; ;

; ; ; ; ; ;

;

Schéma 1: synthèse des aminoéthyl-indoloquinoxalines (1-12)[12].

Notre stratégie pour obtenir des molécules de la famille indoloquinoxaline a consisté

en deux étapes ; une alkylation d�isatine ensuite une condensation avec l�o-

phénylènediamine non substituée.

1. Alkylation d�indole-2,3-dione (isatine)

Nous avons synthétisé des isatines N-substituées par alkylation d�indole-2,3-dione

avec différents agent alkylation, le chlorure de 3,4-dichlorobenzyle, le chlorhydrate de

2-chlorométhylpyridine, le 2-chlorométhylbenzène et le 2-chloro-N,N-chlorhydrate

diéthyléthylamine, dans DMF à température ambiante pendant 24 h et en présence

de carbonate de césium pour obtenir le composé 5 différemment substitué (Schéma

2)[13].

38

NH

O

OCs2CO3/ DMF

N

O

O

R

RX/ rt 24 h

5

NN

Cl

Cl

R =

51

99%52

50%

53

60%

54

96%

Schéma 2: synthèse du produit 5, rendement de forme protonée voir ci-dessous

Les quatre composés 51, 52, 53 et 54 ont été caractérisés par leur spectre RMN de

proton et un spectre IR (Annexe B, spectre 1, 2, 3 et 4) ainsi que par spectrométrie

de masse.

La molécule 51 a été obtenue sous forme neutre ou sous forme de chlorhydrate en

fonction du mode opératoire :

A la fin de la réaction le DMF est évaporé. Si le produit est repris dans du

dichloromethane et laissé précipiter à température ambiante pendant une nuit on

obtient un produit sous forme de chlorhydrate qui se caractérise par un triplet à 9,11

ppm qui intègre pour un proton dû à la protonation de l�atome d�azote (Annexe B,

spectre 5).

Par contre si après évaporation du DMF on purifie par colonne de silice on obtient la

forme non protonée dont la RMN est présentée en annexe (Annexe B, spectre 6).

L�analyse du spectre de masse a haute résolution nous a permis de confirmer la

structure de la forme neutre, le massif isotopique montre les deux m/z

caractéristiques à 306,0102 et 308,0077 (Annexe B, spectre 7)

39

2. Condensation d�isatine N-substituée avec l�o-phénylènediamine non

substituée

La condensation du produit 5 avec l�o-phénylénediamine non substituée dans l�acide

acétique à reflux pendant 2-5 h nous a permis d�obtenir le produit 6 avec un

rendement de 60-80% (Schéma 3)[13].

N

O

O

R

acide acetiquereflux / 2-5 h

N

N

N

R

5 6

o-phenylenediamine

NN

Cl

Cl

61 62 63 64

R =

60% 74% 72% 73%

Schèma 3: synthèse du produit 6

Le composé 5 réagit avec les groupes NH2 d�o-phénylènediamine en engageant les

deux groupes carboxyle afin de former le noyau quinoxaline pour conduire finalement

au composé tertacyclique 6 (Schéma 4).

N

O

O

R

H2N

H2N N O

R

N

NH2-H2O

H+

-H2O

N

N

N

R

5 6


40

L�analyse du spectre de RMN des produits 61, 62, 63 et 64 montre la présence de

deux familles A (H1-H4) et D (H7-H10) de protons aromatiques (Figure 4). pour les

composés 61, 62 et 63 leurs spectres RMN présentent un signal sous forme d�un

singulet qui intègre pour deux protons du groupement CH2 en position 13 (Figure 4).

NN

N

12

3

4 4a 5a6a

7

8

910

10a

11a12a

AB

CD

13

Figure 4: composés 6

L�analyse du spectre RMN des produits 61, 62 et 63 montre aussi la présence d�une

troisième famille des protons aromatiques ; la famille E (H15, H18 et H19) du produit 61

avec trois protons aromatiques (Annexe B, spectre 8), la famille E�(H15-H18) du

produit 62 avec quatre protons aromatique (Annexe B, spectre 9) et la famille E��(H15-

H19) du produit 63 avec cinq protons aromatiques (Annexe B, spectre 10) (Figure 5).

N

1313

13

ClCl

14a15

16a 17a

18

14a14a

1516

17

18

15

1617

18

19

19

EE' E''

61 62 63

Figure 5: composés 61, 62 et 63

Le produit 64 a été identifié aussi par une analyse RMN (Annexe B, spectre 11), il

montre la présence de deux signaux sous forme d�un triplet l�un est relatif aux

protons en position 13 à 4,60 ppm et l�autre aux protons en position 14 à 2,98 ppm et

qui intègrent pour deux protons, un signal sous forme d�un quadruplet relatif aux

protons en position 15 à 2,69 ppm qui intègre pour quatre proton et un signal sous

41

forme d�un triplet relatif aux protons en position 16 à 1,05 ppm et qui intègre pour six

protons (Figure 6).

N

13

14

1516

Figure 6: composés 64

L�analyse du spectre de masse des quatre molécules permet de confirmer la

structure, (Tableau 1). Les composés possèdent deux maxima d�absorption UV-

visible autour de 270 et 352 nm dans le méthanol.

composé SM(DCI/NH4), m/z: [M+H]+

61 378,0 et 380,0

62 311,1

63 310,0

64 319,1

Tableau 1: analyse du spectre de masse des composés 61, 62, 63 et 64

III. Quaternarisation

Nous avons introduit une charge positive directement sur le noyau aromatique du

produit tetracyclique 6 par quaternarisation d�un atome d�azote cyclique afin

d�améliorer la solubilité dans l�eau et l�affinité pour l�ADN quadruplex.

Pour quaternariser le produit 6 nous avons utilisé le sulfate de diméthyle anhydre

DMS pour obtenir le produit 7 avec un contre ion sulfate de méthyle (CH3O)SO3-

soluble dans l�eau (72 et 74) et dans le méthanol (71 et 73). Le changement du contre

ion par un ion chlorure (Cl-) sur une résine DOWEX 1x8(Cl-) nous a permis d�obtenir

42

un produit pâteux 8 de couleur rouge-orange totalement soluble dans l�eau avec un

contre ion chlorure et un rendement de 65-90% (schéma 5)[13, 14].

N

R

N

N

N

R

N

N(CH3O)SO3

NR =

Cl

Cl

(CH3O)2SO2

a reflux/2h

DOWEX 1x 8 (Cl-)

N

R

N

NCl

65% 90% 90%

8182 83

6 7 8

N

N

N

N

N

N(CH3O)SO3

(CH3O)2SO2

a reflux/2h

DOWEX 1x 8 (Cl-)

N

N

NCl

64 74 84

N N N

Cl

90%

(CH3O)SO3

Schemat 5 : quaternarisation du produit 6 avec (CH3O)2SO2

L�analyse du spectre RMN 1H du produit 8 montre la présence d�un nouveau signal

sous forme d�un singulet qui intègre pour trois protons du groupement CH3 de la

quaternarisation et un changement de déplacement chimique au niveau des protons

aromatiques pour les molécules 81, 82 et 83 (Annexe B, spectre 12, 13 et 14).

La position de la méthylation de ces trois produits a été déterminée par une analyse

RMN 2D ainsi que par étude des NOESY 2D intramoléculaires du produit 82 (Figure

7).

43

NN

N

N

5.15/40,30

8.79/127,938.63/117,59

**

*

ROE

ROE

AB

CD

E

7.72/124,25

8.08/137,49

7.81/111,53

6.34/43,98

8.79/142,27

7.98/126,55

8.45/147,39

7.79/125,41

8.18/132,39

8.14/131,89

8.41129,48

*

*

ROE


13C, HMBC, HMQC, Cosy et Noesy 2D 500 MHz

dans D2O

Le spectre RMN du produit 84 (Annexe B, spectre 15), montre la présence de deux

signaux sous forme d�un singulet à 5,09 et 3,20 ppm et qui intègrent chacun pour

trois protons du groupement CH3 de la quaternarisation. Un changement de

déplacement chimique au niveau des protons aromatiques du noyau tetrecyclique

est également observé par rapport au produit non quaternarisé 64 . Les deux

positions de méthylation ont été déterminée aussi par une analyse RMN 2D et par

étude des NOESY 2D intramoléculaires(Figure 8).

NN

N

5.09/40,24

8.73/127,918.61/117,50

**

*

ROEROE

AB

CD

N

3.20/47,45

3.59/57,463.59/57,46

5.15/35,37

7.90/111,21

3.86/56,07

7.67/123,81

8.11/137,32

8.16/132,17

8.16/131,8

8.50/129,50

*

*

*

*

*

ROE

ROEROE

1.40/7,251.40/7,25


13C, HMBC, HMQC, Cosy et Noesy 2D 500 MHz

dans D2O

44

L�analyse du spectre de masse permet de confirmer les structures du produit 8. Ce

composé possède deux maxima d�absorption UV-visible dans le méthanol (Tableau

2).

Composé

UV-visible

lmin (nm) lmax (nm)

81 275 394

82 267 351

83 276 394

84 274 394

Tableau 2 : analyse du spectre UV-visible des composés 81, 82, 83 et 84

IV. Conclusion

La synthèse des dérivés de 6H-indolo[2,3-b]quinoxaline en deux étapes, alkylation

des isatines puis condensation avec l�o-phénylènediamine non substituée, nous a

permet d�obtenir le produit tetracyclique 6 avec un rendement de 60-80%.

La réaction de quaternarisation du produit 6 avec le sulfate de diméthyle permet

l�échange du contre ion pour obtenir un produit 8 soluble dans l�eau avec un contre

ion chlorure et un rendement de 65-90%.

V. Références bibliographiques

1. Mesropyan, E.G., Ambartsumyan, G. B., Avetisyan, A. A., Sarkisyan, M. G., Amazaspyan, G. S.,

Synthesis of Isatin and 5-Bromoisatin Derivatives. Russ J Org Chem, 2001. 37: p. 1476-1477.

2. Ravichandran, V., Mohan, S., Suresh Kumar, K., Synthesis and antimicrobial activity of

Mannich bases of isatin and its derivatives with 2-[(2,6-dichlorophenyl)amino]phenylacetic

acid. Arkivoc, 2007. (xiv): p. 51-57.

3. Nalan Terzio�lu, N.K., Aysel Gürsoy, Christophe Pannecouque, Pieter Leysen, Jan Paeshuyse,

Johan Neyts, and Erik De Clercq, Synthesis and primary antiviral activity evaluation of 3-

hydrazono-5-nitro-2-indolinone derivatives. Arkivoc, 2006. (i): p. 109-118.

4. Surendra N. Pandeyaa, D.S., Gopal Nath, Erik De Clercq, Synthesis, antibacterial, antifungal

and anti-HIV activities of norfloxacin mannich bases. Eur J Med Chem, 2000. 35(2): p. 249-

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5. Lidia Matesic, J.M.L., John B. Bremner, Stephen G. Pyne, Danielle Skropeta, Marie Ransonb

and Kara L. Vine, N-phenethyl and N-naphthylmethyl isatins and analogues as in vitro

cytotoxic agents. Bioorg Med Chem, 2008. 16(6): p. 3118-3124.

6. Harmenberg, J., Wahren, B., Bergman, J., Akerfeldt, S. and Lundblad, L., Antiherpesvirus

activity and mechanism of action of indolo-(2,3-b)quinoxaline and analogs. Antimicrob

Agents Chemother, 1988. 32(11): p. 1720-1724.

45

7. Harmenberg, J., et al., The mechanism of action of the anti-herpes virus compound 2,3-

dimethyl-6(2-dimethylaminoethyl)-6H-indolo-(2,3-b)quinoxaline. Antiviral Res, 1991. 15(3): p.

193-204.

8. Acton, E.M., Narayanan, V. L., Risbood, P. A., Shoemaker, R. H., Vistica, D. T. and Boyd, M. R.,

Anticancer specificity of some ellipticinium salts against human brain tumors in vitro. J Med

Chem, 1994. 37(14): p. 2185-2189.

9. Auclair, C., Pierre, A., Voisin, E., Pepin, O., Cros, S., Colas, C., Saucier, J. M., Verschuere, B.,

Gros, P. and Paoletti, C., Physicochemical and pharmacological properties of the antitumor

ellipticine derivative 2-(diethylamino-2-ethyl)9-hydroxy ellipticinium-chloride, HCl. Cancer

Res, 1987. 47(23): p. 6254-6261.

10. Juret, P., Girard, A., LE Talaer, J. Y., Abbatucci, J. S., Dat-Xuong, N., LE Pecq, J. B., Paoletti, C.,

Preliminary Trial of 9-Hydroxy-2-Methyl Ellipticinium (NSC264-137) in Advanced Human

Cancers. Eur J Cancer 1978. 14: p. 205-206.

11. Zegar, I., Graslund, A., Bergman, J., Eriksson, M. and Norden, B., Interaction of ellipticine and

an indolo[2,3b]-quinoxaline derivative with DNA and synthetic polynucleotides. Chem Biol

Interact, 1989. 72(3): p. 277-293.

12. Shibinskaya, M.O., Lyakhov, S. A., Mazepa, A. V., Andronati, S. A., Turov, A. V., Zholobak, N.

M. and Spivak, N. Y., Synthesis, cytotoxicity, antiviral activity and interferon inducing ability of

6-(2-aminoethyl)-6H-indolo[2,3-b]quinoxalines. Eur J Med Chem, 2010. 45(3): p. 1237-1243.

13. Zanzoul, A., Chollet, A., Stigliani, J. L., Bernardes-Génisson, V., Essassi, E. M., Pratviel, G., 6-

(Diethylaminoethyl)indoloquinoxaline as inhibitor of InhA enzyme of Mycobacterium

tuberculosis. soumis, 2014.

14. Zanzoul, A., Ramli, Y., Essassi, M. & Pratviel, G., A benzimidazopyridoquinoxaline as promising

scaffold for G-quadruplex DNA targeting. Med Chem Res, 2014. 23: p.4042-4049.

Chapitre IV

Synthèse et caractérisation des

molécules de la famille

triazoloquinoxaline

46

I. Introduction

Une méthode a été décrite pour la synthèse d�un composé polycyclique de la famille

triazoloquinoxaline par Mustaphi et al.[1]. Il s�agit d�une condensation de la

quinoxalin-2,3-dithione 1 avec le benzoylhydrazide 2 dans le DMF à reflux pendant

24h. Cette réaction conduit à la formation de trois produits (Schéma 1).

N

N SH

SH

NH

NH2

O

+DMF

a reflux/24h

N

N N

N

NN

N SH

N N

N OH

N

1 2 3 4 5

+ +

Schéma 1 : synthèse du produit 3 dérivé du triazoloquinoxalin[1].

La formation des composés 3, 4 et 5 peut être expliquée selon les mécanismes

suivants :

Le groupe mercapto de la quinoxalin-2,3-dithione 1 attaque le carbonyle du DMF

pour conduire à un intermédiaire (a) qui subit un réarrangement, induisant la

formation du composé 4. Ce dernier subit l�attaque du benzoylhydrazide pour donner

le composé 3 (Schéma 2).

N

N SH

SH

N

O N

N SH

S

N O1

(a)

N

N SH

N

+ SH

O

N

N N

N

N

3 4

C6H5-C-N-NH2

O

47


Le composé 5 pourrait provenir de l�hydrolyse de l�iminothioether (b) obtenu par

action du DMF sur le composé 4 (Schéma 3).

N

ON

N SH

N

+

N

N

N

S

NHO

OH H

(b)4

N

N OH

N

+NHO

HSN

S

5


Dans ce travail, a été reproduite la synthèse décrite par Mustaphi et al. pour obtenir

le produit polycyclique 3 à partir de la quinoxalin-2,3-dithione (Schéma 3).

II. Synthèse du noyau polycyclique dérivé du triazoloquinoxaline

Cette réaction de condensation était auparavant réalisée avec 1 équivalent de

quinoxalin-2,3-dithione 1 et 2 équivalent de benzoylhydrazide 2 dans du DMF à

reflux pendant 24h ; cependant, dans ces conditions expérimentales, nous avons

obtenu un produit non cyclisé 9 sous forme de cristaux avec un rendement de 46%

que nous avons cyclisé dans l�acide acétique à reflux rendant 24h pour obtenir un

produit 10 avec un rendement de 98% proche du produit 3 mais sans groupement

diméthylamine (Schéma 4)[2].

48

Schéma 4 : synthèse du produit 10 dérivé du triazoloquinoxaline[2].

La structure du produit 9 a été identifiée sur la base des données spectrales RNM 1H

et 13C (Annexe C. spectre 1 et 2). Une analyse cristallographique par diffraction aux

rayons X a permis de confirmer la structure de ce composé (Figure 1).

Figure 1 : caractérisation du produit 9 par diffraction aux rayons X[2].

L�analyse du spectre de RMN 1H du produit 10 montre la présence de deux familles,

A avec quatre protons aromatiques et D avec cinq protons aromatiques (Figure 2) et

un signal sous forme d�un singulet qui intègre pour un proton du groupement NH

(Annexe C, spectre 3). Le spectre de masse donne un m/z = 279 (100%)[M + H]+.

49

Figure 2: caractérisation du produit 10 par RMN 1H,

13C, HMBC, HMQC, Cosy et NOE 2D.

Nous avons porté à ébullition le produit 10 dans du DMF pendant 24 h pour obtenir le

produit 3 avec un rendement de 10-20%.

Pour reproduire la synthèse du produit polycyclique 3 décrite par Mustaphi et al. et

augmenter son rendement Nous nous sommes tournés vers une autre voie de

synthèse qui a été décrite par Reinhard et al.[3] à partir du 2,3-dichloroquinoxaline

(Schéma 5).

N

N Cl

Cl

NH2NH2

N

N NHNH2

Cl N

N N

NX

Cl

X-C(OC2H5)3

X = H, Ph

N

N N

NX

Y

HNR1R2

Y = NR1R2

R1 = R2 = CH3

1 2 3

Schéma 5 : synthèse du produit 3[3].

Nous avons reproduit la synthèse du produit 3 en cinq étapes :

50

La première étape consiste au synthèse de la quinoxalin-2,3-dione 11 à partir d�une

condensation de l�o-phénylènediamine avec l�acide oxalique dans HCl 4N (Schéma

6).

NH2

NH2

HO

O

O

HO NH

HN O

O

+HCl 4N

110°C / 1h 60-70%

11

Schéma 6: synthèse du produit 11

La deuxième étape c�est la synthèse du produit 12 le 2,3-dichloroquinoxaline par

chloration du produit 11 (Schéma 7).

NH

HN O

O N

N Cl

ClPOCl3 / 45°C 6h

DMF / CH2Cl2 2 / 10

12 90%


La réaction entre le produit 12 et l�hydrazine dans l�éthanol nous a permis d�obtenir

dans la troisième étape le 3-hydrazinoquinoxaline, produit 13 (Schema 8).

N

N Cl

Cl N

N NHNH2

Cl

NH2NH2 / EtOH

une nuit a Tamb

13 88%


La quatrième étape c�est une condensation du produit 13 avec la triéthyl

orthobenzoate pour obtenir le 4-phényl[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxaline, produit 14 ou

avec la triéthyl orthoformate pour obtenir le 4-Chloro[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxaline,

produit 15 (Schéma 9

51

N

N NHNH2

Cl

N

N

Cl

N

N

N

N

Cl

N

N

O

OO

110°C / 2

h

110°C / 2h

O

OO

H

60-70%

14

15

13

Schéma 9: synthèse du produit 14 et 15

L�analyse du spectre RMN 1H du produit 14 (Annexe C, spectre 4) montre la

présence de deux familles, A avec quatre protons aromatiques et D avec cinq

protons aromatiques (Figure 3). Le spectre de masse donne un m/z = 281,05

(100%)[M + H]+.

N

NN

N

Cl

7.72/131.43

7.67/129.35

7.73/130.02

127.58

151.23

142.46

143.02

7.56/116.02

7.62/128.27

7.43/129.49

8.08/130.29

7.67/129.35

7.73/130.02

125.86

135.78

A B

C

D

Figure 3: caractérisation du produit 14 par RMN 1H,

13C, HMBC, HMQC, Cosy et NOE 2D.

L�analyse du spectre RMN 1H du produit 15 (Annexe C, spectre 5) montre la

présence d�une seule famille A des protons aromatiques et un signal sous forme d�un

singulet à 10,22 ppm et qui intègre pour un proton. Le spectre de masse donne un

m/z = 204,9 (100%)[M + H]+.

52

La dernière étape qui consiste à faire réagir le produit 14 (ou 15) avec le

diméthylamine dans DMF pour obtenir le produit 3 (Figure 4) synthétisé par Mustaphi

et al.[1] et Reinhard et al.[3], nous n�avons pas pu la réaliser faute de temps.

N

N

N

N

NX

X = H, Ph

Figure 4: Structure du produit 3

III. Conclusion

La voie de synthèse décrite par Reinhard et al.[3] reste pour l�instant la plus

reproductible pour synthétiser des dérivés de triazoloquinoxaline à partir du 2,3-

dichloroquinoxaline.

La quaternarisation de cette famille des produits n�a pas été réalisée faute de temps.

IV. Références bibliographiques :

1. Mustaphie, N.E.H., Ferfra, S., Essassi, E. M., Garrigues, B., Pierrot, M. , condensation de la

quinoxaline-2,3-dithione avec le benzoylhydrazide dans le DMF. Phosphorus, Sulfur, and

Silicon, 2004. 179: p. 2265-2271.

2. Zanzoul, A., Essassi, E. M., Pratviel, G., Saadi, M., El Ammari, L., N'-(3-Sulfanyl-idene-3,4-di-

hydro-quinoxalin-2-yl)benzohydrazide di-methyl-formamide monosolvate. Acta Crystallogr

Sect E Struct Rep Online, 2013. 69(Pt 8): p. o1268.

3. Reinhard, S., Howard, H. R., Browne, R. G., Lebel, L. A., Seymour, P. A., Kenneth Koe, B., 4-

Amino[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalines. A Novel Class of Potent Adenosine Receptor

Antagonists and Potential Rapid-Onset Antidepressants. J Med Chem, 1990. 33: p. 2240-

2254.

Chapitre V

Tests biologiques

53

Dans cette partie, l�étude de l�interaction des ligands à base de quinoxaline que nous

avons synthétisés avec les structures G-quadruplex de l�ADN télomérique par la

méthode de FRET, ainsi des tests d�inhibition de l�enzyme InhA de Mycobacterium

tuberculosis ont été menés.

I. Etude de l�interaction des ligands avec les G-quadruplex de l�ADN

télomérique par la méthode de FRET

Les résultats des expériences de FRET effectuées pour évaluer la capacité de liaison

à l�ADN G-quadruplex des composés synthétisés sont rapportés dans l�article 1: �A

benzimidazopyridoquinoxaline as promising scaffold for G-quadruplex DNA

targeting�. (2014)

Résumé:

Comme détaillé dans le chapitre I, le test de FRET permet d'évaluer la capacité de

stabilisation d�un ADN G-quadruplex d�un ligand donné et la sélectivité de ce ligand

pour l�ADN G-quadruplex par rapport à un ADN compétiteur de type ADN double-brin

ou autre. Ce test permet notamment d�établir un classement des ligands en fonction

de leurs affinités et sélectivités relatives pour l'ADN G-quadruplex.

La porphyrine Ni-TMPyP4 a été incluse dans les essais comme ligand G-quadruplex

standard. Ni-TMPyP4 (1 µM) stabilise l'ADN G-quadruplex F21T (0,2 µM) avec un

DT1/2 de 20 °C. Cette molécule a la même capacité de stabilisation que la molécule

TMPyP4, un ligand G-quadruplex commun, dont la constante d�affinité pour l�ADN G-

quadruplex télomérique est connue Ka = 106 M-1. Le composé (2)/(4��) montre un

DT1/2 de 3,6 ; 9,3 et 13,5 °C aux concentrations respectives de 1, 5 et 10 µM (Article

1, Fig. 1). Dans le présent travail, le rapport ligand/ADN F21T était de 5, 25, et 50

mol. equiv. Ces résultats ont montré que le composé (2)/(4��) peut être considéré

comme un ligand modeste de l'ADN G-quadruplex par rapport aux porphyrines

cationiques telles que TMPyP4 et Ni-TMPyP4. Le composé (2)/(4��) a également été

comparé avec un agent intercalant de l'ADN, un dérivé d'ellipticine, l'acétate de 9-

hydroxy-N-methylellipticine (9-OH-NMe-E), et avec deux autres produits cationiques

aromatiques dérivés d'indoloquinoxaline (3)/(64) et (4)/(84) (Article 1, schéma 2). Le

dérivé 9-OH-NMe-E est un médicament anti-tumoral. Jusqu'à présent, sa capacité de

54

liaison de l�ADN G-quadruplex n'avait pas été testée. Le composé (3)/(64) a

également été décrit dans la bibliographie comme possédant une activité

antitumorale. La capacité de stabilisation de l�ADN G-quadruplex de la 9-OH-NMe-E

s�avère similaire à celle du produit pentacyclique quaternarisé (2)/(4��).

Il est intéressant de noter que le composé (2)/(4��) s�est montré capable de se lier

spécifiquement sur l�ADN G-quadruplex en présence d'un excès de compétiteur

d'ADN double-brin ds26 (les concentrations de 2 et 10 µM de compétiteur

correspondent respectivement à 10 et 50 mol. equiv) (Article 1, Fig. 2). A l'opposé, la

9-OH-NMe-E n'a pas conservé la capacité de stabilisation des G-quadruplexes

lorsque la concentration du double brin d'ADN compétiteur a été augmentée

(Article1, Fig. 2).

Les composés (3)/(64) et (4)/(84) ont été les moins efficaces en tant que ligands

d'ADN G-quadruplex. Le composé (3)/(64) s�est avéré totalement incapable de

stabiliser le F21T G-quadruplex tandis que le composé 4 a montré une faible DT1/2 de

2, 3 et 5 °C aux concentrations respectives de 1, 5, et 10 µM. On peut remarquer ici

que l'introduction de deux charges positives sur la molécule (3)/(64) a amélioré

l�affinité du composé pour l'ADN G-quadruplex. Toutefois, ces charges positives ne

sont probablement pas bien situées pour une optimisation significative de l'interaction

ionique avec l'ADN. L'emplacement des charges positives par rapport au noyau

aromatique a déjà été démontré dans la bibliographie comme étant d'une grande

importance pour le réglage de l'interaction avec l�ADN G-quadruplex dans d'autres

séries de ligands G-quadruplex.

Conclusion:

Le composé pentacyclique cationique (2)/(4��), en forme de croissant, dérivé de

benzimidazopyridoquinoxaline, se lie à l'ADN G-quadruplex avec une affinité

modeste, mais ne se lie pas à l'ADN double brin. Les propriétés de liaison de ce

composé à l'égard de l'ADN de G-quadruplex sont meilleures que celles présentées

par d'autres molécules aromatiques cationiques telles que les dérivés de l'ellipticine

ou d�indoloquinoxaline. En conséquence, il est considéré comme une piste

prometteuse pour l'optimisation de propriétés de reconnaissance sélective de l'ADN

de G-quadruplex.

ORIGINAL RESEARCH

A benzimidazopyridoquinoxaline as promising scaffoldfor G-quadruplex DNA targeting

Asmae Zanzoul • Youssef Ramli • El Mokhtar Essassi •

Genevieve Pratviel

Received: 5 December 2013 / Accepted: 27 February 2014 / Published online: 13 March 2014

Ó Springer Science+Business Media New York 2014

Abstract In the search for new molecular scaffolds for

G-quadruplex DNA targeting, we prepared a pentacyclic,

crescent-shaped, benzimidazopyridoquinoxaline deriva-

tive, which proved to bind to G-quadruplex DNA with a

modest affinity but did not bind to double-stranded DNA.

The binding properties of this compound toward G-quad-

ruplex DNA were better than those exhibited by other

aromatic molecules such as ellipticine or indoloquinoxaline

derivatives. Consequently, it is considered as a promising

lead for optimization of selective G-quadruplex DNA

recognition properties.

Keywords Heterocyclic G4-ligand � FRET-melting �

Quinoxaline � Anticancer

Introduction

Guanine-rich DNA sequences are able to fold into four-

stranded structures composed of stacked arrays of guanine

quartets. Each guanine quartet consists of a square planar

arrangement of four guanine bases connected by Hoogs-

teen-type hydrogen bonds (Collie and Parkinson 2011).

These alternative higher-order DNA structures play a role

in fundamental processes of life and were in particular

shown to be connected with cancer. Indeed, DNA

sequences able to adopt G-quadruplex structures are

formed in the single-stranded overhang region of telo-

meres. They are also present in a number of oncogene

promoters (c-myc, c-kit, bcl2, k-ras, VEGF…) (Qin and

Hurley 2008; Balasubramanian et al., 2011). Thus, small

molecules that behave as G-quadruplex ligands (Monchaud

and Teulade-Fichou 2008; Ou et al., 2008; Balasubrama-

nian and Neidle 2009; Granzhan et al., 2010; Monchaud

et al,. 2010; Georgiades et al., 2010; Haider et al., 2011;

Xu 2011) and interfere with their biological function are

considered as potential new antitumoral drugs (Neidle

2010; Miller and Rodriguez 2011). Some of them actually

exhibited antitumoral activity (Burger et al., 2005; Tauchi

et al., 2006; Grand et al., 2002; Leonetti et al., 2008). Up to

now, only one so-called G-quadruplex ligand is under

clinic (Drygin et al., 2009). G-quadruplex ligands may also

be useful as G-quadruplex luminescent probe molecules

(Largy et al., 2013; Ma et al., 2013).

Most of the ligands for G-quadruplex DNA contain a

planar aromatic scaffold that undergoes p–p stacking

interaction with an external guanine quartet of quadruplex

DNA. In the present paper, we investigated a new crescent

shape aromatic scaffold for G-quadruplex DNA binding.

Furthermore, we introduced a positive charge directly on

the aromatic core by quaternarization of a cyclic nitrogen

Electronic supplementary material The online version of thisarticle (doi:10.1007/s00044-014-0985-1) contains supplementarymaterial, which is available to authorized users.

A. Zanzoul � G. Pratviel (&)

Laboratoire de Chimie de Coordination, CNRS, UPR 8241, 205

route de Narbonne, BP 44099, 31077 Toulouse Cedex 4, France

e-mail: [email protected]

A. Zanzoul � G. Pratviel

Universite de Toulouse, UPS, INPT, LCC, 31077 Toulouse,

France

A. Zanzoul � Y. Ramli � E. M. Essassi

Laboratoire de Chimie Organique Heterocyclique, pole de

competences pharmacochimie, Faculte des Sciences, Universite

Mohammed V-Agdal, Avenue Ibn Battouta, BP 1014, Rabat,

Morroco

123

Med Chem Res (2014) 23:4042–4049

DOI 10.1007/s00044-014-0985-1

MEDICINALCHEMISTRYRESEARCH

atom to improve water solubility and DNA affinity. Few

examples of such aromatic nitrogen quaternarized

G-quadruplex ligands can be found in the literature, bis-

quinoline derivative 360A (Pennarum et al., 2005), ethi-

dium bromide derivatives (Koeppel et al., 2001), penta-

cyclic acridine derivatives such as RHPS4 (Gavathiotis

et al., 2003; Gowan et al., 2001), berberin derivatives

(Bessi et al., 2012; Bazzicalupi et al., 2013; Ma et al.,

2011).

The cationic benzimidazopyridoquinoxaline compound

prepared in the present work showed moderate affinity for

G-quadruplex DNA but high selectivity with respect to

double-stranded DNA. Consequently, it can be considered

as a promising scaffold for G-quadruplex DNA targeting.

Experimental section

The followingcompoundswerecommerciallyavailable,o-phen-

ylenediamine, serine, methyl trifluoromethanesulfonate,

dimethyl sulfate, DOWEX 1 9 8 chloride form resin (Sigma-

Aldrich), sodium carbonate anhydrous (Acros), and oligonu-

cleotides (Eurogentec). The anticancer drug, 9-hydroxy-N-

methylellipticine acetatewas a gift of Sanofi, France. Silica gel

refers to Fluka 60 silica (ref. 60741), and alumina refers to

Merck aluminum oxide 90 active neutral alumina (ref.

101077). TLC analysis was performed with Merck 60 F254

silica or 150 F254 aluminum oxide neutral pre-coated alumi-

num plates. NMR spectra were recorded on Bruker Avance-

400 and/or Avance-500 spectrometers with the residual sol-

vent peak as internal calibration. Mass spectra (electrospray)

were recorded on a Perkin–Elmer SCIEX API 365 or an

Applied Biosystems QTRAP. UV–visible spectra were

recorded with a Hewlett Packard 8452A spectrophotometer

andfluorescence spectrawith a SafasFLX-Xenius fluorimeter.

Synthesis of 1 A mixture of o-phenylenediamine (3.0 g,

0.027 mol) and serine (10.2 g, 0.097 mol) was kept under

reflux in 40 mL of hydrochloric acid (5.5 N) for 3 days.

After neutralization with saturated sodium carbonate

solution, the precipitate was filtered, dried under reduced

pressure, and chromatographed on a column of neutral

alumina with 100 % dichloromethane as eluent. The first

eluted fraction was evaporated under reduced pressure, and

the product was precipitated from dichloromethane/hexane

1:10. Yield: yellow cotton-like powder 4 % (150 mg).

Rf = 0.76 (alumin oxide neutral plate, 100 % dichloro-

methane). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm) 9.28 (d,

1H, J = 8 Hz, H7), 8.31 (d, 1H, J = 8 Hz, H4), 8.25 (d,

1H, J = 8 Hz, H1), 8.09 (d, 1H, J = 8 Hz, H10), 7.92 (t,

1H, J = 8 Hz, H3), 7.85 (t, 1H, J = 8 Hz, H2), 7.77 (s,

1H, H13), 7.64 (t, 1H, J = 8 Hz, H8), 7.60 (t, 1H,

J = 8 Hz, H9), 2.84 (s, 3H, H12). 13C NMR (125.7 MHz,

CDCl3) d (ppm) 148.50 (C11a), 144.17 (C10a), 141.32

(C5a), 140.84 (C4a), 139.91 (C14a), 138.74 (C13a), 135.06

(C12), 130.94 (C6a), 130.88 (C3), 129.22 (C1), 129.15

(C2), 128.72 (C13), 128.35 (C4), 125.32 (C9), 124.88 (C8),

120.63 (C10), 116.69 (C7), 18.11 (C12a). HRMS (?ESI)

for C18H13N4 ([M ? H]?) calcd: 285.1140, found:

285.1138. UV/vis (CH3OH) kmax, nm (e, M-1 cm-1) 255

(25 ± 1 9 103), 401 (12.3 ± 1 9 103). Fluorescence

(CH3OH) kex = 390 nm, kem = 490 nm.

Synthesis of 20 Methyl trifluoromethanesulfonate (25 lL,

0.211 mmol) was added to a solution of 1 (40 mg,

0.141 mmol) in CH2Cl2 (5 mL) prealably cooled to

-78 °C. The solution was then warmed to room temper-

ature and stirred for 12 h. After solvent evaporation under

reduced pressure, the dry residue was washed with CH2Cl2(50 mL) affording product 20. Yield: red powder 60 %

(38 mg). Rf = 0.5 (silica plate, CH3CN/H2O/KNO3sat

8:1:1). MS (?ESI) 299.1 ([M ? H)]?).

Product 20 (38 mg) was dissolved in 10 mL of methanol

and deposited on a 10 g column of chloride-loaded

DOWEX 1 9 8–200 (ion exchange resin). The solution

of green product was collected and evaporated to dryness.

Product 2 was dissolved in 5 mL of methanol and

precipitated with diethyl ether (50 mL). After centrifuga-

tion, the pellet was dried under vacuum. The absence of

CF3SO3- counter ion was checked by mass analysis

(negative ESI). Yield: green powder 86 % (24.5 mg). 1H

NMR (400 MHz, CD3OD) d (ppm) 9.82–9.80 (m, 1H, H7),

8.57–8.55 (m, 2H, H13, H4), 8.43 (d, 1H, J = 8 Hz, H1),

8.27–8.30 (m, 1H, H10), 8.20 (t, 1H, J = 8 Hz, H3), 8.13

(t, 1H, J = 8 Hz, H2), 8.04–8.02 (m, 2H, H8, H9), 4.68 (s,

3H, N–CH3), 3.21 (s, 3H, C–CH3). HRMS (?ESI) for

C19H15N4 ([M?]) calcd: 299.1297, found: 299.1289. UV/

vis (CH3OH) kmax nm (e M-1 cm-1) 256 (29 ± 1 9 103),

397 (20 ± 1 9 103).

Synthesis of 200 Quaternarization of 1 was also possible

using MeI to afford 200. MeI (3 mL, 0.021 mol) was added

to a solution of 1 (40 mg, 0.141 mmol) in dimethylform-

amide (10 mL). The reaction was maintained at 80 °C for

2 days and led to pentacyclic compound with iodide

counter ion. The volume of solvent was reduced to 1 mL

under reduced pressure, and acetone was added (100 mL).

The product precipitated overnight at 4 °C. It was filtered,

washed with acetone (3 9 10 mL), and dried under vac-

uum. Yield: red powder 56 % (34 mg). Rf = 0.5 (silica

plate, CH3CN/H2O/KNO3sat 8:1:1).1H NMR (500 MHz,

DMF-d7) d (ppm) 9.88 (m, 1H, H7), 8.79 (s, 1H, H13), 8.71

(d, 1H, J = 8 Hz, H4), 8.57 (m, 1H, H10), 8.51 (d, 1H,

J = 8 Hz, H1), 8.32 (t, 1H, J = 8 Hz, H3), 8.24 (t, 1H,

J = 8 Hz, H2), 8.12–8.09 (m, 2H, H8, H9), 4.89 (s, 3H, N–

CH3), 3.36 (s, 3H, C–CH3).13C NMR (125.7 MHz, DMF-

d7) d (ppm) 144.62 (C11a), 142.89 (C14a), 140.83 (C4a),

Med Chem Res (2014) 23:4042–4049 4043

123

139.70 (C5a), 138.58 (C13), 137.03 (C13a), 134.00 (C10a),

133.73 (C3), 132.07 (C2), 129.82 (C1), 129.00 (C8),

128.91 (C9), 128.88 (C12), 128.37 (C4), 128.33 (C6a),

118.90 (C7), 113.81 (C10), 34.2 (C11), 19.79 (C12a).

Synthesis of 4 Diethyl-(2-indolo[2,3-b]quinoxalin-6-yl-

ethyl)-amine (3) (100 mg, 0.31 mmol)was added to 2 mLof

anhydrous dimethyl sulfate, and themixture was refluxed for

2 h. After cooling, the reaction medium was diluted with

diethyl ether (50 mL). The precipitate was filtered off,

washed with diethyl ether, and dried. The product was dis-

solved in distilled water (10 mL) and washed with chloro-

form (50 mL). The aqueous phase was reduced to 2 mL

under reduced pressure before counter ion exchange per-

formed on a chloride-loaded Dowex 1 9 8–200 ion

exchange resin column (10 g). The resulting aqueous solu-

tion was lyophilized. Yield: red powder 90 % (118 mg). 1H

NMR (500 MHz, D2O) d (ppm) 8.73 (d, 1H, J = 8.5 Hz),

8.61–8.59 (m, 1H), 8.50–8.48 (m, 1H), 8.17–8.14 (m, 2H),

8.13–8.09 (m, 1H), 7.90 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.67 (t, 1H,

J = 8.5 Hz), 5.15 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 5.09 (s, 3H), 3.86 (t,

2H, J = 7.5 Hz), 3.59 (q, 4H, J = 7.2 Hz), 3.20 (s, 3H), 1.40

(t, 6H, J = 7.2 Hz). 13C NMR (125.7 MHz, D2O) d (ppm)

146.8, 146.5, 140.9, 137.3, 132.1, 131.8, 131.7, 129.5, 128.8,

127.9, 123.8, 117.5, 112.7, 111.2, 57.4 (2C), 56.0, 47.4, 40.2,

35.3, 7.2 (2C). Rf = 0.6 (silica plate, CH3CN/H2O/KNO3sat

8:1:1). MS (?ESI) 174.1 ([M/2]2?). UV/vis (CH3OH) kmax

nm (e M-1 cm-1) 274 (31 ± 1 103), 394 (23 ± 1 103).

Fluorescence (CH3OH) kex = 375 nm, kem = 465 nm.

FRET melting assay The compounds were prepared as

0.2 mM stock solutions in MeOH (3, 4) or H2O (Ni-

TMPyP, 9-OH-NMe-E, 2). Further dilutions were per-

formed with H2O. Fluorescence melting curves were

determined (ABIP 7000 realtime PCR machine) with F21T

oligonucleotide (50-FAM-G3(TTAGGG)3-TAMRA-30)

(0.2 lM) (where FAM is the donor fluorophore 6-car-

boxyfluorescein, and TAMRA is the acceptor 6-carbox-

ytetramethylrhodamine) in 10 mM lithium cacodylate

buffer pH 7.2, 10 mM KCl, and 90 mM LiCl. The melting

of the G-quadruplex was monitored by measuring the

fluorescence of FAM (520 nm) in 25 lL reaction samples.

After a first equilibration step at 23 °C during 8 min, a

stepwise increase of 1 °C every minute for 71 cycles to

reach 95 °C was performed, and measurements were made

after each cycle. Thermal denaturation of F21T was per-

formed in the presence of various concentrations of drug

(1, 5, and 10 lM) as well as in the presence of drug (5 or

10 lM) and DNA competitors to test the binding selec-

tivity of the drug to the quadruplex structure: double-

stranded DNA (26-mer oligonucleotide ds26: 50-CAA TCG

GAT CGA ATT CGA TCC GAT TG-30). Competitor DNA

concentration was 0, 2, and 10 lM. Emission of FAM was

normalized, and T1/2 was defined as the temperature for

which the normalized emission is 0.5. T1/2 and dT1/2 are the

mean of at least 3 values.

Results and discussion

Pentacyclic compound benzimidazopyridoquinoxaline 1

was a minor product of the reaction between o-phenylene

diamine and serine carried out in aqueous acid, under

reflux for 3 days (Scheme 1) (Zniber et al., 2000). Com-

pound 1 exhibited a particularly bright green fluorescence

due to light emission between 450 and 600 nm with a

maximum at kmaxem = 490 nm upon excitation at 390 nm,

which was the kmaxex (excitation and emission fluorescence

spectra were recorded in methanol).

Compound 1 was characterized by mass analysis and 2D

NMR experiments. Complete 1H and 13C NMR charac-

terization was achieved through the analysis of coupling

patterns and 2D NMR (1H–1H COSY, 1H–13C HSQC,1H–13C HMBC, 1H–1H ROESY) experiments. Table 1

shows the NMR data of 1. From COSY experiment, two

series of proton signals belonging to the two different

aromatic cycles could be identified. One series included the1H-NMR resonances at 8.31, 8.25, 7.92, and 7.85 that were

attributed to H4, H1, H3, and H2, respectively. The other

series included NMR resonances at 9.28, 8.09, 7.64, and

7.60 that were attributed to H7, H10, H8, and H9,

respectively. Discrimination between the two sets of

Scheme 1 Synthesis of cationic benzimidazopyridoquinoxaline. I, OTf, and Cl refer to iodide, triflate, and chloride counterion, respectively

4044 Med Chem Res (2014) 23:4042–4049

123

signals was not directly possible from NMR data of com-

pound 1 but proved to be possible after methylation. Thus,

attribution of NMR signals of 1 was deduced from the

attributions of 2 (see below).

Quaternarization of 1 was carried out in the presence of

MeI (150 mol. equiv. in dimethylformamide) and/or methyl

trifluoromethanesulfonate (2 mol. equiv. in dichlorometh-

ane). Methyl trifluoromethanesulfonate was more efficient.

Table 1 1H (500 MHz) and 13C NMR data of 1 in CDCl3

Position d13C

(ppm)

d1H

(ppm)

Multiplicity,3JH,H (Hz)

HMBC 3JC,H ROESY

1 129.22 8.25 d, 8 H1/C3

H1/C4a

2 129.15 7.85 t, 8 H2/C4

H2/C14a

3 130.88 7.92 t, 8 H3/C1

H3/C4a

4 128.35 8.31 d, 8 H4/C14a

H4/C2

4a 140.84

5a 141.32

6a 130.94

7 116.69 9.28 d, 8 H7/C9

H7/C10a

8 124.88 7.64 t, 8 H8/C10

H8/C6a

9 125.32 7.60 t, 8 H9/C7

H9/C10a

10 120.63 8.09 d, 8 H10/C8

H10/C6a

10a 144.17

11a 148.50

12 135.06

12a 18.11 2.84 H(Me12a)/

C13

H(Me12a)/

H13

H(Me12a)/

C11a

H(Me12a)/

C12 (2JCH)

H(Me12a)/

C13a

(4JCH)

13 128.72 7.77 H13/C11a H13/

H(Me12a)H13/C5a

13a 138.74

14a 139.91

Table 2 1H NMR (500 MHz) and 13C NMR data of 2 (200 with iodide

counter ion) in DMF-d7

Position d13C

(ppm)

d1H

(ppm)

Multiplicity3JH,H (Hz)

HMBC3

JC,H

ROESY

1 129.82 8.51 d, 8 H1/C3

H1/C4a

2 132.07 8.24 t, 8 H2/C4

H2/C14a

3 133.73 8.32 t, 8 H3/C1

H3/C4a

4 128.37 8.71 d, 8 H4/C2 H4/H7

H4/C14a

4a 140.83

5a 139.70

6a 128.33

7 118.90 9.88 m H7/C9 H7/H4

H7/C10a

8 129.00 8.10 m H8/C10

9 128.91 8.11 m H9/C7

10 113.81 8.57 m H10/C8 H10/

H(Me11)H10/C6a

10a 134.00

11a 144.62

12 128.88

13 138.58 8.79 s H13/C5a

H13/C11a

H13/H12

H13/C12a

13a 137.03 H13/

H(Me12a)

14a 142.89

12a 19.79 3.36 s H12/C12

(2JCH)

H12 /H13

H12/C13 H12/

H(Me11)H12/C11a

11 34.2 4.89 s H(Me11)/

C10a

H(Me11)/

H(Me12a)

H(Me11)/

C11a

H(Me11)/

H10

Med Chem Res (2014) 23:4042–4049 4045

123

Quaternarized product was characterized by mass and 2D

NMR spectrometry. The assignment of the 1H and 13CNMR

spectra was based on the analysis of coupling patterns and

2D NMR (1H–1H COSY, 1H–13C HSQC, 1H–13C HMBC,1H–1HROESY) experiments on 200 (Table 2). As in the case

of 1, two families of proton signals could be attributed to

H1–H4 and H7–H10. As in the case of 1, H13 was the only

aromatic proton appearing as a singlet. TheHMBC spectrum

showed long-range 3J coupling between H-atom of methyl

on nitrogen at position 11 (d = 4.89 ppm) and C10a

(d = 134.0 ppm) on the one hand and between H-atom of

methyl on nitrogen at position 11 and C11a

(d = 144.62 ppm) on the other hand. Significant structural

information on N-methylated compound was gained from

2D ROESY spectrum, which showed a correlation between

the two methyl groups, methyl at N11 and methyl at C12a

(NMR resonances at d = 4.89 and 3.36 ppm). This unam-

biguously located the position of quaternarization at N11. If

methylation had occurred at N13, such a through-space

correlation would not have been possible. Furthermore, a

ROESY correlation was observed between the N-methyl

group (d = 4.89 ppm) and H10 (d = 8.57 ppm) and

between the aromatic protons H4 (d = 8.71 ppm) and H7

(d = 9.88 ppm). This allowed us to identify the resonance

signals of protons H7–H10 and especially that of H7, which

appeared as the most deshielded one. Consequently, the

signal corresponding to the aromatic proton observed at

significantly lower field was attributed to H7 in the NMR

spectrum of 1 as well and thus elucidated attribution.

Additionally, 2D ROESY spectrum of 2 showed a correla-

tion between H13 (d = 8.79 ppm) and H12 protons

(d = 3.36 ppm) as was observed for 1 (Table 1).

In view of biological tests, the quaternarized compound

was associated to a chloride counter ion (2) by incubation

of 20 with a chloride-loaded ion exchange resin. Compound

2 was soluble in water.

Many methods have been designed for the evaluation of

the affinity and selectivity of G-quadruplex ligands (Murat

et al., 2011; Jaumot and Gargallo 2012). Among them the

FRET melting assay developed by Mergny (Mergny and

Maurizot 2001; De Cian et al., 2007) is rapid and easy to

set-up. It was used in numerous reports for the evaluation

of the binding properties of G4-ligands (Monchaud et al.,

2008). Thus, it is particularly convenient for comparison

purpose. This assay is based on the measurement of the

stabilization induced by a ligand to a fluorescently labeled

quadruplex-forming oligonucleotide (F21T, 50-FAM-

G3(TTAG3)3-TAMRA-30). The denaturation of the

G-quadruplex structure upon heating causes the fluores-

cence emission of FAM. DNA melting is characterized by

a half-melting temperature (T1/2) at which half of the

fluorescence emission is measured. The stabilization effect

of a bound G4-ligand induces an increase in the melting

temperature of F21T (DT1/2). The concentration of F21T

G-quadruplex DNA is kept constant (0.2 lM), and the

concentration of G4-ligand may vary. Increasing concen-

tration of G4-ligand in the medium induces an increase of

DT1/2. High DT1/2 at low ligand concentration is the typical

signature for a strong ligand. When a competitor DNA is

added, the G4-ligand may bind to the competitor DNA.

The resulting decrease in DT1/2 indicates the displacement

of the G4-ligand from F21T to the competitor DNA. In the

case of a selective G4-ligand, the DT1/2 is not affected by

the presence of any competitor DNA. The competition

assay is performed at given G4-ligand, and F21T concen-

trations and measurements are carried out at increasing

Fig. 1 FRET melting results for 2, 3, 4, and 9-OH-NMe-E. Stabiliza-

tion of F21T (0.2 lM) was measured at 1 (blue), 5 (red), and 10 lM

(green) concentrations in 10 mM lithium cacodylate buffer (pH 7.2)

with 10 mM KCl and 90 mM LiCl (Color figure online)

Scheme 2 Structure of 9-OH-

NMe-E and compounds 3 and 4

4046 Med Chem Res (2014) 23:4042–4049

123

concentrations of competitor. Therefore, this assay allows

the evaluation of the stabilization capacity of a ligand

toward G-quadruplex DNA denaturation and the evaluation

of the selectivity of a G4-ligand for G-quadruplex DNA

versus a competitor DNA. The assay does not permit the

measurement of binding constants (Ka). However, it con-

stitutes a good first approximation of relative affinity of

ligands for G-quadruplex DNA.

Ni-TMPyP4 porphyrin was included in the tests as a

standard G-quaduplex ligand (Romera et al., 2011). It

stabilized G-quadruplex F21T DNA (0.2 lM) with a DT1/2of 20 °C at 1 lM concentration (not shown). Ni-TMPyP4

has the same stabilization capacity as TMPyP4, a common

G-quadruplex ligand (Wheelhouse et al., 1998) with a

binding constant Ka = 106 M-1 (Dixon et al., 2005).

Compound 2 exhibited DT1/2 of 3.6, 9.3, and 13.5 °C at 1,

5, and 10 lM concentrations, respectively (Fig. 1). The

ratio ligand/F21T DNA employed in the present work was

5, 25, and 50 mol. equiv. of ligand. This data showed that 2

could be considered as a modest G-quadruplex DNA ligand

when compared to cationic porphyrins such as TMPyP4

and Ni-TMPyP4. Compound 2 was also compared with a

DNA intercalating agent in the ellipticine series,

9-hydroxy-N-methylellipticine acetate (9OH-NMe-E)

(Khon et al., 1975; Le Pecq et al., 1974; Jain et al., 1979),

and with two other cationic aromatic indoloquinoxaline

derivatives 3 and 4 (Scheme 2). The 9-OH-NMe-E deriv-

ative is an antitumoral drug, celiptiumÒ (Paoletti et al.,

1980). Up to now, its G-quadruplex binding capacity has

not been assayed. Compound 3 was reported to have some

antitumoral activity (Gudkov 2008). The structure of 3 is

reminiscent of some G-quadruplex ligands reported in the

literature such as indoloquinoline derivative (Ou et al.,

2007; Dai et al., 2011). It was prepared as described by

Shibinskaya et al. (2010) with some modifications. It was

methylated to afford compound 4 in view of better solu-

bility in water and better G-quadruplex affinity due to the

increase in the number of positive charges. As shown in

Fig. 1, the affinity of 9-OH-NMe-E and 2 for G-quadruplex

DNA were similar. Ellipticine derivative exhibited DT1/2 of

2, 6, and 12.3 °C at 1, 5, and 10 lM concentrations,

respectively. Therefore, as compound 2, 9-OH-NMe-E,

proved to be a modest G-quadruplex binder. However, the

binding properties of 2 and 9-OH-NMe-E toward double-

stranded DNA differed. G-quadruplex versus duplex DNA

affinity was assessed by FRET-based competition assay.

Compound 2 appeared to be G-quadruplex specific as

evidenced by stable DT1/2 of F21T/2 complex even in the

presence of excess ds26 double-stranded DNA competitor

(2 and 10 lM concentrations of competitor correspond to

10 and 50 mol. equiv., respectively) (Fig. 2). On the

opposite, 9-OH-N-Me-E, known to intercalate between the

base pairs of DNA, did not retain G-quadruplex stabiliza-

tion capacity when the concentration of double-stranded

DNA competitor increased (Fig. 2).

Compounds 3 and 4 were less efficient G-quadruplex

DNAbinders than 2. Compound 3 proved to be totally unable

to stabilize F21T G-quadruplex while 4 showed very low

DT1/2 of 2, 3, and 5 °C at 1, 5, and 10 lM concentrations,

respectively. The introduction of two constitutive positive

charges on the molecule improved the binding capacity of

the compound toward G-quadruplex DNA. However, these

positive charges were probably not located properly for a

significant optimization of ionic interaction with DNA. The

location of the positive charges with respect to the aromatic

core was previously shown to be of great importance for

tuning G-quadruplex affinity in other series of G-quadruplex

ligands (Moore et al., 2006; Housou et al., 2007).

Conclusion

Pentacyclic aromatic and cationic compound 2 appeared as

a modest G-quadruplex DNA ligand but was shown not to

bind to double-stranded DNA in competition experiments.

Thus, 1 or 2 can be considered as suitable scaffolds for

further modification in order to improve their solubility and

binding constant toward G-quadruplex DNA or RNA.

Indeed, other rigid aromatic platforms showed similar

moderate binding affinities for G-quadruplex DNA before

chemical decoration with suitable cationic side chains

converted them to strong and selective G-quadruplex

ligands (Mergny et al., 2001; Koeppel et al., 2001; Moore

et al., 2006; Hounsou et al., 2007; Ma et al., 2009). The

crescent-shaped pentacyclic compound (2) appears more

promising then ‘‘linear’’ tetracyclic aromatic scaffolds,

such as those of ellipticine (9-OH-NMeE) or indoloqui-

noxaline derivatives (3, 4).

Fig. 2 FRET melting competition results for 2 (10 lM) and 9-OH-

NMe-E (10 lM) carried out with F21T (0.2 lM) without (dark green

bars) or with increasing concentrations (2 and 10 lM, i.e., 10 and

50 mol equiv.) of competitor double-stranded DNA (ds26) in 10 mM

lithium cacodylate buffer (pH 7.2) with 10 mM KCl, 90 mM LiCl

(Color figure online)

Med Chem Res (2014) 23:4042–4049 4047

123

Acknowledgments This work was partly supported by the Inter-

national Associated Moroccan-French Laboratory on Molecular

Chemistry (LIA, LCMMF). Thomas Marie is acknowledged for

technical assistance.

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123

Supporting Information

Fig. S1 Aromatic region of the 1H NMR spectrum (400 MHz) of product 1 in CDCl3.

Fig. S2 Aromatic region of the 1H NMR spectrum (500 MHz) of product 2� in DMF-d7.

Fig. S3 Aromatic region of the 1H NMR spectrum (400 MHz) of product 2 in CD3OD.

Fig. S4 Aromatic region of the 1H NMR spectrum (500 MHz) of product 4 in D2O.

Fig. S5. 13

C NMR spectrum (127.5 MHz) of product 4 in D2O

Fig. S6. 13

C NMR spectrum (127.5 MHz) of product 1 in CDCl3.

Fig. S7. 13

C NMR spectrum (127.5 MHz) of product 2� in DMF-d7.

55

II. Tests sur l�enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis

Dans l�article 2 nous rapportons les conditions de préparation des solutions mères, la

production et la purification de l�enzyme InhA ainsi que les tests d�inhibition de

l�enzyme InhA en prenant comme standard la molécule de triclosan, inhibiteur connu

de l�enzyme.

Article 2: �6-(Diethylaminoethyl)indoloquinoxaline as inhibitor of InhA enzyme of

Mycobacterium tuberculosis�. (2014)

Résumé:

Deux séries de composés hétérocycliques dérivés de l'isatine ont été synthétisées.

Dans la première série, l'isatine a été N-substitué par des groupements aromatiques/

aliphatiques (1a-c)/(54-53-52). Dans la deuxième série, les composés (1a-c)/(54-53-52)

ont été condensés avec l�o-phénylène-diamine pour donner des dérivés

d�indoloquinoxaline (2a-c)/(64-63-62). Les composés ont été testés comme inhibiteurs

de l'enzyme InhA de M. tuberculosis. Le composé 6-

(diéthylaminoéthyl)indoloquinoxaline (2a)/(64) a inhibé 38% de l'activité de InhA à 50

µM. Cette activité constitue un point de départ encourageant. Les modes

d'interaction possibles de 2a-c/64-63-62 avec InhA ont été explorées par docking

moléculaire.

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56

III. Conclusions et perspectives

Nous avons donc montré que le composé aromatique et cationique (2)/(4��) de la

série benzimidazopyridoquinoxaline est apparu comme un ligand de l'ADN G-

quadruplex modeste mais non sélectif pour l'ADN double brin dans des expériences

de compétition. En plus la forme croissant de ce produit pentacyclique apparaissent

plus prometteuses que les composés aromatiques tetracycliques « linéaire » tels que

l'ellipticine (9-OH-NMeE) ou les dérivés d'indoloquinoxaline (3, 4)/(64, 84).

Les dérivés indoloquinoxaline (2a-c)/(64-63-62) que nous avons synthétisés ont été

évalués comme inhibiteurs de l'enzyme de InhA M. tuberculosis. Le composé

6(diéthylaminoéthyl)indoloquinoxaline (2a)/(64) a inhibé InhA. Il peut être considéré

comme une molécule « lead » pour la conception de nouveaux médicaments contre

la tuberculose.

Les études de docking ont montré que les quatre anneaux aromatiques de 2a-c/64-

63-62 semblent appropriés en taille et en forme pour un localisation dans la poche

lipophile comme le groupement de fluorène GEQ et que le composé 2a/64 peut

également établir une interaction ionique unique entre l'alkyl amine tertiaire protonée

et le groupe phosphate de cofacteur.

Conclusion générale

57

Notre travail avait pour objectif la synthèse et la caractérisation des nouveaux ligands

d�ADN quadruplex à base de quinoxaline.

Nous avons choisi de synthétiser dans la première partie de ce travail de thèse un

produit pentacyclique dérivé de benzimidazopyridoquinoxaline à partir de la sérine et

de l�o-phénylènediamine. Ce produit possède une forme en croissant et porte une

charge positive. Les tests de FRET ont montré que ce produit a des meilleures

propriétés de liaison à l�égard de l�ADN-quadruplex que celles présentées par

l�ellipticine ou les dérivés d�indoloquinoxaline. Ce squelette peut donc être considéré

comme une base prometteuse en vu d�une optimisation vers des ligands spécifiques

d�ADN G-quadruplex.

Des pistes d�optimisation en vue d�une meilleure reconnaissance de l�ADN G-

quadruplex pourraient consister à l�addition de bras substituants cationiques sur le

squelette déjà quaternarisé (4��) ou neutre (4) de manière à obtenir des zones

d�interactions supplémentaires avec les boucles ou les sillons des ADNs G-

quadruplex.

Nous nous somme ensuite tournés, dans la deuxième partie de ce travail, vers la

synthèse d�autres composés de la série indoloquinoxaline à partir des isatines

substituées et d�o-phénylènediamine. Ces composés tetracycliques ont été testés

comme inhibiteurs de l�enzyme InhA de Mycobacterieum tuberculosis.

Le composé 6(diéthylaminoéthyl)indoloquinoxaline (64) a montré une inhibition de

38% de l�activité de InhA à 50 µM. Cette activité constitue un point de départ

encourageant. La modélisation de l�interaction de ce composé dans le site actif de

l�enzyme montre deux formes d�interactions possibles : (i) une interaction de la partie

aromatique du composé dans la poche hydrophobe de l�enzyme et (ii) une interaction

ionique entre l'alkyl amine tertiaire protonée et le groupe phosphate du cofacteur

NADH. On voit bien que pour cette molécule 64 le bras aliphatique de jonction entre

la partie aromatique et l�amine tertiaire terminale est trop court pour que les deux

interactions révélées par la modélisation moléculaire puissent avoir lieu en même

temps. En conséquence, il semble intéressant d�envisager la synthèse d�un dérivé

indoloquinoxaline à chaîne plus longue pour tenter d�associer deux modes de liaison

à l�enzyme InhA sur la même molécule et obtenir ainsi un inhibiteur puissant de

l�enzyme.

Partie expérimentale

58

Les réactifs et solvants utilisés proviennent de fournisseurs standards en produits

chimiques et ont été utilisés sans purification ultérieure. Les chromatographies

sur couche mince ont été réalisées sur plaque de silice MERCK 60 F254 ou sur

plaque d'aluminium 150 F254 oxyde d'aluminium neutres.

Les spectres RMN ont été enregistrés sur des appareils Bruker 400 et/ou 500. Les

spectres de masse ont été réalisés au service d�analyse de l�Institut de Chimie de

Toulouse (ICT-FR2599)

Les spectres UV-visible ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Hewlett

Packard 8452 A et les spectres de fluorescence sur un fluorimètre Safas FLX-

Xenius.

Produit 4 :

Un mélange d�o-phénylènediamine (3,0 g, 0,027 mol) et de sérine (10,2 g, 0,097 mol)

est maintenu à reflux dans 40 mL d'acide chlorhydrique (5,5 N) durant 3 jours.

Après neutralisation du milieu réactionnel avec une solution saturée de carbonate de

sodium Na2CO3, le précipité est filtré et séché sous pression réduite. Le brut

réactionnel est alors purifié par chromatographie sur une colonne d'alumine neutre

éluée avec 100% de dichlorométhane. Le solvant des fractions contenant le produit

est évaporé sous pression réduite pour donner, après précipitation du produit dans

un mélange dichlorométhane/hexane, 01/10 et séchage sous vide, 4 sous la forme

d�un produit cotonné jaune (150 mg, rendement = 4%). Rf = 0,76 (plaque d�alumine

neutre, 100% dichlorométhane).

RMN 1H (500 MHz, CDCl3) �, ppm : 9,28 (d,1H, J = 8 Hz, H7), 8,31 (d, 1H, J = 8 Hz,

H4), 8,25 (d, 1H, J = 8 Hz, H1), 8,09 (d, 1H, J = 8 Hz, H10), 7,92 (t,1H, J = 8 Hz, H3),

7,85 (t, 1H, J = 8 Hz, H2), 7,77 (s,1H, H13), 7,64 (t, 1H, J = 8 Hz, H8), 7,60 (t, 1H, J =

8 Hz, H9), 2,84 (s, 3H, H12).

NN

N

NN NN

1

22

4

34a 5a

6a

77

8 9

1100

10a

11a

112

1313a14a

12a

A B C

DD

E

59

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) �, ppm : 148,50 (C11a), 144,17 (C10a), 141,32 (C5a),

140,84 (C4a), 139,91 (C14a), 138,74 (C13a), 135,06 (C12), 130,94 (C6a), 130,88

(C3), 129,22 (C1), 129,15 (C2), 128,72 (C13), 128,35 (C4), 125,32 (C9), 124,88 (C8),

120,63 (C10), 116,69 (C7), 18,11 (C12a).

HRSM (+ESI) m/z : pour C18H13N4 [M + H]+ calculé: 285,1140, observé: 285,1138.

UV/vis [CH3OH] : max, nm (!, M-1 cm-1) = 255 (25 ± 1x103), 401 (12,3 ± 1x103).

Fluorescence [CH3OH] ex = 390 nm, em = 490 nm.

Produit 4� avec in contre ion iodure :

A une solution de 4 (40 mg, 0,141 mmol) dans du diméthylformamide (10 mL), on

ajoute du iodure de méthyle (3 mL, 0,021 mol). La réaction est maintenue à 80 °C

pendant 2 jours. On réduit le volume de solvant à 1 mL sous pression réduite et on

ajoute de l'acétone (100 mL).

Le précipité qui se forme après une nuit à 4 °C est filtré, lavé avec de l'acétone (3x10

mL) et séché sous vide pour obtenir le produit 4� avec un contre ion iodure sous la

forme d�une poudre rouge (34 mg, rendement = 56%). Rf = 0,5 (plaque de silice,

CH3CN/H2O/KNO3sat, 8/1/1).

RMN 1H (500 MHz, DMF-d7) �, ppm : 9,88 (m, 1H, H7), 8,79 (s, 1H, H13), 8,71 (d,

1H, J = 8 Hz, H4), 8,57 (m, 1H, H10), 8,51 (d, 1H, J = 8 Hz, H1), 8,32 (t, 1H, J = 8

Hz, H3), 8,24 (t, 1H, J = 8 Hz, H2), 8,12-8,09 (m, 2H, H8, H9), 4,89 (s, 3H, N-CH3),

3,36 (s, 3H, C-CH3).

RMN 13C (125,7 MHz, DMF-d7) �, ppm : 144,62 (C11a), 142,89 (C14a), 140,83

(C4a), 139,70 (C5a), 138,58 (C13), 137,03 (C13a), 134,00 (C10a), 133,73 (C3),

132,07 (C2), 129,82 (C1), 129,00 (C8), 128,91 (C9), 128,88 (C12), 128,37 (C4),

128,33 (C6a), 118,90 (C7), 113,81 (C10), 34,2 (C11), 19,79 (C12a).

NN

N

NN NN

1

22

4

34a 5a

6a

77

8 9

1100

10a

1111a

1213

13a14a12a

A B C

DD

E

11

I

60

Produit 4�� avec un contre ion triflate de méthyle :

A une solution de 4 (40 mg, 0,141 mmol) dans du dichlorométhane (5 mL) refroidie à

-78°C, on a ajouté du trifluorométhanesulfonate de méthyle (25 µL, 0,211 mmol). La

solution a été ensuite réchauffée à température ambiante et agitée pendant 12

heures. Après concentration sous vide, le résidu a été lavé avec CH2CI2 (50 mL)

pour donner un solide sous forme d�une poudre marron (4�� avec un contre ion

triflate de méthyle) (38 mg, rendement = 60%).

Rf = 0,5 (plaque de silice, CH3CN/H2O/KNO3sat, 8/1/1).

SM (+ ESI) m/z : 299,1 (100%) [M + H]+.

Produit 4�� avec un contre ion chlorure :

Le produit 4�� avec un contre ion triflate de méthyle (38 mg) a été dissous dans 10

mL de méthanol et déposé sur une colonne de 10 g chargée de chlorure DOWEX

1x8-200 (résine échangeuse d'ions), préparée avec du HCl 1 M puis équilibrée avec

de l�eau jusqu�à neutralité (pH 6-7). Le produit vert qui sort de la colonne a été

recueilli et évaporé à sec.

Le produit a été dissout dans 5 mL de méthanol et précipité avec de l'éther

diéthylique (50 mL). Après centrifugation, le culot a été séché sous vide pour obtenir

une poudre verte (4�� avec un contre ion chlorure) (24,5 mg, rendement = 86%).

L'absence de contre ion CF3SO3- a été vérifiée par analyse de masse (ESI négatif).

RMN 1H (400 MHz, CD3OD) �, ppm : 9,82-9,80 (m, 1H, H7), 8,57-8,55 (m, 2H, H13,

H4), 8,43 (d,1H, J = 8 Hz,H1), 8,27-8,30 (m, 1H, H10), 8,20 (t, 1H, J = 8 Hz, H3),

8,13 (t, 1H, J = 8 Hz, H2), 8,04-8,02 (m, 2H, H8,H9), 4,68 (s, 3H, N-CH3), 3,21 (s, 3H,

C-CH3).

HRSM (+ESI) m/z : pour C19H15N4 [M+] calculé: 299,1297, observé: 299,1289.

UV/vis [H2O] : "max, nm (#, M-1 cm-1) = 256 (29 ± 1 x 103), 397 (20 ± 1 x 103).

NN

N

NN NN

1

22

4

34a 5a

6a

77

8 9

1100

10a

1111a

1213

13a14a12a

A B C

DD

E

11

Cl

61

Produit 51 : forme chlorhydrate :

Du carbonate de césium (1,3 g, 0,0039 mole) a été ajouté à une solution agitée de

1H-indole-2,3-dione (0,2 g, 0,00136 mole) dans 15 mL de DMF. Puis le chlorure de

3,4-dichlorobenzoyle a été ajouté (0,266 g, 1,36 mole). Le mélange a été laissé à

température ambiante sous agitation pendant 24 h.

Le précipité minéral est filtré et lavé avec 5 mL de DMF. Le filtrat a été évaporé sous

pression réduite. Le résidu a été repris dans 200 mL de dichlorométhane et précipité

à température ambiante pendant une nuit pour obtenir 51 sous la forme d�un produit

cotonné jaune (0,462 g, rendement = 99%). Rf = 0,28 (plaque de silice, MeOH,

100%).

RMN 1H (400 MHz, CD3OD) �, ppm : 9,11 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,73 (d, 1H, J = 8 Hz),

7,51 (s, 1H), 7,48 (d, 2H, J = 8 Hz), 7,35-7,29 (m, 2H), 6,67-6,63 (m, 2H), 4,54 (d,

2H, J = 8 Hz).

SM (DCI/NH3) m/z : 322,9 (100%) [M+NH4]+ et 324,9 (65%)

Produit 51 : forme non protoné :


1H-indole-2 ,3-dione (0,2 g, 0,00136 mole) dans 15 mL de DMF. Puis le chlorure de

NH

O

O

CCll

CCll

CCll

NN

O

OO

CCCCllll

CCll

62

3,4-dichlorobenzoyle a été ajouté (0,266 g, 1,36 mole). Le mélange a été laissé à

température ambiante pendant 24 h sous agitation.


pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur une colonne de silice

éluée avec hexane/acétate d�éthyle de 90/10 à 70/30. Le solvant des fractions

contenant le produit est évaporé sous pression réduite pour donner 51 sous la forme

d�un produit cotonné jaune. Rf = 0,28 (plaque de silice, MeOH, 100%).

RMN 1H (300 MHz, CD3OD) d, ppm: 7,74 (dd, 1H, J = 8 Hz, J = 1,5 Hz), 7,51 (d, 1H,

J = 2 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,35-7,28 (m, 2H), 6,68-6,62 (m, 2H), 4,54 (s, 1H).

RMN 13C (100.6 MHz, CD3OD) d, ppm: 199,11, 172,73, 151,34, 140,29, 135,08,

134,65, 132,10, 130,29, 128,57, 126,45, 114,79, 113,89, 111,53, 44,64.

HRSM (DCI/CH4) m/z : pour C15H10NO2Cl2 [M+H]+ calculé: 306,0089, observé:

306,0102 (100%) et pour C15H9NO2Cl2 [M+H]+ = 308,0077 (70%).

IR n = 3286, 1621, 1608, 1582, 1518 cm-1.

Produit 52 :

Du carbonate de césium (4,67 g, 0,0136 mol) a été ajouté à une solution agitée de

1H-indole-2 ,3-dione (1 g, 0,0068 mole) dans 20 mL de DMF, puis du chlorhydrate de

2-chlorométhylpyridine (1,77 g, 0,0102 mol) a été ajouté. Le mélange a été laissé

sous agitation à température ambiante pendant 24 h.

Le précipité minéral est filtré et lavé avec 5 mL de DMF. Le filtrat a été évaporé

jusqu'à 1 mL de DMF sous pression réduite; le milieu réactionnel est versé dans 100

mL d'éther sous agitation, le précipité a été filtré sous fritte de verre P4 pour obtenir

52 sous forme d�un produit cotonné jaune (0,83 g, rendement = 50%). Rf = 0,24

(plaque de silice, hexane/acétate d�éthyle, 6/4).

NN

O

OO

N

63

RMN 1H (400 MHz, CDCl3) �, ppm : 8,57 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,69 (t, 1H, J = 8 Hz),

7,62 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,52 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,35 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,25 (t, 1H, J = 8

Hz), 7,11 (t; 1H; J = 8 Hz), 6,98 (d, 1H, J = 8 Hz), 5,06 (s, 2H).

SM (DCI/NH3) m/z : 339,0 (100%) [M+H]+.

IR n = 1723, 1599, 1592 cm-1.

Produit 53 :

Du carbonate de césium (6 g, 0,018 mole) a été ajouté à une solution agitée de 1H-

indole-2 ,3-dione (1 g, 0,0068 mole) dans 20 mL de DMF, puis le 2-

chlorométhylbenzène (1,17 g, 0,0102 mol) a été ajouté. le mélange a été agité à

température ambiante pendant 24 h.


pression réduite; le résidu a été purifié par précipitation dans un mélange

dichlorométhane/heptane, 1/10 pour obtenir un produit sous forme cotonné rouge-

orange (0,95 g, rendement = 60%). Rf = 0,77 (plaque de silice, hexane/acétate

d�éthyle, 6/4).

RMN 1H (400 MHz, CDCl3) �, ppm : 7,61 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,48 (t, J = 8 Hz), 7,37-

7,29 (m, 5H), 7,10 (t, J = 8 Hz), 6,77 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,93 (s, 2H).

SM (DCI/NH3) m/z : 238,0 (100%) [M+H]+.

IR n = 1728, 1608 cm-1.

Produit 54 :

NN

O

OOO

NN

O

OO

NNN

64


1H-indole-2 ,3-dione (1 g, 0,0068 mole) dans 20 mL de DMF, puis du 2-chloro-N,N-

diéthylethylamine chlorhydrate (1,75 g, 0,0102 mol) a été ajouté. Le mélange a été

agité à température ambiante pendant 24 h.


pression réduite; le résidu a été versé dans 100 mL d'éther sous agitation et on filtre

pour obtenir un produit orange sous forme cotonné (1,6 g, rendement = 96%). Rf =

0,16 (plaque de silice, hexane/acétate d�éthyle, 5/5, TEA 1%).

RMN 1H (400 MHz, CDCl3) �, ppm : 7,62-7,57 (m, 2H), 7,11 (t,1H, J = 8 Hz), 6,96 (d,

1H, J = 8 Hz), 3,82 (t, 2H, J = 8 Hz), 2,72 (t, 2H, J = 8 Hz), 2,58 (q, 4H, J = 8 Hz),

1,01 (t, 6H, J = 8 Hz).

SM (DCI/NH3) m/z : 247,0 (100%) [M+H]+.

IR n = 1736, 1606 cm-1.

Produit 61 :

Un mélange de 51 (0,115 g, 0,000337 mol), d�o-phénylènediamine (0,072 mg,

0,000674 mol) et d'acide acétique (10 mL) est porté à ébullition sous reflux pendant 3

h.

Le mélange réactionnel a été évaporé sous pression réduite. Le produit a été purifié

par flash-chromatographie à moyenne pression sur une colonne de silice de 20 g

éluée avec un mélange hexane/acétate d�éthyle de 90/10 à 70/30. Le solvant des

fractions contenant le produit est évaporé sous pression réduite pour donner 61 sous

la forme d�un produit cotonné jaune (0,076 g, rendement = 60%). Rf = 0,72 (plaque

de silice, hexane/acétate d�éthyle, 7/3, 1% TEA).

NN NN

N

ClCCll

65

RMN 1H (500 MHz, CDCl3) �, ppm : 8,53 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 8,37 (dd, 1H, J = 8,3

Hz, J = 1,2 Hz), 8,17 (dd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 1.2 Hz ), 7,81 (ddd, 1H, J = 8,3 Hz, J =

8,3 Hz, J = 1,2 Hz), 7,74 (ddd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 8,3 Hz, J = 1,2 Hz), 7,67 (ddd, 1H,

J = 8,2 Hz, J = 8,0 Hz, J = 1,2 Hz), 7,47 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,43 (ddd, 1H, J = 8,0

Hz, J = 7,6 Hz J = 1,2 Hz), 7,38 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,34 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,17 (dd,

1H, J = 8,3 Hz, J = 2,0 Hz), 5,68 (s, 2H).

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) �, ppm : 145,63, 143,87,140,56,139,93,139,68,

136,85, 133,06, 131,92, 131,19, 130,86, 129,40, 129,20, 129,06, 127,86, 126,57,

126,43, 122,98, 121,56, 119,82, 109,80, 44,04.

SM (DCI/NH3) m/z : 378,0 (100%) [M+H]+ et 380,0 (66%).

UV/vis [CH3OH] : max, nm = 271, 352.

Produit 62 :

Un mélange de 52 (0,25 g, 0,0011 mol), d�o-phénylènediamine (0,18 g, 0,00165 mol)

et d'acide acétique (15 mL) est porté à ébullition sous reflux pendant 2 h.



éluée avec un mélange hexane/acétate d'éthyle, de 90/10 à 80/20. Le solvant des


la! forme! d�un! produit! cotonné! orangre (0,251 g, rendement = 74%). Rf = 0,53

(plaque de silice, hexane/acétate!d�éthyle,!6/4).

RMN 1H (500 MHz, CDCl3) �, ppm : 8,63 (d, 1H, J = 5,0 Hz), 8,50 (d, 1H, J = 7,7 Hz),

8,35 (dd, 1H, J = 8,3 Hz, J = 1,2 Hz ), 8,16 (dd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 1,2 Hz), 7,78

(ddd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 8,3 Hz, J = 1,2 Hz), 7,72 (ddd, 1H, J = 8,3 Hz, J = 8,3 Hz, J

NN N

N

66

= 1,2 Hz), 7,63 (ddd, 1H, J = 8,2 Hz, J = 8,0 Hz, J = 1,2 Hz), 7,54 (ddd, 1H, J = 7,9

Hz, J = 7,0 Hz, J = 1,2 Hz), 7,46 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,40 (dd, 1H, J = 8,0 Hz, J = 7,7

Hz ), 7,19 (dd, 1H, J = 7,0 Hz, J = 5,0 Hz), 7,10 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 5,86 (s, 2H).

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) �, ppm : 156,52, 149,53, 145,69, 144,32, 140,65,

140,14, 139,64, 137,01, 131,10, 129,45, 128,86, 127,88, 126,22, 122,67, 122,66,

121,47, 121,34, 119,71, 110,37, 47,06.

SM (DCI/NH3) m/z : 311,1 (100%) [M+H]+

UV/vis [CH3OH] : max, nm (!, M-1 cm-1) = 270 (40,4 ± 0,5 103), 352 (15,2 ± 0,3 103).

Produit 63 :

Un mélange de 53 (0,46 g, 0,00194 mol), d�o-phénylènediamine (0,21 g, 0,00194

mol) et d'acide acétique (15 mL) est porté à ebullition sous reflux pendant 5 h.


par précipitation dans un mélange dichlorométhane/heptane, 1/10 pour obtenir 63

sous" forme" d�un" produit" cotonné" rouge-orange (0,422 g, rendement = 72%). Rf =

0,72 (plaque de silice, hexane/acétate"d�éthyle,"6/4).

RMN 1H (500 MHz, CDCl3) �, ppm : 8,52 (dd, 1H, J = 7,4 Hz, J = 1,2 Hz), 8,36 (dd,

1H, J = 8,3 Hz, J = 1,2 Hz), 8,18 (dd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 1,2 Hz), 7,79 (ddd, 1H, J =

8,4 Hz, J = 8,3 Hz, J = 1,2 Hz), 7,73 (ddd, 1H, J = 8,3 Hz, J = 8,3 Hz, J = 1,2 Hz),

7,64 (ddd, 1H, J = 8,2 Hz, J = 7,4 Hz, J = 1,2 Hz), 7,42-7,26 (m, 7H), 5,73 (s, 2H).

NN N

N

67

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) �, ppm : 145,85, 144,31, 140,69, 140,08, 139,58,

136,53, 131,01, 129,38, 128,82 (3C), 127,92, 127,68, 127,23 (2C), 126,13, 122,73,

121,18, 119,72, 110,16, 45,03.

SM (DCI/NH3) m/z : 310,0 (100%) [M+H]+.

UV/vis [CH3OH] : max, nm (!, M-1 cm-1) = 271 (34 ± 1 103), 352 (13,2 ± 0,4 103).

Produit 64 :

Un mélange de 54 (1,38 g, 0,0056 mol), d�o-phénylènediamine (0,73 g, 0,0095 mol)

et d'acide acétique (15 mL) est porté à ébullition sous reflux pendant 5 h.



éluée avec un mélange hexane/acétate d'éthyle, de 90/10 à 20/80. Le solvant des


la"forme"d�un"produit"cotonné"jaune"(1,3 g, rendement = 73%). Rf = 0,26 (plaque de

silice, hexane/acétate"d�éthyle,"6/4, 1% TEA).

RMN 1H (500 MHz, CDCl3) �, ppm : 8,50 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 8,32 (dd, 1H, J = 8,3

Hz, J = 1,2 Hz), 8,16 (dd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 1,2 Hz), 7,77 (ddd, 1H, J = 8,4 Hz, J =

8,3 Hz, J = 1,2 Hz), 7,72-7,68 (m, 2H), 7,54 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,39 (dd; 1H, J = 8

Hz, J = 7,6 Hz), 4,60 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 2,98 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 2,69 (q, 4H, J = 7,1

Hz), 1,05 (t, 6H, J = 7,1 Hz).

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) �, ppm : 145,68, 144,59, 140,67, 140,10, 139,31,

130,90, 129,31, 128,64, 127,90, 125,90, 122,74, 120,78, 119,54, 109,57, 50,65,

47,59 (2C), 40,16, 12,04 (2C).

N NN

N

68

SM (DCI/NH3) m/z : 319,1 (100%) [M+H]+.

UV/vis [CH3OH] : �max, nm ( , M-1 cm-1) = 269 (52 ± 2 103), 353 (18 ± 1 103).

Produit 8 :

Un mélange de carbonate de potassium anhydre (4 g) et de DMS (10 mL) a été agité

à température ambiante pendant 10 min.

Du DMS (2 mL) filtré sur une fritte de verre (P4) a été ajouté au produit 6 [61, 62 (40

mg) et 63, 64 (100 mg)]. Le mélange a été agité pendant 2 heures à 110 ° C.

La réaction est contrôlée par chromatographie sur couche mince de silice avec un

mélange d�acétonitrile/H2O/KNO3sat, 8/1/1.

Après refroidissement, le milieu réactionnel est versé dans 50 mL d'éther diéthylique

sous agitation, le produit précipité a été filtré sur verre fritté P4 est récupéré dans 10

mL d'eau distillée et lavé avec 50 mL de chloroforme.

La phase aqueuse a été réduite à 2 mL sous pression réduite pour les produit 72 et

74 avant l'échange de l'ion complémentaire. Dans le cas de 71 et 73 la phase

aqueuse est évaporée à sec et les deux produits sont dissous dans du méthanol (2

mL).

L�échange! du! contre-ion a été réalisée sur une colonne de 1x8-200 Dowex résine

échangeuse d'ions (10 g) préalablement lavé avec HCl 1 N et de l'eau jusqu'à pH

neutre.

Dans le cas des composés solubles dans l�eau!l'échange d'ions a été effectuée par le

chargement d'une solution aqueuse du composé. Dans le cas de composés solubles

dans le méthanol la colonne a été équilibrée avec du méthanol avant le chargement

du composé.

Après l'échange de contre-ion, les solutions d'eau et de méthanol éluées de la

colonne de résine ont été lyophilisées pour obtenir le produit 8 (81, 82, 83 et 84).

69

Produit 81 :

Produit rouge sous forme cotonné, 73 mg, rendement = 65%. Rf = 0,6 (plaque de

silice, acetonitrile/H2O/KNO3sat , 8/1/1).

RMN 1H (400 MHz, D2O) �, ppm : 8,89 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,81 (m, AMXX�), 8,58 (m,

AMXX�), 8,26-8,20 (m, 2H), 8,11 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,93 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,72 (t, 1H,

J = 8 Hz), 7,65 (s, 1H), 7,50 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,38 (d, 1H, J = 8 Hz), 5,99 (s, 2H),

5,21 (s, 3H).

SM (ESI positif) m/z : 392,07 (100%) [M+H]+ et 394,06 (66%).

UV/vis [CH3OH] : !max, nm (", M-1 cm-1) = 275 (30 ± 1 103), 394 (22 ± 1 103).

Produit 82 :

Produit cotonné orange, 100 mg, rendement = 90%. Rf = 0,5 (plaque de silice,

acetonitrile/H2O/KNO3sat , 8/1/1)

RMN 1H (500 MHz, D2O) �, ppm : 8,79 (m, 2H), 8,63 (dd, 1H, J = 8,7 Hz, J = 1,2

Hz), 8,45 (ddd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 8,0 Hz, J = 1,2 Hz), 8,41 (dd, 1H, J = 8,3 Hz, J =

1,2 Hz), 8,18 (ddd, 1H, J = 8,7 Hz, J = 8,0 Hz, J = 1,2 Hz), 8,14 (ddd, 1H, J = 8,3 Hz ,

J = 8,0 Hz , J = 1,2 Hz), 8,08 (ddd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 8,0 Hz, J = 1,2 Hz), 7,98 (dd,

1H, J = 8,0 Hz , J = 5,0 Hz), 7,81 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,79 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,72

(dd, 1H, J = 8,0 Hz, J = 7,8 Hz), 6,34 (s, 2H), 5,15 (s, 3H).

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) d, ppm: 150,0, 147,4, 146,9, 142,3, 141,0, 137,5,

132,4, 132,1, 131,9, 129,5, 129,4, 129,1, 127,9, 126,5, 124,2, 117,6, 113,1, 111,5,

42,9, 40,3.

NNN

NN

CCClll

Cl

Cl

NNNN

N

Cl

70

SM (ESI positif): m/z : 325,1 (100%) [M+H]+.

Produit 83 :

Produit cotonné orange, 123 mg, rendement = 90%. Rf = 0,8 (plaque de silice,

acetonitrile/H2O/KNO3, 8/1/1).

RMN 1H (400 MHz, D2O) d, ppm: 8,62 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,52 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,37

(d, 1H, J = 8 Hz), 8,10-8,03 (m, 2H), 7,92 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,73(d, 1H, J = 8 Hz),

7,54 (t, 1H, J = 8Hz), 7,32-7,23 (m, 5H), 5,82 (s, 2H), 5,01 (s, 3H).

SM (ESI positif) : m/z: 324,1 (100%) [M+H]+.

UV/vis [CH3OH] : �max, nm ( , M-1 cm-1) = 276 (30 ± 1 103), 394 (23 ± 1 103).

Produit 84 :

Produit cotonné rouge-orange, 118 mg, rendement = 90%. Rf = 0,6 (plaque de silice,

acetonitrile/H2O/KNO3sat, 8/1/1)

NNN

N

Cl

NNNNN

N

Cl

CCll

71

RMN 1H (500 MHz, D2O) d, ppm: 8,73 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,61-8,59 (m, 1H, AMXX�),

8,50-8,48 (m, 1H, AMXX�), 8,17-8,14 (m, 2H), 8,13-8,09 (m, 1H), 7,90 (d, 1H, J = 8,5

Hz), 7,67 (t, 1H, J = 8,5 Hz), 5,15 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 5,09 (s, 3H), 3,86 (t, 2H, J = 7,5

Hz), 3,59 (q, 4H, J = 7,2 Hz), 3,20 (s, 3H), 1,40 (t, 6H, J = 7,2 Hz).

RMN 13C (125,7 MHz, D2O) d (ppm):146,8, 146,5, 140,9, 137,3, 132,1, 131,8, 131,7,

129,5, 128,8, 127,9, 123,8, 117,5, 112,7, 111,2, 57,4 (2C), 56,0, 47,4, 40,2, 35,3, 7,2

(2C).

SM (ESI positif) : m/z: 174,1 [M/2]2+.

UV/vis [CH3OH] : max, nm (!, M-1 cm-1) = 274 (31 ± 1 103), 394 (23 ± 1 103).

Fluorescence [CH3OH] ex = 375 nm, em = 465 nm.

Produit 9 :

Un mélange de quinoxalin-2 ,3-dithione (1 g, 5,15 10-3 mole), benzhydrazide (1,4 g,

0,01 mol) et de DMF (40 mL) est porté à ébullition à reflux pendant 48 h. Le volume

de DMF a été réduit sous pression réduite (2 mL) et le résidu a été repris dans 100

mL d'éther diéthylique. Un produit huileux précipité rapidement après l'addition de

l'éther diéthylique. Après centrifugation, la phase d'éther diéthylique a été récupéré et

le précipité (produit huileux) a été lavé avec de l'éther diéthylique (2 x 3 mL). Le

produit cristallise dans la phase d'éther diéthylique pendant une nuit à température

ambiante. Les cristaux ont été collectés, lavés avec de l'éther diéthylique (5 mL) et

séchés sous vide. (0,7 g, rendement = 46%).

RMN 1H (400 MHz, DMSO) d, ppm: 10,74 (s, 1H), 9,19 (s, 1H), 7,97 (d, 2H), 7,61 (t,

1H), 7,56-7,51 (m, 3H), 7,48 (m, 1H), 7,33 (m, 2H).

NHH

HHN N

S

NNHH

O

72

RMN 13C (125,7 MHz, D2O) d (ppm):167,5, 165,8, 162,7, 152,1, 135,7, 133,1, 132,2,

128,9 (2C), 128,0 (2C), 126,5, 126,1, 125,9, 116,2.

SM (FAB positif) : m/z: 297 [M+H]+

RX La molécule cristallise avec une molécule de DMF. (Voir Zanzoul et.al. Acta

Crystallogr. E69, o1268 (2013) et Chapitre IV)

Produit 10 :

Le produit 9 (100 mg, mole) est porté à ébullition sous reflux pendant 24 h dans 4 mL

d�acide acétique. Après évaporation à sec de l�acide le produit est séché sous vide

pour obtenir le composé 10 sous forme cotonnée de couleur jaune. (58 mg,

rendement = 98%). Rf = 0,64 (plaque de silice, acétate d�éthyle, 100%).

RMN 1H (500 MHz, DMSO d6) d, ppm: 13,84 (s, 1H), 7,76-7,64 (m, 6H), 7,45 (t, 1H),

7,16-7,09 (m, 2H).

RMN 13C (125,7 MHz, DMSO d6) d (ppm): 209,00, 173,02, 150,95, 148,60, 131,56,

130,36 (2C), 129,67 (2C), 128,53, 128,33, 125,03, 123,30, 117,96, 116,63.

SM (FAB positif) : m/z: 279 (100) [M+H]+.

Produit 13 :

A une solution de 2,3-dichloroquinoxaline 12 (0,2 g, 1 mmol) dans de l'EtOH (5 ml),

on ajoute l'hydrate d'hydrazine (100 µL, 2 mmol). Le mélange a été agité une nuit à

25 ° C. Le précipité obtenu est filtré et lavé avec de l'EtOH et séché à sous vide pour

obtenir le 3-hydrazinoquinoxaline produit 13. (0,175 g, rendement = 88%).

NN

N

CCll

NHNH2

73

RMN 1H (400 MHz, CDCl3) d, ppm: 7,86 (d, 1H, J = 8 Hz), 7,77 (d, 1H, J = 8 Hz),

7,64 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,47 (t, 1H, J = 8 Hz), 6,83 (s, 1H), 4,19 (s, 2H).

SM (DCI/NH3) : m/z: 195 (100) [M+H]+.

Produit 14 :

Un mélange de produit 13 (0,173 g, 0,89 mmol) et de triéthylamine orthobenzoate (3

mL) a été agité à 100 ° C pendant 2 h. Le milieu réactionnel est refroidi à

température ambiante et le précipité qui se forme est filtré, lavé avec du cyclohexane

et séché sous vide pour donner le produit 14 sous forme cotonnée de couleur

blanche. (0,167 g, rendement = 67%).

RMN 1H (500 MHz, CDCl3) d, ppm: 8,08 (d, 1H, J = 10 Hz), 7,74-7,70 (m, 3H), 7,68-

7,60 (m, 3H), 7,56 (d, 1H, J = 10 Hz ), 7,43 (t, 1H).

RMN 13C (125,7 MHz, CDCl3) d (ppm): 151,23, 143,02, 142,46, 135,78, 131,43,

130,29, 130,02 (2C), 129,49, 129,35 (2C), 128,27, 127,58, 125,86, 116,02.

SM (DCI/NH3) m/z : 204,9 (100%) [M+H]+.

Produit 15 :

NN

NNNN

CCll

NNN

NN

NN

NN

CCll

NN

N

74

Un mélange de produit 13, le 3-hydrazinoquinixaline, (50 mg, 0,00025 mmol) et de

triéthyl orthoformate (2 mL) a été agité à 100 °C pendant 2 h. le milieu réactionnel est

refroidi à température ambiante et le précipité qui se forme est filtré, lavés avec du

cyclohexane et séché sous vide pour donner le produit 15 sous forme cotonnée de

couleur blanche. (34 mg, rendement = 65%).

RMN 1H (400 MHz, DMSO d6) d, ppm: 10,22 (s, 1H), 8.43 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,03 (d,

1H, J = 8 Hz ), 7,84 (t, 1H, J = 8 Hz ), 7,72 (t, 1H, J = 8 Hz ).

SM (ESI positif) :m/z = 281,05 (100%)[M + H]+.

ANNEXES �A�

75

�Page�83�

�

� �

Spectre 1: spectre RMN 1H (400 MHz) du produit 4 dans CDCl3

12a

H13

H7 H4 H 1 H3 H2

H8 H 9

H2O

H10

CDCl3

76

Spectre 3: spectre d�excitation et d�émission du produit 4 dans le méthanol à 7,6 µM

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

300 400 500 600

lambda (nm)

IF spectre exc (lambda

d'ems = 490 nm)

spectre ems (lambda

d'exc = 390 nm)

Spectre 2: spectre UV-visible du produit 4 dans le méthanol à 3,14 µM

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

200 250 300 350 400 450 500

l (nm)

ab

sorb

an

ce

401 nm

255 nm

77

Spectre 4: spectre RMN 1H (500 MHz) du produit 4� dans DMF d7

H11

H12a

H13

H2O

DMF

DMF

78

Spectre 5: spectre RMN 1H (400 MHz) pour du produit 4�� dans CD3OD

H11 H12a

H13

CD3OD

79

Spectre 6: spectre UV-visible du produit 4�� dans l�eau à 30,2 µM

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

200 250 300 350 400 450 500

ab

sorb

an

ce

l (nm)

397

256

ANNEXE �B�

80

N

O

O

CCll

CCll

Spectre 1: spectre IR du produit 51 forme non protoné

81

Spectre 1: spectre IR du produit 51 forme non protoné

NNNNN

O

OO

N

Spectre 2: spectre IR du produit 52

82


NN

O

OO

83

NNN

O

OOOO

NN


84


NH

O

O

Cl

Cl

Cl

CD3OD

CH2

H2O

Harm

N-H

Spectre 5: spectre RMN 1H (400 MHz) du produit 51 forme chlorhydrate dans CD3OD

85

Spectre 5: spectre RMN 1H (400 MHz) du produit 51 forme chlorhydrate dans CD3OD

CH2

CD3OD

H2O

CH2Cl2

(CH3)2CO

7Harm

N

O

O

Cl

Cl

Spectre 6: spectre RMN 1H (300 MHz) du produit 51 forme non protoné dans CD3OD

86

Spectre 6: spectre RMN 1H (300 MHz) du produit 51 forme non protoné dans CD3OD

N

O

O

Cl

Cl

Spectre 7 : spectre de masse haute résolution du produit 51 forme non protoné

87

NN

N

12

3

4 4a5a

6a7

8

910

10a

11a12a

A

BC

D

13

ClCl

15

16a17a

18

14a 19

E

H13

CDCl3

H1

H10

H7 H9

H8

H3

H15

H2

H18 , H4

H19

Spectre 8 : spectre RMN 1H (500 MHz) du produit 61 dans CDCl3

88

NN

N

12

3

4 4a5a

6a7

8

910

10a

11a12a

A

BC

D

N

13

14a

1516

17

18

E'

H13

CDCl3

H15

H1 H10 H7

H8

H9 H3

H17

H4

H2

H16

H18


89


NN

N

12

3

4 4a5a

6a7

8

910

10a

11a12a

A

BC

D

13

14a

15

1617

18

19

E''

H13

CDCl3

H2O

H1 H10

H7 H8

H9

H3

H2, H4, H15, H19,

H16, H18, H17

90

NN

N

12

3

4 4a 5a

6a7

8

910

10a

11a12a

A

BC

D

N

13

14

1516

H13 H14

H15 H16

H1 H7 H10 H9

H3, H8

H4 H2

CDCl3


91

NN

N

12

3

4 4a5a

6a7

8

910

10a

11a12a

13

14a

15

16a17a

18

19

Cl

ClCl

H13 N-CH3

D2O

CH3OH

Spectre 12 : spectre RMN 1H (400 MHz) du produit 81 dans D2O

92

H13

N-CH3

NN

N

12

3

4 4a5a

6a7

8

910

10a

11a12a

N

13

14a

1516

17

18

Cl

D2O

CH3OH


93

H13

N-CH3

D2O

CH3OH

NN

N

12

3

4 4a5a

6a7

8

910

10a

11a12a

13

14a

15

1617

18

19

Cl


94

Spectre 15: spectre RMN 1H (500 MHz) du produit 84 dans D2O

N-CH3

N-CH3

D2O

NN

N

12

3

4 4a 5a

6a7

8

910

10a

11a12a

A

BC

D

N

13

14

1516

Cl

Cl

H13 H14

H15

H16

ANNEXE �C�

95

Spectre 1: spectre RMN

1H (500 MHz) du produit 9 dans DMSO d6

NH

NH

9Harm + 1H de DMF

H2O DMF

DMSO

NH

HN N

S

NH

O

DMF

96

Spectre 2: spectre RMN 13

C (500 MHz) du produit 9 dans DMSO d6

NH

HN N

S

NH

O

Spectre 2: spectre RMN 13

C (500 MHz) du produit 9 dans DMSO d6

97

H2O

DMSO

NH

9Harm

3H

3H

1H

2H

Spectre 3: spectre RMN 1H (500 MHz) du produit 10 dans DMSO d6

98



N

N

Cl

N

N

9Harm CDCl3

H2O

1H

3H

3H

1H 1H

99


N

N

Cl

N

N

DMSO

Publication

N000-(3-Sulfanylidene-3,4-dihydro-

quinoxalin-2-yl)benzohydrazidedimethylformamide monosolvate

Asmae Zanzoul,a,b* El Mokhtar Essassi,a Genevieve

Pratviel,b Mohamed Saadic and Lahcen El Ammaric

aLaboratoire de Chimie Organique Heterocyclique, URAC 21, Pole de Competences

Pharmacochimie, Universite Mohammed V-Agdal, BP 1014 Avenue, Ibn Batouta,

Rabat, Morocco, bLaboratoire de Chimie de Coordination du CNRS 205, Route de

Narbonne 31077, Toulouse, France, and cLaboratoire de Chimie du Solide

Appliquee, Faculte des Sciences, Universite Mohammed V-Agdal, Avenue Ibn

Battouta, BP 1014, Rabat, Morocco

Correspondence e-mail: [email protected]

Received 28 June 2013; accepted 10 July 2013

Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 180 K; mean �(C–C) = 0.003 A;

R factor = 0.047; wR factor = 0.119; data-to-parameter ratio = 17.7.

The 2-sulfanylidene-3,4-dihydroquinoxalin-2-yl ring system of

the title solvate, C15H12N4OS�C3H7NO, is essentially planar,

the maximum deviation from the mean plane being

0.024 (2) A for the thione C atom. The mean plane through

the fused-ring system is almost perpendicular to the terminal

phenyl ring, as indicated by the dihedral angle of 70.05 (8)�. In

the crystal, the main and solvent molecules are linked by N—

H� � �O hydrogen bonds, forming a layer parallel to (010).

Related literature

For potential applications of quinoxaline derivatives, see:

Cheon et al. (2004); Jackson et al. (1991); Benzeid et al. (2012).

Experimental

Crystal data

C15H12N4OS�C3H7NO Mr = 369.44

Monoclinic, P21=ca = 10.4053 (2) Ab = 16.8563 (5) Ac = 10.3624 (2) A� = 100.882 (2)�

V = 1784.83 (7) A3

Z = 4Mo K� radiation� = 0.21 mmÿ1

T = 180 K0.20 � 0.12 � 0.04 mm

Data collection

Oxford Diffraction Xcalibur (Eos,Gemini ultra) diffractometer

Absorption correction: multi-scan(CrysAlis RED; Oxford Diffrac-tion, 2012)Tmin = 0.960, Tmax = 0.992

15848 measured reflections4153 independent reflections3090 reflections with I > 2�(I)Rint = 0.043

Refinement

R[F 2 > 2�(F 2)] = 0.047wR(F 2) = 0.119S = 1.034153 reflections

235 parametersH-atom parameters constrained��max = 0.30 e Aÿ3

��min = ÿ0.25 e Aÿ3

Table 1Hydrogen-bond geometry (A, �).

D—H� � �A D—H H� � �A D� � �A D—H� � �A

N3—H3N� � �O2i 0.88 2.14 2.906 (2) 146N4—H4N� � �O2ii 0.88 2.04 2.906 (2) 166N1—H1� � �O1iii 0.88 2.01 2.8331 (19) 154

Symmetry codes: (i) x; y; zþ 1; (ii) ÿxþ 1;ÿy;ÿz; (iii) ÿxþ 2;ÿy;ÿzþ 1.

Data collection: CrysAlis CCD (Oxford Diffraction, 2012); cell

refinement: CrysAlis RED (Oxford Diffraction, 2012); data reduc-

tion: CrysAlis RED; program(s) used to solve structure: SIR97

(Altomare et al., 1999); program(s) used to refine structure:

SHELXL97 (Sheldrick, 2008); molecular graphics: ORTEP-3 for

Windows (Farrugia, 2012); software used to prepare material for

publication: WinGX (Farrugia, 2012) and publCIF (Westrip, 2010).

Supplementary data and figures for this paper are available from theIUCr electronic archives (Reference: TK5236).

References

Altomare, A., Burla, M. C., Camalli, M., Cascarano, G. L., Giacovazzo, C.,Guagliardi, A., Moliterni, A. G. G., Polidori, G. & Spagna, R. (1999). J.Appl. Cryst. 32, 115–119.

Benzeid, H., Mothes, E., Essassi, E. M., Faller, P. & Pratviel, G. (2012). Compt.

Rend. Chim. 15, 79–85.Cheon, H.-G., Lee, C.-M., Kim, B.-T. & Hwang, K.-J. (2004). Bioorg. Med.

Chem. Lett. 14, 2661–2664.Farrugia, L. J. (2012). J. Appl. Cryst. 45, 849–854.Jackson, P. F., Davenport, T. W., Resch, J. F., Scott Lehr, G. & Pullan, L. M.

(1991). Bioorg. Med. Chem. Lett. 1, 751–756.Oxford Diffraction (2012). Oxford Diffraction Ltd, Yarnton,England.Sheldrick, G. M. (2008). Acta Cryst. A64, 112–122.Westrip, S. P. (2010). J. Appl. Cryst. 43, 920–925.

organic compounds

o1268 Zanzoul et al. doi:10.1107/S1600536813019181 Acta Cryst. (2013). E69, o1268

Acta Crystallographica Section E

Structure Reports

Online

ISSN 1600-5368

supplementary materials

sup-1Acta Cryst. (2013). E69, o1268


Acta Cryst. (2013). E69, o1268 [doi:10.1107/S1600536813019181]

N′-(3-Sulfanylidene-3,4-dihydroquinoxalin-2-yl)benzohydrazide dimethyl-

formamide monosolvate

Asmae Zanzoul, El Mokhtar Essassi, Geneviève Pratviel, Mohamed Saadi and Lahcen El Ammari

Comment

Quinoxaline derivatives have been discovered as leads for a novel series of dipeptidyl peptidase-IV molecules (Cheon et

al., 2004). They are also used as ligands for the strychnine-insensitive glycine site (Jackson et al., 1991) and as new

fluorescent probes for amyloid-β fibrils (Benzeid et al., 2012).

The crystal structure of title compound is build up from two fused six-membered rings (N1, N2 C1–C8) linked to a

benzohydrazide system (N3, N4, O1, C9–C15) and a dimethylformamide solvent molecule as shown in Fig. 1. The fused

rings system is almost planar with the maximum deviation from the mean plane being -0.024 (2) Å for the C1 atom. The

dihedral angle between the terminal phenyl ring and the fused ring system is 70.05 (8)°. In the crystal structure, the

molecules and the solvent are linked by N—H···O hydrogen bond to form a layer parallel to (0 1 0), Table 1.

Experimental

A mixture of quinoxaline-2,3-dithione (1 g, 5.15 10 -3 mol), benzhydrazide (1.4 g, 0.01 mol) and DMF (40 ml) was boiled

under reflux for 48 h. The volume of DMF was reduced under reduced pressure (2 ml) and the residue was taken up into

100 ml of diethyl ether. An oily product precipitated quickly after addition of diethyl ether. After centrifugation the di-

ethyl ether phase was recovered and the precipitate (oily product) was washed with diethyl ether (2 x 3 ml). The product

crystallized in the diethyl ether phase overnight at room temperature. Crystals were collected, washed with diethyl ether

(5 ml) and dried under vacuum. Yield: 700 mg, 46%.

Refinement

All H atoms could be located in a difference Fourier map. However, they were placed in calculated positions with C—H

= 0.95 Å (aromatic), N—H = 0.88 Å and C—H = 0.98 Å (methyl) and refined as riding on their parent atoms with Uiso(H)

= 1.2 Ueq(aromatic and N) and Uiso(H) = 1.5 Ueq(methyl).

Computing details

Data collection: CrysAlis CCD (Oxford Diffraction, 2012); cell refinement: CrysAlis RED (Oxford Diffraction, 2012);

data reduction: CrysAlis RED (Oxford Diffraction, 2012); program(s) used to solve structure: SIR97 (Altomare et al.,

1999); program(s) used to refine structure: SHELXL97 (Sheldrick, 2008); molecular graphics: ORTEP-3 for Windows

(Farrugia, 2012); software used to prepare material for publication: WinGX (Farrugia, 2012) and publCIF (Westrip,

2010).



Figure 1

Molecular structures of the components of the title compound showing the atom-labelling scheme. Displacement

ellipsoids are drawn at the 50% probability level.

N′-(3-Sulfanylidene-3,4-dihydroquinoxalin-2-yl)benzohydrazide dimethylformamide monosolvate

Crystal data

C15H12N4OS·C3H7NOMr = 369.44Monoclinic, P21/cHall symbol: -P 2ybca = 10.4053 (2) Åb = 16.8563 (5) Åc = 10.3624 (2) Åβ = 100.882 (2)°V = 1784.83 (7) Å3

Z = 4

F(000) = 776Dx = 1.375 Mg m−3

Mo Kα radiation, λ = 0.71073 ÅCell parameters from 4153 reflectionsθ = 3.1–27.9°µ = 0.21 mm−1

T = 180 KPlate, yellow0.20 × 0.12 × 0.04 mm

Data collection

Oxford Diffraction Xcalibur (Eos, Gemini ultra) diffractometer

Graphite monochromatorDetector resolution: 16.1978 pixels mm-1

ω scansAbsorption correction: multi-scan (CrysAlis RED; Oxford Diffraction, 2012)

Tmin = 0.960, Tmax = 0.992

15848 measured reflections4153 independent reflections3090 reflections with I > 2σ(I)Rint = 0.043θmax = 27.9°, θmin = 3.1°h = −13→13k = −21→21l = −13→13

Refinement

Refinement on F2

Least-squares matrix: fullR[F2 > 2σ(F2)] = 0.047wR(F2) = 0.119S = 1.034153 reflections

235 parameters0 restraintsPrimary atom site location: structure-invariant direct methods

Secondary atom site location: difference Fourier map



Hydrogen site location: difference Fourier mapH-atom parameters constrainedw = 1/[σ2(Fo

2) + (0.0514P)2 + 0.657P] where P = (Fo

2 + 2Fc2)/3

(∆/σ)max = 0.001∆ρmax = 0.30 e Å−3

∆ρmin = −0.25 e Å−3

Special details

Geometry. All s.u.'s (except the s.u. in the dihedral angle between two l.s. planes) are estimated using the full covariance matrix. The cell s.u.'s are taken into account individually in the estimation of s.u.'s in distances, angles and torsion angles; correlations between s.u.'s in cell parameters are only used when they are defined by crystal symmetry. An approximate (isotropic) treatment of cell s.u.'s is used for estimating s.u.'s involving l.s. planes.Refinement. Refinement of F2 against ALL reflections. The weighted R-factor wR and goodness of fit S are based on F2, conventional R-factors R are based on F, with F set to zero for negative F2. The threshold expression of F2 > 2σ(F2) is used only for calculating R-factors(gt) etc. and is not relevant to the choice of reflections for refinement. R-factors based on F2 are statistically about twice as large as those based on F, and R- factors based on ALL data will be even larger.

Fractional atomic coordinates and isotropic or equivalent isotropic displacement parameters (Å2)

x y z Uiso*/Ueq

C1 0.90077 (17) 0.07517 (11) 0.52315 (18) 0.0238 (4)C2 0.97172 (18) 0.13196 (12) 0.33400 (19) 0.0277 (4)C3 1.0611 (2) 0.18006 (13) 0.2856 (2) 0.0353 (5)H3 1.1320 0.2040 0.3438 0.042*C4 1.0448 (2) 0.19226 (15) 0.1524 (2) 0.0451 (6)H4 1.1046 0.2249 0.1179 0.054*C5 0.9401 (2) 0.15666 (16) 0.0673 (2) 0.0475 (6)H5 0.9300 0.1649 −0.0248 0.057*C6 0.8519 (2) 0.11001 (15) 0.1155 (2) 0.0403 (5)H6 0.7808 0.0868 0.0565 0.048*C7 0.86557 (18) 0.09631 (12) 0.25101 (19) 0.0289 (4)C8 0.79327 (17) 0.03925 (11) 0.42633 (17) 0.0231 (4)C9 0.64594 (16) −0.12910 (12) 0.37671 (17) 0.0245 (4)C10 0.53941 (17) −0.17643 (11) 0.29440 (17) 0.0230 (4)C11 0.40700 (17) −0.15997 (12) 0.28901 (18) 0.0264 (4)H11 0.3817 −0.1175 0.3391 0.032*C12 0.31276 (19) −0.20563 (13) 0.2106 (2) 0.0339 (5)H12 0.2226 −0.1951 0.2083 0.041*C13 0.3494 (2) −0.26669 (13) 0.1356 (2) 0.0357 (5)H13 0.2843 −0.2962 0.0787 0.043*C14 0.4802 (2) −0.28490 (12) 0.14304 (19) 0.0332 (5)H14 0.5049 −0.3278 0.0934 0.040*C15 0.57487 (19) −0.24034 (12) 0.22322 (18) 0.0290 (4)H15 0.6647 −0.2534 0.2298 0.035*C16 0.5145 (2) −0.09973 (14) −0.0642 (2) 0.0382 (5)H16A 0.4905 −0.0777 0.0155 0.057*H16C 0.5032 −0.1575 −0.0649 0.057*H16B 0.4582 −0.0768 −0.1418 0.057*C17 0.7469 (2) −0.09952 (17) 0.0508 (2) 0.0474 (6)H17A 0.8339 −0.0827 0.0381 0.071*H17B 0.7472 −0.1568 0.0666 0.071*H17C 0.7246 −0.0716 0.1265 0.071*C18 0.6865 (2) −0.05175 (12) −0.17353 (19) 0.0314 (4)



H18 0.7771 −0.0417 −0.1684 0.038*N1 0.98526 (15) 0.11775 (9) 0.46798 (15) 0.0263 (4)H1 1.0539 0.1380 0.5203 0.032*N2 0.77741 (15) 0.04876 (10) 0.29977 (15) 0.0277 (4)N3 0.70812 (15) −0.00590 (10) 0.47938 (15) 0.0306 (4)H3N 0.7111 −0.0052 0.5648 0.037*N4 0.61647 (15) −0.05320 (10) 0.39948 (15) 0.0264 (4)H4N 0.5395 −0.0336 0.3639 0.032*N5 0.65059 (16) −0.08079 (10) −0.06642 (15) 0.0312 (4)O1 0.75344 (13) −0.15906 (9) 0.42053 (14) 0.0373 (4)O2 0.61339 (14) −0.03660 (9) −0.27891 (13) 0.0342 (3)S1 0.91904 (5) 0.06336 (3) 0.68523 (5) 0.03039 (15)

Atomic displacement parameters (Å2)

U11 U22 U33 U12 U13 U23

C1 0.0196 (8) 0.0200 (9) 0.0310 (10) 0.0026 (7) 0.0027 (7) −0.0020 (7)C2 0.0236 (9) 0.0272 (10) 0.0317 (10) 0.0012 (8) 0.0033 (8) 0.0048 (8)C3 0.0263 (10) 0.0356 (12) 0.0422 (12) −0.0059 (9) 0.0017 (9) 0.0084 (9)C4 0.0325 (11) 0.0529 (15) 0.0495 (13) −0.0053 (10) 0.0066 (10) 0.0223 (11)C5 0.0351 (12) 0.0684 (18) 0.0373 (12) −0.0015 (12) 0.0028 (10) 0.0218 (12)C6 0.0291 (11) 0.0580 (15) 0.0308 (11) −0.0051 (10) −0.0018 (9) 0.0078 (10)C7 0.0219 (9) 0.0338 (11) 0.0306 (10) −0.0001 (8) 0.0037 (8) 0.0043 (8)C8 0.0192 (8) 0.0234 (10) 0.0256 (9) 0.0012 (7) 0.0016 (7) −0.0026 (7)C9 0.0180 (8) 0.0364 (11) 0.0193 (9) −0.0036 (8) 0.0043 (7) 0.0022 (8)C10 0.0222 (8) 0.0265 (10) 0.0197 (8) −0.0018 (7) 0.0020 (7) 0.0027 (7)C11 0.0229 (9) 0.0269 (10) 0.0290 (10) −0.0018 (8) 0.0040 (8) −0.0027 (8)C12 0.0233 (9) 0.0340 (12) 0.0411 (11) −0.0028 (8) −0.0020 (8) −0.0018 (9)C13 0.0369 (11) 0.0318 (12) 0.0340 (11) −0.0097 (9) −0.0041 (9) −0.0025 (9)C14 0.0454 (12) 0.0270 (11) 0.0274 (10) 0.0004 (9) 0.0072 (9) −0.0033 (8)C15 0.0275 (9) 0.0335 (11) 0.0262 (9) 0.0027 (8) 0.0060 (8) 0.0025 (8)C16 0.0374 (11) 0.0440 (13) 0.0349 (11) −0.0037 (10) 0.0114 (9) 0.0034 (10)C17 0.0407 (13) 0.0691 (17) 0.0308 (11) 0.0010 (12) 0.0030 (10) 0.0126 (11)C18 0.0308 (10) 0.0328 (11) 0.0312 (10) −0.0021 (9) 0.0075 (8) 0.0017 (8)N1 0.0198 (7) 0.0260 (9) 0.0312 (9) −0.0047 (6) 0.0006 (6) −0.0010 (7)N2 0.0214 (8) 0.0350 (10) 0.0260 (8) −0.0024 (7) 0.0025 (6) −0.0003 (7)N3 0.0284 (8) 0.0413 (10) 0.0213 (8) −0.0152 (7) 0.0031 (7) −0.0067 (7)N4 0.0199 (7) 0.0328 (9) 0.0246 (8) −0.0067 (7) −0.0008 (6) −0.0023 (7)N5 0.0300 (9) 0.0392 (10) 0.0241 (8) 0.0000 (7) 0.0048 (7) 0.0041 (7)O1 0.0192 (7) 0.0457 (9) 0.0432 (8) 0.0007 (6) −0.0041 (6) −0.0027 (7)O2 0.0356 (8) 0.0374 (8) 0.0286 (7) −0.0017 (6) 0.0033 (6) 0.0069 (6)S1 0.0267 (2) 0.0378 (3) 0.0253 (3) −0.0027 (2) 0.00135 (19) −0.0026 (2)

Geometric parameters (Å, º)

C1—N1 1.343 (2) C11—H11 0.9500C1—C8 1.483 (2) C12—C13 1.386 (3)C1—S1 1.6661 (19) C12—H12 0.9500C2—N1 1.390 (2) C13—C14 1.383 (3)C2—C3 1.396 (3) C13—H13 0.9500



C2—C7 1.401 (3) C14—C15 1.384 (3)C3—C4 1.374 (3) C14—H14 0.9500C3—H3 0.9500 C15—H15 0.9500C4—C5 1.401 (3) C16—N5 1.456 (3)C4—H4 0.9500 C16—H16A 0.9800C5—C6 1.372 (3) C16—H16C 0.9800C5—H5 0.9500 C16—H16B 0.9800C6—C7 1.404 (3) C17—N5 1.456 (3)C6—H6 0.9500 C17—H17A 0.9800C7—N2 1.384 (2) C17—H17B 0.9800C8—N2 1.300 (2) C17—H17C 0.9800C8—N3 1.360 (2) C18—O2 1.234 (2)C9—O1 1.233 (2) C18—N5 1.330 (3)C9—N4 1.347 (3) C18—H18 0.9500C9—C10 1.495 (2) N1—H1 0.8800C10—C15 1.394 (3) N3—N4 1.390 (2)C10—C11 1.396 (2) N3—H3N 0.8800C11—C12 1.383 (3) N4—H4N 0.8800

N1—C1—C8 113.62 (16) C14—C13—H13 119.8N1—C1—S1 122.24 (13) C12—C13—H13 119.8C8—C1—S1 124.13 (14) C13—C14—C15 119.64 (19)N1—C2—C3 120.68 (17) C13—C14—H14 120.2N1—C2—C7 117.32 (17) C15—C14—H14 120.2C3—C2—C7 122.00 (18) C14—C15—C10 120.48 (18)C4—C3—C2 118.92 (19) C14—C15—H15 119.8C4—C3—H3 120.5 C10—C15—H15 119.8C2—C3—H3 120.5 N5—C16—H16A 109.5C3—C4—C5 120.2 (2) N5—C16—H16C 109.5C3—C4—H4 119.9 H16A—C16—H16C 109.5C5—C4—H4 119.9 N5—C16—H16B 109.5C6—C5—C4 120.7 (2) H16A—C16—H16B 109.5C6—C5—H5 119.7 H16C—C16—H16B 109.5C4—C5—H5 119.7 N5—C17—H17A 109.5C5—C6—C7 120.7 (2) N5—C17—H17B 109.5C5—C6—H6 119.7 H17A—C17—H17B 109.5C7—C6—H6 119.7 N5—C17—H17C 109.5N2—C7—C2 121.65 (17) H17A—C17—H17C 109.5N2—C7—C6 120.77 (17) H17B—C17—H17C 109.5C2—C7—C6 117.58 (18) O2—C18—N5 126.27 (19)N2—C8—N3 120.54 (16) O2—C18—H18 116.9N2—C8—C1 124.59 (17) N5—C18—H18 116.9N3—C8—C1 114.87 (16) C1—N1—C2 124.49 (15)O1—C9—N4 123.04 (17) C1—N1—H1 117.8O1—C9—C10 120.98 (18) C2—N1—H1 117.8N4—C9—C10 115.98 (15) C8—N2—C7 118.23 (16)C15—C10—C11 119.35 (17) C8—N3—N4 120.40 (15)C15—C10—C9 118.19 (16) C8—N3—H3N 119.8C11—C10—C9 122.44 (17) N4—N3—H3N 119.8



C12—C11—C10 119.86 (18) C9—N4—N3 119.73 (15)C12—C11—H11 120.1 C9—N4—H4N 120.1C10—C11—H11 120.1 N3—N4—H4N 120.1C11—C12—C13 120.21 (19) C18—N5—C17 121.23 (17)C11—C12—H12 119.9 C18—N5—C16 121.41 (17)C13—C12—H12 119.9 C17—N5—C16 117.25 (17)C14—C13—C12 120.34 (18)

Hydrogen-bond geometry (Å, º)

D—H···A D—H H···A D···A D—H···A

N3—H3N···O2i 0.88 2.14 2.906 (2) 146N4—H4N···O2ii 0.88 2.04 2.906 (2) 166N1—H1···O1iii 0.88 2.01 2.8331 (19) 154

Symmetry codes: (i) x, y, z+1; (ii) −x+1, −y, −z; (iii) −x+2, −y, −z+1.

AUTEUR : Asmae ZANZOUL

TITRE : synthèse de ligands hétérocycliques polyaromatiques dérivés de quinoxaline pour le

ciblage de l'ADN G-quadruplex télomèrique

RESUME

Ce travail sur la synthèse de ligands hétérocycliques polyaromatiques dérivés de quinoxaline pour le ciblage de l'ADN G-quadruplex télomèrique s'inscrit dans le cadre de la recherche de nouveaux agents anti-cancéreux. L'objectif du travail est la conception des molécules capables d'inhiber la télomérase par stabilisation des G-quadruplex au niveau des télomères. Trois familles de composés polyaromatiques dérivés de quinoxaline ont été synthétisées : (i) la famille benzymidazopyridoquinoxaline, (ii) la famille indoloquinoxaline et (iii) la famille triazoloquinoxaline. Ces macrocycles ont été ensuite quaternarisés pour améliorer la solubilité dans l'eau et l'affinité vers l'ADN quadruplex.

Nous décrivons la synthèse d'un noyau pentacyclique dérivé du benzimidazole à partir de la sérine et l'o-phénylènediamine non substituée dans un milieu acide. La quaternarisation de cette molécule avec le triflate de méthyle donne un produit méthylé soluble dans l'eau.

Puis nous décrivons la synthèse de quatre noyaux tetracyclique dérivés du 6H-indolo[2,3-b]quinoxaline en deux étapes : une alkylation d'indole-2,3-dione suivie d'une condensation de ces isatines substituées avec l'o-phénylènediamine dans un milieu acide. La quaternarisation de ces composés a été effectuée avec le sulfate de diméthyle pour obtenir des produits solubles dans l'eau.

Enfin nous avons préparé quelques molécules polycycliques de la famille triazoloquinoxaline, ainsi qu'un produit de forme ouverte que nous avons isolé sous forme cristalline.

Dans une dernière partie l'étude des interactions des ligands de la famille de benzymidazopyridoquinoxaline et d'indoloquinoxaline avec l'ADN G-quadruplex télomérique par la méthode de FRET a été réalisée. Cette étude a montré que le composé aromatique et cationique de la série benzimidazopyridoquinoxaline, décrite dans le chapitre II, est apparu comme un ligand de l'ADN G-quadruplex modeste mais sélectif pour l'ADN quadruplex. Le composé pentacyclique sous forme de croissant semble plus prometteur que les aromatiques linéaires plus classiques comme les dérivés d�ellipticine ou d'indoloquinoxaline décrits dans le chapitre III.

Certains composés ont été également testés comme inhibiteurs de l'enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis. Le composé 6(diéthylaminoéthyl)indoloquinoxaline que nous avons synthétisés au chapitre III peut être considéré comme une molécule « lead» pour la conception de nouveaux inhibiteurs d�INhA.

Mots clés : benzymidazopyridoquinoxaline, indoloquinoxaline, triazoloquinoxaline, ADN G-quadruplex, enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis.

Produits AZ

N

N

N N N

N

N N N

N

N N

I Cl

4 4'4''

N

O

O N

O

O N

O

ON

O

O

N N

ClCl

5152

53 54

N

ClCl

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NN

N

61 62 6364

N

ClCl

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NN

N

7172

7374

(CH3)SO4

(CH3)SO4

(CH3)SO4

(CH3)SO4

(CH3)SO4

N

ClCl

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NN

NCl

ClCl

Cl

Cl

8182

8384

AUTEUR : Asmae ZANZOUL

TITRE : Synthèse de ligands hétérocycliques polyaromatiques dérivés de quinoxaline pour le ciblage de l'ADN G-quadruplex télomèrique

RESUME

Ce travail sur la synthèse de ligands hétérocycliques polyaromatiques dérivés de quinoxaline pour le ciblage de l'ADN G-quadruplex télomèrique s'inscrit dans le cadre de la recherche de nouveaux agents anti-cancéreux. L'objectif du travail est la conception des molécules capables d'inhiber la télomérase par stabilisation des G-quadruplex au niveau des télomères. Trois familles de composés polyaromatiques dérivés de quinoxaline ont été synthétisées : (i) la famille benzymidazopyridoquinoxaline, (ii) la famille indoloquinoxaline et (iii) la famille triazoloquinoxaline.

Ces macrocycles ont été ensuite quaternarisés pour améliorer la solubilité dans l'eau et l'affinité vers l'ADN quadruplex. Nous décrivons la synthèse d'un noyau pentacyclique dérivé du benzimidazole à partir de la sérine et l'o-phénylènediamine non substituée dans un milieu acide. La quaternarisation de cette molécule avec le triflate de méthyle donne un produit méthylé soluble dans l'eau.

Puis nous décrivons la synthèse de quatre noyaux tetracyclique dérivés du 6H-indolo[2,3- b]quinoxaline en deux étapes : une alkylation d'indole-2,3-dione suivie d'une condensation isatines substituées avec l'o-phénylènediamine dans un milieu acide. La quaternarisation de ces composés a été effectuée avec le sulfate de diméthyle pour obtenir des produits solubles dans l'eau.

Enfin nous avons préparé quelques molécules polycycliques de la famille triazoloquinoxaline, ainsi qu'un produit de forme ouverte que nous avons isolé sous forme cristalline.

Dans une dernière partie l'étude des interactions des ligands de la famille de benzymidazopyridoquinoxaline et d'indoloquinoxaline avec l'ADN G-quadruplex télomérique par la méthode de FRET a été réalisée. Cette étude a montré que le composé aromatique et cationique de la série benzimidazopyridoquinoxaline, décrite dans le chapitre II, est apparu comme un ligand de l'ADN G-quadruplex modeste mais sélectif pour l'ADN quadruplex. Le composé pentacyclique sous forme de croissant semble plus prometteur que les aromatiques linéaires plus classiques comme les dérivés d’ellipticine ou d'indoloquinoxaline décrits dans le chapitre III.

Certains composés ont été également testés comme inhibiteurs de l'enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis. Le composé 6(diéthylaminoéthyl)indoloquinoxaline que nous avons synthétisés au chapitre III peut être considéré comme une molécule « lead» pour la conception de nouveaux inhibiteurs d’INhA.

Mots clés : benzymidazopyridoquinoxaline, indoloquinoxaline, triazoloquinoxaline, ADN G- quadruplex, enzyme InhA de Mycobacterium tuberculosis.

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