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Title 口腔扁平上皮癌におけるCRISP3 遺伝子のコピー数異常

Author(s) 菅原, 圭亮; 柯, 文昌

Journal 歯科学報, 112(6): 714-717

URL http://hdl.handle.net/10130/2984

Right

はじめに

口腔扁平上皮癌は全世界で一年間に約３０万人が罹患する悪性腫瘍である１）。肉眼で観察可能であるにも関わらず未だ進行した病態で発見されることが少なくない。一旦進行すると咀嚼機能，構音機能を失うこととなり，審美的，肉体的，精神的障害を生じる。口腔扁平上皮癌のリスクファクターとして不良補綴物や飲酒，喫煙，HPV 感染などが知られている２－４）。近年，CT，MRI，PET などの画像により診断は向上し，また，外科療法を中心とした治療法は確立されてきているが，死亡率の改善には至っていない５）。そこで，現行の画像診断に加えてより診断・治療成績の向上のために分子生物学的アプローチが必要と考えられる。

悪性腫瘍と癌抑制遺伝子についての研究は活発になされている研究テーマの１つであり，様々な悪性腫瘍において癌抑制遺伝子は多数報告されている。口腔扁平上皮癌においても FHITなどの癌抑制遺伝

子の報告がある６）。今回我々は，マイクロアレイ法とリアルタイム定量 PCR（QPCR）法を用い，口腔扁平上皮癌患者の新規癌抑制遺伝子を全ゲノム網羅的に探索し同定するための実験を行った。その結果，いくつかの候補遺伝子を同定した。今回は新規癌抑制遺伝子候補の１つである CRISP3に関して，特異的 PCR プライマーを作成し QPCR 法を用いてヒト正常口腔粘膜上皮由来細胞株をコントロールとして５つの口腔扁平上皮癌由来細胞株（SAS，Ca9-22，KON，HSC2，HSC4）の DNA コピー数，および東京歯科大学口腔外科，台湾奇美病院口腔外科を受診した口腔扁平上皮癌患者６０症例で DNA コピー数変動解析を行い，CRISP3が新規癌抑制遺伝子となりうるか否か検討した。なお，本研究は東京歯科大学倫理委員会（承認番号：２０５）および奇美病院の倫理委員会の承認を得て行った。

方法と結果および考察

全ゲノム網羅的解析のために口腔扁平上皮癌患者

解説（学位論文 解説）

口腔扁平上皮癌におけるCRISP3 遺伝子のコピー数異常Copy number changes of CRISP3 in oral squamouscell carcinoma

菅原 圭亮 東京歯科大学口腔健康臨床科学講座口腔外科学分野 助教略歴 ２００４年東京歯科大学卒業，２００８年東京歯科大学大学院歯学研究科（口腔外科学専攻）修了（博士（歯学）），同年東京歯科大学口腔外科レジデント，２００９年東京歯科大学口腔外科助教，２０１２年より現職。研究テーマ：口腔扁平上皮癌における頸部リンパ節転移予測分子マーカーの同定 趣味：サッカー，ロードバイク台北市齒科醫師會理事略歴 1991 年台北醫學大學齒學部卒業，２０１１年東京歯科大学大学院歯学研究科（口腔外科学専攻）修了（博士（歯学）） 研究テーマ：口腔扁平上皮癌における新規癌抑制遺伝子の同定

Keisuke Sugahara

柯 文昌Ko Wen-chang

キーワード：口腔扁平上皮癌，CRISP3，新規癌抑制遺伝子，DNA コピー数Key words：oral squamous cell carcinoma, CRISP3, novel tumor suppresser gene, DNA copy number

（２０１２年５月２８日受付，２０１２年７月３日受理，歯科学報 １１２：７１４～７１７，２０１２．）

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３症例の腫瘍組織 cDNA を用い，マイクロアレイ法を行った。今回は Roche 社製 Homo sapiens 4 x72 k gene expression array を使用した。マイクロアレイ法において全３症例で発現低下を示したのはCRISP3，SCGB3A1，AGR2，PIP，C20orf114，TFF1，STATH，AZGP1，MUC7，DMBT1，LOC389429の１１遺伝子であった。また，過剰発現を示したのはMMP1，MMP3の２遺伝子であった（表１）。今回，発現低下を示した１１遺伝子の中で口腔扁平上皮癌との関連の報告がない CRISP3に着目し詳細な解析を行った。Primer 3 software（White-head Institute for Biomedical Research）を用いてCRISP3に特異的な PCR プライマーを作製した。また内部標準として GAPDHにも特異的 PCR プライマーを作製し，SYBR-Green を用いた定量 PCRを行った。CRISP3 のQPCR 法による解析で２つの正常角化

口腔粘膜由来細胞では各相同染色体に１コピーずつに相当する DNA コピー数を認めたのに対し，５つの口腔扁平上皮癌由来細胞株の中で２つの細胞株

（SAS，HSC2）で DNA コピー数欠失を認めた（図１）。また口腔扁平上皮癌患者腫瘍組織においては６０例中２４例（４０％）で DNA コピー数の欠失を認めた。臨床指標においては，性差および原発腫瘍の大きさが T1，T2 で統計学的有意な CRISP3の欠失を認めた（ｐ＜０．０５）（表２）。以上より CRISP3の欠

失は口腔扁平上皮癌の初期段階の発現に関与していることが考えられた。CRISP3は cysteine-rich se-cretory protein family に属し 6p12.3 に存在し，唾液腺，膵臓，前立腺で発現が認められ，前立腺癌において過剰発現がバイオマーカーになりうるとの報告がある。一方で我々の研究と同様に，頭頸部扁平上皮癌のマイクロアレイ解析では発現低下が報告されている。しかしながら口腔扁平上皮癌においてCRISP3を詳細に解析した報告はない。また，C20orf114，STATH，LOC389429，SCGB3A1は肺，前立腺，唾液腺において癌抑制遺伝子であることが報告されている。AGR2は発現低下が胃癌で報告されている７）。我々の実験結果では，過剰発現を示したの

表１ 発現異常を示した遺伝子リスト

Gene symbol 遺伝子名 遺伝子座

過剰発現遺伝子MMP1 matrix metallopeptidase 1 11q22MMP3 matrix metallopeptidase 3 11q22

発現低下遺伝子STATH statherin 4q11-q13MUC7 mucin 7 4q13-q21SCGB3A1 secretoglobin, family 3A, member 1 5q35-qterCRISP3 cysteine-rich secretory protein 3 6p12.3LOC389429 hypothetical LOC389429 6q21AGR2 anterior gradient homolog 2 7p21.3AZGP1 alpha-2-glycoprotein 1, zinc-binding 7q22.1PIP prolactin-induced protein 7q34DMBT1 deleted in malignant brain tumors 1 10q26.13C20orf114 Chr. 20 open reading frame 114 20q11.21TFF1 trefoil factor 1 21q22.3

図１

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はMMP1とMMP3の２遺伝子であった。MMPは１１番染色体長腕に座位し，MMP1は癌細胞の分化，アポトーシス，浸潤，転移への関与が報告されている８－１１）。今回の結果から，CRISP3は口腔扁平上皮癌において新規癌抑制遺伝子である可能性があり，その他の候補遺伝子も含め，今後更に検討を加えて行きたい。

まとめ

癌の予防と制御には分子生物学的マーカーやターゲットの同定が必要である１２，１３）。本研究では，マイクロアレイを用い全ゲノム網羅的に解析を行いCRISP3，SCGB3A1，AGR2，PIP，C20orf114，TFF1，STATH，AZGP1，MUC7，DMBT1，LOC389429の１１遺伝子の発現低下，およびMMP1，MMP3の発現亢進を同定した。そこで口腔扁平上皮癌との関連が知られていない CRIPS3を選択し詳細な解析を行った。

今回の結果から，CRISP3のコピー数欠失は口腔扁平上皮癌の癌化に関与し，新規癌抑制遺伝子である可能性が示唆された。今後は，検体数を増やしCRISP3の機能解析を行い，本結果の検証をし臨床応用を考えている。

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表２ 口腔扁平上皮癌患者における CRISP3の DNA コピー数変動と臨床指標

欠失 正常 P値 欠失 正常 P値

性 差 T 分類男性 １３ ３２ ０．００５ T1＋T2 ２１ ２１ ０．０２１女性 １１ ４ T3＋T4 ３ １５

頸部リンパ節転移年 齢 ＋ ６ １２ ０．５７３

６５歳未満 １７ ２１ ０．１０４ － １８ ２４６５歳以上 １５ ７

病期分類Ⅰ ５ ８ ０．１１１

人 種 Ⅱ ８ ４台湾人 ６ １１ ０．７７３ Ⅲ ６ １３日本人 １８ ２５ Ⅳ ５ １１

喫 煙原発部位Yes ７ １９ ０．１１０舌 ６ １７ ０．４９１No １７ １７頬粘膜 ６ ７

飲 酒下顎歯肉 ６ ６上顎歯肉 ４ ３ Yes １２ ２７ ０．０５８口底 ２ ３ No １２ ９

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本論文は，下記学位論文の内容を解説した。Copy number changes of CRISP3 in oral squamous cellcarcinoma. Ko Wen-chang, Keisuke Sugahara, TakumiSakuma, Ching-Yu Yen, Shyun-Yeu Liu, Gwo-An Liaw,Takahiko Shibahara., ONCOLOGY LETTERS, ３；７５～８１：２０１２．

別刷請求先：〒１０１‐００６１ 東京都千代田区三崎町２－９－１８東京歯科大学口腔健康臨床科学講座口腔外科学分野

菅原圭亮

歯科学報 Vol．１１２，No．６（２０１２） ７１７

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