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Revista Científica de la AMBB, Octubre - Diciembre, 2006 - Vol 16 Nº 488

ERITROPOYESIS Y ESPLENECTOMÍA EN UNMODELO MURINOERITHROPOIESIS AND SPLENECTOMY IN A MURINE MODEL

CECILIA D´ANNA, CHRISTIAN GATTI, TANIA VEUTHEY, MARIANELA SÁNCHEZ, MARTA ROQUE.Laboratorio de Fisiología Humana. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional del Sur. BahíaBlanca. Argentina.

Trabajo Original

Correspondencia:Dra. Marta Roque. Laboratorio de Fisiología Humana, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia,Universidad Nacional del Sur. San Juan 670. (8000) Bahía Blanca. Argentina.E-mail: [email protected]

Rec ib ido : 8 de noviembre de 2006Aceptado: 18 de diciembre de 2006

RESUMEN

Introducción: El bazo delratón adulto participa en la re-cuperación del eritrón porquesu estroma aporta un microen-torno adecuado para la prolife-ración y maduración de proge-nitores. Objetivo: Evaluar porestudios morfológicos el gradode eritropoyesis hepática y re-nal en ratones esplenectomiza-dos en respuesta a la hemólisisinducida por fenilhidrazina(FHZ). Materiales y Métodos:Ratones hembra CF1(30±3g)fueron agrupados en:1)GRUPOCONTROL (GC)(n=18): soluciónfisiológica (SF) intraperitoneal(ip) (300µL;días:0,2) postcirugíasimulada; 2)GRUPO ANÉMICO(GA) (n=18): FHZ ip (60mg/Kg/300mL;días:0,2) postcirugíasimulada;3)GRUPO ESPLENEC-TOMIZADO NO ANÉMICO(GENA)(n=18): SF ip postesplenectomía

(300mL;días:0,2); 4) GRUPO ES-PLENECTOMIZADO ANÉMICO(GEA)(n=18): FHZ ip (60mg/Kg/300mL;días:0,2) postesplenecto-mía. Sangre venosa: cada 2 díashasta el día 10 (n=3). Paráme-tros evaluados: Hb, HCT, reticu-locitos y cuerpos de Heinz. Laesplenectomía se realizó bajoanestesia. Los tejidos fueron fi-jados con Bouin y Formol 10% yprocesados para Hematoxilina-Eosina. Islotes eritropoyéticos(IE) semicuantificados por unescore preestablecido. Resulta-dos: Los grupos anémicos, con ysin bazo, mostraron hemólisisfranca el día 4. La recuperaciónde la anemia fue el día 6 en el GAy el día 10 en el GEA. Reticuloci-tosis máxima: día 8 en el GEA ydía 6 en el GA. Cuerpos de Heinz:elevados hasta el día 6 en GA yhasta el día 8 en GEA. Se obser-varon abundantes IE en hígadoy en menor grado en riñón. Con-

clusiones: La recuperación eri-tropoyética en ratones esplenec-tomizados fue asumida princi-palmente por el hígado. La res-tauración tardía evidenció queel bazo es el órgano que compen-sa con mayor eficiencia la crisishemolítica en esta cepa de rato-nes.

Palabras claves: eritropoye-sis, anemia, esplenectomía, hí-gado, riñón.

ABSTRACT

Introduction: The spleen ofthe adult mouse takes part inthe recovery of erythron becauseits stroma provides a micro-en-vironment that is adequate forprogenitor proliferation andmaturing. Objective: To assess,by means of morphological stu-dies, the degree of hepatic andrenal erythropoiesis in splenec-tomized mice in response tophenylhydrazine (PHZ)-inducedhemolysis. Materials and Me-thods: Female mice CF1(30±3g)were grouped into: 1) CONTROLGROUP (CG) (n=18): intraperito-neal (ip) physiological solution(PS) (300 µL; days: 0,2) post


simulated surgery; 2) ANEMICGROUP (AG) (n=18): ip PHZ (60mg / Kg / 300mL; days: 0, 2)post simulated surgery; 3) SPLE-NECTOMIZED NON- ANEMICGROUP (SNAG) (n=18): ip PS post-splenectomy (300mL; days: 0,2); 4) SPLENECTOMIZED ANE-MIC GROUP (SAG) (n=18): ip PHZ(60 mg / Kg / 300 mL; days: 0, 2)post-splenectomy. Venous blood:every 2 days until day 10 (n=3).Parameters assessed: Hb, HCT,reticulocytes, and Heinz bodies.The splenectomy was performedunder anesthesia. Tissues werefixed using Bouin and 10% For-malin and processed for Hema-toxilin-Eosin. Erythropoietic Is-lands (EI) were semi-quantifiedby a pre-established score. Re-sults: Anemic groups, with andwithout the spleen, showed mar-ked hemolysis on day 4. Anemiarecovery took place on day 6 inthe AG and on day 10 in theSAG. Maximum Reticulocytosis:day 8 in the SAG and day 6 in theAG. Heinz Bodies were high un-til day 6 in AG and until day 8 inSAG. Abundant EI were obser-ved in the liver and in a smallerdegree in the kidney. Conclu-sions: Erythropoietic recoveryin splenectomized mice wasmainly assumed by the liver.Late restoration showed that thespleen is the organ that mostefficiently compensates the he-molytic crisis in this mice strain.

Key words: erythropoiesis,anemia, splenectomy, liver, kid-ney.

INTRODUCCIÓN

El bazo es un órgano alta-mente vascularizado que pre-senta gran variabilidad estruc-tural y funcional entre especies(1). En animales adultos sus fun-

ciones primarias incluyen he-mopoyesis, con estímulo apro-piado, eritrofagocitosis, reservo-rio de sangre e inmunomodula-ción (2,3).

La maduración del sistemahemopoyético murino consisteen una sucesión de procesosprogramados donde las célulasprecursoras migran desde sitiosembrionarios, como el saco vite-lino, hasta el hígado fetal parafinalmente anidar en la médulaósea (4,5). El bazo de ratón man-tiene su función hemopoyéticaen la vida adulta aunque su rolestá limitado principalmente ala eritropoyesis y a la megacario-citopoyesis (6-9). La eritropoye-sis esplénica se manifiesta cla-ramente frente a la disminucióndel aporte de oxígeno tisular oflebotomía, indicando que el es-troma esplénico aporta un mi-croentorno adecuado donde lascélulas madres eritropoyéticasanidan, proliferan y maduran(9). Estudios previos han de-mostrado claramente la capaci-dad esplénica de sostener a lar-go plazo la reconstitución deltejido eritropoyético irradiado (6).

El rol eritropoyético del bazode mamífero se manifiesta espe-cialmente en situaciones de grandemanda como ocurre en la cri-sis hemolítica aguda inducidapor drogas (10-12). Estudiosclásicos de hematología experi-mental demostraron que la mi-gración de células precursoraseritroides medulares hacia elbazo es el principal mecanismoque determina la eritropoyesisesplénica y le otorgaron a esteórgano un rol modulatorio sobrela actividad medular (13,14).

Los primeros estudios de in-ducción de anemia y reticuloci-tosis en animales de laboratoriose realizaron usando fenilhidra-

zina (FHZ) (15). La acción de estehemotóxico clásico está relacio-nada con el estrés oxidativo eri-trocitario. La FHZ produce unaacentuada oxidación de la oxi-hemoglobina a metahemoglobi-na con posterior desnaturaliza-ción de la proteína intraeritroci-taria y producción de cuerpos deHeinz lo que afecta la integridadde la membrana celular(11,15,16). En adición a sus efec-tos oxidantes sobre la hemoglo-bina, la FHZ genera un severoestrés oxidativo produciendoperoxidación lipídica, alteraciónde proteínas del citoesqueleto,depleción de sistemas enzimáti-cos y no enzimáticos, reducciónde la deformabilidad de la mem-brana celular y activación delsistema inmune (17-19). La FHZse une a la proteína banda 3 o«antígeno senescente» originan-do la unión de anticuerpos autó-logos circulantes. El reconoci-miento de este complejo Ag/Acpor macrófagos origina intensafagocitosis esplénica y hepática(11,15,19).

La sumatoria de estos proce-sos conduce a lisis celular (15).Sin embargo, la lisis intravascu-lar es un contribuyente menoren el mecanismo de hemólisisinducido por fenilhidrazina, sien-do la hemólisis extravascular elmecanismo principal de remo-ción de eritrocitos dañados poresta droga hemolítica (17). Estosugiere que ambos mecanismosde injuria hemolítica coexisti-rían en la anemia severa condiferente grado de contribución(17).

Se ha descripto que múltiplesórganos contribuyen en formacoordinada a mantener el siste-ma hemopoyético en estados degran demanda (4). El hígado re-cupera su función hemopoyéti-


ca en la etapa postnatal aunqueno se ha aclarado totalmente sugrado de participación en pre-sencia y ausencia de bazo (4). Noexisten evidencias hasta el pre-sente sobre la contribución eri-tropoyética renal en estados deintensa demanda en ausenciadel bazo (20).

El propósito de este trabajofue evaluar por estudios morfo-lógicos y hematológicos el gradode compromiso eritropoyéticohepático y renal en respuesta ala anemia aguda en ratones es-plenectomizados.

MATERIALES Y METODOS

AnimalesSe utilizaron ratones hembra

CF1 (30 ± 3 g) provistos por elBioterio de la Universidad Na-cional del Sur. Los animales tu-vieron acceso libre a agua y ali-mento, control diario del peso,respetando un ciclo de luz/os-curidad de 12 horas, en unahabitación con temperatura yhumedad regulada. Los procedi-mientos estuvieron acordes conla «Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals» (21).

Diseño experimentalLos animales fueron dividi-

dos en cuatro grupos: 1) GrupoControl (GC) (n=18) dosis intra-peritoneales de solución fisioló-gica (SF) los días 0 y 2 del proto-colo, luego de la cirugía simula-da; 2) Grupo Anémico (GA) (n=18)dosis intraperitoneales de fenil-hidrazina (Sigma Chemical Co,USA) 60 mg/kg de peso corporalen 0,5 mL de SF los días 0 y 2 delprotocolo luego de la cirugía si-mulada; 3) Grupo Esplenectomi-zado no Anémico (GENA) (n=18)dosis intraperitoneales de SF losdías 0 y 2 del protocolo luego dela esplenectomía; 4) Grupo Es-

plenectomizado Anémico (GEA)(n=18) dosis intraperitoneales deFHZ, 60 mg/kg de peso corporalen 0,5 mL de SF los días 0 y 2 delprotocolo luego de la esplenecto-mía.

Preparación de Fenilhidrazi-na

La solución de fenilhidrazinafue preparada en buffer Fosfatode Potasio 0,1 M a pH 7,4. Lasolución estéril fue filtrada an-tes de su uso y fue administradapor vía intraperitoneal a unaconcentración de 60 mg/kg depeso corporal.

Procedimientos quirúrgicosLa extracción del bazo y la

cirugía simulada se realizarondentro de los 7 días previos a lainducción de anemia hemolíti-ca. Los ratones fueron aneste-siados con una solución de keta-mina (Ketafineâ Brouwer) (3 mg/mL/0,7 mL) y xilacina en solu-ción salina estéril (Xylacinaâ Al-fasan) (1 mg/mL). Luego de ra-zurar el cuadrante izquierdo delabdomen se realizó una peque-ña incisión en la piel del flancoizquierdo y se procedió a abrir elperitoneo. Para la esplenecto-mía se cauterizaron los vasosesplénicos y se removió el bazo.Las incisiones se cerraron conhilo quirúrgico. A los lotes decirugía simulada, se les abrió ycerró el peritoneo sin remover elbazo.

Estudios HematológicosSe obtuvieron muestras de

sangre venosa del seno retroor-bital, previa anestesia, utilizan-do capilares heparinizados. Lasextracciones sanguíneas se rea-lizaron cada dos días hasta el día10 del protocolo experimental.La instauración y recuperaciónde la anemia se evaluaron porparámetros hematológicos con-vencionales: Hb, HCT, recuento

de reticulocitos, cuerpos de Heinzy Fórmula Leucocitaria. Los ex-tendidos sanguíneos fueron co-loreados con May Grünwald-Gie-msa. El recuento de reticuloci-tos y de cuerpos de Heinz serealizó por coloración supravital(Azul Brillante de Cresilo) y losresultados se expresaron en por-centaje de células/1000 células.

Estudios MorfológicosLos tejidos hepático y renal

fueron removidos bajo condicio-nes estériles cada dos días hastael día 10 del protocolo experi-mental. Los tejidos disecados sefijaron con Formol 10% y Bouin.Luego de procedimientos de ru-tina, los tejidos se embebieronen parafina y se obtuvieron cor-tes de 5 mm que se colorearoncon Hematoxilina-Eosina. Losislotes celulares característicosde eritropoyesis activa fueronsemicuantificados usando unescore preestablecido que esti-ma islotes eritropoyéticos (IE) enhígado cada 5 campos x 100aumentos y cada 10 campos x100 aumentos en riñón. Se esta-blecieron dos escores para cadatejido: Hígado: a)0-5: +; b)6-15:++; c) 16-50: +++; d) 51-100: ++++y e) 101-150: +++++. Riñón: a) 0-5: +; b) 6-12:++; c) 13-19: +++;d)>20: ++++.

Análisis EstadísticoLos resultados obtenidos se

expresaron como la media arit-mética ± el error estándar de lamedia. Las diferencias estadísti-cas entre grupos tratados y elcontrol se determinaron por elanálisis de varianza de una vía(ANOVA), luego de realizar laprueba de Bartlett para estable-cer la homogeneidad de las va-rianzas. Cuando se detectarondiferencias significativas, se rea-lizó el test de comparacionesmúltiples de Dunnett. El nivel


de significancia se fijó en p<0,05.

RESULTADOS

Estudios HematológicosLos valores de HCT y Hb del

grupo anémico y del grupo es-plenectomizado anémico dismi-nuyeron progresivamente a par-tir del día 2 presentando hemó-lisis aguda el día 4 (HCT: 32,0%± 0,71; Hb: 8,8 g/dL ± 0,18 yHCT: 30% ± 0,71; Hb: 8,5 g/dL ±0,03, respectivamente); mientrasque el Grupo Control y GrupoEsplenectomizado no Anémicono presentaron variaciones du-rante la experiencia (Figura 1).La recuperación de la anemia en

el Grupo Anémico con bazo seobservó el día 6: HCT: 42,1%±1,41; Hb: 11,81 g/dL ± 1,37. Enel Grupo Anémico sin Bazo, larecuperación ocurrió el día 10,donde se observaron valores deHCT de 46,9% ± 0,71 y de Hb de13,0 g/dL ± 0,23.

El pico máximo de reticuloci-tos en el GEA se observó el día 8(57% ± 10) y fue consistente conla respuesta eritropoyética tar-día respecto al GA, (58% ± 15,día 6) (Figura 1).

Tanto en el GA como en elGEA, a partir del día 2 aumenta-ron significativamente los cuer-pos de Heinz, siendo 96% ± 1,41y 96,5% ± 2,12, respectivamente

y continuaron elevados hasta eldía 6 en el GA (27,5% ± 10,6) yhasta el día 8 en GEA (30% ± 5)(Figura 1).

En el Grupo Esplenectomiza-do Anémico fue evidente la celu-laridad atípica, con presencia denumerosos Cuerpos de Howell-Jolly, Sombras de Gumphrecht,eritrocitos con punteado basófi-lo, anisocitosis y poiquilocitosis(Figura 2 A, B, C, D).

Estudios HistopatológicosNo se observaron variaciones

significativas en el peso de losórganos estudiados a lo largo dela experiencia: a) Hígado GC:5,2% ± 0,10 peso del órgano/peso del animal; b) Hígado GA:

0

20

40

60

80

Ret

icul

ocito

s (%

)

30

35

40

45

50

HC

T (%

)


5,7% ± 0,35; c) Hígado GEA:5,9% ± 0,23; d) Riñón GC: 0,64%± 0,06; e) Riñón GA: 0,69% ±0,09; f) Riñón GEA: 0,71% ±0,04).

En la Tabla 1 se muestra lasemicuantificación de islotescelulares con morfología eritro-poyética en hígado y riñón de losgrupos estudiados. Los resulta-dos obtenidos muestran unaacentuada actividad eritropoyé-tica hepática en el GEA a partirdel día 6 y hasta el día 10, obser-vándose el mayor número deislotes con morfología eritropo-yética el día 8, consistente con larecuperación de la anemia. En elgrupo anémico con bazo, se ob-servó un aumento en la activi-dad eritropoyética hepática eldía 6 aunque de menor gradorespecto al GEA. La localizaciónhepática de islotes con morfolo-gía eritropoyética fue sinusoi-dal, siendo mínima la contribu-ción en el entorno de vasos san-guíneos (Figura 3, A y B).

La examinación histológicarenal no mostró gran compromi-so eritropoyético de este tejidoen la recuperación de la anemiaaguda, siendo similar lo halladoen el GEA y en el GA, respecto aGC y GENA (Figura 4, A y B).

DISCUSIÓN

La habilidad del bazo pararemover de circulación eritroci-tos alterados es ampliamenteaceptada (22). En estados dehemólisis severa como en la ane-mia inducida por fenilhidrazina,el bazo actúa depurando célulassanguíneas sensibilizadas por losefectos oxidantes de la droga(15,16). La remoción de los cuer-pos de Heinz que protuyen de lamembrana de los eritrocitos selleva a cabo por «picoteo espléni-

co» (22).En nuestro modelo de ratón

anémico esplenectomizado, laausencia de la función eritrofa-gocítica del bazo, se evidenciapor el incremento sostenido decelularidad atípica en sangreperiférica con la presencia cuer-pos de Howell Jolly que perma-necen más días en circulación.Algunos autores atribuyen la pre-sencia de cuerpos de Howell Jo-lly a la ausencia de «picoteo es-plénico» (22). Como consecuen-cia, se produciría la transforma-ción de los cuerpos de Heinz enestas estructuras esféricas so-bre la membrana del eritrocito(22).

El punteado basófilo (ARNresidual) podría estar indicandocitotoxicidad ó alteraciones en lamaduración eritrocítica aunquela reticulocitosis es un índiceclaro de eritropoyesis regenera-

tiva (23).La presencia de estas anor-

malidades nucleares y citoplas-máticas en los eritrocitos, po-dría estar indicando una posibletoxicidad medular de la FHZ,aunque existen controversiasrespecto a los efectos citotóxicosde la droga (24). Resulta razona-ble asociar la presencia y persis-tencia de estas anormalidadesen sangre periférica con la au-sencia de la función hemocate-rética esplénica.

Nuestros resultados mostra-ron que la liberación de reticulo-citos a circulación en ratonesesplenectomizados fue tardíarespecto al grupo de ratones conbazo, lo que confirmó el despla-zamiento temporal en la recupe-ración del eritrón del grupo ané-mico esplenectomizado.

En el modelo no esplenecto-mizado la anemia fue compen-


sada principalmente por la acti-vidad hemopoyética esplénica,mientras que en el modelo deanemia con esplenectomía larestauración de la actividad eri-tropoyética fue principalmentehepática.

Los estudios morfológicosmostraron eritropoyesis hepáti-ca en animales esplenectomiza-dos tratados con FHZ evaluadapor abundantes agrupacionescelulares con morfología eritroi-

de en este tejido, siendo mínimala contribución del tejido renal.

Los islotes celulares organi-zados en unidades anatómicasdenominadas islotes eritroblás-ticos representan agrupacionesde células eritroides en diferen-tes estadios de maduración or-ganizados alrededor de un ma-crófago (25). La presencia de es-tas agrupaciones en hígado, con-firma la participación de estetejido en la restauración de la

Figura 2. Cambios en la Celularidad Sanguínea en la Anemia Postesplenectomía. A) Grupo Control (GC): normocromía y normocitosis ; B) Grupo Esplenectomizado Anémico (GEA),día 4: Cuerpos de Howell-Jolly (ß), Sombras de Gumprecht (SG), anisocitosis y poiquilocitosis; C) Grupo Esplenectomizado Anémico (GEA), día 6: destrucción celular, Cuerpos de Howell-Jolly (ß), Sombras de Gumprecht (SG), anisocitosis y poiquilocitosis; D) Grupo Esplenectomizado Anémico (GEA), día 8: Cuerpos de Howell-Jolly (ß) y Sombras de Gumprecht (SG). PMN: polimorfonuclear; L: linfocito.

anemia hemolítica.Hasta el presente, no ha sido

informada en la literatura la pre-sencia de islotes eritropoyéticosen el riñón observada en nuestromodelo experimental Actualmen-te estamos desarrollando estu-dios orientados a confirmar laparticipación del tejido renal enla restauración del eritrón enratones anémicos esplenecto-mizados.

Estudios previos mostraron


la participación del hígado en larestauración del eritrón en laanemia inducida por fenilhidra-zina mediante estudios de cap-tación de hierro y por la presen-cia de precursores eritropoyéti-cos en este tejido extramedular(26,27). Ha sido ampliamentedescripto que tanto la eritropo-yesis esplénica como hepáticadependen de la migración decélulas precursoras hemopoyé-

ticas desde la médula ósea ha-cia tejidos extramedulares don-de anidan, proliferan y madu-ran (28, 29).

Un aporte novedoso de nues-tro estudio fue asociar la pre-sencia de islotes celulares sin-usoidales con la recuperacióneritropoyética tardía evaluadapor parámetros hematológicos ymorfológicos. En efecto, la res-puesta eritropoyética hepática

observada en los ratones esple-nectomizados compensó la ane-mia hemolítica en una etapaposterior a la observada en rato-nes con bazo.

Finalmente, podemos con-cluir que la ausencia del bazo noafectó la recuperación del esta-do de anemia, sólo se modificó elrango temporal de restauracióndel eritrón. Nuestros resultadosmuestran que en ausencia de

Figura 3. Islotes Celulares con Morfología Eritropoyética en Hígado en la Anemia Hemolítica postesplenectomía. A) Hígado Control (GENA); B) Hígado GEA, día 6: se observan abundantes islotes sinusoidales (is) e islotes perivasculares (ip). VS: vaso sanguíneo. Los tejidos se procesaron para H&E según lo descripto en Materiales y Métodos (x 2000).

Figura 4. Islotes Celulares con Morfología Eritropoyética en Riñón en la Anemia Hemolíticapostesplenectomía. A) Riñón Control (GENA); B) Riñón GEA, día 8: se observan escasos islotesperivasculares (ip). VS: vaso sanguíneo. Los tejidos se procesaron para H&E según lo descripto enMateriales y Métodos (x 2000).


bazo la función eritropoyética esasumida principalmente por unórgano extramedular como elhígado. Sin embargo, el tejidohepático no responde tan efi-cientemente al estrés hematoló-gico como el tejido esplénico.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado conel apoyo de la Secretaria Generalde Ciencia y Tecnología de laUniversidad Nacional del Sur(PGI-24/B116) y de la AgenciaNacional para la Promoción Cien-tífica y Tecnológica (FONCYT).Tania Veuthey y Cecilia D´Annason Becarias del Consejo Nacio-nal de Investigaciones Científi-cas y Técnicas (CONICET).

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