trabajo tecnicas histoquimicas

Tcnicas Histoqumicas - Tincin

Mtodos morfolgicos del Sistema Nervioso Mster de Neurociencias INCYL Febrero 2012

Daniel ncera Fernndez [email protected]

Tcnicas Histolgicas

En el siguiente esquema se muestran los mtodos y tcnicas comnmente empleados para el procesamiento de los tejidos: obtencin del tejido, fijacin, inclusin, corte, tincin o contraste y observacin. En el presente trabajo por motivos de espacio voy a desarrollar el proceso de tincin.

Figura 1. Mtodos y tcnicas comnmente utilizados en el procesamiento de los tejidos

Podemos dividir el conjunto de tcnicas histolgicas en cuatro categoras:

a) Tinciones generales. Aquellas que estn basadas en colorantes, sustancias mediante las cuales conseguimos colorear los tejidos. Generalmente los colorantes son hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas molculas presentes en los tejidos gracias a unidades qumicas. Se utilizan normalmente para teir a las clulas y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio ptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido. Los colorantes son molculas que poseen tres componentes


importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromoforo, y otro que posibilita la unin a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molcula se denomina cromgeno. Segn la naturaleza qumica del cromoforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinnicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derivados del xanteno y derivados de las talocianinas. Segn la naturaleza qumica del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Clasificacin de los colorantes

Ponen de manifiesto Ejemplos Imagen

BSICOS Ncleo y ARN Tionina, Safranina,

Azul de toluidina,

Azul de metileno o

Hematoxilina

Tionina

CIDOS Citoplasma celular y el

colgeno de la matriz

extracelular

Ucsina cida,

Verde rpido,

Naranja G o la

Cosina

Uesina cida

NEUTROS Puede teir tanto las

partes bsicas como las

cidas de los tejidos

El eosinato de

azul de metileno

Azul de metileno

INDIFERENTES No se unen a

elementos de los tejidos

por afinidad qumica

sino porque se

disuelven en ellos

Colorante sudan

Colorante Sudan

Figura 2. Clasificacin de los colorantes


b) Histoqumica. Aquellas tcnicas de tincin que utilizan una serie de mtodos para observar reacciones qumicas y/o biolgicas en ciertas sustancias o la actividad de enzimas en muestras histolgicas para despus observarlas con colorantes.

c) Lectinas. Son que son capaces de reconocer glcidos que forman parte de polisacridos. Tienen una gran especificidad y se usan para determinar el tipo de glcido que aparece en las glucoprotenas de la membrana plasmtica o de la matriz extracelular de los diferentes tejidos.

d) Inmunocitoqumica. Son tcnicas histolgicas que consisten en la alta especificidad de unin de los anticuerpos a los antgenos contra los que se produjeron. Estos antgenos pueden ser cualquier molcula tisular que, purificada e inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos aadidos a una seccin de tejido reconocern y se unirn especficamente a dicha molcula.

e) Hibridacin. Aquellas tcnicas basadas en la unin complementaria de las bases de cidos nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que dos cadenas complementarias de cidos nucleicos se unan entre s de forma muy especfica, es decir, hibriden. As, se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN con una secuencia de bases determinada que llevan una molcula unida para poder detectarlas.

Tinciones generales

Una de las tinciones mas comnmente usada en histologa es la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante bsico y otro cido para teir de diferente color a las estructuras cidas y bsicas de la clula. Antes de proceder a la tincin, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles (ver figura 3).


Los tiempos dependen del grosor de los cortes y de la concentracin de los colorantes. El desparafinado permite eliminar la parafina. El paso por agua de grifo, tpico de la hematoxilena se denomina diferenciacin. Las sales del agua permiten obtener una coloracin mas violcea, en vez de prpura. La deshidratacin final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Tras el montado y secado, las secciones se puede observar con el microscopio ptico.

Figura 3. Pasos que se siguen tras un tincin general de hematoxilina-eosina

Histoqumica

El objetivo de la histoqumica es mostrar molculas presentes en una seccin histolgica y estudiar su distribucin tisular in situ. Durante el procesamiento del tejido previo a la reaccin histoqumica, como la fijacin o la inclusin, hay que evitar daar a la molcula que queremos detectar porque de otra manera resultara en falsos negativos, es decir, no tener tincin cuando en realidad la molcula de inters est presente en el tejido, aunque deteriorada. Para detectar la molcula que queremos mostrar, a veces, es necesario realizar pasos previos a la reaccin histoqumica, por ejemplo usando un fijador adecuado, ya que de otra manera no reaccionar con los reactivos qumicos. Podemos dividir las tcnicas histoqumicas en: reacciones qumicas e histoqumica enzimtica.


Las reacciones qumicas consisten en la modificacin qumica de molculas del tejido para poder colorearlas. Existen tcnicas histoqumicas para detectar glcidos, protenas y nucletidos. La tcnica histoqumica mas empleada es la reaccin de PAS (Periodic Acid Schi). Se utiliza para la deteccin de hidratos de carbono, libres o conjugados, en los tejidos cuando estn en cantidades relativamente grandes. Una de las ventajas de la tincin histoqumica PAS es su capacidad de discriminacin de tipos de glcidos con pequeas modificaciones de la tcnica (ver figura 4).

La histoqumica enzimtica o histoenzimologa se fundamenta en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijacin. Estos enzimas y las clulas que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reaccin enzimtica que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son especficos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso, donde se localiza el enzima.

Figura 4: Tincin con hematoxilina-eosina (izquierda) y PAS-hematoxilina (derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se observan clulas

caliciformes teidas de rosado con la tcnica de PAS por su alto contenido en

mucopolisacridos, mientras que en una tincin general aparecen transparentes.

Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etctera. Cuando queremos detectar una actividad enzimtica no debemos incluir el material para obtener secciones puesto que la deshidratacin y la temperatura elevada pueden daar la conformacin de la enzima. Por ello estas tcnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelacin o con el vibratomo.


BIBLIOGRAFA

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