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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES
COMO EL ORIGEN DE LA BIOSÍNTESIS DE
SAXITOXINA EN Gymnodinium catenatum
(DINOPHYCEAE)
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS MARINAS
PRESENTA
ARMANDO MENDOZA FLORES
LA PAZ, B. C. S., DICIEMBRE 2018
I
II
III
AGRADECIMIENTOS
A mis directores de tesis Dr. Ignacio Leyva Valencia y Dra. Christine J. Band Schmidt.
A los miembros de mi comité Dra. Bárbara González Acosta, Dra. Claudia E.
Hernández Guerrero y Dra. Clara E. Galindo Sánchez.
Al CONACyT por la beca otorgada 268184, IPN – BEIFI. A los proyectos CONACyT
178227, 248468, FORDECyT 260040, y proyecto SIP – 20180662.
A la RedFAN por los apoyos para realizar las estancias de investigación y la asistencia
a eventos académicos, a SCOR por el apoyo para participar en la ICHA 2016
A los miembros del laboratorio de genómica funcional del CICESE, Ensenada, en
específico a la Dra. Clara Galindo y al Dr. Edgar López Landavery, por el apoyo en el
diseño e implementación del PCR en Tiempo Real.
Al Dr. Francisco E. Hernández Sandoval del laboratorio de Algas Nocivas del CIBNOR
y M. en C. Dulce Ramírez, por realizar los análisis cromatográficos.
Al Dr. Allan Cembella por la invitación a la estancia de investigación en AWI, Alemania.
Al Dr. Uwe John y Dr. Gurjeet S. Kohli por el apoyo en la obtención del transcriptoma
de G. catenatum.
IV
INDICE
INDICE ....................................................................................................................... IV
GLOSARIO ................................................................................................................ VII
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. IX
LISTA DE TABLAS ...................................................................................................... X
RESUMEN ................................................................................................................ XII
ABSTRACT .............................................................................................................. XIII
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES ................................................................................................... 3
2. 1. Toxinas paralizantes ........................................................................................ 5
2. 2. Toxinas paralizantes y Gymnodinium catenatum ............................................ 9
2. 3. Biosíntesis de saxitoxina ................................................................................ 10
2. 4. Genes asociados a la biosíntesis de saxitoxina ............................................. 13
2. 5. Transferencia Horizontal de Genes en dinoflagelados .................................. 17
2. 6. Historia evolutiva de Gymnodinium catenatum .............................................. 19
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 22
4. HIPÓTESIS ........................................................................................................... 23
5. OBJETIVO ............................................................................................................. 23
5. 1. OBJETIVOS PARTICULARES ...................................................................... 23
6. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 24
6. 1. Cepas ............................................................................................................ 24
6. 2. Condiciones de cultivo ................................................................................... 25
6. 3. Extracción de ADN, PCR, secuenciación y análisis filogenéticos. ................. 26
6. 3. 1. Extracción de ADN ................................................................................. 26
6. 3. 2. PCR y secuenciación ............................................................................. 27
V
6. 3. 3. Análisis filogenéticos .............................................................................. 28
6. 4. Cuantificación del número de copias de los dominios sxtA1 y sxtA4, y contenido
de toxinas en Gymnodinium catenatum ................................................................. 30
6. 4. 1. Curva de crecimiento ............................................................................. 30
6. 4. 2. Cosechas de la cepa LC62 .................................................................... 31
6. 4. 3. Extracción de ADN, extracción y cuantificación de toxinas .................... 31
6. 4. 5. Cuantificación del número de copias mediante PCR - tiempo real ........ 32
6. 5. Construcción del transcriptoma de Gymnodinium catenatum y determinación
de la familia de genes para la biosíntesis de saxitoxina ........................................ 34
6. 5. 1. Extracción de ARN ................................................................................. 34
6. 5. 2. Identificación de genes candidatos involucrados en la biosíntesis de
saxitoxina ........................................................................................................... 35
7. RESULTADOS ...................................................................................................... 36
7. 1. Análisis filogenéticos...................................................................................... 36
7. 1. 1. Análisis filogenético dominio sxtA1 ........................................................ 36
7. 1. 2. Análisis filogenético dominio sxtA4 ........................................................ 37
7. 1. 3. Análisis filogenético del gen sxtG ........................................................... 40
7. 2. Cuantificación de toxinas y número de copias de los dominios sxtA1 y sxtA4
............................................................................................................................... 41
7. 2. 1. Curva de crecimiento ............................................................................. 41
7. 2. 2. Perfil y concentración de toxinas ............................................................ 41
7. 2. 3. PCR en tiempo real y número de copias de genes de los dominios sxtA1 y
sxtA4. ................................................................................................................. 43
7. 3. Relación entre el número de copias y la producción de toxinas .................... 47
7. 4. Identificación de los genes candidatos para la biosíntesis de saxitoxina en
Gymnodinium catenatum a partir del transcriptoma .............................................. 49
VI
8. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 51
8. 1. Análisis filogenético y evolución de los genes sxtA y sxtG en los dinoflagelados
............................................................................................................................... 51
8. 2. Perfil y concentración de toxinas paralizantes en G. catenatum .................... 57
8. 3. Relación entre el contenido de toxinas paralizantes y el número de copias de
los dominios sxtA1 y sxtA4 en Gymnodinium catenatum. ..................................... 59
8. 4. Identificación de los genes candidatos para la biosíntesis de saxitoxina a partir
del transcriptoma de Gymnodinium catenatum. ..................................................... 63
9. CONCLUSIONES .................................................................................................. 66
10. PERSPECTIVAS DE ESTUDIO .......................................................................... 67
REFERENCIAS ......................................................................................................... 69
VII
GLOSARIO
Alcaloide: metabolitos secundarios nitrogenados de las plantas sintetizados
generalmente, a partir de aminoácidos, que tienen en común su hidrosolubilidad a pH
ácido y su solubilidad en solventes orgánicos a pH alcalino.
Clado: agrupación que contiene un antepasado común y todos los descendientes
(vivos y extintos) de ese antepasado.
Contig: serie de secuencias superpuestas de ADN utilizadas para hacer un mapa
físico que reconstruye la secuencia original de ADN de un cromosoma o de una región
de un cromosoma.
Cromatografía: método físico de separación en que los componentes que se han de
separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase
estacionaria), mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.
Divergencia evolutiva: acumulación de diferencias entre poblaciones de especies
que están estrechamente relacionadas, que lleva a la especiación.
Filogenia: origen, formación y desarrollo evolutivo general de una especie.
Gen: unidad funcional y física de la herencia. Los genes son segmentos de ADN; la
mayoría de los genes contienen información para elaborar una proteína específica.
Homólogo (gen): en genética y biología molecular la homología de secuencias se
refiere a la situación en que las secuencias de dos o más proteínas o ácidos nucleicos
son similares entre si debido a que presentan un mismo origen evolutivo.
Monofilético: en filogenia, es un grupo en el cual todos los organismos incluidos en él
han evolucionado a partir de una población ancestral común, y todos los descendientes
de ese ancestro están incluidos en el grupo.
Ortólogo: genes que son copias divergentes de un mismo gen o las secuencias que
son similares en diferentes especies por haberse originado en un ancestro en común
VIII
Parálogo: secuencias o genes surgidos por duplicación para ocupar distintas
posiciones en el mismo genoma, y no dependen de la especiación, sino que se han
formado en paralelo y al margen.
Polifilético: aquel grupo que no incluye al antepasado en común más reciente de
todos sus miembros; está constituido por la unión artificial de ramas dispersas del árbol
evolutivo.
Pseudogen: secuencia de ADN que se asemeja a un gen, que se ha inactivado (que
no se expresa) en el curso de la evolución al producirse mutaciones en su secuencia.
Un pseudogen comparte la historia evolutiva de un gen funcional y puede
proporcionarnos una idea de su ascendencia común.
Toxina: sustancia venenosa producida por la actividad metabólica de ciertos
organismos.
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura molecular de la saxitoxina ........................................................... 6
Figura 2. Ruta hipotética de la biosíntesis de saxitoxina propuesta por Shimizu 1993,
en donde se representan los diez pasos para la biosíntesis de la saxitoxina. Tomado
de Kellmann & Neilan (2007)..................................................................................... 12
Figura 3. Ruta metabólica putativa para la biosíntesis de saxitoxina en cianobacterias
y los genes involucrados. Los genes identificados en dinoflagelados y cianobacterias
(círculos negros), los genes identificados solamente en cianobacterias (círculos
punteados). Tomado de Zhang et al. (2014). ............................................................ 15
Figura 4. Mecanismos de la transferencia horizontal de genes. Tomado de ............ 18
Figura 5. Tipos de tabulación de los dinoflagelados. Tomado de Fensome et al. (1999).
.................................................................................................................................. 21
Figura 6. Localidades de aislamiento de las cepas de Gymnodinium catenatum en el
Golfo de California y Pacífico Mexicano. ................................................................... 25
Figura 7. Árbol filogenético del dominio sxtA1 a partir de secuencias de aminoácidos
de dinoflagelados y cianobacterias. El árbol fue reconstruido a partir de la Inferencia
Bayesiana, los valores en los nodos internos representan las probabilidades
posteriores/Bootstrap. ............................................................................................... 37
Figura 8. A) Árbol filogenético del dominio sxtA4 de cianobacterias y dinoflagelados,
los valores del nodo indican las probabilidades posteriores y Bootstrap. B) Árbol
filogenético del dominio sxtA4 de dinoflagelados, el árbol esta reconstruido por
Inferencia Bayesiana. Las marcas de los nodos interiores indican los valores
probabilidades posteriores/Bootstrap. ....................................................................... 39
Figura 9. Árbol filogenético del gen sxtG a partir de secuencias de aminoácidos de
dinoflagelados, cianobacterias y bacterias. El árbol fue reconstruido a partir de Máxima
Verosimilitud, los valores en los nodos internos representan los valores de Bootstrap.
.................................................................................................................................. 40
Figura 10. Curva de crecimiento de la cepa LC62 de G. catenatum en medio GSe,
12:12 horas luz:oscuridad, 24ºC temperatura y 34 de salinidad. .............................. 41
Figura 11. Perfil de toxinas (pmol cel-1) de la cepa LC62 de G. catenatum durante las
diferentes fases del ciclo de cultivo. .......................................................................... 42
X
Figura 12. Concentración total de toxinas paralizantes (pmol cel-1) durante las fases
del ciclo de cultivo de la cepa LC62 de G. catenatum. .............................................. 43
Figura 13. Curva de fusión del PCR en tiempo real del dominio sxtA1. .................... 44
Figura 14. Curva de fusión del PCR en tiempo real del dominio sxtA4. .................... 44
Figura 15. Curva estándar para el dominio sxtA1. Los valores de ciclo umbral (Ct) para
cada una de las diluciones expresadas en Log10. ..................................................... 46
Figura 16. Curva estándar para el dominio sxtA4. Valores del ciclo umbral (Ct) para
cada una de las diluciones expresadas en Log10. ..................................................... 46
Figura 17. Promedio del número de copias por célula de los dominios sxtA1 y sxtA4 en
G. catenatum. Líneas verticales desviación estándar. .............................................. 47
Figura 18. Relación entre el número de copias cel-1 (barras) del dominio sxtA1 y la
producción de toxinas pmol cel-1 (línea punteada con rombos), para cada una de las
fases del ciclo de cultivo de G. catenatum. ............................................................... 48
Figura 19. Relación entre el número de copias cel-1 (barras) del dominio sxtA4 y la
producción de toxinas pmol cel-1 (línea punteada con rombos), para cada una de las
fases del ciclo de cultivo de G. catenatum. ............................................................... 49
LISTA DE TABLAS
Tabla I. Principales tipos de intoxicaciones, sus síntomas y algunas especies
responsables (Hernández-Orozco & Gárate-Lizárraga, 2006). ................................... 4
Tabla II. Análogos de toxinas paralizantes producidas por dinoflagelados marinos
(Cusick & Sayler, 2013; Durán-Riveroll et al., 2013). .................................................. 7
Tabla III. Claves de las cepas, zonas y año de recolección y persona que aisló las
cepas ......................................................................................................................... 24
Tabla IV. Lista de oligonucleótidos empleados para la amplificación de cada dominio
en este estudio. Nombre, secuencia y referencia. ..................................................... 27
Tabla VI. Oligonucleótidos diseñados para la prueba de PCR en tiempo real para G.
catenatum.................................................................................................................. 33
XI
Tabla VII. Ciclo umbral (Ct) del PCR en tiempo real y número de copias cel-1 de los
dominios sxtA1 y sxtA4 durante cada una de las fases del ciclo de cultivo de G.
catenatum.................................................................................................................. 45
Tabla VIII. Genes candidatos involucrados en la biosíntesis de saxitoxina presentes en
G.catenatum obtenidos a partir del transcriptoma. Número de contigs, top score/valor
e del contig mejor valorado, proteína y especie identificada a partir de las búsquedas
de BLAST y el dominio conservado para cada gen identificado. ............................... 50
Tabla IX. Cuadro comparativo de la identificación de los genes para la biosíntesis de
saxitoxina descritos en las diferentes especies de dinoflagelados (Stüken et al., 2011;
Hackett et al., 2012; Zhang et al., 2014). .................................................................. 63
XII
RESUMEN
Se ha propuesto que los genes para la biosíntesis de saxitoxina tuvieron un origen
bacteriano y fueron adquiridos en los dinoflagelados por una transferencia horizontal
de genes (THG). Se tenía la hipótesis de que hubo una THG de dinoflagelado –
dinoflagelado entre Alexandrium y Gymnodinium. Sin embargo, dada la historia
evolutiva de los dinoflagelados parece que esta transferencia entre dinoflagelados no
se llevó a cabo, sino que tal vez se haya dado una THG en una etapa temprana en la
historia evolutiva de los dinoflagelados. Este estudio busca determinar cómo fue la
adquisición de los genes para la biosíntesis de saxitoxina en Gymnodinium catenatum.
Se hicieron análisis filogenéticos de los genes sxtA (dominios sxtA1 y sxtA4) y sxtG
mediante máxima verosimilitud e inferencia bayesiana. Se cuantificaron el número de
copias de los dominios sxtA1 y sxtA4 en distintas etapas de ciclo de cultivo por PCR
tiempo real y se compararon con el contenido de toxinas de la cepa LC62 de G.
catenatum. Se obtuvo el transcriptoma para poder determinar la familia de genes que
pudieran estar involucrados en la biosíntesis de saxitoxina en G. catenatum. Los
árboles filogenéticos de ambos genes muestran que G. catenatum siempre forma un
clado separado de las especies de Alexandrium. Con el dominio sxtA1 se identificaron
secuencias homólogas en dinoflagelados que no producen saxtitoxina. Las secuencias
del gen sxtG que codifica para amidinotransferasa en dinoflagelados productores de
saxitoxina estuvieron más cercanos a secuencias de bacterias. El número de copias
del dominio sxtA4 fue mayor que el número de copias del dominio sxtA1, además la
concentración de toxinas durante las distintas fases de cultivo tuvo una relación con el
número de copias de sxtA4, a diferencia del dominio sxtA1 en donde no se observó
una relación entre el número de copias y la concentración de toxinas. Se identificaron
12 posibles genes para la biosíntesis de saxitoxina, siete involucrados directamente
en su biosíntesis, dos para la formación de análogos, un gen regulador y dos genes
transportadores. La THG entre dinoflagelados no se llevó a cabo, sino que la
adquisición de los genes para la biosíntesis de saxitoxina se dio durante una etapa
temprana en la evolución de los dinoflagelados, posiblemente en la radiación del
mesozoico. De acuerdo a la familia de genes identificados se podría establecer que la
biosíntesis de la saxitoxina es igual entre las diferentes especies de dinoflagelados.
XIII
ABSTRACT
It has been proposed that the genes for saxitoxin biosynthesis had a bacterial origin
and were acquired in dinoflagellates by horizontal gene transfer (HGT). It was
hypothesized that there was a HGT of dinoflagellate – dinoflagellate between
Alexandrium and Gymnodinium. However, according to the evolutive history of the
dinoflagellates, it seems that the HGT between dinoflagellates was not carried out, and
there may have been a HGT at an early stage in the dinoflagellates evolutive history.
In this study we determined how the acquisition of the genes for saxitoxin biosynthesis
in Gymnodinium catenatum occurred. Phylogenetic analyses were done for the genes
sxtA (domains sxtA1 and sxtA4) and sxtG with maximum likelihood and Bayesian
inference. The gene copy number of domains sxtA1 and sxtA4 in different growth
stages was calculated, and compared with the toxin content G. catenatum (strain
LC62). Also, the transcriptome was obtained to search the gene families involved in the
saxitoxin biosynthesis. The phylogenetic threes of both genes show that G. catenatum
always forms a separate clade from Alexandrium species. With the domain sxtA1
identical homolog sequences of species that do not produce saxitoxin were found.
Sequences of the gen sxtG which encodes for amidinotrasferase in saxitoxin producing
dinoflagellates were closer to bacteria sequences. The gene copy number of domain
sxtA4 was higher than the gene copy number of the sxtA1 domain, besides there was
a relation between the toxin content and gene copy number of the domain sxtA4; in
contrast to the domain sxtA1 where no relation was found with the toxin content. Twelve
genes for the saxitoxin biosynthesis were identified, seven directly involved in the
biosynthesis, two tailoring genes, one regulator gene, and two transporters. These
results suggest that HGT between dinoflagellates was not carried out, nevertheless the
acquisition of the genes for saxitoxin biosynthesis occurred during an early stage in the
evolution of dinoflagellates, probably during the Mesozoic radiation. According to the
genes family identified, it could be established that saxitoxin biosynthesis in
dinoflagellates is the same between the different species of dinoflagellates.
1
1. INTRODUCCIÓN
Gymnodinium catenatum Graham es un dinoflagelado desnudo, reportado y
descrito por primera vez en el Golfo de California, México en 1939 (Graham, 1943).
Varios años después se reportó su presencia en Argentina en 1961 (Balech, 1964) y
Japón en 1967 (Hada, 1967). Esta especie tiene una distribución desde zonas
subtropicales a tropicales, y en México se ha reportado su presencia a lo largo de la
costa del Pacífico y en la zona sur del Golfo de México (Band-Schmidt et al., 2006;
Licea et al., 2013; Poot-Delgado et al., 2015). Una de sus principales características
es la capacidad de producir toxinas paralizantes y formar florecimientos algales
nocivos (Hallegraeff et al., 2012).
Gymnodinium catenatum tiene una amplia distribución, esta especie se puede
encontrar desde zonas templadas hasta zonas subtropicales en ambos hemisferios
(Hallegraeff et al., 2012; Cembella & Band-Schmidt, 2018). Una de las principales
formas de dispersión probables que ha favorecido una ampliación en su distribución
se debe al transporte mediante el agua de lastre de los barcos (Bolch & de Salas,
2007). Se ha demostrado por medio de estudios genéticos, que el origen de las cepas
de Tasmania proviene de Asia, y que esta especie fue introducida recientemente,
aproximadamente durante la década de los 70, por medio del agua de lastre de los
barcos de carga, ya que de acuerdo con muestras de sedimentos no se han
encontrado quistes de esta especie previo a la década antes mencionada (Bolch &
Reynolds, 2002).
Las principales características morfológicas que distinguen a G. catenatum son
que las células vegetativas pueden formar cadenas de 32 células y en ocasiones hasta
de 64 células. En condiciones desfavorables las cadenas pueden dividirse en cadenas
más cortas o en células individuales. Las células varían en forma y tamaño; pueden
ser sub-esféricas o cuadradas, y con rangos de tamaño de 31 a 65 µm de altura y 27
a 43 µm de ancho en células individuales, y de 23 a 60 µm de altura y de 27 a 43 µm
de ancho en células que forman cadenas, en donde las células terminales de la cadena
tienen un tamaño similar a las células solitarias. Las células contienen numerosos
cloroplastos de color amarillo-verdoso localizados en la periferia, con pirenoides
2
conspicuos. El núcleo se encuentra en el centro. El sulcus es estrecho y profundo y se
extiende desde el epicono hasta el hipocono. El ápice de la célula presenta un poro
apical en forma de herradura. La superficie de la célula se encuentra cubierta por
vesículas anfiesmales en un patrón hexagonal. Cuando existen condiciones
desfavorables G. catenatum puede formar quistes temporales y de resistencia
(Blackburn et al., 1989; Rees & Hallegraeff, 1991).
El género Gymnodinium no es un grupo monofilético, y esto se ha comprobado
tanto con datos morfológicos, así como con secuencias del ADN ribosomal (Rees &
Hallegraeff, 1991). Sin embargo G. catenatum junto con las especies G. nolleri, G.
microreticulatum, G. inusitatum y G. trapeziforme conforma un grupo bien establecido
con relaciones monofiléticas dentro del género Gymnodinium, llamado el grupo de los
microreticulados; cuyo nombre se debe a la característica de los quistes de cada una
de las especies que lo conforman, los cuales van a poseer una microretícula en la
envoltura del quiste. Lo importante de resaltar de este grupo es que G. catenatum es
la única especie que produce toxinas paralizantes, en ninguna de las otras especies
se ha reportado la presencia de saxitoxina o alguno de sus análogos (Ellegaard &
Oshima, 1998; Bolch et al., 1999; Attaran-Fariman et al., 2007; Gu et al., 2013).
El primer reporte de intoxicaciones por toxinas paralizantes que se tiene de un
florecimiento de G. catenatum se dio cuarenta años después de su descripción en
1976 en las costas de España (Estrada et al., 1984), posteriormente se registró otro
florecimiento en las costas de México en 1979, en el que se reportaron intoxicaciones
de humanos asociados a este florecimiento (de la Garza, 1983; Mee et al., 1986).
Desde esos primeros registros de presencia de toxinas paralizantes, se han reportado
en diversas regiones geográficas: Portugal (Franca & Almeida, 1989), Japón (Ikeda et
al., 1989), Tasmania (Hallegraeff & Summer, 1986), registrándose más de 60 reportes
en 23 países hasta el año 2010 (Hallegraef et al., 2012; Cembella & Band-Schmidt,
2018).
Además de G. catenatum, otras especies de dinoflagelados pueden producir
toxinas paralizantes, en las que se incluyen algunas especies del género Alexandrium,
así como la especie Pyrodinium bahamense (Scholin et al., 1995; Blackburn et al.,
3
2001). Estas especies no tienen una relación filogenética con G. catenatum, ya que
este se encuentra dentro del orden de los Gymnodiniales, mientras los otros dos
géneros se encuentran en el orden Gonyaulacales (Daugbjerg et al., 2000).
Se ha propuesto que G. catenatum produce toxinas paralizantes debido a que
adquirió los genes involucrados para su biosíntesis por medio de una transferencia
horizontal de genes entre dinoflagelados, siendo alguna especie del género
Alexandrium la que le transfirió los genes a G. catenatum (Orr et al., 2013). No
obstante, esta hipótesis no ha sido corroborada; por lo que el presente trabajo busca
comprobar esta hipótesis, y así como proponer la posible ruta de la adquisición de los
genes para la biosíntesis de saxitoxina en G. catenatum.
2. ANTECEDENTES
En la naturaleza y especialmente en las zonas costeras y de agua dulce existen
eventos llamados florecimientos algales nocivos (FAN), este término cubre a un grupo
heterogéneo de eventos que comparten dos características: son causados por
microalgas y pueden tener un impacto negativo en las actividades humanas; como
pueden ser, riesgos directos en la salud humana, impactos en organismos acuáticos,
en el turismo, en el uso recreacional de cuerpos acuáticos y daños en el ecosistema
marino (Zingone & Enevoldsen, 2000).
Actualmente se han descrito alrededor de 4000 especies de microalgas
planctónicas, de las cuales cerca de 200 son capaces de producir florecimientos y de
estas aproximadamente 80 especies son nocivas o toxicas, de las cuales la mayoría
son dinoflagelados (Sournia, 1995; Smayda, 1997).
Para que se desarrolle un FAN, deben de estar involucrados diversos factores;
como pueden ser, la disponibilidad de nutrientes, la turbulencia, la disponibilidad de la
luz, las relaciones con otros grupos del plancton, así como las tasas de crecimiento de
los organismos y de las poblaciones (Smayda, 1997). En algunos casos se ha dicho
que la eutrofización por efectos antropogénicos de las zonas costeras favorece el que
4
haya una mayor cantidad de FAN, también actualmente se toma en cuenta los efectos
del cambio climático en la ocurrencia y duración de estos eventos (Anderson et al.,
2002; Sellner et al., 2003).
Los principales grupos de toxinas producidas por FAN de acuerdo con su
estructura química se agrupan en: poliéteres macrocíclicos y lineales, e.g. ácido
okadaico; poliéteres con estructura de escalera, e.g., brevetoxinas y ciguatoxinas;
iminas macrocíclicas, e.g., espirólidos y gymnodiminas; tetrahidropurinas, e.g.,
saxitoxina y análogos; y aminas secundarias toxicas, incluyendo al ácido domoico
(Anderson et al., 2012). De acuerdo con los síntomas que producen se pueden
identificar varios tipos de intoxicaciones (Tabla I) (Sellner et al., 2003).
Tabla I. Principales tipos de intoxicaciones, sus síntomas y algunas especies responsables (Hernández-Orozco & Gárate-Lizárraga, 2006).
Intoxicación Síntomas Especies productoras
Intoxicación paralizante por consumo de mariscos (IPM; PSP)
Sensación de hormigueo, entumecimiento de cara, cuello, manos, náuseas, vómito y muerte por paro respiratorio
Gymnodinium catenatum Alexandrium catenella Alexandrium minutum Pyrodinium bahamense
Intoxicación diarreica por consumo de mariscos (IDM; DSP)
Diarrea, náuseas, vómito y la exposición crónica promueve la formación de tumores en el sistema digestivo
Dinophysis caudata Dinophysis fortii Prorocentrum lima
Intoxicación amnésica por consumo de mariscos (IAM; ASP)
Síntomas gastrointestinales, vómito, diarrea y calambres. Síntomas neurológicos, desorientación, vértigo, confusión y pérdida temporal de la memoria
Pseudo-nitzschia australis Pseudo-nitzschia seriata Psuedo-nitzschia pungens
Intoxicación neurotóxica por consumo de mariscos (INP, NSP)
Escalofríos, dolor de cabeza, debilidad muscular, náuseas, vómito y muerte por paro respiratorio
Karenia brevis
Ciguatera Náuseas, entumecimiento y temblor de las manos y pies, vómito y en casos extremos, muerte por falla respiratoria.
Gambierdiscus toxicus Ostreopsis spp. Coolia spp.
5
2. 1. Toxinas paralizantes
Las toxinas paralizantes son las responsables de causar la intoxicación
paralizante por consumo de mariscos (Paralytic shellfish poisoning, PSP, por sus siglas
en inglés). Se pueden encontrar en ambientes marinos y de agua dulce; en los
ambientes marinos es producida por los dinoflagelados pertenecientes a los géneros
Alexandrium, Pyrodinium y la especie G. catenatum (Oshima et al., 1993; Usup et al.,
1994). En ambientes de agua dulce son producidas por cianobacterias del género
Anabaena, Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Planktothrix y Lyngbya (Sivonen,
1996; Carmichael et al., 1997; Ballot et al., 2010). Estas toxinas son acumuladas
principalmente por moluscos filtradores, que al ser consumidos por los humanos
pueden provocar intoxicaciones. También pueden ser transferidas por algunos
crustáceos; como el caso de algunos cangrejos xántidos (Llewellyn & Endean, 1989;
Arakawa et al., 1994; 1995), y otros organismos bentónicos, como estrellas de mar,
erizos, caracoles y balanos (Silva et al., 2018). También se ha detectado la presencia
de estas toxinas en sardinas (Costa et al., 2010).
Estas toxinas son un grupo de alcaloides neurotóxicos (Weise et al., 2010), las
cuales van a tener como precursor a la saxitoxina (STX), que fue purificada y descrita
por primera vez a partir de tejidos de almejas y mejillones, y reconociendo que era la
responsable de la intoxicación paralizante por consumo de mariscos (Schantz et al.,
1957). Posteriormente al aislamiento de la STX se determinó su estructura, la cual
consiste en tres anillos que se describen como 3,4,6-trialquilo tetrahidropurina. La
posición dos y ocho del anillo purina contiene grupos NH2 que forman las dos mitades
guanidino de la STX (Fig. 1) (Bordner et al., 1975; Schantz et al., 1975).
6
Figura 1. Estructura molecular de la saxitoxina. Tomado de Wiese et al. (2010).
Actualmente se conocen alrededor de 57 análogos de toxinas paralizantes
(Tabla II) producidas tanto por los dinoflagelados marinos, así como por las
cianobacterias de agua dulce (Wiese et al., 2010). Los análogos van a diferir por
variaciones de los grupos funcionales en cuatro posiciones específicas del anillo de
STX, definiendo los diferentes tipos de análogos (Cusick & Sayler, 2013).
Las toxinas paralizantes se pueden dividir en cuatro tipos: carbamoil,
decarbamiol, N-sulfocarbamiol y benzoil, reconocidas principalmente por la identidad
de la cadena lateral R4 (Hall et al., 1990; Negri et al., 2007; Wiese et al., 2010). Las
toxinas paralizantes más comunes son las hidrofílicas, estas pueden ser no sulfatadas,
monosulfatadas, o di-sulfatadas. Además, también existen variantes del análogo
decarbamoil, las cuales incluyen a las decarbamoil-saxitoxinas, decarbamoil-
gonyautoxinas, y las 13-deoxy-decarbamoil (Cusick & Sayler, 2013).
7
Tabla II. Análogos de toxinas paralizantes producidas por dinoflagelados marinos (Cusick & Sayler, 2013; Durán-Riveroll et al., 2013).
División Nombre R1 R2 R3 R4
Carbamoil STX H H H
NeoSTX OH H H
GTX1 OH OSO3 - H
GTX2 H OSO3 - H
GTX3 H H OSO3 -
GTX4 OH H OSO3 -
N-sulfocarbamoil GTX5(B1) H H H
GTX6(B2) OH H H
C1 H OSO3 - H
C2 H H OSO3 -
C3 OH OSO3 - H
C4 OH H OSO3 -
Decarbamoil dcSTX H H H
dcNeoSTX OH H H
dcGTX1 OH OSO3 - H
dcGTX2 H OSO3 - H
dcGTX3 H H OSO3 -
dcGTX4 OH H OSO3 -
Deoxydecarbamoil DoSTX H H H H
doGTX2 H H OSO3 - H
doGTX3 H OSO3 - H H
Benzoil GC1 H H OSO3-
GC2 H OSO3- H
GC3 H H H
GC4 OH H OSO3-
GC5 OH OSO3- H
GC6 OH H H
GC1a H H OSO3-
GC2a H OSO3- H
GC3a H H H
GC4a OH H OSO3-
GC5a OH OSO3- H
GC6a OH H H
8
GC1b H H OSO3-
GC2b H OSO3- H
GC3b H H H
GC4b OH H OSO3-
GC5b OH OSO3- H
Todos los análogos de las toxinas paralizantes tienen una alta afinidad para
bloquear los canales de sodio de las células nerviosas, bloqueando el flujo de iones
Na+ a través de la membrana de la célula, este bloqueo inhibe la propagación de los
potenciales de acción en las membranas excitables, provocando una parálisis
neuromuscular efectiva (Durán-Riveroll & Cembella, 2017). Los principales síntomas
que se presentan cuando un humano se intoxica con toxinas paralizantes son la
sensación de hormigueo en los labios y lengua; seguidos por dolor de cabeza, vómito,
debilidad muscular, falta de control y coordinación de movimientos voluntarios. Con
altas dosis, se puede llegar hasta la muerte debido a la parálisis de los músculos
involucrados en la respiración, siendo la causa de la muerte por falla respiratoria.
Los canales de sodio tienen cuatro dominios insertados a través de la
membrana, las toxinas paralizantes se unen al dominio 1 del canal, bloqueándolo en
la parte extracelular de la membrana dado que son lo suficientemente grandes como
para no poder pasar a través del poro. La afinidad de la toxina y el canal es de 1:1 (una
molécula de toxina para un canal) (Cestèle & Catterall, 2000; Mattei & Legros, 2014).
Los grupos guanidino de las toxinas van a ser esenciales para la unión en estado
cargados, además de los grupos hidroxilo del carbono 12 (Llewellyn, 2006). Dentro del
grupo STX, los análogos carbamoil son los más potentes, con los análogos
decarbamoil en la parte intermedia y los N-sulfocarbamoil siendo los menos tóxicos,
los análogos benzoil también tienen una menor afinidad a los canales de sodio,
comparado con los carbamoil (Llewellyn, 2006; Durán-Riveroll & Cembella, 2017).
9
Sin embargo, no solamente se ha visto que estas toxinas actúan en los canales
de sodio, sino que también se ha reportado que pueden actuar bloqueando los canales
de Ca2+ y de K+ (Llewellyn, 2006).
2. 2. Toxinas paralizantes y Gymnodinium catenatum
Cuando se describió por primera vez a G. catenatum no se reconoció como un
organismo tóxico. La primera vez que se relacionó con intoxicaciones por consumo de
mariscos fue en las Rias Gallegas en España (Estrada et al., 1984), y posteriormente
en el Pacífico Mexicano, con el registro de intoxicaciones y defunciones en humanos,
y confirmando su toxicidad mediante bioensayos en ratón, pero todavía sin saber que
toxina era la responsable de la intoxicación (De la Garza, 1983; Mee et al., 1986). Fue
hasta 1987 cuando se determinó la presencia de toxinas paralizantes en G. catenatum
en cepas de Tasmania, Australia, en donde se observó una dominancia de toxinas N-
sulfocarbamoil (Oshima et al., 1987).
Gymnodinium catenatum contiene alrededor de 17 análogos de saxitoxina
incluyendo las N-sulfocarbamoil (C1-4, B1 y B2), las gonyautoxinas (GTX1-6),
decarbamoilgonyautoxinas (dcGTX2,3), decarbamoil (dcSTX y dcNEO), neosaxitoxina
(NEO) y las deoxydecarbamoil (doGTX2,3 doSTX) (Negri et al., 2001; Bustillos-
Guzmán et al., 2015; Cembella & Band-Schmidt, 2018). Existe otro grupo de análogos
de saxitoxina que solo se encuentra presente en G. catenatum, conocidos como
análogos benzoil. Estos fueron descubiertos por primera vez en cepas de Australia,
describiéndose solamente tres toxinas, nombradas GC1 - 3 (Negri et al., 2003).
Posteriormente se vió que estas toxinas estaban ampliamente distribuidas en cepas
de G. catenatum de varias regiones geográficas, notando además que este tipo de
toxinas ocupaban un importante porcentaje en el perfil total de las toxinas (Negri et al.,
2007).
A través de los años, se fueron descubriendo mayor número de análogos
benzoil, agregando las formas GC4 – 6; además de estos, se han identificado otros
grupos en donde hay la presencia de un grupo hidroxilo adicional en la cadena benzoil,
10
que se les designo como GC1a – 6a, y finalmente otro grupo en el que se distingue la
presencia de un grupo sulfato además del hidroxilo también localizado en la cadena
benzoil; a los cuales se les nombró GC1b – 6b (Vale, 2008; 2010).
Se ha propuesto que los perfiles de toxinas de G. catenatum pueden funcionar
como un marcador bioquímico para poder diferenciar entre cepas de distintas áreas
geográficas; porque se ha observado que puede haber diferencias entre las
proporciones de la cantidad de toxinas, así como en el perfil (Oshima et al., 1993; Negri
et al., 2001). Además de las diferencias geográficas también se ha observado que el
tamaño de las cadenas, las condiciones del cultivo, así como el efecto de la comunidad
bacteriana también pueden reflejar un cambio en la concentración de las toxinas, así
como de sus perfiles (Band-Schmidt et al., 2006, 2014; Bustillos-Guzmán et al., 2012).
Las cepas mexicanas de G. catenatum se caracterizan por tener un perfil de
toxinas más o menos similar al comparar entre cepas de distintas regiones del país.
Principalmente se pueden encontrar los análogos decarbamoil: dcNEO, dcGTX1/4, los
N-sulfocarbamoil: B1, B2, C1/2, C3/4, y en algunos casos se ha observado la presencia
de los análogos carbamoil: STX y neoSTX. Resaltando que en la mayoría de los casos
los análogos N-sulfocarbamoil C1/2 son los más abundantes (Band-Schmidt et al.,
2005, 2006; Gárate-Lizárraga et al., 2005). Las cepas mexicanas también presentan
toxinas tipo benzoil características de G. catenatum, principalmente los análogos
hidroxibenzoil: GC1/2, GC3 y GC4/5; así como los análogos sulfatobenzoil: GC1b/2b,
las cuales también representan un porcentaje importante en el contenido total de
toxinas (Bustillos-Guzmán et al., 2011, 2015; Durán-Riveroll et al., 2013).
2. 3. Biosíntesis de saxitoxina
La biosíntesis de la saxitoxina fue descrita por primera vez por Shimizu (1993),
a partir del dinoflagelado Alexandrium tamarense y la cianobacteria Aphanizomenon
flos-aquae; estableciendo que el precursor de las saxitoxina es la arginina, también
menciona que el esqueleto tricíclico de la saxitoxina no es producto del metabolismo
ordinario de las purinas; sino que el esqueleto de este sistema de anillos tricíclicos es
11
formado a partir de una condensación de tipo Claisen, a partir del acetato sobre el
carbono de arginina.
Después de haberse descrito la síntesis de la saxitoxina, hubo varios trabajos
que intentaron identificar los genes y las enzimas que están involucradas en su ruta
metabólica; pero casi todos ellos fracasaron debido a la baja concentración en
condiciones naturales de la toxina, la falta de métodos sensibles para su detección y
de técnicas genéticas para la manipulación de los microorganismos (Taroncher-
Oldenburg & Anderson, 2000; Sako et al., 2001; Pomati et al, 2004; Pomati & Neilan,
2004).
En el 2007 Kellmann & Neilan pudieron identificar algunas de las enzimas que
están involucradas en la biosíntesis de saxitoxina a partir de lisados celulares de la
cianobacteria Cylindrospermopsis raciborskii T3. A partir de estos lisados se pudo
confirmar que la condensación tipo Claisen está involucrada en la biosíntesis de la
saxitoxina. Además, se pudieron identificar las enzimas: aminotransferasa clase II,
oxigenasa de hierro no hemo, conteniendo flavina y posiblemente ferredoxina, y una
O-carbamoiltransferasa.
La ruta metabólica para la biosíntesis de la saxitoxina consiste en diez pasos:
1) en el primer paso se da la condensación de Claisen entre la arginina y el acetato;
2) hay una amidinotransferencia de una segunda arginina al grupo α-amino como
primer intermediario; 3) la formación del primer heterociclo por una condensación
parecida a retro-aldólica; 4) la formación de los dos heterociclos restantes por
reacciones desconocidas; 5) introducción de la cadena lateral metilo por acoplamiento
electrofílico; 6) reorganización involucrando un desplazamiento 1,2-H de C-6 al C-5; 7)
epoxidación de la cadena lateral metilo; 8) apertura de epóxido a un aldehído; 9)
reducción del aldehído a alcohol; 10) transferencia O-carbamoil y reacciones de
oxidación completando la molécula de saxitoxina (fig. 2) (Shimizu, 1984, 1993;
Kellmann & Neilan, 2007).
12
Figura 2. Ruta hipotética de la biosíntesis de saxitoxina propuesta por Shimizu 1993, en donde se representan los diez pasos para la biosíntesis de la saxitoxina. Tomado de Kellmann & Neilan (2007).
La biosíntesis de la saxitoxina se lleva a cabo en el citosol de las células tanto
de dinoflagelados y cianobacterias, y la luz parece ser unos de los principales factores
que puede estar regulando la producción de saxitoxina (Kim et al., 1993; Yin et al.,
1997). Pero además de la luz, factores como la disponibilidad de nutrientes, la
13
temperatura y la salinidad pueden afectar la concentración y producción de toxinas
paralizantes en los dinoflagelados. También se ha observado que durante las fases de
adaptación y exponencial del ciclo de cultivo hay un aumento en la producción de
toxinas, seguido por una disminución en la producción conforme avanza la edad del
cultivo (Boyer et al., 1987; Boczar et al., 1988; Anderson et al., 1990; Gedaria et al.,
2007).
La división celular típica de los eucariotas va a estar dividida en cuatro fases (M,
G1, S y G2), iniciando con la mitosis (M), seguida por la interfase, siendo la fase G1,
donde las células son metabólicamente más activas. Por medio de cultivos
sincronizados de Alexandrium fundyense, se determinó que la biosíntesis de la
saxitoxina se lleva a cabo durante la fase G1 del ciclo celular y la activación de la
producción de toxinas paralizantes va a ser inducida por la luz, además se observó
que existe una relación entre la duración de esta fase del ciclo celular y la cantidad de
toxina que se está produciendo (Taroncher-Oldenburg et al., 1997, 1999). La
activación instantánea de la biosíntesis de toxinas PSP in vitro por la luz, sugiere que
este mecanismo podría estar regulado por un mecanismo post-transcripcional
(Kellmann & Neilan, 2007).
2. 4. Genes asociados a la biosíntesis de saxitoxina
Los genes de la ruta metabólica responsables para la biosíntesis de saxitoxina
se caracterizaron por primera vez en la cianobacteria de agua dulce C. raciborskii T3.
Se asignaron 26 proteínas (sxtA – sxtZ) para 30 funciones catalíticas para la
biosíntesis de saxitoxina, y el cluster de genes estaría conformado por
aproximadamente 35,000 pares de bases (Kellmann & Neilan, 2007; Kellmann et al.,
2008). Posteriormente, el cluster de genes fue caracterizado en las demás especies
de cianobacterias de agua dulce que también sintetizan saxotoxina: Anabaena
circinalis, Aphanizomenon sp., Rhaphidopsis brookii y Lyngbya woleii (Mihali et al.,
2009, 2011; Moustafa et al., 2009; Murray et al., 2011). Un complemento de 14 genes
involucrados en la biosíntesis de saxitoxina son compartidos entre las cinco especies
de cianobacterias (sxtA-sxtI, sxtP-sxtS y sxtU); y ocho de estos genes conforman los
14
genes núcleo que están involucrados directamente en la biosíntesis de saxitoxina
(sxtA, sxtB, sxtD, sxtG, sxtH/T, sxtI, sxtS y sxtU) (Orr et al., 2013).
El gen sxtA es el único que inicia la biosíntesis en cianobacterias. Este gen tiene
una estructura parecida a un policétido sintasa (PKS), y está conformado por cuatro
dominios catalíticos con actividad para S-adenosil-metionina metiltranferasa (SAM)
(sxtA1), GCN5-related N-acetiltransferasa (sxtA2), proteína transportadora de acilo
(sxtA3) y una aminotransferasa clase II (sxtA4) (Kellmann et al., 2008). Se ha
propuesto que el posible origen de estos genes en las cianobacterias involucró varios
eventos de transferencia horizontal de genes (THG) a partir de distintos grupos de
bacterias. La posible fuente de estos genes fue una proteobacteria ancestral;
sugiriendo que la biosíntesis de saxitoxina evolucionó a partir de un organismo
procariota (Kellman et al., 2008; Moustafa et al., 2009).
15
Figura 3. Ruta metabólica putativa para la biosíntesis de saxitoxina en cianobacterias y los genes involucrados. Los genes identificados en dinoflagelados y cianobacterias (círculos negros), los genes identificados solamente en cianobacterias (círculos punteados). Tomado de Zhang et al. (2014).
16
En los dinoflagelados se han identificado genes homólogos asociados a la
biosíntesis de saxitoxina en las especies de Alexandrium tamarense grupo IV, A.
fundyense, A. minutum y A. catenella identificando 14 genes, de los 23 identificados
en cianobacterias (Stüken et al., 2011; Hackett et al., 2013; Zhang et al., 2014). Los
transcritos de A. tamarense y A. minutum mostraron que el gen sxtA de los
dinoflagelados tienen la misma estructura de cuatro dominios que el gen sxtA de las
cianobacterias. Pero en contraste con los homólogos bacterianos, los transcritos de
los dinoflagelados son monocistrónicos, tienen un alto contenido de GC, además de
encontrase en múltiples copias, y contener un líder-empalmado (spliced-leader) típico
de dinoflagelados y la cola poli-A de eucariotas (Stüken et al., 2011). Es posible que
los genes responsables para la biosíntesis de saxitoxina no fueron transferidos
directamente entre las cianobacterias y los dinoflagelados. La estrecha relación
monofilética de las proteínas sxtA de los dinoflagelados productores de saxitoxina y,
por otro lado, las proteínas de las cianobacterias soportan la hipótesis que el precursor
del gen sxtA fue adquirido de manera independiente por cada linaje (Hackett et al.,
2013).
Sin embargo, la adquisición de los genes en los distintos linajes de
dinoflagelados todavía permanecía sin resolverse. Una hipótesis propuesta por Stüken
et al. (2011), es que la THG de las bacterias a los dinoflagelados se dio antes del
origen del género Alexandrium y Pyrodinium. Posteriormente Orr et al. (2013), con
base en análisis filogenéticos del gen sxtG propusieron que G. catenatum adquirió los
genes para la biosíntesis de saxitoxina se llevó a cabo por medio de una THG de
dinoflagelado a dinoflagelado.
Los análisis de la expresión de los genes sxtA (dominios sxtA1 y sxtA4) y sxtG,
han demostrado que no existe una relación entre la cantidad de gen expresado con la
cantidad de toxinas paralizantes que se están produciendo en las especies de A.
catenella y A. minutum; mencionando que probablemente los mecanismos post-
transcripcionales están regulando la producción total de toxina (Perini et al., 2014;
Wiese et al., 2014).
17
2. 5. Transferencia Horizontal de Genes en dinoflagelados
La transferencia horizontal de genes (THG), es el proceso de intercambio de
nuevo material genético entre organismos que no están, o están más o menos
relacionados entre ellos, refiriéndose a ese proceso “no genealógico de transmisión de
material genético de un organismo a otro” (Goldenfeld & Woese, 2007).
No existe mucha información acerca de la THG en organismos eucariotas, pero
se sabe que esta ha sido muy importante en la evolución de los eucariotas unicelulares
(Katz, 2002), y no cabe duda de que, por medio de la adquisición de genes foráneos,
los organismos están incluyendo en sus genomas información nueva de una manera
rápida, que puede ser utilizada en beneficio del organismo receptor (Ochman et al.,
2000).
La teoría endosimbiótica y la teoría endosimbiótica seriada hablan acerca de la
adquisición de las mitocondrias y los plástidos, por medio de una endosimbiosis de
bacterias en los primeros eucariotas (Margulis, 1993, 2004). Muchas de las proteínas
que son codificadas por el genoma nuclear son esenciales para el cloroplasto y la
mitocondria, y se ha sugerido que los genes que codifican para estas proteínas fueron
reubicados de los organelos ancestrales al núcleo del hospedero (Lang et al., 1999;
Timmis et al., 2004). Esto sucede porque después de una larga asociación simbiótica,
el simbionte tenderá a relegar todas las funciones metabólicas indispensables al
hospedero (Sagan, 1967). Este proceso de transferencia de genes del simbionte al
hospedero es conocido como transferencia endosimbiótica de genes (TEG), un
proceso similar a la THG (Fig. 4).
18
Figura 4. Mecanismos de la transferencia horizontal de genes.
La TEG ha sido una fuente importante de nuevo material genético en los
dinoflagelados, sobre todo por el origen de su plástido a través de una endosimbiosis
secundaria. Por ejemplo, en el dinoflagelado Lepidodinium chlorophorum que se
caracteriza por poseer un plástido derivado de un alga verde; a diferencia de los demás
dinoflagelados que tienen un plástido derivado de un alga roja, se determinó que
dentro de su genoma existen muchos genes relacionados con las algas verdes,
posiblemente adquiridos por medio de este mecanismo (Minge et al., 2010). En
dinoflagelados que carecen de plástidos, como el caso de Dinophysis acuminata, el
cual puede “robar” plástidos de otros organismos, se han identificado genes en su
núcleo utilizados para procesos fotosintéticos, adquiridos posiblemente por TEG
(Wisecaver & Hackett, 2010).
Sin embargo, en dinoflagelados como Karenia brevis no solamente los plástidos
son los que transfirieron los genes. En esta especie se han detectado alrededor de 30
proteínas transferidas de varias fuentes, tanto transferencias asociadas a
19
endosimbiosis secundarias, y por lo menos 16 solamente detectadas como THG
(Nosenko et al., 2006; Nosenko & Battacharya, 2007).
También se han identificado casos específicos de genes que fueron adquiridos
por medio de THG en los dinoflagelados, tal es el caso del gen para el gliceraldehído-
3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) en donde se menciona la posible transferencia de
genes entre los dinoflagelados y las Euglenophytas (Fagan et al., 1998; Takishita et
al., 2003, 2008). Este es el mismo caso de la enzima rubisco, que posiblemente fue
adquirida por medio de THG en los dinoflagelados, a través de una proteobacteria
(Palmer, 1995).
Este mecanismo de obtención de material genético, parece que ha impactado
de manera importante a los dinoflagelados; por ejemplo, en Alexandrium tamarense a
través de análisis de marcadores de secuencias expresadas (Expressed Sequence
Tags EST), identificaron que entre un 14 y 17% de estas secuencias pudieron ser
transferidas tanto por THG y TEG, y que tanto organismos eucariotas como procariotas
pueden estar involucrados en estas transferencias (Chan et al., 2012; Wisecaver et al.,
2013).
2. 6. Historia evolutiva de Gymnodinium catenatum
Existen alrededor de 2,000 especies de dinoflagelados, tanto en ambientes
marinos como en agua dulce, casi la mitad de ellos son fotosintéticos, pero también
existen formas mixótrofas y heterótrofas (Taylor et al., 2008). Los dinoflagelados
pertenecen a un grupo conocido como los alveolados, el cual también incluye a los
ciliados y apicomplexos, representando uno de los grupos más diversos de protistas
(Fast et al., 2002).
Los dinoflagelados son organismos unicelulares con un núcleo único, conocido
como dinokarion, dentro del núcleo los cromosomas siempre van a permanecer
condensados y van a carecer de histonas, presentando más de 100 cromosomas. Los
dinoflagelados tienen uno de los genomas más grandes de los eucariotas, teniendo
20
entre 1.5 Gb y 185 Gb, siendo seis veces más grande que el de los humanos (Lin,
2011; Wisecaver & Hackett, 2011).
Debido a que el registro fósil de los dinoflagelados parece estar incompleto, se
debe de tener cuidado al momento de interpretar su evolución (Fensome et al., 1999).
Sin embargo, posiblemente los dinoflagelados tuvieron un origen durante el
Precámbrico tardío (1000 Ma), encontrándose pocas formas, pero durante el
Mesozoico (250 Ma) ocurrió una radiación de dinoflagelados, originándose durante
este periodo la mayoría de todas las formas actuales de este grupo (Fensome et al.,
1996; Moldowan et al., 1996).
Dado que existe una gran variedad de formas de dinoflagelados, establecer sus
relaciones filogenéticas a través de sus características morfológicas ha resultado
difícil, sin embargo, con el uso de datos moleculares se han podido esclarecer algunas
de estas de confusiones.
Dentro de los dinoflagelados, los géneros Oxyrrhis, Noctiluca y el orden
Syndiniales son descritos como los grupos basales de los dinoflagelados, ya que en
su mayoría carecen del núcleo característico de los dinoflagelados; el dinokarion, y
otras características morfológicas, además de estar soportado por análisis moleculares
(Saldarriaga et al., 2003; Taylor, 2004; Bachvaroff et al., 2014). Sin embargo, en
algunos casos al género Oxyrrhis lo consideran como un grupo externo a los
dinoflagelados, y clasifican a Noctiluca en una posición incierta (Fensome et al., 1993).
Los dinoflagelados van a presentar cinco tipos básicos de tabulación:
gymnodinoide, peridinoide, gonyaulacoide, dinophysoide y prorocentroide (Fig. 5); los
cuales aparecieron aproximadamente en el mesozoico, y estos siguen siendo las
bases para los cinco órdenes de dinoflagelados (Fensome et al., 1999; Taylor, 2004).
De acuerdo con las características morfológicas; así como los datos moleculares,
sugieren que los dinoflagelados del orden Gymnodiniales son polifiléticos, y parecía
no estar claro si algunos linajes de este orden se originaron antes de la aparición de la
teca, aunque es posible que al menos algunos hayan tenido ancestros tecados. A
diferencia de los dinoflagelados atecados, los demás ordenes de dinoflagelados
21
tecados, parecen ser monofiléticos en su mayoría, aunque en algunos casos presentan
filogenias polifiléticas (Fensome et al., 1999; Daugbjerg et al., 2000; Saldarriaga et al.,
2003; Taylor, 2004; Murray et al., 2005; Hoppenrath & Leander, 2010).
Figura 5. Tipos de tabulación de los dinoflagelados. Tomado de Fensome et al. (1999).
Aunque no es claro todavía si los organismos atecados divergieron primero, y
dada la polifilia del orden Gymnodiniales, parece ser que los dinoflagelados de este
orden junto con el orden Suessiales, fueron los primeros en presentar las
características morfológicas de los dinoflagelados, siendo los dinoflagelados basales
de los llamados dinoflagelados núcleo. Posteriormente, parecen haber divergido de
manera conjunta los Peridiniales, Prorocentrales y Dinophysiales, y por último
surgieron los Gonyaulacales (Saldarriaga et al., 2003; Taylor, 2004).
De acuerdo con estudios con relojes moleculares se ha calculado que los
dinoflagelados del género Alexandrium posiblemente divergieron aproximadamente
entre 119 y 77 millones de años durante el cretácico, y particularmente el complejo de
A. tamarense parece haber surgido hace 23 millones de años (John et al., 2003).
Dentro del orden Gymnodiniales, G. catenatum, G. nolleri y G. microreticulatum forman
22
un complejo conocido como microreticulados, de acuerdo con datos moleculares, G.
microreticulatum fue la primera especie de este grupo en surgir hace 130 millones de
años, posteriormente divergieron G. nolleri y G. catenatum, probablemente siendo esta
última la especie más reciente del grupo (Bolch, 1999).
Basándose con datos moleculares, se han propuesto dos posibles orígenes de
G. catenatum, un origen europeo o un origen en el Pacífico Nororiental, divergiendo a
partir de G. nolleri, y que la dispersión de esta especie, dada la alta relación que tiene
entre sus poblaciones de diferentes regiones geográficas, fue en un evento geológico
reciente (Bolch et al., 1999; Bolch & Reynolds, 2002; Mudie et al., 2002; Amorim &
Dale, 2006).
3. JUSTIFICACIÓN
Con la detección de los genes responsables de la biosíntesis de saxitoxina en
los dinoflagelados se corroboró que la producción de este tipo de toxinas era propia
de los dinoflagelados, contrario a lo propuesto anteriormente, que mencionaba que las
bacterias asociadas a los dinoflagelados eran las responsables de la producción de
las toxinas paralizantes.
Estos genes, al igual que las cianobacterias productoras de toxinas
paralizantes, fueron adquiridos por medio de una transferencia horizontal de genes de
bacterias. Se ha propuesto que la adquisición de los genes en los dinoflagelados se
dio primero en el ancestro en común de los géneros Alexandrium y Pyrodinium, ya que
ambos géneros pertenecen a la misma familia, y posteriormente por medio de una
transferencia dinoflagelado – dinoflagelado fue como G. catenatum adquirió los genes
para la biosíntesis de la saxitoxina.
Sin embargo, esta última hipótesis no había sido corroborada, por lo que este
trabajo busca identificar como y cuando fue la THG en G. catenatum y poder explicar
cómo ha sido la evolución de la producción de toxinas paralizantes en los
dinoflagelados, por medio de análisis filogenéticos de los genes que inician la
biosíntesis de la saxitoxina, además de identificar la familia de genes en el
transcriptoma de G. catenatum.
23
4. HIPÓTESIS
Se propone que la adquisición de los genes para la biosíntesis de saxitoxina se
llevó a cabo por medio de una transferencia horizontal de genes en una etapa
temprana de la evolución de los dinoflagelados, anterior a la radiación mesozoica, con
la consiguiente pérdida de la síntesis de saxitoxina en algunos grupos de
dinoflagelados.
5. OBJETIVO
Determinar el origen de la adquisición de los genes para la biosíntesis de saxitoxina
en Gymnodinium catenatum.
5. 1. OBJETIVOS PARTICULARES
Análisis filogenético de Gymnodinium catenatum para establecer el origen en la
adquisición de los genes sxtA (dominios sxtA1 y sxtA4) y sxtG, involucrados en la
biosíntesis de saxitoxina.
Determinar el número de copias de los dominios sxtA4 y sxtA1 involucrados en la
biosíntesis de saxitoxina dentro del material genómico de G. catenatum.
Evaluar la relación que hay entre el número de copias de los genes sxtA4, sxtA1 y la
cantidad de toxina que produce G. catenatum.
Identificar la familia de genes posiblemente involucrados en la biosíntesis de saxitoxina
en G. catenatum mediante el análisis de su transcriptoma.
24
6. MATERIAL Y MÉTODOS
6. 1. Cepas
Para realizar este trabajo se utilizaron siete cepas de Gymnodinium catenatum
aisladas de cinco regiones del Pacífico mexicano y el Golfo de California (Tabla III, Fig.
6).
Tabla III. Claves de las cepas, zonas y año de recolección y persona que aisló las cepas
Cepa Localidad y año Persona
GCMV – 7 Bahía de Mazatlán, 2007
LC62 Lázaro Cárdenas, 2005 M. Rodríguez-Palacios
G7 new Manzanillo, 2010 S. Quijano-Scheggia
GCCV – 6 Bahía Concepción, 2000 C. Band-Schmidt
BAPAZ – 5 Bahía de La Paz, 2007 C. Band-Schmidt
BAPAZ – 7
BAPAZ – 16
Bahía de La Paz, 2007
Bahía de La Paz, 2016
C. Band-Schmidt
E. Hernández-Castro
25
Figura 6. Localidades de aislamiento de las cepas de Gymnodinium catenatum en el Golfo de California y Pacífico Mexicano.
6. 2. Condiciones de cultivo
Las cepas se mantuvieron en medio GSe modificado (Bustillos-Guzmán et al.,
2015), a 24°C ± 1°C, con un ciclo de 12:12 horas de luz:oscuridad, una irradiancia de
150 μmol fotón m-2 s-1 y salinidad de 34. Las cepas se mantuvieron en tubos de 50 mL
con 20 mL de medio de cultivo. Los cultivos se transferían cada 15 días.
26
6. 3. Extracción de ADN, PCR, secuenciación y análisis filogenéticos.
6. 3. 1. Extracción de ADN
Para las extracciones de ADN se realizaron cultivos de las cepas en matraces
de 150 mL, adicionando 100 mL de medio de cultivo. Las cosechas se hicieron a los
12 días cuando las cepas se encontraban en la fase exponencial de crecimiento. Los
cultivos se concentraron por centrifugación a partir de volúmenes de 30 mL a 3,500
rpm durante 10 minutos.
La extracción de ADN se realizó de acuerdo con el protocolo del buffer de
bromuro de cetil-trimetilaminio (CTAB) (Ausubel et al., 2002). La biomasa obtenida de
las cosechas se resuspendió en 200 µL del buffer CTAB (2% [w/v] CTAB, 2% PVP,
0.5% β-mercaptoetanol, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8) y se incubó
a 65ºC durante 5 minutos. Al término del tiempo de incubación las muestras se
mezclaron en el vortex por un minuto, posteriormente se les adicionaron 800 µL del
buffer CTAB y se incubaron por una hora. Al final se les adicionó un volumen igual de
cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm
durante 10 minutos a temperatura ambiente, recuperándose la fase acuosa en un tubo
nuevo. Para precipitar el ADN se utilizaron 0.6 x volumen de isopropanol frío y 0.1 x
volumen de acetato de amonio 7.5 M dejándolas a -20ºC por 24 horas.
El ADN se recuperó mediante centrifugación a 14,000 rpm a 4ºC durante 20
minutos. El alcohol se descartó. El botón se lavó con 500 µL de etanol al 70% y se
centrifugó a 14,000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. El botón de ADN se dejó secar a
temperatura ambiente durante 20 minutos y se resuspendió en 50 µL de TE.
Para confirmar la presencia de ADN se realizó una electroforesis en gel de
agarosa grado biología molecular al 1% disolviéndola en solución buffer TBE 1X. Se
mezclaron tres µL de ADN con un µL de colorante de carga con GelRed (Biotium). La
electroforesis se corrió en buffer TBE 1X durante 40 minutos a 80 V. La concentración
de ADN genómico se cuantificó en un NanoDrop 2000 (TermoFisher).
27
6. 3. 2. PCR y secuenciación
Todas las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando un termociclador BioRad
modelo MJ MINI personal thermal cylcer (BioRad Laboratories, Hercules, CA). El PCR
se realizó en volúmenes de 25 µL conteniendo 1U de Taq polimerasa (Invitrogen,
Carlsbad, CA), 1.5 mM MgCl, 200 µM dNTP’s, 0.5 µM de cada oligonucleótido, 1X
Buffer PCR, una concentración variable de ADN (entre 10 y 100 ng) y agua destilada
grado biología molecular para ajustar el volumen.
Para determinar las temperaturas de alineación de cada uno de los
oligonucleótidos se realizaron PCR en gradiente con el siguiente programa: 94ºC por
5 minutos como ciclo de desnaturalización, 35 ciclos con 94ºC por 30 segundos,
alineamientos en un gradiente de 55 – 65ºC por 30 segundos y extensión a 72ºC por
un minuto, seguidos de un ciclo de extensión final a 72ºC por siete minutos. Los
productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1%, mediante
electroforesis en buffer TBE 1X.
Los oligonucleótidos utilizados para realizar los PCR se describen en la tabla
IV. Se amplificaron los genes sxtA (dominios sxtA1 y sxtA4) y sxtG, los cuales
corresponden a los genes que inician la biosíntesis de la saxitoxina.
Tabla IV. Lista de oligonucleótidos empleados para la amplificación de cada dominio en este estudio. Región, nombre, secuencia y referencia.
Región Nombre Secuencia 5’ – 3’ Referencia
sxtA1 Sxt001 F TGCAGCGMTGCTACTCCTACTAC Stüken et al., 2011 Sxt002 R GGTCGTGGTCYAGGAAGGAG Stüken et al., 2001 sxtA4 Sxt007 F ATGCTCAACATGGGAGTCATCC Stüken et al., 2001 Sxt008 R GGGTCCAGTAGATGTTGACGATG Stüken et al., 2001 sxtG sxtG206 F GGGCCGTGAAGGATTACCTGA Orr et al., 2013 sxtG663 R GTTGCTCACCATCGACTCCATG Orr et al., 2013
El producto de PCR se mandó purificar y secuenciar a la empresa Macrogen.
Las muestras se purificaron usando la precipitación con etanol y la secuenciación se
llevó a cabo utilizando un kit BigDye terminator v3.1 Cycle y se corrieron en un
secuenciador 3730XL.
28
6. 3. 3. Análisis filogenéticos
Las secuencias se editaron con el programa sequencher 4.1.4. (Gene Codes,
Ann Arbor, MI), la edición se llevó a cabo a partir de las secuencias de Forward y
Reverse de cada una de las regiones amplificadas. Una vez editadas las secuencias
se hicieron búsquedas en BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de la National
Center for Biotechnology Information (NCBI) para encontrar secuencias homólogas de
nucleótidos y proteínas para cada uno de los genes.
Para los análisis filogenéticos del dominio sxtA1 se utilizaron marcadores de
secuencias expresadas (EST por sus siglas en inglés) de diferentes especies de
dinoflagelados depositadas en la Marine Eukaryote Transcriptomic Sequencing Project
(METSP). Para determinar la presencia del dominio sxtA1 se utilizó el programa
BLAST+ 2.7.1 (NCBI, EUA). Se crearon bases de datos locales utilizando secuencias
de péptidos a partir de los EST descargados, estas bases de datos se compararon con
secuencias de aminoácidos del dominio sxtA1 de Alexandrium. Para las búsquedas se
usó el método blastp, para que las secuencias fueran incluidas en el análisis
filogenético debían de tener un valor de e<1e-3. Además, se utilizaron secuencias de
especies de Alexandrium tóxicas y no tóxicas depositadas en la base de datos de
GenBank (NCBI).
Para el análisis filogenético del dominio sxtA1 las secuencias de G. catenatum
obtenidas de la amplificación y las disponibles en el GenBank para esta especie y para
el género Alexandrium fueron traducidas a secuencias de aminoácidos utilizando el
programa CLC Sequence Viewer (CLC Bio, Qiagen, Dinamarca). Las secuencias de
aminoácidos de los dinoflagelados se alinearon con el programa MAFFTv7.313
(Yamada et al., 2016) con el modelo L-INS-I usando los parámetros establecidos. Las
posiciones mal alineadas fueron removidas con el programa Gblocks (Castresana,
2000), estableciendo las opciones de recorte menos estrictas.
Para encontrar el modelo de sustitución adecuado para las secuencias de
aminoácidos se usó el programa MEGA6 (Tamura et al., 2013); siendo el modelo WAG
el modelo evolutivo más adecuado. El análisis de Máxima Verosimilitud se realizó con
el programa RAxML GUI (Silvestro & Michalak, 2012), el modelo PROTWAG fue usado
29
con 100 repeticiones de Bootstrap. El análisis de Inferencia Bayesiana se efectúo con
el programa MrBayes 3.2.6 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001), utilizando el mismo
modelo; se corrieron un millón de generaciones hasta que la desviación estándar de
las secuencias fuera menor a 0.01.
Para el análisis filogenético del dominio sxtA4 solamente se utilizaron
secuencias nucleotídicas de Alexandrium y P. bahamense depositadas en la base de
datos de GenBank. Las secuencias de nucleótidos se alinearon con el programa
MAFFTv7.313 con el modelo G-INS-I con los parámetros establecidos. Las posiciones
mal alineadas se removieron con Gblocks estableciendo las opciones de recorte
menos estrictas.
El análisis de Máxima Verosimilitud se realizó con el programa RAxML GUI. El
modelo GTR con una distribución gamma fue usado para el análisis con 500
repeticiones de Bootstrap. El análisis de Inferencia Bayesiana se realizó con el
programa MrBayes usando el mismo modelo de sustitución nucleotídica, se corrieron
un millón de generaciones hasta que la desviación estándar fuera menor a 0.01, los
árboles se muestrearon cada 200 generaciones.
Para realizar el análisis filogenético del gen sxtG se usó una estrategia
diferente. A partir del transcriptoma de G. catenatum de la cepa BAPAZ – 16 se realizó
la búsqueda del gen. La búsqueda se hizo con el programa BLAST+ 2.7.1, se
construyó una base de datos a partir del transcriptoma. Para obtener la secuencia se
comparó con una secuencia de aminoácidos del gen sxtG de la cianobacteria
Cylindrospermopsis raciborskii mediante el modelo tblastn y para considerar válida la
secuencia se determinó un valor de e<0.01.
Una vez obtenida la secuencia se realizó una búsqueda en la página de BLAST
para confirmar que la secuencia correspondiera a la proteína adecuada. Además, a
partir de la búsqueda de BLAST se descargaron las secuencias que obtuvieron un
mejor índice de similitud para ser utilizadas en la construcción de los árboles
filogenéticos. También se descargaron secuencias de aminoácidos de Alexandrium del
gen sxtG, y secuencias de aminoácidos de cianobacterias del mismo gen.
30
Las secuencias de aminoácidos se alinearon con el programa MAFFTv7.313
con el modelo L-INS-I, utilizando los parámetros predeterminados. Las posiciones mal
alineadas fueron removidas con el programa Gblocks, estableciendo las opciones de
recorte menos estrictas.
Para encontrar el modelo de sustitución adecuado para las secuencias de
aminoácidos se utilizó el programa MEGA6; el cual determinó que el modelo LG como
el más adecuado. El análisis de Máxima Verosimilitud se realizó con el programa
RAxML GUI, el modelo PROTLG fue usado con 100 repeticiones de Bootstrap.
6. 4. Cuantificación del número de copias de los dominios sxtA1 y sxtA4, y
contenido de toxinas en Gymnodinium catenatum
Para la cuantificación del número de copias y contenido de toxinas se utilizó una
sola cepa de G. catenatum, la cepa utilizada fue la LC62 de Michoacán, ya que esta
es la que presentaba un mejor crecimiento y mayores concentraciones de ADN.
Se realizó una curva de crecimiento, para determinar los días exactos de
cosecha. Posteriormente se realizaron cultivos de lote de los cuales se cosecharon las
muestras para extracción de ADN y extracción de toxinas durante distintas etapas del
ciclo de cultivo: durante la fase de adaptación, la fase exponencial temprana, fase
exponencial tardía y la fase estacionaria.
6. 4. 1. Curva de crecimiento
Se realizó la curva de crecimiento de la cepa LC62. Se inició con una
concentración de 500 cel mL-1 en 150 mL de medio de cultivo, esto se realizó por
triplicado. Cada tercer día se tomaron 2 mL del cultivo fijándolo con lugol ácido. Para
determinar el número de células mL-1 se hicieron conteos utilizando una cámara de
Sedgwick – Rafter de 1.0891 mL, en un microscopio invertido Carl Zeiss Axio Vert.A.1.
31
Se calculó el promedio y la desviación estándar de los conteos. Los promedios
de cada día fueron graficados para obtener la curva de crecimiento y determinar las
fases de crecimiento de la cepa y los días de cosecha
6. 4. 2. Cosechas de la cepa LC62
Para determinar el número de copias y toxinas totales de G. catenatum, se
hicieron cultivos de lote independientes en matraces de 250 mL, por triplicado para
cada una de las fases, en donde se inició con una concentración de 500 cél mL-1 en
150 mL de medio de cultivo.
De acuerdo con la curva de crecimiento se determinó realizar las cosechas a
los cuatro, ocho, doce y catorce días de crecimiento, los cuales corresponden a la fase
de adaptación, fase exponencial temprana, fase exponencial tardía y fase estacionaria
respectivamente. De cada uno de los matraces se tomaron las muestras para conteos
de células, las cosechas para cuantificación de toxinas y las cosechas para extracción
de ADN.
Para la extracción de ADN se cosecharon 60 mL para las dos primeras fases y
30 mL para las dos últimas fases. Las cosechas se llevaron a cabo mediante
centrifugación a 4,000 rpm en tubos de 50 mL. Una vez formado el botón de células
estos fueron transferidos a un tubo de microcentrífuga de 2 mL, procurando descartar
la mayor cantidad de sobrenadante; las muestras fueron congeladas para su posterior
análisis.
Para la cuantificación de toxinas se filtraron 50 mL del cultivo para la fase de
adaptación a través de un filtro de fibra de vidrio GF/F de 25 mm. y 0.7 µm. Para las
siguientes fases se filtraron 25 mL de igual manera que en la fase anterior.
6. 4. 3. Extracción de ADN, extracción y cuantificación de toxinas
La extracción de ADN se llevó a cabo mediante la técnica de CTAB buffer,
anteriormente descrita.
32
Para la extracción de toxinas, los filtros utilizados para cosechar las células de
G. catenatum fueron descongelados y molidos, a esto se le adicionó dos mL de ácido
acético 0.03 N, y posteriormente sometidos a un baño ultrasónico (3510 Branson
Ultrasonic Cleaner) por 10 minutos. El sobrenadante se filtró en acrodiscos de fibra de
vidrio (Whatman 3.0 mm GD/X).
El análisis de toxinas se realizó en el laboratorio de microalgas nocivas, del
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Los análisis de toxinas se llevaron
a cabo mediante el HPLC-FLD, en un equipo Agilent HP 1100, utilizando una columna
Luna C-18 Phenomenex, a temperatura ambiente, con oxidación post-columna con
ácido periódico, utilizando el método reportado por Hummert et al. (1997) modificado
por Yu et al. (1998). La detección se realizó con una λ de excitación de 333 nm y λ de
emisión de 390 nm.
Se realizó la hidrólisis de 150 µL de cada muestra de extracto crudo con ácido
clorhídrico para convertir las toxinas N-sulfocarbamoil (toxinas B y C) en sus análogos
carbamoil: B1 → STX; B2 → NEO; C1→ GTX2; C2 → GTX3; C3 → GTX1; C4 →
GTX4. La cuantificación de las toxinas se realizó mediante el cálculo de la diferencia
en el incremento del pico máximo en relación con las toxinas carbamoil, producto de
la hidrólisis. La identificación se llevó a cabo por comparación de los tiempos de
retención y coelución de las muestras con estándares comerciales de saxitoxina (STX),
neosaxitoxina (NEO), gonyautoxinas 1 a 4 (GTX 1-4), decarbamoilsaxitoxina (dcSTX),
decarbamoilgonyautoxina 2 y 3 (dcGTX 2 y 3) y N-sulfocarbamoil-11 sulfato (C1 y 2).
Los estándares fueron adquiridos en el National Research Council, Halifax, Canadá.
6. 4. 5. Cuantificación del número de copias mediante PCR - tiempo real
Para la detección de los dominios sxtA1 y sxtA4 se diseñaron oligonucleótidos
específicos para G. catenatum (Tabla V), utilizando el programa Primer3 (Koressaar &
Remm, 2007), procurando que el diseño se llevara a cabo en zonas conservadas de
cada dominio.
33
Tabla V. Oligonucleótidos diseñados para la prueba de PCR en tiempo real para G. catenatum.
Región Nombre Secuencia 5’ – 3’
sxtA4qPCR sxtA4GcatF CGTACGCTTGAAGCACAATG sxtA4GcatR TGCGAGTCGTCAACGAGTAT sxtA1qPCR sxtA1GcatF AGCACCAGACGTTCTTCACT sxtA1GcatR CTTCACGTGCTCGTAGATGC
Los análisis de PCR en tiempo real se realizaron en el laboratorio de genómica
funcional, del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada.
El PCR en tiempo real se llevó a cabo en un termociclador Bio-Rad CFX96 Touch (Bio-
Rad Laboratories, Hercules, CA). Las reacciones se hicieron por triplicado en una
placa de 96 pozos. Cada pozo contenía 5 µL de Mix de EvaGreen 2x (10x Buffer PCR,
25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 5U Taq, 20x EvaGreen), 0.5 µL de cada primer en una
concentración de 10 µM y 2 µL de ADN, ajustando con agua milliQ para tener una
concentración final de 10 µL.
El programa de amplificación se realizó de la siguiente manera: un ciclo de
95ºC durante 10 minutos para desnaturalizar, posteriormente 45 ciclos de 95ºC por 15
segundos, 56ºC por 30 segundos y 72ºC por 30 segundos, la medición de la
fluorescencia se hizo al final de cada paso de extensión de 72ºC. Después de la
amplificación, se hizo un análisis de pico de fusión con un gradiente de temperatura
de 0.5ºC s-1 de 60 a 95ºC para confirmar que sólo se amplificaron productos
específicos. El ciclo umbral (Ct) se determinó mediante el programa Bio-Rad CFX
Manager.
Para poder determinar el número de copias se realizó una curva estándar para
cada dominio. Se utilizaron productos de PCR de cada uno de los dominios, de estos
productos se hicieron diluciones seriadas desde 5 ng µL-1 hasta 5 x 10-5 ng µL-1,
utilizando el mismo programa de amplificación. Se graficaron los valores de Ct contra
el Log10 de las concentraciones utilizadas.
Antes de poder determinar el número de copias se determinó la concentración
de material genómico en ng de cada una de las muestras analizadas. Para esto se
utilizó la siguiente ecuación:
34
ng = 10𝐶𝑡−𝑏
𝑚
donde Ct corresponde al valor umbral de cada una de las muestras, b es la ordenada
al origen y m es la pendiente de la ecuación de la recta determinada a partir de la curva
estándar.
Una vez obtenida la concentración, se calculó el número de copias utilizando la
siguiente fórmula:
No. copias = (ng)(6.022 × 1023)
(tamaño del fragmento ∗ 1 × 109 )(660)
donde 6.022 × 1023 es el número de Avogadro y 660 es el promedio del peso
molecular de cada una de las bases. Finalmente, este valor fue dividido por el número
de células contenidas en cada muestra para así tener el valor del número de copias
por célula (Murray et al., 2011; Stüken et al., 2011).
6. 5. Construcción del transcriptoma de Gymnodinium catenatum y
determinación de la familia de genes para la biosíntesis de saxitoxina
Para la construcción de transcriptoma se utilizó la cepa BAPAZ – 16. La
extracción de ARN y la construcción del transcriptoma se realizaron en el
departamento de Ecología Química, del Alfred Wegener Institut, Alemania.
6. 5. 1. Extracción de ARN
La extracción de ARN se realizó mediante el método de TRIzol reagent
(ThermoFisher Scientific, California, EUA). Se cosecharon 40 mL del cultivo, durante
la fase exponencial por centrifugación a 3,500 rpm durante 15 minutos, se descartó el
sobrenadante y el botón se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 2 mL.
El botón se resuspendió en 500 µL de reactivo de TRIzol, se homogeneizo la
mezcla en vortex durante un minuto y se incubó durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Posteriormente se adicionaron 100 µL de cloroformo, nuevamente se incubó
35
por 5 minutos a temperatura ambiente, y centrifugó a 14,000 rpm a 4ºC por 15 minutos,
se transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo. Para aislar el ARN se adicionaron 250 µL
de isopropanol frío al tubo que contenía la fase acuosa, se incubo por 10 minutos a
temperatura ambiente. Para obtener el botón de ARN se centrifugó a 14,000 rpm a 4ºC
durante 10 minutos, el sobrenadante fue desechado. Para lavar el ARN se agregaron
500 µL de etanol al 75%, se centrifugó a 14,000 rpm a 4ºC por 5 minutos, se retiró el
sobrenadante y se dejó secar el botón. El botón de ARN se resuspendió en 50 µL H2O
libre de nucleasas.
La concentración de ARN se calculó con un Nanodrop, y la calidad del ARN se
visualizó mediante el Bioanalyzer 2100 expert (Agilent, CA, EUA).
6. 5. 2. Identificación de genes candidatos involucrados en la biosíntesis de
saxitoxina
Para la identificación de los genes involucrados en la biosíntesis de saxitoxina
en G. catenatum, se utilizó el ensamble de los contigs. Para realizar la búsqueda se
utilizó el programa BLAST+ 2.7.1, mediante este programa las secuencias de contigs
ensambladas se transformaron a una base de datos mediante el método makeblastdb.
Una vez generada la base de datos se comparó con las secuencias de genes para la
biosíntesis de saxitoxina de las cianobacterias. Para realizar esta comparación se
descargaron las secuencias de aminoácidos de las cianobacterias C. raciborskii y A.
circinalis, para cada uno de los 26 genes reportados para la biosíntesis de saxitoxina,
una vez descargadas las secuencias se utilizó el modelo tblastn.
Todas las secuencias con un valor de acierto de e<0.1 se extrajeron, estas
secuencias fueron utilizadas para realizar una búsqueda en BLAST, usando la base
de datos de proteínas no redundante del NCBI.
Además de la búsqueda de las proteínas en BLAST, también se hicieron
búsquedas en la base de datos de Dominios Conservados (CDD por sus siglas en
inglés).
36
7. RESULTADOS
7. 1. Análisis filogenéticos
7. 1. 1. Análisis filogenético dominio sxtA1
El tamaño de las secuencias del dominio sxtA1 de G. catenatum fue de
alrededor de 525 y 541 pb, con una similitud entre las amplificaciones de PCR
predichas y observadas. El contenido de GC de las secuencias fue del 64%. La
búsqueda realizada en BLAST muestra que las secuencias amplificadas de G.
catenatum corresponde a secuencias de la misma especie y dominio (98% de similitud
y valor de e 0.0). El segundo mejor alineamiento se relacionó con el gen sxtA de
Alexandrium fundyense (91% de similitud y valor de e 0.0).
La inferencia filogenética del dominio sxtA1 mostró una separación con respecto
del grupo de las cianobacterias, en este caso llamado clado cianobacteria. Los
dinoflagelados se agruparon por separado, en un grupo denominado clado
dinoflagelado. Dentro de este segundo clado se pueden observar dos ramas bien
definidas, una rama agrupa a los dinoflagelados de diferentes géneros (no productores
de saxitoxina), incluyendo algunas especies del género Alexandrium. La segunda rama
incluye especies tóxicas y no productoras de saxitoxina del género Alexandrium, así
como a las cepas de G. catenatum (Fig. 7).
Dentro del clado donde se encuentran las especies de Alexandrium y G.
catenatum, se puede observar que las cepas de Australia (GCTRA01 y CS395) como
las de México (GCMV7, GCCV6 y LC62) no muestran una gran diferencia entre sí; las
diferencias entre las cepas de G. catenatum fue de 0.2%. El otro grupo presente dentro
de este clado estuvo conformado solamente por especies del género Alexandrium. Las
distancias evolutivas entre las especies de Alexandrium y G. catenatum estuvieron
entre 7.1% y 10.7% respectivamente.
37
Figura 7. Árbol filogenético del dominio sxtA1 a partir de secuencias de aminoácidos de dinoflagelados y cianobacterias. El árbol fue reconstruido a partir de la Inferencia Bayesiana, los valores en los nodos internos representan las probabilidades posteriores/Bootstrap.
7. 1. 2. Análisis filogenético dominio sxtA4
Las amplificaciones por PCR del dominio sxtA4 de las cepas de G. catenatum
resultaron en un producto de aproximadamente 658 pb; coincidiendo con las
amplificaciones predichas y observadas, el contenido de GC de las secuencias fue de
60%. Para este dominio, fueron usadas las secuencias de las tres especies/género
que producen STX (Alexandrium, P. bahamense y G. catenatum). Las búsquedas en
BLAST indicaron que las secuencias amplificadas de las cepas mexicanas se
alinearon en primer lugar con secuencias del dominio sxtA4 y cepas de G. catenatum
(99% de similitud); el segundo alineamiento en BLAST correspondió a la especie A.
fundyense con el mismo dominio (90% de similitud).
38
Las secuencias de cianobacterias formaron un clado bien soportado y separado
del clado de los dinoflagelados (Fig. 8A). El árbol filogenético construido a partir de
Máxima Verosimilitud e Inferencia Bayesiana mostró que las secuencias de G.
catenatum también formaron un clado bien soportado (100 bootstrap, 1.0 probabilidad
posterior), separado de las especies de Alexandrium y P. bahamense. En este caso,
dentro del clado de G. catenatum una cepa mexicana se agrupó con una cepa
australiana, y las otras dos cepas mexicanas se agruparon en una segunda rama (Fig.
8B). Las diferencias entre las cepas de G. catenatum fue de 3%.
La única secuencia disponible de P. bahamense se agrupó con las especies de
Alexandrium, formando un subclado con secuencias de A. ostenfeldii (100 bootstrap,
1.0 probabilidad posterior), que fue designado como clado Alexandrium/Pyrodinium.
Las diferencias entre las secuencias de Alexandrium y G. catenatum fue de 13%.
39
Figura 8. A) Árbol filogenético del dominio sxtA4 de cianobacterias y dinoflagelados, los valores del nodo indican las probabilidades posteriores/Bootstrap. B) Árbol filogenético del dominio sxtA4 de dinoflagelados, el árbol esta reconstruido por Inferencia Bayesiana. Las marcas de los nodos interiores indican los valores probabilidades posteriores/Bootstrap.
40
7. 1. 3. Análisis filogenético del gen sxtG
El tamaño del contig identificado a partir del transcriptoma de G. catenatum
como parte del gen sxtG tuvo un tamaño de 1560 pb. El contenido de GC fue de 57%.
De acuerdo con la búsqueda realizada en BLAST la secuencia de G. catenatum mostró
89% de similitud con el gen sxtG de A. fundyense.
Además, se puede observar la formación de dos clados, uno conformado por el
grupo de eucariotas (Clorophyta, Apicomplexa y Nematoda), y el otro conformado por
las secuencias de amidinotransferasa de bacterias; dentro de este clado se encuentran
las secuencias de dinoflagelados y cianobacterias productores de saxitoxina (Fig. 9).
Dentro del clado bacteria, las secuencias de los dinoflagelados conforman un
subclado, denominado clado dinoflagelado, las dos secuencias de G. catenatum se
encuentran dentro de una misma rama. El clado dinoflagelado se encuentra cercano
a secuencias de proteobacterias.
Figura 9. Árbol filogenético del gen sxtG a partir de secuencias de aminoácidos de dinoflagelados, cianobacterias y bacterias. El árbol fue reconstruido a partir de Máxima Verosimilitud, los valores en los nodos internos representan los valores de Bootstrap.
41
7. 2. Cuantificación de toxinas y número de copias de los dominios sxtA1 y sxtA4
7. 2. 1. Curva de crecimiento
La curva de crecimiento muestra que la cepa LC 62, alcanzó la densidad
máxima a los doce días de cultivo, con una densidad aproximada de 2878 ± 333 cel
mL-1. Las distintas fases de crecimiento celular fueron: fase de adaptación que duró
hasta el sexto día de cultivo, la fase exponencial temprana entre el día seis y diez días,
la fase exponencial tardía entre el día diez y doce, alcanzando una biomasa máxima
al día doce, seguida de una fase de decaimiento abrupta (Fig. 10). La tasa de
crecimiento exponencial fue de 0.17 div día-1.
Figura 10. Curva de crecimiento de la cepa LC62 de G. catenatum en medio GSe, 12:12 horas luz:oscuridad, 24ºC temperatura y 34 de salinidad.
7. 2. 2. Perfil y concentración de toxinas
En la cepa LC62 se identificaron 10 análogos de STX: las N-sulfocarbamoil
C1/2, B1 y B2; las decarbamoil dcSTX, dcNEO y dcGTX2/3 y las carbamoil GTX2/3.
Los pares de las toxinas C1/2, B1/2, dcGTX2/3 y GTX2/3 se expresan como sumatoria,
42
ya que estas pueden epimerizar con facilidad bajo las condiciones de extracción y
análisis. No se encontró STX ni NEO. Se pudieron observar variaciones en las
proporciones de las toxinas durante las distintas fases de la curva de crecimiento.
Las toxinas C1/2 fueron las más abundantes en las cuatro fases del ciclo de
cultivo representando entre el 50 y 40% pmol cel-1. El segundo lugar en abundancia
fueron las toxinas dcNEO entre el 21 y 32% pmol cel-1, seguidas por las toxinas B1/2
del 20 al 25% pmol cel-1. Las toxinas dcSTX y GTX1/2 siempre se encontraron por
debajo de 0.5% (Fig. 11).
Durante las fases del ciclo de cultivo se observó una variación en las
proporciones en el perfil de toxinas; las toxinas C1/2 y B1/2 aumentaron de la fase de
adaptación a la fase exponencial temprana de 39 a 50% y de 20 a 26%
respectivamente, manteniéndose constante durante las otras fases. En contraste; la
toxina dcNEO y dcGTX2/3 disminuyeron de la fase de adaptación a la fase exponencial
temprana de 32 a 22% y de 7 a 3% respectivamente, manteniéndose constante
durante las siguientes fases (Fig. 11).
Figura 11. Perfil de toxinas (pmol cel-1) de la cepa LC62 de G. catenatum durante las diferentes fases del ciclo de cultivo.
43
Las concentraciones de toxinas en las fases del ciclo de cultivo fueron:
adaptación 1.54 ± 0.59 pmol cel-1, exponencial temprana 1.13 ± 0.02 pmol cel-1,
exponencial tardía 1.04 ± 0.02 pmol cel-1 y estacionaria 0.95 ± 0.26 pmol cel-1. La
concentración total de toxinas paralizantes tuvo una variación de acuerdo con las
distintas fases del ciclo de cultivo; durante la fase de adaptación se obtuvo la mayor
concentración de toxinas, habiendo una disminución en la concentración con la edad
del cultivo. Aunque la mayor variación se da entre la fase de adaptación a la fase
exponencial temprana, se puede observar que hay una disminución menor entre las
siguientes fases (Fig. 12).
Figura 12. Concentración total de toxinas paralizantes (pmol cel-1) durante las fases del ciclo de cultivo de la cepa LC62 de G. catenatum.
7. 2. 3. PCR en tiempo real y número de copias de genes de los dominios sxtA1
y sxtA4.
Los análisis de PCR de tiempo real de los dominios sxtA1 y sxtA4, muestran
que el ciclo umbral; el cual indica que comienza la detección de la flourescencia por
parte del equipo, ocurre entre los 30 y 32 ciclos de amplificación (Tabla V).
44
Las curvas de fusión para cada uno de los dominios muestran dos picos, esto
pudiera indicar la formación de dímeros cuando se llevan a cabo las reacciones de la
amplificación (Figs. 13, 14).
Figura 13. Curva de fusión del PCR en tiempo real del dominio sxtA1.
Figura 14. Curva de fusión del PCR en tiempo real del dominio sxtA4.
El número de copias varió en cada fase del ciclo de cultivo en los dos dominios
analizados. El menor número de copias en el dominio sxtA1 fue durante la fase
exponencial temprana (32.81 copias cel-1), y el mayor durante la fase estacionaria
(75.71 copias cel-1). En contraste el dominio sxtA4 obtuvo el mayor número de copias
durante la fase de adaptación (143 copias cel-1) y el menor durante la fase estacionaria
(74.15 copias cel-1) (Tabla VI).
45
Tabla VI. Ciclo umbral (Ct) del PCR en tiempo real y número de copias cel-1 de los dominios sxtA1 y sxtA4 durante cada una de las fases del ciclo de cultivo de G. catenatum.
dominio Fase ciclo de cultivo Ciclo umbral
Ct
Cel mL-1 No. de copias cel-1
sxtA1 Adaptación 31 837.67 71.81
Exponencial temprana 32 2706.33 32.81
Exponencial tardía 31 4865.33 56.01
Estacionaria 30 5963 75.71
sxtA4 Adaptación 30 837.67 143.93
Exponencial temprana 31 2706.33 102.39
Exponencial tardía 31 4865.33 108.74
Estacionaria 32 5963 74.15
Las curvas estándar para los dos dominios analizados muestran que el cilco
umbral aumentó conforme la concentración de ADN disminuyó. Para los dos dominios
la eficiencia de la reacción se determinó que fue del 99%. Los valores de “b” y “m” se
obtuvieron a partir de las curvas estándar, para el dominio sxtA1 m = -3.77 y b = 20.25,
para el dominio sxtA4 m = -3.77 y b = 20.15 (Figs. 15, 16). Con estos valores se
pudieron obtener las concentraciones de las muestras para poder determinar el
número de copias en cada fase del ciclo cultivo.
46
Figura 15. Curva estándar para el dominio sxtA1. Los valores de ciclo umbral (Ct) para cada una de las diluciones expresadas en Log10.
Figura 16. Curva estándar para el dominio sxtA4. Valores del ciclo umbral (Ct) para cada una de las diluciones expresadas en Log10.
47
El promedio del número de copias de todas las fases del ciclo de cultivo para
cada uno de los dominios revela que el dominio sxtA4 tiene un mayor número de copias
que el dominio sxtA1, en promedio el dominio sxtA4 tiene aproximadamente 110 ± 51
copias cel-1, mientras que el dominio sxtA1 contiene 64 ± 29 copias cel-1 (Fig. 17).
Figura 17. Promedio del número de copias por célula de los dominios sxtA1 y sxtA4 en G. catenatum. Líneas verticales desviación estándar.
7. 3. Relación entre el número de copias y la producción de toxinas
Existe una diferencia respecto a la relación en el número de copias de los
dominios sxtA1 y sxtA4 y la producción de toxinas totales. Los valores de correlación
de spearman calculados (ρ = -0.4, p = 0.79) indican que no existe relación entre el
número de copias del dominio sxtA1 y la concentración de toxinas, ya que la
producción de toxinas disminuye conforme avanza la edad del cultivo, en contraste el
número de copias no presenta esta tendencia. Se puede observar que de la fase de
adaptación hacia la fase exponencial temprana hay una disminución en el número de
copias, pero de esta fase a la fase exponencial tardía hay un incremento en el número
de copias, y esta vuelve a aumentar hacia la fase estacionaria, siendo la fase
estacionaria la que tiene el mayor número de copias cel-1 (Fig. 18).
48
Figura 18. Relación entre el número de copias cel-1 (barras) del dominio sxtA1 y la producción de toxinas pmol cel-1 (línea punteada con rombos), para cada una de las fases del ciclo de cultivo de G. catenatum.
A diferencia del dominio anterior, el dominio sxtA4 parece tener una relación
entre el número de copias y la producción de toxinas. La producción de toxinas
disminuyó con la edad del cultivo; siendo mayor la concentración en la fase de
adaptación y menor en la fase estacionaria, en el mismo sentido el número de copias
disminuyó con la edad del cultivo, aunque se observa un ligero aumento entre la fase
exponencial temprana hacia la fase exponencial tardía, vuelve haber una disminución
de la fase exponencial tardía a la fase estacionaria (Fig. 19). El valor de correlación de
spearman (ρ = 0.8, p = 0.16), indica que hay una correlación positiva entre la
producción de toxinas y el número de copias del dominio sxtA4, sin embargo, esta no
es significativa.
49
Figura 19. Relación entre el número de copias cel-1 (barras) del dominio sxtA4 y la producción de toxinas pmol cel-1 (línea punteada con rombos), para cada una de las fases del ciclo de cultivo de G. catenatum.
7. 4. Identificación de los genes candidatos para la biosíntesis de saxitoxina en
Gymnodinium catenatum a partir del transcriptoma
El número total de secuencias ensambladas del transcriptoma de G. catenatum
fue de 77,499, se hicieron las búsquedas de los genes candidatos para la biosíntesis
de saxitoxina por medio de BLAST, para identificar secuencias homólogas que tuvieran
una misma actividad bioquímica.
De los 23 genes descritos para la biosíntesis de saxitoxina en cianobacterias se
lograron identificar 86 secuencias homólogas candidatos los cuales corresponden a
12 genes, a partir del transcriptoma de G. catenatum (tabla VII). Siete de estos genes
(sxtA, sxtG, sxtU, sxtW, sxtH, sxtT y sxtI) se reconocen como genes núcleo, los cuales
están asociados a alguno de los diez pasos de la biosíntesis de saxitoxina. Dos de los
genes identificados (sxtX, sxtO) están relacionados en la modificación de la saxitoxina
en alguno de sus análogos, y los genes sxtF/M se describen como genes
transportadores. El último gen sxtZ esta descrito como gen regulador.
50
Las proteínas identificadas por medio de BLAST y los dominios conservados
corresponden a los descritos para las cianobacterias. Pero las especies encontradas
con un mejor grado de similitud variaron dependiendo del gen, la mayoría de los genes
estuvieron relacionados con dos especies de dinoflagelados: Alexandrium fundyense
y Symbiodinium microadriaticum. Aunque también se encontró relación con la
cianobacteria Nostoc sp., una Actinobacteria y la bacteria termófila
Thermoactinomyces dagus.
Los genes sxtF y sxtM de acuerdo a las búsquedas en BLAST corresponden a
la misma proteína y por lo tanto al mismo dominio conservado. Lo mismo sucede con
los genes sxtH y sxtT.
De los genes utilizados para el análisis filogenético se lograron identificar ambos
genes, el gen sxtA obtuvo 14 secuencias, las cuales corresponden a la forma larga de
este gen, el cual solamente se encuentra en los dinoflagelados productores de
saxitoxina. El gen sxtG tuvo 4 secuencias y de acuerdo a las búsquedas de BLAST,
se identificó como amidinotransferasa, este gen también solamente va a estar presente
en los dinoflagelados productores de saxitoxina.
Tabla VII. Genes candidatos involucrados en la biosíntesis de saxitoxina presentes en G.catenatum obtenidos a partir del transcriptoma. Número de contigs, top score/valor e del contig mejor valorado, proteína y especie identificada a partir de las búsquedas de BLAST y el dominio conservado para cada gen identificado.
BAPAZ 16 contigs Top score/valor e
Proteína/especie BLAST Dominio Conservado
sxtA 14 357/3e-103 sxtA forma larga/ Alexandrium fundyense
8 amino 7 oxononato sintetasa
sxtF 3 45.8/1e-004 Proteína de extrusión multidrogas y toxina/ Symbiodinium microadriaticum
Superfamilia parecida a MATE Proteína de flujo de salida de multidrogas
sxtM 2 45.8/6e-005 Proteína de extrusión multidrogas y toxina / S. microadriaticum
Superfammilia parecida a MATE Proteína de flujo de salida putativa
sxtG 4 81.3/3e-016 Amidinotransferasa/ A. fundyense
Superfamilia Amidinotransferasa
sxtH 7 85.5/6e-018 2Fe-2S – proteína vinculante/
Dominio Rieske
51
Nostoc sp.
sxtT 7 75.9/1e-014 2Fe-2S – proteína vinculante/ Nostoc sp.
Dominio Rieske
sxtI 11 105/3e-023 Porteína de nodulación NoIO/ S. microadriaticum
Predicted carbamoiltransferasa, familia NodU
sxtU 18 110/1e-027 Oxidoreductasa Actinobacteria bacterium
NADP-dependiente 3—hidroxi ácido deshidrogenasa Superfamilia deshidrogenasa de cadena corta
sxtO 8 164/3e-051 Adenilil-sulfato quinasa/ S. microadriaticum
Superfamilia NK
sxtX 3 91.7/1e-020 Cefalosporina hidroxilasa/ Thermoactinomyces dagus
S-adenosil metionina-deperndiente de metiltransferasa (SAM)
sxtW 4 43.9/7e-006 Fotosistema I centro de hierro - azufre/ S. microadriaticum
Superfamilia Fer4_7
sxtZ 5 75.5/7e-014 Fosfatasa PSR1/ S. microadriaticum
Superfamilia PRK 15347 Histidina quinasa
8. DISCUSIÓN
8. 1. Análisis filogenético y evolución de los genes sxtA y sxtG en los
dinoflagelados
De acuerdo con los datos filogenéticos obtenidos de los genes para la
biosíntesis de saxitoxina (sxtA1, sxtA4 y sxtG), se puede establecer que las secuencias
de G. catenatum se diferencian genéticamente de las de Alexandrium y P. bahamense,
lo que posiblemente nos esté indicando que la THG entre dinoflagelados propuesta
por Orr et al. (2013) no haya ocurrido, sugiriendo posiblemente que G. catenatum
podría haber adquirido los genes por otra vía.
Desde que se realizaron los primeros análisis para establecer las relaciones
filogenéticas de los dinoflagelados, un aspecto de interés fue el hecho que las especies
de dinoflagelados que no están relacionados filogenéticamente; Alexandrium y G.
catenatum, puedan producir toxinas paralizantes. Desde un principio se postularon
52
hipótesis que proponían que posiblemente se haya dado un origen independiente por
medio de un proceso endosimbiótico de las bacterias asociadas a los dinoflagelados,
dándoles la capacidad de producir toxinas, y no por un proceso intrínseco de los
dinoflagelados; dando lugar a dos escenarios, el primero es que haya sido después de
haber divergido de especies no tóxicas, y el otro donde las especies no tóxicas hayan
perdido la capacidad de producir toxinas después de haber divergido de especies
tóxicas (Zardoya et al., 1995; Adachi et al., 1997).
El proceso endosimbiótico que se menciona anteriormente se conoce como la
transferencia horizontal de genes, y se ha demostrado que este mecanismo de
adquisición de nuevo material genético es un proceso común en los eucariotas
unicelulares y ha jugado un papel importante en la evolución de estos organismos
(Andersson, 2005; Keeling & Palmer, 2008).
Se ha descrito que la ingesta de presas por medio de la fagocitosis es el
mecanismo por el cual los eucariotas pueden adquirir genes foráneos (Doolittle, 1998).
De acuerdo con esta premisa, si Alexandrium fuera una presa de G. catenatum, este
le habría transferido los genes, por lo que en la reconstrucción filogenética G.
catenatum estaría incluido dentro del clado de Alexandrium/Pyrodinium. No obstante,
con ambos dominios (sxtA1 y sxtA4) G. catenatum forma un clado bien soportado que
está separado de las otras especies, y esto indicaría que la THG entre ambos
dinoflagelados no haya ocurrido. Además, G. catenatum solo puede alimentarse de
especies pequeñas del fitoplancton <12 µm (Jeong et al., 2005). Tampoco se ha
documentado que G. catenatum se alimente de especies de Alexandrium.
Se ha probado que existe una relación entre G. catenatum y bacterias, las
cuales le ayudan en el crecimiento y la producción de toxinas paralizantes (Bolch et
al., 2011; Albinsson et al., 2014), siendo las proteobacterias la principal comunidad
asociada a esta especie (Green et al., 2004, 2010). De acuerdo con el análisis
filogenético del gen sxtG; el cual codifica para la enzima amidinotransferasa, se
observa que el clado de los dinoflagelados se encuentra asociado a secuencias de
amidinotransferasa de bacterias; tanto proteobacterias, como actinobacterias,
53
quedando como un clado externo las secuencias de los eucariotas utilizadas para el
análisis.
La relación entre los dinoflagelados y las bacterias ha sido un tema ampliamente
estudiado, en el caso de Alexandrium, las α y γ-proteobacteria habitan en la superficie
celular, especialmente sobre la teca (Brinkmeyer et al., 2000; Biegala et al., 2002).
Estas interacciones entre las bacterias y los dinoflagelados pudieran explicar el origen
bacteriano de los genes para la producción de saxitoxina. En bacterias del género
Moraxella aisladas de cultivos de especies de Alexandrium, se ha detectado la
presencia y producción de toxinas paralizantes (Kodama et al., 1990; Gallacher et al.,
1997).
De acuerdo con Hackett et al., (2012) y Orr et al. (2013), la THG ocurrió de
manera independiente en los dinoflagelados y las cianobacterias, los análisis
filogenéticos para los genes sxtA y sxtG, muestran que las cianobacterias en todos los
casos se encuentran formando un clado independiente de los dinoflagelados, con lo
que se puede corroborar las hipótesis planteadas previamente.
Murray et al. (2015) propusieron que la explicación más parsimoniosa para el
origen de los genes para la biosíntesis de saxitoxina en los dinoflagelados fue por
medio de una sola transferencia horizontal en un evento temprano en la evolución de
los dinoflagelados. De acuerdo con los datos filogenéticos, la presencia de parálogos
del dominio sxtA1 en especies que no producen saxitoxina pueden soportar esta
hipótesis.
De acuerdo con la historia evolutiva de los dinoflagelados, el mayor evento de
divergencia y en donde surgieron la mayoría de las formas actuales de dinoflagelados
fue durante la radiación del mesozoico (Fensome et al., 1996). De los dinoflagelados
analizados, se encuentran representados la mayoría de los órdenes de estos
(Peridiniales, Suessiales, Gonyaulacales y Gymnodiniales), además de haberse hecho
la búsqueda del dominio sxtA1 en los géneros Oxyrrhis y Noctiluca; en ambos géneros
no se detectó la presencia del dominio sxtA1. Dado que Oxyrrhis y Noctiluca se
reconocen como dinoflagelados basales y no existe el dominio sxtA1; esto podría
54
indicar que posiblemente la THG pudo haberse dado posterior a la radiación del
mesozoico, y por eso se puede detectar este dominio en varias especies de
dinoflagelados.
El género Alexandrium tiene una historia evolutiva más reciente que el complejo
de microreticulados, el primero se originó alrededor del Cretácico tardío hace 77
millones de años (John et al., 2003), mientras que el segundo, pudo haber
evolucionado alrededor hace 130 millones de años (Bolch, 1999). De acuerdo con
Janouskovec et al. (2016), el orden Gymnodiniales es un grupo polifilético, que se
encuentra en la base de los dinoflagelados núcleo, y dentro de este orden, Karenia
parece ser basal con respecto a Gymnodinium. La presencia de parálogos de sxtA1
en dos especies del orden Gymnodiniales (Karenia brevis y Pelagodinium beii), sugiere
que la THG ocurrió antes de que los órdenes Gymnodiniales y Gonyaulacales
divergieran.
Del análisis del transcriptoma de G. catenatum se pudieron detectar 12 genes
involucrados en la biosíntesis de saxitoxina, de los cuales en seis genes (sxtF/M, sxtI,
sxtO, sxtW, sxtZ) las secuencias se relacionan con el dinoflagelado Symbiodinium
microadriaticum de acuerdo con las búsquedas en BLAST. La presencia de más genes
en por lo menos un dinoflagelado puede apoyar la idea de que un mayor número de
genes hayan sido transferidos. Los demás genes se asociaron con bacterias y
cianobacterias, apoyando una vez más que la hipótesis que la THG se dio de las
bacterias hacia los dinoflagelados.
La presencia de estos genes en especies que ya no producen saxitoxina pudiera
explicarse porque tal vez pueden ser utilizados en alguna otra ruta metabólica de los
dinoflagelados. La mayoría de estos genes solamente cumplen funciones de
transporte, o están relacionados en la modificación de la saxitoxina en alguno de sus
análogos. La pérdida de los genes núcleo para la biosíntesis de saxitoxina explicaría
el por qué no todos los dinoflagelados pueden producir este metabolito secundario. La
presencia de secuencias del gen sxtA1 en especies de Alexandrium que no producen
saxitoxina, también pudiera indicar que los dinoflagelados que no producen toxinas
paralizantes lo estén utilizando para alguna otra función.
55
El proceso de pérdida de genes se puede dar principalmente por dos
mecanismos, por medio de un cambio abrupto mutacional, y segundo por un proceso
lento de acumulación de mutaciones durante la pseudogenización que sigue a una
pérdida de la función del gen (Albalat & Cañestro, 2016). Los dinoflagelados de los
órdenes Peridiniales y Suessiales, son más recientes con respecto a los
Gonyaulacales y los Gymnodiniales. Es posible que durante su evolución fueron
acumulando mutaciones en los genes núcleo para la biosíntesis de saxitoxina y estos
hayan pasado a ser pseudogenes, haciendo que ya no codifiquen para las enzimas
necesarias para la biosíntesis.
En las cianobacterias se ha propuesto que la capacidad de producir toxinas
paralizantes fue adquirida a través de múltiples eventos de THG, dentro de las distintas
especies de cianobacterias productoras de saxitoxina (Kellmann et al., 2008; Moustafa
et al., 2009). Análisis filogenéticos de cepas de cianobacterias muestran una estrecha
relación monofilética entre especies productoras y no productoras de toxinas
paralizantes, sugiriendo que cualquier supuesto evento de pérdida de genes ha
ocurrido relativamente recientemente en el transcurso de su evolución (Murray et al.,
2011).
En todos los trabajos en donde se analizó la presencia de los genes para la
biosíntesis de saxitoxina en dinoflagelados (Stüken et al., 2011, Hackett et al., 2012,
Orr et al., 2013, Murray et al., 2015), se observó que en todas las especies que no
producen este tipo de toxinas se da la ausencia del gen sxtG y del dominio sxtA4, los
cuales son indispensables para la biosíntesis de la saxitoxina. Entonces, si la THG se
dió después de la radiación del mesozoico, hubo la pérdida de la capacidad de producir
toxinas paralizantes en los demás ordenes; especialmente por la pérdida del dominio
sxtA4 y del gen sxtG, presentes solamente en especies productoras de toxinas
paralizantes.
De acuerdo con los datos de cepas de A. tamarense y A. ostenfeldii, en las dos
especies hay cepas que producen saxitoxina y otras que no producen. Se ha visto que
en ambos la presencia del gen sxtA4 es importante para la producción de toxinas, ya
que en las cepas que no producen toxina no se encuentra el dominio (Murray et al.,
56
2012; Suikkanen et al., 2013). Esto apoya la idea de que durante la evolución en ciertas
especies de dinoflagelados se perdió la capacidad de producir las toxinas. Por lo
menos dentro de las especies del género Alexandrium puede ser que todas las
especies se hayan originado a partir de un ancestro tóxico, y con el tiempo fueron
perdiendo la capacidad de producir toxinas paralizantes.
Aunque no existen datos acerca de la presencia de genes para la biosíntesis de
saxitoxina en G. microreticulatum y G. nolleri, es posible que estos organismos hayan
tenido la capacidad de producir saxitoxina, pero que perdieron algunos de los genes
núcleo, y solamente G. catenatum haya mantenido la capacidad de poder producir esta
toxina. Se sabe que G. catenatum es la última especie del complejo de los
microreticulados en haber surgido (Bolch, 1999), siendo posible que G. catenatum
también haya evolucionado a partir de especies que en algún momento fueron tóxicas.
La pérdida de algunos de los genes para la biosíntesis de saxitoxina en los
dinoflagelados, sugiere que durante su evolución los dinoflagelados han perdido la
capacidad de poder producir este tipo de toxinas. Posiblemente más adelante en su
evolución, los dinoflagelados que todavía pueden producir las toxinas paralizantes
puedan perder esta función.
Sin embargo, existe otra posibilidad en la evolución de los dinoflagelados y la
producción de toxinas. Por ejemplo, A. ostenfeldii se caracteriza por poder producir
tres tipos de neurotoxinas: las toxinas paralizantes, los espirólidos y las gymnodiminas
(Cembella et al., 2000; MacKinnon et al., 2006). Aunque la misma cepa no puede
producir toxinas paralizantes, espirólidos y gymnodiminas al mismo tiempo, es
importante ver porque una misma especie puede producir tres tipos de toxinas. Se
puede observar que en el árbol filogenético del dominio sxtA1, secuencias diferentes
de A. ostenfeldii se pueden agrupar junto con las especies productoras de saxitoxina,
así como en el clado de las especies que no producen saxitoxina.
De acuerdo con lo anterior, podría suponerse que los genes que se utilizaban
para la producción de saxitoxina, podrían ser utilizados para la producción de los
espirólidos y gymnodiminas. Sobre todo, el dominio sxtA1, que se encuentra presente
57
en otros géneros y especies que no producen saxitoxina, pero producen otros tipos de
toxinas, por ejemplo, K. brevis es una especie productora de brevetoxinas (Landsberg
et al., 2009), Protoceratium reticulatum, Lingolodinium polyedrum y Gonyaulax
spinifera son especies productoras de yessotoxinas (Paz et al., 2004; Rhodes et al.,
2006). Una característica de la mayoría de las toxinas producidas por microalgas es
que actúan sobre diferentes canales celulares regulados por voltaje (Cestele &
Catterall, 2000; Mattei & Legros, 2014).
8. 2. Perfil y concentración de toxinas paralizantes en G. catenatum
De los 57 análogos de toxinas paralizantes que se han reportado (Wiese et al.,
2010), G. catenatum contiene alrededor de 17 análogos de saxitoxina (Negri et al.,
2001; Cembella & Band-Schmidt, 2018). La cepa LC62 produce solamente diez
análogos, siendo las toxinas N-sulfocarbamoil las que presentan una mayor proporción
con respecto a las demás toxinas, esto corresponde a lo reportado para la mayoría de
las cepas de esta especie (Oshima et al., 1993). Cabe mencionar que en este trabajo
no se buscaron los análogos benzoil.
Algunos trabajos mencionan que el perfil de toxinas puede ser característico
para una región geográfica específica. El perfil de la cepa LC62 está compuesto
principalmente por las toxinas N-sulfocarbamoil B1/2 y C1/2, decarbamoil dcNEO y
dcGTX2/3, y en cantidades muy bajas de las toxinas GTX1/2 y dcSTX. Para cepas del
Golfo de California y de la Bahía de Mazatlán el perfil de toxinas varía de acuerdo con
el medio de cultivo que se esté utilizando, en medio f/2 no se observa la presencia de
dcNEO y GTX 1/2, sin embargo, cuando el cultivo se mantiene en medio GSe se
detectan estas toxinas (Band-Schmidt et al., 2005, 2006; Gárate-Lizárraga et al.,
2005). El perfil de toxinas para la cepa LC62 es similar al perfil de las cepas que crecen
en medio GSe, con la excepción de no presentar las toxinas dcGTX1/4 (Bustillos-
Guzmán et al., 2015). Esto indicaría que las cepas mexicanas presentan un perfil de
toxinas similar; con algunas variaciones, dependiendo del medio de cultivo utilizado.
58
Para las cepas de G. catenatum de costas mexicanas, cuando se compara su
perfil de toxinas con lo reportado para otras regiones geográficas, no existen grandes
variaciones. En todos los casos se observa la presencia dcSTX, dcNEO y con algunas
variaciones entre las GTX y dcGTX, y los análogos N-sulfocarbamoil (C1-4) casi
siempre presentes y siendo los más abundantes (Oshima et al., 1993; Park et al., 2004;
Costa et al., 2015), exceptuando unas cepas de Singapur que carecen de estos
análogos (Holmes et al., 2002). Los datos publicados del perfil de toxinas de G.
catenatum de diferentes regiones muestran un alto grado de relación, con más del 80%
de similitud, mostrando una baja variación fenotípica (Bustillos-Guzmán et al., 2015).
La baja variación fenotípica del perfil de toxinas entre las distintas cepas de G.
catenatum y las bajas variaciones menores al 3% de las secuencias de los dominios
sxtA1 y sxtA4 de las cepas australianas y las cepas mexicanas, soportan la propuesta
de que G. catenatum tuvo una dispersión geográfica relativamente reciente.
Si bien, el perfil de toxinas no cambió durante las diferentes etapas del ciclo de
cultivo, si se observó una modificación en las proporciones de algunos análogos. En
las toxinas C1/2 se presentó un aumento conforme la edad del cultivo avanzaba, al
igual que las B1/2, en contraste la concentración de dcNEO disminuyó de la fase de
adaptación a la fase exponencial temprana. Esto concuerda con lo observado en
trabajos anteriores con cepas mexicanas, donde la concentración del análogo dcNEO
disminuye conforme la edad del cultivo aumenta (Band-Schmidt et al., 2006, 2010).
Las variaciones en las proporciones de los diferentes análogos parecen ser algo
característico de las cepas mexicanas de G. catenatum; sin embargo, es difícil poder
asociar estas variaciones con los genes presentes para la biosíntesis de saxitoxina, ya
que todavía no se sabe con certeza que genes están relacionados con los análogos
que se producen.
En cianobacterias se ha asociado la presencia del gen sxtX a la biosíntesis de
NeoSTX (Mihali et al., 2009). Por otra parte, en el transcriptoma de G. catenatum se
observó la presencia del gen sxtX, sin embargo, en el perfil de toxinas no se detectó
NeoSTX. Posiblemente este mismo gen pueda ser utilizado para la síntesis del
59
análogo dcNEO, pero para poder corroborar esto es necesario hacer un análisis
directamente con este gen.
8. 3. Relación entre el contenido de toxinas paralizantes y el número de copias
de los dominios sxtA1 y sxtA4 en Gymnodinium catenatum.
Una característica de los dinoflagelados es que presentan un genoma grande y
muchas de las familias de genes están presentes en múltiples copias, encontrándose
entre 30-5000 copias por genoma, lo que indica que un alto número de copias de genes
está extendido en los dinoflagelados (Bachvaroff & Place, 2008; Hou & Lin, 2009; Lee
et al., 2014).
En promedio el número de copias presentes en el genoma de G. catenatum fue
de 110 copias cel-1 del dominio sxtA4, siendo en promedio menor a lo reportado para
A. catenella que contiene entre 100 y 280 copias cel-1 (Murray et al., 2011; Stüken et
al., 2011); y mayor que lo reportado para A. minutum y A. ostenfeldii con 1.5-10.8 y 1-
15 copias cel-1 respectivamente (Stüken et al., 2015; Savela et al., 2016). No hay
información acerca del número de copias para el dominio sxtA1 en otros
dinoflagelados, pero en G. catenatum se observó que este es menor comparado con
el dominio sxtA4.
También se puede observar que entre los dinoflagelados productores de toxinas
paralizantes no hay un patrón en el número de copias del dominio sxtA4 presentes
dentro del genoma.
Se ha propuesto que en cepas de A. minutum no existe una relación entre el
número de copias genéticas y el tamaño del genoma (Stüken et al., 2015). Las
especies de A. catenella y A. ostenfeldii tienen un tamaño de genoma similar; 100 pg
cel-1 y 115 pg cel-1, respectivamente (Figueroa et al., 2010), en donde las diferencias
en el número de copias de sxtA4 es diez veces mayor en A. catenella en comparación
con A. ostenfeldii. Dentro de los dinoflagelados el tamaño del genoma presenta una
correlación con el tamaño de la célula (Lin, 2011). El tamaño de G. catenatum varía de
31 a 41 µm de largo y 27 a 33 µm de ancho (Blackburn et al., 1989), mientras que las
60
células de A. catenella varían de 21 a 23.5 µm de largo y 23 a 25 µm de ancho (Kim
et al., 2002). A pesar de que el tamaño del genoma de G. catenatum se desconoce;
se puede asumir que G. catenatum tiene un genoma más grande que A. catenella. En
contraste, el número de copias del dominio sxtA4 en A. catenella es mayor que en G.
catenatum, por lo tanto, se puede asumir que el tamaño del genoma no tiene una
relación con el número de copias de sxtA4 en los dinoflagelados. Estos cambios en el
número de copias dependen de otros factores aún desconocidos (Savela et al., 2016).
De acuerdo a lo propuesto por Murray et al. (2015), donde mencionan que
después de la adquisición de los genes por medio de la THG, ocurrió un proceso de
duplicación de genes. Sin embargo, este proceso de duplicación no fue igual entre los
dinoflagelados que producen toxinas paralizantes cuando los genes fueron adquiridos,
y esta puede ser la razón por la que se pueden observar diferencias en el número de
copias dentro de los dinoflagelados, y además la presión de la selección puede actuar
de diferentes maneras sobre los genes de la producción de saxitoxina.
Otro aspecto importante es la relación entre el número de copias dentro del
genoma y la cantidad de toxina que se está produciendo. Murray et al. (2011),
propusieron que la concentración de toxinas puede estar relacionada con la cantidad
de copias del gen sxtA4 presentes en las células. Pero está relación parece no existir,
por lo menos entre los distintos dinoflagelados que se han analizado, ya que G.
catenatum presenta un mayor contenido de toxinas (500 pg cel-1) con respecto a lo
reportado en la especie de A. catenella de 5 pg cel-1, sin embargo, A. catenella tiene
un mayor número de copias.
En el análisis de muestras de A. minutum se encontró que había una relación
entre el número de copias y la cantidad de toxinas producidas por esta especie (Stüken
et al., 2015). En contraste, los datos de A. ostenfeldii no mostraron una relación entre
el número de copias y la concentración de toxinas (Savela et al., 2016). En ambos
casos, aunque tienen un número de copias reducido, la concentración de toxinas
parece ser similar a las de A. catenella (Murray et al., 2011). Mientras que en G.
catenatum parece que no existe una relación entre la concentración de toxinas y el
número de copias del dominio sxtA4.
61
Entre los dinoflagelados productores de toxinas paralizantes, parece que la
concentración total de toxinas producidas varía entre las diferentes especies. En P.
bahamense se tiene registrado una concentración de 288 fmol cel-1 (Gedaria et al.,
2007), para A. minutum, A. tamarense y A. catenella varían de 19.37, 61, 20 fmol cel-
1, respectivamente (Kim et al., 1993; Stüken et al., 2015) y la concentración de toxinas
obtenidas en G. catenatum fue de 1.54 pmol cel-1 (1540 fmol cel-1). Sería importante
poder determinar el número de copias del gen sxtA4 que están presentes en cada una
de las especies, para así poder tener un panorama más amplio de la relación que hay
entre la concentración de toxina y el número de copias.
En los datos comparados entre la concentración de toxinas y el número de
copias del dominio sxtA4 en G. catenatum, parece que puede haber una relación, ya
que durante las distintas fases de crecimiento del ciclo celular se puede observar que
conforme el número de copias decrece, el contenido de toxinas también disminuye.
Los datos sugieren que la concentración total de toxinas paralizantes se ven
modificadas durante las distintas etapas de crecimiento del ciclo de cultivo. En casi
todos los casos en las especies de dinoflagelados que producen toxinas paralizantes,
conforme el cultivo envejece las concentraciones de toxinas disminuyen (Boczar et al.,
1988; Kim et al., 1993; Gedaria et al., 2007), y esto mismo sucede con la cepa LC62,
las máximas concentraciones se obtienen en la fase de adaptación y estas disminuyen
conforme la edad del cultivo avanza.
Esta relación entre el número de copias y la concentración de toxinas en las
distintas fases del cultivo parece ser solamente una característica de G. catenatum.
Sin embargo, cuando se compara el número de copias del dominio sxtA1 y el contenido
de toxinas en G. catenatum, no hay una relación entre estos dos aspectos. Esto podría
indicar que tal vez este dominio está siendo utilizado para la producción de algún otro
metabolito, o que, tal vez el número de copias de ambos dominios no se vea reflejado
en la producción de toxinas.
Estudios entre la comparación de la concentración de toxinas y la expresión de
los distintos genes para la biosíntesis de saxitoxina dan resultados mezclados. Hay
correlaciones positivas entre el número de copias de sxtA4 de ARNm y la producción
62
de toxinas en muestras de campo (Stüken et al., 2013). Por otro lado, en condiciones
controladas la expresión del gen sxtA4 permanece constante durante las distintas
fases de crecimiento, mientras que la concentración de toxinas varía, al igual que no
hay una relación entre la expresión de sxtA1 y sxtG con el contenido de toxinas en
especies de Alexandrium (Perini et al., 2014; Wiese et al., 2014).
El que no exista una relación entre el número de copias del dominio sxtA4 y la
concentración de toxinas en algunas especies de Alexandrium, podría indicar que un
mecanismo regulador desconocido esté actuando en el control de la producción de las
toxinas paralizantes (Savela et al., 2016). Stüken et al. (2011), mencionan que
probablemente al encontrar variaciones en el número de copias del dominio sxtA4 de
A. catenella en distintas fases del ciclo de cultivo, se podría deber a que, al momento
de tomar las muestras en las distintas fases, se encuentran células en diferentes
momentos de la división celular. Sin embargo, este fenómeno también se ha
observado en el número de copias de genes ribosomales, habiendo una disminución
de copias conforme la edad del cultivo avanzaba (Galluzzi et al., 2010)
Si estas variaciones en el número de copias son reflejo de que, durante cada
fase del cultivo, las células se encuentran en distintas fases de la división celular, sería
conveniente hacer un cultivo sincronizado, para lograr que la mayoría de las células
se encuentren en la misma fase del ciclo celular, y poder hacer las comparaciones
entre la concentración de toxinas, el número de copias de los genes involucrados en
la biosíntesis de saxitoxina, además de determinar la expresión de los genes.
Se ha determinado que la producción de toxinas en Alexandrium se lleva a cabo
durante la fase G1 del ciclo celular, y esta fase se va desarrollar durante la fase
lumínica del ciclo de luz:oscuridad (Taroncher-Oldenburg et al., 1997, 1999). Si la
producción de toxinas se lleva a cabo durante esta fase del ciclo celular, debería de
existir una relación con la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis de la
saxitoxina.
63
8. 4. Identificación de los genes candidatos para la biosíntesis de saxitoxina a
partir del transcriptoma de Gymnodinium catenatum.
De los 23 genes identificados para la biosíntesis de saxitoxina en
cianobacterias, se lograron identificar 12 genes candidatos en G. catenatum. Es
importante resaltar que el método de búsqueda de los genes se llevó a cabo por medio
de la similitud con las secuencias de aminoácidos de las cianobacterias, ya que la
búsqueda utilizando las secuencias de nucleótidos no evidenciaban similitudes entre
las secuencias, por lo que la identificación solo propone a posibles candidatos que
estarían involucrados en la biosíntesis de la saxitoxina. Esto se debe a que las
secuencias de los dinoflagelados y las cianobacterias se han diferenciado lo suficiente
después de haber adquirido los genes cada grupo (Stüken et al., 2011; Orr et al., 2013).
Comparado con los genes reportados para los otros dinoflagelados productores
de toxinas paralizantes (A. catenella, A. fundyense, A. tamarense y A. minutum), en
todos los casos se identificaron 12 genes, no obstante, los genes identificados en G.
catenatum no siempre correspondieron a los genes encontrados en especies de
Alexandrium (Tabla VIII).
Tabla VIII. Cuadro comparativo de la identificación de los genes para la biosíntesis de saxitoxina descritos en las diferentes especies de dinoflagelados (Stüken et al., 2011; Hackett et al., 2012; Zhang et al., 2014).
A. tamarense A. fundyense A. minutum A. catenella G. catenatum
sxtA X X X X X
sxtB X X X X
sxtD X X
sxtF/M X X X X X
sxtG X X X X X
sxtH/T X X X X X
sxtI X X X X X
sxtL X
sxtN X X
sxtR X X
sxtS X X X
64
sxtU X X X X X
sxtW X
sxtX X X X
sxtO X X
sxtZ X X
De los genes núcleo la ausencia del gen sxtB en G. catenatum parece ser
importante, ya que de acuerdo a los análisis de la biosíntesis de saxitoxina este gen
es el que cataliza la tercera reacción de la biosíntesis (Mihali et al., 2009). Esto podría
indicar que la presencia de este gen no tiene que ser fundamental para la biosíntesis
de la saxitoxina, a diferencia de los dos genes que le preceden en la ruta metabólica
(sxtA y sxtG), ya que se ha observado que cuando estos dos genes faltan en los
dinoflagelados, no se puede llevar a cabo la biosíntesis de la saxitoxina. Sin embargo,
con el análisis del transcriptoma de G. catenatum se logró identificar la secuencia
homóloga del gen sxtW, que también es un gen núcleo, y este gen no se había
reportado antes para las demás especies de Alexandrium. De acuerdo con Zhang et
al. (2014), la ausencia de algunos genes núcleo en los dinoflagelados puede deberse
a la pérdida de los genes homólogos y a su sustitución funcional por otros genes.
Además de los genes núcleo, existen los genes que son responsables de la
transformación de la saxitoxina a sus análogos. En las cianobacterias se tienen
identificados por lo menos cuatro genes; sxtX, sxtO, sxtL y sxtN (Wang et al., 2016).
En G. catenatum se identificaron dos de estos; sxtX y sxtO, el último gen es la segunda
vez que se reporta para dinoflagelados, el cual solamente se ha descrito para A.
catenella (Zhang et al., 2014). El gen sxtX se ha asociado a la síntesis de neoSTX
(Mihali et al., 2009), y el gen sxtO se ha relacionado con la producción de las toxinas
C1/2 y con las toxinas GTX2/3 (Cho et al., 2014).
En el perfil de toxinas de G. catenatum en un principio se identificó la presencia
de NeoSTX (Gárate-Lizárraga et al., 2005; Band-Schmidt et al., 2006); no obstante,
tiempo después se corroboró este resultado y se comprobó que el análogo que
produce G. catenatum en realidad es dcNEO (Bustillos-Guzmán et al., 2015). De
acuerdo a los esquemas que proponen en donde actúan los genes para la biosíntesis
65
de saxitoxina en su ruta metabólica (fig. 3) (Mihali et al., 2009; Cho et al., 2014; Zhang
et al., 2014), antes de formarse la molécula de STX, primero se obtiene dcSTX, y
posteriormente se forma la STX por medio de una enzima Carbamiol-tranferasa (sxtI).
En este caso, el gen sxtX podría estar actuando antes de la formación de la STX, por
su función hidroxilasa, ya que dcNEO va a presentar un grupo hidroxilo en el nitrógeno
uno de la molécula de STX.
El perfil de toxinas de P. bahamense se caracteriza por producir pocos
análogos, principalmente STX, neoSTX, B1 y B2 (Usup et al., 2012), en general las
especies del género Alexandrium pueden producir los análogos carbamatados STX,
NeoSTX, GTX1-4, y los N-sulfocarbamoil B1, B2 y C1-C4 (Anderson et al., 2012), y G.
catenatum puede producir alrededor de 17 análogos; entre ellos los N-sulfocarbamoil
(C1-4), carbamoil, GTX1-6, las decarbamoil dcSTX, dcNEO y dcGTX2,3
principalmentes, además de las toxinas benzoil, que solamente son producidas por
esta especies (Negri et al., 2001; Hallegraeff et al., 2012). El perfil de toxinas de las
diferentes especies de Alexandrium y de G. catenatum, son caracteres fenotípicos
fijos, por lo que no se encuentran muchas variaciones en sus perfiles de toxinas
(Anderson et al., 2012; Bustillos-Guzmán et al., 2015).
De los genes núcleo presentes en los dinoflagelados, aunque existen pocas
diferencias, se podría suponer que la biosíntesis de la saxitoxina dentro de los
dinoflagelados es similar. Sin embargo, las variaciones en su perfil, se debe de explicar
con la presencia de los genes como el sxtO y el sxtX; pero, todavía es difícil poder
identificar y asociar a los demás genes para la producción de algún análogo.
La presencia del gen sxtF/M, el cual es identificado como un gen transportador,
se encuentra presente en todos los dinoflagelados, así como en las cianobacterias,
esto indicaría que posiblemente el transporte de las toxinas al exterior de la célula es
igual en los dinoflagelados y en las cianobacterias.
El gen sxtZ, también es la segunda vez que se identifica en los dinoflagelados,
la primera vez que se identifico fue en A. catenella (Zhang et al., 2014). Este gen tiene
una función reguladora en la biosíntesis de la saxitoxina, y se presume que en
66
cianobacterias funciona a un nivel transcripcional (Kellmann et al., 2008). Se ha
propuesto que la biosíntesis de saxitoxina está regulada por un mecanismo post-
transcripcional (Wiese et al., 2014). La presencia de este gen en por lo menos dos
dinoflagelados podría estar indicando que en efecto, un proceso en la transcripción
este regulado la producción de la saxitoxina en los dinoflagelados
Al estar trabajando con transcriptomas de dinoflagelados, se debe tener en
cuenta que solamente se está viendo lo que se está expresando en ese momento
específicamente, y como menciona Stüken et al. (2011) muchas veces no se tiene un
transcriptoma completo, por lo que se podría no tener la información completa.
Además, como se observó, la concentración de los análogos cambia conforme la edad
del cultivo avanza, y esto podría estar reflejando que en ciertos momentos al tomar las
muestras no identificamos un gen especifico, ya que no podría estarse expresando en
ese momento.
9. CONCLUSIONES
La adquisición de los genes para la biosíntesis de saxitoxina en G. catenatum,
no corresponde a la hipótesis propuesta por Orr et al. (2012), donde se menciona que
esta especie adquirió los genes por medio de una THG entre dinoflagelados. Con los
datos obtenidos y dadas las diferencias en las secuencias entre las diferentes especies
productoras de saxitoxina, nos indican que esta transferencia no se llevó a cabo.
Con base en los resultados de las secuencias de los genes sxtA (dominios sxtA1
y sxtA4) y sxtG, el escenario más factible para la adquisición de los genes para la
biosíntesis de saxitoxina en G. catenatum es que se haya dado una transferencia
horizontal de genes (THG) de organismos procariotas; principalmente proteobacterias
y actinobacterias, en la historia temprana de los dinoflagelados, y esta posiblemente
haya sido durante la radiación del mesozoico, momento en el que surgen la mayoría
de los dinoflagelados, y posteriormente a esta transferencia, algunos dinoflagelados
perdieron la capacidad para producir saxitoxina por la pérdida de los genes esenciales
para su biosíntesis. Por lo tanto, G. catenatum pudo haber evolucionado a partir de
67
especies que tenían la capacidad de producir saxitoxina, aunque actualmente es la
única especie dentro del género que puede producir toxinas paralizantes.
De acuerdo a las similitudes de los perfiles de toxinas y la poca variación que
presentan las secuencias de los genes sxtA1, sxtA4 y sxtG en cepas de G. catenatum
aisladas de las costas de México y Australia, se sugiere que esta especie tuvo una
dispersión geográfica reciente.
Contrario a lo propuesto por otros autores, los resultados de este trabajo
muestran que en los dinoflagelados no necesariamente existe una relación entre el
número de copias de los dominios sxtA1 y sxtA4 para la biosíntesis de saxitoxina y el
tamaño del genoma. Además, aunque en G. catenatum parece haber una relación
entre el número de copias del dominio sxtA4 y la concentración de toxinas paralizantes
en las distintas fases del ciclo de cultivo, en las especies de Alexandrium al parecer no
existe esta relación. Sin embargo, es necesario realizar más análisis para corroborar
esta hipótesis.
Aunque se desconoce la ruta metabólica para la biosíntesis de saxitoxina en los
dinoflagelados, de acuerdo a la familia de genes identificados para la biosíntesis de
saxitoxina en las distintas especies, indicaría que la biosíntesis debe de ser igual entre
los dinoflagelados, y similar a la descrita para las cianobacterias. Además, debido a la
presencia del gen regulador, se puede determinar que la producción de la saxitoxina
va a estar regulada por mecanismos transcripcionales.
10. PERSPECTIVAS DE ESTUDIO
A pesar de contar con información acerca de los genes involucrados para la
biosíntesis de saxitoxina, todavía es necesario realizar estudios para poder
comprender como ha sido la evolución de la biosíntesis de saxitoxina en los
organismos productores de esta toxina.
Para poder tener un panorama completo de la biosíntesis de toxinas
paralizantes en los dinoflagelados es necesario contar con la información de la familia
de genes de P. bahamense, y así poder comparar a los dinoflagelados productores de
68
toxinas paralizantes, y ver que genes son compartidos por todos ellos. Además de
detectar la presencia de genes en dinoflagelados pertenecientes al género
Gymnodinium, especialmente en G. nolleri y G. microreticulatum, especies que junto
con G. catenatum forman el grupo de microreticulados.
En complemento con lo anterior, también se necesita realizar un análisis de la
producción de toxinas paralizantes en las bacterias asociadas a los dinoflagelados, y
en otros grupos de proteobacterias y actinobacterias, para identificar si existe la
presencia de los genes involucrados en la biosíntesis de saxitoxina, y así detectar si la
transferencia horizontal de genes fue a partir de un solo grupo de bacterias, o si en la
historia evolutiva de los dinoflagelados y cianobacterias hubieron múltiples
transferencias.
69
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