transplantation de myoblastes ... ... ' 'myotonic dystrophy, the facts ' ', peter harper la dm1 peut

Click here to load reader

Download TRANSPLANTATION DE MYOBLASTES ... ... ' 'Myotonic Dystrophy, The Facts ' ', Peter Harper La DM1 peut

Post on 15-Dec-2020

6 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • SOLENNE CARON

    TRANSPLANTATION DE MYOBLASTES GENETIQUEMENT MODIFIES

    DE PATIENTS ATTEINTS DE DYSTROPHIE

    MYOTONIQUE DANS LE MUSCLE DE SOURIS

    Mémoire présenté

    à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

    dans le cadre du programme de maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire

    pour l'obtention du grade de Maître es Sciences (M. Se.)

    FACULTE DE MEDECINE

    UNIVERSITÉ LAVAL

    QUÉBEC

    Février 2008

    © Solenne Caron, 2008

  • 1

    Résumé

    La dystrophie myotonique est une maladie génétique multisystémique touchant entre

    autre les muscles. Elle est causée par la présence d'un triplet CTG répété en 3'UTR du gène

    de la DMPK. Cette mutation cause notamment la rétention de l'ARNm mutant dans le noyau

    des myoblastes, ce qui conduit à la formation de foci contenant des agglomérats d'ARN et

    de protéines. Notre équipe a développé plusieurs thérapies visant à détruire l'ARNm muté :

    deux ARN interférents, un ribozyme et un ARN antisens.

    Ces thérapies fonctionnent en cultures cellulaires mais leur effet n'avait pas été testé in vivo.

    Mon projet consistait donc en la transplantation de myoblastes "corrigés" dans des muscles

    de souris afin d'observer l'effet des thérapies in vivo.

    Des vecteurs lentiviraux contenant chacun une thérapie ont été générés, puis les lentivirus

    correspondants ont été produits. Les myoblastes ont été infectés, sélectionnés, puis greffés

    dans les tibialis antérieurs de souris SCID (immunodéficientes) préalablement irradiés. Un

    mois après la greffe, les souris ont été sacrifiées et leurs tibialis ont été analysés. Une

    immunohistochimie a été réalisée sur ces coupes avec l'anticorps antidystrophine humaine,

    afin de différencier les fibres musculaires d'origine humaine des fibres murines. La taille des

    fibres corrigées a été comparée à la taille des fibres témoins.

    Les transplantations effectuées n'ont malheureusement pas fonctionné sans doute à cause

    d'une mauvaise injection des myoblastes.

  • 11

    Abstract

    Myotonic Dystrophy is a multisystemic genetic disease affecting muscles amongst other

    organs. It is caused by the présence of a repeated CTG triplet in the 3'UTR of the DMPK

    gène. This mutation is responsible in particular for mRNA rétention in the nucleus, wich

    leads to the formation of RNA foci and protein séquestration. Our team developed several

    thérapies aiming at destroying the mutated RNA : two thérapies are based on shRNAs, one

    is based on the use of ribozymes and another relies on the use of an antisense RNA.

    Thèse thérapies work in cell culture but their effect has not been tested in vivo. The goal of

    my project was to transplant "corrected" myoblasts in mouse muscles in order to observe

    the effect of the thérapies in vivo.

    Lentiviral vectors expressing each therapy were constructed and lentiviruses were then

    produced. Myoblasts were infected and then transplanted in the anterior tibialis of irradiated

    SCID mice. One month after transplantation, mice were sacrificed and their tibialis were

    analysed. An immunohistochemistry was performed using an antibody against human

    dystrophin in order to differentiate between human and murine fibers. The size of corrected

    fibers was compared to the size of normal fibers.

    The transplantation did not succeed, probably due to failed myoblast injections.

  • 111

    Avant-propos

    Je tiens à remercier Dr Jack Puymirat de m'avoir donné la chance d'intégrer son

    laboratoire pour effectuer ma maîtrise de biologie moléculaire et cellulaire.

    Merci aux membres de l'équipe pour avoir participé à l'ambiance du laboratoire, et

    plus particulièrement Marie-Claude Couture pour m'avoir épaulée durant ces deux années,

    aussi bien professionnellement que personnellement, Daniel Beaulieu pour m'avoir aidée

    avec les souris, Danika Laberge pour ses conseils concernant la culture cellulaire, Frédéric

    Hamel, Richard Pelletier, Marzena Woyciechowska, Jean Boulanger et Gilles Doucet pour

    leurs multiples conseils.

    Je tiens également à remercier l'équipe du Dr Jacques P. Tremblay pour leurs

    précieux conseils concernant la transplantation de myoblastes et l'immunohistochimie anti-

    dystrophine, et plus particulièrement Daniel Skuk et Philippe Mills.

  • iv

    Table des matières

    Résumé ii Abstract iii

    Avant-propos iv

    Table des matières v

    Liste des tableaux et figures vii

    Liste des abréviations ix

    Introduction 1

    1. La dystrophie myotonique de type 1 1 1.1. Symptômes 2 1.2. Atteinte musculaire 3 1.3. Atteinte moléculaire 4 1.4. Toxicité de l'ARNm 9

    2. Le muscle 10 2.1. Développement du muscle 13 2.2. Régénération musculaire 14

    3. Approche thérapeutique 15 3.1. Techniques d'approche utilisées 15

    3.1.1. shRNA 15 3.1.2. Ribozyme 17 3.1.3. ARN antisens 19

    3.2. Vecteurs 19 4. Transplantation de myoblastes 20

    Objectifs 22

    Matériel et méthodes 23

    1. Plasmides 23 1.1. Construction des plenti-shDMIO et plenti-shDMBO 23

  • V

    1.2. Construction du plenti-CTGl77 (antisens) 24 1.3. Construction du plenti-RBZ-1 24

    1.4. Construction du plenti-Rbz-mut 24

    2. Production virale 25 2.1. 293T 25

    2.1. Transfection 25 3. Transduction de myoblastes 27

    3.1. Caractéristiques des différentes cellules utilisées 27 3.2. Transduction 27

    4. Transplantation 29 4.1. Type de souris 29 4.2. Irradiation 29 4.3. Greffe 29

    4.3.1. préparation des cellules 29 4.3.2. greffe 30 4.3.3. sacrifice 30

    5. Analyse des résultats 31 5.1. Coupe 31 5.2. Anti-dystrophine 31

    Résultats 32

    1. Greffe n°l 32 1.1. Expérience 32 1.2. Résultat 33

    2. Greffe n°2 33 2.1. Expérience 33 2.2. Résultat 34

    3. Greffe n°3 36 3.1. Expérience 36 3.2. Résultat 37

    Discussion 39

    Références 43

  • VI

    Liste des tableaux et figures

    Tableau 1 : symptômes de la maladie

    Tableau 2 : exemples de maladies à triplets répétés

    Tableau 3. Type de cellules injectées lors de la première greffe

    Tableau 4. Type de cellules injectées lors de la seconde greffe

    Tableau 5. Type de cellules injectées lors de la troisième greffe

    Figure 1. Expansion de nucleotides durant la replication de l'ADN (mitose ou méiose)

    Figure 2. Influence des répétitions CTG sur la cellule musculaire DM1

    Figure 3. Foci nucléaires dans des myotubes DM1

    Figure 4. Organisation du muscle squelettique

    Figure 5. Différentiation de myoblastes en myotubes

    Figure 6. Localisation des sites d'appariement des quatre outils utilisés pour détruire

    l'ARNm de la DMPK

    Figure 7. Interférence à ARN

    Figure 8. Schéma d'un shRNA

    Figure 9. Schéma du ribozyme utilisé contre l'ARNm de la DMPK

    Figure 10. Schéma du lentivirus utilisé

    Figure 11. Devenir du lentivirus dans le myoblaste

    Figure 12. Greffe de cellules du bébé de treize mois (BB13MS)

    Figure 13. Greffe de cellules d'un fœtus atteint de DM1 (ST750) (Skuk, 1999)

    Figure 14. Schéma du lentivirus contenant le shDMIO

    Figure 15. Schéma du lentivirus contenant le shDM130

    Figure 16. Schéma du lentivirus contenant le CTG177 (antisens)

    Figure 17. Schéma du lentivirus contenant le Rbz-1 (Ribozyme)

    Figure 18. Etapes de la transfection de 293T

  • vu

    Figure 19. Etapes de la transduction de myoblastes

    Figure 20. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle humain normal

    Figure 21. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée

    Figure 22. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS

    Figure 23. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée

    Figure 24. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle

    irradié, immunohistochimie n° 1

    Figure 25. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle

    irradié, immunohistochimie n°2

    Figure 26. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle

    non irradié, immunohistochimie n°l

    Figure 27. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle

    non irradié, immunohistochimie n°2

  • Vlll

    Liste des abréviations

    CDM : Congénital Dystrophia Myotonica CUG-BP : CUG Binding Protein

    DM1 : Dystrophie Myotonique de type 1

    DMEM : Dulbeco's Modified Eagle Médium

    DMPK : Dystrophia Myotonica Protein Kinase

    DMSO : DiMethyle SulfOxyde

    FBS : Fetal Bovine Sérum

    GFP : Green Fluorescent Protein

    HBSS : Hank's Balanced Sait Solution

    HeBS : Hep es Buffered Saline

    HIV : Virus d'immunodéficience Humaine

    hnRNP : Heterogenous Nuclear RiboNucleoProtein

    LTR : Long Terminal Repeat

    MBNL : Muscleblind

    miRNA : micro RNA

    SCID : Severe Combinated ImmunoDeficient