TROMBOCITI – ONTOGENEZA I STRUKTURA

Klinički zavod za kemiju

KBC „Sestre milosrdnice „

Biserka Getaldić

Zagreb , 11.11.2017.

POVIJESNIPRAVAC

P.G. Werlhof – osobni liječnik Georga II identificirao Morbus maculosushaemoragicus – opisom ITP

J.J. Lister – prvi upotrijebio akromatski mikroskop

G. Bizzozero – prvi identificirao trombocite kao krvne stanice injihove hemostatske funkcije

F. Brohm – dijagnosticirao trombocitopeniju kao uzrok purpure

P. Kaznelson – student medicine u Pragu dokazao destrukciju trombocita u slezeni; započinje era splenektomije

W.J.Harrington i P.S. Evans – ITP je imunološki poremećaj; započinje era imunosupresiva

Izoliran TPO

Započinje era terapijske upotrebe TPO

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

• 1910. Vrijeme krvarenja DUKE

• 1909. Bojenje razmaza po Wrightu – indirekna metoda broja trombocita po Foni-u

• 1977. Direktne metode Riees Ecker

• 1980.Hematološki analizatori – TROMBOCOUNTER – 1980. S Plus Coulter

• 1982. David Bessman - inverzan odnos broja trombocita i MPV –nomogram

• 1985. Technicon H*1- BROJ TROMBOCITA

• 1989. Coulter STKS

• 2006. Abbe Y. – IPF na analizatorima

Našapovijest

do 1985.direktnametoda RiessEcker

od 1989.automatskobrojenje

3 SPECIFIČNOSTI TROMBOCITA

1.MEGAKARIOPEZA

2.TROMBOPEZA

3. STANIČNA STRUKTURA

Klasični hijerarijski hematopoezni model - bifurkacija

• Produkcija u koštanoj srži iz iste progenitorske stanice kao za eritroidnu i mijeloidnu lozu – CMP/CFU-GEMM

• Bipotencijal MEP (CFU-E/Mgk) konačno dovodi do prekursorskih stanica za razvoj Mgk

• Mgk – prva morfološki moguća identificirana prekursorska stanica trombocita

MEGAKARIOPOEZA – u adekvatnim uvjetima staničnekulture ovaj proces traje tjedan dana

• Mgk progenitorske stanice – porast broja Mgk kao odgovor na hematopoetskecitokine

• Hijerarhijski razvoj kroz stadije BFU-Mgk i CFU-Mgk (razlika u površinskim antigenima i karakteristikama rasta)

• Primitivnija progenitorska st. od BFU-Mgk –megakariocitna st. s visokim proliferativnimpotencijalom (HPPC-Mgk)

• Morfološki male neraspoznatljive st. nalik limfoidnima

• TPO kao glavni humoralni čimbenik regulacije razvoja trombocita

megakariocit

• CFU – Meg je zrelija progenitorska stanica iz koje se razvija 3-50 zrelih megakariocita

• Megakariocit nema proliferacijskoi potencijal već u periodu od 4-10 sati može završiti transformaciju u protrombocite te njihovo sekvencioniranje u trombocite koje ulaze u cirkulaciju ( 4000-10000)

• Megakariociti mogu migrirati u pluća

• 250 000 megakariocita svakodnevno što rezultira sa novo formiranih 1009

trombocita

• za usporedbu -u jednom satu 10 10 eritrocita ; 10⁹ granulocita

• Iz navedenog slijedi da je uski intraindividualni raspon od

• 14-25 X10 9/L u cirkulaciji

trombocit

Laboratorijski uzorak

trombopoeza

MIKROOKOLIŠ HEMATOPEZNIH STANICA U KOŠANOJ SRŽI

TROMBOCITI

ERITOCITI

NEZRELE STANICEMIJELOIDENE LOZE

Trombopoietin

• 1994.izoliran

• Sintetizira se u stromi koštane srži, jetri, slezeni i bubregu

• Referentni interval koncentracije Tpo u serumu je 50-500pg/L, dobiven metodom ELISA.

• U bolesnika s kroničnim zatajenjem funkcije jetre nalaze se vrijednosti ispod donje granice detekcije svih metoda od 20pg/L - usporedba –eritropoietin -3,0-16,6 IU /L- 1985. god

• . Upotreba rekombinantnog humanog Tpo (rhTPO) prije kemoterapije prema kliničkim studijama može smanjiti induciranost trombocitopenije te time i potrebu za transfuzijama trombocitnih pripravaka.

MehanizamTPO

Protrombociti

• Otpuštanje trombocita s krajeva protrombocita slijedi niz nastanaka ruptura citoplazmatskih niti, nakon čega ostaje takozvana „ogoljena jezgra“ megakariocita koja ulazi u proces apoptoze

• Trombociti ulaze u cirkulaciju pri čemu se odmah oko 30 % skladišti u slezeni

• Dijagnostika

1. Protrombocite nije moguće vidjeti svjetlosnim mikroskopijom

2. Formiranje protrombocita i ubrzavanje njihovog fragmentiranja od megakariocita i dalje je predmet istraživanja. Za sada je poznato da je povećanje / ubrzanje stvaranja protrombocita povezano sa povišenim tlakom smicanja

3.Laboratorijski dostupan pokazatelj ubrzane trombopoeze je udjel retikuliranih trombocita

•optička metoda uz fluorescenciju

•fluorokrom: oksazin

•dio fluorescentne analize trb.

•rezultat: %IPF

•(frakcija nezrelih trombocita)

•referentni intervali:

1,0-7,3%

Ultrastruktura trombocita pokazuje nekoliko zona ili regija s definiranom funkcionalnom aktivnosti :

periferna i strukturna zona membranskog sustava

citoplazmatska zona s organelama

granule α i sive granule /dens /

Membranski sustav

• Površina trombocitne plazmatske membrane je glatka osim periodičnih invaginacija koje daju obrise kompleksnoj mreži intramembranskih cijevi koje su propusne do citoplazme i nazivaju se otvoreni kanikularni sustav

• Površina plazmatske membrane ili gilokaliks (često je nazivaju i pahuljasti omotač stanica) znatno je tanja od analognih površinskih slojeva

• Podražava više od 50 kategorija receptora koji sudjeluju u adheziji i inicijalizaciji agregacije vezujući specifične ligande ili agoniste

• Većina receptora poznata je po svojoj elektroforetskoj nomenklaturi

Shematski prikaz dijela glikoproteinskih receptora

Citoskeleton

• Membranski sustav trombocita predstavlja konglomerat lipidnih i proteinskih molekula i naziva se sol - zona ispod koje se nalazi mikrotubularni i filamentni skelet trombocita ili strukturna zona.

• Ova membrana trombocita je odvojena od intrastaničnog sadržaja mikroskopski nevidljivim slojem skeletom trombocita (na slici submembranski filamenti ). Ovaj citoskeleton je proteinska mreža koja pomaže plazmatskoj membrani da održi diskoidni oblik trombocita u mirovanju te omogućava ekstremno brze promjene oblika stanice tijekom aktivacije. Dva BITNA polimerna sustava postoje u megakariocitu: aktin i tubulin

citoskeleton

• Strukturna zona osim otvorenog kanikularnog sustava trombociti imaju i gusti tubularni sustav (eng. DTS-dense tubular system) za koji se pretpostavlja da je analogija endoplazmatskom retikulumu i predominantni je sustav skladištenja kalcija i regulacije koncentracije kalcijevih iona, mjesto sinteze prostaglandina i tromboksana kao i enzima ciklooksigenaze ( samim tim ovaj je sustav izuzetno interesantan u razumijevanju mehanizma djelovanja antiagregacijskihlijekova).

Mikrograf elektronskim mikroskopom

a. Visoko rezolutni mikrograf trombocita smještenog između eritrocita (lijevo) i endotelne stanice (desno). Vidljive organele: mitohondrij, mikrotubuli, jedinstveni profil površine vezane na otvoreni kanikularni sustav, profil gustog tubularnog sustava, poneka α-granula, jedna gusta granula i čestice glikogena.

b. Dijagram trombocita koji prikazuje 4 strukturne zone.

α granule

Ključni proteini u α-granulama Koagulacijski

proteini

Ne-kogulacijski

proteini

Proteini prisutni u citoplazmi trombocita i α-

granulama

Unos endocitozom Fibronektin Albumini

Fibrinogen Imunoglobulini

Sintetizirani u megakariocitu Faktor V -

Trombospondin -

VWF -

Proteini prisutni u α-granulama, ali ne i u

citoplazmi

(sintetizirani u megakariocitu)

Β-tromboglobulin EGF

HMWK Multimerin

PAI-1 PDC1

Plazminogen PDGF

PF4 TGF-β

Inhibitor proteina C VEGF/VPF

Proteini vezani na membranu trombocita

Samo na membrani α-granula P-selektin GMP33

- Osteokalcin

Na plazmatskoj membrani i α-granulama GP IIb-IIIa cap1

GP IV CD9

GP Ib-IX-V PECAM-1

EGF - Endotelni faktor rasta,

GMP - Gvanidinmonofosfat.GP – Glikoprotein,

HMWH – Visoko molekularni kininogen, Ig –Imunoglobulin,PAI-1–Inhibitor aktivatora plazminogena,

PDCI – trombocitni inhibitorkolagenaze,

PDGF – trombocitni faktor rasta

PECAM-1 – trombocitna molekula adhezije na

endotel,PF4 – trombocitni faktor 4,

TGF β – transformirajuči faktor rasta β,

VEGF/VPF – vaskularni endotelni faktor rasta i

faktor permeabilnosti,VWF – von Willebrandov Faktor,

cap1 – protein asociran s adenilciklazom

Guste granule

Molekula Komentar

ADP Nije metabolički, podržava agregaciju trombocita vezanjem na P2Y1 I P2Y12

ADP receptore

ATP Nepoznata funkcija, otpuštanje ATP-a detektirano prilikom aktivacije

trombocita

Serotonin Vazokonstriktor, veže se za endotelne stanice i membranu trombocita

Ca2+ i Mg2+ Važni za aktivaciju trombocita i koagulaciju

ADP – Adenozindifosfat, ATP – Adenozintrifosfat, P2Y1 I P2Y12 – članovi porodice receptora na koje se vežu purini Serotonin

In vitro promjene

•Trajni problem u laboratorijskoj dijagnostici

Prikaz EDTA induciranih promjena- TEM

A) Aktivirani trombociti sa značajnim morfološkim promjenama u membrani –uključujući elongaciju

B) Veliki aktivirani trombocit -potencijalne morfološke promjene u α granulama-priprema za kondenzaciju i fuziju

C) Produžene projekcije trombocita i inicijacija PMP (trombocitne mikročestice) vezikulacije

D) Intaktni aktivirani trombocit s fuzijom stanične membrane i PMP formacijom

E) Projekcija stanične membrane i kondenzacija α organela

F) Trombociti u naprednom stadiju aktivacije –stanična membrana oštećena,PMP-ovi i druge stanične organelesu otpuštene

Prikaz citrat induciranih promjena - TEM

A) Križni presjek normalnog trombocita glatka stanična membrana

-prikaz otvorenog kanalikularnogsustava i α granula

B) Presjek kroz longutidinalnuravninu

D) Normalan trombocit – intaktna stanična membrana i neke stanične organele- α granule, denzova tjelešca i produljene filamente denzovihtjelešaca

E) Normalan trombocit sa depozitom glikogena

F) Trombocit u ranom stadiju aktivacije, promjene stanične membrane

C) Normalan presjek trombocitaOvoreni kanikularni sustav,Mitohondrij, granule i inatknamembarana

PRIMARNA HEMOSTAZA- in vivo

ADHEZIJA

SEKRECIJASEKRECIJA AGREGACIJA

Potencijalno: Trombogram ?!

1. Broj trombocita

2. MPV

3. Trombokrit

4. PDW

5. Trombociti – fluorescencija

6. IPF

7. LPLTF

8. MPC Mean Platelet Component Concentration