Çukurova Ün İvers İtes İ · 2019-05-10 · haemolisis and vancomycin resistant. enterococcus...
TRANSCRIPT
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ Ayşegül KARAKAŞ BEYAZ PEYNİR VE FERMENTE SUCUKLARDAN Enterococcus faecium’un
İZOLASYONU VE TANIMLANMASI
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ADANA, 2005
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BEYAZ PEYNİR VE FERMENTE SUCUKLARDAN Enterococcus
faecium’un İZOLASYONU VE TANIMLANMASI
Ayşegül KARAKAŞ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
Bu tez 30/12/2005 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından
Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir.
İmza............……………… İmza..................................... İmza.................…………
Doç. Zerrin ERGİNKAYA Doç. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR
DANIŞMAN ÜYE ÜYE
Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF.2003.YL.41 • Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
I
ÖZ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BEYAZ PEYNİR VE FERMENTE SUCUKLARDAN Enterococcus
faecium’un İZOLASYONU VE TANIMLANMASI
Ayşegül KARAKAŞ
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
Danışman : Doç. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Yıl : 2005, Sayfa: 69
Jüri : Doç. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Doç. Dr. Hatice KORMAZ GÜVENMEZ
Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR
Bu çalışmada Adana’daki çeşitli marketlerden 20 adet sucuk ve 30 adet peynir örneği toplanarak, Enterococcus faecium izole edilmeye çalışılmıştır. İzole edilen suşlarda, selektif besiyerinde gelişim, gram boyama, katalaz testi, 10 ºC ve 45 ºC sıcaklıkta gelişim ile glikozdan gaz üretimi gibi özellikleri belirlenerek, biyokimyasal özellikleri API 20STREP test kiti ile tespit edilip tanımlanaları yapılmıştır.
Analizler sonunda 20 adet sucuk örneğinden elde edilen izolatlardan 3 tanesinin Enterococcus spp.’ye ait olduğu tespit edilmiştir. Bu izolatlardan 1 tanesi Enterococcus faecium türü olarak tanımlanırken, sucuk örneğindeki sayımların 9.4 x 105 kob/g olduğu tespit edilmiştir. Diğer sucuk izolatlarının bir tanesi Enterococcus durans; diğeri ise Enterococcus avium olarak tanımlanmış ve sayımları sırasıyla 2 x 101 kob/g ve 3 x 103 kob/g olarak tespit edilmiştir.
Peynir örneklerinden elde edilen kültürlerin 3 tanesi Enterococcus faecium olarak tanımlanmıştır. Enterococcus faecium olarak tanımlanan izolatların sayımları ise 2.3x106; 2x101 ve 3x103 kob/g olarak bulunmuştur. Ayrıca peynir örneklerinden 1 tane Enterococcus durans ve 1 tane de Enterococcus avium izole edilmiştir.
Çalışmada ayrıca izole edilen Enterococcus spp.’nin hemoliz varlığı ve vancomycin’e direnç özellikleri araştırılmıştır. Peynir ve sucuk örneklerinden elde edilen Enterococcus durans suşlarında hemoliz varlığı saptanırken diğer suşlarda hemoliz varlığı bulunamamıştır. İzole edilen Enterococcus spp.’nin vancomycin’e dirençleri araştırılmış ve bu suşların vancomycin’e karşı direnç göstermedikleri tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler : Enterococcus faecium, izolasyon, tanımlama, peynir, sucuk
II
ABSTRACT
MSc THESIS
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Enterococcus faecium FROM CHEESES AND FERMENTED SAUSAGES
Ayşegül KARAKAŞ
DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF ÇUKUROVA
Supervisor : Assoc. Prof. Zerrin ERGİNKAYA Year : 2005, Pages: 69 Jury : Assoc. Prof. Zerrin ERGİNKAYA
Assoc. Prof. Hatice KORMAZ GÜVENMEZ Assist. Prof. Işıl VAR
In this study, 20 sausages and 30 cheeses samples were collected from markets in Adana and Enterococcus faecium strains were tried to be isolated from these samples. In isolated strains, growth on selective media, gram dye, catalase test, growth at 10 ºC ve 45 ºC and production gas from glucose were tested. Biochemichal characteristics were determined and they were identified using API 20STREP test kit.
In the study, 3 of islolates that were obtained from 20 sausage samples belonged to Enterococcus spp. One of these isolate was identified as Enterococcus faecium with count of 9.4 x 105 cfu/g. Other sausages isolates were identified as Enterococcus durans with count of 2 x 101 cfu/g; as Enterococcus avium with count of 3 x 103 cfu/g.
3 of isolates obtained from cheese samples were identified as Enterococcus
faecium. These Enterococcus faecium isolates were counted 2.3x106; 2x101 ve 3x103 cfu/g. Also 1 Enterococcus durans strain and Enterococcus avium strain were isolated from cheese samples.
In the study, isolated Enterococcus spp. were searched for precence of haemolysin and vancomycin resistant. These isolates were tested for precence of haemolisis and vancomycin resistant. Enterococcus durans strains which isolated from cheese and sausage samples showed β haemolysin; haemolysin couldn’t find in other strains. Enterococcus spp. isolated in this study tested for vancomycin resistance and it’s found that these strains did not show vancomycin resistant. Vancomycin resistant was found only for Enterococcus faecium 1047387 that was used as referance strain. KeyWords : Enterococcus faecium, isolation, identification, cheese, sausage
III
TEŞEKKÜR
Eğitimim sırasında hep yanımda olduğunu hisstttiren, her konuda bana yol
gösteren, yardımcı olan, yakın ilgisi ile beni her zaman teşvik ve motive eden sevgili
hocam Doç. Dr. ZERRİN ERGİNKAYA’ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmam sırasında ilgi ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Yrd.
Doç. Dr. Işıl VAR, Arş. Gör. Bülent ZORLUGENÇ, Bülent KABAK, Emine
AKSAN’a,
Tüm çalışmalarım süresince her türlü yardımını ve manevi desteğini
gördüğüm sevgili arkadaşım Orhan GÖZEN’e,
Tezim sırasında destek vermekten kaçınmayan ve her zaman yardımcı olan
sevgili arkadaşlarım Naci Erhan YURDAKUL, Cihan ÇELİK’e, sevgili kardeşim
Esra KARAKAŞ’a,
Manevi desteği için Ali ÖNDER’e,
Beni yetiştiren ve yaşamım boyunca bana maddi ve manevi destek veren
sevgili annem Teslime KARAKAŞ ve babam Bekir KARAKAŞ’a teşekkürü borç
bilirim.
IV
İÇİNDEKİLER
ÖZ ................................................................................................................................. I
ABSTRACT.................................................................................................................II
TEŞEKKÜR............................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... IV
SİMGELER VE KISALTMALAR...........................................................................VII
ÇİZELGELER DİZİNİ .............................................................................................. IX
ŞEKİLLER DİZİNİ..................................................................................................... X
RESİMLER DİZİNİ...................................................................................................XI
1. GİRİŞ ....................................................................................................................... 1
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR........................................................................................ 6
2.1. Enterococcus spp.’nin Genel Özellikleri .......................................................... 6
2.2. Enterococcus faecium ....................................................................................... 6
2.2.1. Enterococcus faecium’un Starter Kültür Olarak Kullanılması .................. 7
2.2.2. Enterococcus faecium’un Probiyotik Özellikleri ....................................... 9
2.2.3. Enterococcus faecium’un İndikatör Olarak Kullanılması........................ 10
2.2.4. Enterococcus faecium’un Antimikrobiyel Özellikleri ............................. 11
2.2.5. Enterococcus faecium’un Patojenitesi ..................................................... 13
2.2.6. Enterococcus faecium’un Hemolitik Özellikleri...................................... 13
2.2.7. Enterococcus faecium’un Antibiyotik Direnci......................................... 14
2.3. Enterococcus faecium’un İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar ............... 18
2.3.1. Enterococcus faecium’un Süt Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan
Çalışmalar ................................................................................................ 18
2.3.2. Enterococcus faecium’un Et Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan
Çalışmalar ................................................................................................ 19
2.3.3. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ile İlgili Yapılan Diğer Çalışmalar
.................................................................................................................. 20
2.3.4. Enterococcus faecium’un Starter ve Yardımcı Kültür Olarak Kullanılması
ile İlgili Yapılan Çalışmalar ..................................................................... 20
SAYFA
V
2.3.5. Enterococcus faecium’un Biyokoruyucu Kültür Olarak Kullanılması ile
İlgili Yapılan Çalışmalar .......................................................................... 22
2.3.6. Enterococcus faecium’un Probiyotik Kültür Olarak Kullanılması ile
İlgili Yapılan Çalışmalar .......................................................................... 25
2.3.7. Enterococcus faecium’un Antibiyotik Direnci ve Patojeniteleri İle İlgili
Yapılan Çalışmalar................................................................................... 27
2.3.8. Enterococcus faecium’un Vancomycin Direnci İle İlgili Yapılan
Çalışmalar ................................................................................................ 29
3. MATERYAL VE METOT .................................................................................... 30
3.1. Materyal .......................................................................................................... 30
3.1.1. Referans Suşlar......................................................................................... 30
3.1.2. Besiyerleri ................................................................................................ 30
3.1.3. Kimyasal Maddeler .................................................................................. 30
3.2. Metot ............................................................................................................... 31
3.2.1. Örneklerin Analize Hazırlanması............................................................. 31
3.2.2. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ve Sayımı ..................................... 32
3.2.3. Enterococcus faecium’un Tanımlanması ................................................. 32
3.2.3.1. Tuz Toleransının Belirlenmesi.............................................................. 35
3.2.3.2. Sıcaklık Toleranslarının Belirlenmesi................................................... 35
3.2.3.3. Glikozdan Gaz Üretimi ......................................................................... 35
3.2.3.4. API Testi ............................................................................................... 35
3.2.3.5. Vancomycin Direnç Testi ..................................................................... 37
3.2.3.6. Hemoliz Testi ........................................................................................ 37
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA .................................................... 39
4.1. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ve Tanımlanması................................. 39
4.1.1. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ...................................................... 39
4.2. API Testi ......................................................................................................... 42
4.3. BEA ve KAA Agar Besiyerlerinin Kıyaslanması........................................... 47
4.4. Enterococcus spp.’nin Hemoliz Varlığının Belirlenmesi ............................... 50
VI
4.5. Enterococcus spp.’nin Vancomycin Dirençleri .............................................. 52
5. SONUÇ .................................................................................................................. 53
KAYNAKLAR .......................................................................................................... 55
ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................... 69
VII
SİMGELER VE KISALTMALAR
ADH : Arginin Dihydrolase
AMD : Amidon Acidification
API : Analytical Profile Index
ARA : Arabinose Acidification
ARE : Antibiotic Resistant Enterococci
BEA : Bile Esculin Azide Agar
ESC : Esculin
GRAS : Generally Recognised As Safe
GRE : Glicopeptide Resistant Enterococci
GLYG : Glycogen Acidification
HIP : Hipuric Acid Hydrolisis
INU : Inulin Acidification
ICMSF : International Commission on Microbiological Specifications For
Foods
KAA : Kanamycin Aesculin Azide Agar
kob (cfu) : Koloni Oluşturma Birimi (Colony Forming Unit)
LAB : Laktik Asit Bakterileri
LAC : Lactose Acidification
LAP : Leucine Amino Peptidase
MAN : Mannitol Acidification
MRS : ManRogoSharpe Agar
PAL : Alkaline Phosphatase
PYRA : Pyrarolidonyl Arylamidase
RAF : Raffinose Acidification
RIB : Ribose Acidification
SOR : Sorbitol Acidification
TRE : Trehalose Acidification
TSA (CASO) : Trypticase Soy Agar
VIII
VRE : Vancomycin Resistant Enterococcus
VREF : Vancomycin Resistant Enterococcus faecium
VP : Voger Proskauer
α GAL : α Galoctosidase
β GAL : β Galactosidase
β GUR : β Giucuronidase
β HEM : β Haemolysis
IX
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 3.1. Araştırmada Kullanılan Besiyerleri ve Kullanım Amaçları................... 31
Çizelge 3.2. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis’in Bazı Karakteristikleri
............................................................................................................................ 38
Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları ............ 39
Çizelge 4.2. Tanımlanan Suşlar ................................................................................ 43
Çizelge 4.3. API 20 STREP Test Kiti ile Elde Edilen Biyokimyasal Test Sonuçları 45
Çizelge 4.4. Örneklerden İzole Edilen Enterococcus Türlerinin Sayım Sonuçları.... 47
Çizelge 4.5. β Hemoliz Testi Sonuçları ..................................................................... 51
Çizelge 4.6. Vancomycin Direnç Testi Sonuçları ...................................................... 52
SAYFA
X
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 3.1. Enterococcus faecium’un Tanımlanması................................................... 33
Şekil 3.2. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ve Tanımlanması............................ 34
Şekil 3.3. API 20 Strep Test Sistemi.......................................................................... 36
SAYFA
XI
RESİMLER DİZİNİ
Resim 4.1. Enterococcus faecium (İzolat No: 28) Suşunun API 20STREP ile
Tanımlanması..................................................................................................... 45
Resim 4.2. Enterococcus faecium (İzolat No: 68) Suşunun API 20STREP ile
Tanımlanması..................................................................................................... 46
Resim 4.3. Enterococcus faecium (İzolat No: 69) Suşunun API 20STREP ile
Tanımlanması..................................................................................................... 46
Resim 4.4. Enterococcus faecium (İzolat No: 104) Suşunun API 20STREP ile
Tanımlanması..................................................................................................... 46
Resim 4.5. Enterococcus faecium 1045803 Suşunun KAA Besiyerinde Görünüşü.. 49
Resim 4.6. Enterococcus faecium 1045803 Suşunun BEA Besiyerinde Görünüşü .. 50
1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ
1
1. GİRİŞ
Enterococcus’lar gıda mikrobiyolojisi ve klinik mikrobiyoloji açısından
önemli laktik asit bakterileri arasında yer almaktadır (Franz ve ark., 2003; Klein,
2003). Enterococcus cinsi bakteriler doğada yaygın olarak bulunmakta olup, insan ve
hayvanların gastrointestinal sistemindeki floralarının bir parçasıdırlar. Bu nedenle,
bu bakterilerin primer kaynağı olarak, insan ve sıcak kanlı hayvanların intestinal
yolları gösterilmektedir (Klein ve ark., 1998; Ringo ve Gatesoupe, 1998; Ke ve ark.,
1999, Birollo ve ark., 2001). Ayrıca memeliler, kuşlar, böcekler, sürüngenler ile
hava, su, lağım, toprak, bitki materyalleri ve çiğ materyaller gibi fekal kontamine
olmuş ortamlarda bulunurlar (Lu ve ark., 2002; Doming ve ark., 2003). Bu
kaynakların dışında, deniz ürünleri ve süt ürünleri gibi hayvansal kaynaklı gıdalar,
sebzeler ile fermente gıdalarda da bu mikroorganizmalara rastlanmaktadır (Hayes ve
ark., 2003; Kühn ve ark., 2003).
Enterococcus cinsine ait bakteriler, genelde fekal çevrelerde yoğun olarak
bulunmalarına karşın, gıdalarda üretim aşamalarında hijyenik olmayan koşullar
sonucunda ortaya çıkarlar (Giraffa, 2003; Lukaskova ve Sustackova, 2003). Ayrıca
intestinal ve çevresel kontaminasyonla da süt ve et gibi çiğ gıdalarda kolonize
olabilirler. pH, sıcaklık ve tuza karşı olan dirençleri sayesinde, gıda üretimi sırasında
canlı kalarak son ürünü de kontamine edebilirler. Bu sebeple gıdalarda bulunmaları
kontaminasyonun bir göstergesi olarak kabul edilirken, fermente gıdalarda kötü
üretim koşulları ve kontaminasyon seviyesinin bir göstergesi olarak bilinir (Hugas ve
ark., 2003). Bu özelliklerinden dolayı Enterococcus’ların sularda ve bazı gıda
ürünlerinde hijyen indikatörü olarak kullanılmaktadır (Arizcun ve ark.,1997; Frahm
ve Obst, 2003; Klein, 2003).
Enterococcus cinsi bakteriler, gıdaların normal floralarının da bir parçası
oldukları için, sadece kötü hijyen koşullarının göstergesi değildirler (Giraffa, 2002;
Klein, 2003). Bu bakteriler birçok gıdada doğal olarak bulunan ve çeşitli gıdaların
fermantasyonunda rol oynayan önemli mikroorganizmalardır (Cocconcelli ve ark.,
2003; Guessas ve Kihal, 2004). Özellikle bazı fermente et ürünlerinin ve bazı peynir
çeşitlerinin mikrofloralarının önemli bir kısmını oluştururlar (Giraffa, 2003).
1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ
2
Diğer yandan, Enterococcus cinsi bakterilerin bazıları, et ürünlerinde, şarap
ve meyve sularında bozulma yaparlar (Semedo ve ark., 2003). Bu organizmalar,
sıcaklığa karşı dirençleri sayesinde ile pastörizasyonda canlılıklarını koruyabildikleri
için pişmiş, dilimlenmiş ya da paketlenmiş etlerde çapraz kontaminasyon sonucunda
gelişerek, diğer birçok laktik asit bakterileri gibi bozulma yapan mikroorganizmalar
olarak tanımlanırlar (Hugas ve ark., 2003). Fermente sucuklarda da yüksek sayılarda
bulundukları zaman bozulmaya neden olurlar (Giraffa, 2002).
Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis gıdalardan ve bağırsaklardan
en sık izole edilen, gıda proseslerinde yer alan en önemli türlerdir (De Vuyst ve ark.,
2003; Klein, 2003). Bu iki tür, sucukların fermantasyonu sırasındaki baskın
mikroflorayı oluştururlar (Papamanoli ve ark., 2003). Ayrıca süt ürünleri ve
peynirlerde de yüksek sayılarda bulunurlar (Giraffa ve Sisto, 1997; Gelsomino ve
ark., 2001; Vancanneyt ve ark., 2002).
Her iki tür de peynir ve fermente süt ürünleri ile sucuk, salam gibi fermente
gıdaların üretiminde, organoleptik özellikleri geliştiren, raf ömrünü ve stabilitesini
arttıran doğal starter kültürlerdir (De Vuyst, 2000; Eaton ve Gasson, 2002; Ross ve
ark., 2002; Vancanneyt ve ark., 2002; Linaje ve ark., 2004). Ayrıca, E. faecium ve E.
faecalis karışık kültür ya da yardımcı kültürler olarak da kullanılırlar (Gelsomino ve
ark., 2001). Bu bakteriler proteolitik ve lipolitik aktiviteleri sayesinde bazı
peynirlerin olgunlaştırılmalarında önemli rol oynarlar (Sarantinopoulos ve ark.,
2001). Enterococcus faecium, Akdeniz ülkelerinde üretilen Feta, Mozerella, La
Serena ve Comte gibi peynirlerde doğal floralarının bir parçasıdırlar (Gelsomino ve
ark., 2001; Sarantinopoulos ve ark., 2002).
Enterococcus faecium; Listeria, Clostridium, Bacillus, Staphylococcus
cinsine ait bazı patojen türleri inhibe edebilen ya da öldürebilen enterocin adı verilen
bakteriyosinleri üretmektedir (Tarelli ve ark., 1994; Yıldırım ve Yıldırım, 2000).
Bakteriyosinlerin gıdalarda istenmeyen mikroorganizmaların kontrol altına
alınmasında önemli rol oynadığı düşünülmektedir (O’Keeffe ve ark., 1999).
Enterococcus cinsine ait bazı bakterilerin insanlar ve hayvanlar için
probiyotik özellik taşıdığı ve gıdalarda probiyotik olarak kullanım alanı buldukları
bildirilmektedir (Çakır ve ark., 2002; Eaton ve Gasson, 2002; Karahan ve Çakmakçı,
1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ
3
2002; Kühn ve ark., 2003; Papamanoli ve ark., 2003; Yaman ve Esendal, 2004).
Günümüzde Enterococcus cinsi bakteriler hayvan beslenmesinin yanı sıra insanlar
tarafından kullanılan probiyotik özellikli bazı farmasetik ürünlere ilave edilmektedir
(Klein ve ark., 1998).
Enterococcus faecium, bakteriyosin üretimi ve probiyotik özellikleri
nedeniyle biyoteknolojik uygulamalar bulmasına rağmen, diğer taraftan bu
bakterilerin birçok enfeksiyona neden olan fırsatçı patojenler oldukları da
bildirilmektedir (Giraffa ve Sisto, 1997; Birollo ve ark., 2001; Ahmad ve ark., 2002;
Eaton ve Gasson, 2002; Cocconcelli ve ark., 2003; Lund, 2003). Bu organizmalar
endocartitis, üriner yol enfeksiyonları ile merkezi sinir sistemi ve solunum yollarında
enfeksiyonlara neden olurlar (Vancanneyt ve ark., 2002; Gelsomino ve ark., 2003).
Ayrıca, karın, safra yolu ve yanık ve kesiklerde enfeksiyon yapabilirler (Doming ve
ark., 2003; Peters ve ark., 2003).
Enterococcus’lar düşük virulans faktör göstermelerine ve yüksek patojenik
organizmalar olarak adlandırılmamalarına rağmen, önemli patojenler arasında
gösterilmektedir (Lu ve ark., 2002) Enterococcus’ların antimikrobiyel ajanlara olan
dirençleri bu bakterileri fırsatçı patojenlere dönüştürmektedir (Hammes ve Hertel,
2001). Düşük virulans özelliklerine sahip olsalar bile, virulans özellikleri ve
antibiyotiklere karşı dirençleri birleştiğinde tedavileri zor olmaktadır (Lund ve ark.,
2002).
Glikopeptide dirençli Enterococcus’ların sayısının artmasıyla birlikte bu
türler dünya çapında önemli bir problem olarak ortaya çıkmaktadır (Ke ve ark.,
1999). Glikopeptidler immun sistemi zayıf ya da bastırılmış bireylerde birkaç
enfeksiyona karşı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir. Günümüzde
Enterococcus cinsi bakteriler Amerika’da ikinci en sık hastane enfeksiyonu yapan
bakteri olarak bildirilmektedir (Klein, 2003). Enfeksiyona neden olan Enterococcus
cinsi bakteriler arasında en sık izole edilen türler Enterecoccus faecalis ve
Enterecoccus faecium’dur (Salminen ve ark., 1998; Lund ve ark., 2002).
Enterococcus enfeksiyonlarda klinik izolatların % 85’ini Enterococcus faecalis, %
10’unu ise Enterococcus faecium oluşturmaktadır (Lu ve ark., 2002; Hammes ve
Hertel, 2001). Meydana gelen enfeksiyonlarda, Enterococcus faecium,
1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ
4
antibiyotiklere karşı Enterococcus faecalis’ten daha dirençli olmasıyla dikkat
çekmekte ve patojenik Enterococcus faecium’un çok çabuk antibiyotik direnç
mekanizması geliştirebilmesinin ve bu özelliğini transfer edebilme kabiliyetinin
sağlık açısından önemli bir risk olduğu düşünülmektedir (Lund ve ark., 2002;
Rinkinen ve ark., 2003).
Bunun dışında Enterococcus spp.’nin biyojen amin üretimi ile gıda
intoksikasyonlarına neden olabilecekleri düşünülmektedir (Durlu-Özkaya ve Tunail,
2000; Giraffa, 2002; Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002).
Enterococcus’lar yılardır probiyotik ve starter kültür olarak güvenli bir
şekilde kullanılmıştır (Eaton ve Gasson, 2001). Gıda kaynaklı Enterococcus’lar
günümüze kadar herhangi bir klinik enfeksiyona neden olmamıştır. Ayrıca şimdiye
kadar herhangi bir probiyotik Enterococcus enfeksiyonu rapor edilmemiştir
(Rinkinen ve ark., 2003). Ancak bazı gıda hijyenistleri Enterococcus cinsi
bakterilerin gıdalarda bulunmasından endişe etmektedir. Çünkü bu
mkroorganizmalar henüz GRAS (generally recognised as safe) yani güvenilir olarak
kabul edilmemişlerdir (Giraffa ve ark., 2000; Gelsomino ve ark., 2001).
Enterococcus cinsi bakterilerin klinik olaylara neden olması sebebiyle, bu
bakterilerin gıda fermantasyonlarında ve probiyotik olarak kullanılmaları günümüzde
sorgulanmaktadır (Vancanneyt ve ark., 2002).
Enterococcus faecium genellikle gıdalarda bulunan zararsız
mikroorganizmalar iken, hastane enfeksiyonları yapan bakteriler olarak karşımıza
çıkmaktadır. Bu nedenle bu organizmaların gıda mikrobiyolojisinde ve gıda
proseslerinde kontrolü önem taşımaktadır.
Bu araştırmada, farklı firmalar tarafından üretilen sucuk ve beyaz peynir
örneklerinde Enterococcus faecium’un varlığını belirlemek amacı ile izolasyon ve
tanımlama yapılmıştır. Ayrıca gıdalardan izole edilen Enterococcus spp.’nin
vancomycin dirençleri ve hemoliz özellkleri araştırılarak, klinik kökenli
Enterococcus spp. ile karşılaştırılmıştır. Bu çalışmanın sucuk ve peynir gibi
gıdalardan izole edilen Enterococcus türlerinin virulans özellikleri araştırılarak insan
sağlığı için bir tehtid oluşturup oluşturmadığının değerlendirilmesi ve bu türlerin
1. GİRİŞ Ayşegül KARAKAŞ
5
probiyotik ya da starter kültür olarak gıdalarda kullanım alanı bulup bulamayacağına
dair yapılacak araştırmalar için kaynak olabileceği düşünülmektedir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
6
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
2.1. Enterococcus spp.’nin Genel Özellikleri
Enterococcus spp., taksonomide 1984 yılından önce Streptococcus cinsi
altında yer almaktaydı. 1989’dan sonra Thiercelin tarafından bu cinsin ilk
tanımlaması yapılmış ve 1993 yılında Thiercelin ve Jouhaud tarafından Enterococcus
olarak tanımlanmıştır. Daha önce Streptococcus faecalis ve Streptococcus faecium
olarak bilinen bakteriler, yeni sınıflandırmada Enterococcus faecalis ve
Enterococcus faecium olarak adlandırılmıştır (Doming ve ark., 2003; Klein, 2003).
Enterococcus cinsine ait bakteriler, aerobik ya da fakültatif anaerobik, katalaz
(-), kok şeklindedirler (Gelsomino ve ark., 2001). Sıvı besiyerlerinde
0,6-2,0 x 0,6-2,5 mm çiftli ya da zincir şeklinde olup, endospor oluşturmazlar. Besin
gereksinimleri komplekstir (Holt ve ark., 1994). Gelişebilmeleri için gerek B
vitaminleri ve gerekse bazı temel amino asitler açısından pek çok gram (+)
bakteriden daha fazla besin maddesine gereksinim duyarlar (Hayaloğlu ve
Erginkaya, 2001). Bu bakteriler Lancefield D grubu içinde yer almaktadırlar
(Giraffa, 2003). Laktozu fermente edebilirler, arabinoz pozitif ve pürivat negatiftirler
(Willey ve ark., 1999). Karbonhidratları fermente ederek L (+) laktik asit oluştururlar
ve bu özelliklerinden dolayı tipik homofermentatif laktik asit bakterileri olarak
bilinirler, ancak gaz oluşturmazlar (Klein ve ark., 1998; De Vuyst, 2000; Doming ve
ark., 2003; Linaje ve ark., 2004). Karbonhidrat metabolizmaları için Embden-
Mayerof-Parnas yolunu kullanırlar (Morgen ve Hill, 2002).
2.2. Enterococcus faecium
Enterococcus faecium’un belirgin bir kaynağı olmayıp, değişik kaynaklarda
bulunurlar. Bu bakteriler lağım, hayvansal atıklar, toprak, yüzey suları, bitki ve
sebzelerde bulunmaktadır (Marekova ve ark., 2003). Bu bakteriler birçok gıdada,
özellikle de hayvansal orijinli gıdalarda bulunmaktadır. Enterococcus faecium
fermente gıdalardan sıklıkla izole edilmektedir (Bodil, 2003; Klein, 2003).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
7
Enterococcus faecium enzim aktiviteleri ile primer ve sekonder metabolitler
oluşturarak, peynirlerin aromasına katkıda bulunmaktadır (Giraffa, 2003).
Enterococcus faecium, asidifikasyon, proteoliz, sitrattan yararlanma, uçucu aromatik
bileşikler üretme gibi fonksiyonel özelliklere sahip olması nedeniyle, bir çok
geleneksel fermente gıdanın tat, koku ve aromasında önemli rol oynamaktadırlar. Bu
nedenle de bazı gıdaların fermantasyonunda duyusal özellikleri arttırmak amacıyla
da kullanılmaktadır (De Vuyst, 2000; Cocconcelli ve ark., 2003).
Ayrıca Enterococcus faecium insanlarda ve hayvanlarda intestinal
mikrofloranın dengesini korumak amacıyla probiyotik olarak kullanılmaktadır (Eaton
ve Gasson, 2001; Strompfova, 2004).
Tüm yararlarına rağmen pastörize süt ve seçilen laktik starter kültürlerle
yapılan taze yumuşak endüstriyel peynirlerin yüksek derecede Enterococcus faecium
ile kontaminasyonu, peynir üretimindeki olumsuz hijyenik koşullar nedeniyle,
ürünlerin duyusal özelliklerinin bozulmasına neden olabilir. Bu nedenle de bu tip
peynirlerde Enterococcus’ların bulunması istenmez (Giraffa, 2003).
Enterococcus faecium, et ve et ürünleri gibi sözkonusu ürünlerde, gıdalarda
sıcaklık, pH ve tuza karşı dirençli olmaları nedeniyle sayıları yüksek düzeylere
çıkabilmekte ve bozulma yapabilmektedirler (Callewaert ve ark., 2000). Bu yüzden
fermente olmayan etlerde bozulmayı önlemek amacıyla bu bakterilerin inhibe
edilmeleri gerekmektedir. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis’in
pastörizasyon uygulanan konserve domuz etlerinde bozulma yaptıkları
bildirilmektedir (Giraffa, 2002).
2.2.1. Enterococcus faecium’un Starter Kültür Olarak Kullanılması
Bu bakteriler peynir ve et ürünlerinin üretiminde normal florada bulunması
nedeni ile özellikle ev yapımı birçok peynir üretiminde doğal süt starter kültürleri
arasında yer almaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2001; Ross ve ark., 2002; Giraffa,
2003; Saavedra ve ark.,2003). Peynirlerde Enterococcus faecium bulunması, bu
ürünlerde organoleptik karakteristiklerin ortaya çıkmasına yardımcı olmaktadır
(Sarantinopoulos ve ark., 2002).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
8
Enterococcus faecium Akdeniz ülkelerinde geleneksel peynirlerin üretimi
sırasında kulanılmaktadırlar. Asetaldehit, aseton, diasetil gibi tipik flavor bileşikleri
üreterek istenen aromanın kazandırılmasına ya da duyusal özelliklerin
geliştirilmesine katkıda bulunurlar (El-Din ve ark., 2002; De Vuyst ve ark., 2003).
Enterococcus faecium proteolitik enzim üretimi ile peynir üretiminde
kazeinin parçalanmasını sağlamaktadır. Ayrıca, peynir yapımı sırasındaki faydalı
etkilerinden biri de esterazlarla süt yağını hidrolize etmeleridir (El-Din ve ark.,
2002).
Enterococcus faecium, peynirlerde aromanın gelişimine katkıda
bulunmalarının yanı sıra, peynir kalitesinin arttırılmasında da önem taşırlar
(Sarantinopoulos ve ark., 2001; Hugas ve ark., 2003; Saavedra ve ark., 2003).
Özellikle Kuzey ve Güney Avrupa ülkelerinde çiğ veya pastörize sütten
üretilen peynirlerde Enterococcus faecium doğal starter süt kültürü olarak bulunurlar.
Geleneksel bu peynirler, iyi kaliteli çiğ sütlerin pastörize edilip, 42-44 ºC’de 12-15
saat inkübe edilerek Enterococcus faecium’un doğal seleksiyonunun
gerçekleştirilmesi ile üretilmektedir (Giraffa, 2003). Portekiz, İspanya, İtalya ve
Yunanistan gibi Avrupa ülkelerinde çiğ ya da pastörize sütten üretilen çeşitli
geleneksel peynirlerden birçok Enterococcus faecium suşu izole edilmiştir (Devriese
ve Pot, 1995; El-Din ve ark., 2002; Gelsomino ve ark., 2003; De Vuyst ve ark.,
2003).
Enterococcus faecium, geleneksel yöntemle üretilen Mozzarella peynirlerinin
yapımında starter kültür olarak kullanılan ve bu peynirlerden izole edilen önemli
türdür (El-Din ve ark., 2002). Feta peynirlerinin üretiminde de Enterococcus faecium
ve Enterococcus durans baskın laktik mikroflora olarak starter kültürleri
oluşturmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002).
Çalışmalar Enterococcus faecium’un Manchego, Armada, Picante, Majoero,
Teleme, Monte Veronese, Fontin, Kefalotyri, Caprino, Serra, Vecano ve Comte gibi
geleneksel peynirlerin üretimi ve olgunlaştırılmalarında yüksek sayılarda bulunarak,
ürün özelliklerini olumlu yönde etkilediğini ve bu peynirlerde starter kültürler olarak
kullanılabileceğini ortaya koymuştur (Sarantinopoulos ve ark., 2002).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
9
Enterococcus faecium Cebreiro peynirlerinin yapımında starter kültürler
olarak kullanılmaktadır. Mozerella peynirlerinin üretiminde ise Enterococcus
faecalis, diğer LAB’leri ile birlikte starter kültürlerin hazırlanmasında
kullanılmaktadır (Franz ve ark., 1999).
Enterococcus faecium K77D suşu fermente süt ürünlerinde starter kültür
olarak kullanılmasının İngiltere’de ACNFP (Advisory Committee on Novel Foods
and Proceses) tarafından tavsiye edilmektedir (El-Din ve ark., 2002).
Enterococcus faecium yardımcı kültürler olarak da kullanılmaktadır.
Enterococcus faecium türlerinin yardımcı kültürleri olarak kullanılma nedeni,
peynirin olgunlaştırılmasını hızlandırmak, istenen tadı elde etmek ya da probiyotik
özelliklerinden yararlanmak şeklinde ifade edilmektedir (Giraffa, 2003).
Akdeniz ülkelerinde birçok küçük işletmelerde, çiftlik ve yerel kasaplarda,
geleneksel veya ev yapımı fermente et ürünlerinin üretimi, starter kültürler
kullanılmadan, doğal floraya bağlı olarak gerçekleştirilmektedir. Ev yapımı bu
ürünler yüksek pH’ya sahip olmaları nedeniyle, Enterococcus’lar için iyi bir gelişme
ortamı sağlamaktadır. Böylece Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu
ürünlerin fermantasyonu süresince yüksek sayılarda bulunabilmekte ve
fermantasyona katkıda bulunmaktadır. Doğal yolla üretilen bu ürünler birçok ülkede
eskiden beri beğenilerek tüketilmektedir (Hugas ve ark., 2003).
Enterococcus faecium’un fermente et ürünlerindeki rolleri ve sucuklardaki
biyokimyasal aktiviteleri ilgili bazı araştırmalarda, Enterococcus faecium’un sucuk
aromasına glikolitik, proteolitik ve lipolitik aktiviteleri ile katkıda bulundukları ifade
edilmiştir. Ayrıca taze etlerde kırmızı renk oluşumunu sağlayan metyoglobinin
indirgenme reaksiyonlarında da rol aldığı bildirilmektedir (Hugas ve ark., 2003).
2.2.2. Enterococcus faecium’un Probiyotik Özellikleri
Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium’un bazı suşları probiyotik
olarak kullanılmaktadır (Devriese ve ark., 1995; Klein ve ark., 1998; Hammes ve
Hertel, 2001; İnanç, 2005). Enterococcus faecalis sadece hayvanlarda probiyotik
olarak kullanılırken, Enterococcus faecium hem insanlarda, hem de çiftlik
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
10
hayvanlarında probiyotik olarak kullanılmaktadır (Semedo ve ark., 2003; Bozkurt ve
Aslım, 2004).
Enterococcus faecium türleri çiftliklerde hayvanların gelişiminde ve
hastalıkların önlenmesinde ve hayvan yemi üretiminde probiyotik olarak
kullanılmaktadır (Devriese ve ark., 1995; Çakır ve ark., 2002). Hayvan
yetiştiriciliğinde bu bakterilerin probiyotik olarak kullanılması hem hastalıklara karşı
direncin, hem de hayvanların gelişiminin arttırılmasında pozitif sonuçlar
vermektedir. Ayrıca ürettikleri ve diğer bakterilerin gelişmesini inhibe eden
bileşikleri sayesinde intestinal kas tabakasında hızla çoğalarak patojenik bakterilere
karşı ilk savunma tabakasını oluşturmaktadırlar (Yaman ve Esendal, 2004).
Enterococcus faecium, hayvan beslenmesinde antibiyotiklerin kullanılmasına
alternatif olarak gösterilmektedir (Hammes ve Hertel, 2001).
Enterococcus faecium’un ticari probiyotik preparatları bulunmaktadır
(Sanders, 1999; Cocconcelli ve ark., 2003). Bu bakterilerin hayvanlarda ve
insanlarda probiyotik olarak gastroenteritisin tedavisinde ve mikrobiyal dengenin
korunmasına katkıda bulunduğu bildirilmektedir (Hugas ve ark., 2003).
Enterococcus faecium’un immun sisteminin güçlendirilmesi, kanser ve diyarenin
önlenmesi gibi olumlu etkileri olduğu tespit edilmiştir (Rinkinen ve ark., 2003;
Temmerman ve ark., 2003). Son yıllarda Enterococcus faecium 68 (SF68) içeren
preparatların akut enteritis, turist diyaresi ve diğer bağırsak bozukluklarına karşı
kullanıldığı rapor edilmiştir. (Papamanoli ve ark., 2003; Linaje ve ark., 2004).
2.2.3. Enterococcus faecium’un İndikatör Olarak Kullanılması
Enterococcus faecium gıdalarda starter kültür ve probiyotik olarak
kullanıldıkları gibi, gıda kontaminantları olarak da karşımıza çıkmaktadır (Eaton ve
Gasson, 2001). İlk olarak fekal çevrelerde fark edildikleri için fekal
kontaminasyonun indikatörleri olarak tanımlanırlar (Gelsemino ve ark., 2001;
Samakupa ve ark., 2003) ve içme sularında hijyenin ve fekal kontaminasyonun
indikatörü olarak kullanılırlar (Arizcun ve ark., 1997; Frahm ve Obst, 2003; Kühn
ve ark., 2003).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
11
Enterococcus faecium intestinal ve çevresel kontaminasyonla et ve süt
ürünleri gibi hayvansal orijinli gıdalarda kolonize olmaktadır. Enterococcus
faecium’un aside olan toleransı ve indikatör olarak kullanılan koliformların aside
karşı bu bakterilerden daha hassas olmaları nedeniyle Enterococcus faecium’un
gıdaların üretimi sırasında yetersiz hijyenik uygulamaların ve kontaminasyon
seviyesinin tespitinde daha iyi sonuç vereceği bildirilmektedir (Birollo ve ark., 2001;
Mannu ve ark., 2003). Bu organizmalar, gıda üretimi ile gıdaların dondurulması
aşamalarında ve işletmelerde yetersiz sanitasyonu göstermede önemli indikatörler
olarak kullanılmaktadırlar (Karapınar, 1995; Giraffa, 2002; Doming ve ark., 2003).
Enterococcus spp.’nin indikatör olarak kullanımları sınırlı olmakla birlikte,
bazı gıdalarda belirli sayıların üzerinde bulunmaları sanitasyon koşullarının
yetersizliğinin göstergesi olarak kullanılmaktadır. Ancak ICMSF komisyonu
Enterococcus’lar için herhangi bir mikrobiyolojik limit önermemiştir (Karapınar,
1995).
2.2.4. Enterococcus faecium’un Antimikrobiyel Özellikleri
Son yıllarda gıdaların raf ömrünü uzatmak, gıda güvenliğini sağlamak
amacıyla daha az kimyasal madde kullanımı ve minimum proses görmüş gıda elde
etmeye eğilim vardır. Yeşil teknoloji adı verilen bu uygulamalar için bakteriyosin
gibi mikrobiyel metabolitlerin kullanılmasının yeni bir biyokoruyucu yöntem
olabileceği belirtilmektedir (Ross ve ark., 2002).
Enterococcus faecium, Listeria, Clostridium, Bacillus, Staphylococcus
cinsine ait bazı patojen bakterileri inhibe edebilen ya da öldürebilen enterocin adı
verilen bakteriyosinleri üretmektedir (Callewaert ve ark., 2000; Hammes ve Hertel,
2001). Enterocin’ler gram pozitif bakterilere karşı aktif olmalarına rağmen, bu
bileşiklerin gram negatif Vibrio cholerae’ya karşı antibakteriyel etkisi olduğu
belirlenmiştir (O’Keeffe ve ark, 1999). Enterococcus faecium belirtilen bu inhibisyon
etkisinden dolayı, gıda endüstrisinde bozulma yapan ya da gıda kaynaklı patojen
bakterilere karşı gıdaların raf ömrünü uzatmakta ve güvenliğini sağlamaktadır (Leroy
ve ark., 2003; Strompfova ve ark., 2003; Linaje ve ark., 2004).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
12
Entecoccus faecium ve Enterococus faecalis suşlarının ürettikleri
enterocin’ler, diğer bakteriyosinlere göre daha iyi fizikokimyasal özellik ve
biyolojik aktivite gösterdikleri için, teknolojik potansiyel taşıyan bakteriyosinlerdir
(Ennahar ve ark., 2001; Park ve ark., 2003; Moreno ve ark., 2003). Bu bileşiklerin
gelecekte tarımda ve endüstriyel atıkların değerlendirilmesinde de kullanım alanı
bulabileceği düşünülmektedir (Marekova ve ark., 2003). Ayrıca biyomedikal
uygulamalar, bu bileşiklerin ineklerde mastitis tedavisinde kullanılabileceklerini
göstermektedir (Strompfova ve ark., 2003).
Bakteriyosin üreten Enterococcus faecium’ un aynı zamanda iyi bir rekabetçi
olması da bu organizmanın teknolojik açıdan önemini artırmaktadır. Bu özellikleri
nedeniyle Enterococcus faecium gıda fermantasyonlarında starter ya da karışık
kültürler olarak kullanım alanı bulmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002). Yakın
zamanda yapılan çalışmalar, bakteriyosin üreten suşların starter kültür olarak
kullanımları soğutulmuş ve fermente gıdaların muhafazasında yoğunlaşmıştır
(Bayizit ve Yılsay, 2000).
Bakteriyosinlerin teknolojik uygulamaları, peynir üretimi sırasında
bakteriyosin üreten suşların peynirlere ikinci bir kültür ya da koruyucu bir kültür
veya probiyotik kültürler olarak eklenmesi şeklindedir. Enterococcus faecium
türlerinin ikinci starter kültür olarak mikroorganizmanın kendisinin kullanılmasının
yanı sıra, ürettiği bakteriyosin de saflaştırılarak gıdalara eklenebilmektedir
(Callewaert ve ark., 2000; Giraffa, 2003; Leroy ve ark., 2003; Saavedra ve ark.,
2003).
Enterococcus faecium’un ürettiği enterocin’ler anti-Listeria aktivitesi
gösteren en önemli bakteriyosinler arasındadır (Carnio ve ark., 1999; Ennahar ve
ark., 2001; Herranz ve ark., 2001; Moreno ve ark., 2003). Cheddar peynirlerinin
üretiminde Enterococcus faecium, Listeria aktivitesinin inhibisyonu için
kullanılmaktadır (Leroy ve ark., 2003; Saavedra ve ark., 2003).
Et ürünlerinin üretiminde Enterococcus faecium’un bakteriyosinojenik veya
biyokoruyucu starter kültürler olarak kullanılması, bu ürünlerin doğal yolla
dayandırılmalarını sağlamaktadır (Hugas ve ark., 2003).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
13
Bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşları gastrointestinal yolda
istenilen populasyonun devamlılığı açısından da önem taşımaktadır (Strompfova ve
ark., 2004).
2.2.5. Enterococcus faecium’un Patojenitesi
Gıdalarda sıklıkla kullanılan Enterococcus faecium’un virülans faktörleri tam
olarak bilinmemektedir (Lund, 2003; Lukasova ve Sustackova, 2003; Semedo ve
ark., 2003). Enterococcus faecalis’in Enterococcus faecium’dan daha fazla virulans
faktör taşıdığı bildirmektedir (Franz ve ark., 2001).
Enterococcus’ların virulans faktörleri taşıyıcı dokusuna yapışma, invazyon,
hemoliz, agregasyon maddeleri, fermente gıdalarda biyojenik amin üretimi ve
gelatinase, hyaluronidase, cytolycin, Esp (enteroccal surface protein) gibi yüksek
moleküler ağırlıklı ekstraselüler yüzey proteini ve diğer toksik maddeleri
salgılamaları ile plazmid üretimi olarak sayılabilir (Giraffa, 2002; De Vuyst ve ark.,
2003; Semedo ve ark., 2003).
Enterococcus faecium’un patojenitelerindeki en önemli faktör ise bu
organizmaların antibiyotiklere karşı olan dirençleridir (Butaye ve ark., 1999; Franz
ve ark., 2001). Antibiyotiklere karşı direnç hem doğal olarak bulunabilmekte, hem de
antibiyotiğe karşı duyarlı türlerin yeni genler kazanması ya da mutasyona uğramaları
sonucunda sonradan da kazanılabilmektedir. Enterococcus faecium türlerilerinin
virulansı kullanılan antibiyotiklere olan direnç nedeniyle artmaktadır (Giraffa, 2002;
Ünlü ve ark., 2002; Lukasova ve Sustackova, 2003).
2.2.6. Enterococcus faecium’un Hemolitik Özellikleri
Enterococcus’larda hemolitik aktivite önemli virulans faktör olarak ortaya
çıkmaktadır (Linaje ve ark., 2004). Beta-hemoliz daha çok Enterecoccus faecalis ve
Enterecoccus faecium türlerinde meydana gelmektedir. Hemolitik aktivitenin
bulunmaması süt ürünlerinde kullanılacak bakteriyosin üreten starter kültürleri için
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
14
bir seçim kriteridir. Ancak bir suşun hemolitik aktiviteye sahip olmaması bu suşun
virulans özellik taşımadığını göstermemektedir (De Vuyst ve ark., 2003).
2.2.7. Enterococcus faecium’un Antibiyotik Direnci
Enterococcus cinsi bakteriler genellikle düşük virulansa sahip olmalarına
rağmen, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecelis kullanılan antibiyotiklere
karşı dirençli olmaları nedeniyle, klinik terapilerde önemli problemlere neden
olmaktadır (Panagea ve Chadwick, 1996; Giraffa ve ark., 2000; Bodil ve ark., 2002;
Peters ve ark., 2003). Amerika’da sağlıklı bireylerin ortalama % 5-20’sinde
Enterococcus kolonizasyonu ya da enfeksiyonu rapor edilmiştir (Namdari, 1998).
Enterococcus faecalis enfeksiyonların % 80-90’ından sorumlu iken, Enterococcus
faecium ise % 5-15’inden sorumlu olduğu bildirilmiştir (El-Din ve ark., 2002; Erdem
ve ark., 2004). Amerika’da Enterococcus faecium, hastane enfeksiyonlarına en sık
neden olan ikinci bakteridir (Wegener ve ark., 1997; Klare, 2003). Bu bakteriler
klinik uygulamalarda kullanılan bir çok antibiyotiğe karşı dirençlidirler (Lukasova ve
Sustackova, 2003). Bazı kaynaklarda Enterococcus faecium’un antibiyotiklere karşı
Enterococcus faecalis’ten daha dirençli olduğu belirtilmektedir (Quednau ve ark.,
1999).
Antibiyotiklerin uygunsuz bir şekilde hayvan beslenmesinde gelişim arttırıcı
olarak kullanılması, dirençli Enterococcus faecium türlerinin ortaya çıkmasında
selektif ajan rolü taşımaktadır (Gaukel ve Spieβ, 1998; Quednau ve ark., 1999;
Butaye ve ark., 2000; Giraffa, 2002; Cocconcelli ve ark., 2003). Kullanılan bu
antibakteriyeller arasında insan tedavisinde de kullanılan antibiyotikler
bulunmaktadır (Gaukel ve Spieβ, 1998; Butaye ve ark., 1999). İnsan tedavisinde ve
hayvanlarda gelişim arttırıcı olarak kullanılan antibakteriyeller arasında çapraz
direnç bulunmaktadır. Çapraz direnç sonucunda hayvan gelişiminde kullanılan
antimikrobiyellere direnç, insanlarda tedavi amacıyla kullanılan ilaçlara dirençle
sonuçlanmaktadır (Emborg ve ark., 2003).
1980’li yılların sonunda ilk defa glikopeptidlere karşı dirençli Enterococcus
(GRE) tespit edilmiş ve bunun neden olduğu enfeksiyon güçlükle tedavi
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
15
edilebilmiştir (Peters ve ark., 2003). Vancomycin ve teicpoplanine karşı direnç, gıda
kaynaklı Enterococcus’lar arasında en sık izole edilen direnç fenotipidir (Giraffa,
2002). Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu glikopeptidlere karşı
direnç kazanmışlardır (Willey ve ark., 1999; Başustaoğlu ve ark., 2001). Teicoplanin
ve vancomycin gibi glikopeptidlerin önemi, çoklu ilaç direnci gösteren türlere ya da
penicilin, ampicillin gibi antibiyotiklere karşı alerji gösteren kişilerin klinik
tedavisinde kullanılmalarından kaynaklanmaktadır (Giraffa, 2002). Bu antibiyotikler
immun sistemi zayıf ya da bastırılmış bireylerde birkaç enfeksiyona karşı en son çare
olarak kullanılan antibiyotiklerdir (Salminen ve ark., 1998). Bu nedenle
vancomycin’e dirençli Enterococcus’lar (VRE) halk sağlığı için global bir tehdit
olarak ortaya çıkmaktadır (Gelsomino ve ark., 2003).
VRE’ler çoklu ilaç direnci gösteren bakterilerin yol açtığı enfeksiyonların
tedavisinde ve vancomyicin ile tedaviye ihtiyaç duyulan hastalarda tedavinin
başarısız olmasına neden olmaktadırlar (Lukasova ve Sustackova, 2003). Bu nedenle
hastanelerde vancomycin’e dirençli Enterococcus’ların ortaya çıkması endişe
vermektedir (Gelsomino ve ark., 2003). VRE’lerin ortaya çıkmasıyla
Enterococcus’lar kullanılan bütün antibiyotiklere karşı direnç kazanmış
durumdadırlar (Wegener ve ark., 1997). VRE’lerin sebep olduğu enfeksiyonlar,
Avrupa ve Amerika’da önemli bir problem haline gelmiştir (Barton ve Gary, 1995;
Eaton ve Gasson, 2002). Son yıllarda Enterocccus faecium en sık ortaya çıkan VRE
olarak tanımlanmaktadır (Roberts, 1997; Salminen ve ark., 1998; De Vuyst ve ark.,
2003).
Vancomycin’e dirençli Enterococcus faecium (VREF) suşları, hastane
ortamları, insanlar, hayvansal kaynaklar, akuatik habitatlar ve tarımsal ürünlerden
izole edilmiştir (Lukasova ve Sustackova, 2003). Yapılan çalışmalar vancomycin’e
yüksek derecede direnç gösteren Enterococcus faecium suşlarının hayvansal orjinli
gıdalarda bulunduğunu göstermiştir (Robredo ve ark., 2000). Vancomycin’e dirençli
Enterococcus faecium suşları lağım suları ile sulanmış bitkiler, atık sular ve dışkılar
gibi çeşitli kaynaklardan çevresel kontaminasyon yoluyla gıdalara ulaşabilmektedir
(Giraffa, 2002). Kesim yerlerindeki kötü hijyen koşulları sonucunda karkaslar fekal
kontaminasyonla kontamine olarak hayvansal gıdalar bu dirençli türler için bir vektör
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
16
olmaktadır (Lemcke ve Bülte, 2000). VREF suşları biftek, kümes hayvanları, domuz
ve diğer et ürünlerinden izole edilmiştir (Emborg ve ark., 2003).
Kontamine gıdalar aracılığı ile VRE’lerin insanlara transfer edilebilme riski
endişe doğurmaktadır (Robredo ve ark., 2000; Klare, 2003). Direnç genlerinin gıda
zinciri aracılığı ile insanları da etkileyebileceği düşünülmektedir (Peters ve ark.,
2003).
Pastörize ve çiğ sütlerde antibiyotiğe dirençli Enterococcus’ların (ARE)
varlığı tespit edilmiştir. ARE’ler et ürünleri, yemeye hazır gıdalar ve hatta probiyotik
kültürlerde bulunmaktadır. Bu ürünlerde antibiyotik direnç bulunması, direncin gıda
zincirine yayılması riskini doğurmaktadır. Kanamycin ve gentamicin’e yüksek direnç
gösteren Enterococcus faecium türleri Fransız peynirlerinden ve hastanedeki
hastalardan izole edilmiştir (Giraffa, 2002). Enterococcus faecium süt endüstrisinde,
özellikle de peynir üretiminde starter olarak kullanılmasına rağmen günümüze kadar
süt ürünlerinde VRE ile ilgili bir enfeksiyon rapor edilmemiştir (Robredo ve ark.,
2000).
Gıda kaynaklı Enterococcus faecium türlerinin patojen olduklarına dair hiçbir
kanıt bulunmamasına rağmen, bu organizmalar taşıyıcıya adapte olabilen
antimkrobiyel direnç ve virulans özellikler taşıyabilirler (Hayes ve ark., 2003). Bu
bakteriler, genetik materyallerini değiştirebilmeleri ve genetik bilgilerini diğer
türlerle bile paylaşabilmeleri nedeniyle, mevcut genomun değişmesine yol açmakta
yada plazmidler aracılığıyla genetik materyallerin hücreler arası transferine neden
olmaktadır (Yaman ve Esendal, 2004). Böylece bu organizmalar kendisi bile virulans
faktör taşımazken, zararsız bir türü patojen haline dönüştürebilmektedir (Quednau ve
ark., 1999; De Vuyst ve ark., 2003).
Yapılan konjugasyon çalışmaları klinik Enterococcus türlerindeki transfer
sıklığının, gıda kaynaklı veya probiyotik türlere göre daha başarılı olduğunu
göstermiştir (Klein, 2003). Yapılan araştırmalar klinik örneklerdeki Enterococcus
türlerinin, gıda kaynaklı türlerden daha fazla virulans faktör taşıdığını ve ayrıca
starter kültür olarak kullanılan Enterococcus türlerinin, klinik izolatlara göre daha
düşük patojeniteye sahip olduklarını göstermektedir (Franz ve ark., 2001). Klinik
izolatlardaki virulans faktörlerin etkileri, gıdalardan izole edilen türlerinkinden çok
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
17
daha fazladır. Gıdalardan izole edilen Entrococcus faecium suşları genellikle virulans
faktör taşımamaktadır (Eaton ve Gasson, 2001). Ancak halen güvenli olarak bilinen
bir suşun konjugasyonla bilinen virulans faktörlerden birini kazanma riski vardır.
Probiyotik ve starter kültür olarak yüksek sayılarda Enterococcus tüketilmesi
sonucunda, virulans gen taşıyan plazmidlerin yayılabileceği düşünülmektedir (Eaton
ve Gasson, 2002). Çünkü gıdalarda bulunan Enterecoccus faecalis ve Enterecoccus
faecium‘un antibiyotik direnç taşıyabildikleri tespit edilmiştir (Semedo ve ark.,
2003). Ayrıca gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan Enterococcus
faecium suşlarının, klinik örneklerden izole edilen medikal orijinli patojenlerden in
vitro koşullarda transkonjugasyon yoluyla virulans faktörler elde edilebildikleri
tespit edilmiştir (Quednau ve ark., 1999; De Vuyst ve ark., 2003). Bu nedenle
antimikrobiyel dirençli Enterococcus faecium populasyonları taşıyan gıdaların
tüketimi, muhtemel tranferlere aracı olabilir ve taşıyıcıda direnç determinantlarının
oluşması ve kolonizasyonu ile sonuçlanabilir (Hayes ve ark., 2003).
Günümüzde halen Enterococcus’ların fermente gıdalardaki virülans faktörleri
ve antibiyotik direnci hakkında çok az veri bulunmaktadır. Gıda ortamındaki gen
transferinin ve fermantasyon sırasındaki antibiyotik direnç dinamiklerinin nasıl
meydana geldiği ile ilgili bilgilere ihtiyaç duyulmaktadır (Cocconcelli ve ark., 2003).
Patojen olan Enterococcus türleri ile gıdalarda güvenli olarak kullanılan kültürler
arasındaki fark tam olarak bilinmemektedir (Eaton ve Gasson, 2001).
Virülans faktörlerin ortaya çıkması ve fermente gıdalarda kullanılan
bakteriyosin üreten ya da koruyucu, starter veya probiyotik olarak kullanılan
kültürlerin güvenliği suşa özgüdür. Günümüzde halen Enterococus’ların starter
kültür olarak kullanılmalarının güvenilir olup olmadığına cevap vermek güçtür
(Franz ve ark., 2001). Bu organizmaların endüstriyel alanda ve gıda proseslerinde
kullanılmaları halen sorgulanmaktadır (Sarantinopoulos ve ark., 2002). Gıda kültürü
olarak kullanılacak Enterococcus türlerinin antibiyotik dirençliliği ve virulans
özellikleri açısından güvenilirliliği test edilmelidir (De Vuyst ve ark., 2003).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
18
2.3. Enterococcus faecium’un İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar
2.3.1. Enterococcus faecium’un Süt Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan
Çalışmalar
Arizcun ve ark. (1997) koyun sütünden yapılmış Feta, La Serena, Torta del
Casar gibi peynirlerde Enterococcus sayımlarının 104-107 cfu/g civarında olduğunu
belirtmişlerdir. Bu peynirlerdeki yüksek orandaki Enterococcus sayımlarının
proteolitik ve lipolitik aktivite sonucunda peynirlerin aromalarına olumlu katkıda
bulunduklarını belirtmişlerdir. Koyun sütünden üretilen Roncal ve Idiazabal
peynirlerinde bulunan Enterococcus sayımlarının, koyun sütünden üretilen diğer
peynir çeşitlerine göre daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada
Roncal ve Idiazabal peynirlerinin 120 günlük olgunlaştırılmasından sonra toplam 282
Enterococcus izole edilerek tanımlanmışlardır. En fazla izole edilen türlerin
Enterococcus faecalis ve onu takiben de Enterococcus faecium olduğunu
belirtmişlerdir. Bu bakterilerin Indiazabal peynir üretiminde uygulanan dumanlama
proseslerinden etkilenmediklerini ifade etmişlerdir.
Mannu ve ark. (1999), sığır sütünden üretilen ve üretiminde starter kültür
kullanılmayan Pecorino Sardo peynirlerinin mikroflorasını incelemişler ve bu
peynirlerde sadece Enterococcus ve Lactococcus türlerinin bulunduğunu tespit
etmişlerdir.
Gelsomino ve ark. (2001), bu organizmaların sütlere direkt hayvan veya insan
dışkısı ya da kontamine su kaynakları, ekipmanlar veya depolama tanklarından
bulaştıklarını bildirmişlerdir. Cheddar peynirinin üretimi sırasında çeşitli
kaynaklardan izole ettikleri Enterococcus türlerini tanımlamışlar ve sığırlarda izole
edilen türler içinde Enterococcus faecium baskın iken; insan dışkısı, süt ve
peynirlerde ise Enterococcus casseliflavus ve daha sonra da Enterococcus faecalis’in
en sık izole edilen tür olduğunu bildirmişlerdir. Süt depolama tankları ve
ekipmanlarda ise izole edilen türlerin sadece Enterococcus casseliflavus ve
Enterococcus faecalis olduğunu belirtmişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
19
El-Din ve ark. (2002), Enterococcus faecium’un çiğ sütteki dominant flora
olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca peynirlerde sık rastlanma nedenlerinin başında, bu
bakterilerin yüksek sıcaklık, tuz ve aside olan toleranslarından ileri geldiğini
belirtmişlerdir.
Manopoulou ve ark. (2003), Feta peynirlerinden elde edilen 146 izolatın 29
tanesinin Enterococcus faecium olduğunu ve bu türlerin peynir üretiminden
olgunlaştırma sonuna kadar varlığını sürdürdüğünü tespit etmişlerdir.
Giraffa (2003), pastörizasyondan sonra oluşan çevresel kontaminasyonun,
Enterococcus faecium’un pastörize sütlerden üretilen peynirlerde doğal mikrofloralar
olarak ortaya çıkması ile sonuçlandığını belirtmiştir.
Saavedra ve ark. (2003), Arjantin’de geleneksel yöntemle üretilmiş Tafi
peynirlerinden izole ettikleri Enterococcus türlerinin 122 tanesini Enterococcus
faecium olarak tanımlamışlardır.
2.3.2. Enterococcus faecium’un Et Ürünlerinden İzolasyonu İle İlgili Yapılan
Çalışmalar
Wegener ve ark. (1997), Enterococcus’ların et ürünlerine bulaşmasının kesim
sırasında olduğunu belirterek, yapılan bir çalışmada farklı kesimhanelerden domuz
karkasları üzerindeki Enterococcus sayısının 104-108 /100 cm3 olduğu bildirmişlerdir.
Bunlar arasındaki dominant mikroflorayı ise Enterococcus faecium ve Enterococcus
faecalis’in oluşturduğunu belirtmişlerdir.
Giraffa (2002), Enterococcus spp.’nin çiğ etlerde sayılarının 102-104 cfu/g
civarında olduğununu belirterek, et ürünlerinde fekal veya çevresel kontaminasyonla
gıdaların fermantasyonu sırasında çoğaldığını bildirmişlerdir.
Papamanoli ve ark. (2002), fermente sucuklardan izole ettikleri LAB’lerinin
% 4’ünü Enterococcus spp.’nin oluşturduğunu tespit etmişlerdir.
Hugas ve ark. (2003), yaptıkları bir çalışmada Alman ve İtalyan fermente
sucuklarda olgunlaştırma prosesinin sonunda hem starter kültür kullanılan, hem de
kullanılmayan sucuklarda Enterococcus konsantrasyonunun 103-105 arasında olduğu
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
20
bildirilmişlerdir. Enterococcus’ların sucukların olgunlaştırılması sırasındaki varlığını
geniş aralıktaki gelişim sıcaklıkları ve tuza olan yüksek toleransına bağlamışlardır.
2.3.3. Enterococcus faecium’un İzolasyonu İle İlgili Yapılan Diğer Çalışmalar
Wessels ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada çiğ süt, krema, tereyağı ve
fermente süt ürünlerinden izole ettikleri Enterococcus türlerinin 54 tanesinin
Enterococcus faecium, 40 tanesinin Enterococcus faecalis, 14 tanesinin ise
Enterococcus durans olduğunu bildirmişlerdir.
Giraffa (2003), yaptığı çalışmada, Enterococcus faecim’un 68 ºC’de 30
dakikalık ısıl işlem sonunda canlılığını sürdürebildiğini göstermiştir. Bu nedenle
fermente olan ya da olmayan gıdalardaki Enterococcus varlığının kaçınılmaz
olduğunu ifade etmiştir.
Barakat ve ark. (2000), ticari olarak üretilip, modifiye atmosferle paketlenmiş
tavuk etlerinin 3.5 ºC’de 7 güne kadar depolanması sırasında oluşan baskın
mikrofloranın Lactococcus spp. ve Carnobacterium spp. ile birlikte Enterococcus
faecalis olduğunu tespit etmişlerdir.
2.3.4. Enterococcus faecium’un Starter ve Yardımcı Kültür Olarak Kullanılması
İle İlgili Yapılan Çalışmalar
Gardiner ve ark. (1999), yaptıkları çalışmada probiyotik kültür olarak
kullanılan Enterococcus faecium PR88’in Cheddar peynirinde yardımcı kültür olarak
kullanımı araştırmışlardır. Yardımcı kültür olarak eklenen bu suşun olgunlaştırma
sonunda sayımı alındığında iyi gelişim gösterdiğini tespit etmişlerdir. Ayrıca bu
kültürle üretilen peynir ile kontrol örneğini karşılaştırmışlar ve sonuçta PR88 eklenen
Cheddar peynirinde uçucu aromatik bazı bileşenlerin daha yüksek seviyelerde
bulunduğu gözlemlemişledir. Ayrıca bu suşun, peynir kompozisyonunu
etkilemediğini belirterek, yapılan duyusal değerlendirmede PR88 eklenen peynirin
daha iyi puanlama aldığını ifade etmişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
21
Stanton ve Ross (2000), Lactubacillus ve Enterococcus faecium Fargo 688
kullanarak Cheddar peyniri ve yoğurt üretmişler ve Enterococcus faecium suşunun
Cheddar peynirinin aromasını geliştirdiğini belirlemişlerdir.
Giraffa ve ark. (2000), Picante peynirlerinden izole edilen Enterococcus
faecium suşlarının peynirlerde sitrat metabolizmasını kullanarak olgunlaştırma
sırasında asetaldehit, diasetil, aseton gibi uçucu bileşikleri oluşturduklarını ve
böylece peynir aromasına katkıda bulunduğu bildirmiştir.
Giraffa (2002), probiyotik olarak kullanılan Enterococcus faecium PR88
suşunun Cheddar peynirinin üretiminde kullanıldığında aroma oluşumuna pozitif
katkıda bulunduğunu belirtmiştir.
Hayaloğlu ve Erginkaya (2001), Mısır’da Enterococcus faecalis’in tek veya
karışık suşlarının kullanılarak yoğurt benzeri bir ürün elde edildiği ve bu bakterinin
yeterince proteoltik aktivite göstererek istenen düzeyde asit ve aroma oluşturduğunu
belirtmişlerdir.
El-Din ve ark. (2002), çiğ sütten yapılan Mısır Domiatti ve Mish
peynirlerinden çeşitli Enterococcus türleri izole etmişlerdir. İzole edilen suşların
proteolitik ve lipolitik aktivitelerini incelemek amacıyla peynir üretimi yapmışlar ve
peynir üretiminde Enterococcus faecium kullanılan örnekleri kontrol örneği ile
kıyasladıklarında, bu örneklerin organoleptik özellikleri geliştiren daha fazla suda
çözünebilir nitrojen ve toplam serbest amino asit içerdiğini tespit etmişlerdir. Bu
özellikleri nedeniyle Enterococcus faecium kültürlerinin geleneksel peynir
üretiminde adjunct (yardımcı) kültür olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir.
Gülmez ve Güven (2002), Enterococcus faecalis INIA4 suşu ilave edilerek
üretilen peynirlerin, duyusal muayenelerde kontrol örneğine göre daha fazla puan
aldığını bildirmişlerdir.
Franz ve ark. (2003), Enterococcus faecium suşlarını Feta peynirlerinin
üretiminde duyusal ve fizikokimyasal özellikleri geliştirmek amacıyla yardımcı
kültürler olarak kullanıldıklarını bildirmişlerdir.
Sarantinopoulos ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada Feta peyniri üretiminde
starter kültür olarak Enterococcus faecium FAIR-E 198 ve Enterococcus faecium
FAIR-E 243 kültürlerinin kombinasyonu kullanmışlardır. Her iki Enterococcus
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
22
faecium suşunun da starter kültür olmayan diğer laktik asit bakterileri, Micrococcus
ve koliformlar üzerine olumlu etkide bulunduğunu gözlemlemişlerdir. Bu suşların
ana uçucu bileşenler olarak etanol, asetat, aseton, aseteldehit, asetoin ve diasetil
ürettiklerini tespit etmişler ve her iki suşun da tamamen olgunlaşmış peynirlerin
aroma, tat, renk ve tekstür gibi hemen hemen bütün duyusal özelliklerini olumlu
yönde etkilediklerini bildirmişlerdir. Bu çalışma sonunda Enterococcus faecium
suşlarını Feta peyniri yapımında karışık kültür olarak kullanımını önermişledir.
Giraffa (2003), birkaç çalışmada Enterococcus faecium, Enterococcus
faecalis, Enterococcus durans türlerinin Feta, Venaco, Cebreiro ve Hispanico gibi
İtalyan yarı pişmiş peynirlerinin üretiminde mezofilik ve termofilik LAB’leri ile
birlkte starter kültür olarak kullanıldığını bildirmiştir. Ayrıca Enterococcus faecium
ve Enterococcus faecalis türlerinin mezofilik ve termofilik LAB’leri ile birlikte yarı
pişmiş İtalyan peynirlerinin üretiminde yardımcı kültürler olarak kullanıldığını
belirtmişlerdir. Aynı çalışmada ürüne ilave edilen bu bakterilerin peynirlerde tat,
aroma, renk, yapı gibi hemen hemen tüm duyusal profile pozitif etki yaptığını
belirtmiştir. Bu türlerle üretilen peynirlerde çözünür nitrojen, toplam aminoasit,
uçucu serbest yağ asitleri, uzun zincirli serbest yağ asitleri ile diasetil ve asetoin
içeriğinin yüksek olduğunu bildirmiştir.
Hugas ve ark. (2003), fermente sucuklardan izole edilen Enterococcus
faecium CTC492’nin sucuk üretiminde starter kültür olarak kullanıldığında, bu suşun
proses sonuna kadar gelişim gösterdiğini tespit etmişlerdir.
2.3.5. Enterococcus faecium’un Biyokoruyucu Kültür Olarak Kullanılması İle
İlgili Yapılan Çalışmalar
Hugas-Maurici ve ark. (1999), Enterococcus faecium CTC492 suşunun
Listeria monocytogenes’e karşı antimikrobiyel etkisini göstermişlerdir.
O’Keeffe ve ark., (1999), yapılan çalışmalarda Enterococcus faecium’un
ürettiği enterocin’lerin laktik asit bakterileri, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Clostridium botilinum, Clostridium perfiringens,
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
23
Clostridium tyrobutyricum ve diğer Clostridium spp. üzerine antibakteriyel
etkilerinin tepit edildiğini belirtmişlerdir.
Callewaert ve ark. (2000), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium
suşlarının, sucukların fermantasyonunda, dilimlenmiş ve vakum paketlenmiş etlerde
Listeria monocytogenes ve mukoz oluşturan laktik asit bakterilerinin gelişiminin
önlenmesinde kullanıldığını bildirmişlerdir. Ayrıca sucuk üretiminde starter kültür
olarak kullandıkları Enterococcus faecium CCM4231 ve Enterococcus faecium RZS
C13 suşlarının Listeria spp.’yi inhibe ettiğini belirleyerek bu suşları etlerde karışık
kültür olarak önermişlerdir.
Herranz ve ark. (2001), İspanyol fermente sucuklardan izole ettikleri
Enterococcus faecium P21 suşunun Listeria monocytogenes’i inhibe ettiğini
göstermişlerdir.
Sarantinopoulos ve ark. (2002), güçlü anti-Listeria aktivitesi gösteren
Enterococcus faecium suşlarının silaj, süt ürünleri, balık, sebzeler ve fermente sucuk
gibi çeşitli ortamlardan izole edildiğini belirtmişlerdir.
Leroy ve ark. (2002), denemelerde Listeria spp.’ye karşı aktivite gösteren
enterocin’lerin hem fermente, hem de fermente olmayan gıdaların doğal olarak
korunmalarında büyük bir önem taşıdıkları bildirmişlerdir.
Tarelli ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada izole ettikleri Enterococcus
faecium suşunun Listeria monocytogenes’e karşı antagonistik etkisini
belirlemişlerdir.
De Vuyst ve ark. (2003), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının
peynir yapımında koruyucu kültür ya da karışık kültür olarak kullanıldıklarında,
Listeria ve Clostiridium’a karşı antibakteriyel etkisi olduğunu ve bu suşların
olgunlaştırmaya da katkıda bulunabileceğini bildirmişlerdir.
Franz ve ark. (2003), peynirlerden izole edilen Enterococcus faecium WHE
81 suşunun Listeria monocytogenes’i inhibe eden enterocin A ve enterocin B
ürttiklerini bildirmiştir. Başka bir çalışmada ise fermente sucuk üretiminde
bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının kullanılmasının Listeria
monocytogenes’i inhibe ettiğini belirterek, Enterococcus faecium’u fermente sucuk
üretiminde biyokoruyucu olarak önermişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
24
Giraffa (2003), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium suşlarının,
geleneksel kimyasal koruyuculara göre daha avantajlı olduğunu ve et ürünlerinde
ortaya çıkan patojenlerin gelişimini endellediğini bildirmiştir. Yaptığı çalışmada
peynirlerde koruyucu olarak kullanılan Enterococcus faecium kültürlerinin enterocin
üretiminin Listeria’ya karşı etkisinin olgunlaştırma süresince devam ettiğini ve
ürünlerin organoleptik karakteristiklerine ve ticari starter aktivitelerine hiçbir
olumsuz etkisinin olmadığını bildirmiştir.
Hugas ve ark. (2003), bakteriyosin üreten Enterococcus faecium RZSC13,
Enterococcus faecium CCM4231, Enterococcus faecalis AS48 suşlarının model
sucuk üretiminde olgunlaştırma sonunda Listera’yı inhibe ettikleri belirtmişlerdir.
Ayrıca sucuk fermantasyonu sırasında Salmonella, Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, ve Staphylococcus aureus gibi majör mikrobiyel tehlikeleri kontrol
etmek amacıyla, et ortamında iyi bir yarışçı olan, enterocin A ve B üreten
Enterococcus faecium CTC492 starter ya da biyokoruyucu kültür olarak
kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Çalışmaları sonucunda pişirilerek yemeye hazır
gıda ürünlerinin dilimleme ve paketleme sırasında patojen bakterilerle kontamine
olması halinde koruyucu herhangi bir etkenin bulunmadığını hatırlatarak, enterocin
üreten Enterococcus faecium suşlarının bu ürünlerde kullanım alanı bulabileceğini
bildirmişlerdir.
Leroy ve ark. (2003), bakteriosin üreten Enterococcus faecium fermente
sucukların üretiminde karışık kültür olarak kullanılmasının Listeria sayısını
azaltılmasına etki ettiğini bildirerek, ürettikleri model Cheddar peynirinde
Enterococcus faecium RZS C5 suşunu karışık kültür olarak tavsiye etmişlerdir.
Ayrıca Enterococcus faecium RZS C5 suşunun fermente sucuk üretiminde de
Listeria sayımının azalmasına yardımcı olan karışık kültür olarak kullanımıyla ilgili
başarılı çalışmalar bulunduğunu belirtmişlerdir.
Marekova ve ark. (2003), bu bakterilerin Listeria ve Bacillus gibi gıda
kontaminantlarına karşı gıda ürünlerini korumak amacıyla endüstriyel olarak
kullanıldıklarını bildirmişlerdir. Çalışmalarında Enterococcus faecium EK 13
suşunun Listeria, Bacillus, Staphylococcus spp.’yi inhibe eden bakteriyosin ürettiğini
tespit etmişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
25
Moreno ve ark. (2003), ürettikleri model Cheddar peynirinde Enterococcus
faecium RZS C5 ve Enterococcus faecium DPC 1146 suşlarını karışık kültür olarak
kullanmışlar ve bu bakterilerin enterocin üretiminin, peynirin olgunlaştırma
aşamasının sonuna kadar devam ederek indikatör Listeria LMG 13568 suşunu inhibe
ettiğini göstermişlerdir.
Park ve ark. (2003), Enterococcus faecium JMC 5804 suşunun Clostridium
spp., Listeria monocytogenes ve VRE’leri (vancomycin’e dirençli Enterococcus)
inhibisyon etkisini bulmuşlardır.
Työppönen ve ark. (2003), çeşitli et ürünlerinin fermantasyonu sırasında
antimikrobiyel bileşik üreten Enterococcus faecium suşlarının kullanımının bu
ürünlerdeki Listeria monocytogenes ve E. coli O157:H7 sayısını azalttığını
bildirmişlerdir.
Simonova ve Laukova (2004), tavşanlardan izole etikleri Enterococcus
faecium EF 2019 suşunun antimikrobiyel özellik taşıdığını göstermişlerdir.
2.3.6. Enterococcus faecium’un Probiyotik Kültür Olarak Kullanılması İle
İlgili Yapılan Çalışmalar
Koneman ve ark. (1994) ise, ishal olan hastalarda Enterococcus faecium’un
probiyotik olarak kullanıldığı durumlarda ishal süresinin azaldığını bildirmişlerdir.
Karahan ve Çakmakçı (1996), domuz bağırsaklarından izole edilen
Enterococcus faecalis suşlarının in vitro koşullarda E. coli’yi inhibe ettiğini
saptamışlardır.
Waterman ve Small (1998), fermente et ürünlerinde ısıl işlem
uygulanmamasının probiyotik olarak kullanılan bu kültürlerin gastrointestinal yola
iletilmesinde etkili olduğunu bildirmişlerdir.
Franz ve ark. (1999), Enterococcus faecium suşlarının bazı probiyotik
preparatlarının marketlerde gastrointestinal dengeyi geliştirmek için besin katkıları
olarak satıldığını dile getirmişlerdir.
Gardiner ve ark. (1999), Cheddar peynirlerinin Enterococcus faecium’un
gastrointestinal yola iletilmesinde etkili bir araç olduğunu belirtmişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
26
Sanders (1999), Enterococcus faecium suşlarının farmasetik ürünler şeklinde
probiyotik olarak kullanıldığını bildirmiştir.
Stanton ve Ross (2000), Lactubacillus ve Enterococcus faecium Fargo 688
kullanarak ürettikleri yoğurt ve Cheddar peyniri ile 21 gün boyunca beslenen
domuzların immun sistemini geliştiğini tespit etmişlerdir.
Audisio ve ark. (2001) tavuklardan izole edilen Enterococcus faecium
CRL1385 probiyotik özellik taşıdığını göstermişlerdir.
Doyle (2001), Enterococcus faecium 18C23 suşunun enterotoksijenik E.
coli’nin intestinal dokuya bağlanmasını önlediğini bildirmiştir.
Lund ve ark. (2002), S. thermophilus ve Enterococcus faecium içeren Causida
kültürünün kolesterolün düşürülmesinde probiyotik olarak kullanılan bir ticari
preparat olduğunu belirtmişleridir.
Crittenden ve ark. (2003), probiyotik yoğurt üretmek için çeşitli kültür
kombinasyonları denemişler ve en iyi kombinasyonun S. thermophilus ve
Enterococcus faecium olduğunu saptamışlardır.
Hugas ve ark. (2003), Enterococcus faecium F688 fermente et ürünlerinde
probiyotik olarak satılan ticari bir suş olduğunu ve bu suşun sucuklarda
olgunlaştırma sonunda 107 cfu/g’e ulaşabilen iyi bir yarışçı olduğunu bildirmişlerdir.
Saavedra ve ark. (2003), Son yıllarda Enterococcus faecium suşlarının,
Cheddar peynirlerinde ve fermente et ürünlerinde probiyotik kültürler olarak
kullanıldığını belirterek, bu bakterilerin probiyotik etkisinin, kolesterolün sindirim
sisteminden kana absobsiyonunun azaltılması şeklinde olduğunu bildirmişlerdir.
Tsai ve ark. (2004), probiyotik özellikteki Enterococcus spp.’nin ticari
preparatlar dışında farklı kaynaklardan da aldıklarına dikkat çekmiş ve geleneksel
yöntemle fermente edilen peynir ve süt ürünlerinden Enterococcus faecium izole
edildiğini vurgulamışlardır. Yaptıkları çalışmada dışkılardardan izole edilen
LAB’leri ve bunların fonksiyonel özelliklerini araştırırken izole ettikleri Entreccocus
faecium Tm39 suşunun intestinal epitellere bağlanma özelliği gösteren, safraya
toleranslı ve Helicobacter pylori’ye karşı antagonistik aktivite gösteren bir suş
olduğunu tespit etmişlerdir. Çalışmalarında bu suşun vancomycin’e direnç
göstermediğini ve insan intestinal epitel hücrelerine invasiv etki göstermediğini ifade
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
27
ederek, bu suşun gerekli güvenlik değerlendirmelerinden sonra probiyotik kültür
olarak kullanılabileceğini ifade etmişlerdir.
Strompfova ve ark. (2004), yapılan bir çalışmada Enterococcus faecium
içeren ticari bir probiyotik preparat olan Vitacanis’in Salmonella enterica ser.
typhimurium’a karşı koruyucu etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada
40 köpek dışkısından izole edilen Enterococcus izolatının bakteriosin üretimi, düşük
pH, safra toleransı, antibiyotiğe direnç ya da tolerans gibi özelliklerini
araştırmışlardır. İzole edilen türler arasında en iyi probiyotik özelliği Enterococcus
faecium ve Enterococcus faecalis’in gösterdiğini bildirmişlerdir. Bu çalışma
sonucunda Enterococcus faecium EF01 suşunun gastrointestinal yolda
yaşayabildiğini ve burada kolonize olduğunu ve hedef gram pozitif bakterilere karşı
aktivite gösterdiğini ve bu nedenle de yeni bir probiyotik suş olabileceği
belirtmişlerdir.
Yaman ve ark. (2004), yapılan bir çalışmada Entreccocus faecium’un ticari
preparatlarının İsrail sazanlarının yem dönüşümünü ve büyüme oranını arttırdığını ve
probiyotik kültürün kullanılmaya başlanmasından 14 gün sonra sazan balığının
mkroflorasında E. coli tespit edilemediğini bildirmişlerdir.
Hlivak ve ark. (2005), yaptıkları değerlendirmeler sonucunda Enterococcus
faecium M-74’ün insanlarda probiyotik uygulamalarının kardiyovasküler
hastalıkların tedavisinde veya önlenmesinde kullanılabileceğini belirtmişlerdir.
2.3.7. Enterococcus faecium’un Antibiyotik Direnci ve Patojeniteleri İle İlgili
Yapılan Çalışmalar
Quednau ve ark. (1999), antibiyotik direncin plazmid transferi ile
gerçekleştiğini ifade ederek, Enterococcus faecium’un türleri tavuklardaki dönor
direnç genlerini alabildiğini bildirmiştir.
Eaton ve Gasson (2001), gıdalardan ve klinik materyallerden izole edilen
Enterococcus türlerinin virülans faktörlerini araştırmışlardır. Yapılan çalışmada
Enterococcus faecalis suşlarının hepsinin virulans faktör taşıdığını, ancak medikal
izolatların, gıdalarda starter olarak kullanılan izolatlara göre daha fazla virulans
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
28
faktöre sahip olduğunu tespit etmişlerdir. İzole edilen Enterococcus faecium
suşlarında ise virulans faktöre rastlamamışlardır.
Giraffa (2002), İsveç’te perakende satışa sunulan tavuklardan izole edilen
Enterococcus türlerinde tetracycline, erythoromycin ve vancomycin gibi
antibiyotiklere karşı direnç tespit edildiğini ve bacitracin, choloamphenicol,
erythoromycin, gentamicin, penicilin, rifampicin, tetracycline ve streptomycine karşı
dirençli Enterococcus türlerinin dilimlenmiş et, sucuk, biftek, domuz eti ve çiğ
etlerden izole edildiğini bildirmiştir.
Lukasova ve Sustackova (2003), sucuk ve çiğ sütten izole edilen
Enterococcus türlerinin, tetracycline, chloramphenicol, gentamicin, erythromycin’e
karşı direnç tespit edildiğini belirterek, bir çalışmada Enterecoccus faecium ve
Enterecoccus faecalis’in tetracyclin direnç genlerini Lactococcus lactis sub species
lactis var diacetylactis’in kromozomuna transferinin gösterildiğini bildirmişlerdir.
Yaptıkları çalışmada ise Mısır Dominati peynirlerinden izole ettikleri Enterecoccus
faecium suşlarının oxacillin, caphazolin’e karşı dirençli, ampicillin, amoxicillin ve
cefaclor’a hassas olduğu tespit etmişlerdir.
Cocconcelli ve ark. (2003), model peynir ve fermente sucuk üretiminde klinik
kaynaktan alınan Enterococcus faecalis’in antibiyotik direnç ve virülans genlerini
fermantasyon sırasında gıda kaynaklı Enterococcus faecalis’e transfer edebildiğini
göstermişlerdir.
Erdem ve ark. (2004), hastanede yatan hastalardan izole edilen 17
Enterococcus faecalis ve 10 Enterococcus faecium suşunun aminoglikozidlere karşı
yüksek derecede dirençli olduğunu tespit etmişlerdir.
Hugas ve ark. (2003), Enterococcus türlerinin konjugasyonla genetik
özelliklerini değiştirebilme kabiliyetinde olduklarını belirterek, salam ve çiğ et gibi et
ürünlerinden izole edilen Enterococcus türlerinin antibiyotik direnç deteminantlarını
Enterococcus faecalis JH2-2’ye transfer ettiklerini bildirmişlerdir.
Mannu ve ark. (2003), süt ürünlerinden izole edilen 40 Enterococcus faecium,
dışkılardan izole edilen 28 Enterococcus faecium ve klinik izolatlardan izole edilen
28 Enterococcus faecium suşunun antbiyotik direnci ve virulans faktörlerini
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşegül KARAKAŞ
29
araştırmışlardır. Sonuçta kinik izolatların gıda kaynaklı izolatlardan daha patojenik
olduğunu göstermişlerdir.
2.3.8. Enterococcus faecium’un Vancomycin Direnci İle İlgili Yapılan
Çalışmalar
Wegener ve ark. (1996), kesimhanelerden ve marketlerden aldıkları et
ürünlerinden izole ettikleri Enterococcus faecium suşlarında vancomycin direnci
tespit etmişlerdir.
Giraffa ve Sisto (1997), peynirlerden izole edilen Enterococcus faecium ve
Enterococcus faecalis suşlarının vancomycin’e direnç göstermediğini tespit
etmişlerdir.
Robredo ve ark. (2000), 18 farklı süpermarketten alınan 101 tavuk, domuz ve
hindi etlerinde ve 50 kesimhaneden alınan tavuk dışkılarında VRE varlığını
araştırmışlardır. Tavuk örneklerinin % 27.2’sinde, tavuk dışkılarının ise % 16’sından
VRE tespit edilmiştir. VRE’lerin 11 tanesi Enterococcus durans, 10 tanesi
Enterococcus faecalis, 10 tanesi ise Enterococcus faecium olarak tanımlanmıştır.
Başustaoğlu ve ark. (2001), Ankara’da akut lösemi olan bir hastanın kanından
vancomycin’e dirençli Enterococcus faecium izole ederek, bu olayın Türkiye’de
izole edilen ilk glikopeptide dirençli Enterococcus faecium suşu olduğunu
bildirmişlerdir. Yaptıkları çalışmada 1266 alet, 176 rektal örnek ve hastanede bir
haftadan fazla kalan hastalarda vancomycin’e dirençli Enterococcus türlerinin
varlığını araştırmışlar, ancak hiçbir örnekten vancomyine dirençli Enterococcus
faecium izole edememişlerdir.
Hauben (2003), vancomycin’e dirençli 148 Enterococcus türünün pastörize et
ürünleri ile fermente sucuklarda gelişebilme özelliklerini araştırmışlar ve 143
Enterococcus faecium suşunun bütün et ürünlerinde canlılığını sürdürebildiğini
belirtmişlerdir.
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
30
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
Araştırmada Adana ilindeki çeşitli market ve pazardan temin edilen farklı
firmalara ait olan 30 beyaz peynir örneği ve 20 sucuk örneği kullanılmıştır.
3.1.1. Referans Suşlar
Araştırmada referans suş olarak, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı
Hastanesi’nden temin edilen Enterococcus faecium 1045803 ve Enterococcus
faecalis 1047387 suşları kullanılmıştır.
3.1.2. Besiyerleri
Araştırmada kullanılan besiyerleri ve kullanım amaçları Çizelge 3.1’de
verilmiştir.
3.1.3. Kimyasal Maddeler
Araştırmada kullanılan kimyasal maddeler aşağıda belirtilmiştir.
Kimyasal Maddeler Özellik
Sodium azide Merck
Vancomycin MP Biomedicals
Koyun Kanı RSHM
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
31
Çizelge 3.1. Araştırmada Kullanılan Besiyerleri ve Kullanım Amaçları
Besiyeri Özellik Kullanım Amacı İnkübasyon
Koşulları Kanamycin Aesculin Azide Agar (KAA)
Merck Enterococcus İzolasyonu ve Sayımı
37 ºC’de 24-48 Saat , Aerob
Bile Esculin Azide Agar (BEA)
Acumedia
Enterococcus İzolasyonu ve Sayımı
37 ºC’de 24 Saat, Aerob
Trypticase Soy Agar
Merck
Hemoliz
37 ºC’de 24 Saat, Aerob
% 6.5 NaCl’de Gelişim 37 ºC’de 48 Saat, Aerob 10 ºC’de 48 Saat, Aerob
Trypticase Soy Agar -Broth (CASO)
Merck
Değişik Sıcaklıklarda Gelişim 45 ºC’de 48 Saat, Aerob
% 6.5 NaCl’de Gelişim 37 ºC’de 48 Saat, Aerob 10 ºC’de 48 Saat, Aerob
ManRogosa Sharpe Agar-Broth (MRS)
Merck
Değişik Sıcaklıklarda Gelişim 45 ºC’de 48 Saat, Aerob
% 6.5 NaCl’de Gelişim 37 ºC’de 48 Saat, Aerob 10 ºC’de 48 Saat, Aerob
M17 Agar- Broth
Merck
Değişik Sıcaklıklarda Gelişim 45 ºC’de 48 Saat, Aerob
Glikoz Fosfat Broth
Glikozdan Gaz Üretimi
37 ºC’de 48 Saat, Aerob
3.2. Metot
3.2.1 Örneklerin Analize Hazırlanması
Beyaz peynir ve sucuk örnekleri laboratuara getirilerek aynı gün analize
alınmıştır. Örneklerde Enterococcus faecium varlığını belirlemek ve sayım için 90 ml
seyreltme sıvısı (%0.85 NaCl, % 0.1 pepton) bulunan erlen içerisine 10’ar g. peynir
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
32
ve sucuk örnekleri tartılmış ve Ultraturax homojenizatörde 5000 devirde 10 d.
homojenizasyon işlemi uygulanarak, 10 d. bekletilmiştir. Daha sonra hazırlanan
örneklere 10-1’lik dilüsyonlarla gerekli seyreltmeler yapılmıştır.
3.2.2. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ve Sayımı
Gerekli seyreltmeleri yapılan örnekler Kanamycin Aesculin Azide Agar ve
Bile Aesculin Azide Agar besiyerlerine yayma kültürel ekim yöntemi kullanılarak
ekilmiştir. BEA besiyerine sterilizasyondan sonra, 0.2 g/l sodium azide eklenerek
besiyeri selektif hale getirilmiştir.
BEA besiyeri 24 saat 37 ºC’de, KAA besiyeri ise 24-48 saat 37 ºC’de inkübe
edildikten sonra, koloni etrafında siyah halka oluşturan bakteriler şüpheli koloniler
olarak değerlendirilerek, bu kültürlerin sayımları alınmıştır. Ayrıca şüpheli koloniler
sürme ekim yöntemi ile Man Rogosa Sharpe (MRS) agarda saflaştırılmıştır.
3.2.3. Enterococcus faecium’un Tanımlanması
Enterococcus faecium’un tanımlanması için yapılan analizler ve işlem
basamakları şekil 3.1. ve 3.2’de özetlenmiştir. Şüpheli koloniler gram boyamaya tabi
tutulmuş ve gram (+) koklar belirlenerek, katalaz testi yapılmıştır. Katalaz (-) olan
suşların değişik sıcaklıklardaki ve % 6.5 NaCl tuzda gelişimleri ile glikozdan gaz
üretme gibi özellikleri tespit edilmiştir.
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
33
Gram Pozitif, Katalaz Negatif, Kok Şekilli İzolatlar
% 6.5 NaCl ve 10 0C ve 45 0C’de Gelişim
EVET
Glikozdan Gaz Üretimi
HAYIR
Biyokimyasal Analizler (API 20STREP)
Şekil 3.1. Enterococcus faecium’un Tanımlanması (Klein, 2003)
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
34
0.2 g/l Sodium Azide Peynir ve Sucuk Örnekleri
BEA
BEA ve KAA Besiyerlerinde 37 ºC’de 24 s. İnkübasyon
Siyah Halkalı Koloniler
Gram (+)/ Katalaz (-) Kok
Tuz Toleransı (+) Sıcaklık Toleransı (+)
%6.5 NaCl İçeren MRS, MRS, M17,CASO Broth-agar M17, CASO Broth-agar
37 ºC’de 48 s.İnkübasyon 10 ºC ve 45 ºC’de 48 s. İnkübasyon
Glikozdan Gaz Üretimi (-)
Glikoz Fosfat Broth 37 ºC’de 48 s. İnkübasyon
Biyokimyasal Tanımlama (API 20 Strep)
Enterococcus spp.
Vanomycin Direnci Hemoliz CASO Agar (4 ve 6 µg ml-1 vancomycin) MRS Agar (%1 Koyun Kanı)
(37 ºC’de 24 s. İnkübasyon) (37 ºC’de 24 s. İnkübasyon)
Gelişim (-) Gelişim (+) Koloni Etrafında Şeffaf Zon
Dirençsiz Dirençli β-Hemoliz Şekil 3.2. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ve Tanımlanması
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
35
3.2.3.1. Tuz Toleranslarının Belirlenmesi
İzolatların tuz toleranslarını belirlemek amacıyla % 6.5 NaCl içeren MRS
broth-agar, M17 broth-agar, CASO broth-agar besiyerleri kullanılmıştır. Kültürler
4000 devirde 15 d. santrifüj edilerek besiyeri atılmıştır. 1 ml saf su ile
sulandırıldıktan sonra yukarıda belirtilen besiyerlerine ekim yapılmıştır. Kültürlerin
37 ºC’de 48 saat inkübasyondan sonra gelişimleri incelenmiştir.
3.2.3.2. Sıcaklık Toleranslarının Belirlenmesi
İzolatların sıcaklık toleranslarının belirlenmesi için MRS broth-agar, M17
broth-agar, CASO broth-agar hazırlanmıştır. 48 saat inkübasyondan sonra suşların
10 ºC ve 45 ºC’deki gelişimleri incelenmiştir (Facklam ve ark., 2002).
3.2.3.3. Glikozdan Gaz Üretimi
İzolatların glikozdan gaz üretimlerini test etmek amacıyla glikoz fosfat broth
içeren tüplere durham tüpü konularak 37 ºC’de 24 saat inkübe edilmiş ve gaz
üretmeyen kültürler değerlendirmeye alınmıştır.
% 6.5 tuz içeren besiyerinde, 10 ºC’de ve 45 ºC’de gelişim gösteren ve
glikozdan gaz üretmeyen kültürler biyokimyasal analizlere tabi tutulmuştur (Facklam
ve ark., 2002).
3.2.3.4. API Testi
Elde edilen kültürlerin bazı biyokimyasal özelliklerini değerlendirmek
amacıyla API 20 Strep (Biomeriux) test kiti kullanılmıştır. Bu test kiti Streptococcus
ve Enterococcus türlerinin tanımlanması için 20 biyokimyasal test içermektedir.
API sistemindeki biyokimyasal testlere göre elde edilen pozitif ve negatif
sonuçlar bilgisayar programında değerlendirilmiştir. Şekil 3.3’de API 20 Strep
sisteminin uygulaması gösterilmektedir (Biomerieux, 2004).
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
36
Koloni
API Suspension Medium 2 ml
100 µl 500µl
VP HIP ESC PYRA αGAL βGUR βGAL PAL LAP ADH
API GP Medium
RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG
RIB GLYC : Mineral Yağ Ekleme
37 ºC’de 4 Saat İnkübasyon VP HIP ESC PYRA αGAL βGUR βGAL PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG
VP VP1 + VP2 (10 Dakika Bekleme) HIP NIN (10 Dakika Bekleme)
PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP ZYMA + ZYMB
+ - + - + - (Biyokimyasal Reaksiyondaki Renk Değişimine Göre Değerlendirme)
API Lab Bilgisayar Programında Okuma (Not: API 20 Strep Analytical Profile Index’te sonuç vermeyenler 37 ºC’de 24 saatlik inkübasyon sonunda tekrar değerlendirme yapılmıştır)
Şekil 3.3. API 20 Strep Test Sistemi (Biomerieux, 2004)
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
37
3.2.3.5. Vancomycin Direnç Testi
Vancomycin direncini tespit etmek amacıyla BEA besiyerlerine 4 µg ml-1 ve
6 µg ml-1 vancomycin eklenerek sürme ekim yapılmıştır. Ekim yapan kültürlerden
vancomycin içeren besiyerinde gelişim gösterenler vancomycin’e dirençli olarak
değerlendirilmiştir (Facklam ve ark., 2002).
3.2.3.6. Hemoliz Testi
Enterococcus türlerinin hemoliz varlığının araştırılmasında % 1 (w/v) koyun
kanı içeren Trypticase soy agara ekim yapılmıştır. Kanlı agarda üretildiklerinde
koloni çevresinde şeffaf bir zon oluşturan koloniler β hemoliz özelliği
göstermektedirler (Wilke, 2005).
Çizelge 3.2’de Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis’in bazı
karakteristikleri verilmiştir.
3. MATERYAL VE METOT Ayşegül KARAKAŞ
38
Çizelge 3.2. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis’in Bazı Karakteristikleri (Koneman ve ark., 1994; Domig ve ark., 2003)
KARAKTERİSTİKLERİ Enterococcus faecium Enterococcus faecalis
Hareketlilik - - 45°C'de Gelişim + + 50°C'de Gelişim + + 10°C'de Gelişim + + %6.5 NaCl' de Gelişim + +/- pH 9.6’da Gelişim + + %40 Safrada Gelişim + + 60°C'de 30 dak. Direnç + + % 0.04 Tellurite’de Gelişim - + % 0.01 Tetrazolium’da Gelişim - + Sarı Pigment Üretimi - Hemoliz D +/- Hareketlilik - - Glikozdan Gaz Üretimi - - Katalaz Testi - - Argininden Amonyak Üretimi + + Mannitolden Asit Üretimi + + Arginin Hidrolizi + Hippurate Hidrolizi D+ Voges-Proskauer Reaksiyonu + D-Xylose’den Asit Üretimi D- L-Rahamnose’den Asit Üretimi D- Sükrozdan Asit Üretimi D+ + Laktozdan Asit Üretimi + + Mellibiose’den Asit Üretimi D+ - Raffinozdan Asit Üretimi - - Melezitose’den Asit Üretimi - + Adonitolden Asit Üretimi - Sorbitolden Asit Üretimi D- + Laktik Asit Üretimi L APPA - PYRA + Alkali Fosfataz - Piruvat Fermantasyonu - D-Arabitol - L-Arabitol - Dulcital - 2-Ketoglukan -
APPA: Alanil-Fenilalanil-Prolinerylamidase; PYRA:Pyrolidonylarylamidase; D: Değişken; L: L (+)
Laktik Asit; D +: Genellikle Pozitif; D -: Genellikle Negatif; + : Pozitif; - : Negatif
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
39
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
Araştırmada 20 sucuk ve 30 peynir örneğinde Enterococcus faecium varlığı
araştırılmıştır. Bu ürünlerden izole edilen Enterococcus faecium suşlarının ve diğer
Enterococcus spp.’nin tanımlamaları yapılarak, vancomycin dirençleri ve virulans
faktör olan hemoliz varlığı araştırılmıştır. Ayrıca elde edilen sonuçlar referans olarak
kullanılan klinik kökenli Enterococcus spp. ile karşılaştırılmştır.
4.1. Enterococcus faecium’un İzolasyonu ve Tanımlanması
4.1.1. Enterococcus faecium’un İzolasyonu
BEA ve KAA agardan sucuk ve peynir örneklerine ait olan ve izole edilen
şüpheli koloniler gram boyamaya tabi tutularak, gram (+) kok olanlara katalaz testi
uygulanmıştır. Katalaz (-) olan kolonilerin, 10 ºC ve 45 ºC sıcaklıklardaki ve % 6,5
NaCl tuzda gelişimleri incelenmiş ve bu koşullarda gelişme gösteren suşların
glikozdan gaz oluşturma özellikleri değerlendirilmiştir. Glikozdan gaz oluşturmayan
suşlar, daha sonra tanımlanmak üzere stok kültür olarak saklanmıştır. Çizelge 4.1’de
peynir ve sucuk örneklerinden elde edilen analiz sonuçları görülmektedir.
Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları
Örnek No
İzolat No
Kaynak Gram
Boyama
Şekil Katalaz
Testi
%6.5 NaCl'
de Gelişim
10 ºC' de
Gelişim
45 ºC' de
Gelişim
Glikozdan Gaz
Üretimi
1 1 Peynir - Çubuk 1 2 Peynir - Çubuk 2 3 Peynir + Kok - - - - 2 4 Peynir + Kok - - - - 2 5 Peynir + Çubuk 2 6 Peynir - Kok 3 7 Peynir + Kok - - 3 8 Peynir - Çubuk 4 9 Peynir + Kok - + - - 4 10 Peynir + Kok - + - - 4 11 Peynir + Kok - - - - 4 12 Peynir - Çubuk 5 13 Peynir + Kok - + - -
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
40
Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları
Örnek No
İzolat No
Kaynak Gram
Boyama
Şekil Katalaz
Testi
%6.5 NaCl'
de Gelişim
10 ºC' de
Gelişim
45 ºC' de
Gelişim
Glikozdan Gaz
Üretimi
5 14 Peynir - Kok 6 15 Peynir + Kok - + - - 6 16 Peynir + Kok - + - - 6 17 Peynir + Kok - - 7 18 Peynir + Kok - - 7 19 Peynir - Çubuk 7 20 Peynir - Kok 7 21 Peynir + Kok - - - - 7 22 Peynir - Kok 8 23 Peynir + Kok - - 8 24 Peynir + Kok - - 8 25 Peynir + Kok + 8 26 Peynir - Çubuk 8 27 Peynir + Kok - + + + - 9 28 Peynir + Kok - + + + - 9 29 Peynir + Kok - - - -
10 30 Peynir - Çubuk 10 31 Peynir - Çubuk 11 32 Peynir + Kok + 11 33 Peynir - Kok 12 34 Peynir + Kok - + - - 13 35 Peynir + Kok - - 14 36 Peynir + Kok - - 15 37 Peynir + Çubuk - 16 38 Peynir - Kok 17 39 Peynir - Kok 17 40 Peynir - Kok 17 41 Peynir + Çubuk 18 42 Peynir - Kok 18 43 Peynir + Kok - - 19 44 Peynir + Kok - + + + + 20 45 Peynir + Kok - - - - 20 46 Peynir + Kok - - - - 20 47 Peynir - Kok 21 48 Peynir + Kok - - 21 49 Peynir - Kok 21 50 Peynir + Çubuk 22 51 Peynir - Kok 22 52 Peynir + Kok - - 22 53 Peynir + Kok + 23 54 Peynir + Kok + 23 55 Peynir + Kok - + - - 24 56 Peynir - Çubuk 24 57 Peynir - Kok 24 58 Peynir - Kok 25 59 Peynir + Kok - + - 25 60 Peynir + Kok - + + - 26 61 Peynir + Çubuk 27 62 Peynir - Çubuk
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
41
Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları
Örnek No
İzolat No
Kaynak Gram
Boyama
Şekil Katalaz
Testi
%6.5 NaCl'
de Gelişim
10 ºC' de
Gelişim
45 ºC' de
Gelişim
Glikozdan Gaz
Üretimi
28 63 Peynir + Kok + 28 64 Peynir - Kok 28 65 Peynir + Kok + 29 66 Peynir - Kok 30 67 Peynir + Kok - + + + - 30 68 Peynir + Kok - + + + - 30 69 Peynir + Kok - + + + - 30 70 Peynir - Kok 30 71 Peynir + Kok + 31 72 Sucuk + Kok + 31 73 Sucuk - Kok 32 74 Sucuk - Kok 32 75 Sucuk + Kok - + - - 33 76 Sucuk - Kok 34 77 Sucuk + Çubuk 35 78 Sucuk + Kok + + - - 35 79 Sucuk + Kok - + + + - 36 80 Sucuk + Kok - - 36 81 Sucuk + Kok + 37 82 Sucuk + Kok - + - - 37 83 Sucuk + Kok - - 37 84 Sucuk + Kok + 38 85 Sucuk + Kok + 39 86 Sucuk - Kok 40 87 Sucuk - Kok 40 88 Sucuk + Çubuk 41 89 Sucuk + Kok - - - 41 90 Sucuk + Kok + 41 91 Sucuk - Kok 42 92 Sucuk - Kok 42 93 Sucuk + Kok - - 42 94 Sucuk + Çubuk 43 95 Sucuk + Kok + 44 96 Sucuk - Kok 44 97 Sucuk + Kok + 45 98 Sucuk + Kok - - 45 99 Sucuk + Kok - + + + + 45 100 Sucuk - Kok 46 101 Sucuk + Çubuk 46 102 Sucuk - Kok 46 103 Sucuk + Kok - + - - 47 104 Sucuk + Kok - + + + - 47 105 Sucuk + Kok + 47 107 Sucuk + Kok + 48 108 Sucuk + Kok - + + - + 48 109 Sucuk + Kok - - 49 110 Sucuk - Çubuk
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
42
Çizelge 4.1. Peynir ve Sucuk Örneklerinden Elde Edilen Analiz Sonuçları
Örnek No
İzolat No
Kaynak Gram
Boyama
Şekil Katalaz
Testi
%6.5 NaCl'
de Gelişim
10 ºC' de
Gelişim
45 ºC' de
Gelişim
Glikozdan Gaz
Üretimi
49 111 Sucuk + Kok - - 49 112 Sucuk + Kok + 50 113 Sucuk + Kok - + + + - 50 114 Sucuk + Kok +
Araştırmada 71’i peynir ve 43’ü sucuk örnklerinden olmak üzere toplam 114
suş elde edilmiş ve bu suşların 11’i gram (-) çubuk; 10’u gram (+) çubuk; 23’ü gram
(-) kok; 70’i ise gram (+) kok olarak bulunmuştur. Bu suşlardan gram (+) koklar
seçilerek diğer analizlere tabi tutulmuştur. Bu suşlardan 15’inin % 6,5 NaCl’de
gelişim gösterdiği tespit edilmiştir. Tuza dirençli bulunan bu suşlardan 8’inin 10 ºC
ve 45 ºC sıcaklıklarda geliştiği, katalaz (-) olduğu ve glikozdan gaz üretmediği
bulunmuştur. Daha sonra bu suşların bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ve
tanımlamalarının yapılması amacıyla API testi uygulanmıştır.
4.2. API Testi
Enterococcus türlerinin identifikasyonunda fenotipik testlere alternatif olarak
API 20STREP gibi hazır kitler kullanılaktadır (O’Keeffe ve ark., 1999, Robert ve
ark., 1999; Ramotar ve ark., 2000). Bu araştırmada incelenen sucuk ve peynir
örneklerinden elde edilen izolatların ve referans suşların fenotipik tanımlamaları
yapıldıktan sonra biyokimyasal tanımlamaları API 20STREP (Biomeriux) ile
yapılmıştır. Çizelge 4.2’de tanımlanan suşlar, Çizelge 4.3’de ise API 20STREP test
kiti ile elde edilen analiz sonuçları verilmiştir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
43
Çizelge 4.2. Tanımlanan Suşlar
Örnek No
İzolat No
Elde Edildiği Kaynak
Alındığı Yer ve Satış Şekli
Tür
8 27 Peynir Market/ Ambalajsız
Açıkta Enterococcus avium
9 28 Peynir Market/ Ambalajsız
Açıkta Enterococcus
faecium 30 67 Peynir Pazar Enterococcus durans
30 68 Peynir Pazar Enterococcus
faecium
30 69 Peynir Pazar Enterococcus
faecium 35 79 Sucuk Pazar Enterococcus durans
47 104 Sucuk Pazar Enterococcus
faecium 50 113 Sucuk Pazar Enterococcus avium
Sucuk örneklerinden izole edilen suşların API 20 Strep ile tanımlanması
sonucunda, 3’ünün Enterococcus spp.’ye ait olduğu tespit edilmiş ve bunlardan biri
Enterococcus faecium, ikincisi Enterococcus durans ve üçüncüsü ise Enterococcus
avium olarak tanımlanmıştır.
Analize alınan 30 peynir örneklerinden elde edilen suşlardan 3’ü
Enterococcus faecium, biri Enterococcus durans ve diğeri ise Enterococcus avium
olarak tanımlanmıştır.
Peynir örneklerinde Enterococcus spp.’nin bulunma nedeni, yüksek ve düşük
sıcaklıklarda gelişebilmeleri, tuz ve aside toleranslarından kaynaklanmaktadır (Franz
ve ark., 1999).
Gelsomino ve ark. (2001), bu bakterilerin direkt hayvan ya da insan dışkısıyla
ya da süt tanklarından ve ekipmanlardan bulaştıklarını belirtmişlerdir. Bu gıdalardan
çeşitli Enterococcus türleri izole edilirken, en sık izole edilen türlerin Enterococcus
faecium ve Enterococcus faecalis olduğunu bildirmişlerdir.
Araştırmada Çizelge 4.2’de gösterilen örnekler pazardan ve marketlerden
alınan ve ambalajsız şekilde satılan peynirlerdir. Bu peynirlerden Enterococcus
türlerinin izole edilmesi, üretim sırasında Enterococcus türlerinin fekal ya da
çevresel kontaminasyonla ürüne bulaştığını ya da bu ürünün üretiminde kullanılan
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
44
çiğ sütün yüksek derecede Enterococcus ile kontamine olduğunu düşündürmektedir.
Örneklerin marketlerde ve pazar alanlarında ambalajsız şekilde açıkta satışa
sunulmuş olması nedeniyle, diğer bir Enterococcus kaynağının ise personel olduğu
söylenebilir.
Enterococcus cinsi bakteriler fekal ve çevresel kontaminasyonla etlerde
kolonize olarak, fermente gıdalarda çoğalabilirler (Giraffa, 2003). Papamoli ve ark.
(2002), Enterococcus spp.’nin sucukların fermantasyon ekolojisine kolaylıkla adapte
olabildiklerini bildirmiştir.
Enterococcus türlerinin izole edildiği örnekler pazardan alınan ev yapımı
fermente sucuklardır. Araştırmada kullanılan örneklerdeki Enterococcus varlığı bu
sucukların üretiminde kullanılan etlerde meydana gelen Enterococcus
kontaminasyonunun bir göstergesi olabilir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
45
Çizelge 4.3. API 20STREP Test Kiti ile Elde Edilen Biyokimyasal Test Sonuçları
Resim 4.1, 4.2, 4.3 ve 4.4’de izole edilen Enterococcus faecium suşlarının
API 20STREP ile tanımlanması görülmektedir.
Resim 4.1. Enterococcus faecium (İzolat No: 28) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması
Örnek İzolat No
V P
H I P
E S C
P Y R A
α G A L
β G U R
β G A L
P A L
L A P
A D H
R I B
A R A
M A N
S O R
L A C
T R E
I N U
R A F
A M D
G L Y G
β H E M
Enterococcus
faecalis
1047387 + - + + - - - - + + + - + + + + - - + - +
Enterococcus
faecium
1045803
+ - + + - - - - - + + + + + + + - - - - -
Enterococcus
avium 27 + - + + - - + - + - + - + - + + - - - -
Enterococcus faecium
28 + - + + - - + - + - + + + - + + - - - - - Enterococcus
durans 67 + - + + - - + - - - + - - - + + - - - - +
Enterococcus faecium 68 + - + + - - + - + + + - + - + + - - - - -
Enterococcus faecium 69 + - + + - - + - - + + + + - + + - + - - -
Enterococcus
durans 79 + - + + - - + - - - + - - - + - - - - +
Enterococcus faecium
104 + - + + - - - - - + + + + - + + - + - - - Enterococcus
avium 113 + - + + + - - - - - + + + - + + - + - - -
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
46
Resim 4.2. Enterococcus faecium (İzolat No: 68) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması
Resim 4.3. Enterococcus faecium (İzolat No: 69) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması
Resim 4.4. Enterococcus faecium (İzolat No: 104) Suşunun API 20STREP ile Tanımlanması
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
47
4.3. BEA ve KAA Agar Besiyerlerinin Kıyaslanması
Araştırmada sucuk ve peynir örnekleri KAA agar ve BEA agar besiyerlerine
ekilerek 37 ºC’de 24 saatlik inkübasyondan sonra koloni etrafında siyah hale
oluşturan bakteriler şüpheli Enterococcus türleri olarak değerlendirilmiştir.
Enterococcus cinsi bakterilerin izolasyonlarında 100’den fazla besiyeri
modifikasyonları önerilmektedir. En sık kullanılan besiyerleri KAA agar ve BEA
agardır. Ancak hiçbir besiyerinin bütün Enterococcus cinsi bakteriler için selektif
olmadığı bildirilmektedir (Reuter,1992; Domig ve ark., 2003). Tanımlaması yapılan
Enterococcus türlerinin bu besiyerlerinde alınan sayım sonuçları çizelge 4.4’de
verilmiştir.
Çizelge 4.4. Örneklerden İzole Edilen Enterococcus Türlerinin Sayım
Sonuçları
İzolat No
Kaynak Tür Sayım KAA
(kob/g) Sayım BEA
(kob/g) 27 Peynir Enterococcus avium 17.5 x 101 < 10
28 Peynir Enterococcus
faecium 2.3 x 106 < 10
67 Peynir Enterococcus
durans 1.6 x 103 < 10
68 Peynir Enterococcus
faecium 2 x 101 < 10
69 Peynir Enterococcus
faecium < 10 3 x 103
79 Sucuk Enterococcus
durans 2 x 101 < 10
104 Sucuk Enterococcus
faecium 9.4 x 105 < 10
113 Sucuk Enterococcus avium 3 x 103 < 10
Araştırmada fermente sucuklardan izole edilen türlerden biri Enterococcus
faecium olarak tanımlanırken, Enterococcus avium ve Enterococcus durans gibi
Enterococcus türleri de izole edilmiştir. Bu türlerin sayımları KAA agarda sırasıyla
2 x 101 ; 9.4 x 105 ; 3 x 103 kob/g olarak tespit edilmiştir. Ancak bu türler için BEA
agarda alınan sayım sonuçları ise <10 bulunmuştur.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
48
Hugas-Maurici ve ark. (1999), fermente edilerek üretilen kümes hayvanları ve
domuz eti ürünleri ile biftekteki Enterococcus sayılarının 102-104 cfu/g arasında
değiştiğini belirtmişlerdir.
Franz ve ark. (1999), çeşitli sucuklardan Enterococcus izole edildiğini
belirterek, bu ürünlerdeki Enterococcus sayısının 102-2,6 x 105 arasında olduğunu
bildirmişlerdir.
Bu araştırmada sucuklardan elde edilen Enterococcus spp. sayımlarının Franz
ve ark. (1999) ve Hugas-Maurici ve ark. (1999) ile paralel olduğu görülmektedir.
Araştırmada peynir örneklerinden ise Enterococcus faecium, Enterococcus
avium, Enterococcus durans türleri izole edilmiştir. İzole edilen Enteorcoccus
faecium türlerinin KAA agarda sayımları ise sırasıyla 2.3 x 106 ve 2 x 101 kob/g
olarak tespit edilirken, BEA agarda alınan sayımlar <10 olarak bulunurken, 69 nolu
izolat için 3 x 103 kob/g olarak bulunmuştur.
Enterococcus spp. psikrotrofik doğası, sıcaklığa direnci, değişik substratlara
adaptasyonu ve gelişim koşulları nedeniyle, sayıları sütlerin soğutulması sırasında ya
da pastörizasyondan sonra artabilmekte ve bu türler hem çiğ sütün, hem de pastörize
sütün mikroflorasının bir parçası olabilmektedir (Giraffa, 2003). Enterococcus’ların
pastörizasyondan sonra canlılıklarını sürdürebilmeleri sözkonusudur (Arizcun ve
ark., 1997).
Arizcun ve ark. (1997), peynirlerdeki Enterococcus sayısının 104-107 cfu/g
olduğunu bildirmişlerdir.
Franz ve ark. (1999), Enterococcus sayısının farklı peynirlerde 104-106 cfu/g;
tamamen olgunlaştırılmış peynirlerde ise 105-107 cfu/g olduğunu bildirmişlerdir.
Sayılarının peynir çeşidine göre değiştiğini belirterek, Enterococcus faecium ve
Enterococcus faecalis’in peynirlerden izole edilen baskın türler olduğunu
belirtmişlerdir.
Cogan ve ark. (2001), Enterococcus’ların sayılarının peynirlerde 107-108
cfu/g’a ulaşabildiğini bildirmişlerdir.
Sarantinopoulos ve ark. (2003), tamamen olgunlaştırılmış peynirlerde baskın
mikroorganizmalar olduklarını vurgulayarak, sayılarının peynirlerde 104-107 cfu /g;
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
49
tamamen olgunlaştırılmış peynirlerde ise 105-107 cfu/g arasında olduğunu
bildirmiştir.
Araştırmada peynir örneklerinden elde edilen Enterococcus spp. sayıları 101-
106 kob/g arasında değişmektedir.
Araştırmada alınan sayımlar KAA agar besiyerinin daha selektif olduğunu
göstermektedir.
Resim 4.5’de Enterococcus faecium’un KAA besiyerinde, resim 4.6’de ise
Enterococcus faecium’un BEA besiyerinde koloni görünüşü verilmektedir.
Resim 4.5. Enterococcus faecium 1045803 Suşunun KAA Besiyerinde Görünüşü
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
50
Resim 4.6. Enterococcus faecium 1045803 Suşunun BEA Besiyerinde Görünüşü
4.4. Enterococcus spp.’nin Hemoliz Varlığının Belirlenmesi
Enterococcus türlerinin hemoliz varlığının araştırılmasında % 1 (w/v) koyun
kanı içeren Trypticase soy agara ekim yapılarak 37 ºC’de 24 saatlik inkübasyondan
sonra, kanlı agarda ürediklerinde koloni çevresinde şeffaf bir zon oluşturan izolatlar
β hemoliz özelliği taşıdığı şeklinde değerlendirilmiştir. Çizelge 4.5’de β hemoliz testi
sonuçları gösterilmektedir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
51
Çizelge 4.5. β Hemoliz Testi Sonuçları
İzolat No
Tür Elde Edildiği
Kaynak β Hemoliz
Referans Enterococcus faecalis 1047387 Referans Suş +
Referans Enterococcus faecium 1045803 Referans Suş -
27 Enterococcus avium Peynir - 28 Enterococcus faecium Peynir - 67 Enterococcus durans Peynir + 68 Enterococcus faecium Peynir - 69 Enterococcus faecium Peynir - 79 Enterococcus durans Sucuk +
104 Enterococcus faecium Sucuk - 113 Enterococcus avium Sucuk -
Çalışmada izole edilen Enterococcus türlerinden sadece biri peynir ve diğeri
sucuk örneklerinden izole edilen Enterococcus durans suşlarının ve referans olarak
kullanılan suşlardan Enterococcus faecalis 1047387 suşunun β hemoliz özelliği
gösterdiği belirlenmiştir. İzole edilen Enterococcus faecium suşlarında ise virulans
faktör olan ise hemoliz varlığına rastlanmamıştır.
β hemolizin hayvansal modeller üzerinde yapılan çalışmalar sonucunda
virulans faktör olduğu tespit edilmiştir (Franz ve ark., 1999). İnsan enfeksiyonlarında
ise enfeksiyonun şiddetinde rol oynadığı bildirilmektedir (De Vuyst ve ark., 2003).
Enfeksiyon yapan klinik Enterococcus suşlarının % 60’ının β hemoliz özelliği
gösterdiği tespit edilmiştir (Franz ve ark., 1999). Bu nedenle β hemolizin tespit
edilmesi klinik tanı bakımından önemlidir (Elsner ve Sobottkal, 2000). Ancak
hemolitik aktivitenin bulunmaması bu suşun virulans olmadığı anlamına gelmez (De
Vuyst ve ark., 2003).
β hemolitik suşlar daha çok Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium
suşlarında bulunmaktadır. Ancak β hemolizin Enterococcus durans, Enterococcus
casseliflavus, Enterococcus avium ve Enterococcus raffinosus gibi türlerde de
bulunduğu tespit edilmiştir (Semedo ve ark., 2003).
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ayşegül KARAKAŞ
52
4.5. Enterococcus spp.’nin Vancomycin Dirençleri
Vancomycin direncini tespit etmek amacıyla BEA besiyerlerine 4 µg ml-1 ve
6 µg ml-1 vancomycin eklenerek sürme ekim yapılmış ve gelişim gösteren suşlar
vancomycin’e dirençli olarak değerlendirilmiştir. Sonuçta izole edilen türlerin
vancomycin’e karşı direnç göstermedikleri tespit edilmiştir. Vancomycin direnci
sadece referans olarak kullanılan Enterococcus faecium 1045803 suşunda
bulunmuştur. Çizelge 4.6’da vancomycin direnç testi sonuçları görülmektedir.
Çizelge 4.6. Vancomycin Direnç Testi Sonuçları
İzolat No
Tür Elde Edildiği
Kaynak Vancomycin
Direnci
Referans Enterococcus faecalis 1047387
Referans Suş -
Referans Enterococcus faecium 1045803
Referans Suş +
27 Enterococcus avium Peynir - 28 Enterococcus faecium Peynir - 67 Enterococcus durans Peynir - 68 Enterococcus faecium Peynir - 69 Enterococcus faecium Peynir - 79 Enterococcus durans Sucuk -
104 Enterococcus faecium Sucuk - 113 Enterococcus avium Sucuk -
Vancomycin immun sistemi zayıf ya da bastırılmış bireylerde, penicillin’e
karşı alerji gösteren hastalarda ve Staphylococcus aureus enfeksiyonlarının
tedavisinde en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir (Klein, 2003).
Vancomycin’e dirençli Enterococcus türlerinin ortaya çıkmasıyla Enterococcus’lar
kullanılan bütün antibiyotiklere karşı direnç kazanmış durumdadırlar (Wegener ve
ark., 1997).
Bazı kaynaklarda Enterococcus faecium’un antibiyotiklere karşı
Enterococcus faecalis’ten daha dirençli olduğu belirtilmektedir (Quednau ve ark.,
1999).
5. SONUÇ Ayşegül KARAKAŞ
53
5. SONUÇ
Analize alınan 20 farklı sucuk örneğinden izole edilen ve Enterococcus spp.
olarak belirlenen 3 izolatın tanımlamaları sonucunda bu izolatların Enterococcus
durans, Enterococcus avium ve Enterococcus faecium türleri oldukları belirlenmiştir.
Analize alınan 30 farklı peynir örneğinden elde edilen kültürlerin
tanımlamaları sonucunda ise Enterococcus spp. olarak tanımlanan izolatlardan
3’ünün Enterococcus faecium, 1’inin Enterococcus durans ve 1’inin de
Enterococcus avium türleri oldukları belirlenmiştir.
Enterococcus türleri fekal kontaminasyon sonucunda gıdalarda
bulunmaktadırlar. Araştırmaya alınan peynir ve sucuk örneklerindeki Enterococcus
spp. varlığı, bu gıdaların üretimlerinde kullanılan hammaddelerinin yüksek derecede
Enterococcus spp. ile kontamine olduğunu düşündürmektedir. Enterococcus spp.’nin
gıdalara insanlar aracılığı ile el teması sonucunda da bulaşmaktadır. Bu çalışmadaki
Enterococcus türlerinin izole edildiği peynir ve sucuk örneklerinin pazar ve
marketlerde ambalajsız şekilde satışa sunulmuş olmaları, sözkonusu gıdalarda
insanlardan kaynaklanan Enterococcus kontaminasyonunun da bir göstergesi olabilir.
Çalışmada kullanılan farklı iki besiyerinde alınan sonuçların kıyaslaması da
yapılmıştır. Araştırmada sucuklardan izole edilen Enterococcus faecium,
Enterococcus avium, Enterococcus durans suşları için KAA besiyerlerinden elde
edilen sayım sonuçları sırasıyla 2 x 101 ; 9.4 x 105 ; 3 x 103 kob/g olarak tespit
edilirken, BEA agarda alınan sayım sonuçları ise <10 bulunmuştur.
Peynirlerden izole edilen Enteorcoccus faecium türlerinin KAA agarda
sayımları ise sırasıyla 2.3 x 106 ve 2 x 101 kob/g olarak tespit edilirken, BEA agarda
alınan sayımlar <10 olarak bulunurken, sadece 69 nolu izolat için BEA agarda alınan
sayım sonucu 3 x 103 kob/g olarak bulunmuştur. Sonuçta Enterococcus spp.’nin
izolasyonunda KAA besiyerinin BEA besiyerine göre daha yüksek sayım verdiği ve
daha selektif olduğu bulunmuştur.
Çalışmada izole edilen Enterococcus suşlarında β hemoliz özelliği
araştırılmış ve Enterococcus durans suşlarının yanı sıra referans olarak kullanılan
5. SONUÇ Ayşegül KARAKAŞ
54
klinik suşlardan Enterococcus faecalis 1047387 suşunun β hemoliz özelliğine sahip
olduğu bulunmuştur. Enterococcus faecium izolatlarında ise virulans faktör olan ise
β hemoliz özelliğine rastlanmamıştır
Araştırmada izolatların vancomycin’e dirençleri de araştırılmıştır. Sonuçta
izole edilen suşların vancomycin’e karşı dirençli olmadıkları tespit edilmiştir. Sadece
referans olarak kullanılan Enterococcus faecium 1045803 suşu vancomycin’e
dirençli olarak bulunmuştur.
Enterococcus suşlarının gıdalarda starter ve probiyotik kültür olarak
kullanılması gıda güvenliği açısından çok iyi değerlendirilmelidir. Enfeksiyon yapan
Enterococcus türlerinin gıdalarda bulunmaları istenmemektedir. Hastalık yapan
Enterococcus türleri ile gıdalarda bulunan Enterococcus türleri birbirleriyle
ilişkilendirilmemesine rağmen, bu bakterilerin starter kültür ve/veya probiyotik
kültür olarak, gıda zincirine girecek suşların seçilmesinde daha dikkatli olmayı
gerektirmektedir. Günümüzde halen Enterococcus türlerinin starter ve probiyotik
kültür olarak kullanılmalarının güvenilir olup olmadıklarına cevap vermek güçtür.
Bu organizmaların endüstriyel alanda ve gıda üretimlerinde kullanılmaları halen
sorgulanmaktadır. Gıdalarda starter ve probiyotik olarak kullanılacak Enterococcus
türlerinin glikopeptidlere ve diğer antibiyotiklere direnci ve hemoliz oluşturmalarının
yanı sıra diğer virulans özellikleri de taşıyıp taşımadıkları araştırılmalıdır.
55
KAYNAKLAR
AHMAD, M.; SMITH, D., G.; MAHBOOB, S., 2002. Effect of pH Medium During
Growth on Heat Tolerance of Enterococcus faecium and Enterococcus
faecalis. OnLine Journal of Biological Sciences, 2, 7, 502-504.
AHMAD, M.; SMITH, D., G.; MAHBOOB, S., 2002. Effect of NaCl on Heat
Tolerance of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis. OnLine
Journal of Biological Sciences, 2, 7, 483-484.
ARIZCUN, C.; BARCINA, Y.; TORRE, P.; 1997. Identifıcation and
Characterization of Proteolytic Activity of Enterococcus faecium spp.
Isolated from Milk and Roncal and Idiazabal Cheese. International Journal of
Food Microbiology, 38, 17-24.
AUDISIO, M., C., OLIVER, G., APELLA, M., C., 2001. Effect of Different
Complex Carbon Sources on Growth and Bactericin Synthesis of
Enterococcus faecium. International Journal of Food Microbiology, 63, 235-
241.
BARAKAT, R., K.; GRIFFITHS, M., W.; HARRIS, L., J.; 2000. Isolation and
Characterisation of Carnobacterium, Lactococcus, and Enterococcus spp.
From Cooked, Modified Atmosphere Packed, Refrigerated, Poultry Meat.
International Journal of Food Microbiology, 62, 83-94.
BARTON, A., L.; GARY, V.; 1995. Selective Media For Detecting Gastrointestinal
Carriage of Vancomycin Resistant Enterococci. Diagnostic Microbiology and
Infectious Diasease, Vol, 23, No. 3, 119-122.
BAYİZİT VE YILSAY, 2000. Süt ve Ürünlerinde Bulunan Laktik Asit
Bakterilerinin Oluşturduğu Bakteriosinler. ALINMIŞTIR. DEMİRCİ, M. Süt
Mikrobiyolojisi ve Katkı Madeleri. Tekirdağ, 595s.
BAŞUSTAOĞLU, A.; AYDOĞAN, H.; BEYAN, C.; YALÇIN, A.; ÜNAL, S.,
2001. First Glycopeptie-Resistant Enterococcus faecium Isolate From Blood
Culture in Ankara, Turkey. Emerging Infectious Diseases, Vol. 7, No. 1, 1-3.
BIOMERIEUX, 2004. API 20 STREP. Identification System for Streptococcus and
Related Organisms. 07625F-GB/08.
56
BIROLLO, G., A.; REINHEMIER, J., A.; VINDEROLA, C., G.; 2001. Enterococci
vs non-lactic Acid Microflora as Hygiene Indicators for Sweetened Yoghurt.
Food Microbiology, 18, 597-604.
BODIL, L., ADAMSSON, I.; EDLUND, C.; 2002. Gastrointestinal Transit Survival
of Enterococcus faecium Probiotic Strain Administered With or Without
Vancomycin. International Journal of Food Microbiology, 77, 109-115.
BODIL, L., 2003. Different Roles of Enterococcus faecium from a human
Perspective. Doktorsavhanling Vid Karolinska Intitutet, 3, 435.
BOZKURT, H.; ASLIM, B., 2004. İmmobilizasyonun Probiyotik Kültürlerde
Kullanımı ; Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi, Cilt:2, Sayı:7, 1-14.
BUTAYE, P.; DEVRIESE, L., A.; HAESEBROUCK, F., 1999. Phenotypic
Distinction in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains
Between Susceptibility and Resistance to Growth-Enhancing Antibiotics.
Antimicrobial Agents and Chemoterapy, Vol. 43, No.10, 2569-2570.
BUTAYE, P.; VAN DAMME, K.; DEVRIESE, L., A.; VAN DAMME, L.; BAELE,
M., LAUWERS, S.; HAESEBROUCK, F.; 2000. In vitro Susceptibility of
Enterococcus faecium Isolated From Food to Growth-Promoting and
Therapeutic Antibiotics. International Journal of Food Microbiology, 54, 181-
187.
CALLEWAERT, R.; HUGAS, M.; DE VUYST, L., 2000. Competitivenes and
Bacteriocin Production of Enterococci in the Production of Spanish-style Dry
Fermented Sausages. International Journal of Food Microbiology, 57, 33-42.
CARNIO, M., C.; EPPERT, I.; SCHERER, S.; 1999. Analysis of the Bacterial
Surface Ripening Flora of German and French Smeared Cheeses With
Respect to Their Anti-Listerial Potential. International Journal of Food
Microbiology, 47, 89-97.
COCCONCELLI, P., S.; CATTIVELLI, D.; GAZZOLA, S.; 2003. Gene Transfer of
Vancomycin and Tetracycline Resistances Among Enterococcs faecalis
During Cheese and Sausage Fermentations. International Journal of Food
Microbiology, 88, 315-323.
57
COGAN, T., M.; REA, M., C.; DRINAN, F.; GELSOMINO, R.; 2001. Enterococi in
Food Fermentations: Functional and Safety Aspects. www.teagasc.ie
CRITTENDEN, R., G.; MARTINEZ, N., R.; PLAYNE, M., J.; 2003. Synthesis and
Utilisation of Folate by Yoghurt Starter Cultures and Probiotic Bacteria.
International Journal of Food Microbiology, 80, 217-222.
ÇAKIR, İ.; KARAHAN, A., G.; ÇAKMAKÇI, L., 2002. Probiyotikler ve Etki
Mekanizmaları. Gıda Mühendisliği Dergisi, Vol. 6, No. 12, 15-19.
DE VUYST, L.; 2000. Technology Aspects Releated to The Application of
Functional Starter Cultures. Food Technology Biotechnology, Vol. 38, No. 2,
105-112.
DE VUYST, L.; MORENO, M., R.; REVETS, H.; 2003. Screening for Enterocin and
Detection of Hemolysin and Vancomycin Resistance in Enterococci of
Different Origins. International Journal of Food Microbiology, 84, 299-318.
DEVRIESE, L. A., POT, B., 1995. The Genus Enterecoccus. ALINMIŞTIR,
WOOD, B., J., B., HOLZAPPEL, W., H., The Genera of Lactic Acid
Bacteria,Blackie Academic&Professional, 397s.
DEVRIESE, L., A.; POT, B.; VAN DAMME, L.; KERSTERS, K.;
HAESEBROUCK, F., 1995. Identfication of Enterococcus Species Isolated
From Foods of Animal Origin. International Journal of Food Microbiology,
Vol. 26, No. 2, 187-197.
DOMING, K., J.; MAYER, H., K.; KNEIFEL, W.; 2003. Methods Used for The
Isolation, Enumeration, Characterisation and Identification of Enterococcus
spp. 1. Media for The Isolation and Enumeration. International Journal of
Food Microbiology, 88, 2-3, 147-164.
DOMING, K., J.; MAYER, H., K.; KNEIFEL, W.; 2003. Methods Used for The
Isolation, Enumeration, Characterisation and Identification of Enterococcus
spp. 2. Pheno- and Genotyping Criteria. International Journal of Food
Microbiology, 88, 165-188.
DOYLE, M., E., 2001. Alternatives To Antibiotic Use for Growth Promotion in
Animal Husbandry; FRI Briefings, Food Research Institute.
58
DURLU-ÖZKAYA, F.; TUNAİL, N., 2000. Salamura Beyaz Peynirlerde Biyojen
Amin Riski. ALINMIŞTIR, DEMİRCİ, M., Süt Mikrobiyolojisi ve Katkı
Maddeleri, Tekirdağ, 595s.
EATON, T., J., GASSON, M., J., 2001. Molecular Screening of Enterococcus
Virulance Determinants and Potential for Genetic Exhance Between Food and
Medical Isolated. Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 67, No. 4,
1628-1635.
EATON, T., J.; GASSON, M., J., 2002. A Variant Enterococcal Surface Protein
Espfm In Enterococcus faecium; Distribution Among Food, Commensal,
Medical And Enviromental Isolates. FEMS Microbiology Letters 216, 269-
275.
EL-DIN, B., B., EL-SODA, M.; EZZAT, N., 2002. Proteolitic, Lipolytic And
Autolytic Activities of Enterococci Strains Isolated From Egyptian Dairy
Products. Lait, 82, 289-304.
ELSNER, H., A.; SOBOTTKAL, I.; 2000. Virulence Factors of Enterococcus
faecalis and Enterococcus faecium Blood Culture Isolates. Eur. J. Clin.
microbiol. Infect. Dis., 19, 39-42.
EMBORG, H., D.; ANDERSEN, J., S.; SEYFARTH, A., M.; BOEL, J.,
WENEGER, H., C., 2003. Relations Between The Occurance of Resistance
To Antimicrobial Growth Promoters Among Enterococcus faecium Isolated
From Broilers And Broiler Meat. International Journal of Food Microbiology,
84, 273-284.
ENNAHAR, S.; ASOU,Y.; ZENDO, T.; SONOMOTO, K.; ISHIZAKI, A., 2001.
Biochemical And Genetic Evidence For Production Of Enterocins A And B
By Enterecoccus faecium WHE 81, International Journal of Food
Microbiology, 70, 291-301.
ERDEM, İ.; CİÇEK-ŞENTÜRK, G.; YÜCESOY-DEDE, B.; YÜKSEL-
KOÇDOĞAN, F.; YÜKSEL, S.; KARAGÜL, E., 2004. In Vitro Effect Of
Levofloxacin And Vancomycin Combination Against Aminoglycosid-
Resistant Enterococci. International Journal of Antimicrobial Agents, 20, 92-
94.
59
FACKLAM, R., R.; SAHM, D., S.; TEIXEIRA, L., M.; 2002. Standart Laboratory
Methods For Identifying and Growing Enterococci. Manual of Clinical
Microbiology, ASM Press.
FRAHM, E., OBST, U., 2003. Application of the Flourogenic Probe Technique
(TaqMan PCR) to the Detection of Enterococcus spp. and Escherichia coli in
Water Samples. Journal of Microbiological Methods 52, 123-131.
FRANZ, C., M., A., P., HOLZAPFEL, W., H., STILES, M., E., 1999. Enterococci at
the Crossroad of Food Safety?. International Journal of Food Microbiology,
47, 1-24.
FRANZ, C., M., A., P., MUSCHOLL-SILBERHORN, A., B., YOUSİF, N., M., K.,
VANCANNEYT, M., SWİNGS, J., HOLZAPFEL, W., H., 2001. Incidence
of Virulance Factors and Antibiotic Resistace Among Enterococci Isolated
From Food. Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 67, No. 9, 4385-
4389.
FRANZ, C., M., A., P., STILES, M., E.; SCHLEIFER, K., H.; HOLZAPFEL, W.,
H.; 2003. Enterococci in Foods- A Conundrum for Food Safety. International
Journal of Food Microbiology, 88, 2-3, 105-122.
GARDINER, G., E.; ROSS, R., P.; WAALACE, J., M.; SCANLAN, F., P.;
JAGERS, P., P.; FITZGERI, G., F.; STANTON, C.; 1999. Infuluence of a
Probiotic Adjunct Culture of Enterococcus faecium on The Quality of
Cheddar Cheese. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol. 47, No.
12, 4907-4923.
GAUKEL, V.; SPIEß, W., E., L.; 1998. 3. Karlsruhe Nutrıtıon Symposıum European
Research Towards Safer and Better Food.
GELSOMINO, R.; VANCANNEYT, M.; CODON, S.; SWINGS, J.; COGAN, T.,
M.; 2001. Enterococcal Diversity in the Enviroment of an Irish Cheddar-type
Cheesemaking Factory. International Journal of Food Microbiology, 71, 177-
188.
GELSOMINO, R.; VANCANNEYT, M.; COGAN, T., M.; SWINGS, 2003. Effect
of Raw-Milk Cheese Consumtion on the Enterococcal Flora of Human Feces.
J. Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 69, No. 1, 312-319.
60
GIRAFFA, G.; SISTO, F.; 1997. Susceptibility to Vancomycin of Enterococci
Isolated from Dairy Products. Letters in Applied Microbiology, 25, 335-338.-
GIRAFFA, G.; OLIVARI, A., M.; NEVIANIE., 2000. Isolatıon of Vancomycın-
Resistant Enterococcus faecium from Italıan Cheeses. Food Microbiology,
17, 671-677.
GIRAFFA, G.; 2002. Enterococci From Food. FEMS Microbiology Reviews, 26,
163-171.
GIRAFFA, G.; 2003. Functionality of Enterococci in Dairy Products. International
Journal of Food Microbiology. 88, 2-3, 215-222.
GUESSAS, B.; KIHAL, M.; 2004. Characterisation of Lactic Acid Bacteria Isolated
from Algerian Arid Zone Raw Goat’s Milk. African Journal of
Biotechnology, Vol. 3, No. 6, 339-342.
GÜLMEZ, M.; GÜVEN, A., 2002. Probiyotik, Prebiyotik ve Sinbiyotikler. Kafkas
Üniv. Vet. Fak. Derg., 8 (1), 83-89.
HAMMES, W., P.; HERTEL, C., 2001. Research Approaches for pre- and
Probiotics: Challenges and Outlook Food Research. International Journal of
Food Microbiology, 35, 165-170.
HAYALOĞLU, A., A., ERGİNKAYA, Z., 2001. Gıda Endüstrisinde Kullanılan
Laktik Asit Bakterileri, Bizim Büro Basımevi, 26s.
HAYES, J., R., ENGLISH, L., L., CARTER, P., J., PROESCHOLDT, T., LEE, K.,
Y., WAGNER, D., D., WHITE, D., G., 2003. Prevalence and Antimicrobial
Resistnce of Enterococcus Species Isolated from Retail Meats. Applied and
Enviromental Microbiology, Vol. 69, No. 12, 7153-7160.
HAUBEN, J., H.; 2003. The Potential of Vancomycin-resistant Enterococci to Persist
in Fermented and Pasteurised Meat Products . International Journal of Food
Microbiology, Vol. 88, No. 1, 11-18.
HERRANZ, C., CINTAS, L., M., HERNANDEZ, P., E., MOLL, G., N.,
DRİESSEN, A., J., M., 2001. Enterocin P Causes Potassium Ion Eflux
Enterococcus faecium T136 Cells. Antimicrobial Agents and
Chemotheraphy, Vol. 45, No 3 , 901-904.
61
HERRANZ, C., CASAUS, P.; MUKHOPADHYAY, S.; MARTINEZ, J.; M.;
RODRIGUEZ, J., M.; HERNANDEZ, P., E.; CINTAS, L., M.; 2001.
Enterococcus faecium P21: A Strain Occurring Naturally in Dry-Fermented
Sausages Procucing Thr Class II Bacteriocins Enterocin A and Enterocin B.
Food Microbiology, 18, 115-131.
HLIVAK, P., JAHNOVA, E., ODRASKA, J., FERENCIK, M., EBRINGER, L.,
MIKES, Z., 2005. Long-Term (56-week) oral administration of probiotic
Enterococcus faecium M-74 decreases the experssion of SICAM and
monocyte CD54, and increases that of lymphocyte CD49d in humans.
Brastisl Lek Listy, 106 (4-5), 175-181.
HOLT, J., G., KRIEG, N., R., SNEATH, P., H., A., STALEY, J., T., 1994. Gram-
Positive Cocci. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,
Williams&Wilkins, 787s.
HUGAS-MAURICI, GARRIGA-TURON, M., MONFORT-BOLIVAR, J., M.,
YLLA-ULLASTRE, J.; 1999. Bacteriocin Active Against Listeria
monocytogenes. Trends in Food Science&Technology, Vol. 7, No. 2, 67.
HUGAS, M., GARIGGA, M., AYMERICH, M., T., 2003. Functionality of
Enterococci in Meat Products. International Journal of Food Microbiology,
88, 2-3, 223-233.
İNANÇ, N.; 2005. Probiyotik ve Prebiyotiklerin Beslenmedeki Önemi.
www.nutrisyon.com
KARAHAN, A., G.; ÇAKMAKÇI, M., L., 1996. Probiyotikler. Gıda Dergisi, 21
(84), 297-302.
KARAHAN, A., G.; ÇAKMAKÇI, M., L., 2002. Probiyotikler ve Etki
Mekanizmaları. Gıda Dergisi, 6, 12, 15-19.
KARAPINAR, M., 1995. Mikrobiyolojik Kalite Kontrolünde Kullanılan Test
Yöntemleri. Gıdaların Mikrobiyolojik Kalite Kontrolü. Ege Üniversitesi
Basımevi, 198s.
KE, D., PICARD, F., J., MARTINEAU, F., MENARD, C., ROY, P., H.,
OUELLETTE, M., BERGERON, M., 1999. Development of a PCR Assay
62
for Rapid Detection of Enterococci. Journal of Clinical Microbiology, Vol.
37, No. 11., 3497-3503.
KLARE, I.; 2003. Occurrence and Spread of Antibiotic Resistances in Enterococcus
faecium. International Journal of Food Microbiology, Vol. 88, No. 2-3, 269-
290.
KLEIN, G.; PACK, A.; BONAPARTE, C.; REUTER, G.; 1998. Taxonomy and
Physiology of Probiotic Lactic Acid Bacteria. International Journal of Food
Microbiology, 41, 103-125.
KLEIN, G.; 2003. Taxonomy, Ecology and Antibiotic Resistance of Enterococci
From Food and Gastro-Intestinal Tract. International Journal of Food
Microbiology. 88, 2-3, 123-131.
KUHN, I., IVERSEN, A., BURMAN, L., G.; OLSSON-LIJEQUIST, B.;
FRANKLIN, A.; FINN, M.; AARESTRUP, F.; SEFRTH, A., M.; BLANCH,
A., R.; VILANOVA, X.; TAYLOR, H.; CAPLIN, J.; MORENO, M., A.;
DOMİNGUEZ, L.; HERRERO, H.; MOLLBY, R. 2003. Comparison of
Enterococcal Populations in Animals, Humans and The Enviroment-A
European Study. International Journal of Food Microbiology. 88, 2-3, 133-
145.
KUHN, I., IVERSEN, A., MOLLBY, R., 2003. The phene plateTM System for
Studies of the Diversity of Enterococcal Populations from the Food Chain
and the Enviroment. International Journal of Food Microbiology. 88, 2-3,
189-196.
KONEMAN, E., W., ALLEN, S., D., JANDA, W., M., SCHRECKENBERGER, P.,
C., WINN, W., C., 1994. Introduction to Diagnostic Microbiology, J. B.
Lippincott Company, 527s.
LEMCKE, R.; BULTE, M., 2000. Occurrence of the Vancomycin-resistant Genes
Van A, Van B, Van C1, Van C2 and Van C3 in Enterococcus Strains Isolated
from Poultry and Pork. International Journal of Food Microbiology, Vol. 60,
Issue 2-3, 185-194.
LEROY, F., MORENO, M., R., F., DE VUYST, L., 2003. Enterecoccus faecium
RZS C5, An Interesting Bacteriocin Producer to Be Used As A Co-culture
63
in Food Fermentation. International Journal of Food Microbiology, 88, 235-
240.
LINAJE, R.; COLOMA, M., D.; PEREZ-MARTINEZ, G.; ZUNIGA, M., 2004.
Characterization of Faecal Enterococci from Rabits for the Selection of
Probiotic Strains. Journal of Applied Microbiology. 96, 761-771.
LU, H., Z.; WENG, X., H.; LI, H.; YİN, Y., K.; PANG, M., Y.; TANG, Y., W.;
2002. Enterococcus faecium-related Outbreak With Molecular Evidence
Transmission From Pigs To Humans. Journal of Clinical Microbiology, Vol.
40, No. 3, 913-917.
LUKASOVA, J.; SUSTACKOVA, A.; 2003. Enterococci and Antibiotic Resistance.
Acta Vet. Brno, 72, 315-323.
LUND, B.; ADAMSSON, I.; EDLUND, C., 2002. Gastrointestinal Transit Survival
of an Enterococcus faecium Probiotic Strain Administered with or without
Vancomycin. Interniotanal Journal of Food Microbiology, 77, 109-115.
MANNU, L.; PABA, A.; PES, M.; FLORIS, R.; SCINTU , M., F.; MORELLIL;
1999. Strain Typing Among Enterococci Isolated From Home-Made Pecorino
Sardo Cheese. FEMS Microbiology Letters, 170, 25-30.
MANNU, L.; PABA, A.; DAGA, E.; COMUNIAN, R.; ZANETTI, S.; DUPRE, I.;
SECHI, L., A.; 2003. Comparison of The Incidence of Virulence
Determinants and Antibiotic Resistance Between Enterococcus faecium
Strains of Dairy, Animal and Clinical Origin. International Journal of Food
Microbiology, Vol. 88, No. 2-3, 291-304.
MANOLOPOULOU, E.; SARANTİNOPOULUS, P.; ZOIDOU, E.; AKTYPIS, A.;
MOSCHOPOULOU, E.; KANDARAKIS, I., G.; ANIFANTAKIS, E., M.,
2003. Evolution of Microbial Populations During Traditional Feta Cheese
Manufacture And Ripening. International Journal of Food Microbiology, 82,
153- 161.
MAREKOVA, M.; LAUKOVA, A.; DE VUYST, L.; NES, I.; F., 2003. Partial
Characterization of Bacteriocins Produced Enviromental Strain Enterococcus
faecium EK13. Journal of Applied Microbiology, 94, 523-530.
64
MORENO, M., R., F.; REA, M., C., COGAN, T., M.; DE VUYST, L., 2003.
Applicability of a Bacteriocin-Producing Enterococcus faecium as a co-
Culture in Cheddar Cheese Manufacture. International Journal of Food
Microbiology, 81, 73-84.
NAMDARI, H., 1998. Application of PCR for the Characterisation of Enterococci.
Clinical Microbiology Newsletter, Vol. 20, No.11, 91-93.
NICHOLAS, R., E.; WINSTANLEY, T., G.; RIDGWAY, E., J.; PERRY, J., D.;
2005. Differentiation of Vancomycin-Resistant Enterococcus Differential
Medium. British Journal of Biomedical Science.
O’KEEFFE, T.; HILL, C.; ROSS, R., P., 1999. Characterization and Heterologous
Expression of the Genes Encoding Enterocin A Production, Immunitiy and
Regulation in Enterococcus faecium DPC1146. Applied and Enviromental
Microbiology, Vol. 65, no. 4, 1506-1515.
PANAGEA, S., CHADWİCK, P., R., 1996. Heat Tolerance of Vancomycin
Resistant Enterococcus faecium. Journal of Clinical Pathology, 49, 687-689.
PAPAMANOLI, E.; TZANESTAKİS, N.; LİTOPOULOU-TZANETAKİ, E.;
KOTZEKIDOU, P.; 2003. Characterisation of Lactic Acid Bacteria Isolated
From a Greek Dry- Sausages in Respect of Their Technological and Probiotic
Properties. Meat Science, 65, 859-867.
PARK, S., H.; ITOH, K.; FUJISAVA, T., 2003. Characteristics and Identification of
Enterocins Produced by Enterococcus faecium JMC 5804T. The Society for
Applied Microbiology, 95, 294-300.
PETERS, J.; MAC, K.; WİCHMANN-SCHAUER, H.; KLEIN, G.; ELLERBROEK,
L., 2003. Species Distribution and Antibiotic Resistance Patterns of
Enterococci Isolated from Food of Animal Origin in Germany. International
Journal of Food Microbiology 88, 311-314.
QUEDNAU, M.; AHRNE, S.; MOLIN, G., 1999. Genomic Relationships Between
Enterococcus faecium Srtains From Different Sources With Different
Antibiotic Resistance Profiles Evaluated By Restriction Endonuclease
Analysis Of Total Choromosomal DNA Using Ecorı And Pruıı. Applied and
Enviromental Microbiology Apr., 1777-1780
65
RAMOTAR, K.; WOODS, W.; LAROCQUE, L.; TOYE, B., 2000. Comparison of
Phenotypic Methods to Identify Enterococci Intrinsically Resistant to
Vancomycin (Van C VRE). Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,
36, 119-124.
REUTER, G., 1992. Culture Media for Enterococci and Group-D Streptococci.
International Journal of Food Micobiology, Vol. 17, No. 2, 101-111.
RINGO, E.; GATESOUPE, F., J.; 1998. Aquaculture 160,177-203.
RINKINEN, M.; JALAVA, K.; WESTERMARCK, E.; SALMINEN, S.;
OUWEHAND, A.; C., 2003. Interaction Between Probiotic Lactic Acid
Bacteria and Canine Enteric Pathogens: A Risk Factor for Intestinal
Enterococcus faecium Colonization. Veterinary Microbiology, 92, 111-119.
ROBREDO, B.; SINGH, K., V., BAQUERO¸ F.; MURRAY, B., E.; TORRES, C.,
2000. Vancomycin Resistant Enterococci Isolated From Animals And Food.
International Journal of Food Micobiology, 54, 197-204.
ROBERTS, T., A.; 1997. Maximizing The Usefulness of Food Microbiology
Research. Emerging Infectious Dieases. Vol. 3, No. 4, 523-528.
ROBERT, P., R.; SINICKAS, V., G.; LEWIS, C.; BYRON, K., A.; 1999. A
Comparison Of Polymerase Chain Reaction And Phenotyping For Rapid
Speciation Of Enterococci And Detection Of Vancomycin Resistance. Taylor
& Francis. Vol. 31, No 2, 127-132.
ROSS, R., P.; MORGEN, S.; HILL, C., 2002. Preservation and Fermantation: Past,
Present and Future, International Journal of Food Microbiology, 79, 3-16.
SAAVEDRA, L.; TARANTO, M., P.; SESMA, F.; FONT DE VALDEZ, G.; 2003.
Hommade Traditional Cheeses for the Isolation of Probiotic Entrecoccus
faecium Strains. International Journal of Food Microbiology, 88, 241-245.
SALMINEN, S., WRIGHT, A., V., MORELLI, L., MARTEAU, P., BRASSART,
D., DE VOS, W., M., FONDEN, R., SAXELIN, M., COLLINS, K.,
MOGENSEN, G., BIRKELAND, S., E., MATILLA-SANDHOLM, T., 1998.
Demonstration of Safety of Probiotics- a Review. International Journal of
Food Microbiology, 44, 93-106.
SAMAKUPA, A., P.; EINARSSON, H.; EYPORSDOTTIR, A., 2003. Hygine
66
Indicators In A Fish Processing Establishment- A Case Study In A White
Fish Processing Establishment. UNU-Fisheries Training Programme, 29s.
SANDERS, M., E., 1999. Probiotics. Food Technology, Vol. 53, No. 11, 67-73.
SARANTINOPOULOS, P.; LEROY, F.; LEONTOPOULOU, E.; GEORGALAKI,
M., D.; KALANTZOPOULOS, G.; TSAKALIDOU, E., DE VUYST, L.,
2001. Bacteriocin Production by Enterococcus faecium FAIR-E 198 in View
of Its Application as Adjunct Starter in Grek Feta Cheese Making. L.
International Journal of Food Microbiology, 72, 125-136.
SARANTINOPOULOS, P.; KALANTZOPOULOS, G.; TSAKALIDOU, E., 2002.
Effect of Enterococcus faecium on Microbiological, Physicochemical and
Sensory Characteristic of Greek Feta Cheese. International Journal of Food
Microbiology, 76, 93-105.
SARANTINOPOULOS, P.; LEROY, F.; LEONTOPOULOU, E.; GEORGALAKI,
M., D.; KALANTZOPOULOS, G.; TSAKALIDOU, E.; DE VUYST, L.;
2002. Bacteriocin Production by Enterococcus faecium FAIR-E 198 in Vıew
of Its Application As Adjunct Starter in Grek Feta Cheese Making.
International Journal of Food Microbiology, 72, 125-136.
SEMEDO,T., SANTOS, M.,A., LOPES, M.,S., MARQUES, J., J., CRESPO, M., T.,
B., TENREİRO, R., 2003. Virulance Factors in Food, Clinical and Reference
Enterococci : A Common Trait in the Genus?, System Appl. Microbiology,
26, 13-22.
SIMONOVA, M.; LAUKOVA, A., 2004. Isolation of Faecal Enterococcus faecium
Strains From Rabbits and Their Sensitivity to Antibiotics and Ability to
Bacteriocin Production. Bull Vet. Inst. Pulawy, 48, 383-386.
STANTON, C.; ROSS, P.; 2000. Functional Foods in Relation to Health and
Disaese. Moorepark End of Project Report, Teagsc, 11s.
STROMPFOVA, V., LAUKOVA, A., MUDRONOVA, D., 2003. Effect of
Bacteriocin-like Substance Produced by Enterococcus faecium EF55 on the
Composition of Avian Gastrointestinal Microflora. Acta Vet. Brno, 72, 559-
564.
67
STROMPFOVA, V.; LAUKOVA, A.; OUWEHAND, A., C.; 2004. Selection of
Enterococci for Potential Canine Probiotic Additives. Veterinary
Microbiology. 100, 1-2, 107-114.
TARELLI, G., T.; CARMINATI, D.; GIRAFFA, G.; 1994. Production of
Bacteriocin Active Against Listria monocytogenes and Listera innocua From
Dairy Enterocooci. Food Microbiology, Vol. 11, No. 3, 243-252.
TEMMERMAN, R.; POT, B.; HUYS, G.; SWINGS, J., 2003. Identification and
Antibiotic Susceptibility of Bacterial Isolates from Probiotic Products.
International Journal of Food Microbiology, 81, 1-10.
TSAI, C., C., LIU, T., H., CHEN, M., H., TSAI, C., C., TSEN, H., Y., 2004.
Toxicity evaluation for an Enterococcus faecium strain TM39 in vitro and in
vivo. Food and Chemichal Toxicology, vol.42, no.10, 1601-1609.
TYOPPONEN, S.; PETAJA, E.; MATTILA-SANDHOLM, T., 2003. Bioprotectives
and Probiotics For Dry Sausages. International Journal of Food
Microbiology, 83, 233-244.
ÜNLÜ, M.; VARDAR-ÜNLÜ, G.; BAKICI, M., Z.; ŞAHİN, A.; 2002. Klinik
Örneklerden Soyutlanan Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium
Kökenlerinin Çeşitli Antibiyotiklere Direnci. İnfeksiyon Dergisi, 16 (4), 471-
475.
VANCANNEYT, M.; LOMBARDI, A.; ANDRIGEHETTO, C.; KNIJFF, E.;
TORRIANIS.; BJORKROTH, K., J.; FRANZ, C., M., A., P.; MORENO, M.,
R., F.; REVETS, H.; DE VUYST, L.; SWINGS, J.; KERSTERS, K.;
DELLAGLIO, F.; HOLZAPFEL, W., H.; 2002. Intraspecies Genomic
Groups in Enterococcus faecium nd Correlation with Origin and
Pathogenicity. Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 68, No.3, 1381-
1391.
WATERMAN, S.; SMALL, P.; 1998. Acid Sensitive Enteric Pathogens are
Protected From Killing Under Exremely Acid Conditions of pH 2.5 when
They Are Inoculated Onto Certain Solid Food Sources. Applied and
Enviromental Microbiology, 64, 5924-5928.
68
WEGENER, H., C.; MADSEN, M.; NIELSEN, N.; AARESTRUP, F., M., 1997.
Isolation of Vancomycin Resistant Enterococcus faecium from Food.
International Journal of Food Microbiology, 35, 57-66.
WESSELS D., JOOSTE, P., J.; MOSTERT, J., F.; 2002. Technologically Important
Characteristics of Enterococcus Isolates From Milk and Dairy Products.
International Journal of Food Microbiology, Vol. 10, No. 3-4, 349-352.
WILLEY, B., JONES, R., N.; MCGEER, A.; WITTE, W.; FRENCH, G.;
ROBERTS, R., B.; JENKIS, S., G.; NADLER, H.; LOW, D., E., 1999.
Practical Approach to the Identification of Clinically Relevant Enterococcus
Species. Diagn. Microbiol Infect Dis., 34, 165-171
WILKE, A.; 2005. Streptokok İnfeksiyonları. http://www.infeksiyon.org
YAMAN, F.; ESENDAL, Ö.; 2004. Balıklarda Probiyotik Kullanımı. Orlab on-line
Mikrobiyoloji Dergisi, Vol. 2, No. 6, 1-18.
YERLİKAYA, P.; GÖKOĞLU, N., 2002. Gıdalarda Biyojen Aminler ve Önemi.
Gıda Mühendisliği Dergisi, Sayı:12, Yıl, 6, 24-30
YILDIRIM, Z.; YILDIRIM, M., 2000. Laktik Asit Bakterileri Tarafından Üretilen
Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri. ALINMIŞTIR, DEMİRCİ, M., Süt
Mikrobiyolojisi ve Katkı Maddeleri, Tekirdağ, 595s.
69
ÖZGEÇMİŞ
1979 yılında Adana’da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi aynı şehirde
tamamladım. 1997 yılında Çukurova Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümünü
kazandım ve 2002 yılında bu bölümden mezun oldum. Şu anda bir markette mağaza
yönetici olarak çalışmaktayım.