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UNICAMP

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

KARLA REICHERT

AÇÃO DA ATORVASTATINA NO REMODELAMENTO VENTRICULAR APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO: ESTUDO EXPERIMENTAL.

CAMPINAS 2017

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KARLA REICHERT

AÇÃO DA ATORVASTATINA NO REMODELAMENTO VENTRICULAR APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO: ESTUDO EXPERIMENTAL.

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas, como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em

Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Orlando Petrucci Junior

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA

KARLA REICHERT E ORIENTADA PELO

PROF. DR. ORLANDO PETRUCCI JUNIOR.

CAMPINAS 2017

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Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 01-P-1744/2016; CAPES,99999.006241/2014-00

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Ciências MédicasMaristella Soares dos Santos - CRB 8/8402

Reichert, Karla, 1986- R271a ReiAção da atorvastatina no remodelamento ventricular após infarto do

miocárdio : estudo experimental / Karla Reichert. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.

ReiOrientador: Orlando Petrucci Júnior. ReiTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Ciências Médicas.

Rei1. Atorvastatina cálcica. 2. Infarto do miocárdio. 3. Remodelação ventricular.

I. Petrucci Júnior, Orlando,1966-. II. Universidade Estadual de Campinas.Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Atorvastatin properties in ventricular remodeling after myocardialinfarction : an experimental studyPalavras-chave em inglês:Atorvastatin calciumMyocardial infarctionVentricular remodelingÁrea de concentração: Fisiopatologia CirúrgicaTitulação: Doutora em CiênciasBanca examinadora:Orlando Petrucci Júnior [Orientador]Nilson AntunesElaine Soraya Barbosa de Oliveira SeverinoLeonardo Antônio Mamede ZornoffJoão Carlos Ferreira LealData de defesa: 23-02-2017Programa de Pós-Graduação: Ciências da Cirurgia

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

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BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO KARLA REICHERT

ORIENTADOR: ORLANDO PETRUCCI JUNIOR

MEMBROS:

1. PROF. DR. ORLANDO PETRUCCI JUNIOR

2. PROF. DR. NILSON ANTUNES

3. PROF. DRA. ELAINE SORAYA BARBOSA DE OLIVEIRA SEVERINO

4. PROF. DR. LEONARDO ANTÔNIO MAMEDE ZORNOFF

5. PROF. DR. JOÃO CARLOS FERREIRA LEAL

Programa de Pós-­‐Graduação em Ciências da Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-­‐se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 23/02/2017

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DEDICATÓRIA

Aos meus queridos pais Carlos Reichert e Regina Reichert, pelo amor

incondicional, incentivo e apoio em todas as decisões da minha vida. A vocês que me

ensinam diariamente a importância da integridade e honestidade.

Ao meu esposo Isaac Kötz, pelo carinho, companheirismo e paciência

durante toda esta trajetória. A você que mostrou que a distância não existe na

presença da paciência, amor e confiança.

A todos meus familiares, amigos, colegas e professores que contribuíram e

acreditaram na realização deste trabalho.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me dar forças para vencer os desafios,

e sempre me proporcionar novos caminhos e possibilidades.

Aos meus pais que são meus exemplos de vida, que foram meus

companheiros em todos os momentos, acreditando e motivando cada passo que eu

realizava. Obrigada pelos conselhos e por estarem sempre presentes.

Ao meu esposo Isaac pelo companheirismo, compreensão, paciência e

apoio em todas as decisões que foram tomadas durante esta trajetória.

A minha irmã Karina e meus sobrinhos Ingred e Dalton, pelo carinho e

incentivo.

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Orlando Petrucci por toda orientação,

estímulo, além da sua importante participação na execução deste trabalho. Muito

obrigada pela confiança e pelas ajudas que já me proporcionou não somente como

professor e mentor, mas também como um grande amigo.

A equipe da técnica cirúrgica do Núcleo de Medicina e Cirurgia

Experimental, Willian, Ana Cristina, Miguel, e Waldemir pelo auxilio e assistência

durante a execução dos procedimentos cirúrgicos experimentais.

Ao meu colega, amigo e companheiro de laboratório Helison Rafael do

Carmo. Obrigada por todo apoio e colaboração durante este caminho.

Aos colegas de laboratório Fany Lima, Carolina Sacilotto e Vanessa

Baptista, pelos momentos de descontração e brincadeiras.

A farmacêutica Cristina Tanikawa pela ajuda, incentivo e amizade.

A biologista Daniela Diógenes pela amizade e o apoio científico durante a

execução dos experimentos laboratoriais. Obrigada por toda ajuda e por compartilhar

seus conhecimentos.

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Aos professores Nilson Antunes e Márcio Roberto do Carmo pelo

acolhimento e receptividade no início da minha jornada em Campinas.

As minhas grandes amigas Ana Paula Toniazzo, Carla Madeira e Mariana

Pina, pela amizade e companheirismo independente da distância.

A todos os meus familiares e amigos que me apoiaram e participaram das

minhas escolhas.

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RESUMO

Introdução: Estratégias terapêuticas que modulam o remodelamento

ventricular podem ser úteis após o infarto do miocárdio, e as estatinas podem exercer

efeitos nas vias envolvidas com o metabolismo do colágeno. O objetivo deste estudo

foi determinar se o tratamento com atorvastatina durante 4 semanas, exerce ações no

metabolismo do colágeno e na resposta inflamatória decorrentes do remodelamento

ventricular, utilizando modelo experimental de infarto do miocárdio em ratos.

Materiais e método: Foram utilizados ratos Wistar machos, submetidos à

ligadura permanente da artéria interventricular anterior. Os animais foram divididos

em: Grupo Sham – animais submetidos ao procedimento cirúrgico sem ligadura da

artéria interventricular anterior e que receberam solução salina por gavagem

diariamente (n= 14);; Grupo Controle – animais submetidos ao infarto do miocárdio e

que receberam solução salina por gavagem diariamente (n=27), e o grupo

Atorvastatina – Animais submetidos ao infarto do miocárdio e que receberam

10mg/kg/dia de atorvastatina por gavagem diariamente (n=24). Os animais foram

mantidos nessas condições por 4 semanas. Ao final deste período foram avaliados

por cateter de pressão-­volume e eutanasiados para análise histológica e molecular do

miocárdio.

Resultados: Não encontramos diferenças no grupo controle e atorvastatina

em relação ao peso inicial e final, apesar de mostrarmos maiores pesos no início e no

fim do estudo nos animais do grupo sham. A partir dos dados hemodinâmicos, os

animais do grupo atorvastatina apresentaram menor volume diastólico final do

ventrículo esquerdo em relação aos animais do grupo controle (176,2 ± 27,51μL para

sham vs. 220,2 ± 31,67μL para controle vs. 172,8 ± 36,21μL para atorvastatina;;

P=0,04). Além disso, também verificamos que o tratamento com atorvastatina durante

4 semanas foi capaz de reduzir o conteúdo de fibrose quando comparamos com o

grupo controle (20,8 ± 7,6% vs. 15,0 ± 6,7%;; P=0,03). Não encontramos diferenças

em relação ao grupo controle e atorvastatina, quando avaliamos o conteúdo de

colágeno (9,5 ± 5,0% vs. 7,4 ± 4,5%;; P=0,24). O tratamento com atorvastatina foi

capaz de reduzir a área transversal de cardiomiócitos quando comparamos com os

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animais do grupo controle (446,8 ± 133,0μm2vs. 261,1 ± 79,35μm2;;P<0,01). As

expressões de proteínas envolvidas no metabolismo do colágeno foram moduladas

após o tratamento com a atorvastatina. MMP1 e TIMP1 apresentaram maiores

expressões, enquanto que PCPE, SPARC e COL I, apresentaram menores

expressões nos animais do grupo atorvastatina em relação aos animais do grupo

controle. Quando avaliamos a resposta inflamatória, mostramos que TLR4, IL1 e NF-­

kBp50foram reduzidos após o tratamento com atorvastatina.

Conclusão: O tratamento com atorvastatina durante 4 semanas reduziu a

disfunção ventricular, fibrose e hipertrofia após infarto do miocárdio, além de

apresentar efeitos no metabolismo do colágeno e na resposta inflamatória. A

atorvastatina pode ser um tratamento de escolha para atenuar os efeitos deletérios

causados pelo remodelamento ventricular após eventos isquêmicos no tecido

cardíaco.

Palavras-­chave: Atorvastatina cálcica, Infarto do miocárdio, Remodelação

ventricular.

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ABSTRACT

Introduction: Therapeutic strategies that modulate ventricular remodeling

can be useful after myocardial infarction and statins can exert effects on pathways

involved in collagen metabolism. The aim of this study was to determine whether

atorvastatin treatment for 4 weeks, exerts actions in collagen metabolism and

inflammatory response resulting from ventricular remodeling using myocardial

infarction in rats.

Methods: Male Wistar rats were used in this study. Myocardial infarction

was induced in rats by ligation of the left anterior descending coronary artery. Animals

were randomized into: Sham group -­ animals submitted to the surgical procedure

without ligation of the left anterior descending coronary artery and received saline by

gavage daily (n=14);; Control Group -­ animals submitted to myocardial infarction and

received saline by gavage daily (n=27), and the Atorvastatin group -­ animals submitted

to myocardial infarction and received 10mg/kg/day of atorvastatin daily by gavage

(n=24). The animals were kept under these conditions for 4 weeks. At the end of this

period were evaluated by pressure-­volume catheter and euthanized for histologic and

molecular analysis.

Results: We did not found differences between control and atorvastatin

group in relation to the initial and final weight, but we showed greater weight in the

sham group. Furthermore, atorvastatin group had lower end-­diastolic volume in

compared of the control group (176.2 ± 27.51μL to sham vs. 220.2 ± 31.67μL to control

vs. 172.8 ± 36.21μL to atorvastatin;; P=0.04). We also found that treatment with

atorvastatin for 4 weeks was able to reduce the fibrosis content when compared to the

control group (20.8 ± 7.6% vs. 15.0 ± 6.7%;; P=0.03). We did not found differences to

the control and atorvastatin group, when we assess the collagen content (9.5 ± 5.0%

vs. 7.4 ± 4.5%;; P=0.24). Atorvastatin was able to reduce the myocytes cross-­sectional

area compared to the animals in control group (446.8 ± 133.0μm2 vs. 261.1 ±

79.35μm2;;P<0.01). The expression of proteins involved in collagen metabolism have

been modulated after treatment with atorvastatin. MMP1 and TIMP1 had higher

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expressions, while PCPE, SPARC and COL I, had lower expression in animals of the

atorvastatin group compared to control group. We evaluate the inflammatory response.

TLR4, IL1 and NF-­kBp50 showed lower expression after treatment with atorvastatin.

Conclusion: Treatment with atorvastatin for 4 weeks reduced ventricular

dysfunction, fibrosis and hypertrophy after myocardial infarction, besides of the effects

on collagen metabolism and inflammatory response. Atorvastatin may be a treatment

of choice to attenuate the deleterious effects caused by ventricular remodeling.

Key words: Atorvastatin calcium, Myocardial infarction, Ventricular

remodeling.

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LISTA DE ABRAVIATURAS E SIGLAS

CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais

CNN: Fator de Crescimento do Tecido Conectivo

CNPQ: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

COL I: Colágeno 1

COL III: Colágeno 3

COX2: Cicloxigenase2

DC: Doença Coronariana

dP/dt: Derivada de Pressão/Derivada de Tempo

DP: Desvio padrão

eNOS: Óxido Nítrico Endotelial Sintase

ESPVR: Relação de Pressão e Volume no Final da Sístole

FAPESP: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estados de São Paulo

HMG-­CoAredutase:3-­hidroxi-­ 3-­metilglutaril coenzima A redutase

IAM: Infarto Agudo do Miocárdio

IκBα: I Kappa B alfa

IM: Infarto do Miocárdio

IFNγ: Interferon gama

IL1-­α: Interleucina1 alfa

IL1-­β: Interleucina1 beta

IL10: Interleucina 10

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IL 2: Interleucina 2

IL 12: Interleucina 12

IL6: Interleucina6

LDL: Lipoproteína de Baixa Densidade

MEC: Matriz Extracelular Cardíaca

MHC-­Classe II: Complexo de Histocompatibilidade Classe 2

MMPs: Metaloproteinases

NF-­kB: Fator Nuclear Kappa B

PCPE: Intensificador de Pró-­ colágeno C Proteinase

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase

pIkBα: I Kappa B alfa fosforilada

PPARs: Receptor Ativado por Proliferador de Peroxissoma

PRSW: Trabalho de Pré-­carga Recrutável

P: Probabilidade de Significância

ROS: Espécimes Reativos de Oxigênio

RII: Resposta Imune Inata

RV: Remodelamento Ventricular

SCA: Síndrome Coronariana Aguda

SPARC: Proteína Ácida Secretada e Rica em Cisteína

Tau: Constante de Relaxamento Isovolumétrico

TGF-­β1: Fator de Crescimento Transformador beta 1

TIMPs: Inibidor Tecidual de Metaloproteinases

Tmax: Tempo de Concentração Plasmática Máxima

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TNF-­α: Fator de Necrose Tumoral alfa

TLR2: Receptor do tipo Toll 2

TLR4: Receptor do tipo Toll4

TSP: Trombospondina

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

VE: Ventrículo Esquerdo

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LISTA DE SÍMBOLOS

α: Alfa

β: Beta

γ: Gama

κ: Kappa

±: Mais ou menos

<: Menor

mmHg/s: Milímetro de mercúrio/segundos

ms: Milissegundo

uL: Microlitro

ug: Micrograma

μm: Micrômetro

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 17

1.1 Doenças Cardíacas – Conceitos .............................................................. 17

1.2 Remodelamento ventricular ...................................................................... 17

1.3 Composição estrutural do miocárdio ......................................................... 18

1.4 Sinalização após IAM ................................................................................ 19

1.5 Metaloproteinases de Matriz -­ MMPs ........................................................ 20

1.6 Estatinas -­ Atorvastatina ........................................................................... 22

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 25

2.1 Objetivo Principal ...................................................................................... 25

2.2 Objetivo Primário ....................................................................................... 25

2.3 Objetivo Secundário .................................................................................. 25

3. MATERIAIS E MÉTODO ....................................................................................... 26

3.1 Protocolo Experimental ............................................................................. 26

3.2 Procedimentos Cirúrgicos – Indução do IM .............................................. 26

3.3 Avaliações Hemodinâmicas ...................................................................... 27

3.4 Análises Histológicas ................................................................................ 28

3.5 Immunoblotting .......................................................................................... 30

3.6 PCR em tempo real ................................................................................... 31

3.7 Análises estatísticas .................................................................................. 32

4. RESULTADOS ...................................................................................................... 33

5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 43

6. CONCLUSĀO ........................................................................................................ 49

7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 50

8. ANEXOS ............................................................................................................... 61

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1-­ INTRODUÇÃO

1.1 Doenças Cardíacas -­ Conceitos

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, as doenças cardíacas

são consideradas uma desordem no tecido cardíaco e/ou nos vasos sanguíneos,

decorrentes de origem coronariana, cerebrovasculares, hipertensiva, congênita ou de insuficiência cardíaca.

A doença coronariana (DC) é a manifestação cardiovascular mais

prevalente, e será considerada a principal causa de morbidade e mortalidade no

mundo em 2020 (1, 2). A estimativa é de aproximadamente 23,6 milhões de mortes

decorrentes da DC em 2030 (3). A DC é mais prevalente em homens, sendo responsável por 46% das causas de óbitos e 37% em mulheres (3).

A síndrome coronariana aguda (SCA) é definida como um conjunto de

manifestações clínicas resultantes da presença de trombose coronariana aguda, que

surge devido à ruptura de uma placa aterosclerótica que bloqueia ou reduz o fluxo

sanguíneo no tecido cardíaco (1). Nestas condições, ocorrem sinais compatíveis com

a presença de isquemia miocárdica aguda, como angina instável, infarto do miocárdio

(IM) sem elevação do segmento ST, ou IM com elevação do segmento ST (4, 5). Em

situações mais raras, a SCA pode apresentar causas não ateroscleróticas como

ocorre nas arterites, traumas, dissecções, tromboembolismo, anormalidades

congênitas, uso abusivo de drogas como cocaína e ainda após cateterismos cardíacos (1).

1.2 Remodelamento Ventricular

Após eventos isquêmicos no tecido cardíaco, ocorrem alterações

moleculares, celulares e intersticiais. Essas alterações são capazes de levar a

mudanças no tamanho, massa, e geometria da cavidade ventricular, promovendo o

desenvolvimento de um processo conhecido como Remodelamento Ventricular (RV) (6).

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O RV pode ser classificado em duas fases: aguda e crônica. A fase aguda

ocorre nas primeiras 72 horas após o insulto isquêmico, e é caracterizada pelo

aumento da cavidade ventricular devido uma expansão do infarto. Já a fase crônica

surge após as 72 horas de isquemia, sendo caracterizada pela presença de processos

hipertróficos além de alterações da forma elíptica do ventrículo esquerdo para a forma

esférica (7).

O RV pode ser considerado um processo fisiológico, patológico e

adaptativo. É considerado fisiológico, quando ocorre durante o período de

crescimento normal de um adulto, uma vez que as alterações que surgem são normais

e compatíveis com o desenvolvimento corporal sem ter efeitos deletérios ao sistema

cardíaco (7). O processo patológico é decorrente da presença de algumas condições

clínicas como infarto agudo do miocárdio (IAM), cardiomiopatias, hipertensão arterial

sistêmica, doenças valvares, agentes infecciosos e cardiotóxicos, e dessa forma

torna-­se prejudicial ao tecido cardíaco (7, 8). Contudo, é considerado em alguns casos

um processo adaptativo quando surge mesmo na presença de eventos patológicos,

estabilidade morfológica e funcional do ventrículo esquerdo, sem evoluir para

consequências deletérias (6). Por isso o RV não é considerado um evento

homogêneo. Quando associado a processos patológicos, o RV está atribuído a

condições que são desfavoráveis ao miocárdio devido a alterações progressivas na

cavidade ventricular a fim de normalizar os efeitos inicias provocado. Com o excessivo

estresse, o RV desencadeia deformações estruturais como dilatação, hipertrofia,

arritmias, aneurismas ventriculares, além de contribuir para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca e reduzir o desempenho e a função cardíaca (9-­13).

1.3 Composição Estrutural do Miocárdio

O tecido cardíaco é composto por um componente muscular constituído

por cardiomiócitos, e um componente intersticial formado por uma matriz extracelular (14).

O coração adulto humano pode apresentar de 4 a 5 bilhões de

cardiomiócitos, que são considerados os principais componentes da estrutura

19

miocárdica e em situações normais no tecido cardíaco, essas células correspondem

em torno de 70% do volume da parede ventricular (15).

A matriz extracelular cardíaca (MEC) consiste em uma estrutura altamente

dinâmica responsável pela manutenção e organização do tecido cardíaco, constituída

por uma rede de colágeno fibrilar, membrana basal, proteoglicanos,

glicosaminoglicanos e fibroblastos (16, 17). O colágeno é o maior componente da

matriz extracelular sendo sintetizado e secretado por fibroblastos cardíacos (16, 18,

19). O colágeno do tipo 1 (COL I) e colágeno do tipo 3 (COL III) são os mais

abundantes no miocárdio, pois correspondem a 95% do colágeno total, sendo o do tipo I presente em torno de 50-­85% e o do tipo III de 10-­45% (6, 20-­22).

Além dessas proteínas envolvidas com função estrutural, também estão

presentes na MEC proteínas regulatórias que agem como mediadores biológicos,

modulando as interações entre células e matriz extracelular, e são conhecidas como

proteínas matricelulares (23, 24). As proteínas matricelulares não são expressas no

miocárdio adulto normal e são reguladas após uma injúria tecidual, como ocorre nos

eventos isquêmicos do tecido cardíaco, e dessa forma são capazes de induzir a

resposta inflamatória, além de processos reparativos e fibróticos durante o RV (23,

25). As principais proteínas matricelulares envolvidas com o IAM, hipertrofia, fibrose

e RV, incluem as trombospondinas (TSPs) do tipo 1, 2 e 4, Tenascin C e X, Proteína

Ácida Secretada e Rica em Cisteína (SPARC), Osteopontina, Periostina, e Fator de

Crescimento do Tecido Conectivo (CNN) 1 e 2 (26).

1.4 Sinalização após IAM

Após isquemia no tecido cardíaco, vários mediadores inflamatórios são

ativados e células inflamatórias são estimuladas a se deslocarem para o local da

injúria tecidual, promovendo a ativação de um sistema conhecido como Resposta

Imune Inata – RII (8). No miocárdio, macrófagos são ativados e neutrófilos assim como

monócitos se infiltram na região da injúria, secretando citocinas inflamatórias (27).

A necrose de cardiomiócitos decorrentes da isquemia cardíaca é o ponto

chave da ativação e exacerbação da resposta inflamatória. Isso ocorre por que a

20

ativação da RII decorrente da morte celular, promove a expressão e ativação de

Receptores do tipo Toll -­ TLRs, que em conjunto com a geração de radicais livres irão

estimular agentes pró-­inflamatórios como Fator Nuclear kappa B – NF-­kB em

cardiomiócitos residentes, e dessa forma induzir a expressão de citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão (28, 29).

Além disso, após a isquemia inicial, fibroblastos passam a ser diferenciados

em miofibroblastos e este mecanismo de transformação é mediado pelo Fator de

Crescimento Transformador beta 1 – TGF-­β1 (14). Os miofibrobastos são células que

não estão presentes no tecido cardíaco normal e são responsáveis pela produção e

secreção de uma série de citocinas, como IL1-­α, IL1-­β, IL 6, IL 10 e Fator de Necrose

Tumoral alfa (TNF-­α), potencializando ainda mais o processo inflamatório

desencadeado no miocárdio já lesionado (30). Além de contribuir para este processo

inflamatório, os miofibroblastos estimulam a expressão de genes que irão codificar moléculas precursoras de COL I e III(14, 30).

A progressiva resposta inflamatória decorrente da injúria isquêmica

tecidual, inicia um importante papel na patogênese do RV, pois atua na modulação da

cicatrização e induz a mudanças na MEC (31).

1.5 Metaloproteinases de Matriz -­ MMPs

Além dos mecanismos inflamatórios desencadearem o processo de RV,

mecanismos enzimáticos também apresentam importante participação neste evento,

como a ação das metaloproteinases de matriz conhecidas como MMPs. As MMPs são

endopeptidases zinco-­dependentes envolvidas com a regulação da estrutura e

funcionalidade da matriz extracelular (32).

As MMPs encontram-­se no miocárdio na sua forma latente, e quando

ativadas são responsáveis pela degradação dos componentes presentes na matriz

extracelular, principalmente colágeno, e dessa forma contribuem para o

desenvolvimento do RV (33-­36). Os mecanismos de ação mediados pelas MMPs

também estão presentes em outras patologias além das doenças cardiovasculares, como neoplasias e doenças inflamatórias (35, 37).

21

A partir do processo inflamatório inicial, macrófagos e monócitos estimulam

fibroblastos e miofibroblastos a sintetizarem novas moléculas de colágeno. Ao mesmo

tempo, as MMPs que iniciaram suas ações proteolíticas degradam fibras de colágenos

presentes na matriz extracelular e consequentemente desencadeiam alterações adversas como progressiva dilatação e disfunção ventricular (38).

O acúmulo de colágeno é decorrente de alterações entre sua síntese e

degradação, e a partir disso, ocorre o aparecimento de fibrose cardíaca (20, 39). O

colágeno é o modulador tanto da função sistólica como diastólica, e por isso a fibrose

é relacionada com a deterioração da função ventricular, devido alterações das funções contráteis e de relaxamento da câmara cardíaca (6, 8, 40).

As MMPs podem ser secretadas por células inflamatórias, cardiomiócitos,

fibroblastos, células endoteliais, sendo a sua principal fonte os macrófagos (27, 41-­

43). Podem ser ativadas por diferentes mediadores, como tripsina, plasmina,

calicreínas, Interferon gama (IFN-­γ), IL1-­α e β, e TNF-­α, mas a direta ativação dessas

enzimas é mediada principalmente por espécimes reativos de oxigênio -­ ROS (11, 41,

44). O mecanismo de ativação ocorre após a clivagem em regiões catalíticas

especificas presentes nas MMPs (43). A secreção dessas enzimas além de exercer

mecanismos proteolíticos sobre a matriz extracelular, também pode desencadear processos de apoptose nos cardiomiócitos (42).

As MMPs apresentam afinidades e especificidades a determinado

substrato, e por isso podem ser classificadas em colagenases que compreendem

MMP1, MMP8 e MMP13, estromelisinas correspondentes a MMP3 e MMP10,

gelatinases incluindo MMP2 e MMP9, e as do tipo membranas conhecidas como MT1

– MMP (45, 46). A MMP1 é responsável por degradar colágeno do tipo I, II, III, VII, VIII e X (47).

A regulação das MMPs pode ser mediada pelos seus inibidores teciduais

endógenos – TIMPs, ou quando presentes na circulação, a inibição ocorre pela α –

macroglobulina (48, 49). TIMPs são sintetizados por células do tecido conjuntivo, e fortemente se ligam nas MMPs em uma relação 1:1 (50, 51).

O balanço entre a ação das MMPs e seus inibidores TIMPs é de

fundamental importância para a manutenção do equilíbrio e homeostase da matriz

22

extracelular (49, 52). A MMP1 exibe como inibidor tecidual TIMP1, e esse quando

apresenta seus níveis elevados desfavorece a atividade proteolítica de MMP1 (48).

Estudos já têm demonstrado que elevados níveis de MMPs estão

diretamente envolvidos com a progressão do RV, e a sua inibição pode reduzir a

dilatação do ventrículo esquerdo e dessa forma preservar a sua funcionalidade (36, 38).

1.6 Estatinas – Atorvastatina

As estatinas são drogas que pertencem a uma classe de fármacos

indicados para o tratamento de dislipidemias, e contribuem para a redução de morbidade e mortalidade nas doenças cardiovasculares (53).

A principal ação das estatinas está voltada para inibição da 3-­hidroxi-­3-­

metilglutaril coenzima A redutase (HMG-­CoA redutase), uma enzima responsável pela ativação da via do mevalonato na biossíntese de colesterol (54-­56).

As estatinas além de reduzir os níveis da Lipoproteína de Baixa Densidade

(LDL), é um potente agente farmacológico que protege contra o desenvolvimento de

doenças coronarianas, pois é capaz de controlar a formação de ateromas (57, 58).

As estatinas podem apresentar mecanismos cardioprotetores que vão além

das reduções dos níveis de colesterol, e esses mecanismos são conhecidos como

efeitos pleiotrópicos, pois estão envolvidos com ações anti-­inflamatórias, antioxidantes, e anti-­hipertróficas (57, 59, 60).

Devido suas ações anti-­inflamatórias, essas drogas podem modular e

reduzir a atividade de transcrição de NF-­kB, além de desencadear efeitos sobre a

redução de proteínas de fase aguda como proteína C reativa, e reduzirem níveis de

proteínas marcadoras de stress oxidativo (54, 61). Outro efeito pleiotrópico decorrente

do tratamento com estatinas é sua ação imunossupressora (58). Esse efeito

imunossupressor ocorre a partir da regulação de IFN-­γ, que consequentemente

suprime a expressão do Complexo de Histocompatibilidade Classe 2 (MHC-­Classe

23

II)(62). Com isso, as estatinas podem contribuir para a redução nas taxas de

mortalidade e de rejeição após transplantes cardíacos (63).

Além disso, as estatinas podem desencadear mecanismos protetores

sobre o endotélio vascular pois são capazes de proteger o tecido cardíaco após

eventos de isquemia e reperfusão, através do aumento dos níveis de óxido nítrico

sintase endotelial (eNOS) (60, 64, 65). Desta maneira, este agente farmacológico

pode atenuar os efeitos deletérios do RV por meio da inibição de mediadores

inflamatórios, aumento da síntese e biodisponibilidade de óxido nítrico, além de inibição de apoptose e hipertrofia nas células cardíacas (66, 67).

Atualmente existem sete tipos de estatinas comercialmente disponíveis,

como lovastatina, pravastatina, sinvastatina, fluvastatina, pitavastatina, rosuvastatina e atorvastatina (68).

A atorvastatina é uma estatina sintética com características lipofílicas, e por

isso é facilmente distribuída em diferentes tipos de tecidos, através de difusão passiva

(69). Por ser de caráter lipofílico, podem atravessar as membranas celulares, e desempenhar facilmente seus efeitos pleiotrópicos (70).

A atorvastatina assim como as outras estatinas, apresenta um pico de

concentração plasmática (Tmax) de quatro horas, com o tempo de meia vida de

aproximadamente 14 horas, porém seus metabólitos ativos permanecem com efeitos

inibitórios sobre a HMG-­CoA redutase em até 20-­30 horas(68).

Os efeitos benéficos da atorvastatina sobre o RV já têm sido demonstrados.

Martin et al., verificaram que o tratamento com atorvastatina é capaz de inibir a síntese

de colágeno após estímulos pró-­fibrótico sem cultura de fibroblastos cardíacos

humanos (71). As estatinas podem exercer efeitos sobre as expressões de MMPs em

placas ateroscleróticas tanto em modelos experimentais bem como em estudos

clínicos, além de induzir a expressão de TIMP1 (32). Altas doses de atorvastatina em

cultura de células mononucleadas têm mostrado efeitos anti-­inflamatórios,

principalmente sobre a redução da expressão de cicloxigenase2 (COX2), e sobre

atividade de transcrição de NF-­Kb (72). Em modelos experimentais, o tratamento com

atorvastatina pode induzir a expressão de citocinas como IL10, além de suprimir os

níveis de IL2, IL12, TNF-­α e IFN-­γ (63). Além de apresentar seus efeitos sobre nos

24

mecanismos inflamatórios, a atorvastatina pode interferir nas expressões de VCAM1-­

importante molécula de adesão de células endoteliais, que promovem a formação de ateromas, e assim, controla o desenvolvimento de arteriosclerose (73).

O tratamento terapêutico com atorvastatina pode atenuar os processos

envolvidos após eventos de IAM, e dessa forma influenciar positivamente sobre os efeitos deletérios do RV.

Apesar de desempenhar inúmeros efeitos benéficos sobre o sistema

cardiovascular, o tratamento clínico com a atorvastatina pode desenvolver alguns

efeitos adversos, como miopatias, e em casos mais raros podem evoluir para

rabdomiólise (68). Esses efeitos não são comuns, mas já é bem compreendido que

ocorrem devido ao caráter lipofílico da atorvastatina, e por isso facilmente penetra no

tecido muscular. A atorvastatina também pode apresentar mecanismos de ação

voltados para reduzir os níveis de Coenzima Q10. A Coenzima Q10 é um ácido graxo

solúvel essencial para a produção de energia celular no músculo esquelético, e

apresenta propriedades antioxidantes, responsáveis por preservar a integridade e

função celular (74). Dessa forma, a atorvastatina pode induzir a efeitos tóxicos no

músculo esquelético, e em casos mais graves, contribuir para o desenvolvimento de insuficiência renal.

25

2-­ OBJETIVOS

2.1 Objetivo Principal

O propósito deste estudo foi avaliar a ação da atorvastatina e seus efeitos

sobre o processo de cicatrização e remodelamento do ventrículo esquerdo.

2.2 Objetivo Primário

Determinar o efeito da atorvastatina sobre metabolismo do colágeno

através de mediadores específicos após o evento de IM.

2.3 Objetivo Secundário

Identificar a expressão de moléculas inflamatórias e sinalizadoras envolvidas com o RV, em resposta à ação terapêutica da atorvastatina.

26

3-­ MATERIAIS E MÉTODO

3.1 Protocolo Experimental

Este estudo foi realizado no laboratório de Isquemia e Reperfusão do

Miocárdio e no laboratório de Técnica Cirúrgica, ambos localizados no Núcleo de

Medicina e Cirurgia Experimental da Faculdade de Ciências Médicas-­UNICAMP,

durante o período de 2013 – 2016. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no

Uso de Animais-­ CEUA, sob o protocolo n° 2860-­1 (Anexo I). O estudo recebeu

suporte financeiro CAPES (01-­P-­1744/2016), CNPQ (472930/2013-­3) e Fapesp (2012/09494-­3).

3.2 Procedimento Cirúrgico – Indução do IM

Foram utilizados 65 ratos da linhagem Wistar, machos e com 4 semanas

de vida. Para o procedimento cirúrgico de indução do IM, os animais foram conectados

a um sistema de anestesia inalatória com isoflurano a 2%, sem serem entubados.

Após realizarmos estímulos de reflexo para verificar a adequada indução do plano

anestésico, os animais foram submetidos à toracotomia. Para isso, uma pequena

incisão foi realizada na pele na região torácica à esquerda, e depois da dissecção da

musculatura, o tórax foi aberto na região intercostal, e “delicadamente” o coração foi

exposto através da incisão torácica. Um fio de polipropileno 6.0 foi passado ao redor

da artéria interventricular anterior e a mesma foi ocluída. O coração foi novamente

inserido no tórax e a incisão fechada. O procedimento tem duração de

aproximadamente dois minutos.

A técnica foi descrita por Gao et al., e Wu et al., (75, 76) e é rotineiramente

realizada no laboratório com uma mortalidade operatória em torno de 15% em virtude

do infarto.

Os animais após o procedimento cirúrgico, foram mantidos em gaiolas com

livre acesso a água e dieta padrão para ratos, e em temperatura de 21ºC com ciclo de luz clara e escura de 12 horas cada.

27

Após recuperados, os animais foram divididos em 3 grupos:

Grupo Sham: Foram utilizados 14 animais. Neste grupo os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico estabelecendo o mesmo protocolo acima

descrito, porém sem a ligadura da artéria interventricular anterior. Neste grupo, 2ml

de placebo (solução fisiológica) foi administrada por gavagem iniciando no primeiro dia após o procedimento cirúrgico, e mantido durante 4 semanas.

Grupo Atorvastatina: Foram utilizados 24animais. Neste grupo os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico com indução do IM, e 10mg/kg/dia de

atorvastatina (Lipitor® – Pfizer) diluída em 2ml de solução fisiológica, foi administrada

por gavagem iniciando no primeiro dia após o procedimento cirúrgico e mantido

durante 4 semanas. Os animais foram pesados semanalmente e a dose foi ajustada

conforme o ganho de peso. A dose da atorvastatina é considerada segura e é baseada

em estudos que avaliaram seu uso em modelos de ratos (53, 66, 77).

Grupo Controle: Foram utilizados 27 animais. Neste grupo os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico com indução do IM, e 2ml de placebo

(solução fisiológica) foi administrada por gavagem iniciando no primeiro dia após o procedimento cirúrgico, e mantido durante 4 semanas.

No estudo foram utilizados 86animais nos quais 65completaram todo o

período de 4 semanas. Além disso, 21 animais foram a óbito durante o procedimento

cirúrgico ou durante o período de recuperação (sham n=1;; atorvastatina n=10;; controle n=10).

3.3 Avaliações Hemodinâmicas

Após completar 4 semanas a partir do início do procedimento cirúrgico, foi

realizado o estudo hemodinâmico.

Para essas avaliações, os animais do grupo sham (n=8), atorvastatina

(n=5) e controle (n=7) foram anestesiados com xilazina (5mg/kg) e ketamina

(75mg/kg) através de injeção intraperitonial. Após atingirem adequado plano

anestésico, um cateter de pressão-­volume (SPR-­838, Millar Instruments, Houston,

USA), foi inserido na cavidade do ventrículo esquerdo através da artéria carótida

28

esquerda. Durante a inserção do cateter foi realizado o monitoramento contínuo de

pressão e volume para o correto posicionamento. O cateter foi acoplado em um

conversor Power Lab 8/30 A/D (AD Instruments;; Mountain View, CA, USA). Correções

de condutância foram determinadas pela injeção de 20-­30μL de solução salina

hipertônica (NaCl 30%). No final da obtenção dos dados para a posterior análise

hemodinâmica, correções do volume do ventrículo esquerdo foram realizadas através

da calibração curvete. Dados como Volume Diastólico Final, Volume Sistólico Final,

Constante de Relaxamento Isovolumétrico (Tau), derivada de Pressão/derivada de

Tempo Máximo (dP/dT Máxima), derivada de Pressão/derivada de Tempo Mínimo

(dP/dT Mínima), Trabalho de Pré-­carga Recrutável (PRSW) e Relação de Pressão e

Volume no Final da Sístole (ESPVR) foram analisados.

No final desse experimento, os animais foram induzidos a um plano

anestésico profundo, por meio de uma overdose de tiopental de sódio e eutanasiados.

O ventrículo esquerdo foi isolado e separado das demais estruturas cardíacas. Após

isso, o ventrículo esquerdo e os pulmões dos animais foram pesados, a fim de

identificar a presença de hipertrofia miocárdica através da relação com o peso final dos animais.

3.4 Análises Histológicas

As análises histológicas foram realizadas após o estudo hemodinâmico, e

destinadas para verificar o conteúdo de fibrose, colágeno, e área transversal dos

cardiomiócitos.

Para as análises de fibrose e colágeno, os animais foram divididos em

grupo sham(n=8), grupo atorvastatina (n=13), e grupo controle (n=14). Os cortes

histológicos apresentaram a espessura de 4μm e as imagens obtidas foram

correspondentes à altura do músculo papilar. Todas as análises foram realizadas a

partir deste segmento de escolha. Foi avaliado tanto o ventrículo esquerdo por inteiro,

como também a região correspondente a parede contralateral do ventrículo esquerdo

(região não infartada). Para estabelecer fibrose e colágeno da região não infartada,

identificamos a parede contralateral do VE considerando a região oposta do infarto.

29

Dessa forma, a região infartada foi excluída, e mantivemos apenas a região remota

para esta análise.

Foram analisadas lâminas coradas com colorações de Tricrômio de

Masson e de Picrusirius Red, para o estudo de fibrose e colágeno respectivamente.

Para a obtenção das imagens histológicas foi utilizado o microscópio de luz óptica e

luz polarizada (Imager A2 Axio Carl Zeiss, Germany), com lentes de aumento de 2,5X

e uma câmera acoplada no microscópio -­ AxioCam ICC 1 – Zeiss. A reconstrução dos

fragmentos foi realizada com o uso do programa PTGui (Rotterdam Netherlands,

version 9.1.3). Para a quantificação de fibrose e colágeno, foi utilizado um programa

de análise quantitativa – Image ProPlusversion6.0 – USA.

Além das análises do conteúdo de fibrose e colágeno, também foi realizado

a análise da área transversal de cardiomiócitos. Este protocolo foi utilizado para

identificar a presença de hipertrofia miocárdica. Nesta técnica foi realizada a medição

da área transversal de cardiomiócito, que é descrita por Stefanon et al (78). Para esta

avaliação, os animais foram divididos em grupo sham (n=5), grupo atorvastatina (n=5),

e grupo controle (n=5). Para isso, foi usado o mesmo microscópio de luz óptica

utilizado para a obtenção das imagens para fibrose e colágeno, com lentes de

aumento de 40X. As lâminas foram coradas com colorações de hematoxilina e eosina,

e as imagens foram correspondentes à região não infartada, com análise de 12-­15

campos, o que totalizou uma contagem de 70 células por animal. A medição da área

dos cardiomiócitos é dada em micrômetros, e foi obtida através do contorno manual

das células. As células que foram analisadas foram aquelas que apresentavam

integridade estrutural em relação ao núcleo e citoplasma. O programa usado para esta

análise quantitativa foi o mesmo para fibrose e colágeno descrito acima (Image ProPlus: version6.0 – USA).

30

3.5 Immunoblotting

A expressão das proteínas estudadas foi realizada por immunoblotting.

Para esta avaliação os animais foram divididos em grupo sham (n=6), grupo

atorvastatina (n=6), e grupo controle (n=6).

Após a remoção de outras estruturas cardíacas, as amostras

correspondentes ao ventrículo esquerdo foram rapidamente congeladas em nitrogênio

líquido, e armazenadas em -­80°C. Para este estudo, foi realizada a extração de

proteínas totais da região não infartada. A extração foi executada através do preparo

de um tampão Ripa contendo inibidores de proteases e fosfatases(79, 80). Após a

extração, foi realizada a dosagem de proteínas totais através do método BCA (23225/23227 – BCA Protein Assay Kit – Thermo Scientific – USA).

Foram preparados géis SDS-­PAGE de 10-­12%, e aplicado uma quantidade

de proteínas totais correspondente a 40μg.A eletroforese foi realizada em cuba de

minigel (Mini-­PROTEAN® II Cell -­ BioRad), e após isso foi realizada a transferência

utilizando Trans-­Blot®Turbo (BioRad), para membranas de nitrocelulose -­ 0,2µm

(BioRad). A membrana foi bloqueada por 2 horas, e incubada com anticorpos

primários durante 10-­12 horas, sendo estes correspondentes a: MMP1/8 (sc30069),

TIMP1 (ab61224), COL I (sc8784), COL III (sc28888) e PCPE (sc730022), SPARC

(ab61383), IkB -­α (sc371), p IkB -­α (sc8404), TLR2 (ab108998), TLR4 (ab30667), e

Tenascin-­C (ab108930). Os anticorpos secundários foram adicionados e incubados

com a membrana por 2 horas, e após lavagem, foi adicionada uma solução reveladora

contendo peroxidase (solução de quimiluminescência Super Signal West Pico

Chemiluminescent Substrate, Pierce). As imagens das bandas correspondentes às

proteínas de interesse foram obtidas através de uma foto documentadora (Gel Logic

Imaging System), sendo essas analisadas pelo método de densitometria. Além disso,

os sinais das bandas correspondentes às proteínas de interesse foram normalizados

pela coloração de Ponceau (80, 81).

31

3.6 PCR em tempo real

As expressões gênicas foram avaliadas por meio de PCR em tempo real,

e os animais foram divididos em grupo sham (n=4), grupo atorvastatina (n=4) e grupo controle (n=4).

A extração de RNA total foi correspondente a região não infartada,

utilizando o reagente de TRizol (Life Technologies), conforme as instruções fornecidas

pelo fabricante. Após a extração, foi verificada a integridade e a quantificação de RNA,

utilizando um leitor de ELISA (Epoch Micro-­Volume Spectrophotometer System), nas

relações 260/280nm. A partir disso, a reação de transcrição reversa para a obtenção

de cDNA foi preparada com o uso do kit High Capacity cDNA (Applied Biosystems),

utilizando 1µg de RNA total. Os componentes do máster mix para a reação foram: Rt

buffer, dNTP, random primers, transcriptase reversa e inibidor de RNAse. A reação foi

realizada utilizando o protocolo de 25°Cdurante 10 minutos, seguido por 37°C durante 120 minutos, 85°C por 5minutes e 4°Caté o final da reação.

O PCR em tempo real foi realizado no equipamento StepOne Plus™

System (Life Technologies – Carlsbad CA, Estados Unidos). Foi utilizado sondas de

hidrólise TaqMan do kit Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), contendo os

seguintes componentes: TaqMan Fast Advanced Mater Mix, TaqMan gene

expression, cDNA template e água livre de nuclease. As condições relacionadas à

amplificação das reações seguiram o protocolo de incubação inicial em 50°C durante

2 minutos, ativação da polimerase em 95°C por 20 minutos, e 40 ciclos de reação de

PCR com desnaturação dos primers em 95°C por 1 minuto e posterior anelamento em

60°C durante 20 minutos.

A expressão dos genes estudados foi normalizada usando actina como

gene de referência. Além disso, as análises foram realizadasatravés do programa

Data Assist (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA, USA) utilizando 2ΔΔCT como método de detecção.

Os seguintes primers foram estudados, e são comercialmente disponíveis

(Life Technologies): IL1 (Rn00566700), IL6 (Rn01410330), NF-­kBp50 (Rn01399583),

NF-­kB p65 (Rn01502266), e actina (Rn00667869).

32

3.7 Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa GraphPad

Prism, version5, San Diego, CA, USA. As variáveis contínuas foram expressas em

média ± DP. Além disso, para testar se as amostras apresentavam distribuições

normais, realizamos testes de D´Agostino-­Pearson. Comparação entre os três grupos

foi realizada através da análise de variância (ANOVA), seguido por Teste de

Bonferroni e de Kruskal-­Wallis, quando apropriados. O valor de P<0,05 foi

considerado estatisticamente significante.

33

4-­ RESULTADOS

Os achados deste estudo em relação ao peso dos animais nos mostraram

que o grupo sham apresentou maior peso no início do estudo, quando comparado

com os animais do grupo controle e atorvastatina. O mesmo achado foi encontrado

em relação ao peso final. Os animais do grupo sham apresentaram maior peso final em relação ao grupo controle e atorvastatina (Tabela 1).

O peso do ventrículo esquerdo (VE) e do pulmão não demonstrou

diferenças quando comparamos todos os grupos do estudo. Quando avaliamos a

relação peso VE/peso animal, além do peso pulmão/peso animal, encontramos que

os animais do grupo sham foram significantemente menores em relação ao grupo

controle e atorvastatina, sem demonstrar diferenças nessas relações (peso VE/peso

animal e peso pulmão/peso animal), quando comparamos controle versus atorvastatina (Tabela 1).

Tabela 1: Pesos animais – grupos sham, controle e atorvastatina.

Tabela 1: Os dados acima são expressos em média ± desvio padrão. * P<0,05 – versus grupo Sham.

Pesos (mg)

Sham

Controle

Atorvastatina

Peso Inicial

164,5 ± 10,28

105,7 ± 23,77 *

100,6 ± 19,07 *

Peso Final

339,1 ± 19,13

259,1 ± 18,57*

255,8 ± 26,48*

Peso VE

0,6968 ± 0,1370

0,6274 ± 0,0702

0,6579 ± 0,0812

Peso Pulmão

1,561 ± 0,4297

1,686 ± 0,4384

1,976 ± 0,7392

Peso VE / Peso Animal

0,0020 ± 0,0004

0,0024 ± 0,0002 *

0,0025 ± 0,0003 *

Peso Pulmão / Peso Animal

0,0046 ± 0,0012

0,0067 ± 0,0020 *

0,0079 ± 0,0028 *

34

A partir dos dados hemodinâmicos, avaliamos os parâmetros de volumes,

índices de relaxamento e contractilidade do ventrículo esquerdo após 4 semanas de

indução do IM. Os achados nos revelaram que os animais do grupo atorvastatina

apresentaram menor volume diastólico final, quando comparados com o grupo

controle (Tabela2). Além disso, encontramos que os animais do grupo atorvastatina

apresentaram uma tendência para menor volume sistólico final, mas sem demonstrar

diferenças quando comparamos com os animais do grupo controle. A constante de

relaxamento isovolumétrico (Tau) mostrou ser menor nos animais do grupo sham,

quando comparado com os grupos controle e atorvastatina. Quando avaliamos dP/dt

máxima e mínima, encontramos maiores valores de dP/dt mínima no grupo sham, e

não demonstramos diferenças nos valores de dP/dt máxima em relação aos grupos

do estudo. Os índices de contractilidade PRSW e ESPVR não demonstraram

diferenças quando comparamos o grupo atorvastatina com o grupo controle, apesar

de mostrarem tendências de serem mais elevados após o tratamento com a atorvastatina.

Tabela 2: Avaliações hemodinâmicas dos animais do grupo sham, controle e atorvastatina.

Parâmetro

Sham

Controle

Atorvastatina

Valor de P

Volume Diastólico Final(uL)

176,2 ± 27,51

220,2 ± 31,67

172,8 ± 36,21 #

0,04

Volume Sistólico Final (uL)

165,3 ± 26,09

201,8 ± 27,70

167,1 ± 31,70 #

0,05

Tau (MS)

10,51 ± 1,74

20,43 ± 6,90 *

18,11 ± 3,56 *

<0,01

dP/dt Máxima, mmHg/s

7976 ± 1268

6926 ± 2828

5405 ± 1651

0,13

dP/dt Mínima, mmHg/s

-­8462 ± 1902

-­4719 ± 1836 *

-­5059 ± 2122 *

<0,01

PRSW

35,34 ± 20,13

28,97 ± 16,68

40,79 ± 36,57

0,71

ESPVR

4,18 ± 1,54

0,55 ± 0,49 *

1,38 ± 1,62 *

<0,01

35

Tabela 2: Representa os dados hemodinâmicos obtidos após 4 semanas de indução ao IM. O valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significante.*P<0,05 – versus grupo Sham;; #P<0,05 – versus grupo Controle.

As avaliações histológicas nos revelaram que o conteúdo de fibrose

analisado no ventrículo esquerdo foi significantemente reduzido nos animais do grupo

sham quando comparado com os animais do grupo controle e atorvastatina (1,1 ±

0,3% para sham vs. 20,8 ± 7,6% para controle vs. 15,0 ± 6,7% para atorvastatina;; P<

0,01). Também encontramos que o tratamento com a atorvastatina foi capaz de

reduzir a fibrose quando comparamos com o grupo controle (20,8 ± 7,6% vs. 15,0 ±

6,7%;; P=0,03) (Figura1). O conteúdo de colágeno reduziu significantemente nos

animais do grupo sham em relação aos outros grupos estudados (0,8 ± 0,3% para

sham vs. 9,5 ± 5,0% para controle vs. 7,4 ± 4,5% para atorvastatina;; P<0,01), porém

não evidenciamos diferenças entre o grupo controle em relação ao grupo atorvastatina

(9,5 ± 5,0% vs. 7,4 ± 4,5%;; P=0,24)(Figura 1).

Além de avaliar o conteúdo de fibrose e colágeno no ventrículo esquerdo

por inteiro, também realizamos a mesma análise na parede contralateral do ventrículo

esquerdo. Com isso, verificamos uma redução no conteúdo de fibrose no grupo sham

quando comparamos com os grupos controle e atorvastatina (0,68 ± 0,48% para sham

vs. 3,56 ± 2,70% para controle vs. 2,61 ± 1,44% para atorvastatina;; P<0,01), porém

este mesmo achado não foi encontrado nos grupos estudados, quando avaliamos o

conteúdo de colágeno (0,70 ± 0,32% para sham vs. 1,17 ± 0,71% para controle vs.

0,91 ± 0,44% para atorvastatina;; P=0,14) (Figura 2).

36

Figura 1: Quantificação de fibrose e colágeno no ventrículo esquerdo.

Figura 1: Representa os achados histológicos correspondentes ao ventrículo esquerdo na porção do músculo papilar. As imagens A e D são representadas pelos animais do grupo sham, B e E ao

grupo controle, enquanto que C e F são dos animais do grupo atorvastatina. As imagens

superiores estão coradas com coloração de Tricrômio de Masson e usadas para avaliar fibrose, e

as imagens inferiores estão coradas com coloração de Picrusirius Red usadas para avaliar

colágeno. Escala de barras: 1000μm. Os gráficos de barras representam a porcentagem de fibrose

e colágeno nos três grupos estudados (Sham – cinza;; Controle – preto;; Atorvastatina – branco).

*P<0,05 vs. Sham, e #P<0,05 vs. Controle.

0

5

10

15

20

25 *

* #

Sham Controle Atorvastatina

% Fibrose

0

5

10

15

**

Sham Controle Atorvastatina

% Colágeno

BA

D E F

C

37

Figura 2: Quantificação de fibrose e colágeno na parede contralateral do ventrículo esquerdo.

Figura 2: Representa os achados histológicos das análises da parede contralateral do ventrículo esquerdo. Os gráficos de barras representam a porcentagem de fibrose e colágeno nos três grupos

estudados (Sham – cinza;; Controle – preto;; Atorvastatina – branco). *P<0,05 vs. Sham.

Nas análises histológicas também avaliamos os processos hipertróficos na

parede contralateral do ventrículo esquerdo, através da medição da área transversal

de cardiomiócitos. Os achados mostraram que os animais do grupo sham

apresentaram menor área de cardiomiócitos quando comparamos com os animais do

grupo controle e atorvastatina (209,6 ± 45,34μm2 para sham vs. 446,8 ± 133,0μm2

para controle vs. 261,1 ± 79,35μm2 para atorvastatina;; P<0,01). Além disso, o

tratamento com a atorvastatina após a indução do IM foi capaz de reduzir a área dos

cardiomiócitos quando comparamos com os animais do grupo controle (446,8 ± 133,0

μm2vs. 261,1 ± 79,35μm2;; P<0,01) (Figura 3).

0

1

2

3

4

5 *

*

Sham Controle Atorvastatina

% Fibrose -­ Contralateral

0.0

0.5

1.0

1.5

Sham Controle Atorvastatina

% Colágeno -­ Contralateral

38

Figura 3: Área Transversal de Cardiomiócitos.

Figura 3: Representa os achados histológicos correspondentes a Área Transversal de Cardiomiócitos. As imagens, A, B e C são representadas pelos animais do grupo sham, controle e atorvastatina

respectivamente. As imagens estão coradas com colorações de hematoxilina e eosina. Escala de

barras: 100μm.O gráfico de barras representa a área transversal das células cardíacas nos três grupos

estudados (Sham – cinza;; Controle – preto;; Atorvastatina – branco). *P<0,05 vs. Sham, e #P<0,05 vs.

Controle.

O estudo das expressões de proteínas foi realizado por meio de

immunobloting. A avaliação do metabolismo do colágeno após a indução do IM foi

estudada através das expressões de MMP1/8, TIMP1, COL I, COL III, PCPE e

SPARC. Expressões de MMP1/8 e TIMP1 foram maiores após o tratamento com

atorvastatina, quando compramos com o controle (Figura 4). Nossos resultados

também mostraram que os animais do grupo sham apresentaram menores níveis de

expressão de COL I, quando comparamos com o grupo atorvastatina e controle. O

tratamento com atorvastatina também foi eficaz para reduzir os níveis de COL I em

0

100

200

300

400

500

* #

*

Sham Controle Atorvastatina

µm2

A B CAB CA

39

relação ao grupo controle. Porém, quando avaliamos as expressões de COL III, não

evidenciamos quaisquer diferenças entre os grupos envolvidos no estudo (Figura 4).

Para o metabolismo do colágeno, também avaliamos a expressão de

proteínas envolvidas com a síntese de colágeno, como PCPE e SPARC. A partir disso,

demonstramos que o tratamento com atorvastatina durante 4 semanas levou a

menores expressões de PCPE e SPARC, quando comparamos com os animais do grupo controle (Figura 4).

Figura 4: Immunobloting das proteínas envolvidas no metabolismo do colágeno.

Figura 4: Representa níveis de expressão de MMP1/8, TIMP1, COL I, COL III, PCPE e SPARC da região não infartada do ventrículo esquerdo. As bandas superiores correspondem à expressão da

proteína estudada, enquanto que as bandas inferiores (coloração avermelhada) correspondem à

coloração de Ponceau. Os gráficos de barras mostram os níveis de expressões em unidades relativas,

a partir das análises realizadas por densitometria nos três grupos (Sham – cinza;; Controle – preto;;

Atorvastatina – branco). P<0,05 foi considerado estatisticamente significante.

Sham Controle Atorvastatina0

1

2

3

4

MMP1/8 52 kDa

P<0,01

P<0,01

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0

1

2

3

4

TIMP1 23 kDa

P= 0,01

P= 0,05

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

P= 0,01P< 0,01

P< 0,01

COL I 70 kDa

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0

1

2

3

PCPE 36 kDa

P<0,01P= 0,02

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0

1

2

3

4

SPARC 35 kDa

P<0,01P= 0,01

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0.0

0.5

1.0

1.5

COL III 110 kDa

Unidades Relativas

40

Quando avaliamos a expressão de proteínas envolvidas com a resposta

inflamatória, estudamos as expressões de pIkBα/IkBα, TLR2, TLR4 e Tenascin-­C.

Não encontramos diferenças entre os animais do estudo em relação as expressões

de pIkBα/IkBα, apesar de observarmos uma tendência de menor expressão após o

tratamento com atorvastatina (Figura 5). Tenascin-­C apresentou menores expressões

nos animais do grupo sham em relação controle e atorvastatina. Esse resultado

também demonstra uma tendência de menor expressão após o tratamento com

atorvastatina, pois não encontrarmos diferenças em relação ao grupo controle.

Contudo, o tratamento com atorvastatina reduziu significantemente a expressão de

TLR4 quando comparamos com os animais que receberam solução salina, porém

TLR2 não mostrou diferenças entre os grupos estudados (Figura 5).

41

Figura 5: Expressão de proteínas envolvidas na resposta inflamatória.

Figura 5: Imagens das bandas referentes às proteínas envolvidas na reposta inflamatória. Sinais das bandas correspondentes a IkB-­alfa fosforilada (pIkB-­alfa) foram normalizados pela expressão de IkB-­

alfa total. Sinais das bandas correspondentes a Tenascin-­C, TLR2 e TLR4, foram normalizados pela

coloração de Ponceau demonstradas pelas bandas vermelhas. Os gráficos de barras mostram os níveis

de expressões em unidades relativas, a partir das análises realizadas por densitometria nos três grupos

(sham – cinza;; controle – preto;; atorvastatina – branco).P<0,05 foi considerado estatisticamente

significante.

A resposta inflamatória, também foi avaliada através de PCR em tempo

real. Expressões gênicas de IL1, IL6, NF-­kBp50 e NF-­kBp65 foram estudadas (Figura

6). Nossos resultados mostraram que os animais do grupo sham apresentaram

menores expressões gênicas de IL1, em relação aos animais do grupo controle e

atorvastatina. O tratamento com atorvastatina também mostrou menores níveis de IL1

Sham Controle Atorvastatina0

5

10

15

p IkB-­α

IkB-­α

41 kDa

36 kDa

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tenascin-­C 241 kDa

P= 0,04

P<0,01

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

TLR2 90 kDa

Unidades Relativas

Sham Controle Atorvastatina0

1

2

3

4 P= 0,01P<0,01

TLR4 75 kDa

Unidades Relativas

42

quando comparamos com os animais do grupo controle. Os níveis IL6 foram menores

nos animais do grupo sham, porém não encontramos diferenças nos animais tratados

com atorvastatina em relação aos animais do grupo controle. Além disso, a expressão

de NF-­kBp50 foi menor nos animais do grupo sham e nos que receberam

atorvastatina, em relação ao grupo controle. Contudo, NF-­kBp65 mostrou ser menor

nos animais do grupo sham, sem mostrar diferenças entre os demais animais envolvidos no estudo.

Figura 6: Avaliação da resposta inflamatória – PCR em tempo real.

Figura 6: Gráficos correspondentes às expressões gênicas de IL1, IL6, NF-­kBp50 e NF-­kBp65. Os níveis de expressão foram normalizados usando actina como gene de referência. P<0,05 foi

considerado estatisticamente significante.

Sham Controle Atorvastatina 0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

IL 1

P= 0,01

P= 0,01

P< 0,01

Nível Relativo de RNAm

Sham Controle Atorvastatina0

1e-­005

2e-­005

3e-­005

4e-­005

IL 6

P< 0,01

P= 0,01

Nível Relativo de RNAm

Sham Controle Atorvastatina0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

NF-­kB p50

P< 0,01

P< 0,01

P< 0,01

Nível Relativo de RNAm

Sham Controle Atorvastatina0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

NF-­kB p65

P< 0,01

P< 0,01

Nível Relativo de RNAm

43

5-­ DISCUSSÃO

No presente estudo, nós avaliamos os efeitos do tratamento com

atorvastatina sobre o metabolismo do colágeno e remodelamento ventricular, após

infarto do miocárdio em modelo experimental. Nossos principais achados nos

revelaram que a atorvastatina pode influenciar nos efeitos deletérios decorrentes da isquemia miocárdica.

Estudos anteriores em modelos experimentais demonstraram que as

funções sistólicas e diastólicas da bomba cardíaca podem ser preservadas após o

tratamento com estatinas (37, 82). No presente estudo, nós mostramos que o

tratamento durante 4 semanas com a atorvastatina possivelmente influencia na

manutenção da função diastólica demonstrada por menor volume diastólico final,

apesar de não avaliarmos a pressão diastólica final. O tratamento com atorvastatina

antes e após a indução do infarto tem sido reportado por atenuar e melhorar

disfunções ventriculares, através de melhores índices de dP/dt Máxima, pressão diastólica final e PRSW (53).

Após a injúria tecidual, a produção e deposição de colágeno estão

aumentadas na MEC levando para o desenvolvimento de fibrose e rigidez cardíaca

(40). O colágeno é o modulador tanto da função sistólica como diastólica, e por isso a

fibrose é relacionada com a deterioração da função ventricular devido alterações das

funções contráteis e de relaxamento da câmara cardíaca (6, 8, 40). Nós encontramos

através das análises histológicas, que a atorvastatina foi capaz de reduzir o conteúdo

de fibrose, mas não o de colágeno no ventrículo esquerdo. A partir disso, nós

buscamos encontrar possíveis fatores envolvidos com esses achados, e acreditamos

que exista uma provável influência das colorações utilizadas. Tricrômio de Masson

permite uma análise quantitativa de todos os tipos de colágenos e componentes

presentes na MEC, enquanto Picrusirius Red é uma coloração específica e que

facilmente se liga as moléculas de COL I e III. Utilizando Picrusirius Red para avaliar

colágeno, nós consideramos os dois tipos de colágeno presente nas amostras, uma

vez que para avaliar COL I e III separadamente realizamos immunoblotting. Nossos

resultados mostraram que a redução do conteúdo de fibrose foi atribuída à menor

44

expressão de COL I, mas não de COL III. Com isso, a terapia com atorvastatina

melhorou a função ventricular decorrente ao seu efeito antifibrótico, e consequentemente resultou em menor rigidez ventricular e disfunção diastólica.

Avaliamos a influência da atorvastatina sobre o metabolismo do colágeno.

As MMPs são endopeptidases zinco-­dependentes, que após a sua ativação estão

envolvidas com a regulação na estrutura e funcionalidade da matriz extracelular (32).

Sua regulação ocorre pela degradação de componentes da MEC, principalmente o

colágeno, e assim contribuem para o desenvolvimento do RV (33, 34). As MMPs

apresentam reguladores endógenos – TIMPs, responsáveis pelo controle de sua ação

catalítica (83). TIMP1 apresenta ação inibitória para MMP1 (48). TIMPs apresentam

seus efeitos sobre o RV, através da regulação de processos inflamatórios, dilatação

e disfunção ventricular (84).A ausência de TIMP1 após o IM pode levar a piora na

função diastólica demonstrada por maiores índices de volume diastólico final, além de

promover o desenvolvimento de hipertrofia e rigidez ventricular (85). Por isso, é de

fundamental importância, que ocorra o balanço entre a ação das MMPs e seus

inibidores TIMPs a fim de manter o equilíbrio e a homeostase da MEC (49, 52).

Anteriormente foi reportado que o tratamento durante 4 semanas com

atorvastatina pode aumentar os níveis de MMP2/TIMP2, associados com menor

conteúdo de fibrose (77). Os autores neste estudo mostraram que essa sinalização

ocorre por que a taxa de degradação de colágeno na MEC é maior do que a taxa de

síntese, levando para redução da deposição de colágeno, e consequentemente para

menor fibrose cardíaca. No presente estudo, nós mostramos que os níveis de MMP1/8

e TIMP1 foram elevados após o tratamento com atorvastatina. O tratamento com a

atorvastatina também influenciou em dois marcadores de síntese de colágeno: PCPE

e SPARC. PCPE (Procollagen C-­Proteinase Enhancer) é uma glicoproteína que tem

como função potencializar a atividade de PCPs (Procollagen C Proteinases),

importante enzima presente na síntese de novas moléculas de colágeno (86). SPARC

é uma proteína matricelular presente na MEC, que participa da formação de novas

moléculas de colágeno, através da sua ligação em moléculas de pró-­colágeno (87).

Além disso, SPARC é expressa após infarto do miocárdio, processos fibróticos e

hipertróficos (26). Nós encontramos que a atorvastatina influencia negativamente nas

expressões de PCPE e SPARC, demonstrado por nossos resultados de menores

45

níveis de expressão. Além disso, animais do grupo atorvastatina apresentaram

menores expressões de COL I, porém sem apresentar os mesmos efeitos sobre COL

III. A partir desses achados, o aumento dos níveis de MMP1/8 e TIMP1, redução em

PCPE e SPARC, além de menor expressão de COLI, indicam que a atorvastatina

aumenta a degradação e reduz a síntese de colágeno, o que resultou em menor

deposição na MEC e menor fibrose ventricular.

A presença de hipertrofia ventricular após infarto do miocárdio está

diretamente associada com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, e surge com

uma consequência do RV (88). No nosso estudo, nós avaliamos a hipertrofia cardíaca

através da relação do ventrículo esquerdo ajustado pelo peso dos animais, e pela área

transversal de cardiomiócitos. Quando estudamos a hipertrofia através da relação dos

pesos dos animais, não encontramos diferenças em relação aos grupos controle e

atorvastatina. No modelo experimental de infarto em ratos, a interação de eventos

como reabsorção do tecido necrótico e a quantidade de colágeno no local da

cicatrização, pode interferir com o peso ventricular, e dessa forma não demonstrar o

“real” crescimento celular (89). O processo de cicatrização e remodelamento pode ter

interferido nos nossos resultados de hipertrofia avaliados pelo peso dos animais. Por

isso, nós também estudamos o grau hipertrófico através da área transversal de

cardiomiócitos. Com isso, nós encontramos que os animais tratados com atorvastatina

apresentaram significantemente menor área transversal das células cardíacas quando

comparamos com o grupo controle. As estatinas apresentam efeitos anti-­hipertróficos,

e esses podem estar envolvidos com regulação da via PPARs (Peroxisome

Proliferator-­Activated Receptor) (90). PPARs inibe a hipertrofia cardíaca por meio da

redução dos níveis de citocinas pró-­inflamatórias (90, 91). Atorvastatina pode prevenir

à redução de PPARs, e dessa forma, limita o desenvolvimento de processos

hipertróficos (92, 93). Apesar de não avaliarmos a hipertrofia pela via PPARs, nós

mostramos que ocorreu uma redução no tamanho dos cardiomiócitos, e isso pode ter

sido atribuído às propriedades anti-­inflamatórias da atorvastatina, e possivelmente PPARs pode ter influenciado nesses efeitos.

Após o insulto isquêmico no tecido cardíaco, vários mediadores

inflamatórios são ativados e células inflamatórias são estimuladas a se deslocarem

para o local da injúria tecidual (8). Essas células infiltram-­se no local da injúria,

46

secretam citocinas que irão potencialmente aumentar a reposta inflamatória, e

contribuir para a expansão do infarto para região não infartada do ventrículo esquerdo

(27). Além disso, a necrose decorrente do evento isquêmico leva a ativação da RII.

Com isso, ocorre a expressão e ativação de TLRs, que em conjunto com a geração

de radicais livres, irão estimular agentes pró-­inflamatórios como NF-­kB, e assim

induzir a expressão de citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão (28, 29). A

progressiva resposta inflamatória inicia um importante papel na patogênese do RV, pois atua na modulação da cicatrização e induz a mudanças na MEC (31).

As estatinas apresentam propriedades anti-­inflamatórias e

cardioprotetoras, atribuídas aos seus efeitos pleiotrópicos (57, 59, 60). Nós avaliamos

as propriedades anti-­inflamatórias da atorvastatina através do estudo da expressão

de algumas citocinas pró-­inflamatórias na região remota do infarto. O tratamento com

atorvastatina significantemente reduziu os níveis de IL1, sem afetar os níveis de IL6.

Redução nas expressões gênicas de IL1 pode influenciar na fosforilação de IκBα,

apesar de não encontrarmos diferenças entre os grupos estudados. No citoplasma,

NF-­kB é encontrada na forma de heterodímeros, principalmente p50/RelA (p65), e

está ligada em proteínas inibitórias conhecidas como IkBs (94). Alguns eventos como

anoxia, presença de espécimes reativos de oxigênio, e estímulos pró-­inflamatórios

mediados por TNF-­α e IL1, contribuem para a ativação de IkB quinases, também

conhecidas como complexo IKK (95, 96). As IkB quinases quando ativadas, são

responsáveis pela fosforilação das IkBs, principalmente a IkBα (97). Quando

fosforilada, IkBα desliga-­se de NF-­kB permitindo sua translocação a partir do

citoplasma para o núcleo (95, 97, 98). No núcleo NF-­κBp50/RelA age como fator de

transcrição estimulando e liberando proteínas de fase aguda, moléculas de adesão,

TNF-­α, IL1 e IL6 (99). NF-­κB é uma importante moduladora de resposta imune, e está

ativa em várias doenças inflamatórias. Nas doenças cardiovasculares, está associada

com alto índice de mortalidade (97). Contudo, a IL1 é uma citocina pró-­inflamatória

responsável por consequências deletérias após IM, pois induz a resposta inflamatória,

apoptose de cardiomiócitos, fibrose e hipertrofia cardíaca (31, 100). Os efeitos da

atorvastatina em relação as suas ações anti-­inflamatórias, podem estar envolvidos

com redução dos níveis de IL1, que atenuaram as expressões de pIκBα, e resultou

em menores estímulos de NF-­κB.

47

Os dímeros de NF-­kB podem ser considerados ativadores ou repressores

da transcrição gênica, uma vez que p50 é considerado repressor e RelA (p65)

ativador. NF-­kB p50/p50 é o heterodímero repressor mais comum, porém quando o

dímero p50 liga-­se com um dímero ativador (RelA) – que apresenta domínio de

transativação (TAD), este apresentará função transcricional (101). Apesar disso, no

presente estudo nós não encontrarmos diferenças em NF-­κBp65 após o tratamento

com a atorvastatina, e mostramos que a inibição de NF-­κBp50 pode refletir em

melhora no RV em modelo experimental. Frantz et al., mostraram que a ausência de

NF-­κBp50 após IM em modelo experimental, foi associada a redução na dilatação

ventricular, além de menor deposição de colágeno na MEC, atenuando dessa forma

as consequências do RV (102). Atorvastatina tem mostrado inibição dos efeitos

deletérios de NF-­κB (103). Ortego et al., demonstraram que o tratamento com

atorvastatina em células lisas do músculo, inibe a ativação NF-­κB, e isso ocorre

principalmente devido à redução nos estímulos de IκBα no citoplasma (104).

TLRs são receptores específicos que participam da RII, e são ativados por

leucócitos após injuria isquêmica no tecido cardíaco (29, 105, 106). TLRs

potencializam a resposta inflamatória, pois também contribuem para translocação de

NF-­κB do citoplasma para o núcleo, além de estimularem a liberação de citocinas

como IL1, IL6 e TNF-­α (106, 107). Esses receptores compreendem uma família de 11

tipos (TL1 – TLR11), sendo TLR2 e TLR4 os mais estudados no miocárdio (108, 109).

A partir dos nossos resultados, nós encontramos que os animais do grupo

atorvastatina apresentaram menor expressão de TLR4, sem apresentar efeitos sobre

as reduções dos níveis de TLR2. Com isso, esses achados nos mostram que a

redução em TLR4, possivelmente contribuiu para menor expressão de IL1, e, portanto,

refletiu em menores estímulos de pIκBα e NF-­kBp50. Similar aos nossos achados, o

efeito cardioprotetor conferido ao tratamento com fluvastatina, tem sido decorrente a indução de menores níveis de TLR4 e o que levou a menor ativação de NF-­kB (107).

As proteínas matricelulares agem como mediadoras biológicas expressas

no tecido cardíaco após injuria isquêmica, e contribuem para a resposta inflamatória

durante o RV (23, 25). A expressão dessas proteínas está elevada após condições

patofisiológicas como IM, hipertrofia ventricular, fibrose, miocardites e doenças

valvares (26). Tenascin-­C é considerado importante marcador inflamatório, pois atua

48

como regulador da ativação de NF-­kB, além de agir na formação de novas moléculas

de colágeno (23). Após o IM, a melhora na função diastólica e redução do conteúdo

de fibrose, podem ser conferidas a ausência das expressões de Tenascin-­C (26, 110).

No presente estudo, apesar de não encontrarmos diferenças significantes entre os

grupos controle e atorvastatina, nós mostramos que o tratamento com atorvastatina

pode reduzir as expressões de Tenascin-­C, e dessa maneira ter contribuído para

menor expressão de IL1, induzindo menores níveis de NF-­kBp50, além de levar a menor síntese e deposição de colágeno na MEC.

Este estudo apresenta algumas limitações:

1. Diferentes doses de atorvastatina não foram investigadas para verificar

efeitos dependentes com a dose. Nós avaliamos os efeitos da atorvastatina em

modelo experimental de infarto do miocárdio em ratos, utilizando10mg/kg/dia. Estudos

anteriores têm mostrado que esta dose de atorvastatina é segura e apresenta efeitos cardioprotetores (53, 111-­113).

2. O presente estudo refere-­se a um estudo experimental e não estudo

clínico. Nós mostramos que o tratamento com atorvastatina influencia positivamente

no RV após o IM em modelo experimental em ratos. O processo de remodelamento

ventricular está também presente em algumas cardiopatias e condições clínicas, como

insuficiência aórtica crônica com o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca, além de

insuficiência mitral associada com dilatação ventricular. Neste estudo, nós não

avaliamos os efeitos do tratamento com atorvastatina nessas condições, e por isso,

ensaios clínicos e futuras investigações são necessários para este propósito.

Contudo, este modelo experimental de IM em ratos tem sido extensivamente utilizado

e reportado na literatura, e assemelha-­se com o mecanismo patofisiológico que ocorre após a oclusão coronariana em humanos (114).

49

6-­ CONCLUSÃO

A partir do presente estudo, encontramos que atorvastatina melhora a

funcionalidade ventricular, atenua formação de fibrose, reduzindo hipertrofia e

inflamação após infarto do miocárdio em ratos.

Os efeitos favoráveis encontrados após o tratamento com atorvastatina

foram decorrentes da modulação sobre marcadores específicos envolvidos no

metabolismo do colágeno como MMP1/8, TIMP1, PCPEe SPARC, além da regulação

na resposta inflamatória demonstrada por IL1, NF-­kBp50, e TLR4. A atorvastatina

pode ser uma terapia de escolha a fim de controlar os efeitos adversos causados

durante e após o RV.

Portanto, concluímos que a administração da atorvastatina durante 4

semanas pode ser uma estratégica terapêutica utilizada para limitar os processos

reparativos que ocorrem após injúria isquêmica no miocárdio.

50

7-­ REFERÊNCIAS

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61

8-­ ANEXOS

Anexo – I: Parecer do comitê de ética.

62

Anexo – II: Referência do artigo publicado da presente tese apresentada:

Reichert K, Pereira do Carmo HR, Torina AG, de Carvalho DD, Sposito

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