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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Influência do ácido oléico como promotor de absorção cutânea para o ácido 5-

aminolevulínico na terapia fotodinâmica do câncer de pele: estudos in vitro e in vivo em

modelo animal.

ALINE REGINA HELLMANN CAROLLO

RIBEIRÃO PRETO – SP

2007

ALINE REGINA HELLMANN CAROLLO



modelo animal.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre

em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração:

Medicamentos e Cosméticos.

Orientadora: Profª. Drª. Maria Vitória Lopes Badra Bentley

RIBEIRÃO PRETO – SP

2007

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Carollo, Aline Regina Hellmann



modelo animal / Aline Regina Hellmann Carollo; orientadora: Maria Vitória Lopes Badra

Bentley – Ribeirão Preto, 2007.

117 f.; il.

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área

de Concentração: Medicamentos e Cosméticos) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto / Universidade de São Paulo.

1. Ácido 5-aminolevulínico. 2. Terapia fotodinâmica. 3. Ácido oléico. 4. Câncer de

pele.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Aline Regina Hellmann Carollo.



modelo animal.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,

para obtenção do Título de Mestre, Área de

Concentração: Medicamentos e Cosméticos.

Aprovado em:

Banca examinadora

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ____________ Assinatura: ___________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________


Prof. Dr. ____________________________________________________________________


DEDICATÓRIA

Ao meu grande amor, Alexandre, pelo carinho, pela paciência, pela ajuda e por sempre

me apoiar em minhas decisões.

À minha mãe, Ilze, que sempre me incentivou nos momentos difíceis e me ensinou a

lutar por meus sonhos. Obrigada pelo seu apoio e seu carinho.

Ao meu pai, Arno, pelo carinho.

Aos meus grandes amigos de Campo Grande, que fazem muita falta, em especial, Dani

e Meiry.

À todos os amigos que fizemos em Ribeirão e que tornam os dias aqui muito mais

agradáveis: Patrícia, Fábio, Ernesto, Ro, Gobbo, Michel, Camila, Ana Maria, Alessandro,

Lidiane, Cléber, Denise, Estela, Hosana, Andréia e Beto.

Aos meus sobrinhos Max, Pedro Affonso e Mariana e meus afilhados Eduarda,

Gustavo e Lucas: adoro vocês!

AGRADECIMENTOS

À Deus, que me deu sabedoria e força para alcançar meus objetivos.

À Profª Drª M. Vitória L. B. Bentley, por ter me acolhido em seu grupo de

trabalho, pela confiança e pela orientação deste trabalho

À Profª Drª Dionéia Camilo R. de Oliveira, do Departamento de Física e

Química da FCFRP-USP, pela ajuda e pela amizade desde nossa chegada a Ribeirão Preto.

A todos meus amigos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, pela

amizade, pelo apoio e pela colaboração.

Aos funcionários do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Henrique e José

Orestes, pela ajuda e pela sempre alegre convivência.

À funcionária Márcia Sirlene Zardin Graeff, do Departamento de Morfologia

da FMRP-USP, pelo auxílio na obtenção das imagens de microscopia confocal.

À funcionária Izilda R. Violante, do Departamento de Morfologia da FMRP-

USP, pela contribuição na confecção dos cortes para a microscopia.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela

bolsa de mestrado concedida e pelo financiamento do projeto.

A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste

trabalho.

RESUMO

CAROLLO, A.R.H. Influência do ácido oléico como promotor de absorção cutânea para

o ácido 5-aminolevulínico na terapia fotodinâmica do câncer de pele: estudos in vitro e in

vivo em modelo animal. 2007. 117 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.

A administração tópica do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) tem se destacado na

Terapia Fotodinâmica (TFD) do câncer de pele pela eficiência no tratamento de tumores e

pelos reduzidos efeitos colaterais fototóxicos. Entretanto, esta eficácia é limitada devido à

baixa penetração do 5-ALA na pele. Uma proposta para aumentar a penetração do 5-ALA na

pele é a utilização de promotores de absorção cutânea, que visam alterar a barreira cutânea

para várias moléculas bioativas. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento

farmacotécnico de formulações contendo ácido oléico (AO) como promotor de absorção

cutânea, visando o aumento da penetração cutânea do 5-ALA para a TFD do câncer de pele.

O fluxo in vitro de 5-ALA das formulações contendo AO (10%) foi significativamente

aumentado após 12 horas de experimento, em relação às formulações sem AO, principalmente

para os grupos contendo 5% e 10% de 5-ALA. A retenção no estrato córneo (EC) e na

[epiderme + derme] sem EC também aumentou significativamente, mostrando um efeito

promotor do AO. Foram também realizados experimentos in vivo em camundongos, com o

intuito de analisar o efeito da formulação sobre a produção e o acúmulo in vivo de

protoporfirina IX (PpIX) na pele. Observou-se que a presença do promotor de absorção

aumentou significativamente a quantidade de PpIX extraída da pele comparado às

formulações sem este aditivo. Para visualizar a presença de PpIX no tecido, realizou-se

microscopia confocal das peles de animais tratados com as formulações. As imagens foram

condizentes com os experimentos in vivo, observando-se um aumento da intensidade de

fluorescência nas amostras de pele que foram tratadas com as formulações contendo AO. Os

resultados in vitro e in vivo mostraram a potencialidade das formulações contendo AO como

promotor de absorção cutânea na liberação do 5-ALA na TFD do câncer de pele.

Palavras chave: Ácido 5-aminolevulínico. Terapia fotodinâmica. Ácido oléico. Câncer

de pele.

ABSTRACT

CAROLLO, A.R.H. Oleic acid influence as a cutaneous penetration enhancer for 5-

aminolevulinic acid photodynamic therapy of skin cancer: in vitro and in vivo studies in

animal model. 2007. 117 f. Dissertation (Maester) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.

The topical administration of 5-ALA has been distinguished on skin cancer

photodynamic therapy (PDT) because of its efficiency in the treatment of tumors and the

reduced phototoxic collateral effects. However, this effectiveness is limited by its low

penetration in the skin. A proposal to optimize the 5-ALA penetration in the skin is the use of

cutaneous penetration enhancers, which seek to alter the cutaneous barrier for many bioactive

molecules. The aim of this work was the pharmaceutical development of formulations

containing oleic acid (OA) as a cutaneous penetration enhancer, seeking the increase of the

cutaneous penetration of 5-ALA for skin cancer PDT. The in vitro flux of 5-ALA from

formulations containing OA (10% w/w) was significantly increased after 12 hours of

experiment, in comparison with formulations without OA, mainly for the groups containing

5% and 10% of 5-ALA. The stratum corneum (SC) and [epidermis + dermis] without SC

retention were also significantly increased, showing an enhancer effect of the fatty acid. In

addition, in vivo experiments were accomplished in mice, with the purpose of analyzing the

formulation effect on the PpIX production and accumulation in the skin. It was observed that

the penetration enhancer's presence significantly increased the amount of PpIX extracted from

the skin, in contrast with formulations without this addition. To visualize the PpIX presence in

the tissue, confocal microscopy of the treated animal skins was made. The images were

suitable with the in vivo experiments, with increased intensity of fluorescence in the tissue

samples that were treated with formulations containing OA. Both in vitro and in vivo results

showed the potentiality of the formulations containing OA as a cutaneous penetration

enhancer for 5-ALA delivery on the skin cancer PDT.

Key words: 5-aminolevulinic acid. Photodynamic therapy. Oleic acid. Skin cancer.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Diagrama de Jablonski modificado, ilustrando os diferentes processos fotofísicos que ocorrem a partir da irradiação de um fotossensibilizador na TFD (redesenhado a partir de Mayia (2000)). .......................................................................................................................... 21 Figura 2 - Ciclo do Heme (adaptado de Hasan et al. 2003) .................................................... 24 Figura 3 - Estrutura do tegumento (http://www.medicinenet.com/skin_biopsy/ .................... 30 Figura 4 - Rotas de permeação através do estrato córneo (redesenhado de Barry (1987)). .... 31 Figura 5 - Estrutura tridimensional do ácido oléico. ............................................................... 36 Figura 6 - A) Microscopia de fluorescência convencional; B) Microscopia confocal de varredura a laser (ALVAREZ-ROMAN et al., 2004). ............................................................. 39 Figura 7 - Princípio da microscopia confocal.......................................................................... 40 Figura 8 - Reação de derivatização do 5-ALA. ....................................................................... 49 Figura 9 - Célula de Franz modificada (Hanson Research, Microetti).................................... 54 Figura 10 - Esquema de funcionamento do aparelho de difusão (Hanson Research, Microetti) .................................................................................................................................................. 55 Figura 11 - Estudo in vivo de acúmulo de PpIX em pele de camundongo. (A) preparo do sistema; (B) camundongo 24 horas após a depilação; (C) camundongo após aplicação da formulação; (D) com esparadrapo para proteção da formulação. ............................................ 60

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 1O2 Oxigênio singleto

5-ALA Ácido 5-aminolevulínico

AO Ácido oléico

CA Ceratose actínica

CCB Carcinoma de células basais

CCE Carcinoma de células escamosas

CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy - Microscopia Confocal de Varredura a Laser

CV Coeficiente de variação

DMSO Dimetilsulfóxido

E Exatidão

EC Estrato córneo

EDTA Ácido etileno diamino tetraacético

J Fluxo

LDL Lipoproteínas de baixa densidade

MeOH Metanol

O/A Óleo/água

p/p Peso por peso

PBG Porfobilinogênio

PG Propilenoglicol

PpIX Protoporfirina IX

r Coeficientes de correlação linear da reta

rpm Rotações por minuto

TFD Terapia fotodinâmica

v/v Volume por volume

λ Comprimento de onda

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 12

2- REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 16

2.1- A Terapia Fotodinâmica ................................................................................................ 18 2.2- O ácido 5-aminolevulínico ............................................................................................ 23 2.3- TFD-5-ALA tópica ........................................................................................................ 25 2.4- Estudos in vitro de Permeação Cutânea ........................................................................ 27

2.4.1- Estrutura da pele ..................................................................................................... 28 2.4.2- A barreira da pele ................................................................................................... 30

2.5- Promotores de absorção cutânea ................................................................................... 32 2.5.1- Ácidos graxos como promotores de absorção cutânea ........................................... 33 2.5.2- Ácido oléico como promotor de absorção cutânea ................................................ 35

2.6- Microscopia confocal de varredura a laser (Confocal Scanning Laser Microscopy - CSLM) .................................................................................................................................. 38

2.6.1- Princípios da microscopia confocal........................................................................ 39 2.6.2- Aplicações da CLSM ............................................................................................. 40

3- OBJETIVOS ........................................................................................................................ 43

3.1. Objetivos específicos ..................................................................................................... 44 4- MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 45

4.1- Materiais ........................................................................................................................ 46 4.1.1- Fármacos ................................................................................................................ 46 4.1.2- Reagentes e solventes ............................................................................................. 46 4.1.3- Equipamentos e acessórios ..................................................................................... 46 4.1.4- Pele ......................................................................................................................... 48 4.1.5- Animais de laboratório ........................................................................................... 48

4.2- Métodos ......................................................................................................................... 49 4.2.1- Padronização de metodologia analítica para o 5-ALA ........................................... 49 4.2.2- Obtenção das formulações contendo 5-ALA e AO em propilenoglicol ................ 52 4.2.3- Estudo in vitro de permeação cutânea .................................................................... 53 4.2.4- Estudo in vitro de retenção cutânea........................................................................ 56 4.2.5- Quantificação in vivo da PpIX induzida por 5-ALA em peles sadias de camundongo ..................................................................................................................... 58 4.2.6- Microscopia confocal das peles de camundongo tratadas com 5-ALA ................. 61

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 63

8- ANEXO ................................................................................................................................ 77

12

1- INTRODUÇÃO

1 - Introdução 13

A radiação solar, especialmente a UVB, é reconhecidamente carcinogênica para o

homem e constitui a principal causa do aparecimento de neoplasmas cutâneos (GREEN et al.,

1999; WOODHEAD; SETLOW; TANAKA, 1999).

Embora o câncer de pele seja o tipo de câncer mais freqüente, correspondendo a cerca

de 25% de todos os tumores malignos registrados no Brasil, quando detectado precocemente

apresenta altos percentuais de cura. Como a pele é um órgão heterogêneo, esse tipo de câncer

pode apresentar neoplasias de diferentes linhagens. Os mais freqüentes são o carcinoma

basocelular e o carcinoma epidermóide, também chamados de câncer de pele não melanoma.

O câncer de pele com origem nos melanócitos é denominado de câncer de pele melanoma, e,

embora seja o menos freqüente, é o tipo mais grave da doença, devido a sua alta probabilidade

de metástase (INCA, 2006).

Um tratamento seletivo e não-invasivo, a Terapia Fotodinâmica (TFD), tem sido

introduzido clinicamente, tanto para a visualização do tumor (fotodetecção), como para a

destruição local de tumores malignos e lesões pré-malignas. A TFD pode ser utilizada na pele

e em outros órgãos que possam ser alcançados pela luz.

A TFD consiste basicamente na administração intratumoral, sistêmica ou tópica de

agentes fotossensibilizadores, que se acumulam no tecido tumoral. Aplica-se, então, luz em

um comprimento de onda adequado, levando à necrose do tecido tumoral.

A TFD precisa de três elementos para seu sucesso: um agente fotossensibilizador, luz e

oxigênio molecular. A maior parte dos trabalhos desenvolvidos, tanto experimental como

clinicamente, tem como objetivo garantir a existência de fotossensibilizador e de luz em

quantidades suficientes no tecido alvo no momento do tratamento. Embora a TFD seja

absolutamente dependente da presença de oxigênio, o controle de seus níveis é muito difícil

(VAN DEN AKKER, 2003).

1 - Introdução 14

Na Terapia Fotodinâmica utilizando ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), uma dose

excessiva de 5-ALA exógeno é dada ao paciente. O 5-ALA é o primeiro intermediário no

caminho biossintético do heme, que leva à produção da protoporfirina IX (PpIX), precursora

imediata do heme e potente fotossensibilizador endógeno. Esta dose excessiva sobrecarrega

temporariamente a biossíntese de porfirinas e cria um reservatório de PpIX. Uma vez que este

reservatório se forme no tecido alvo e luz seja aplicada no tempo apropriado, o efeito da TFD

ocorre. A TFD atua seletivamente na destruição do tumor, pois o fotossensibilizador mostra

uma predileção para as células tumorais (FRITSCH et al., 1997).

Entretanto, esta modalidade parece ser limitada pela quantidade de 5-ALA que chega às

células alvo, uma vez que o 5-ALA é uma molécula altamente hidrofílica (NOVO;

HUTTMANN; DIDDENS, 1996). Devido às barreiras biológicas, como as membranas

celulares e o estrato córneo (EC), serem relativamente impermeáveis às moléculas hidrofílicas

por possuírem propriedades lipofílicas, a captação celular do 5-ALA é superficial.

O aumento na penetração de fármacos pode ser alcançado variando a composição do

veículo ou alterando a permeabilidade da pele. Assim, várias estratégias podem ser utilizadas,

como modificações químicas na estrutura do fármaco, modificações na forma farmacêutica,

técnicas físicas como a iontoforese e o ultra-som e uso de promotores de absorção.

Os promotores de absorção podem alterar a composição e/ou a organização dos lipídeos

intercelulares do EC, diminuindo desta maneira sua função barreira e, conseqüentemente,

proporcionando uma difusão adequada de fármacos através da pele (SANTUS; BAKER,

1993). O uso de ácidos graxos saturados e insaturados como promotores para a permeação de

fármacos é de interesse tanto em liberação tópica como transdérmica de fármacos, pois uma

das vantagens desta classe de promotores é que eles são componentes endógenos da pele

humana, incluindo o EC. Um ácido graxo abundantemente encontrado no EC humano é o

1 - Introdução 15

ácido oléico (LAMPE et al., 1983), que tem sido relatado como eficiente promotor de

absorção para diversos fármacos.

Assim, o desenvolvimento de formulações que otimizem a penetração tópica e

transdérmica do fármaco no tecido alvo constitui uma interessante estratégia para a

otimização da TFD tópica do câncer de pele.

16

2- REVISÃO DA LITERATURA

2 - Revisão da Literatura 17

Os tumores cutâneos malignos não-pigmentados, representados principalmente por dois

tipos de alteração do epitélio, o carcinoma de células basais (CCB) e o carcinoma de células

escamosas (CCE), representam a mais comum e grave dentre as neoplasias, ocorrendo

principalmente em populações de pele branca (BASTIAENS et al., 1998; GROSSMAN;

LEFFELL, 1997). A incidência deste tipo de câncer tem aumentado muito nos últimos anos

(THISSEN; NEUMANN; SCHOUTEN, 1999) e sua principal causa é atribuída à radiação

solar, especialmente a radiação UVB, que é reconhecidamente carcinogênica para o homem

(GREEN et al., 1999).

Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer do Ministério da Saúde, anualmente são

registrados de 90 a 100 mil novos casos de câncer de pele no Brasil, predominantemente CCB

e CCE. Para o ano de 2006, o número de casos novos de câncer de pele não melanoma

estimados é de 55.480 casos em homens e de 61.160 em mulheres, de acordo com as

Estimativas de Incidência de Câncer publicadas pelo INCA. Estes valores correspondem a um

risco estimado de 62 casos novos a cada 100 mil homens e 60 para cada 100 mil mulheres

(INCA, 2006).

Vários fatores podem ser citados para este tipo de câncer de pele, entre eles: fatores

fenotípicos, tais como cor da pele, do cabelo e dos olhos, a tendência a se queimar ou

bronzear, a presença de sardas e histórico familiar de câncer de pele (CUMMINGS; TRIPP;

HERRMANN, 1997); exposição ocupacional ao sol; e exposição à radiação ultravioleta,

radiação ionizante ou ao arsênico (BARON; GREENBERG, 2000; GOTTLOBER et al.,

1999). Dentre estes fatores, a exposição acumulativa ao sol é, provavelmente, o mais

importante para o desenvolvimento do câncer, embora a predisposição genética seja

igualmente destacada.

O tratamento convencional dos tumores malignos não pigmentados é feito através de

cirurgia, aplicação de laser, eletrodissecação, criocirurgia, quimioterapia tópica (5-fluoracil e


podofilina) e radioterapia. Estas terapias podem apresentar taxa de recorrência de 5 a 10% e

normalmente deixam cicatrizes e/ou hipo ou hiperpigmentação, além de efeitos colaterais

como dor, inflamação grave e irritação, que podem permanecer durante semanas (DE ROSA;

BENTLEY, 2000; WAGNIERES et al., 1998). Assim, foi necessário o desenvolvimento de

formas de tratamento mais eficientes, menos destrutivas e que apresentassem resultados

estéticos melhores, especialmente em pacientes imunodeficientes e naqueles com várias

lesões (PENG et al., 1995; STENDER; WULF, 1996; SZEIMIES et al., 1996; WENNBERG

et al., 1996; ZEITOUNI; SHIEH; OSEROFF, 2001).

2.1- A Terapia Fotodinâmica

Devido à busca por tratamentos alternativos para o câncer de pele (ORTEL et al., 1996)

que não apresentem os inconvenientes das terapias usuais, a TFD tornou-se a primeira opção

de terapia para diversas doenças cutâneas. A TFD é um tratamento seletivo e não-invasivo,

que tem sido introduzido clinicamente, tanto para a visualização do tumor (fotodetecção)

como para a destruição local de tumores malignos e lesões pré-malignas.

Embora a TFD seja considerada uma inovação, a luz já vem sendo utilizada para fins

medicinais há muito tempo. Na antiguidade, os Egípcios e os orientais já utilizavam

amplamente a luz para tratar doenças, assim como os Gregos, que deram a esta prática o nome

de helioterapia (MOAN; PENG, 2003). O primeiro a relatar clinicamente o uso da luz no

tratamento de doenças foi Finsen, no fim de 1800, que a utilizava no combate à varíola e

tuberculose (ALLISON; MOTA; SIBATA, 2004). Dougherty e colaboradores (1978)

realizaram o primeiro estudo clínico sistemático de lesões malignas utilizando o conceito

fotoquímico, onde um agente sensibilizante, luz e oxigênio foram combinados para destruir o

tecido tumoral.


A TFD, por definição, consiste na administração de agentes fotossensibilizantes ou seus

precursores, pelas vias intratumoral, sistêmica ou tópica. Após um intervalo de tempo que

permita a distribuição e localização desses agentes no tumor, as lesões são expostas à luz com

comprimento de onda com absorção apropriada para o fotossensibilizador. A combinação de

fotossensibilizador e luz levam à formação de uma espécie altamente reativa, o oxigênio

singleto (1O2), que causa a destruição das células alvo (GIBSON et al., 1997).

As reações citotóxicas acontecem principalmente dentro das células tumorais, uma vez

que o fotossensibilizador se acumula seletivamente no tumor. Esta seletividade parece ser, em

parte, devido ao metabolismo aumentado das células neoplásicas, que então acumulariam

mais fotossensibilizador que as células normais. Além disso, o clearance nas células normais

é mais rápido que em células tumorais (ZENZEN; ZANKL, 2004). Vários mecanismos já

foram demonstrados in vivo que contribuem para o acúmulo tumor-seletivo de

fotossensibilizador e, conseqüentemente, com o efeito tumor-específico da TFD. Um exemplo

disto é a alta afinidade por lipoproteínas de baixa-densidade (LDL) que muitos

fotossensibilizadores apresentam. Uma vez que a maioria das células tumorais tem maior

número de receptores para LDL que as células normais, os fotossensibilizantes LDL-

associados são levados para dentro das células tumorais principalmente via endocitose (JORI;

REDDI, 1993; PENG et al., 1990). Também foi demonstrado que a permeabilidade das veias

tumorais é aumentada, o que, conseqüentemente, leva a um aumento da entrada de nutrientes

e também de fotossensibilizador para dentro do tecido tumoral (KRAMMER, 2001).

Finalmente, a baixa solubilidade no ambiente ácido normalmente encontrado no fluido

intersticial das células neoplásicas e a pobre drenagem linfática do tecido tumoral prolongam

a retenção do fotossensibilizador nas células tumorais (HENDERSON; DOUGHERTY,

1992).


Existem três mecanismos principais pelos quais a TFD atua na destruição do tumor.

Primeiramente, as espécies de oxigênio reativo podem matar as células tumorais diretamente.

Em segundo lugar, a TFD pode danificar as veias associadas ao tumor, conduzindo à

formação de trombos, e subseqüente infarto do tumor. Em terceiro lugar, a TFD também pode

ativar uma resposta imune contra as células do tumor (DOLMANS; FUKUMURA; JAIN,

2003).

Os mecanismos da destruição celular induzida na TFD incluem várias reações iniciadas

pela absorção de fótons pelo agente fotossensibilizador, fazendo com que este passe do seu

estado fundamental (S0) para o excitado (1S) (Figura 1). O fotossensibilizador excitado pode

relaxar voltando a seu estado fundamental por emissão de fluorescência (F) ou liberando calor

por conversão interna (IC), ou, ainda, ir para um estado tripleto (3T) por um processo

chamado cruzamento intersistema (intersystem crossing) (ISC), do qual ele pode relaxar

emitindo fosforescência (P) e indo diretamente do estado tripleto para o singleto (MAIYA,

2000). Este fenômeno está sendo explorado atualmente para o desenvolvimento de

procedimentos de fotodiagnóstico (STRINGER; MOGHISSI, 2004).


Figura 1 - Diagrama de Jablonski modificado, ilustrando os diferentes processos

fotofísicos que ocorrem a partir da irradiação de um fotossensibilizador na TFD (redesenhado

a partir de Mayia (2000)).

O fotossensibilizador excitado pode passar por dois tipos de reações: no Tipo 1, um

fotossensibilizador excitado pode reagir diretamente com o substrato, como uma membrana

celular ou molécula, e transferir um próton ou um elétron, formando assim radicais livres que

mais adiante reagem com oxigênio molecular, produzindo ânion radical superóxido, peróxido

de hidrogênio ou radical hidroxila. O ânion radical superóxido é gerado, por exemplo, pela

excitação de porfirinas na presença de substâncias redutoras (SHARMAN; ALLEN; VAN

LIER, 2000); já na reação do Tipo 2, o fotossensibilizador no estado tripleto pode transferir

sua energia a um oxigênio molecular, um dos raros compostos que tem estado fundamental

tripleto, e as duas moléculas vão para o estado singleto. No estado singleto o oxigênio

molecular, 1O2, é altamente reativo e assim responsável pela maioria das lesões geradas

durante a TFD (SHARMAN; ALLEN; VAN LIER, 2000). O fotossensibilizador excitado, ao

transferir sua energia em excesso, volta a seu estado fundamental para aceitar novos fótons ou

se torna fotoquimicamente degradado (usado) em um processo chamado “photobleaching”

(CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; NOWIS et al., 2005) .


A chance de ocorrerem ambas as reações, dos Tipos I e II, a partir de um estado singleto

é bastante remota, devido ao fato de que este estado normalmente é de pouca duração e que

qualquer reação que o envolva deva acontecer dentro de seu tempo de vida (t), que é

tipicamente entre nanosegundos (ns =10-9 s) e picosegundos (ps =10-12 s). Por outro lado,

estados tripleto, que são gerados a partir de um precursor singleto, têm mais chances de reagir

com outros substratos porque eles são de vida longa (t variando de microsegundos, μs = 10-6 s

a milisegundos, ms =10-3 s) e há tempo suficiente para a reação acontecer (MAIYA, 2000).

O fotossensibilizador ideal deve possuir algumas propriedades: pureza química,

seletividade para tecidos tumorais, rápido acúmulo no tecido tumoral e rápido clearance,

estabilidade química e física, ativação pela luz, boa penetração tecidual, alto coeficiente de

absorção e ser atóxico na ausência de luz (LOPEZ et al., 2004; NOWIS et al., 2005). Até o

momento, nenhum destes agentes apresentou todas estas características. Uma revisão a

respeito dos diversos fotossensibilizadores existentes e seus prováveis mecanismos de ação é

apresentada por De Rosa & Bentley (2000).

Os fotossensibilizadores mais amplamente estudados são as porfirinas, que foram

identificadas há 150 anos. Uma de suas qualidades é a toxicidade mínima na ausência de luz e

a falta de interações farmacológicas com outros fármacos, fazendo da TFD um procedimento

seguro em tratamentos oncológicos combinados (NOWIS et al., 2005). No entanto, estas têm

a desvantagem de fotossensibilizar a pele por um período prolongado (DOUGHERTY;

COOPER; MANG, 1990), expondo os pacientes a riscos de reações fototóxicas acidentais

durante o tratamento.

Uma alternativa para este problema é a utilização de pró-fármacos que levem à

formação do fotossensibilizador apenas in situ.


2.2- O ácido 5-aminolevulínico

O 5-ALA é um pró-fármaco, convertido através da rota biossintética do heme em uma

substância altamente fluorescente, a protoporfirina IX (PpIX), um eficiente

fotossensibilizador (Figura 2). O 5-ALA é formado na mitocôndria no primeiro passo do ciclo

do heme, pela condensação de glicina e succinil CoA. No citosol, duas moléculas de 5-ALA

são combinadas para formar porfobilinogênio (PBG) e quatro moléculas de PBG são então

combinadas para formar uroporfirinogênio. Este é então convertido a coproporfirinogênio,

que após a sua recaptação pela mitocôndria é transformado pela enzima coproporfirinogênio

oxidase a protoporfirinogênio e este dá origem à PpIX, que é a precursora imediata do grupo

heme (HASAN et al., 2003).


Figura 2 - Ciclo do Heme (adaptado de Hasan et al. 2003)

A síntese de 5-ALA é controlada por um mecanismo de feedback negativo, no qual a

presença de heme livre inibe a síntese de 5-ALA (KAPPAS et al., 1995). Evitando-se o

mecanismo de feedback, o 5-ALA exógeno pode induzir acúmulo intracelular de PpIX, cuja

conversão à heme é relativamente lenta, levando a concentrações fotossensibilizantes

(KENNEDY; POTTIER, 1992).


Em contraste com as porfirinas, o 5-ALA é uma molécula pequena, hidrossolúvel e que

pode penetrar seletivamente no estrato córneo anormal dos tumores, enquanto a pele normal

adjacente parece relativamente impenetrável (PENG et al., 1997).

A PpIX e outros intermediários formados após a administração tópica de 5-ALA são

eliminados rapidamente do corpo, o que limita o risco de fotossensibilização da pele

(WEBBER; KESSEL; FROMM, 1997).

2.3- TFD-5-ALA tópica

A TFD-5-ALA tópica possui várias vantagens em relação às terapias convencionais: é

uma técnica não-invasiva, possui curto período de fotossensibilização, pode ser usada para

tratar múltiplas lesões em pequenas sessões, produz excelentes resultados estéticos inclusive

para tumores superficiais com grande extensão sem danos para a pele normal circundante, e

tem sido bem aceita pelos pacientes por não apresentar outros efeitos colaterais, além de dor

moderada durante a fotoativação. Outra vantagem é que, enquanto a cirurgia e a crioterapia

podem apenas ser usadas para tratar lesões visíveis, a TFD-5-ALA é capaz de destruir

tumores não-aparentes que estão localizados na área irradiada onde 5-ALA fora aplicado

(KARRER et al., 1995; MORTON, 2001; WOLF; KERL, 1995).

O uso de 5-ALA na TFD do câncer é uma proposta relativamente nova. No primeiro

estudo clínico realizado, foi utilizada uma emulsão O/A contendo 5-ALA em pacientes com

CBC, CCE e ceratose actínica (CA). O tratamento apresentou ótimos resultados, com

regressão completa dos tumores em 90 a 100% das lesões (KENNEDY; POTTIER; PROSS,

1990).

5-ALA é uma molécula hidrofílica e se apresenta na forma zwitterion em pH fisiológico,

ou seja, apresenta carga positiva no grupamento amino e carga negativa no grupamento


carboxílico. Compostos hidrofílicos apresentam limitada capacidade de atravessar barreiras

biológicas como o EC (MERCLIN; BRAMER; EDSMAN, 2004). Esta capacidade, sendo

uma condição fundamental para a conversão de 5-ALA em PpIX, mostra que a principal

limitação para a TFD-5-ALA tópica pode estar na profundidade de penetração do 5-ALA no

EC, fato que foi demonstrado por Fritsch e colaboradores (1999) usando microscopia de

fluorescência.

O mecanismo de ação da TFD-5-ALA parece estar relacionado à citotoxicidade direta e

às reações de inflamação aguda com danos mínimos às estruturas vasculares (PENG et al.,

1997).

A TFD-5-ALA tem sido objeto crescente de pesquisas e publicações. Assim,

investigações recentes se focalizaram no desenvolvimento de carreadores, como microesferas

e lipossomas, e de promotores de absorção, com o objetivo de aumentar a penetração do 5-

ALA. Uma variedade de ésteres de 5-ALA também tem sido investigados (GAULLIER et al.,

1997; KLOEK; VANHENEGOUWEN, 1996).

O desenvolvimento de sistemas de liberação que proporcionem um aumento na

penetração do 5-ALA nos tecidos tumorais constitui uma maneira de otimizar a TFD. Pierre e

colaboradores (2001) utilizaram lipossomas com composição lipídica similar ao EC dos

mamíferos com este objetivo. Os estudos in vitro mostraram que as preparações com estes

lipossomas apresentaram retenção na pele significativamente aumentada, comparado a uma

solução aquosa com a mesma concentração de 5-ALA. O aumento da penetração cutânea

pode ser fundamental no sucesso da TFD, uma vez que a atividade da PpIX é dependente da

sua concentração no tecido alvo (DE ROSA; BENTLEY, 2000). Este aumento na penetração

também pode ser conseguido variando-se a composição do veículo ou alterando a

permeabilidade da pele.


Experiências incluíram o uso de quelantes do ferro para diminuir a quantidade de PpIX

convertida à heme pela ferroquelatase, uma vez que o ferro livre é necessário para que a

enzima atue (CURNOW et al., 1998). Outra tentativa é a administração de 5-ALA como um

de seus ésteres (metil, benzil, hexil ou pentil) com o objetivo de melhorar a penetração por

tornar a molécula mais lipofílica (KLOEK; AKKERMANS; VAN HENEGOUWEN, 1998).

Este assunto foi recentemente revisado por Lopez e colaboradores (2004), mostrando a grande

quantidade de moléculas derivadas do 5-ALA que podem ser utilizadas na otimização da

TFD. De Rosa e colaboradores (2003) mostraram o aumento da quantidade de hexil e octil-

ALA retidos na epiderme viável, em comparação a outros ésteres e ao próprio 5-ALA. O

aumento na penetração do 5-ALA também pode ser obtido pela utilização de promotores de

permeação: a utilização de emulsões O/A com 20% (p/p) de DMSO aumentou a permeação in

vitro do 5-ALA através da pele de camundongos sem pêlo, enquanto os estudos in vivo

mostraram um aumento significativo de PpIX após 3 hs de tratamento com uma emulsão O/A

contendo 10% 5-ALA (p/p), 3% EDTA (p/p) e 20% DMSO (p/p) (DE ROSA et al., 2000);

Steluti e cols. (2005) mostraram um aumento da penetração do 5-ALA e do acúmulo de PpIX

em pele de camundongos, com a utilização de formulações contendo monoleato de glicerol e

propilenoglicol. Outro meio de aumentar a penetração de 5-ALA é com a utilização de outras

técnicas, como a iontoforese: experimentos utilizando esta técnica avaliaram a liberação de 5-

ALA em função do pH e determinaram os principais mecanismos responsáveis por este

transporte elétrico (GUY et al., 2000; LOPEZ et al., 2003).

2.4- Estudos in vitro de Permeação Cutânea


A absorção e/ou retenção podem ser medidas por técnicas in vitro devido à simplicidade

das condições experimentais. Estes métodos para medida de permeação de fármacos através

da pele são necessários para avaliar a passagem e/ou retenção dos mesmos na/através da pele,

quando destinados à aplicação tópica.

2.4.1- Estrutura da pele

A pele constitui uma via potencial de aplicação de fármacos devido a seu fácil acesso e

sua grande superfície. Representa o órgão mais extenso do corpo, cobrindo uma superfície de

aproximadamente 1,73m2 sendo irrigada por 1/3 do sangue, além de corresponder a 5% do

peso corporal (BARRY, 1983; CHIEN, 1992).

A pele é composta principalmente de duas partes: a face externa, que corresponde à

epiderme, e a face interna, à derme (Figura 3). A derme possui espessura média de 2 a 4mm,

sendo constituída de uma matriz de proteínas fibrosas imersas num tecido coloidal amorfo.

Apresenta-se rica em capilares sangüíneos, canais linfáticos e terminações nervosas, além de

conter os segmentos inferiores das glândulas sebáceas e folículos pilosos. A elasticidade da

derme é atribuída às fibras protéicas presentes, incluindo colágeno (tipo I e III) e elastina. A

derme contém também fibroblastos, macrófagos, mastócitos e leucócitos. Ela executa assim,

papel de sustentação e de nutrição e divide-se em duas partes: derme papilar ou tecido

conjuntivo frouxo e derme reticular ou tecido conjuntivo denso (MOSER et al., 2001).

A epiderme tem uma estrutura multilamelar, que representa os diferentes estágios de

diferenciação celular. A epiderme viável é subdividida em quatro partes: estrato lúcido,

estrato granuloso, estrato espinoso e estrato germinativo e contém queratinócitos em vários

estágios de diferenciação, assim como melanócitos, células de Langerhans (importante no


reconhecimento de antígenos e resposta imune) e células de Merkel (envolvidas na percepção

sensorial) (ASBILL; MICHNIAK, 2000). Ela é separada da derme pela junção dermo-

epidérmica. Subindo a partir da camada basal proliferativa para a camada mais externa, as

células mudam de uma forma ordenada, de células metabolicamente ativas e que se

multiplicam para células densas, mortas funcionalmente e queratinizadas, isto é, corneócitos.

Estas últimas células são envolvidas por bicamadas lipídicas multilamelares e constituem a

camada mais externa da epiderme, de 10 a 20 μm, chamada estrato córneo (BARRY, 1983).

Há ainda a tela subcutânea, que juntamente com a epiderme e a derme forma o

tegumento. Ela é formada por tecido conjuntivo frouxo contendo células adipócitas que

fabricam e estocam lipídeos, sendo responsável pelo isolamento térmico e proteção mecânica

contra os choques externos a que se submete o corpo (WILLIAMS; BARRY, 1992).


Figura 3 - Estrutura do tegumento (http://www.medicinenet.com/skin_biopsy/

article.htm).

2.4.2- A barreira da pele

A pele serve como uma barreira física e química, protegendo o organismo da invasão de

microorganismos, da perda de água e da radiação solar, além de ser responsável pelo tato,

pela regulação da temperatura corporal e pela produção de vitamina D. Conseqüentemente, a

pele, em particular, a camada córnea, forma uma barreira efetiva para a permeação de

fármacos (ASBILL; MICHNIAK, 2000). Uma simples demonstração disto ocorre quando a

camada mais externa é retirada com fita adesiva: a permeabilidade para água e outros

compostos aumenta dramaticamente (SCHEUPLEIN; BLANK, 1971). As propriedades de

barreira são baseadas na composição dos lipídeos do EC e, em particular, no excepcional

arranjo estrutural da matriz lipídica intercelular e no envelope lipídico que envolve as células

Epiderme

Derme

Folículo piloso

Tela subcutânea

Glândula sebácea

Terminação nervosa Glândula sudorípara


(POTTS; FRANCOEUR, 1991). Os lipídeos intercelulares são principalmente ceramidas,

colesterol e seus ésteres, ácidos graxos e uma pequena fração de sulfato de colesterol

(GRUBAUER et al., 1989).

As rotas de permeação de fármacos através da pele incluem a difusão através do estrato

córneo e através dos apêndices da pele, como folículos pilosos e glândulas sudoríparas.

Entretanto, estes apêndices ocupam apenas 0,1% do total da superfície de pele humana e sua

contribuição para a permeação é muito pequena (MOSER et al., 2001). Dois caminhos podem

ser identificados através do EC: um caminho intercelular, onde o fármaco difunde-se ao redor

dos corneócitos, permanecendo constantemente dentro da matriz lipídica, e outro transcelular,

passando através dos corneócitos (Figura 4) (ABRAHAM; CHADHA; MITCHELL, 1995).

Figura 4 - Rotas de permeação através do estrato córneo (redesenhado de Barry

(1987)).


Logo, devido às propriedades de barreira, poucos fármacos estão aptos a difundir

passivamente através do EC. Assim, a fim de alcançar penetração suficiente de substâncias

ativas na/através da pele, estas propriedades do EC são muitas vezes reduzidas pelo uso de

métodos físicos ou químicos, que atuam como promotores de absorção.

Dentre os métodos físicos, pode-se citar a iontoforese, onde um potencial elétrico é

aplicado, aumentando a penetração na pele pelo transporte de moléculas iônicas através de

uma membrana trocadora de íons, neste caso, a pele (LOPEZ et al., 2001). Já a sonoforese ou

fonoforese é uma técnica que utiliza freqüências de ultra-som de KHz a MHz, que são

capazes de aumentar a permeabilidade da pele (MITRAGOTRI; KOST, 2000). A

eletroporação utiliza impulsos de alta voltagem e de curta duração, com o objetivo de induzir

um aumento transitório na permeabilidade da pele através da criação de “poros” nos lipídeos

do EC (REGNIER et al., 1999).

O aumento da permeação da pele por métodos químicos utiliza substâncias químicas

denominadas promotores de absorção, que são discutidos a seguir.

2.5- Promotores de absorção cutânea

Os promotores de absorção cutânea são agentes químicos que alteram a função barreira

da pele de maneira reversível e segura. Eles permitem que muitos fármacos aumentem sua

taxa de penetração, diminuem o lag time e ainda possibilitam a administração de quantidades

maiores de fármacos, inclusive os polares, o que não seria possível sem a presença dos

promotores.

Embora muitos promotores de absorção químicos tenham sido desenvolvidos para pele

humana ou animal, nenhum deles se mostrou ideal.


Algumas das propriedades desejáveis para promotores de absorção são (BARRY, 1983):

Devem ser não-tóxicos, não-irritantes e hipoalergênicos;

É ideal que ajam rapidamente e que a atividade e a duração do efeito sejam previsíveis

e reprodutíveis;

Não devem ser farmacologicamente ativos para o organismo, ou seja, não devem se

ligar a sítios receptores;

Devem funcionar unidirecionalmente, ou seja, devem permitir a entrada dos agentes

terapêuticos no organismo enquanto previnem a perda de substancias endógenas;

Quando removidos da pele, as propriedades de barreira devem ser restituídas rápida e

totalmente;

Devem ser apropriados para formulação em diversas preparações tópicas, assim,

devem ser compatíveis com os excipientes e os fármacos;

Devem ser cosmeticamente aceitáveis

É improvável que seja encontrado algum promotor com todas estas propriedades e os

ajustes dos promotores disponíveis devem ser feitos levando-se em conta a relação

risco/benefício.

2.5.1- Ácidos graxos como promotores de absorção cutânea

Os lipídeos intracelulares apresentam um importante papel na manutenção da função de

barreira do EC, formando uma camada hidrofóbica entre as células, que inibe a difusão de

água e substâncias hidrofílicas através do EC. As estruturas dos componentes lipídicos


revelam que os ácidos graxos são partes dominantes dos lipídeos do EC, logo, possuem um

papel importante na qualidade geral da barreira da pele (PIERRE, 2004). Assim, uma

mudança na quantidade de ácidos graxos nos lipídeos da pele por adição exógena pode levar a

uma perturbação na função de barreira da pele, que resultaria em um aumento da

permeabilidade para muitas substâncias. Após um curto período de tempo, a biossíntese

lipídica na pele é capaz de reparar o dano, mantendo a função de barreira da pele com

praticamente nenhum traço de perturbação (TANOJO, 1996).

Os ácidos graxos podem diferir em vários aspectos: tamanho da cadeia, características

das duplas ligações (posição, número, configuração), estrutura da cadeia e substituintes, e

estas variações estruturais podem influenciar em seus efeitos como promotores de absorção

(SANTOYO; YGARTUA, 2000). Eles são capazes de se inserir entre as caudas hidrofóbicas

da bicamada do EC, perturbando seu empacotamento, aumentando sua fluidibilidade e

conseqüentemente, diminuindo a resistência difusional para permeantes (GOLDEN; MCKIE;

POTTS, 1987).

Em sua revisão, Williams e Barry (2004) analisaram diversos resultados de estudos com

ácidos graxos como promotores de absorção com diferentes cadeias de hidrocarbonetos e a

partir das relações encontradas entre as estruturas dos ácidos e sua atividade, concluíram que

cadeias alquil saturadas com comprimento de 10 a 12 carbonos ligados a grupos de cabeça

polar fornecem um potente promotor. Em contrapartida, para promotores de absorção

contendo cadeias alquil insaturadas, cadeias de 18 carbonos aparentam ser melhores. Para tais

compostos insaturados, espera-se que a configuração cis perturbe mais a estrutura dos lipídeos

intercelulares que a configuração trans, uma vez que a última difere pouco do análogo

saturado. Além disso, os ácidos graxos se mostraram eficientes promotores tanto para

substâncias lipofílicas como hidrofílicas.


2.5.2- Ácido oléico como promotor de absorção cutânea

O AO ou ácido cis-9 octadecenóico é o ácido graxo mais comum na natureza, presente

em praticamente todos os óleos e gorduras originados de plantas e animais. Este ácido

também é encontrado abundantemente nos lipídeos do EC humano (LAMPE et al., 1983).

O AO é um ácido graxo com cadeia longa (18 carbonos) mas, diferentemente de muitos

ácidos de cadeia longa, é líquido à temperatura ambiente devido à dupla ligação (C9-C10) na

cadeia alquilica. Embora seja abundante no corpo, não é essencial para o ser humano

(TANOJO, 1996).

Nos primeiros estudos de permeabilidade utilizando ácidos graxos, Cooper (1984)

relatou que o AO promove principalmente a absorção percutânea de fármacos apolares,

enquanto Aungst e colaboradores (1986) descreveram o AO como um promotor para

fármacos polares e apolares. Investigações posteriores mostraram que o AO aumenta

principalmente a absorção de fármacos polares (TANOJO, 1996).

O AO tem sido relatado por aumentar a permeação de muitos fármacos, entre eles: 4-

cianofenol (MAK; POTTS; GUY, 1990); 5-fluorouracil (YAMANE; WILLIAMS; BARRY,

1995); aciclovir, hidrocortisona, ácido retinóico e trifluorotimidina (LOFTSSON;

SOMOGYI; BODOR, 1989); ácido salicílico (COOPER, 1984); aminoácidos (RULAND;

KREUTER, 1992); antidepressivos tricíclicos, como cloridrato de imipramina e de

amitriptilina (JAIN; PANCHAGNULA, 2003); celecoxib (YENER et al., 2003); cetoprofeno

(SINGH et al., 1996); dinitrato de isosorbida (GABIGA; CAL; JANICKI, 2000); estradiol

(GOODMAN; BARRY, 1988; LOFTSSON; SOMOGYI; BODOR, 1989); flurbiprofeno

(FANG; HWANG; LEU, 2003); indometacina (TAKEUCHI et al., 1992); maleato de timolol

(SONI; JAIN; JAIN, 1992)); manitol, hidrocortisona e progesterona (BARRY; BENNETT,

1987); melatonina (HAO; ZHU; ZHENG, 1999); naloxona (AUNGST; ROGERS;


SHEFTER, 1986); nifedipina (SQUILLANTE et al., 1998); ondansetron (DIMAS; DALLAS;

REKKAS, 2004); piroxicam (MORTAZAVI; ABOOFAZELI, 2003; SANTOYO;

YGARTUA, 2000); tenoxicam (LARRUCEA et al., 2001); terbinafina (ALBERTI et al.,

2001); zidovudina (AZT) (OH et al., 1998; SEKI et al., 1990).

Pierre e colaboradores (2006) demonstraram que o fluxo e a retenção na epiderme viável

de 5-ALA foram aumentados pela presença de 10% de AO na formulação in vitro, assim

como o acúmulo de PpIX in vivo também aumentou e se manteve por mais tempo que o

controle.

Apesar dos vários trabalhos com o AO como promotor de absorção, o modo como ele

atua ainda não está claro (ROWAT; KITSON; THEWALT, 2006). Uma hipótese é que ácidos

graxos cis-insaturados, como o AO, ‘fluidizam’ os lipídeos do EC. As alterações no

empacotamento dos lipídeos, causadas pelo arranjo espacial que a dupla ligação 9,10 da

molécula de AO assume devido à sua configuração cis (Figura 5), podem perturbar os lipídeos

do EC cristalino. O AO provavelmente age penetrando nas estruturas lipídicas, com sua

extremidade polar próxima das cabeças polares dos lipídeos e, então, desorganizando e

aumentando a fluidez da região lipídica e, por meio disto, ele promove a permeabilidade da

membrana (BARRY, 1987; TAKEUCHI et al., 1998).

Figura 5 - Estrutura tridimensional do ácido oléico.

Membranas modelo de lipídeos extraídos do EC exibiram uma redução na temperatura

de fusão na presença de AO. Um termograma do EC humano típico apresenta quatro


transições endotérmicas principais: T1 em cerca de 37°C, T2 em 72°C, T3 em 83°C e T4 em

100°C. A endoterma T1 normalmente não é considerada em estudos de permeação, uma vez

que se considera que ela seja atribuída a secreções sebáceas e contaminantes da superfície

(BOUWSTRA et al., 1992), enquanto a T4 parece ser originária de um componente protéico,

uma vez que não é reversível com a temperatura e permanece após a extração lipídica

(GOODMAN; BARRY, 1989). O AO agiu reduzindo a entalpia da temperatura de transição

T2 do EC em cerca de 50% após 6hs, sendo esta redução mantida até o tempo de 12hs

(YAMANE; WILLIAMS; BARRY, 1995) e aumentou a liberdade conformacional ou

flexibilidade das cadeias alquil dos lipídeos endógenos acima de sua temperatura de transição

(ONGPIPATTANAKUL et al., 1991), indicando que o AO estabiliza a fase fluida

(WALKER; HADGRAFT, 1991).

Uma grande quantidade de evidências aponta para a separação de fase como mecanismo

por trás da ação do AO. Investigações espectroscópicas utilizando AO deuterado em EC

humano mostraram que o AO em altas concentrações pode existir como um líquido dentre os

lipídeos do EC, formando uma fase separada dentro das bicamadas lipídicas, à temperatura

fisiológica (ONGPIPATTANAKUL et al., 1991). Estudos de microscopia eletrônica

mostraram que um discreto domínio lipídico é induzido dentro das bicamadas lipídicas do EC

pela exposição ao AO (TANOJO et al., 1997). Através de estudos de espectroscopia de RMN

de 2H, demonstrou-se que o AO extrai uma fração dos componentes da membrana do EC,

promovendo a separação de fases no sistema (ROWAT; KITSON; THEWALT, 2006). A

formação desta fase separada pode proporcionar defeitos de permeabilidade dentro das

bicamadas lipídicas, facilitando, deste modo, a permeação de substâncias hidrofílicas através

da membrana (WILLIAMS; BARRY, 2004). Baseado nestes dados acredita-se que o AO

aumente a permeabilidade transdérmica por criar uma fase mais permeável que coexiste com

os lipídeos endógenos do EC (ROWAT; KITSON; THEWALT, 2006).


O AO, do mesmo modo que outros ácidos graxos, tem se mostrado mais potente como

promotor de absorção quando combinado com propilenoglicol (PG) (COOPER, 1984;

LARRUCEA et al., 2001; WILLIAMS; BARRY, 2004). Co-solventes como PG solvatam a

queratina intracelular e ocupam os sítios de ligação de hidrogênio, aumentando a mobilidade

do fármaco (RULAND; KREUTER, 1992). Estas alterações na estrutura da membrana

resultariam em defeitos interfaciais entre os domínios sólido e líquido, que podem servir para

reduzir o caminho difusional ou a resistência do EC (ONGPIPATTANAKUL et al., 1991).

Além disso, o coeficiente de partição para a liberação do fármaco do veículo para a pele é

aumentado pelo PG, permitindo fluxos maiores (RULAND; KREUTER, 1992).

2.6- Microscopia confocal de varredura a laser (Confocal Scanning Laser Microscopy - CSLM)

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) tornou-se uma técnica bem

estabelecida para a obtenção de imagens de alta-resolução de espécimes biológicos e outros,

sem os inconvenientes de outros tipos de microscopia, como a necessidade de preparação das

amostras, como fixação e cortes, que produzem artefatos, além da baixa resolução das

imagens obtidas.

As principais vantagens técnicas da CLSM incluem: a habilidade para obter imagens de

secções ópticas com uma boa resolução em pouco tempo de forma não-invasiva, tanto in vitro

como in vivo (CULLANDER; GUY, 1992); e a visualização de imagens paralelas à superfície

da amostra, em múltiplas profundidades, sem corte mecânico da amostra.

A principal limitação da CLSM reside na gama de lasers para os quais a excitação

eficiente do fluoróforo pode ser obtida. Na verdade, a exposição aos lasers de alta intensidade

pode ser altamente destrutiva para o tecido viável e para o próprio fluoróforo. Outros

possíveis problemas da CLSM são a presença de autofluorescência nas amostras biológicas e


o fato que componentes celulares e o estado de hidratação da pele podem induzir aberrações e

obstruir o ajuste do ponto zero da superfície de pele (ALVAREZ-ROMAN et al., 2004).

2.6.1- Princípios da microscopia confocal

Na microscopia de fluorescência convencional, muito da profundidade ou do volume do

espécime são uniformemente e simultaneamente iluminados, assim como o plano onde a

objetiva é focalizada (Figura 6A). Isto produz uma área “embaçada” acima e abaixo do plano

focal de interesse, o que reduz o contraste e diminui a resolução, tornando difícil o

discernimento entre as estruturas celulares. Ao contrário, a iluminação do microscópio

confocal não é simultânea, mas seqüencial. A iluminação é focalizada como um ponto em um

elemento do espécime de cada vez (Figura 6B) (ALVAREZ-ROMAN et al., 2004).

Figura 6 - A) Microscopia de fluorescência convencional; B) Microscopia confocal de

varredura a laser (ALVAREZ-ROMAN et al., 2004).

O princípio confocal é uma simples forma de processo de abertura (Figura 7). As lentes

condensadoras formam uma imagem de uma abertura (1) (pin-hole) dentro do volume da

amostra para formar um ponto confocal (confocal spot). As lentes objetivas formam, por sua

vez, uma imagem deste ponto confocal na segunda abertura (2). A luz de dentro do local de

foco (linha sólida) atravessa a segunda abertura e é detectada, enquanto a luz proveniente de

planos acima e abaixo do plano de foco (linha tracejada) formará um ponto desfocado na


abertura. Desta forma, os fótons espalhados ou refletidos dos planos fora de foco não

contribuem significativamente para o sinal detectado, ou seja, para a formação da imagem

(CULLANDER, 1998; OCKLEFORD, 1995; SHOTTON, 1989).

Figura 7 - Princípio da microscopia confocal.

2.6.2- Aplicações da CLSM

Simonetti e cols. (1995) caracterizaram as propriedades de barreira de epiderme humana

reconstituída por comparação das rotas penetração de compostos fluorescentes através do

estrato córneo da pele reconstituída, com um tecido nativo. Foi observado que o estrato


córneo neste sistema possui propriedades bem distintas do nativo, assim, o transporte de

fármacos em tecido reconstituído possuirá um perfil diferente do real.

A CLSM também permite estudar a estrutura de pele em três dimensões, com alta

precisão. Vardaxis e cols. (1997) realizaram estudos morfológicos da pele de porcos

utilizando anticorpos fluorescentes. Os autores concluíram que a CLSM fornece informações

morfológicas valiosas e adicionais com relação à estrutura da pele, comparada à microscopia

de luz convencional.

Grams e Bouwstra utilizaram a CLSM para a determinação da distribuição de um

fluoróforo nos folículos pilosos (2002a) e para a comparação do acúmulo de diferentes

fluoróforos com diferentes lipofilicidades e o efeito do veículo na disposição dos fluoróforos

na pele (2002b). Eles viram que a penetração do fluoróforo no folículo piloso pode ser

melhorada aumentando moderadamente a lipofilicidade do penetrante.

A CLSM, usando um scanner portátil miniaturizado, em combinação com um fluoróforo

exógeno, foi utilizada para visualizar a pele humana viva intacta. Swindle e cols. (2003)

caracterizaram a morfologia microscópica da epiderme humana normal in vivo depois da

administração intradermal de fluoresceína sódica. As imagens obtidas por CLSM foram

identificáveis e eram consistentes com cortes histológicos de pele vistos em um microscópio

convencional. Porém, certas características não puderam ser identificadas com confiança na

falta de estudos histológicos complementares.

Na TFD, a influência do DMSO e do EDTA no acúmulo de PpIX induzida por 5-ALA

foi visualizada por CLSM. De Rosa e cols. (2000) mostraram o aumento da fluorescência

relacionada à PpIX após a aplicação de formulações in vivo em camundongos sem pêlo.

Uma vez que a microscopia confocal é direcionada para espécimes marcados ou corados

com substâncias fluorescentes, ela apresenta grande aplicação nos estudos de agentes

fotossensibilizantes na TFD. A localização intracelular e a distribuição nos tecidos destes


agentes administrados ou produzidos in situ são importantes para a determinação da

especificidade destes agentes por diferentes tecidos e do seu efeito fototóxico (DE ROSA,

2002).

43

3- OBJETIVOS

3 - Objetivos 44

O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento farmacotécnico de

formulações contendo AO como promotor de absorção cutânea, visando o aumento da

penetração cutânea do 5-ALA para a Terapia Fotodinâmica do câncer de pele.

3.1. Objetivos específicos

Padronização de metodologia analítica para a quantificação de 5-ALA por

espectrofluorimetria.

Padronização de metodologia analítica para a quantificação de PpIX induzida por 5-

ALA por espectrofluorimetria.

Obtenção de formulações contendo diferentes concentrações de 5-ALA com AO a

10% (p/p) em propilenoglicol.

Estudos in vitro de permeação e retenção cutânea do 5-ALA, em pele de orelha de

porco e quantificação por espectroflurimetria.

Estudos in vivo de acúmulo de PpIX e quantificação por espectrofluorimetria.

Microscopia confocal das peles tratadas com as formulações contendo 5-ALA e AO,

para visualização da formação de PpIX in vivo.

45

4- MATERIAIS E MÉTODOS

4 – Materiais e Métodos 46

4.1- Materiais

4.1.1- Fármacos

Ácido 5-aminolevulínico (Cloridrato) (~98%) - Sigma;

Protoporfirina IX (≥ 95%) - Sigma.

4.1.2- Reagentes e solventes

Acetilacetona, grau P.A. - Vetec;

Ácido oléico (~99%) - Sigma;

Água MilliQ (filtro Gradient - Millipore);

Creme depilatório, peles sensíveis - Veet - Reckitt Benckiser;

Etanol, grau HPLC - J. T. Baker;

Formaldeído (37%) - Merck;

Metanol, grau HPLC - J. T. Baker;

NaH2PO4.H2O – Vetec;

Propilenoglicol, grau P.A. - Synth;

Tissue Tek® - O.C.T. Compound 4583 - Sakura.

4.1.3- Equipamentos e acessórios

Agitador de tubos - MS1 minishaker, IKA;

Agitador magnético - Lab disk, IKA;

Balança analítica - Adventure™, Ohaus;


Balança semi-analítica - AS 2000C, Marte;

Banho sonicador - Q-335D, Quimis;

Banho-maria - 314/4, Nova Ética;

Células de difusão vertical MICROETTE, modelo 57-100-828, acoplada a coletor

automático Sip Control - Hanson Research CO;

Centrífuga - Rotofix 32, Hettich;

Criostato - D-6900, Microm;

Discos de algodão - Cremer;

Filtros de 0,45 μm de celulose regenerada- Millipore®;

Fitas adesivas - Scotch®, 3M;

Fluorímetro - F4500, Hitachi;

Homogeneizador de tecidos - Turrax;

Lâminas de vidro extra brancas (Knitell) gelatinizadas com gelatina de pele bovina

tipo B (Sigma);

Luvas de procedimentos;

Medidor de pH - DM 20, Digimed;

Micropipetas automáticas ajustáveis de 20,0 a 200,0 μL, 100 a 1000 μL e 1,0 a 5,0 mL

- Finnpipette;

Microscópio Confocal de Varredura a Laser, modelo TCS SP2 - Leica Microsystems,

Mannheim, Alemanha;

Pinça, bisturi e tesoura cirúrgica para dissecação;

Tubos de ensaio âmbar com tampa ;

Tubos de plástico para extração (50mL) - Corning.


4.1.4- Pele

Pele da região dorsal de orelha de porco. As orelhas foram obtidas logo após o abate do

animal (Frigorífico Friboi - Pontal/SP). Seu preparo consistiu de lavagem em água corrente e,

em seguida, dissecação da pele da região dorsal externa das mesmas. As peles foram

congeladas por, no máximo, 30 dias.

4.1.5- Animais de laboratório

Camundongos com 12 a 16 semanas, linhagem Balb/C, ambos os sexos. Os animais

foram obtidos do Biotério I da FORP e foram mantidos em sala climatizada (22 °C ± 2 °C),

com suprimento de água e ração ad libidum.

Os camundongos foram depilados da seguinte forma: foram cortados os pêlos da região

dorsal com uma tesoura cirúrgica, tomando-se o cuidado de não ferir a pele do animal. Em

seguida, foi aplicado creme depilatório e deixado por 5 minutos. Após este período o creme

foi retirado utilizando-se água destilada, até que a pele estivesse completamente limpa. O

camundongo era então seco pressionando-se levemente papel absorvente sobre o mesmo. Este

procedimento foi realizado sempre 24 horas antes do experimento, para garantir que a

utilização do creme não interferisse na penetração das formulações. Cawley e colaboradores.

(1996) compararam a penetração transdérmica de insulina passivamente e com iontoforese em

ratos diabéticos depilados com creme depilatório no dia do experimento, 24 horas antes e sem

aplicação do creme. Eles viram que, nos ratos tratados com creme depilatório 24 horas antes

da iontoforese ou da aplicação passiva de insulina, os níveis de glicose sanguínea

permaneceram semelhantes aos níveis iniciais e não houve aumento da penetração de insulina

quando comparado ao grupo onde não foi usado creme depilatório. Já nos ratos tratados com


o creme no mesmo dia do experimento, houve queda significativa nos níveis de glicose

sanguínea.

4.2- Métodos

4.2.1- Padronização de metodologia analítica para o 5-ALA

O 5-ALA não apresenta fluorescência. Sendo assim, para que se possa fazer a quantificação

do mesmo por fluorimetria é necessário que o 5-ALA seja submetido a uma reação de

derivatização. Esta derivatização é baseada numa modificação da reação de Hantzsch, onde

compostos amínicos reagem com acetilacetona e formaldeído (OISHI et al., 1996) (Figura 8).

O derivado fluorescente do 5-ALA, 2,6-diacetil-1,5-dimetil-7-(2-carboxietil)-3H-pirrolizina,

pode, então, ser quantificado através de espectrofluorimetria.

5-ALA + Acetilacetona + Formaldeído → Derivado fluorescente

Figura 8 - Reação de derivatização do 5-ALA.

O

O

O

HO

H2N

O

O

N

OHO

O

O

H

H


4.2.1.1- Reação de derivatização (OISHI et al., 1996)

Preparo do reagente de acetilacetona

O reagente foi preparado misturando-se 15 mL de acetilacetona, 10 mL de etanol e 75

mL de água destilada, ao abrigo da luz, sob agitação a 600 rpm em agitador magnético.

Preparo da solução de formaldeído 10% (v/v)

O reagente formaldeído (37%v/v) foi diluído 3,7 vezes em água destilada e esta solução

foi então estocada ao abrigo da luz.

Em tubo de ensaio âmbar com tampa, adicionaram-se 3,5 mL de reagente de

acetilacetona, 0,45 mL de solução de formaldeído a 10% e 50 μL da solução de 5-ALA a ser

quantificada (solução estoque, solução receptora do estudo de permeação ou extrato

metanólico resultante do tape stripping e retenção). Esta mistura foi agitada em vortex por

aproximadamente 3 segundos e aquecida em banho-maria a 100°C por 10 minutos. O produto

foi então resfriado em banho de gelo e mantido ao abrigo da luz até o momento da leitura.

A partir do derivado fluorescente obtido, foi feita a determinação do comprimento de

onda (λ) de excitação (pico máximo de absorção) e de emissão no espectrofluorímetro (item

4.2.1.2).


4.2.1.2- Determinação do comprimento de onda (λ) de emissão do derivado fluorescente de 5-ALA em espectrofluorímetro

Foi preparada uma solução estoque de 5-ALA a 100μg/mL, dissolvendo-se 12,8mg do

cloridrato do fármaco em 100mL de solução tampão fosfato, pH 5,0, e esta foi estocada ao

abrigo da luz a 4°C.

Foi realizada a reação de derivatização descrita no item 4.2.1.1, utilizando-se 50μl desta

solução estoque. O derivado fluorescente foi então submetido à excitação na região do

ultravioleta, utilizando-se λ = 378nm. Desta forma, determinou-se o λ de emissão máximo da

solução preparada, no espectrofluorímetro.

4.2.1.3- Determinação da linearidade do método

Com o intuito de avaliar a linearidade do método, ou seja, a proporcionalidade entre a

concentração e a resposta, foi feita uma curva analítica, onde foram determinados os

coeficientes de correlação (r) e a equação da reta. Partindo-se de soluções estoque de 5-ALA a

100μg/mL em solução tampão fosfato pH 5,0 e em metanol, foram preparadas diluições em

quadruplicata, representando os seguintes pontos da curva analítica: 0,3125; 1,25; 5,0; 10,0;

25,0; 50,0 e 100,0 μg/mL.

Alíquotas de 50μl de cada diluição (quadruplicata) foram submetidas à reação de

derivatização, conforme descrita no item 4.2.1.1, e os derivados fluorescentes foram

quantificados em espectrofluorímetro. A curva analítica foi obtida relacionando-se as

concentrações de 5-ALA (μg/mL) na abscissa (eixo X) e os valores de intensidade de

fluorescência na ordenada (eixo Y).


4.2.1.4- Determinação da precisão e exatidão do método de espectrofluorimetria para o 5-ALA

Para avaliar a precisão e a exatidão do método, foi feita uma curva padrão em triplicata

(5-100μg/mL) e dez replicatas de amostras das concentrações de 5 e 50μg/mL foram

analisadas juntamente com a curva padrão, em um mesmo dia, para avaliar a precisão e a

exatidão intra-ensaio e por cinco dias consecutivos, para avaliar a precisão e exatidão inter-

ensaio.

A precisão está relacionada com a dispersão das medidas ao redor de seu valor médio e

é expressa matematicamente através da porcentagem do coeficiente de variação (%CV),

calculado pela seguinte fórmula:

A exatidão, expressa matematicamente pela porcentagem de erro (% E), corresponde à

diferença entre o valor obtido após a análise e o valor real da amostra e é calculada pela

seguinte fórmula:

4.2.2- Obtenção das formulações contendo 5-ALA e AO em propilenoglicol

Estudos anteriores mostraram que a concentração de 10% de AO em propilenoglicol

apresentou melhor desempenho na promoção da absorção cutânea in vitro do 5-ALA e

%CV = (desvio padrão/média das concentrações determinadas) X 100

%E = valor obtido - valor real X 100

valor real


acúmulo in vivo de PpIX em modelo animal (PIERRE et al., 2006). No presente projeto, estão

sendo estudadas formulações contendo diferentes concentrações de 5-ALA e esta

concentração efetiva de AO.

As formulações de 5-ALA a 1, 5, 10 e 20% (p/p) foram preparadas pesando-se

quantidade apropriada do fármaco e completando-se o peso para 1g com solução de AO a

10% (p/p) em propilenoglicol. As formulações controle consistiram das mesmas soluções,

porém não contendo AO.

4.2.3- Estudo in vitro de permeação cutânea

Devido às propriedades histológicas e bioquímicas serem semelhantes à pele humana,

bem como por apresentar resultados comparáveis à permeabilidade de fármacos neste tipo de

pele, foi utilizada pele de orelhas de suínos obtidas a partir de frigoríficos como modelo de

pele animal.

Para os experimentos de permeação foram empregadas células de difusão de Franz

modificadas (Células de difusão vertical Microette acopladas a coletor automático SIP control

– Hanson Research - USA) (Figura 9). De modo geral, o experimento apresenta uma

formulação contendo o fármaco (fase doadora), a qual fica em contato com a membrana

(orelha de porco). Abaixo da membrana tem-se a solução receptora, onde é determinada a

quantidade de fármaco liberada ou permeada/cm2 de área de exposição nos diferentes tempos

de coleta.


Figura 9 - Célula de Franz modificada (Hanson Research, Microetti)

A solução receptora empregada foi tampão fosfato 0,15M, pH 5,0, mantida a

temperatura de 37°C por um banho termostatizado de água circulante. Esta fase receptora

manteve condições de “sink” para o fármaco no experimento in vitro.

As porções de pele animal (orelha de porco) recentemente dissecadas foram colocadas

nas células de difusão, sendo que o lado inferior da pele ficou em contato com a solução

receptora. A área de exposição das peles foi de aproximadamente 1,77 cm2. Alíquotas de

120μL de cada preparação (formulações ou controles) foram aplicadas sobre a membrana

animal (lado epidérmico) fixada ao suporte. A solução receptora (cerca de 7,0mL) foi

constantemente agitada a 300 rpm e amostras de 1mL foram coletadas e armazenadas em

vials pelo coletor automático em intervalos de tempo pré-estabelecidos: 1, 2, 4, 6, 8 e 12

horas. O equipamento manteve constante o volume da solução receptora automaticamente,

sendo assim, a cada coleta foi reposto 1,0mL de solução nova, bombeada pelo sistema de

seringas. Um esquema simplificado do funcionamento do aparelho de difusão é mostrado na

Figura 10.


Figura 10 - Esquema de funcionamento do aparelho de difusão (Hanson Research,

Microetti)

As alíquotas foram quantificadas pela técnica de espectrofluorimetria, após a obtenção

dos derivados fluorescentes de 5-ALA pela reação de derivatização (item 4.2.1.1).

Após a quantificação no espectrofluorímetro, foi feita a correção das diluições

decorrentes das coletas, segundo a fórmula:

onde,

Qreal,t = quantidade permeada real no tempo t

Cmensurada,t = concentração mensurada da coleta no tempo t

Vr = volume da célula de difusão (7 mL)

Qreal,t = Cmensurada,t x Vr + Va x Σn-1 Ca


Va = volume de amostra removido (1 mL)

Ca = concentração da amostra removida anteriormente

A quantidade corrigida do fármaco permeado foi dividida pela área de pele utilizada

(1,77 cm2) e esses valores foram plotados em função do tempo (μg/cm2 x tempo) para

visualização do perfil de permeação do fármaco. Os experimentos foram realizados com um

n=5.

4.2.4- Estudo in vitro de retenção cutânea

Para o estudo de retenção cutânea, o procedimento foi o mesmo descrito no item 4.2.3.

Após 8 ou 12 horas de experimento na célula de difusão, as peles foram retiradas e lavadas

com água destilada para retirar o excesso de formulação e levemente secas com papel

absorvente para a retirada do excesso de água. Em seguida, foram submetidas aos

procedimentos de retirada do estrato córneo (tape stripping) e extração do fármaco da

[epiderme + derme].

4.2.4.1- Tape stripping (retenção no estrato córneo)

A técnica baseia-se na remoção progressiva do estrato córneo, a camada mais externa

da epiderme, pela aplicação seqüencial de fitas adesivas na área onde a formulação foi

aplicada, seguida da extração do fármaco retido nas fitas e posterior determinação da

concentração por espectrofluorimetria.

A área de pele exposta à difusão (1,77 cm2) foi submetida à retirada do EC. Para isto,

foram utilizadas fitas adesivas Scotch®, 3M (n=15), sendo que a primeira fita foi desprezada,


por conter excesso de formulação. As fitas foram colocadas em um tubo de ensaio contendo

10mL de metanol. Os tubos com as fitas e o metanol foram agitados em vortex por 3 minutos

e sonicados por 30 minutos para a extração do fármaco. O extrato metanólico foi então

filtrado em filtro de celulose regenerada de 0,45 μm. Um volume de 50μL deste filtrado foi

posteriormente quantificado por espectrofluorimetria, após a reação de derivatização (item

4.2.1.1). Os resultados obtidos foram expressos em quantidade de 5-ALA retido no EC por

área de exposição (μg de 5-ALA/cm2).

4.2.4.2- Estudos de retenção na [epiderme + derme]

Após a retirada do EC como descrito anteriormente, a área da pele restante (epiderme

sem EC + derme) foi recortada, picada e aos fragmentos obtidos foram adicionados 5mL de

metanol e agitada em homogeneizador de tecidos Turrax por 1 minuto. Em seguida, foi

realizada a sonicação em banho de ultra-som durante 30 minutos, a fim de romper as células e

liberar o fármaco. A suspensão obtida foi centrifugada a 300 rpm por 15 minutos e em

seguida filtrada em filtro de celulose regenerada de 0,45 μm. Alíquotas de 50μL do filtrado

foram submetidas à quantificação por espectrofluorimetria, após a reação de derivatização

(item 4.2.1.1). Os resultados obtidos expressam a quantidade de 5-ALA retido na [epiderme +

derme] por área de exposição (μg de 5-ALA/ cm2).


4.2.5- Quantificação in vivo da PpIX induzida por 5-ALA em peles sadias de camundongo

O estudo in vivo realizado em camundongos Balb/C foi aprovado pela Comissão de

Ética no Uso de Animais (CEUA) do campus da USP de Ribeirão Preto (Protocolo nº

07.1.88.53.4 - Anexo, p. 117).

4.2.5.1- Determinação do comprimento de onda (λ) de emissão da PpIX

Uma solução estoque de PpIX foi preparada diluindo-se 4 mg da substância em 200 mL

de MeOH:H2O (9:1) acidificada com HCl a pH 3,0 para total solubilização da PpIX. Esta

solução foi estocada ao abrigo da luz à temperatura inferior a 0 °C. A partir desta solução foi

preparada uma solução de 200 ng/mL, em MeOH:H2O 9:1, e esta solução foi excitada com

um λ de 400 nm para se determinar o λ máximo de emissão da PpIX no espectrofluorímetro,

através da varredura à velocidade de 1200 nm/min e fenda excitação/emissão = 10/10.

4.2.5.2- Determinação da linearidade do método

A linearidade foi avaliada, em triplicata para cada concentração, através da construção

de uma curva analítica, com valores expressos em ng/mL. Soluções de PpIX em MeOH:H2O

9:1 foram preparadas nas concentrações de 0,5, 1,0, 2,5 10, 25, 50 e 100 ng/mL, a partir da

diluição de uma solução padrão de PpIX a 200 ng/mL. As leituras das amostras foram feitas

diretamente em espectrofluorímetro com λ de excitação/emissão = 400/631 nm, velocidade de

varredura 1200 nm/min e fenda (10/10). A curva padrão foi obtida plotando-se os valores das

concentrações de PpIX no eixo das abscissas (X) e os valores de intensidade de fluorescência

correspondentes no eixo das ordenadas (Y).


4.2.5.3- Determinação da precisão e exatidão do método de espectrofluorimetria para a PpIX

Para avaliar a precisão e a exatidão do método, foi feita uma curva analítica em triplicata

(0,5-100μg/mL) e dez replicatas de amostras das concentrações de 2,5 e 50μg/mL foram

analisadas juntamente com a curva padrão, em um mesmo dia, para avaliar a precisão e

exatidão intra-ensaio e por cinco dias consecutivos, para avaliar a precisão e exatidão inter-

ensaio. A precisão e exatidão foram calculadas conforme descrito anteriormente (item

4.2.1.4).

4.2.5.4- Procedimento de extração da PpIX induzida por 5-ALA após aplicação in vivo

Para este estudo, foram utilizadas as formulações contendo 1, 5, 10 e 20% de 5-ALA em

propilenoglicol e 1, 5 e 10% de 5-ALA em propilenoglicol com 10% de AO. Também foram

testados os seguintes controles: pele de camundongo não tratada, pele de camundongo tratada

apenas com propilenoglicol e pele de camundongo tratada com propilenoglicol com 10% de

AO.

Cerca de 200 μL das formulações e controles descritos acima foram adicionados a um

sistema elaborado da seguinte forma: curativos adesivos Band-aid® (Johnson & Johnson)

tiveram a almofada retirada e no local foi colocado um retângulo de 2 cm2 feito a partir de um

disco de algodão (Figura 11 A). Este sistema foi aplicado na região dorsal da pele sadia e sem

ferimentos de camundongos Balb/C (Figura 11 B e C), 24 horas após a depilação, conforme

descrito no item 4.1.5. A região de aplicação foi protegida com esparadrapo (Figura 11 D),

para evitar que os animais retirassem a formulação. Os animais assim tratados foram mantidos


ao abrigo da luz por 4 horas. Após o tempo de aplicação, eles foram sacrificados em câmara

de CO2 e as regiões correspondentes aos locais de aplicação foram dissecadas.

Figura 11 - Estudo in vivo de acúmulo de PpIX em pele de camundongo. (A) preparo

do sistema; (B) camundongo 24 horas após a depilação; (C) camundongo após aplicação da

formulação; (D) com esparadrapo para proteção da formulação.

O método de extração da PpIX da pele tratada com as formulações foi baseado na

metodologia descrita por De Rosa e cols (2000), conforme descrito a seguir.

A região de aplicação da formulação (2 cm2) foi dissecada, picotada, adicionada a um

tubo plástico contendo 25 mL de MeOH:H2O 9:1 e homogeneizada em homogeneizador de

tecidos por 2 minutos. Os tubos foram então colocados no banho de ultra-som por 15 minutos,

a solução filtrada em papel de filtro comum e finalmente em filtros de celulose regenerada de


0,45 μm, resultando no filtrado 1. O homogeneizado de pele restante foi submetido a uma

nova extração, exatamente da mesma forma que a primeira, resultando no filtrado 2.

A fluorescência dos filtrados 1 e 2 foi determinada diretamente por fluorimetria. A

concentração de PpIX extraída foi quantificada a partir de uma curva analítica de PpIX em

MeOH:H2O, na faixa de concentração de 0,5 a 100 ng/mL, com excitação/emissão de 400/631

nm. Todo procedimento foi realizado ao abrigo da luz. As concentrações de PpIX

determinadas nos filtrados 1 e 2 foram somadas e expressas em μg de PpIX extraída/cm de

pele.

4.2.6- Microscopia confocal das peles de camundongo tratadas com 5-ALA

A metodologia para visualização da formação de PpIX in vivo em peles de

camundongos sadios, através da microscopia confocal, foi baseada no método proposto por

De Rosa (2002), conforme é explicado a seguir.

4.2.6.1- Administração das formulações em peles de camundongos

Foram utilizados camundongos previamente depilados (item 4.1.5), de ambos os sexos,

apresentando pele sadia e sem nenhum ferimento. A administração das formulações foi feita

conforme descrito anteriormente (item 4.2.5.4). Foram utilizados como controle peles de

animal sem tratamento, tratada apenas com propilenoglicol, com propilenoglicol e AO e com

solução tampão.


4.2.6.2- Obtenção dos cortes da pele de camundongo

Após terem sido dissecadas, as peles foram imersas em uma matriz crioprotetora inerte

(Tissue Tek®), composta de polímeros como polietilenoglicol e álcool polivinílico, que

apenas oferece suporte para que a pele possa ser cortada. Em seguida, foram congeladas em

acetona com gelo seco, até formarem um bloco compacto. O bloco contendo a pele foi então

cortado transversalmente em criostato, numa espessura de aproximadamente 60 μm. Os cortes

foram diretamente colocados sobre lâminas gelatinizadas e cobertos com lamínula, sem

qualquer procedimento de fixação ou coloração.

4.2.6.3- Microscopia Confocal de Varredura a Laser

Na microscopia confocal as amostras foram excitadas com laser a 488 nm e a emissão

lida acima de 590 nm. As imagens confocais foram obtidas usando-se objetiva de imersão

com aumento de 20 vezes. Os cortes mecânicos feitos no criostato foram opticamente

seccionados na microscopia confocal, de maneira que foram analisados cerca de 30 μm de

tecido, dentro do corte de pele de 60 μm, eliminado, assim, as superfícies dos cortes

mecânicos que podem ser irregulares e com isso interferir na análise.

63

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

7 - Referências Bibliográficas 64

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8- ANEXO

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