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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos
Área de Bromatologia
EFEITO DO PROCESSAMENTO TÉRMICO SOBRE A OCORRÊNCIA
DO 7-CETOCOLESTEROL EM CAMARÃO-ROSA
(penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis)
Andréa Figueiredo Procópio de Moura
Dissertação para obtenção do grau de MESTRE
Orientador: Prof. Dr. Alfredo Tenuta Filho
São Paulo 1999
Andréa Figueiredo Procópio de Moura
EFEITO DO PROCESSAMENTO TÉRMICO SOBRE A OCORRÊNCIA
DO 7-CETOCOLESTEROL EM CAMARÃO-ROSA
(Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis)
Comissão Julgadora
Dissertação para obtenção do grau de MESTRE
Prof. Dr. Alfredo Tenuta Filho Orientador I Presidente
Prof. Dr. Jorge Mancini Filho 1 º Examinador
Profa. Ora. Elisabeth A. F. S. Torres 2º Examinador
São Paulo, 16 de dezembro de 1999.
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof Alfredo Tenuta Filho pela orientação dedicada e paciente.
Ao Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental da FCF/USP
pela oportunidade da realização deste trabalho.
A CAPES e à FAPESP pelo suporte financeiro.
A Professora Dulcinéia Saes Parra Abdalla por gentilmente ter aberto as
portas de seu laboratório, tornando possível nosso ingresso na pesquisa de
colesterol.
Aos Professores Massami Shimokomaki e Célia Colli pelas valiosas
sugestões a este trabalho.
Aos Professores Rinaldo Artes e Júlia Pavan, do Departamento de
Estatística do IMEI USP, pela assessoria prestada com tanto interesse e
solicitude.
Ao Professor Noriyoshi Yamaguti pela caracterização zoológica das
espécies de camarão-rosa.
Aos Professores João Roberto Oliveira Nascimento, Úrsula Maria Lanfer
Marquez, Lígia Bicudo de Almeida Muradian e Maria Oriana Reyes Figueiroa
pela oportunidade de estágio junto ao programa PAE.
As secretárias Ângela, Mônica e Bel pela atenção e simpatia.
Aos amigos da Secretaria de pós-graduação, Benê, Elaine e Jorge, pelo
carinho e boa vontade nas tantas "quebradas de galho".
Ao Laboratório de Lípides pela análise da composição de ácidos graxos
e, de modo muito especial à Rosângela, que sempre esteve pronta a ajudar,
dando muito mais que um apoio técnico.
Ao Laboratório de Microbiologia, em particular à Mariana, pelas análises
microbiológicas e troca de "figurinhas" na dura lida com o camarão.
Às funcionárias Lourdinha e Joana pelo delicioso café de todo dia e pelo
bom humor contagiante com que realizam suas atividades.
Às colegas de laboratório Sandra, Isabel, Cristiane, Mariane e Cristina
pelas grandes e freqüentes colaborações durante a realização deste trabalho e
pela convivência alegre e amiga.
Aos grandes amigos que fiz aqui Aninha, Dê, Aline, Raquel, Isabela,
Diogo e Erasmo, uma das melhores conquistas que a Paulicéia me
proporcionou.
Aos amigos e colegas de curso, pelas singelas contribuições do dia-a
dia e à todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização deste trabalho.
íNDICE
LISTA DE FIGURAS .. ... ... .... ............ .. ........... ...... ..... ................ .... ..... ..... .......... x
LISTA DE TABELAS .............................. ................... .... ......................... ........ xii
LISTA DE ABREViATURAS ....................... .......... ................... ... ... ............... xiv
RESUMO ............. .. ............. .... ...... ........ .. ............. ...................... .. ..... ..... .. .... .. xv
SUMMARY ... .. .... ... ............ ...... ...... .. ..... ........................................... ......... ..... xvi
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... '1
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 2
2.1. OXIDAÇÃO DO COLESTEROL EM ALIMENTOS ............... ... ... .. ... ..... ......... 2
2.1.1 . FORMAÇÃO DOS ÓXIDOS DE COLESTEROL ....................... ............. 2
2.1.2. FATORES PREDISPONENTES ...... ............. .................... .... .... ... ... .. ...... 6
2.1.2.1. Oxigênio ...................... ..... ..................................... ..... .. ..... .. ....... ..... .... ....... 7
2.1.2.2. Presença de ácidos graxos polinsaturados ............ .... ..... ................ ...... ...... 8
2.1.2.3. Temperatura .............. ... .. .. .............. .... ................................... ...... 1 O
2.2. EFEITOS BIOLÓGICOS DOS ÓXIDOS DE COLESTEROL ....................... 12
2.3. METODOLOGIA UTILIZADA NA DOSAGEM DE ÓXIDOS DE
COLESTEROL ........... .. ... ..... ........... .......... .. .. .... ... .......................... ...... ....... .. ... .. 16
2.4. 7-CETOCOLESTEROL COMO INDICADOR DA OXIDAÇÃO DO
COLESTEROL ....... ... ...... ... ... ...... ....... .. .. ..... .. ...... .... ....... .............. .. ..... ....... .. ..... . 19
2.5. OCORRÊNCIA DE ÓXIDOS DE COLESTEROL EM ALIMENTOS ............. 20 i
2.5.1. PRODUTOS MARINHOS ..................................................................... 22
2.5.1.1 Camarão .............. .. .... ... ... ..... .. ..... .. ... ........... ... ................ ..... .... ... .............. 23
3. OBJETIVOS ............................................................................................. 25
4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 26
4.1 MATERIAL ... ........ ... .... ....... .... ..... ..... ..... ........ .. .... .. .... ............... ... ................ . 27
4.2 MÉTODOS .... ...................... ......... ......... ................ ....... ............ ............. ....... 30
4.2.1. PROCESSAMENTO DO CAMARÃO ............................. .. .................. .. 30
4.2.1.1 . Cocção ..... ............ ......... ....... ..... ... .... ............ .......... ... ..... ... ..... ........ .. ........ 30
4.2.1.2. Fritura ..... .... ............. ............... ....... .... ...... ....... ......... ... ........ ............. .... .... 30
4.2.2. DETERMINAÇÃO DE UMIDADE .. ... ... .. ............................................... 31
4.2.3. DETERMINAÇÃO DE LíPIDES TOTAIS ... ..................... ... ... ... .... .. ....... 31
4.2.4. PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS ................. ........ .... .... ............ ....... ........ 31
4.2.5. DOSAGEM DE BASES VOLÁTEIS TOTAIS (BVT) .... ... .... ... ... ..... ... ..... 32
4.2.6. DETERMINAÇÃO ELETROMÉTRICA DO pH .. ..... .... ...... ................... .. 32
4.2.7. SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS). 32
4.2.8. ANÁLISE MiCROBIOLÓGiCA ............ .. ... .. ........ .... ...... ... ..... .... .......... .. . 33
4.2.9. DOSAGEM DE COLESTEROL E 7-CETOCOLESTEROL .. ......... ........ 33
4.2.10. ANÁLISE ESTATísTiCA ........... ................. .... .. ....... ........ ........... ........ 35
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 36
5.1. CARACTERIZAÇÃO DO CAMARÃO-ROSA FRESCO COMO MA TÉRIA-
PRIMA .... ..... .... .. .......... ... ...... .. .. .... ....... .. .. .. ................ .. ............. ... ... ....... .. .. .... .... 36
5.1 .1. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE .... .... .. ...... ....... .... ... .... .. ... .. ............ .... ... . 36
5.1.1.1. pH ..... ............ .... ..... .... .... .. ....... ... ...... .................. ..................................... 37
5.1.1.2. Bases Voláteis Totais -BVT .. ................. ... ...................... .... ............ ....... .. . 38
5.1.1 .3. Substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico - TBARS .................... ........ . 40
5.1.1.4. Análise Microbiológica ...... .. ........... .................... ...... ..... ...... ..... ........... ...... 42
5.1.1.5. pH x BVT x TBARS x Análise Microbiológica ........ ..... ..... ...... .. .. .. .......... .... 44
5.1 .2. AVALIAÇÃO DA FRAÇÃO LlPíDICA. ..... ..... ..... ..... ........ .. ............ ........ 46
5.1.2.1. Concentração lipídica ..... ....... .... ........ ......... ... .. .................. .... .. ... ........... ... 46
5.1 .2.2. Perfil de ácidos graxos .... ...... ..... ... .... ..... ..... ..... ......... .... .... .. ... .. ... ........ ... .. 48
5.1.2.3. Concentração de colesterol ........ ..... ........... .. ............. ....... ........ .... ....... .... . 51
5.1.3. OCORRÊNCIA DE 7 -CETOCOLESTEROL ........ .......... ... .. ........ ..... ..... 54
5.2. EFEITO DE PROCESSAMENTOS TÉRMICOS SOBRE ÁCIDOS GRAXOS
E COLESTEROL EM CAMARÃO-ROSA ..................... ....... .... ....... ... .. ... ..... ....... 57
5.2.1 . CONCENTRAÇÃO LIPíDICA .................. ... .......... .......... ...... ....... ....... .. 57
5.2.2. COMPOSiÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS .. ..... .. ............... .... ... .. ....... .. .. .... 58
5.2.3. COLESTEROL E 7-CETOCOLESTEROL. ... .. ....... ... ........ ..... .... .... ....... 66
5.2.3.1 Colesterol .... ..... ... ........ .. ... ....... .. .. .. ........ .. .... ...... .. .. ....... .. ..... ....... .... .... ..... .. 66
5.2.3.2 7-Cetocolesterol ............. .. ... ........... ................................ ............... ....... ..... 69
6. CONCLUSÕES ........................................................................................ 75
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 76
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Estrutura química do colesterol. ...... ..... ....... ......... .. .. ...... ...... .. 2
Figura 2.2. Estrutura química do colesteril éster ... ....... .. .. ..... ..... .............. 3
Figura 2.3 Produtos da oxidação do colesterol. .... .... .... ... .... .. ........ ....... . .4
Figura 4.1 . Camarão da espécie Penaeus brasiliensis ...... ........ ... .. ... ... . 27
Figura 4.2. Camarão da espécie Penaeus paulensis ...... ... .................. .. 27
Figura 4.3. Camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis) antes e após a
limpeza ...... ......... ...... ............ ....... ....... ............ ......... ....... ...... 29
Figura 4.4. Camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis) submetido ao
cozimento e fritura .. ...... ........ ..... ....... .. ......... ..... .. .. ...... ... ... .. .. 29
Figura 4.5. Espectro de absorção ultravioleta do colesterol e do 7-
cotocolesterol em hexano:isopropanol (97:3) .... .. ..... .. ......... 33
Figura 4.6. Cromatograma dos padrões de colesterol e 7 -cetocolesterol
visualizados em 3D ......... ............... ....................... ....... .. ..... . 34
Figura 5.1. Concentração de colesterol livre em camarão-rosa fresco
(Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis) em relação ao
teor lipídico totaL ... .. ..... ..... .. ........... .. ................... .. ... ........ .. .. 54
Figura 5.2. Efeito dos processamentos sobre a composição de ácidos
graxos em camarão-rosa (Penaeus brasiliensis + Penaeus
paulensis) .... ..... ... .... ..... ................ ... .. ........ .......... ........ .. ... .. .. 60
x
Figura 5.3. Cromatograma da composição de ácidos graxos de camarão
rosa (Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis)
fresco ......................... .. ..... .... ............................... ...... ........... 63
Figura 5.4. Cromatograma da composlçao de ácidos graxos em
camarão rosa (Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis)
submetido ao cozimento .......... .. ... ................... .... .. ....... ..... . 64
Figura 5.5. Cromatograma da composição de ácidos graxos em
camarão rosa (Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis)
submetido à fritura ................ ....... ..... ................ ................... 65
Figura 5.6. Efeito dos processamentos térmicos sobre as concentrações
de colesterol e 7 -cetcolesterol livres (base seca) em
camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis) ....... ........ ... ... . 66
Figura 5.7. Efeito dos processamentos térmicos sobre a concentração
de colesterol livre (base seca) em camarão-rosa (P.
brasiliensis + P. paulensis) ...................... .......... .... ........... .... 67
Figura 5.8. Efeito dos processamentos térmicos sobre a concentração
de 7 -cetocolesterol livre (base seca) em camarão-rosa (P.
brasiliensis + P. paulensis) ........................... ... ..... .. ....... ... .... 69
xi
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 . Alimentos em que a presença de óxidos de colesterol tem
sido determinada ..... .. ..... ..... .... ..... .. ...... .... .... .. ...... .... .. ... ... .. .... 21
Tabela 4.1. Recuperação do colesterol e 7 -cetocolesterol pelo
metodologia de CSALLANY et aI. (1989) ......... ..... .. .............. 35
Tabela 5.1. Valores de pH, bases voláteis totais (BVT), substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e contagens totais de
microorganismos mesófilos (CTM) e psicrotróficos (CTP) em
camarão-rosa fresco (Penaeus brasiliensis + Penaeus
paulensis) ...... ........... ... ............ ......... ........... ...... .... .. .. ...... ...... 36
Tabela 5.2. Correlação entre os indicadores de qualidade: pH, bases
voláteis totais (BVT), substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) e contagens totais de microorganismos
mesófilos (CTM) e psicrotróficos
(CTP) ..... .. ... .. .... ..... .... ....... .... ........... .... .... ..... ...... .. .. .... ....... ..... 45
Tabela 5.3. Concentração lipídica total de camarão-rosa (penaeus
brasiliensis + Penaeus paulensis) ................ .... ..... ..... .......... . 46
Tabela 5.4. Ácidos graxos (% por área) de Penaeus brasiliensis +
Penaeus paulensis, Penaeus brasiliensis e Penaeus
paulensis ..... .. ............ ............. .. .... ...... .. ............... ... .... .... ..... .. . 50
Tabela 5.5. Colesterol e 7 -cetocolesterol livres em camarão-rosa fresco
(Penaues brasiliensis + Penaeus paulensis) .... ..... .. ....... .. ... .. . 54
xiii
Tabela 5.6. Umidade e lípides totais em camarão-rosa (Penaeus
brasíliensis + Penaeus pau/ensis) submetido a
processamentos (g/100g amostra) ... .... ..... ... ..... ... .. .... ...... .. .... 57
Tabela 5.7. Ácidos graxos (% por área) de camarão-rosa (Penaeus
brasiliensis + Penaeus paulensis) fresco, cozido e frito ..... .... 59
Tabela 5.8. Concentrações de colesterol e 7 -cetocolesterol livres na água
de cozimento e no óleo de fritura do camarão-rosa (Penaeus
brasi/iensis + Penaeus pau/ensis) ..... ... .. ..... ...... .... .... ..... ... .... . 72
Tabela 5.9. Valores de TBARS em camarão-rosa (P. brasiliensis + P.
paulensis) fresco e processado ....... .. ... ...... .. ..... ... ............ ...... 73
LISTA DE ABREVIATURAS
>- 7a-hidroxicolesterol: colest-S-ene-3p, 7P-diol;
>- 7p-hidroxicolesterol: colest-S-ene-3p, 7P-diol;
>- 7 -cetocolesterol: 3p-hidroxicolest-S-ene-7 -one;
>- 2S-hidroxicolesterol: colest-S-ene-3p, 2S-diol;
>- colestanotriol: Sa-colestano-3p,S,6p-triol;
>- colesterol-Sa,6a-epóxido: S,6a-epoxi-Sa-colestano-3p-ol;
>- colesteroISp,6p-epoxido: S,6p-epoxi-Sp-colestano-3p-ol);
xiv
>- HPLC: high performance liquid chromatography/ cromatografia líquida de alta
eficiência;
>- TBA: ácido tio barbitúrico;
>- BVT: bases voláteis totais;
>- ACA T: colesterol aciltransferase Coenzima A;
>- HMG-CoA: 3-hidroxi, 3-metilglutaril Coenzima A;
>- LDL: low density lipoprotein /Iipoproteína de baixa densidade;
>- TLC: thin layer chromatography / cromatografia em camada delgada;
>- UV: ultra violeta;
>- EPA: ácido eicosapentaenóico;
>- DHA: ácido docosahexaenóico;
>- ml: mililitros;
>- Ilg: microgramas;
>- ppm: partes por milhão.
xv
RESUMO
o colesterol, como um lipídeo insaturado, está sujeito à oxidação
levando à formação de óxidos biologicamente ativos, capazes de
desencadear processos aterogênicos, mutagênicos e cancerígenos. A
presença de luz, calor, radiações ionizantes, ácidos graxos polinsaturados e
a exposição ao oxigênio desencadeiam o processo oxidativo do colesterol.
Durante o processamento térmico e subseqüente estocagem, os alimentos
são submetidos a vários destes fatores, levando à oxidação. Os moluscos e
crustáceos, além da presença de polinsaturados, apresentam níveis
elevados de colesterol, possuindo portanto, um grande potencial para
formação de óxidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de
óxidos de colesterol em camarão-rosa fresco (Penaeus brasiliensis e
Penaeus paulensis) e a sua formação durante o cozimento e a fritura. O 7-
cetocolesterol foi utilizado como indicador da oxidação do colesterol, por ser
formado em maior quantidade e nos estágios iniciais da oxidação.
Nossos resultados relataram a ocorrência de 7 -cetocolesterol em
amostras comerciais frescas de camarão-rosa (P. brasílíensís + P.
paulensis). O 7 -cetocolesterol livre quantificado apresentou concentrações
que variaram entre 0,185 e 0,366~g/g, com valor médio de 0,230~g/g. O
processamento térmico do camarão-rosa fresco, de um modo geral, levou a
uma diminuição nas concentrações de colesterol e 7 -cetocolesterol livres.
Essa redução foi bem maior na fritura do que no cozimento, e mais
acentuada para o 7 -cetocolesterol do que para o colesterol. A fritura foi o
processamento que provocou maior alteração na composição lipídica do
camarão. A redução nas concentrações de colesterol e 7 -cetocolesterol livre
em camarão-rosa processado foi relacionada com a eluição destes
compostos nos meios de processamento. Este fato foi confirmado pela
presença destes dois compostos na água utilizada no cozimento e no óleo
de fritura.
xvi
SUMMARY
The cholesterol, as a unsaturated lipid, undergoes to autoxidation witch
results in the production of cholesterol oxides that exert a ride range of
biological activities such as atherosclerosis and mutagenicity and
carcinogenesis. The light and oxygen exposure, heat-processing and
polyunsaturated fatty acids presence can accelerate cholesterol oxidation.
During the cooking and subsequent storage, foods are exposed to a several
of these factors, taking to the oxidation. Because of the presence of
polyunsaturated fatty acids and the high leveis of cholesterol the mollusks
and crustaceans have a great potential for oxides production. The objective
of this work was evaluate to occurrence of cholesterol oxides in fresh pink
shrimp (Penaeus brasiliensis and Penaeus paulensis) and their formation
during the boiling and deep-frying. The 7 -ketocholesterol was used as a
'tracer' of the degree of cholesterol oxidation, due to its fast and continuous
formation and this relatively high amounts with respect to the other oxidation
products.
Our results showed the occurrence of 7 -ketocholesterol in fresh
commercial samples of pink-shrimp (P. brasiliensis + P. paulensis). The
amount of free 7 -ketocholesterol found in raw samples was 0,185 to 0,366
ug/g, with average of O,230ug/g. In general, cooking of pink-shrimp
decreased the free cholesterol and 7 -ketocholesterol concentrations. That
decrease in frying was higher than in boiling and was more pronounced for 7-
ketocholesterol than for cholesterol. The frying was the cooking that result
the highest alteration in lipid composition of shrimp. The reduction of free
cholesterol and 7 -ketocholesterol concentrations in processed pink-shrimp
was related with elution of these compounds by the cooking medium. This
fact was confirmed by presence of cholesterol and 7 -ketocholesterol in the
boiling water and in the frying oil.
Introdução 1
o colesterol encontra-se distribuído nos tecidos animais como
principal esterol. Desempenha funções estruturais e funcionais nas
membranas celulares, sendo o precursor dos ácidos biliares e hormônios
esteróides.
o colesterol, como lípide insaturado, está sujeito à oxidação, gerando
óxidos biologicamente ativos. Estudos têm evidenciado que esses óxidos
apresentam características biológicas indesejáveis, como a interferência na
morfologia e nas funções de membrana, aterogenicidade, citotoxicidade,
mutagenicidade, carcinogenicidade e inibição da biossíntese do colesterol.
Os alimentos de origem animal são as principais fontes de colesterol
na dieta. O colesterol encontra-se no alimento intimamente associado a
outros lípides, sendo que a oxidação destes, pode levar à oxidação do
colesterol, principalmente se estiverem presentes ácidos graxos
polinsaturados, que são mais facilmente oxidáveis. A presença de luz, calor,
metais de transição e a exposição ao oxigênio desencadeiam o processo
oxidativo. Durante o processamento térmico e subseqüente estocagem, os
alimentos são submetidos a vários destes fatores, levando-os à oxidação.
O efeito do processamento térmico dos alimentos sobre a formação
dos óxidos de colesterol vem sendo investigado. Evidências sugerem que o
tempo e a temperatura são fatores determinantes neste processo,
influenciando diretamente' na taxa de oxidação do colesterol.
Apesar dos produtos marinhos serem importantes fontes de ácidos
graxos polinsaturados, eles ainda são relativamente pouco estudados neste
particular. Os moluscos e crustáceos, além da presença de ácidos graxos
polinsaturados, apresentam níveis elevados de colesterol, possuindo
portanto um grande potencial para formação de óxidos. O camarão, em
particular, possui teores de colesterol variando entre 90 e 200mg/1 OOg.
VOI:JWOOI1BIB OVSIA3~ ·Z I _
Revisão de Literatura 2
2.1. OXIDAÇÃO DO COLESTEROL EM ALIMENTOS
2.1.1. FORMAÇÃO DOS ÓXIDOS DE COLESTEROL
A estrutura química do colesterol (Figura 2.1) é composta por um
núcleo policíclico com quatro anéis ligados (A, 8, C e D), uma cadeia lateral
hidrocarbônica ramificada ligada ao C-17 do anel D, um grupo hidroxila 13-
orientado ligado ao C-3 do anel A, e uma dupla ligação entre o C-5 e o C-6
do anel B. Uma parte do colesterol presente nos alimentos encontra-se
esterificada, isto é, o grupo hidroxila que se projeta do C-3 é ligado a um
resíduo de ácido graxo através de uma ligação éster (Figura 2.2). De
relevância para a autoxidação são a insaturação do anel 8 e a presença de
dois carbonos terciários na cadeia lateral, o C-20 e o C-25 (MAERKER,
1987).
OH
Figura 2.1. Estrutura química do colesterol.
o colesterol , bem como os demais esteróis, pode ser oxidado pelas
vias enzimática e não-enzimática. A enzimática ocorre no organismo vivo,
predominantemente no fígado e nos tecidos geradores de hormônios
esteróides. Dentre os mecanismos de oxidação não-enzimática, a
autoxidação é a mais amplamente estudada e a de maior relevância em
alimentos. Os produtos formados durante a autoxidação, muitas vezes são
exatamente os mesmos · produzidos pela oxidação enzimática, dada a
Revisão de Literatura 3
semelhança entre estes dois processos e a coincidência dos sítios de
oxidação (SMITH, 1990).
o II
R-C-O
Figura 2.2 Estrutura química do colesteril éster.
o mecanismo de iniciação da oxidação do colesterol ainda é obscuro,
mas parece estar ligado à formação de um radical no carbono alílico C-7
(Figura 3), produzido pela ação de outro radical ou por radiação ionizante
(MAERKER, 1987; SMITH, 1990). Este radical reage com uma molécula de
oxigênio triplete e02) gerando o radical peroxila que, pela fixação de um
hidrogênio, se estabiliza produzindo as formas epiméricas 7 a- e 7J3-
colesterol hidroperóxido. Os dois epímeros inicialmente se encontram em
equilíbrio, mas a forma J3 é termodinamicamente mais estável que a a e a
interconversão ocorre facilmente. A decomposição térmica dos 7-
hidroperóxidos produz o 7 a- e 7J3-hidroxicolesterol e o 7 -cetocolesterol que,
por desidratação, forma o colesta-3,5-dieno-7-ona. O peróxido de hidrogênio
(H20 2) e os hidroperóxidos, produzidos ao longo do processo oxidativo,
atuam como oxidantes do colesterol, produzindo 5,6 epóxidos de colesterol,
com a forma J3 predominando. A hidratação dos epóxidos produz o
colestanotriol que ainda pode ser oxidado a 3J3,5-di-hidroxi-5a-colestano-6-
ona (SMITH, 1987; 1990).
Revisão de Literatura
• •
00 • 25-Colesterol-hidroperóxido OOH 25-Hidroxicolesterol HO
Oxldaçlo da Cadela Lateral
------- -l--:~~----~ ---------:;~----------------:~~~---------------::,~ --------
# ,(,I~ ~ ,(,I~ .~ ~ ~~
H HO :::".. HO:::'" HO:::'" OOH Colesterol 00 •
H202
\.-.
H o
CaH17
5a.- and ~ Epoxicolesterol
H
Colestanotriol HO HO
Radical Peroxila
CaH17
CaH17 '!,h _roa ...... H~ ~
7 a.- and 713-Colesterol hidroperóxido
7a.- and 7J3-Hidroxicolesterol
7 -Cetocolesterol
Figura 3. Produtos da oxidação do colesterol
4
Na molécula de colesterol, a presença da dupla ligação no C-5 afeta a
conformação dos anéis A e B, trazendo as posições alílicas do C-4 e C-7
para o plano da dupla ligação. Desta forma, o início da oxidação poderia se
dar em qualquer um dos dois carbonos com a mesma facilidade, mas não é
o que acontece. A reação raramente ocorre no C-4 devido ao impedimento
estérico provocado pela presença do grupo hidroxila no C-3 e do grupo triacil
substituído no C-5 (MAERKER, 1987). Apesar do radical peroxila ser mais
facilmente formado no C-7, ele pode também ser produzido por transferência
Revisão de Literatura 5
de elétrons em outros sítios, como acontece nos carbonos da cadeia lateral.
A partir daí, é gerada uma série de derivados oxidados, o 20-, 24-, 25-, 26- e
27 -hidroperóxidos de colesterol que, por degradação, produzem os
hidróxidos de colesterol correspondentes. A reação na cadeia lateral ocorre
preferencialmente nos carbonos terciários C-20 e C-25 (MAERKER, 1987;
SMITH, 1990).
Modelos experimentais onde o colesterol se encontra na forma sólida
têm sido os mais pesquisados, embora seja de maior interesse o estudo do
colesterol em solução ou dispersão aquosa, uma vez que, tanto em
alimentos como em seres vivos, ele se encontra em meio aquoso
(GUARDIOLA et aI., 1996). O padrão oxidativo do colesterol nestes dois
sistemas é diferente. A oxidação da cadeia lateral, por exemplo, somente
ocorre quando o colesterol se encontra em estado sólido, exceto nos C-20 e
C-25 (MAERKER, 1987). Já a formação das formas epiméricas do 5,6-
colesterol epóxido ocorre tanto no estado cristalino quanto em solução ou
dispersão (MAERKER, 1987). Segundo SMITH (1987), quando o colesterol
se encontra no estado cristalino e na presença de oxigênio, a reação de
oxidação é conduzida pelo arranjo de moléculas no cristal. Assim, as
moléculas de colesterol são organizadas em camadas duplas como os
grupos 3-hidroxil justapostos e a cadeia lateral exposta (SMITH, 1987).
Desta forma, a oxidação da cadeia lateral seria facilitada.
Em adição à autoxidação, existem outros dois mecanismos de
oxidação não-enzimática, a peroxidação lipídica e a oxidação fotoquímica. A
peroxidação lipídica é de muita importância na oxidação do colesterol em
alimentos e implica na presença de ácidos graxos insaturados que serão
oxidados previamente. O processo difere da autoxidação basicamente na
sua iniciação, que está vinculada à formação de radicais hidroperóxidos ou
peróxidos cíclicos oriundos da oxidação lipídica catalisada por enzimas.
Esses radicais desencadeiam a oxidação do colesterol gerando os mesmos
Revisão de Literatura 6
produtos da autoxidação do anel B (70.- e 7J3-hidróxidos, 5,60.- e 5,6J3-
epóxidos, 7 -cetocolesterol e colestanotriol).
A oxidação fotoquímica ocorre quando o colesterol é exposto à luz na
presença de oxigênio, levando à formação do oxigênio singlete (102),
espécie eletronicamente excitada, gerada a partir do oxigênio molecular
triplete e02). São formados hidroperóxidos que iniciam o processo oxidativo
do colesterol (SMITH, 1990).
Mais de 60 óxidos de colesterol, alguns compostos voláteis e o
peróxido de hidrogênio já foram identificados como produtos da oxidação do
colesterol. Muitos outros ainda permanecem desconhecidos. Fatores como
temperatura, estado físico do colesterol, pH, presença de água e substratos
para a oxidação afetam a formação dos óxidos de colesterol em um dado
sistema (KIM & NAWAR, 1993). Os estudos em alimentos envolvem
geralmente o mesmo grupo de óxidos: 70.- e o 7J3- hidroxicolesterol, 7-
cetocolesterol, 25-hidroxicolesterol, colestanotriol , 5,60.- e o 5,6J3-epóxidos
(KIM & NAWAR, 1991; CHEN & CHEN,1994; PARK et aI., 1996). Outros
componentes resultantes das reações de oxidação, como cetonas e
compostos voláteis também são formados pela oxidação do colesterol , mas
geralmente não são detectados pelos métodos utilizados nestes estudos. A
identificação de todos os óxidos de colesterol formados não é usual, sendo
de pouco interesse em alimentos (SMITH, 1996).
2.1.2. FATORES PREDISPONENTES
O colesterol é instável sob uma grande variedade de condições, como
luz, calor, radiação, presença de radicais livres, oxigênio e metais de
transição (KIM & NAWAR, 1993; RANKIN & PIKE, 1993; PANIANGVAIT et
aI., 1995). Alguns parâmetros são comumente investigados como possíveis
influenciadores da oxidação do colesterol, favorecendo a sua reação. Os de
Revisão de Literatura 7
maior relevância são a presença de oxigênio e de ácidos graxos
polinsaturados e o efeito da temperatura de processamento.
2.1.2.1. Oxigênio
A oxidação do colesterol pelo · oxigênio triplete e02) é a mais bem
estudada e quantitativamente o processo predominante. Entretanto, existem
outras espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete C O2), o íon
superóxido, o peróxido de hidrogênio, o radical hidroxil e o ozônio (03), que
também oxidam o colesterol. Estas espécies de oxigênio podem ser geradas
normalmente "in vivo" ou como produtos decorrentes da alteração do
metabolismo (SMITH, 1987; 1990).
Várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas verificando a influência do
oxigênio na formação de derivados oxidados do colesterol. LEBOVICS et ai.,
(1994) realizaram um estudo com ovo em pó irradiado e observaram que a
formação de derivados do colesterol pôde ser significativamente reduzida,
quando o oxigênio foi excluído durante a irradiação e a estocagem. A
utilização da embalagem a vácuo ainda melhorou a retenção de "flavor" do
produto.
SHOZEN et aI. (1997) avaliaram o efeito da presença do oxigênio na
oxidação do colesterol, durante a estocagem de anchova, e concluíram que
a combinação de embalagem à vácuo e o uso de um seqüestrador de
oxigênio foi o método mais efetivo no retardamento da formação de óxidos.
As amostras sob estas condições, estocadas por 165 dias a 25°C,
apresentaram concentrações de óxidos de colesterol similares ao controle
não protegido contra o ar atmosférico e estocado por 14 dias.
GUARDIOLA et ai. (1997) observaram maior formação de óxidos de
colesterol em ovos desidratados por "spray-drying", quando não foi utilizada
a embalagem à vácuo durante a estocagem.
Revisão de Literatura 8
Segundo os resultados mencionados anteriormente, principalmente
durante a estocagem do alimento, a exclusão do oxigênio é recomendável
não só para evitar a oxidação do colesterol, como também a oxidação
lipídica de um modo geral, prevenindo assim a formação de compostos que
interferem nas características organolépticas e nutricionais do produto,
diminuindo a sua vida-de-prateleira.
2.1.2.2. Presença de ácidos graxos polinsaturados
o colesterol está presente nos alimentos intimamente associado a
outros componentes. Suas moléculas são parte integrante da bicamada
lipídica da membrana celular, estando associadas aos fosfolípides.
Interações entre o colesterol e outros componentes celulares podem afetar
sua estabilidade oxidativa e o curso de sua oxidação (SMITH, 1987; KIM &
NAWAR, 1993). A presença de ácidos graxos polinsaturados tem sido
associada com a oxidação do colesterol em alimentos (KIM & NAWAR,
1991 ; OHSHIMA et aI., 1993; LI et aI., 1994; LI et aI., 1996). Os ácidos
graxos polinsaturados são mais susceptíveis à peroxidação, sendo
facilmente incorporados dentro da cadeia da oxidação lipídica com formação
de radicais livres e hidroperóxidos. SMITH (1987) sugeriu que os
hidroperóxidos formados durante a oxidação de ácidos graxos
polinsaturados são necessários para iniciar a oxidação do colesterol.
Segundo o autor, a oxidação do colesterol em alimentos e sistemas
biológicos segue um caminho análogo à oxidação dos ácidos graxos,
podendo ser intermolecular ou intramolecular. Em sistemas intermoleculares,
os radicais oxil e peroxil de ácidos graxos polinsaturados (fosfolípides)
adjacentes ao colesterol na membrana celular extrairiam um átomo de
hidrogênio do colesterol, iniciando o processo oxidativo. Nos sistemas
intramoleculares , a oxidação se daria pelo ataque da porção acil sobre a
porção colesteril, dentro da mesma molécula de colesteril éster (SMITH,
1987).
Revisão de Literatura 9
Para elucidar as interações oxidativas do colesterol com os
triacilgliceróis, KIM & NAWAR (1991), OHSHIMA et ai. (1993) e OSADA et
ai. (1993a) criaram sistemas modelo contendo colesterol puro, misturas de
colesterol e triacilgliceróis elou mistura de colesterol com ácidos graxos
saturados e insaturados, que foram submetidos a diferentes procedimentos.
No estudo de KIM & NAWAR (1991 l, o sistema foi aquecido a 130°C por
períodos variáveis. Foi observado que a presença dos triacilgliceróis e dos
ácidos graxos acelerou a oxidação do colesterol, sendo que o perfil dos
óxidos produzidos variou qualitativamente entre os sistemas. OHSHIMA et
ai. (1993) submeteram as amostras à estocagem por 104 dias, a 25° C, e ao
final do experimento, onde foi usado o colesterol puro, nenhum óxido foi
encontrado. Em contrapartida, nas misturas contendo colesterol e
triacilgliceróis, a formação de óxidos de colesterol já era observada a partir
do 24º dia de estocagem. Resultados semelhantes foram encontrados por
OSADA et aI. (1993a), quando submeteram o sistema ao aquecimento a
100°C, por 24 horas. Foi observado que o colesterol era estável e
essencialmente não produzia nenhum óxido quando aquecido isoladamente.
Entretanto, quando na presença de gorduras, o colesterol era instável, em
particular quando aquecido com gorduras insaturadas. Neste caso, o
conteúdo de colesterol era reduzido e os óxidos eram gerados rapidamente.
A partir dos resultados relatados, os autores concluíram que a
peroxidação lipídica precede a oxidação do colesterol e sugeriram que o
grau de in saturação dos lípides presentes no alimento, pode influenciar o
tipo de óxido a ser formado.
Para confirmar os resultados anteriores e dar continuidade aos
estudos, LI et aI. (1994) demonstraram que a estabilidade oxidativa diminuía
com o grau de insaturação dos triacilgliceróis do óleo de sardinha. O
acúmulo de óxidos de colesterol coincidia com a diminuição dos ácidos
graxos polinsaturados dos triacilgliceróis. A redução do grau de insaturação
foi efetiva no prolongamento do período de indução da oxidação do
Revisão de Literatura 10
colesterol, mas não teve nenhum efeito após esta fase. Obtendo resultados
concordantes, LI et ai. (1996) realizaram um estudo comparativo entre a
formação de óxidos de colesterol em óleo de peixe e em vários óleos
vegetais, com diferentes graus de insaturação, todos adicionados de
colesterol. Depois de 35 dias de estocagem, foi observada maior formação
de óxidos no óleo de peixe, rico em polinsaturados, e a menor no óleo de
palma, rico em ácidos graxos saturados. A diferença na susceptibilidade da
oxidação do colesterol nestas condições, foi atribuída aos diferentes graus
de insaturação dos triacilgliceróis dos óleos analisados.
2.1.2.3. Temperatura
A produção de óxidos de colesterol induzida pelo aquecimento tem
sido relatada em vários alimentos, como carnes processadas (HIGLEY et aI.,
1986a; PIE et ai., 1991 ; KESAVA-RAO et aI., 1996), leite (ROSE-SALLlN et
aI., 1995) e ovo em pó (TSAI & HUDSON, 1984; GUARDIOLA et aI., 1997),
banha (PARK & ADDIS, 1986a, 1986b; CHEN et aI., 1994) e óleos (LI et aI.,
1996b).
A taxa de oxidação do colesterol difere de acordo com a temperatura,
o tempo de aquecimento e a forma de exposição ao calor (PIE et aI., 1991;
MORGAN & ARMSTRONG, 1992; OSADA et aI., 1993a; KESAVA-RAO et
aI., 1996). OSADA et aI. (1993a) observaram a formação de óxidos e a
estabilidade do colesterol em diferentes temperaturas. Depois de 24 horas
de aquecimento foi observado que a 100°C o colesterol se mostrava
bastante estável, não produzindo nenhum óxido. A 120°C a oxidação
começou a ocorrer de forma gradativa até que, a 150°C, atingiu o seu
máximo em 12 horas. Acima desta faixa, a oxidação voltava a ser
insignificante, sendo que na de 200°C, o colesterol foi totalmente
carbonizado após 6 horas de aquecimento. Estes resultados indicam que
próximo às temperaturas de cozimento (100°C) o colesterol é bastante
Revisão de Literatura 11
estável, sendo facilmente oxidado em temperaturas mais elevadas, como
aquelas usualmente utilizadas em produtos assados e frituras (120 - 150°C).
o estado físico do colesterol também determina sua susceptibilidade
à oxidação durante o aquecimento. O colesterol no estado sólido apresenta
uma resistência maior à oxidação do que em solução. À medida que a
temperatura se aproxima do ponto de fusão do colesterol (148,5°C),
observa-se que a taxa de oxidação cresce. A 150°C e 180°C, já no estado
líquido, 80% do colesterol inicial desaparece dentro de uma hora de
aquecimento (KIM & NAWAR, 1993).
O efeito do tempo e da temperatura de processamento sobre a
composição dos óxidos de colesterol têm sido investigado. CHIEN et aI.
(1998) avaliaram a formação dos óxidos de colesterol, individualmente,
durante aquecimento a 150°C, por 30 minutos. Os autores observaram que
tanto os 7 -hidroperóxidos quanto os 7 -hidróxidos aumentavam sua
quantidade discretamente, durante os primeiros minutos de aquecimento,
atingindo posteriormente um platô. O 7 -cetocolesterol e os epóxidos foram
os únicos que aumentaram a sua concentração durante todo o período de
aquecimento.
PARK & ADDIS (1986b) também relataram uma linearidade na
formação de 7 -cetocolesterol e 5a-epoxicolesterol com o tempo de
aquecimento em temperatura próxima a 150°C. OSADA et ai. (1993a)
submeteram o colesterol ao mesmo aquecimento e, concordando com os
resultados de PARK & ADDIS (1986b), encontraram o 7-cetocolesterol como
maior produto da oxidação, seguido pelo 5a- e 5~-epóxidos e o 7 a- e 7~-
hidróxidos. Por outro lado, com o aquecimento do colesterol a 120°C, o 7-
cetocolesterol foi o produto predominante, sendo marginal a formação dos
demais óxidos.
Revisão de Literatura 12
Muitas vezes, o alimento é exposto ao aquecimento por períodos
curtos. Neste caso, haverá apenas a formação dos óxidos oriundos da
oxidação do C-7 (7-cetocolesterol, 70.- e 7~-hidróxidos, 70.- e 7~
hidroperóxidos), não havendo tempo hábil para que sejam produzidos os
compostos secundários, como o ~- epóxido e o colestanotriol (PIE et aI.,
1991 ).
A forma de exposição ao calor também se constitui um fator importante
na oxidação do colesterol, sendo que os níveis de óxidos têm se mostrado
maiores nos alimentos submetidos ao aquecimento direto em relação
àqueles submetidos ao aquecimento indireto (MORGAN & ARMSTRONG,
1992).
Desta forma, os estudos apresentados indicam que a temperatura é, de
fato, determinante no processo de oxidação do colesterol. Assim, alimentos
submetidos a processos tecnológicos que envolvam exposições drásticas ao
calor apresentam um grande potencial para produção . de óxidos de
colesterol, merecendo por isso a atenção correspondente.
2.2. EFEITOS BIOLÓGICOS DOS ÓXIDOS DE COLESTEROL
Em 1976, IMAI e colaboradores relataram que a purificação do
colesterol estocado por cinco anos, antes de sua administração em ratos,
prevenia o aparecimento de lesões aterogênicas. Quando o colesterol
estocado não era purificado, havia o desenvolvimento de lesões
degenerativas e necróticas nas células musculares lisas dos animais. As
impurezas presentes foram identificadas como produtos da oxidação, onde
os maiores componentes eram o 25-hidroxicolesterol, colestanotriol,
colesterol a-epóxido, 7 -cetocolesterol e 7 -hidroxicolesterol.
Revisão de Literatura 13
Os óxidos de colesterol são esteróis similares em estrutura ao
colesterol, contendo um grupo adicional que pode ser uma hidroxila, cetona
ou epóxido, ligado ao núcleo esterol ou um grupo hidroxila ligado à cadeia
lateral. Podem ser formados no próprio organismo, através de processos
oxidativos endógenos, ou estar presentes nos alimentos.
Estudos desenvolvidos em ratos e coelhos indicaram que os óxidos de
colesterol presentes na dieta podem ser absorvidos pelo intestino, sendo
encontrados em quilomícrons e lipoproteínas (BASCOUL et ai., 1985; PENG
et ai., 1991; OSADA et ai., 1994; VINE et ai., 1997). Em 1991 , EMANUEL e
colaboradores desenvolveram o primeiro estudo em humanos. Esses
autores prepararam uma dieta à base de ovo em pó, rica em óxidos de
colesterol, e observaram níveis máximos no plasma e quilomícrons, entre
duas e quatro horas após a ingestão, observando uma grande variação
individual entre os óxidos encontrados.
Em ratos, foi relatado que a absorção dos óxidos de colesterol também
variou muito, sendo de 6% para o total dos óxidos até 90% para o
colestanotriol e o colesterol 5-epóxido, individualmente (BASCOUL et aI.,
1986).
OSADA et ai. (1994) encontraram para o total de óxidos uma absorção
de 30% contra 67% observada para o colesterol puro. Neste estudo foi
avaliada a absorção linfática dos óxidos de colesterol em ratos, 24 horas
após a sua administração. O 7f3-hidroxicolesterol, colesterol f3-epóxido e 7a
hidroxicolesterol apresentaram taxas maiores de absorção, 42, 32 e 30%,
respectivamente, seguidos pelo colesterol a-epóxido, 27,5%, colestanotriol,
15%, e, por último, o 7 -cetocolesterol, com 12%.
Vários estudos têm sido desenvolvidos a fim de elucidar as
conseqüências toxicológicas da presença dos óxidos de colesterol no
organismo. Autores como SMITH & JOHNSON (1989), KUMAR & SINGHAL
Revisão de Literatura 14
(1991), SOSINGER et ai. (1993), GUARDIOLA et aI. (1996) e LlNSEISEN &
WOLFRAM (1998) reuniram os estudos referentes ao efeitos biológicos dos
óxidos de colesterol publicados nas três últimas décadas.
Existem evidências da participação dos óxidos de colesterol em vários
processos, caracterizando-os como citotóxicos (OHTANI et aI., 1996; 1997),
mutagênicos (SEVANIAN & PETERSON, 1986) , aterogênicos (PENG et aI.,
1991) e cancerígenos (KENDALL et ai., 1992). Embora a implicação destes
óxidos com o câncer seja um fator bastante alarmante, é o envolvimento na
aterosclerose humana que domina a literatura. Dentro deste processo, foram
evidenciadas alterações provocadas pelos óxidos de colesterol, onde
destacam-se:
./ alteração da permeabilidade vascular do endotélio, aumentando a
penetração de diferentes componentes do plasma, como íons, LDL ou
quilomícrons remanescentes (PENG et ai., 1991);
./ diminuição da síntese de prostaciclinas (essenciais para a integridade
vascular), favorecendo a agregação plaquetária e a formação de trombos
(HU et ai., 1990);
./ alteração da funcionalidade dos receptores da LDL, interferindo no
metabolismo do colesterol, podendo levar à hipercolesterolemia
(GOLDSTEIN et ai., 1983);
./ inibição da HMG-CoA redutase (3-hidroxi,3-metilglutaril Coenzima A
redutase), diminuindo a síntese de colesterol endógeno (SMITH &
JOHNSON, 1989);
./ acúmulo de colesteril éster, pela ativação da ACAT - colesterol
aciltransferase CoA, em diferentes células, levando à formação de
Revisão de Literatura 15
células espumosas, peça-chave para o desencadeamento do processo
aterosclerótico (PENG et ai., 1991; GUARDIOLA et aI., 1996).
Embora a hipercolesterolemia esteja associada à aterosclerose,
raramente se tem identificado o envolvimento do colesterol como agente
iniciador, ao contrário do colesterol oxidado, principalmente o LDL,
geralmente envolvido no referido processo (IMAI et aI., 1976; PENG et aI.,
1991 ).
Em 1968, quando COOK e colaboradores utilizaram, pela primeira vez,
óxidos de colesterol para desenvolver aterosclerose experimental, o
colestanotriol foi identificado como agente mais tóxico. Ainda hoje,
juntamente com o 25-hidroxicolesterol, são considerados os mais tóxicos
produtos da oxidação do colesterol, em relação à aterosclerose (TAYLOR,
1979; PENG etal., 1991).
Quanto à ação mutagênica e carcinogênica dos óxidos de colesterol,
nenhum estudo relevante foi relatado nos últimos anos (GUARDIOLA et aI. ,
1996). Ensaios in vitro foram desenvolvidos desde a década de 70, tentando
associar a presença dos óxidos com o desenvolvimento de vários tipos de
câncer. Evidências sugerem principalmente a participação dos epóxidos e do
colestanotriol neste processo (BLACK & DOUGLAS, 1972; KENDALL et aI.,
1992). SEVANIAN & PETERSON (1986) confirmaram através de ensaios in
vitro a ação mutagênica do colesterol epóxido.
Revisão de Literatura
2.3. METODOLOGIA UTILIZADA NA DOSAGEM DE ÓXIDOS DE
COLESTEROL
16
o interesse no desenvolvimento de métodos analíticos sensíveis, para
a determinação qualitativa e quantitativa dos óxidos de colesterol, vem
crescendo nos últimos anos. Ainda assim, não há um método padrão oficial
proposto que reuna precisão, seletividade e rapidez para a análise destes
compostos.
Os métodos de extração e análise variam muito de um estudo para
outro e muitas vezes torna-se impraticável a comparação dos resultados
obtidos com os da literatura, ainda que sejam referentes a um mesmo
produto (CARERI et aI., 1998; ULBERTH & ROSSLER, 1998).
A quantificação do colesterol e dos seus óxidos em alimentos envolve
basicamente técnicas cromatográficas como a de camada delgada - TLC
(SMITH, 1967; LEBOVICS et ai., 1992), gás-líquido - CGL (PARK & ADDIS,
1986a; WALTON et al.,1989; NOUROOZ-ZADEH, 1990), a gasosa - CG
(PIE et a/., 1991; OHSHIMA et aI., 1993; OSADA et aI., 1993b) e a líquida de
alta eficiência - HPLC (ANSARI & SMITH, 1979; PARK & ADDIS, 1985;
ROSSI et aI., 1993; PENAZZI et aI., 1995).
A TLC é primariamente uma técnica qualitativa e sua atividade é muitas
vezes limitada devido à grande superfície percorrida pela amostra, sob
exposição à luz e ao oxigênio, podendo levar à formação de óxidos não
originalmente presentes (PARK & ADDIS, 1985; CSALLANY et ai., 1989;
CHEN & CHEN, 1994). LEBOVICS et ai. (1996) utilizaram a TLC obtendo
bons resultados na identificação de óxidos de colesterol com a dosagem
posterior através de um método enzimático.
A cromatografia gasosa com coluna empacotada vinha sendo utilizada
na análise de óxidos de colesterol, mesmo não possuindo uma resolução
Revisão de Literatura 17
satisfatória. Posteriormente, o desenvolvimento da coluna capilar permitiu
uma melhor resolução (MAERKER & UNRUH, 1986; MAERKER, 1987). A
utilização de CG capilar acoplada a um espectrômetro de massa tem sido
indicado como melhor método para quantificar os óxidos de colesterol , uma
vez que a confirmação da identidade desses compostos ocorre
simultaneamente (ULBERTH & RÚSSLER, 1998). Por outro lado, a CG
requer uma purificação maior das amostras, antes da injeção, e é conduzida
sob temperaturas muito elevadas, podendo destruir compostos sensíveis ao
calor e/ou gerar substratos para oxidação (CARERI et aI., 1998).
Apesar de possuir teoricamente um poder de separação inferior ao da
CG, a HPLC tem sido bastante utilizada, tanto em fase reversa quanto em
fase normal (ANSARI & SMITH, 1979; PENAZZI et ai., 1995). A análise por
HPLC requer um tratamento simples e rápido das amostras, eliminando
etapas que podem levar a modificações no conteúdo dos óxidos (PENAZZI
et aI. , 1995). Geralmente é realizada com detetor espectrofotométrico e por
isso alguns compostos, como os epóxidos e o colestanotriol , não podem ser
quantificados por não possuírem adequada absorção no U.v. (CSALLANY et
ai., 1989; ROSE-SALLlN et ai., 1995; CARERI et aI., 1998). Neste caso,
pode ser usado outro detector, geralmente o de índice de refração (RI), mas
que é cerca de 1000 vezes menos sensível que o UV (ANSARI & SMITH,
1979; CHEN & CHEN, 1994). Recentemente, foi utilizado o detetor "Iight
scattering" que possui maior sensibilidade que os de UV e RI , pois revela a
presença de qualquer composto independente de sua estrutura molecular
(LAKRITZ & JONES, 1997; CABONI et ai., 1997).
Em alimentos, a análise de óxidos de colesterol é bastante complexa
pela presença de interferentes como o colesterol, fosfolípides, triglicérides e
outros lípides, que dificultam seu isolamento (MAERKER, 1987). Aliado a
isso, os óxidos de colesterol ocorrem em alimentos em quantidades muito
baixas, exigindo etapas preliminares de concentração a fim de facilitar sua
quantificação.
Revisão de Literatura 18
Existem várias metodologias de isolamento e purificação dos óxidos de
colesterol. A saponificação é freqüentemente utilizada para remover
triacilgliceróis neutros, ésteres de esteróis e impurezas solúveis em água
(FINOCCHIARO & RICHARDSON, 1983; PARK & ADDIS, 1986; PIE et a/.,
1990). Quando realizada a 75°C/30 minutos, em meio alcalino, desestabiliza
o 7-cetocolesterol que é prontamente convertido a colesta 3,5 dien07-ona
(MAERKER & UNRUH JR., 1986; PARK et a/., 1996). Este problema vem
sendo contornado pela utilização da saponificação a frio, realizada à
temperatura ambiente/20 horas (PARK & ADDIS, 1985; NOUROOZ-ZADEH,
1990; GUARDIOLA et a/., 1995a). PARK et alo (1996) observaram uma
recuperação de 96% do 7 -cetocolesterol submetido a essas condições de
saponificação. Apesar de ser eficiente, o tempo gasto neste tipo de
saponificação é muito extenso, dificultando o seu uso em análises de rotina
(CHEN & CHEN, 1994).
A extração em fase sólida utilizando sílica (GUARDIOLA et aI., 1995a),
Florisil (PENAZZI et a/., 1995), cartucho em fase reversa (CHEN CHEN,
1994) ou uma combinação destas mini-colunas (NOUROOZ-ZADEH, 1990)
tem sido proposta como alternativa para o isolamento e enriquecimento dos
óxidos de colesterol. Comparada à saponificação, a extração em fase sólida
é mais vantajosa por minimizar a decomposição dos óxidos de colesterol já
formados e a formação de outros óxidos e por ser realizada de forma mais
rápida, permitindo seu uso em análise de rotina, com grande número de
amostras (ULBERTH & ROSSLER, 1998).
Independente da metodologia adotada para análise dos óxidos de
colesterol, deve-se sempre atentar para que todo o procedimento analítico
seja conduzido rapidamente, de preferência em baixas temperaturas e na
ausência de luz, para que não se crie condições favoráveis à oxidação com
superestimação dos resultados (CSALLANY et a/., 1989).
Revisão de Literatura 19
2.4. 7 -CETOCOLESTEROL COMO INDICADOR DA OXIDAÇÃO DO
COLESTEROL
o 7 -cetocolesterol é um dos principais óxidos, sendo formado a partir
da desidratação do 7 -hidroperóxido ou da desidrogenação do 7-
hidroxicolesterol, sob exposição ao oxigênio (KIM & NAWAR, 1993). Tem
sido identificado em vários estudos como maior produto da oxidação do
colesterol (PARK & ADDIS, 1986a; PIE et aI., 1991; ZUBILLAGA &
MAERKER, 1991; OHSHIMA et aI., 1993; OSADA et aI., 1993a; NIELSEN et
aI., 1996a; NOVELLI et a/., 1998), embora outros óxidos, como os epóxidos
(MORGAN & ARMSTRONG,1992) e o 7-hidroxicolesterol, sejam também
encontrados em grandes quantidades. Sob aquecimento, o 7 -cetocolesterol
tem se mostrado mais estável que os demais óxidos, sendo também o
produto predominante nos estágios iniciais da oxidação (MAERKER, 1987;
KIM & NAWAR,1993; OSADA et aI., 1993a).
Tendo em vista tais características, a utilização do 7-cetocolesterol
como indicador da oxidação do colesterol tem sido sugerida por alguns
autores (GALLlNA-TOSCHI & CABONI, 1992; PENAZZI et aI., 1995; ZUNIN,
1995; 1997; RODRIGUEZ-ESTRADA et aI., 1997). Sem dúvida, a
determinação paralela de outros óxidos, também encontrados com relativa
freqüência, daria uma noção mais completa da oxidação, mas certamente
não seria realizada de forma tão simples e rápida (ZUNIN, 1995).
A quantificação do 7 -cetocolesterol foi realizada através de várias
metodologias. PENAZZI et aI. (1995) testaram dois métodos por HPLC, um
em fase normal e outro em fase reversa, em produtos preparados com gema
de ovo em pó e leite em pó. Também utilizando a HPLC em fase normal,
RODRIGUEZ-ESTRADA et aI. (1997) avaliaram o efeito de diferentes
processamentos do hambúrguer sobre a oxidação do colesterol. RANKIN &
PIKE (1993) empregaram a cromatografia gasosa, avaliando a efetividade
de antioxidantes naturais na inibição da oxidação do colesterol. ZUNIN
Revisão de Literatura 20
(1995; 1997) utilizou cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de
massa, em estudos com ovos frescos e em pó, e a HPLC para massas com
ovos. Em todos estes estudos, a determinação do 7 -cetocolesterol foi
eficiente como indicador de processo oxidativo envolvendo o colesterol , em
alimentos.
Na literatura, além dos estudos realizados em alimentos, constam
também trabalhos desenvolvidos em sistemas biológicos, onde o 7-
cetocolesterol foi quantificado juntamente com outros óxidos . No estudo de
DYER et aI. (1997) com indivíduos diabéticos, o 7-cetocolesterol foi utilizado
como indicador específico da oxidação da LDL, quantificado por
cromatografia gás-líquido.
Com bons resultados, LEBOVICS et aI. (1996) empregaram a
cromatografia em camada delgada para a separação e a determinação
enzimática posterior de óxidos de colesterol em gema de ovo em pó. Apesar
do 7 -cetocolesterol, neste caso, não ter sido utilizado como indicador da
oxidação do colesterol, é bastante concreta a possibilidade de sua detecção
pelo método simples e barato, proposto neste estudo, viabilizando a sua
utilização inclusive no controle de qualidade de alimentos em nível industrial.
2.5. OCORRÊNCIA DE ÓXIDOS DE COLESTEROL EM ALIMENTOS
o colesterol encontra-se amplamente distribuído nos alimentos de
origem animal. Dentre estes, aqueles que possuem maiores concentrações
de colesterol, como os ovos, a maioria das carnes, derivados lácteos como a
manteiga e alguns tipos de queijo serão consequentemente os mais
propensos à formação de óxidos. Por isso têm sido freqüentemente
estudados (Tabela 2.1).
Revisão de Literatura 21
Outros fatores como a presença de pró-oxidantes e antioxidantes, tipo
e condições de processamento a que será submetido o alimento e a sua
composição lipídica, também irão determinar a taxa de formação de óxidos
de colesterol (PARK & AOOIS,1986; MORGAN & ARMSTRONG,1992;
RANKIN & PIKE,1993).
Os produtos de origem vegetal possuem outros esteróis conhecidos
como fitoesteróís, estruturalmente muito semelhantes ao colesterol
(FfNOCCHfARO & RfCHARDSON, 1983).
Tabela 2.1. Alimentos em que a presença de óxidos de colesterol tem sido determinada.
Produto Referências
Produtos Finocchiaro et aI. , 1984 Rose-Sallin et aI., 1995
lácteos T sai & Hudson, 1984 Ntefsen et ai., 1996a, 1996b
Pie et aI., 1990
Ovos Lebovics & Gaal, 1992 Guardiola et aI., 1995b, 1997
Morgan & Armstrong, 1992 Zunin, 1995
Rossi et aI., 1993
De Vore, 1988 Engeseth & Gray, 1994
Carnes e Pie et ai., 1991 Kesava-Rao et ai., 1996
derivados Csallany et aI., 1989 Careri et aI., 1998
Zubillaga & Maerker, 1991 Vestergaard & Parolari, 1999
Osada et aI. , 1993b Shozen et aI., 1995; 1997
Pescado Ohshima et ai. , 1993; 1996 Candeta et aI., 1997
Chen & Yen, 1994 Wu & Lillard, 1998
Óleos Park & Addis, 1986a; 1986b Li et aI., 1996
Revisão de Literatura 22
2.5.1. PRODUTOS MARINHOS
Embora possuam atributos adequados para a formação de óxidos de
colesterol, os produtos marinhos têm sido relativamente pouco estudados.
Apenas dois grupos de pesquisa vêm relatando estudos desenvolvidos neste
sentido (OHSHIMA et aI., 1993; 1996; OSADA et aI., 1993b).
OHSHIMA et aI. (1993) determinaram a concentração do colesterol e
seus óxidos em produtos marinhos populares no Japão. Foi observada uma
grande variação na concentração total de óxidos; de 8,3 ppm, em camarão,
a 188 ppm, em anchovas, submetidos ao cozimento e posterior
desidratação. De todos os produtos analisados, as anchovas mostraram as
maiores concentrações em óxidos de colesterol.
Os óxidos predominantemente encontrados em pescado são aqueles
oriundos da oxidação do anel B, com destaque para o 70.- e 7p
hidroxicolesterol e o 7-cetocolesterol (OHSHIMA et aI., 1993; OSADA et aI.,
1993b; CHEN & YEN, 1994). Entretanto, outros óxidos, como o 25-
hidroxicolesterol e o colestanotriol, também foram encontrados em menor
proporção (SHOZEN etal., 1995; 1997; OHSHIMAetal. , 1996).
OHSHIMA et aI. (1993) e OSADA et aI. (1993b) avaliaram a formação
de óxidos de colesterol , em presença de outros lípides, e observaram que os
radicais formados a partir de ácidos graxos polinsaturados agiam como
aceleradores da oxidação. Estes autores também analisaram a composição
de ácidos graxos do pescado, a fim de demonstrar a relação entre o grau de
insaturação e a oxidação do colesterol.
Outros estudos procuraram avaliar o efeito do processamento
(SHOZEN et aI., 1995; OHSHIMA et aI., 1996) e do uso de embalagem e
antioxidantes durante a estocagem de pescado (SHOZEN et a/., 1995).
Revisão de Literatura 23
SHOZEN et ai. (1995) observaram que os peixes com maior teor de
lípides aumentavam consideravelmente a concentração de óxidos de
colesterol após o processamento, enquanto os com menor teor não
demonstravam nenhuma modificação significativa. Este resultado reafirma a
influência da composição lipídica do alimento na oxidação do colesterol.
2.5.1.1 Camarão
o consumo de camarão vem crescendo a cada ano. De acordo com
o NATIONAL FISHERIES INSTITUTE (1998), nos últimos 20 anos o
consumo per capita deste produto cresceu 66% e, em 1996, atingiu a marca
de 1, 13Kg/habitante/ano nos Estados Unidos. No Brasil, a pesca extrativa de
crustáceos atingiu em 1997 a marca de 61 mil toneladas (IBAMA, 2000). O
consumo per capita do camarão é maior nas regiões litorâneas, sendo que
em 1996 chegou a 0,78 kg/habitante/ano na região metropolitana de Belém
(IBGE, 2000).
O camarão possui um baixo teor de lípides, entre 1 e 1,5%, de
acordo com a espécie, local e época de captura (KING et aI., 1990). Grande
parte do material lipídico do camarão tem função estrutural, sendo
constituído basicamente de fosfolípide e esterol (JOHNSTON et ai., 1983;
KING et ai., 1990). A maior parte dos ácidos graxos que compõem os
fosfolípides e os esteróis são polinsaturados e só uma pequena fração é
saturada. O camarão seria, portanto, uma excelente alternativa alimentar
para pessoas com problemas cardíacos, não fosse a elevada concentração
de colesterol. De acordo com a espécie de camarão analisada, o colesterol
varia de 90 a 200 mg/100g (KRITCHEVSKY et ai., 1967; JOHNSTON et ai.,
1983; KRZYNOWEK, 1985; KING et ai., 1990).
Em relação à concentração de óxidos de colesterol em camarão, os
únicos dados existentes na literatura foram reportados por OHSHIMA et ai.
(1993), que observaram a espécie Sergestes lucens cozida e desidratada, e
Revisão de Literatura 24
LEE et ai. (1998) que analisaram camarão desidratado, de espécie não
identificada, comercializado na Korea. As concentrações de 7 -cetocolesterol
nestes camarões foram 4,0 J.l.9/g de matéria seca e 16,57J.l.9/g de lípide,
respectivamente.
SOl\I13rsO -t
I~
Objetivos 25
./ Avaliar a qualidade do camarão-rosa fresco comercializado no mercado
local, principalmente com relação à ocorrência de 7 -cetocolesterol;
./ Avaliar o efeito de processamentos térmicos usuais sobre a formação do
7-cetocolesterol, em camarão-rosa.
SoaO.L;t1N 3 'VI~3.L VIN at
I~
Material e Métodos 26
As operações que envolvem a pesca industrial do camarão-rosa -
chegada dos barcos aos bancos de pesca, captura do camarão e retorno à
terra - são demoradas.
o barco só retorna à terra, em princípio, quando tiver capturado um
volume de camarão que seja economicamente viável. Daí, este camarão é
conduzido aos pontos-de-venda, onde, dependendo do volume
comercializado, ainda pode permanecer por mais tempo armazenado.
Durante este período, o camarão precisa estar adequadamente
acondicionado (sob refrigeração ou congelamento), para que mantenha
condições apropriadas de consumo.
Muitas vezes, porém, as operações de manuseio e armazenagem,
tanto a bordo quanto em terra, não são as mais adequadas, afetando a
qualidade do produto. Em particular, a oxidação lipídica é um dos processos
mais importantes decorrentes de uma manutenção inadequada do pescado
em geral, resultando num rápido comprometimento da qualidade. Neste
caso, se incluiriam os processos oxidativos envolvendo o colesterol.
Com base no que foi exposto anteriormente, o planejamento do
presente trabalho foi cumprido em duas fases. Inicialmente, foram
analisadas amostras de camarão-rosa, tidas comercialmente como frescas,
objetivando avaliar em que condições este produto chega ao consumidor,
tanto em relação à oxidação do colesterol quanto aos demais processos
deteriorativos.
Em uma segunda etapa, o camarão-rosa fresco foi processado
termicamente, através de cozimento e fritura, observando-se o efeito destes
tratamentos em relação à oxidação do colesterol.
Material e Métodos 27
4.1 MATERIAL
Duas espécies de camarão do gênero Penaeus são conhecidos
comercialmente como camarão-rosa, o Penaeus brasiliensis (Figura 4.1.) e
o Penaeus paulensis (Figura 4.2). Estas espécies apresentam diferenças
sutis entre si e são comercializadas juntas, com o nome genérico de
camarão-rosa.
Figura 4.1. Camarão da espécie Penaeus brasiliensis
Figura 4.2. Camarão da espécie Penaeus paulensis.
Material e Métodos
o camarão-rosa foi adquirido em peixarias, feiras
supermercados do município de São Paulo -SP, entre
28
livres e
abril e
setembro/1999. Foram analisados na primeira etapa 6 lotes de camarões
(300g cada) de diferentes procedências, sendo a maioria oriunda do Estado
de Santa Catarina. Os camarões foram classificados comercialmente como
camarão-rosa médio, com tamanhos aproximados de 13-15 cm de
comprimento e peso variando entre 30 e 33g. Na segunda etapa, foram
processados 4 lotes (1 kg cada) obtidos em um mesmo estabelecimento, em
momentos diferentes durante o período compreendido entre 6 de julho e 28
de setembro. A escolha deste estabelecimento, no caso, o mercado central ,
foi realizado em função dos resultados obtidos na etapa anterior, sendo
selecionado o local cujas amostras apresentaram melhor qualidade.
O camarão foi trazido ao laboratório em saco plástico, envolto em gelo
triturado, numa caixa de isopor. Toda a limpeza (retirada do exoesqueleto,
cefalotórax e intestino) foi realizada no laboratório (Figura 4.3). Em seguida
o camarão foi triturado em um homogeneizador até a formação de uma
massa homogênea.
O camarão não foi lavado em água em nenhuma das etapas, a fim de
não alterar as características microbiológicas do produto. As partes
porventura contaminadas durante a remoção do cefalotórax, foram
removidas. Os lotes que seriam submetidos aos processamentos, foram
divididos em dois grupos: cozido e frito, e, em seguida analisados (Figura
4.4). Durante o manuseio das amostras, foram adotados procedimentos
adequados para não descaracteriza'-Ias, química e microbiologicamente.
O hexano (Aldrich - 110-54-3) e o isopropanol (EM Science - PX1838-1)
usados foram de grau HPLC. O colest-5-ene-3J3-01 (colesterol - C8667) e o
3J3-hidroxicolest-5-ene-7-one (7-cetocolesterol - C2394)) foram adquiridos
da Sigma Chemical Co. Os demais reagentes utilizados nas análises foram
de grau ACS.
Material e Métodos 29
Figura 4.3. Camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis) antes e após a limpeza.
Figura 4.4. Camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis) submetido ao cozimento e
fritura.
Material e Métodos 30
4.2 MÉTODOS
4.2.1. PROCESSAMENTO DO CAMARÃO
O camarão-rosa fresco foi submetido ao cozimento e à fritura,
processamentos esses usuais na preparação deste produto. Todo o
processamento, como o restante das análises, foi realizado em triplicata.
Nos dois tratamentos, o ponto final fixado foi a temperatura interna do
produto, entre 75 e 80°C, medida através de termômetro comum.
4.2.1.1. Cocção
Foi conduzida em água sem nenhuma adição de condimento. Cerca
de 100 ml de água destilada foram colocados em um béquer de vidro e
aquecidos em uma manta elétrica. Em seguida, o camarão foi adicionado à
água fervente, permanecendo ali por cerca de 4 minutos. A temperatura da
água foi monitorada durante todo o processo. Quando da adição do
camarão, a temperatura sofreu uma redução para 92-94°C, retornando ao
nível inicial depois de 1 minuto. Ao final, o volume de água foi medido em
proveta e uma alíquota retirada para as análises de colesterol e 7-
cetocolesterol.
4.2.1.2. Fritura
A fritura foi realizada sem adição de condimento, em óleos de soja e
girassol, a 140°C, por 3 minutos, empregando uma fritadeira elétrica
Moulinex T49, com tempo e temperatura programáveis. O processamento foi
conduzido sem a reutilização do óleo. Antes de ser descartado, uma
alíquota do óleo usado foi coletada para as análises de colesterol e 7-
cetocolesterol.
Material e Métodos 31
4.2.2. DETERMINAÇÃO DE UMIDADE
Baseada na perda de peso da amostra submetida a aquecimento em
estufa, a 105°C (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMIST,
1995).
4.2.3. DETERMINAÇÃO DE lÍPIDES TOTAIS
Com base na extração lipídica com clorofórmio/metanol e
quantificação gravimétrica (BLlGH & DYER, 1959).
4.2.4. PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS
Para preparação dos ésteres metílicos de ácidos graxos, foi utilizado
o método de HARTMAN & LAGO (1973). O processo iniciou-se com a
transferência de 1 ml da fração lipídica obtida em 4.2.3 para um tubo de
vidro com tampa esmerilhada. Depois de evaporar o clorofórmio sob
atmosfera de nitrogênio, adicionaram-se 2ml de solução de hidróxido de
sódio O,5N em metanol e aqueceu-se em banho-maria fervente por 5
minutos. Em seguida, adicionaram-se 6ml da mistura para esterificação
aquecendo-se por mais 3 minutos. Depois de esfriar, adicionaram-se 5 ml
de água destilada, agitando-se os tubos por 1 minuto. Os ésteres metílicos
foram extraídos com 3 lavagens sucessivas com hexano (2ml cada),
transferindo-se a fase orgânica para outro tubo. À fase orgânica
adicionaram- se 5ml da solução saturada de bicarbonato de sódio, agitando
se por 1 minuto e transferindo-se novamente a fase orgânica para outro
tubo. Seguiu-se a evaporação do solvente em roto-evaporador à
temperatura de cerca de 40°C. Os ésteres metílicos obtidos foram
ressuspensos em 1 ml de hexano, de onde retiraram-se as alíquotas para
injeção no cromatógrafo.
Material e Métodos 32
Foi utilizado um cromatógrafo a gás modelo HP 6890, equipado com
detetor de ionização de chama, coluna capilar de sílica fundida (Supelcowax
10), com 30m de comprimento e 0,25mm de diâmetro interno. As condições
cromatográficas foram as seguintes: coluna isotérmica à temperatura de
230° C, vaporizado r à temperatura de 250°C, detetor à temperatura de 250°
C, e utilização de hélio como gás de arraste, com fluxo de 1 ml/min. A
identificação dos ácidos graxos foi realizada pela comparação dos tempos
de retenção dos ésteres metílicos dos ácidos graxos das amostras com os
dos padrões correspondentes. Os resultados foram calculados em
percentagem de área.
4.2.5. DOSAGEM DE BASES VOLÁTEIS TOTAIS (BVT)
Baseada na dosagem de compostos nitrogenados básicos voláteis
como a trimetilamina, dimetilamina e amônia oriundos da deterioração
enzimática autolítica ou bacteriana (ANAL YTICAL METHODS COMMITTEE,
1979).
4.2.6. DETERMINAÇÃO ELETROMÉTRICA DO pH
Realizada segundo as Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz,
(1985).
4.2.7. SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)
Foi utilizada a técnica de Vyncke (1970), que tem por base a reação
entre o ácido tiobarbitúrico e as diversas substâncias resultantes da
oxidação lipídica, sendo o malonaldeído o principal produto. A curva de
calibração foi construída utilizando-se o TEP (tetraetoxipropano) como
padrão e os resultados foram expressos em mg de malonaldeído I kg de
amostra.
Material e Métodos 33
4.2.8. ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
Foram realizadas as provas de contagem total de mesófilos - CTM e
contagem total de psicrotróficos - CTP, segundo MATURIN & PULER (1995)
e COUSIN et aI. (1992), respectivamente.
4.2.9. DOSAGEM DE COLESTEROL E 7 -CETOCOLESTEROL
Foi utilizado um sistema de HPLC Shimadzu, modelo SCL-10Avp,
equipado com detetor "diode array" SPD-M10Avp , sistema de bombas LC-
10ADvp e injetor automático de amostras SIL-10ADvp. Foi empregado o
método de CSALLANY et aL, (1989) utilizando uma coluna de sílica, J.l
Porasil 30 x 0,39 cm (Waters Associates), diâmetro de poro de 10J.lm, em
fase normal. A fase móvel foi hexano-isopropanol 97:3 (v/v), com fluxo de
1mllmin. A leitura do cotesterol foi reaHzada a 206nm e a do 7-cetocotesterol
a 233nm.
200 - Colut.l'ol
- 7.c.ttH:o/"'rol
100
g
200 250 300 350 nm Figura 4.5. Espectro de absorção ultravioleta do colesterol e do 7 -cetocolesterol em
hexano: isopropanol (97:3).
Para o procedimento de extração, foi utilizada a técnica proposta por
CSALLANY et aI. (1989), adaptada de FOLCH et aI. (1957). O procedimento
iniciou-se com a pesagem da amostra (0,59) e adição de 20mt da solução de
clorofórmio-metanol (2: 1). seguida da homogeneização em velocidade média
Material e Métodos 34
(Homogeneizador Tecnal Modelo TE102) por cerca de 1 mino O homogenato
foi transferido para um funil de separação e lavado duas vezes com 50ml de
água. A água de lavagem foi combinada e re-extraída por duas vezes com
clorofórmio: metanol (2: 1). As amostras foram centrifugadas a 4000xg, por 15
minutos, a 22° C, usando uma centrífuga Sorvall Superspeed RC2-B
(Automatic Refrigerated Centrifuge). A camada de clorofórmio foi removida e
desidratada, por filtração em sutfato de sódio anidro. Depois da filtração, o
solvente foi concentrado em roto-evaporador e evaporado sob nitrogênio. O
resíduo foi dissolvido com 3ml de fase móvel, por duas vezes consecutivas.
Seguiu-se a filtração em membrana, com poro de 0,45J.lm (Unidade Filtrante
HV Millex - Millipore Indústria e Comércio Ltda.). Após a filtração, a amostra
foi concentrada sob nitrogênio, reduzindo seu volume para 3m!. Alíquotas de
30J.l1 foram injetadas no cromatógrafo.
i 200
100
o
Figura 4.6. Cromatograma dos padrões de colesterol e 7-cetocolesterol visualizado em 3D.
A identificação dos picos de colesterol e 7 -cetocolesterol foi realizada
pela comparação dos tempos de retenção da amostra em relação aos
padrões correspondentes. A separação do colesterol e do 7 -cetocolesterol foi
completada dentro de 15 minutos. A quantificação foi feita por padronização
externa, pela medida da área do pico, sendo que a curva-padrão do 7-
cetocolesterol foi construída de 0,1 a 0,5 J.lg e a do colesterol de 10 a 50J.lg.
Material e Métodos 35
Ambas foram lineares e proporcionaram coeficientes de correlação igual a
~=0,999.
o limite de detecção foi 1 x 10-9!-!g (LONG & WINEFORDNER, 1983).
O teste de recuperação foi feito de acordo com CSALLANY et aI. (1989),
utilizando duas concentrações diferentes para o colesterol e uma para o 7-
cetocofesterol. Os resultados foram baseados na média de seis injeções,
sendo obtida para o colesterol uma recuperação de 99,9% e para o 7-
cetocolesterol 93,5% (Tabela 4.1).
Tabela 4.1. Recuperação do colesterol e 7 -cetocolesterol pelo metodologia de CSALLANY
et aI. (1989).
Colesterol
7 -Cetocolesterol
Quantidade adicionada (J.1g)
12/18
20
4.2.10. ANÁLISE ESTATíSTICA
Quantidade recuperada (J.1g) %
11,23/19,69
18,7
99,9
93,5
Os resultados obtidos foram expressos como médias ± desvio padrão
calculados pelo Microsoft Excel 7.0 da Microsoft Inc. Para comparação
estatística dos dados foram reaHzados a análise de variâncía (ANOVA), o
teste t não-pareado, teste de Mann-Whitney, e a correlação linear de
Pearson, através do programa GraphPad Instat, versão 2.01 da GraphPad
Software. Estabeleceu-se o nível mínimo de significância de 5%.
oyssnoslc 3 soC,,~,nS3~"9
Resultados e Discussão 36
5.1. CARACTERIZAÇÃO DO CAMARÃO-ROSA FRESCO COMO
MATÉRIA-PRIMA
5.1.1. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE
o pH, bases voláteis totais (BVT), substâncias que reagem ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) e contagem de microorganismos foram utilizados no
-presente trabattlo como ffldicadores -da qual'idade -do eamarão-rosa freseo
(Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis) (Tabela 5.1). Quando analisados
em conjunto, esses indicadores foram considerados os melhores parâmetros
no reconhecimento da qualidade de camarões frescos, com exceção das
TBARS {lUNA, 1971}.
Tabela 5.1. Valores de pH, bases voláteis totais (BVT), substâncias reativas ao ácido
tiob-arbitúrico(TBARS} e contagenstctais de mi-c-roúrg-anismos mesófil-os (CTM)
e pSicrotróficos (CTP) em camarão-rosa fresco (Penaeus brasiliensis + Penaeus
paulensis)
Lote Local pH BVT TBARS CTM. CTP
* ** mgN/100g mgMAlKg UFC/g UFC/g
1 SM 7,85 38,8 ±4,2 2,12 ± 0,01
2 SM 7,88 49,7 ±2,1 1,92 ± 0,18
3 M 7,35 32,4 ± 1,4 5,80 x 103 1,03 X 105
4 M 7,83 34,3 ± 2,2 0,34 ± 0,02 1,68 x 107 2,50x107
5 M 7,70 29,4 ±2,4 t ,66±O,OS 5,50x 103 t ,54 x 105
6 FL 8,10 73,0 ± 6,1 1,91 ±0,16 2,03 x 106 3,00x 107
7 M 7,09 27,6 ± 1,6 0,17 ± 0,02 1,02 x 104 1,05 X 104
8 M 7,17 30,6 ± 0,2 1.,32 ±O,t3. 3 2,.70)( 10 3,8Qx. 105
9 M 7,21 34,4 ± 1,8 1,01 ± 0,10 2,50x103 9,70 X 104
10 M 7,41 41,2±3,3 1,36 ± 0,13 3,60 x 10a 3,90 x 105
* Lotes de 1 a 6, amostragens feitas entre abril e maio; lotes de 7 a 10, entre julho e
setembro f 1-999.** t.:0I..-a-1 das -amostragens: SM = Supermercado, M = Merc--ddo, Fl = Feira
livre.
Resultados e Discussão 37
5.1.1.1. pH
Os valores de pH observados variaram de 7,09 a 8,10 (Tabela 5.1)
superando em sua maioria 05 encontrados na literatura, relativos ao
camarão fresco: 6,75 em Penaeus brasiliensis (LUNA, 1971); 7,4 em
Penaeus aztecus (FLlCK & LOVELL, 1972); 7,05 em Penaeus merguiensis
(SHAMSHAD et a/., 1990); e 7,6 em Pandalus jordani (FLORES &
CRAWFORD, 1973).
05 valores de pH do camarão-rosa (Tabela 5.1) mostraram-se bem
maiores que o aceito pelo RIISPOA (1980), para pescado, que define um
máximo de 6,8 para a carne externa e 6,5 para a interna. Um alto valor de
pH pode estar relacionado ao glicogênio muscular no post-mortem, o qual,
de um modo geral, é menor no pescado em relação aos animais de sangue
quente. Foi observado que a concentração de glicogênio podia atingir níveis
indetectáveis no camarão procedente da pesca industrial, devido ao esforço
de fuga do animal no momento da captura. Uma menor concentração de
glicogênio, implica numa menor produção de ácido lático e,
consequentemente, em um pH mais elevado. Um outro possível fator
colaborador para o aumento do pH seria a maior concentração de
compostos nitrogenados não-protéicos no músculo dos crustáceos, em
relação aos mamíferos e peixes (FLlCK & LOVELL, 1972).
A variação do pH parece estar relacionada às condições de
armazenamento e procedimentos aos quais é submetido o camarão
imediatamente após sua captura (FLORES & CRAWFORD, 1973). O pH
inicial de 7,05 no camarão Penaeus merguiensis chegou a 8,25, depois de
16 dias de estocagem em gelo (O°C) e a 8,6 quando armazenado a 35°C,
durante 24 horas (SHAMSHAD et a/., 1990).
Resultados e Discussão 38
Essas observações fazem supor que, se um barco camaroneiro pode
levar até 15 dias de viagem para retornar ao porto de desembarque, tal
como normalmente ocorre na pesca industrial do camarão-rosa, o pH do
animal poderá estar mais elevado que o esperado, ainda que o mesmo
esteja adequadamente mantido em gelo.
Alguns autores tentaram estabelecer um limite máximo de pH sob o
qual o camarão ainda se apresentasse apto ao consumo. BAILEY et aI.
(1956) consideraram que o camarão com pH até 7,7 era fresco; com pH
entre 7,71 e 7,95 era de má qualidade, porém aceitável ; e com pH acima de
7,95, o mesmo já não estava mais apto ao consumo. LUNA (1971) foi mais
rigoroso, sugerindo que um pH maior que 7,2 já caracterizava um produto
não-comestível. SHAMSHAD et aI. (1990) correlacionaram o valor de pH
com a análise sensorial e outros parâmetros de qualidade. Observaram que
o pH acima de 7,6 determinava um estado de deterioração.
Dentre os valores de pH sugeridos anteriormente, os que mais se
ajustam aos resultados da Tabela 5.1 ., seriam os de BAILEY et aI. (1956),
uma vez que o lote 6, com pH 8,10, foi o único a apresentar indícios de não
estar apto ao consumo. Apesar dos demais lotes apresentarem também
elevados valores de pH, não foram observados sinais aparentes de
deterioração.
5.1.1.2. Bases Voláteis Totais - BVT
Como BVT são determinados compostos básicos nitrogenados
voláteis, como a trimetilamina, dimetilamina e amônia, resultantes da ação
enzimática autolítica e microbiana sobre proteínas musculares. São
compostos cujas quantidades variam com o tempo de estocagem,
aumentando à medida que a deterioração do pescado avança.
Resultados e Discussão 39
As amostras de camarão-rosa fresco apresentaram valores de BVT
entre 27,6 e 73,0 mgN/100g, sendo que para a maioria, os resultados
variaram entre 30,6 e 38,8 mgN/100g (Tabela 5.1). Resultados semelhantes,
foram obtidos para o "camarão tropical" , cuja espécie não foi identificada,
que apresentou no primeiro dia de estocagem uma concentração de 34,31
mgN/100g (SAVAGAON et a/., 1972).
Além de variar em função do tempo de estocagem, os valores de BVT
variam principalmente com a temperatura de armazenamento. SHAMSHAD
et al.(1990) avaliaram os níveis de BVT durante a estocagem sob diferentes
temperaturas e observaram resultados quase duas vezes maiores, quando o
camarão era armazenado à temperatura ambiente. Este rápido aumento de
BVT em relação a elevadas temperaturas, parece estar relacionado ao
aumento na contagem microbiana e à atividade enzimática. YEH et aI.
(1978) encontraram concentrações significantes de duas enzimas
produtoras de amônia: adenosina deaminase e AMP deaminase, em
camarão do Golfo do México. Os autores observaram que durante o post
mortem inicial a amônia produzida enzimaticamente compreendia mais de
50% da amônia total e que a temperatura ótima para atuação dessas
enzimas era 3rC.
O RIISPOA (1980) determina um valor máximo de BVT em pescado
de 30mgN/100g, para efeito de consumo. LUNA (1971) após avaliar os
padrões de decomposição do Penaeus brasiliensis, em três diferentes
temperaturas, estabeleceu um modelo de qualidade onde em concentrações
inferiores a 22 mgN/100g, o camarão era considerado fresco; entre 23 e 40
mgN/100g era comestível, e com valores acima de 40mgN/100g já não
estava mais apto ao consumo.
A maioria das amostras de camarão-rosa analisada, vendida
comercialmente como fresca, não apresentou valores de BVT abaixo de
Resultados e Discussão 40
22mgN/100g, não estando, portanto, dentro dos padrões desejáveis para
camarão fresco. Além disso, duas das amostras apresentaram valores
superiores a 40mgN/100g, caracterizando-as como não-comestíveis,
segundo os parâmetros de LUNA (1971). Entretanto, as amostras de
camarão-rosa analisadas não apresentaram sinais aparentes de
deterioração, excetuando-se a correspondente ao lote 6, cujo odor
denunciava a falta de frescor.
5.1.1.3. Substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico - TBARS
o teste das TBARS é muito utilizado na determinação da oxidação
lipídica de alimentos, principalmente em carnes. Trata-se de um método
colorimétrico, onde o desenvolvimento da cor se dá pela formação de
complexos entre o ácido tiobarbitúrico e uma ampla faixa de metabólitos
lipídicos, como aldeídos, cetonas, cetoesteróis e ésteres. Dentre estes
compostos, o de maior ocorrência é o malonaldeído ou aldeído malônico,
um produto secundário da oxidação lipídica. Por isso, o resultado é
expresso em mg de malonaldeído por quilograma de amostra.
As concentrações de malonaldeído (MA) observadas em camarão
rosa fresco variaram entre 0,17 e 2,12 mg/Kg (Tabela 5.1).
o potencial oxidativo do pescado marinho é grande em relação às
outras espécies animais. Isso decorre em função do alto teor lipídico e
principalmente da elevada insaturação dos ácidos graxos correspondentes,
característico desse alimento. No caso presente, o camarão é um tipo de
pescado com baixo teor lipídico, o que contribuiria portanto, para uma
menor oxidação e conseqüente menor ocorrência de malonaldeído.
Os resultados da Tabela 5.1, de certa forma, coincidem com os
relatados para espécies de peixe com maior teor lipídico que o camarão-
Resultados e Discussão 41
rosa: 0,70 - 1,06 mgMA/kg em pescada, 1,5 mgMA/kg em sardinha e 0,13
mgMA/kg em espécie de peixe não identificada (CRACKEL, et aI., 1988;
YANKAH et a/. , 1993; BOTSOGLOU et aI., 1994).
Na literatura não tem sido indicados limites de malonaldeído acima
dos quais o produto estaria oxidado e, portanto, impróprio ao consumo.
Segundo BUCKLEY & MORRISSEY (1992), as alterações oxidativas em
carnes geralmente são quantificadas através de produtos secundários de
degradação, expressos como número de TBARS (mgMA/kg). Números de
TBARS maiores que 1 correlacionaram-se significativamente com escores
sensoriais indicativos de oxidação, em carnes estocadas sob congelamento.
A grande maioria dos números de TBARS indicada na Tabela 5.1 está
acima de 1.
Embora o teste de TBARS apresente boa correlação com a análise
sensorial, na detecção de rancidez em produtos animais, ele tem limitações.
O malonaldeído, bem como os demais compostos de cadeias curtas de
carbono, não é estável por um longo período de tempo devido à sua alta
reatividade. Complexando-se com aminoácidos, proteínas, glicogênio e
outros constituintes alimentares, formam-se compostos que não serão
quantificados pelo referido por este teste (TARLADGIS et aI., 1962;
FERNANDEZ et a/., 1997). Além disso, a inespecificidade, grande
quantidade de interferentes e baixa sensibilidade na detecção de níveis
menores de malonaldeído têm gerado muitos questionamentos sobre sua
utilização no controle de qualidade de alimentos (BOTSOGLOU et a/.,
1994).
Apesar dessas restrições, não há na verdade um método adequado
e/ou conveniente que possa ser usado em substituição ao teste das TBARS,
para o propósito indicado. O teste de TBARS foi incluído no presente estudo
Resultados e Discussão 42
em função de uma eventual correlação com a formação de 7 -cetocolesterol,
objeto de estudo neste trabalho.
5.1 .1.4. Contagem Microbiológica
No presente estudo, foram realizadas as contagens de
microorganismos mesófilos e psicrotróficos na porção comestível de
camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis). As contagens de mesófilos
variaram de 2,5 x 103 até 1,7 x 107 UFC/g, enquanto as de psicrotróficos de
1,05 x 104a 3,0 x 107 UFC/g (Tabela 5.1 .).
Não existe um padrão microbiológico para as contagens de mesófilos
e psicrotróficos em pescado fresco. Para a maioria dos alimentos, entre eles
as carnes, uma contagem acima de 105 já seria indicativo de deterioração.
Não existindo um valor de referência específico para o pescado, seria de
boa prática a adoção do limite aceito para a maioria dos alimentos (105).
Elevadas contagens bacterianas nem sempre determinam perda de
qualidade ou mesmo a deterioração do produto (SHAMSHAD et aI., 1990).
GAGNON & FELLERS (1957) analisaram as mudanças bioquímicas de
camarão congelado, observando que muitas amostras com boas
características organolépticas e boa qualidade bioquímica apresentavam
contagens elevadas, enquanto outras, de pior qualidade, estavam com
baixa contaminação. Concluíram os autores que não era possível utilizar a
contagem microbiana como único parâmetro na avaliação da qualidade de
camarão.
De fato, pôde-se observar na Tabela 5.1 que os lotes 4 e 6
apresentaram contagens superiores em relação às outras amostras. Ainda
assim, apenas a amostra 6 demonstrava estar em processo de deterioração,
perceptível principalmente pelo odor característico.
Resultados e Discussão 43
o camarão pode apresentar diferentes contagens microbianas em
função do local de captura e da época do ano. Tais variações parecem estar
relacionadas com alterações nas características da água, tais como
oscilações de temperatura, salinidade, atividade do fitoplâncton, níveis de
oxigenação e pH (VANDERZANT et aI., 1971).
Após a captura, o camarão torna-se exposto à contaminação em
maior ou menor grau, pela transferência de microorganismos presentes no
barco e durante o manuseio nas operações de bordo e de terra. A má
higiene dos porões dos barcos pesqueiros, onde o camarão é armazenado,
o gelo produzido com água de qualidade inadequada, lavagem com água
imprópria e transporte em condições de refrigeração não recomendadas,
têm sido indicados como fatores preponderantes na contaminação pós
captura (PEDRAJA, 1970; GERMANO et aI., 1993). Há portanto, uma
substituição da flora aquática original marinha pela de origem terrestre. O
crescimento microbiano durante a estocagem, a bordo ou em terra,
principalmente de psicrotróficos, e a atuação das enzimas musculares
(autólise) levam aos processos deteriorativos do camarão (PEDRAJA,
1970).
GREEN (1949) examinou o camarão logo após sua retirada da água
e verificou grande oscilação nas contagens bacterianas dentro do mesmo
lote, de 1,6 x 103 a 1,2 x 106 UFC/g. A maioria dos microorganismos se
localizava na superfície (exoesqueleto) e no cefalotórax, sendo que a
simples remoção desse último, reduzia as contagens em 75%. Ainda neste
estudo, foram analisadas amostras comerciais que apresentaram valores
elevados, 6,0 x 105 a 1,2 x 108 UFC/g. Nas amostras com contagens mais
elevadas, já era perceptível o odor amoniacal. Tais alterações estariam
relacionadas às más condições de estocagem e transporte até o ponto-de
venda.
Resultados e Discussão 44
A manutenção do camarão a baixas temperaturas durante o
armazenamento e transporte é sem dúvida essencial, principalmente
quando se considera que nestas condições o crescimento microbiano ainda
continua acontecendo. SHAMSHAD et a/., (1990) verificaram que a espécie
de camarão Penaeus merguiensis apresentava uma contagem microbiana
inicial de 5 x 105 UFC/g. Mantido a 0°C/16 dias, a 15-20°C/7dias e a 35°C/24
horas, as contagens finais observadas foram de 3,5 x 107, 3,4 x 109 e 6,4 x
109 UFC/g, respectivamente. Este quadro caracteriza bem a situação que se
repete até os dias atuais, pois comercialmente pode-se obter no mercado,
desde produtos com excelente qualidade até outros em adiantado processo
de deterioração. O ponto fundamental de todo o processo é a armazenagem
do camarão sob refrigeração adequada, ao lado da higiene das instalações
e qualidade da água utilizada na lavagem e produção de gelo.
5.1.1.5. pH x BVT x TBARS x Contagem Microbiana
Em nosso estudo, foram observadas fortes correlações entre as
contagens de mesófilos (CTM) e psicrotróficos (CTP) (r =0,85) e entre esta
última (CTP) e o pH (r =0,85). Correlações algo menores, porém não
menos significativas, foram verificadas entre as BVT e o pH (r =0,70) e
entre as BVT e a contagem de psicrotróficos (CTP) (r =0,68). O pH
apresentou, de um modo geral, boas correlações com os demais testes
realizados. Mínimas correlações envolveram as TBARS.
Caracteristicamente este teste é específico como indicador de qualidade
envolvendo a oxidação lipídica (Tabela 5.2).
A maioria das amostras de camarão-rosa analisadas (Tabela 5.1)
apresentou resultados característicos de um produto em franca
deterioração. Apesar disto, apenas o lote 6 apresentava alterações
perceptíveis em suas características organolépticas. Esta amostra
apresentou concentrações de BVT, contagens bacterianas e valor de pH
aumentados. Além disso, os camarões apresentavam textura arenosa,
Resultados e Discussão 45
cefalotórax se desprendendo facilmente do corpo, coloração pálida com
pontos de enegrecimento e odor forte.
Tabela 5.2. Correlação entre os indicadores de qualidade: pH, bases voláteis totais (BVT),
substâncias reativas ao ácido tiob-arbitúrR.--o (TBARS) e contagens totais de
microorganismos mesófilos (CTM) e psicrotróficos (CTP).
pH BVT TBARS CTM
CTP 0,85 0,68 0,36 0,85
CTM 0,76 0,51 -0,03
TBARS 0,59 0,54
BVT 0,70
Pôde-se observar também uma grande heterogeneidade entre os lotes
e dentro de cada lote. Isso porque as alterações organolépticas, bacterianas
ou enztmáticas autoHticas observadas em produtos marinhos são part1cutares
para cada indivíduo, de acordo com a sua composição muscular (PEDRAJA,
1970). Desta
apresentarão
caracterfsticas,
forma, os camarões capturados em um mesmo local não
necessariamente as mesmas mudanças nas suas
ainda que sejam subrrret100s às mesmas eorrd1ções de
manipulação e processamento.
Resultados e Discussão 46
5.1.2. AVALIAÇÃO DA FRAÇÃO LIPíDICA
5.1.2.1. Concentração lipídica
o camarão-rosa (Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis)
apresentou um teor lipídico médio de 1,13 ± 0,09 g/100g (Tabela 5.3).
Tabela 5.3. Concentração lipídica total de camarão-rosa (penaeus brasiliensis +
Pen-aevs pôm'ensís). (a)
Lote Lípides (g/100g) Lote Lípides (g/100g)
1 1,04 ± 0,03 6 1,27 ± 0,03
2 1,09 ± 0,08 7 1,08 ± 0,05
3 1,19 ± 0,05 8 1,05 ± 0,06
4 1,24 ± 0,01 9 1,13 ± 0,10
5 t,23 ± 0 ,03 10 O,9S ± 0 ,Ú2
Média geral = 1,13 ± 0,09
(a) Média ± desvio padrão
o camarão-rosa mostrou um baixo conteúdo lipídico e, de modo geral ,
não apresentou muita variação entre os valores obtidos para as diversas
espécies estudadas. JOHNSTON et alo (1983) env~faram uma
concentração lipídica de 1,2g/1 00g para Penaeus aztecus, KING et aI.
(1990) 1,3 g/100g para Pandalus borealis e Pandalus jordani e
KRZYNOWEK & PANUNZIO (1989) de 0,8 a 1,1 g/100g para 5 espécies
diferentes: Penaeus duraram notiaNs, PenaetJs vannanei, Penaeus azt-ecus
aztecus, Penaeus durarum durarum, Penaeus aztecus subtilis. Para a
espécie Penaeus brasiliensis, BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA
(1997) relataram concentrações entre 0,9 e 1, 19/1 OOg. No entanto, TAKADA
et al. (1988) mencionaram teores tipfdicos bem dtvergen-tes. Elesan-atisaram
18 espécies e obtiveram teores lipídicos entre 1,1 e 4,2 g/100g. Dentre estes,
Resultados e Discussão 47
o Penaeus pau/ensis apresentou uma concentração de 3,4g/100g e o
Penaeus brasiliensis 4,2g/1 OOg.
o teor lipídico do camarão pode variar em função da parte de seu
corpo que é analisada. Isso porque o depósito de lípides deste crustáceo é
o hepatopâncreas, localizado no cefalotórax. A remoção do cefalotórax,
durante os procedimentos de limpeza, reduz o conteúdo lipídico do camarão
inteiro de 2,8 a 3g/100g para 1,2 a 1,5 g/100g, no músculo comestível. A
análise dos resíduos (exoesqueleto + cefalotórax) apresenta uma
concentração lipídica entre 1 e 4g/100g (KRZECZOWSKI, 1970).
A alimentação também tem se mostrado um fator importante na
composição lipídica do camarão. CHANMUNGAM et alo (1983) analisaram
camarões marinhos selvagens e camarões de água-doce cultivados,
observando que a concentração lipídica deste último foi quase 3 vezes
maior: 1,33 e 3,18 g/100g, respectivamente. Neste caso, o teor de gordura
da dieta, parece ser determinante na composição lipídica do camarão. Além
disso, a disponibilidade de alimento sem a necessidade de gasto energético
para conseguí-Io, faz com que estes camarões tenham uma maior reserva
lipídica.
Além destes fatores, existem ainda evidências de que o teor lipídico
de produtos marinhos pode variar com o sexo do animal e o estado
fisiológico em que ele se encontra, sua origem geográfica, a estação do ano
em que foi capturado e a temperatura da água em que vive (KRZYNOWEK
& MURPHY, 1987). Em muitas espécies, esta variação pode chegar até
10% de seu valor normal. Em camarão, muito pouco se sabe a esse
respeito.
Resultados e Discussão 48
5.1.2.2. Perfil de ácidos graxos
Tem sido crescente a busca por uma alimentação mais saudável, com
baixa concentração de gordura, principalmente gordura saturada, e com
predominância de ácidos graxos polinsaturados da série co3 em relação aos
co6, que são associados à etiologia de várias doenças (CANDELA et aI. ,
1997).
Os produtos marinhos além de possuírem proteínas com elevado valor
biológico, se constituem na maior fonte de ácidos graxos polinsaturados de
cadeia longa da série co3, os quais têm sido extensivamente estudados
graças a seu envolvimento na prevenção de doenças cardiovasculares,
hipertensão, arritmias, desordens auto-imunes e câncer (KINSELLA et aI.,
1990; CANDELA et aI., 1997). Desta forma, ao se preconizar dietas com
altas concentrações de ácidos graxos co3 e baixas quantidades de co6, tem
se motivado o consumo de produtos marinhos.
O camarão apresenta uma menor proporção de ácidos graxos
polinsaturados em relação a outros crustáceos, como o caranguejo, e
alguns moluscos, como mexilhão, ostra, marisco e lula. As quantidades de
ácido eicosapentanóico - EPA e ácido docosaexaenóico - DHA variam muito
entre estas espécies, sendo que os crustáceos apresentam maior
concentração de EPA, enquanto os moluscos maiores níveis de DHA (KING
et aI., 1990).
O perfil de ácidos graxos do camarão-rosa analisado em nosso estudo
(Tabela 5.4) revelou 33% de saturados, 20% de monoinsaturados e 40% de
polinsaturados. Foram identificados 18 ácidos graxos no total, sendo 7
saturados, 4 monoinsaturados e 7 polinsaturados. Os ácidos
eicosapentaenóico - EPA (20:5co3) e docosahexaenóico - DHA (22:6co3)
corresponderam a 28,5% do ·total dos ácidos graxos, ou a 70% dos ácidos
Resultados e Discussão 49
graxos polinsaturados. Evidentemente, sendo baixa a concentração lipídica
do camarão-rosa, o aporte de EPA e DHA, por consequência, não é alto.
Nos estudos disponíveis na literatura consultada, em que a
composição dos ácidos graxos de camarão foi determinada, é difíci l
comparar os valores obtidos individualmente, uma vez que não são
quantificados o mesmo número de ácidos graxos em todos os trabalhos.
BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997) quantificaram 87 ácidos
graxos e TAKADA et aI. (1988) apenas 13, em Penaeus brasiliensis.
KRZECZKOWSKI (1970) e KING et aI. (1990) quantificaram 29 e 27 ácidos
graxos, respectivamente na espécie Pandalus borealis, também conhecido
como camarão-rosa.
A literatura revela variações individuais na proporção dos ácidos
graxos de camarão, até mesmo dentro de uma mesma espécie
(KRZECZKOWSKI, 1970; TAKADA et aI. , 1988; KING et aI., 1990;
BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA, 1997). Na Tabela 5.4 foram
comparados os resultados do Penaeus brasiliensis + Penaeus paulensis,
obtidos no presente trabalho, com os correspondentes ao P. brasiliensis
estudado por BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997) e ao P.
paulensis analisado por TAKADA et aI. (1988).
Dentre os ácidos graxos saturados, o palmítico (C16:0) apresentou
concentração mais elevada em nosso estudo, enquanto o esteárico (C18:0)
foi maior que no resultado apontado por BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ
AMAYA (1997), porém menor que no trabalho de TAKADA et aI. (1988) .
Da mesma forma, nos monoinsaturados, os níveis encontrados para o
palmitoléico (C16:1) no presente trabalho e os relatados por BRAGAGNOLO
& RODRIGUEZ-AMAYA (1997) são equivalentes entre si e superiores ao
apontado por TAKADA et aI. (1988), enquanto o teor do oléico (C18:1) se
mostrou mais elevado em nosso estudo, em relação aos dos outros autores.
Resultados e Discussão 50
Tabela 5.4. Ácidos graxos (% por árE!a) de Penaeus brasiliensis +. Penaeus paulensis,
Penaeus bras/7iensis e Penaeus pauTensis.
Ácidos Graxos (%) P. brasiliensis + Penaeus Penaeus P. paulensis brasiliensis paulensis
~a~ ~b~ ~c~ - --
14:0 Mirístico 1,6 ± 0,2 1,6 ± 0,3 1,5
15:0 Pentadecanóico 1,0 ± 0,03 1,0 ± 0,1 0,6
16:0 Patmítico 18,2 ± 1,6 14,9 ± O,5 16,3
17:0 Margárico 2,1 ± 0,1 1,9 ± 0,2 1,8
18:0 Esteárico 10,1 ± 0,4 8,6 ± 0,8 14,5
20:0 Araquídico O,2 ± O,O
22:0 Beênico 0,3 ± 0,1
Saturados 32,9 30,2 34,7
16:1(j)7 Palmitoléico 6,6 ± 0,4 6,3 ± 0,7 3,4
17:1(j)9 Heptadecenóico 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,1
18:1(j)9 Oléico 12,2 ± 0,1 7,9 ±0,8 11 ,0
20:1(j)9 Eicosanóico 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 1,6
Monoinsaturados 20,4 22,6 16,0
18:2(j)6 Linoléico 2,5 ± 0,4 1,5 ± 0,1 1,1
18:3(j)3 Linolênico 0,4 ± 0,03 0,5 ± O,O
20:2(j)6 Eicosadienóico 0,7 ± 0,02
20:%6 Araquidônico 6,7 ± 0,8 5,2 ± 0,2
2O:5(j)3 Eicosapentanóico 17,8 ± O,7 18,7 ± 2,3 17,9
22:5(j)3 Docasapentaenóico 1,7 ±0,3 1,4 ± 0,2 2,5
22:6(j)3 Docosaexaenóico 10,7 ± 0,8 13,3 ± 0,6 11 ,2
Polinsaturados 40,5 45,0 42,7
(a) Nosso estudo; (b) BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997); (c) TAKADA et aI.
(1988).
Em relação aos polinsaturados EPA e DHA, os maiores valores foram
encontrados por BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997), em cujo
trabcHho ambos somaram 32%, contra 28,5 e 29,1% do nosso estudo e do de
BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farn:?r.~uticas
Universidade de São Paulo
Resultados e Discussão 51
TAKADA et aI. (1988), respectivamente. Estes valores se assemelham aos
obtidos por KRZYNOWEK & PANUNZIO (1989) em relação a 4 espécies
diferentes de camarão: Penaeus durarum notialis, Penaeus vannanei,
Penaeus aztecus aztecus e Penaeus aztecus subtilis, cujas concentrações
variaram de 27,2 a 35,1% do total de ácidos graxos.
A concentração total de ácidos graxos polinsaturados foi menor em
nosso estudo que nos demais. A razão polinsaturados/saturados, apesar de
ter sido a mesma encontrada por TAKADA et aI. (1988), 1,2 , foi inferior à
obtida por BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997) 1,5. Da mesma
forma, estes autores encontraram uma razão 0)3/0)6 maior, 4,1 contra 3,1
obtida em nosso estudo.
Apesar das diferenças entre os estudos (Tabela 5.4), seja na
quantidade de ácidos graxos ou na proporção entre eles, os ácidos graxos
predominantes em camarão foram os mesmos: C16:0, C18:0, C16:1, C18:1,
C20:4, C20:5 (EPA) e o C22-6 (DHA). Em nosso trabalho e no de
BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997), a soma destes ácidos
graxos perfizeram 78 e 79% do total, respectivamente.
5.1.2.3. Concentração de colesterol
o colesterol é encontrado no organismo animal e nos alimentos nas
formas livre e esterificada. Para sua quantificação total em alimentos, torna
se necessária a conversão do colesterol éster em colesterol livre, sendo a
saponificação o método mais freqüentemente utilizado neste sentido. Em
nosso estudo, a metodologia empregada é específica para a dosagem de
colesterol livre, uma vez que suprime a etapa de saponificação.
Dados escassos são disponíveis a respeito da distribuição do
colesterol livre e esterificado em alimentos. Segundo MASORO (1968), em
Resultados e Discussão 52
tecidos e fluidos do fígado, córtex adrenal, plasma e linfa de mamíferos a
maioria do colesterol está na forma esterificada, enquanto na grande massa
muscular esquelética predominantemente se encontra livre.
TU et aI. (1967) analisaram os músculos de suíno e bovino e
estimaram uma concentração média de colesterol éster em torno de 6% do
colesterol total. DE VORE (1988) relatou, também em carne bovina,
percentuais de colesterol éster entre 7,6 e 9,1 . MARION & WOODROOF
(1965) determinaram percentuais de colesterol éster variando entre 14 e
15% em relação ao colesterol total, para músculo de ave. Quando se
considera a gordura e os óleos animais, este percentual se torna mais
elevado, girando em torno de 22% para aves, 26% para banha, chegando
até 78,6% para óleo de fígado de bacalhau (PIKUL et aI., 1984; LEE et a/. ,
1998). Como o camarão é um tecido muscular, acredita-se que a mesma
proporção observada nos demais músculos se repita também neste produto.
o extrato lipídico do camarão é composto em sua maior parte por
fosfolípides, 62,1%, seguido pelos lípides neutros, 36%, e glicolípides, 1,9%
(JOHNSTON et a/., 1983). Dentre os esteróis, componentes da fração
lipídica neutra, o colesterol é o mais proeminente, correspondendo a 94 a
99% do total (GORDON, 1982; KRZYNOWEK & PANUNZIO, 1989).
A concentração de colesterol livre em camarão-rosa fresco (Penaeus
brasiliensis + Penaeus paulensis) variou de 92 a 136 mg/100g, com valor
médio de 118 mg/100g (Tabela 5.5).
Este resultado médio de colesterol livre foi similar aos
correspondentes ao colesterol total obtidos por TAKADA et aI. (1988), 121
mg/100g, e por BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ-AMAYA (1997), 127
mg/100g, ambos referentes ao Penaeus brasiliensis.
Resultados e Discussão 53
o valor médio de colesterol livre observado para Penaeus brasiliensis
+ Penaeus paulensis foi superior ao colesterol total médio encontrado por
KRISHNAMMORTHY et aI. (1979), em Penaeus setiferus, 96 mg/100g. Mas
foi inferior aos relatados por KRZYNOWEK & PANUNZIO (1989), nas
espécies descritas anteriormente, 152 mg/100g, por KRITCHEVSKY et ai.
(1967), para uma espécie não identificada, 200mg/100g, e por KING et ai.
(1990), 147 mg/100g, para os camarões Pandalus borealis e Pandalus
jordani.
A variabilidade observada nos diversos estudos em relação ao
colesterol total, tem sido atribuída à espécie de camarão analisada, às
variações sazonais, tipo de alimentação, local de origem e, também, às
diferentes metodologias utilizadas na quantificação (KRITCHEVSKY et ai.,
1967; GORDON, 1982; KRZYNOWEK, 1985; BRAGAGNOLO &
RODRIGUEZ-AMAYA ,1997).
Os métodos colorimétricos são muito criticados devido à sua baixa
especificidade para a quantificação do colesterol. Nos estudos de
KRISHNAMMORTHY et aI. (1979) e KRITCHEVSKY et ai. (1967) foi
utilizado o método colori métrico, KRZYNOWEK & PANUNZIO (1989)
empregaram a cromatografia gasosa e BRAGAGNOLO & RODRIGUEZ
AMAYA (1997), a cromatografia líquida.
A concentração de colesterol livre em camarão-rosa fresco (Tabela
5.5) também foi estabelecida em função de seu teor lipídico (Tabela 5.3) e
expressa na Figura 5.1. Os resultados foram expressos em percentagem e o
colesterol correspondeu a 7,7 a 11,9 de todo o conteúdo lipídico. Esta
parcela é bastante expressiva, principalmente quando comparada aos
demais músculos, como o frango, onde o colesterol total oscila entre 1 e 4%
em relação ao total de lípides, dependendo do corte muscular, chegando ao
valor máximo de 6,4% (MARION & WOODROOF, 1965; PIKUL et aI., 1984).
Resultados e Discussão 54
Tabela 5.5. Colesterol e 7-cetocolesterol livres em camarão-rosa fresco (penaues
brasHiensis + Penaeus paulensis).(a )
Lote Colesterol mg/100g 7 -Cetocolesterol ~g/g
1 92,1±1 ,9 0,195 ± 0,006
2 96,3 ± 5,2 0,210 ± 0,019
3 103,7 ± 3,8 0,195 ± 0,011
4 95,4 ±6,5 0,194 ± 0,006
5 127,6 ±6,6 0,204 ± 0,006
6 135,9 ± 7,5 0,192 ± 0,005
7 120,3 ± 3,0 0,185±0,012
8 121 ,4 ± 0,6 0,366 ± 0,032
9 123,5 ± 4,7 0,361 ± 0,006
10 116,50 ± 8,0 0,198±0,014
(a) Média ± desvio padrão
"ê ~ Q)
8 ::!!. o
15
~.~ - --- - - - - ------------ -- - -------- - ------------------------------------- - -- - - - - --- ---12
9
6 1/
3
o 1/ ~ ~ ~ "--7" '-7 '-7" ~ ~ ~/
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 5.1. Concentração de colesterol livre em camarão-rosa fresco (P. brasiliensis + P.
paulensis) em relação ao teor lipídico total.
5.1.3. OCORRÊNCIA DE 7 -CETOCOLESTEROL
Foi constatada a ocorrência de 7-cetocolesterol em amostras
comerciais frescas de camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis). O 7-
Resultados e Discussão 55
cetocolesterol livre quantificado apresentou concentrações que variaram
entre 0,185 e 0,366J.l9/g, com valor médio de 0,230J.l9/g. Com exceção dos
lotes 8 e 9, que apresentaram concentrações mais elevadas (>0,300J.l9/g),
os demais mostraram valores bastante semelhantes, em torno de 0,197/J.g/g
(Tabela 5.5).
Os dados existentes na literatura referentes aos músculos frescos
demonstram que estes produtos originalmente não deveriam conter óxidos
de colesterol (PANIANGVAIT et aI., 1995). Mas, nem sempre é isso que se
observa. Os poucos estudos que quantificaram óxidos de colesterol em
produtos frescos, apresentaram resultados bastante variáveis.
Enquanto ZUBILLAGA & MAERKER (1991) observaram
concentrações de 7 -cetocolesterol total de 0,22 /J.g/g em carne de vitela, de
0,06 J.l9/g em carne suína, e 0,83/J.g/g em carne bovina, PIE et aI. (1991)
relataram para estes mesmos produtos concentrações de 0,71, 0,92 e
1,12J.l9/g, respectivamente, ou seja, 3, 15 e 1,3 vezes maiores. CSALLANY
et aI. (1989) só observaram a formação de 7-cetocolesterol livre em carne
suína, depois de estocada por 10 dias sob refrigeração. PARK & ADDIS
(1985) não detectaram óxido de colesterol em cérebro, fígado e carne
bovina, o mesmo ocorrendo na sardinha e na lula estudadas por OSADA et
aI. (1993b). Por outro lado, SHOZEN et aI. (1995) detectaram concentrações
de 7-cetocolesterol total de 9,8 e 7,9 J.l9/g, em base seca, para o bacalhau e
a lula, respectivamente. Estes resultados, calculados para o músculo
contendo 80% de umidade, seriam de 1,96 e 1, 58/J.g de 7 -cetocolesterol
total/g, respectivamente.
RODRIGUEZ-ESTRADA et aI. (1997) utilizaram o 7 -cetocolesterol
como indicador da oxidação do colesterol em hambúrguer e observaram que
a amostra fresca apresentou concentração bastante elevada deste óxido,
25,2 /J.g/g de Iípide. Os autores associaram este fato ao tempo e às
Resultados e Discussão 56
condições de estocagem da carne no supermercado, onde a exposição à luz
e ao oxigênio e a ampla superfície de contato da carne moída, poderiam ser
os fatores responsáveis pela oxidação. E ainda relataram que, apesar da
concentração de 7 -cetocolesterol estar elevada no produto fresco, este valor
não representou um risco, do ponto de vista toxicológico, uma vez que a
quantidade mínima de 7 -cetocolesterol equivalente a um mínimo de
atividade biológica é igual a 0,5mgl hambúrguer ou 30 ~g/g de lípide.
Quando as concentrações de 7 -cetocolesterol encontradas em
camarão-rosa foram expressas em ~g/g de lípide, o valor médio obtido,
20,6, foi semelhante ao observado por RODRIGUEZ-ESTRADA et ai.
(1997). Apesar do valor de referência citado por estes autores ser relativo
ao hambúrguer, os lotes 8 e 9 do camarão-rosa analisado, apresentaram
níveis de 7 -cetocolesterol superiores a 30 ~g/g de lípide, o que é bastante
preocupante. Além disso, a presença de 7 -cetocolesterol em camarão-rosa
e também no estudo de RODRIGUEZ-ESTRADA et aI. (1997), na verdade,
estaria indicando a possível ocorrência de outros óxidos, também
produzidos na oxidação do colesterol. Desta forma, a quantidade total de
produtos da oxidação do colesterol, pode ser ainda maior.
Na literaturá consultada não foi relatado nenhum estudo envolvendo
a dosagem de óxidos de colesterol em camarão fresco. Dois trabalhos
analisaram óxidos de colesterol em camarão processado. OHSHIMA et ai.
(1993) encontraram 4,0 ~g/g de 7-cetocolesterol total (matéria seca) na
espécie Sergestes lucens cozida e desidratada, e LEE et ai. (1998)
16,57~g/g de lípide em camarão desidratado (espécie não identificada),
comercializado na Korea. Este último, mesmo em se tratando de um produto
processado, apresentou concentrações de 7 -cetocolesterol inferiores às
observadas no presente estudo em camarão fresco, 20,6 ~g/g de lípide,
confirmando mais uma vez, O alto grau de oxidação deste camarão.
Resultados e Discussão 57
5.2. EFEITO DE PROCESSAMENTOS TÉRMICOS SOBRE ÁCIDOS
GRAXOS E COLESTEROL EM CAMARÃO-ROSA
5.2.1. CONCENTRAÇÃO LIPíDICA
Não houve diferença significativa no conteúdo lipídico do camarão-rosa
submetido ao cozimento, em relação ao fresco. Já, quando submetido à
fritura, o camarão teve seu teor ttpfdico signiftcativamente aumentado,
atingindo valores 3 vezes maiores que os obtidos na amostra fresca
(expresso em base seca) (Tabela 5.6).
o maior conteúdo lipídico no produto frito se deveu à absorção do óleo
utilizado na fritura, conforma consta na literatura (MAl et aI., 1978; AGREN &
HANNtNEN, 1993; CANDELA et ai., 1996).
Tabela 5.6. Umidade e lípides totais em camarão-rosa (penaeus brasiliensis + Penaeus
paufensis) submetido a proces::.-amentos (g7'100g amm,-tra) (a).
Amostra Umidade Lípides em Base Úmida Lípides em Base Seca
Fresca 78,2 ± 1,9 1,13±0,09 4,86 ± 0,38a
Cozida 7"3,7± 1,6 1,33 ± 0,04 5,22 ± 0,6ca
Frita 62,5 ± 1,7c 4,92 ± 0,45 14,18 ± 1,63 b
(a) Média ± desvio padrão. Letras diferentes significam diferenças estatisticamente
significantes (p<0,01).
Durante o tratamento térmico de alimentos, pode-se observar tanto a
absorção de materiais do meio de processamento, como também a perda de
componentes do produto, por evaporação ou por efuição no meio de
processamento. Tais alterações são produzidas em função do método
utilizado, tempo e temperatura de processamento, tamanho, superfície e
composição química do alimento (MAl et aI., 1978). Estudos realizados em
diversas espécies de peixes, têm sugerido que produtos com menores
Resultados e Discussão 58
quantidades de material lipídico, tendem a absorvê-los do meio durante o
processamento (MAl et al.,1978; GALL et aI., 1983; AGREN & HANNINEN,
1993; CANDELA et aI., 1998). Esta poderia ser, portanto, a razão para o
significativo aumento do teor lipídico do camarão frito, uma vez que
originalmente trata-se de um produto de baixo teor de lípides.
5.2.2. COMPOSiÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
Apesar do grande interesse médico e nutricional em torno dos ácidos
graxos ro3, poucos estudos vêm sendo feitos acerca das possíveis
modificações na composição que os mesmos podem sofrer quando
submetidos ao processamento.
Os efeitos do cozimento e da fritura sobre a composição de ácidos
graxos do camarão-rosa estão demonstrados na Tabela 5.7 e na Figura 5.1.
Os cromatogramas correspondentes às amostras fresca, cozida e frita das
Figuras 5.2, 5.3 e 5.4.
Pôde-se observar que o cozimento não afetou significativamente a
composição de ácidos graxos do camarão, embora tenha havido uma
discreta diminuição na proporção de saturados e monoinsaturados,
acompanhado de um pequeno aumento de polinsaturados.
Já, a fritura, ocasionou modificações relevantes na proporção dos
ácidos graxos. Este processamento proporcionou uma grande diminuição na
concentração de saturados e um considerável aumento na proporção de
polinsaturados.
Resultados e Discussão 59
Tabela 5.7. Ácidos graxos (% por área) de camarão-rosa (Penaeus brasiliensis + Penaeus
paurensis) fresco, cozido e frito. (a)
Ácidos Graxos Camarão Fresco Camarão Cozido Camarão Frito
14:0
15-:&
16:0
17:0
18:1)
20:0
22:0
16:1007
17:1<07
18:1<09
20:1<09
18:2006
18:3<03
20":2006
20:4<06
20:5<03
tt5oo3
22:6003
NI
Saturado
Monoinsat
Polinsat.
1,58±0,18
t,Ot ± O,03
18,20 ± 1,63
2,06±0,10
10,06 ± 0 ,37
6,59 ± 0,38
1,04±0,18
12,22 ± 0,07
O,52 ± 0,11
2,51 ± 0,40
0,37 ± 0,03
0 ,66±0,02
6,66 ± 0,79
17,79 ± 0,70
1,73±0,26
10,71 ± 0,83
6,33 ± 0,30
32,90a
2O.,36a
40,42a
2,04 ± 0,01
O,81' ± O
14,92 ± 0,08
1,81 ± 0,01
10,74 ± 0 ,01
6 ,64±0,04
0,90 ± O
10,70 ± 0,01
O,43±0
1,94 ± 0,01
0,31 ± O
0 ,60 ± 0 ,01
6,62 ± 0,01
21,10±0,03
2,40 ± 0,01
11 ,59 ± 0,01
6,46 ± 0,11
30,32a
18,67a
44,56a
0,26 ± 0,01
7,47 ± 0,03
0,29 ±O
4,75 ± 0 ,01
0,26 ± O
0,66 ±O
0;88 ± 0 ,01
18,76 ± 0,01
61,82 ± 0,01
0,84 ±O
1,88 ± 0,01
1,44 ± 0,01
0,68 ±O
13,69'0
19.,64a
65,99c
(a) Média ± desvio padrão; NI = não identificado; Letras diferentes significam
diferenças ·est.a.tist-rcament.e s+gnificantes {p < a ,OS}
De um modo geral, os ácidos graxos monoinsaturados foram os que
sofreram menor influência do processamento, tanto em relação ao cozimento
quanto à fritura, não apresentando d#erenças signíficathfas quando
comparados à amostra não processada.
Resultados e Discussão 60
70
60 I'G 50 ~
' I'G 40 Q) "C 30 ~ o
20
10
O Fresco Cozido Frito
• Saturados o Monoinsaturados o Polinsaturados
Figura 5.2. Efeito dos processamentos sobre a composição de ácidos graxos em camarão
rosa (Penaeus brasiliensfs + Penaeus pãUfensis)
A concentração de ácidos graxos saturados no camarão foi reduzida
de 32,9% para 13,7% após a fritura, comportamento esse semelhante ao
observado por GAll et ai. (1983) e por CANOELA et ai. (1996; 1998) em
espécies diferentes de pescado submetidas à fritura. Em todos estes casos.
como também no presente trabalho, o ácido palmítico (C16:0) foi o que
sofreu maior redução. De acordo com a Tabela 5.7, a redução do ácido
pafmftico atingiu 58,9%.
o aumento observado na concentração de ácidos graxos
polinsaturados reflete claramente a absorção de lípides do meio de fritura,
mencionada anteriormente. O ácido tinotéil...-o (C18:2ro6) presente em mator
quantidade no óleo de girassol, Iltilizado na fritura, foi o ácido graxo que teve
o maior incremento. Enquanto no camarão fresco sua proporção em relação
aos ácidos graxos totais chegava a 2,51 %, na amostra frita atingiu 61,82%
(p<O,OO1), cerca de 25 vezes mats.
Resultados e Discussão 61
Em relação ao EPA e DHA, dois importantes ácidos graxos
polinsaturados da série 003, as alterações produzidas pelo processamento
foram surpreendentes. No camarão submetido ao cozimento, as
concentrações desses ácidos graxos se mostraram um pouco aumentadas.
Este aumento só chegou a ser significativo (p<O,01) para o EPA, ou seja, de
17,79% para 21,1% (Tabela 5.7).
No camarão submetido à fritura, no entanto, houve aparentemente
uma redução nos níveis de EPA e de DHA. Este fato foi observado também
em diferentes espécies de sardinha mas não em todo o pescado analisado.
O salmão, por exemplo, não apresentou nenhuma mudança nas
concentrações de EPA e DHA durante a fritura (SÁNCHEZ-MUNIZ et a/.,
1992; CANDELA et a/., 1998). Estes diferentes comportamentos pareciam
estar relacionados à quantidade inicial de EPA e DHA no produto fresco,
sendo que quanto maior o teor destes ácidos graxos, maior era sua perda
para o meio de fritura.
O estudo de SHOZEN et aI. (1995) confirmou esta suspeita.
Submetidos à "grelhagem", produtos marinhos ricos em EPA diminuíram
sensivelmente seus níveis de ácidos graxos polinsaturados, em relação
àqueles produtos contendo baixas concentrações deste ácido graxo.
Resultados semelhantes foram também obtidos por CANDELA et aI. (1997).
Três tipos de pescado foram submetidos à fritura e aquele que
originalmente possuía menor quantidade de EPA e DHA, passou a se
constituir na maior fonte destes ácidos graxos após o processamento,
devido à sua relativa estabilidade ao processo de fritura.
Este fato é extremamente relevante, uma vez que em nossa cultura
ocidental o hábito de se ingerir o pescado cru não é muito difundido e a
fritura se constitui num dos processamentos mais usuais, tanto para o
camarão quanto para os demais produtos marinhos. Desta forma, alguns
Resultados e Discussão 62
alimentos desejados por se constituírem em excelentes fontes de ácidos
graxos (03, na sua forma natural, após o processamento poderiam ter os
seus efeitos benéficos reduzidos.
A absorção do óleo do meio de fritura ainda leva à uma alteração
bastante importante, a relação ro3/ro6. Como os óleos vegetais são as
maiores fontes de ácidos graxos polinsaturados da série ro6, a absorção do
óleo de fritura pelo produto aumenta · a proporção de ácidos graxos ro6 em
relação aos ro3. Enquanto o camarão fresco apresentou uma relação ro6/ro3
de 0,33 , o camarão frito atingiu 18,86 , quase 60 vezes maior. Este efeito
pode ser minimizado, pela escolha de outro óleo de fritura, com menor
concentração de ácidos graxos (06, ou ainda, com maior teor de ro3.
De modo geral, pôde-se considerar que a fritura do camarão em óleo
de girassol, além de ter aumentado o teor lipídico total do produto, ainda
limitou os efeitos positivos da presença de ácidos graxos ro3, seja
diminuindo a sua concentração ou aumentando a proporção (06/(03, durante
o processo.
Resultados e Discussão 63
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Figura 5.3. Cromatograma da composição de ácidos graxos de camarão-rosa (penaeus
brasiliensís + Penaeus paulensís) fresco.
Resultados e Discussão 64
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Figura 5.4. Cromatograma da composição de ácidos graxos de camarão-rosa (penaeus
brasiliensis + Penaeus paulensis) submetido ao cozimento.
Resultados e Discussão
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Figura 5.5. Cromatograma da composição de ácidos graxos em camarão-rosa (Penaeus
brasíliensis + Penaeus paulensis) submetido à fritura.
65
Resultados e Discussão 66
5.2.3. COLESTEROL E 7 -CETOCOLESTEROL
No presente estudo, os processamentos térmicos do camarão-rosa
fresco (P. brasiliensis + P. paulensis) , de um modo geral, levaram a uma
·d-imi·Atliçãe -nas 'cof'rCentraçOOsdecofestero-l- 'e 7-cetocoles-terol -Hvres. Essa
redução foi bem maior na fritura do que no cozimento, e mais acentuada para
o 7-cetocolesterol do que para o colesterol (Figura 5.5). A variação particular
destes compostos diante dos processamentos, será discutida
indivi-dtlal·mente.
2 750
1,6 600
1,2 450 OI
OI o - o OI ~ -::J OI
0,8 300 E
0,4 150
o o Fresco Cozido Frito
-+-7-Ceto -+-Colesterol
Figura 5.6. Efeito dos processamentos térmicos sobre as concentrações de colesterol e 7-
cetcolesteroi iivres (base seca) em camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulens;s).
5.2.3.1 Colesterol
A redução das concentrações de colesterol livre só foi significativa
(p<O,05) na fritura (Figura 5.6) . A concentração média de colesterol livre no
camarã0'-coziOO' foi' 1-0-,7% -meoor,enq-uarrto -i'i0-fFtto 24,7%. -Esta -mmmuiçã<:>
poderia estar relacionada com a oxidação do colesterol,. e conseqüente
formação de óxidos, com a sua degradação térmica, ou ainda, com sua
eluição no óleo de fritura. O tipo de tratamento térmico a que o produto é
Resultados e Discussão 67
submetido, tempo, temperatura e forma de exposição ao calor, vão
determinar quais os processos envolvidos. Por outro lado, não pode ser
desCOflStderado -o fato de -que -o óteo -de soja contém anti-oxl-dante, o q-uat
poderia também estar prote.gendo o colesterol em relação à oxidação.
750 -~ ----- - -- - -- .- - - - -- ------------ - -- - - -- - - - ------- - - - -- - - - -- -- - -- - -- -----------.--------------- - -- - ~ --
C) 600 o o -- 450 C)
E Õ 300 '-G) -fi) 150 G)
Õ u o
1 2 3 4
• Fresca o Cozida o Frita
Figura 5.7. Efeito dos processamentos térmicos sobre a concentração de colesterol livre
(trc3b-e set,-a-) em camarão-ros-a( P. brasiliensis + P. paulerrsis)
HONG et aI. (1996) observaram uma redução do colesterol total em
torno de 10%, submetendo lulas (Todarodes pacificus) ao cozimento em
água- por 5 minutoS". Quando· este mes·mo· produto foi submetido' ·à expos+ção
direta ao vapor para desidratação ("steaming")., também por 5 minutos, a
perda de colesterol foi bem mais acentuada, chegando a 25%. OSADA et aI.
(1993b) também observaram em relação à lula, uma redução de 36 e 55%
durante -os- -procedimentos de -secagem e ·en·latafrrento, -res-pectivamente. Em
hambúrguer, RODRIGUEZ-ESTRADA et aI. (1997) observaram redução na
concentração de colesterol em seis processamentos diferentes, sendo que
no cozimento, a 100° C por 20 minutos, esta redução chegou a 41 %_ Quando
a temf'erat-urautilizada- é maior,entre 460 e 185°C, o -desaf'a-reci-mento-d-o
colesterol está muito mais relacionado à sua de_gradação térmica do que à
oxidação (PARK & ADDIS, 1986b).
Resultados e Discussão 68
A diminuição na concentração de colesterol total durante a fritura foi
uma observação unânime em todos os estudos que avaliaram o efeito deste
processamento. MAl et ai. (1978) observaram diminuição em filés de peixe
grelhados, assados e fritos, mas apenas a fritura atingiu valores
significativos. CANDELA et a/. (1997) verificaram redução entre 15 e 22%
em três espécies de peixes e associaram a perda de colesterol à sua
eluição no óleo de fritura. Este fato foi confirmado por WU & LlLLARD
(1998) que igualmente trabalharam com filés de peixe, e também, em nosso
presente estudo (Tabela 5.8).
Embora a eluição no óleo de fritura, possa ser a hipótese mais
plausível para a redução do colesterol em produtos fritos, SANCHEZ-MUNIZ
et ai. (1992), trabalhando com sardinhas, relacionaram-na à absorção do
óleo pelo pescado. Desta forma, a concentração de colesterol, ao ser
diluída, por um maior conteúdo lipídico do produto, apresentava valores
mais baixos.
Alguns tratamentos térmicos não provocaram a redução do colesterol
total e sim seu aumento, como no estudo de WU & LlLLARD (1998), em que
filés de "catfish" (Ictalurus punctatus) foram submetidos à fritura e ao
cozimento, em microondas e forno convencional. Com exceção da fritura, os
demais processamentos provocaram o aumento na concentração de
colesterol .
Outros estudos também relataram aumento na concentração de
colesterol total. Porém os resultados não foram expressos em base seca e,
por isso, este aumento não pôde ser atribuído com certeza ao
processamento. Embora pareça óbvio que a concentração de colesterol
deva ser expressa em base seca para comparação dos tratamentos com a
amostra crua, muitos estudos não utilizaram este recurso, responsabilizando
o aumento de colesterol à perda de umidade. Foi o caso de PIE et a/.(1991),
KOWALE et al.(1996) e de KESAVA-RAO et al.(1996), que avaliaram o
Resultados e Discussão 69
efeito do processamento e da estocagem na formação de óxidos de
colesterol , em carnes de várias espécies. Nestes estudos, o aumento de
ooestefOl foi atfibuf-do à -perda deu-midadee COAs6Qüente "COflCentra-ção da
matéria seca, levando ao aumento do conteúdo lipídico e demais
componentes.
5.2.3.2 7 -Cetocolesterol
De modo semelhante ao colesterol, as concentrações de 7-
cetocolesterol livre diminuíram quando o camarão-rosa foi submetido aos
-processamentos (Hgu-ra S.7). Nas amostragens 2e 3 ,essa red·u--ção· foi
significativa (p<0,001), tanto no cozimento quanto na fritura, enquanto nas de
números 1 e 4, apenas no camarão frito os valores de 7-cetocolesterol livre
foram reduzidos de forma significativa (p<0,05).
2
O'l 1,6 -O'l :::s Õ 1,2 ~ Q) -I/) Q)
Õ 0,8 (.) o -Q)
0,4 o I ,...
o 1 2 3 4
Fresca oCozida o Frita
Figura 5.8. Efeito dos processamentos térmicos sobre a concentração de 7 -cetocolesterol
'·ivre (base sec-a} em camarão-rosa (P. brasiíiensis + P. paulensis).
Não foi confirmada a expectativa de que houvesse formação de 7-
cetocolesterol, como resultado da oxidação do colesterol, durante os
-processamentos térmicos do camarão-rosa. É altam6fite rel-e''ilante,o fato·
Resultados e Discussão 70
dos resultados obtidos sugerirem que durante a cocção e a fritura do
camarão-rosa não ocorre a oxidação do colesterol.
Os estudos que comprovaram a formação de óxidos de colesterol
durante o processamento, geralmente utilizaram períodos prolongados de
aquecimento, de 6, 12 e até 24 horas (OSADA et aI., 1993a). Em situações
extremas, como em gordura animal , o aquecimento perdurou por até 200
horas (PARK & ADDIS, 1986a; CHEN et aI., 1994). Nestes casos, a
oxidação ocorreu de maneira gradual, sendo que a formação de óxidos se
iniciou dentro das primeiras horas de aquecimento. No presente estudo, o
tempo de cozimento e de fritura foram de 4 e 3 minutos, respectivamente,
pois o interesse era reproduzir, de forma mais fidedigna possível, o
processamento usual do camarão antes do consumo.
DE VORE (1988) não observou produção de 7-cetocolesterol durante
processamento de carne bovina. Da mesma forma, RODRIGUEZ-ESTRADA
et aI. (1997) submeteram hambúrguer a seis processamentos diferentes e
em todos eles, não foi observado nenhum incremento na concentração de 7-
cetocolesterol. Neste estudo foi observada também que o valor de peróxido
diminuiu com os processamentos, sugerindo que a formação de 7-
cetocolesterol a partir destes compostos ocorreu numa velocidade menor
que a sua decomposição térmica. Além disso, os óxidos de colesterol
poderiam estar se associando a outras moléculas, tornando-se
indetectáveis.
Outros estudos reproduziram o processamento tradicional de alguns
alimentos, para avaliação do conteúdo de óxidos de colesterol. Em muitos
deles, ao contrário do que foi observado em camarão e em hambúrguer,
houve formação de óxidos durante o processamento, mesmo quando o
tempo de aquecimento era reduzido. OHSHIMA et aI. (1996), por exemplo,
observaram a formação de óxidos de colesterol entre 3 e 6 minutos de
aquecimento, durante a grelhagem de anchovas. Desta forma, observa-se
Resultados e Discussão 71
que o tempo de processamento isoladamente, pode não ser decisivo na
oxidação do colesterol. O conteúdo de lípides também possui grande
relevância, sendo que a produção de óxidos tem se mostrado sensivelmente
menor nos alimentos com baixo teor lipídico.
OSADA et aI. (1993b) avaliaram a oxidação de colesterol em sardinha
e lula desidratadas. Eles observaram que a sardinha, que possui maior teor
lipídico, apresentou concentrações mais elevadas em todos os óxidos, com
o total deles sendo duas vezes maior em relação à lula. OHSHIMA et alo
(1993) verificaram este mesmo comportamento em anchovas e camarões
cozidos/desidratados. Nas anchovas, o conteúdo lipídico foi de 25,9% (base
seca) e o total de óxidos chegou a . 171 ,2 j.!g/g (base seca), enquanto o
camarão apresentou 6,2% (base seca) de lípides e 8,3j.!g/g (base seca) de
óxidos de colesterol.
SHOZEN et alo (1995) foram mais além, ao analisarem alguns
produtos marinhos tradicionais no Japão. Relataram uma forte correlação
(~=O,98) entre as concentrações de óxidos de colesterol e o conteúdo
lipídico dos peixes. Além disso, determinaram que a maior formação de
óxidos de colesterol em peixes gordos estava relacionada não só ao seu
maior conteúdo lipídico, mas também à composição dos mesmos. Isso
porque a classe lipídica predominante no peixe gordo é a de triglicerídeos
que, ao serem oxidados, agem como um facilitador da oxidação do
colesterol (LI et a/., 1994).
Portanto, imagina-se que, o curto período de aquecimento do
camarão-rosa durante os processamentos de cozimento e fritura, associado
ao baixo conteúdo lipídico do referido crustáceo, e consequentemente à
pequena disponibilidade de substrato oxidativo, ainda que altamente
insaturado, podem não ter sido suficientes para promover a oxidação do
colesterol.
Resultados e Discussão 72
Dentre os dois processamentos avaliados, a fritura aparentemente
apresentava maior potencial para produção de óxidos de colesterol. Isso
~0fEtue a -tern~efatlffatl-tiI1-zada- -FleS-te -pmcesso- é- maisefev-ada- -~tJefl0
cozimento, aproximando-se da faixa de temperatura de maior instabilidade do
colesterol, 120 a 1500 C (OSADA et aI., 1993a; KIM & NAWAR, 1993). No
entanto, a fritura foi o processamento que levou à maior redução nos níveis
de 7 -cetocoiesterol livre. Essa redução pode estar relacionada, da mesma
forma que o co!esterol , à eluiç.ão no óleo de fritura, uma vez que a análise do
mesmo também demonstrou a presença de 7 -cetocolesterol livre. A eluição
do deste óxido em óleo foi bem maior que na água utilizada no cozimento,
stlpostamente por uma qüestão de solubilidade (Tabela 5.8.-).
Tabela 5.B. Concentrações de colesterol e 7-cetocolesterol livres na água de cozimento e
no óleo de fritura do camarão-rosa (P. brasiliensis + P. pau/ensis) .
Colesterol mg/ml 7 -Cetocolesterol Ilg/ml
Mínima Máxima Mínima Máxima
Água 0,003 0,029 0,60 0,160
Óleo 1,94 2,3 2,B 3,3
o camarão-rosa fresco e processado foi avaliado em relação às
TBARS (Tabela 5.9) e estas correlacionadas com o 7-cetocolesterol.
Os resultados observados na Tabela 5.9 indicaram uma redução das
TBARS no produto cozido entre 71,1 e 95,7%, em relação ao fresco.
Considerando-se as condições de píOcessamento, os resültados verificados
sugerem ter havido dissolu.Ç_ão na água de cozimento e/ou volatiliza.ção do
malonaldeído e de outras substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Nesse
particular, o cozimento seria um processamento altamente interessante, por
poder eliminar ou r-edüzir, ainda qüe parcialmente, sübstâncias nocivas como
o malonaldeído. A este composto tem sido atribuída .propriedades
mutagênicas e carcinogênicas (BOTSOGLOU et aI., 1994).
Resultados e Discussão 73
Da mesma forma, os resultados de TBARS para o camarão-rosa frito
revelaram uma diminuição entre 35,9 e 39,5% em relação à amostra fresca.,
com exceção do lote 3, que se comportou de modo diferente dos demais
(Tabela 5.9) .
Tabela 5.9. Valores de TBARS em camarão-rosa (P. brasiliensis + P. paulensis) fresco e
processado (a) .
Valor de TBARS ( rng Malonaldeído I kg)
Fresco Cozido Frito
1 0,74 ± 0,09 0,03 ± ° 0,47 ± 0,04
2 5:65 ±0:68 2,16 ± 0:13 3:62 ± 0:02
3 4,33 ± 0,43 1,25 ± 0,09 5,12 ± 0,82
4 6,50 ± 0,22 1,46 ± 0,09 3,93 ± 0,52
(a) Média ± desvio padrão, em base seca
Alguns estudos avaliaram a relação entre os valores de TBARS e a
oxidação de colesterol , durante a estocagem de alimentos (DE VORE, 1988;
ENGESETH et aI., 1994; VESTERGAARD & PAROLARI, 1999). Somente
DE VORE (1988) conseguiu estabelecer uma boa correlação entre a
produção de óxidos de colesterol e a quantidade de malonaldeído. Este autor
desenvolveu seu estudo em carne bovina crua e cozida, estocadas sob
refrigeração por O, 2 e 4 dias, encontrando correlações de ~ =0,82 e ~=O,98
, respectivamente.
Em nosso estudo, a correlação ~=0,34 obtida entre os valores de
TBARS e o 7 -cetocolesterol livre no camarão processado demonstrou não
existir correspondência na formação de ambos. Mesmo quando foram
analisados apenas os valores obtidos nas amostras frescas, a correlação se
mostrou baixa (~=0,43) .
Resultados e Discussão 74
Os fatores que determinam a produção de malonaldeído são os
mesmos que favorecem o processo oxidativo do colesterol , tais como, grau
de insaturação dos ácidos graxos, presença de metais e calor. Porém, o
malonaldeído é um produto da oxidação de ácidos graxos polinsaturados e,
embora estes estejam intimamente associados ao colesterol, não se pode
afirmar que a oxidação de um, invariavelmente implicará na oxidação do
outro.
S3Qsnl0NOO "9
Conclusões 75
./ foi constatada a ocorrência de 7 -cetocolesterol em camarão-rosa fresco;
./ o camarão-rosa, depois de submetido ao cozimento, apresentou uma
concentração de 7 -cetocolesterol livre menor que o camarão fresco;
./ o camarão-rosa, depois de submetido à fritura, apresentou concentrações de
colesterol e 7 -cetocolesterol livres menores que o produto fresco, sendo esta
diminuição mais pronunciada para o 7 -cetocolesterol.
SV~I:lYHOOI'BIB SVI~N~H3:13H -L
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