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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Farmácia Área de Análises Clínicas

Efeito do resveratrol e do 2-Metoxiestradiol em linhagens de melanoma humano em modelos de monocamada e de pele

reconstituída

Renato Ramos Massaro

Tese para obtenção do grau de DOUTOR

Orientadora: Profa. Dra. Silvya Stuchi Maria Engler

São Paulo 2014

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Massaro, Renato Ramos M414e Efe i to d o r e sve ra t ro l e do 2 -me to x ie s t r ad io l em l inhagens de melanoma humano em modelos de monocamada e de pe le reconsti tuída / Renato Ramos Massaro . -- São Paulo, 2014. 145p. Tese (doutorado ) – Faculdade de Ciências Farmacêut icas da Universidade de São Paulo . Departamento de Anál ises Clínicas e Toxico lógicas . Orientador: Engler , Si lvya Stuchi Maria 1 . Pele : Câncer 2. Melanona 3. Pele artificial I. T. II. Engler, Si lvya Stuchi Maria , or ientador . 616.9945 CDD

Renato Ramos Massaro

Efeito do Resveratrol e do 2-Metoxiestradiol em linhagens de melanoma humano em modelos de monocamada e de pele

reconstituída

Versão Original

Comissão Julgadora da

Tese para obtenção do grau de Doutor

Profa. Dra Silvya Stuchi Maria Engler orientador/presidente

____________________________ 1o. examinador

____________________________ 2o. examinador

____________________________ 3o. examinador

____________________________ 4o. examinador

São Paulo, __________ de 2014

Aos meus pais Sérgio Massaro e Sônia Maria Ramos Massaro

pelo apoio incondicional e compreensão

AGRADECIMENTOS

Em todo trabalho desenvolvido, por mais que tentemos fazer tudo de

forma independente (que fique claro que este não é o caso aqui), sempre

dependemos de algumas pessoas direta ou indiretamente. No meu caso, eu fiz

questão de aproveitar o máximo das pessoas que estavam à minha volta para

tornar o desenvolvimento deste trabalho mais agradável e melhorar a

qualidade deste. Dessa forma, agradeço todos os que interagiram comigo

nestes últimos quatro anos e meio, cientificamente ou não, pois graças a vocês

consegui completar esta etapa e me tornar a pessoa que sou hoje.

Agradeço especialmente a minha orienta Profa. Dra. Silvya Stuchi Maria

Engler. Durante o tempo que estive no laboratório ela esteve no exterior, eu

estive no exterior, e independente da distância, sua dedicação, atenção e

disponibilidade sempre foram notórias. Agradeço muitíssimo a paciência

comigo, e a liberdade de seguir alguns caminhos que muitas vezes eram um

tanto quanto dispersos. Agradeço a oportunidade que me deu de fazer

Doutorado Sanduiche nos Estados Unidos. Agradeço muito a oportunidade que

me deu de ensinar e me responsabilizar por uma aluna de iniciação científica, a

Mariana Bartié. Agradeço principalmente ter acreditado na minha capacidade

de desenvolver um projeto de doutorado, a insistência em querer me ensinar

caminhos que muitas vezes a minha cabeça-dura não queria me deixar ver, e

quero deixar claro que esse ensino foi muito importante para mim tanto no

âmbito científico como no pessoal. Em novembro foram completados 10 anos

que estou sob sua orientação, e agradeço a competência com a qual ela

conduziu meu trabalho. Foi uma honra ter feito iniciação científica, mestrado e

doutorado sob sua orientação. Hoje vejo que todas as discussões científicas,

cobranças e até brigas não foram nada além de preocupação em tornar seu

aluno um cientista e uma pessoa melhor. Muito obrigado.

À Prof. Silvia Berlanga de Moraes Barros por ser minha madrinha

científica e acreditar no meu trabalho durante este tempo que estive no

laboratório. Por ter dado todo o suporte e ajuda na ausência da Silvya. Por

todas as discussões e um olhar experiente e diferencial sobre o meu trabalho.

Pelas cobranças e preocupação com o meu desenvolvimento científico.

Ao Dr. Keiran Smalley por ter me dado a oportunidade de fazer meu

Doutorado Sanduiche sob sua orientação, por ter me dado chance de trabalhar

com outros projetos e com aspectos diferentes do melanoma, por ter me

incentivado a participar de aulas, congressos e simpósios no tempo que eu

estive no Moffitt Cancer Center and Research Institute. A convivência científica

e pessoal e a interação com o seu grupo de pesquisa foi essencial para a

minha formação e para o desenvolvimento do meu doutorado.

À minha banca de qualificação do doutorado: Prof. Dr. Ricardo Ambrósio

Fock, Profa. Dra. Claudimara Ferini Pacicco Lotfi e Profa. Dra. Soraya Soubhi

Smaili, vocês contribuíram muito para balizar e tornar este trabalho o que ele é

hoje.

À minha banca de defesa de doutorado por lerem meu trabalho e

contribuírem com comentários para a elaboração final.

Aos meus companheiros de laboratório, desde minha chegada há 10

anos. Alguns ficaram por menos tempo, outros por mais, mas todos

contribuíram para que eu pudesse desenvolver este trabalho. Aos que já

saíram do laboratório, Cristina Dislich Ropke, Tania Cristina Higashi Sawada,

Paula Anastácia Ferreira, Vanessa Vitoriano da Silva, Daniela Dayrell França,

Fabriciano Pinheiro, Elisângela Monteiro Pereira, Diogo Pineda Rivelli, Rebeca

Leite de Almeida, Tatiana Caroline Silveira Correa, Laura da Silva Cardeal,

Carla Abdo Brohem, Erika Regina Matheus, Raquel Brandão Haga, Fernanda

Branco Fillipin, Rafael Duarte Paes, Mariana Bartié (a melhor aluna de iniciação

científica do mundo), Vitor Castro, Taissa Mattos, Marina Gutierrez, Andréa

Mendez Araújo, Patricia Baltrukonis Bucci Casari, Maria Clara Araújo Crepaldi,

Kaio Vitzel, Mariana Figueiredo de Moura, Natalia Tamachiro, Denise Varella

Miranda, Carolina Benevenuto e Thalita Zanoni. Aos que continuam no

laboratório, Andréa Costa Fruet, Kely Medeiros Turra, Bianca Ferrucio,

Fernanda Faião Flores, Michelle Garcia Discacciati de Carvalho, Silvana

Sandri, Tatiana do Nascimento Pedrosa, Débora Kristina Magalhães Alves,

Paula Comune Pennacchi, Manoela Tiago dos Santos, Carolina Motter

Catarino, Octávio Luís Alves Gomes, Gustavo Takashi Ikeda, Garcia Pereira de

Souza e Nayane de Souza. Obrigado a todos por tornar cada dia de trabalho

mais agradável.

Aos meus companheiros de laboratório no tempo que eu estive no

exterior, Kim Paraiso, Eirik Haarberg, Sarah Slooth, Manali Phadke, Gretchen

Alicea, Inna Fedorenko e especialmente ao Vito Rebecca, com quem eu

desenvolvi grande parte do meu projeto e que me ajudou em cada etapa que

eu estive no exterior.

Às técnicas Clarissa Kera, Elaine Augusto, Silene Migliorini, Camila

Marinho e Silvia Romano pela prestatividade, eficiência e por tornar meu

trabalho no laboratório muito mais organizado e leve. Sem elas, nem metade

deste trabalho teria sido realizado.

Agradeço em especial à Carla, Laura, Rebeca, Diogo e Tati por serem

meus mentores no laboratório enquanto estavam por lá. Muito do que eu

aprendi foi com eles, principalmente com a Tati, que foi minha chefinha por

toda minha iniciação científica. Agradeço muito a vocês por todas as

discussões, análises críticas, carinho, amizade incondicional, incentivo e, claro,

a paciência de vocês em me ensinar o que sei hoje.

Aos cientistas Alice, Carla, Danilo, Gabriela, Joana, Mônica e Tatiana,

por me incentivarem e compartilharem histórias e dificuldades comigo. Ter

vocês do meu lado neste caminho foi muito importante.

Aos meus amigos. Eu tenho a sorte de ter muitos e tenho medo de

esquecer de colocar aqui o nome de alguém aqui, então não vou citá-los.

Todos vocês foram muito importantes para mim e para a manutenção da minha

sanidade mental durante o desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço todos do departamento de análises clínicas e toxicológicas,

acho que neste período utilizei todos os laboratórios, sem exceção. Muitos de

vocês se tornaram meus amigos ao longo desta jornada de 10 anos. Agradeço

aos professores, alunos e agregados que, seja nos corredores desejando um

bom dia, ou na bancada ajudando na realização de experimentos, ajudaram no

desenvolvimento deste trabalho. Agradeço em especial a Profa. Ana Campa e

seus alunos por estarem sempre disponíveis para ajudar em todo e qualquer

assunto. Sinto como se este laboratório fosse uma extensão do nosso.

À minha família pelo apoio e incentivo incondicional. Aos meus pais por

todo o amor e carinho. Pai e mãe, graças a vocês eu tive condições de fazer

algo que eu amo, e sou grato todos os dias por ter o apoio, paciência (muita

mesmo) e amor incondicional de vocês. Aos meus irmãos Ric e Edu por

servirem de exemplo para mim, quando eu crescer quero ser igual a vocês. À

Luzia, que cuida de mim e me mima desde os meus 2 anos de idade. Ao tio

Poli, tia Heli e meu primo Daniel, muito obrigado por todo o incentivo. Ao Guto

por abanar sua cauda e fazer festa para mim sempre que eu chego em casa.

À Gisela Ramos do laboratório de histotécnica do ICB-USP pela

paciência em me ensinar a usar o micrótomo.

À Profa. Betina Malik do IQ-USP e seus alunos por permitirem que eu

utilizasse seu microscópio de fluorescência invertido.

Às secretarias do departamento Ana, Dora, Edna e Suely; e à secretaria

de pós-graduação, Elaine, Jorge e Miriam. À Rose e Claudinha e todos os

funcionários da FCF-USP. Vocês não fazem idéia do quanto facilitaram a

minha vida, o trabalho de todos vocês foi essencial para que eu pudesse

desenvolver o meu.

À CNPq, FAPESP, CAPES e PRP-USP pelo apoio financeiro que

possibilitou o desenvolvimento do meu trabalho.

“The universe is under no obligation to make sense to you”

Niel deGrasse Tyson

RESUMO

MASSARO, R.R. Efeito do Resveratrol e do 2-Metoxiestradiol em linhagens de melanoma humano em modelos de monocamada e de pele reconstituída. 2014. 180f. (Tese de Doutorado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013 Os melanomas são o tipo mais mortal de câncer de pele, apesar da baixa incidência, 80% das mortes de câncer de pele são devem-se ao melanoma metastático. Novas abordagens farmacológicas e a busca por novos compostos para a terapêutica do melanoma, em aplicações isolados ou em combinação com outros fármacos é imprescindível. Esta busca ocorre principalmente no campo das terapias de alvos específicos, devido à aquisição de resistência tumoral e recidiva. O resveratrol (RES) é um polifenol com atividade anti-oxidante, e seu efeito anti-tumoral foi mostrado pela indução de morte celular, porém o seu estudo não foi aprofundado pela inviabilidade do uso de altas doses in vitro para observação de efeitos celulares. Outro composto, o 2-methoxiestradiol (2ME) é um metabólito do estrógeno cujo efeitos anti-câncer já foi demonstrado em melanoma, porém sem elucidação das vias de sinalização envolvidas. O efeito em células com resistência adquirida também nunca foram testados. Neste estudo ampliamos o painel de linhagens celulares de melanoma humano, e demonstramos que o 2ME induz morte celular, inibe a proliferação destas células sendo que esta inibição está associada a indução de senescência. Pela primeira vez foi observada a inibição de proliferação pelo 2ME em células com a mutação BRAF V600E resistentes ao vemurafenibe (inibidor de BRAF) e duplo resistentes ao vemurafenibe e trametinibe (inibidor de MEK). A inibição de proliferação foi acompanhada pela modulação de p21Cip1, Ciclina B1, pRb, proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular. A exposição prolongada ao 2ME inibiu a formação de colônias em todas as linhagens de melanoma (não resistentes e resistentes), mas não teve o mesmo efeito em fibroblastos primários, mostrando efeito seletivo. Em modelo tridimensional de esferóides, foi observado que as linhagens resistentes (Sk-Mel-28R) e duplo resistentes (Sk-Mel-28RT) são mais invasivas que a parental (Sk-Mel-28). Neste modelo, o 2ME foi capaz de inibir a invasão e viabilidade destas células. No modelo de pele reconstituída, na ausência de tratamento, observa-se invasão das células de melanoma pela derme, porém este fenômeno é diminuído quando as peles são tratadas com 2ME. Estes resultados demonstram que o 2ME é um efetivo agente anti-melanoma, independente de sua resistência. Palavras chave: Resveratrol, 2-Metoxiestradiol, melanoma e pele reconstituída.

ABSTRACT

MASSARO, R.R. Effects of Resveratrol and 2-Methoxyestradiol in human melanoma cell lines in monolayer and skin reconstruct models. 2014. 180f. (Tese de Doutorado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013

Melanomas are the deadliest type of skin cancer, and in spite of the low incidence, 80% of the skin cancer associated death cases are due to metastatic melanoma. New pharmacological approaches and the search of new compounds for melanoma therapeutics, for monotherapy or combination therapy, are essential. This search occurs mainly in the targeted therapy field because of the melanoma acquisition of resistance to the current treatments. Resveratrol (RES) is a polyphenol with anti-oxidant activity, and its anti-tumor effect has been shown through the induction of cell death. However, the study of this compound has been discontinued in this work due to the impossibility of using high doses in vitro for the observation of cellular effects. Another compound, 2-methoxyestradiol (2ME) is a metabolite from estrogen, and its anti-cancer effects has already been shown in melanoma, but with no elucidation of the signaling pathways involved. Furthermore, the effects in cells with acquired resistance have never been shown. In this study we used a broader panel of human melanoma cell lines and demonstrated that 2ME induces cell death, inhibits proliferation of these cells, and this inhibition is associated with the induction of cell senescence. The inhibition of proliferation caused by 2ME was observed for the first time in BRAF V600E cells that are resistant to Vemurafenib (BRAF inhibitor) and double resistant to Vemurafenib and Trametinib (MEK inhibitor). The proliferation inhibition was related to the modulation of p21Cip1,Cyclin B1 and pRb, which are proteins involved in cell cycle regulation. Long exposure to 2ME in colony formation assay showed the inhibition of colony in all melanoma cell lines (regardless of resistance and mutational status), but not in primary fibroblasts, showing selective effect. In three-dimensional spheroid model, it was observed that the resistant (Sk-Mel-28R) and double-resistant (Sk-Mel-28RT) cell lines were more invasive than the parental cell line (Sk-Mel-28). In this model, 2ME was able to inhibit cell invasion and cell viability. In the skin reconstruct model, in the absence of treatment, melanoma cell invasion can be observed in the dermis layer. However, after the treatment with 2ME these cell invasion foci are inhibited. Altogether, these effects demonstrate that 2ME is an effective anti-melanoma agent, regardless of resistance. Key words: Resveratrol, 2-Methoxyestradiol, melanoma and reconstructed skin.

LISTA DE ABREVIATURAS

2ME 2-metoxiestradiol

3MA 3-metiladenina

5FU 5-fluorouracil

ABC ATP-Binding Cassette

ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1

AKT Também conhecido como PKB (Protein kinase B), regulador

critic da sobrevivência celular e proliferação

Apaf-1 Apoptotic protease activating factor 1

ATG5 Autophagy protein 5 ou Proteína autofágica 5, proteína

necessária para a elongação do autofagossomo

BAD Bcl-2 associated death promoter, um fator pró-apoptótico

Baf Bafilomicina A1, um inibidor de autofagia

Bax Bcl-2 associated X protein ou Proteína X associada ao Bcl-2,

um fator pró-apoptótico que antagonize a proteína Bcl-2

Bcl-2 B-cell lymphoma 2, um fator anti-apoptótico

Bcl-xl

B-cell lymphoma extra large, molécula transmembrana

presente na mitocôndria que funciona como fator anti-

apoptótico

BIM Também conhecido como BCL2L11, Bcl-2 like protein 11, um

fator pró-apoptótico

BRAF Gene que traduz a proteína B-Raf, que faz parte da família Raf

kinase

BrdU Bromodeoxyuridine ou Bromodeoxiuridina

BSC Basal Cell Carcinoma ou Carcinoma Basocelular

Cdc2 Cell division cycle protein 2, também conhecida como CDK1

ou p34cdc2

Cdc25 Cell division cycle protein 25 ou proteína 25 relacionada ao

ciclo de divisão celular, ativa Cdks pela desfosforilação

Cdk Ciclin dependent kinase ou cinase dependente de ciclina

cDNA DNA complementar, sintetizado a partir de um mRNA

CTLA4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 ou proteína 4

associada ao linfócito T citotóxico

DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole, corante fluorescente que se liga

a regiões do DNA ricas em A-T

DMEM Dulbecco’s Modified Eafle’s Medium

DMSO Dimetil Sulfóxido

DNA Desoxribonucleic Acid ou Ácido Desoxiribonucleico

DR5 Death receptor 5 ou receptor de morte 5

DTT Molecula redutora chamada ditiotreitol

ERK

Extracellular Signal-Regulated Kinases ou Cinases Reguladas

por Sinalização Extracelular, proteínas da cascada de

sinalização de MAPK

FDA Food and Drug Administration

FTI Farnesyltransferase Inhibitor ou Inibidor de Farnesiltransferase

H3K9me3 Histona H3 trimetilada na lisina 9

Hedgehog Via de sinalização chave para o desenvolvimento embrionário

HMB45 Human melanoma black 45, anticorpo que reage com antígeno

presente em melanomas melanocíticos

GFP Green Fluorescent Protein ou Proteína Fluorescente Verde

HE Hematoxilina-Eosina

HIF-1α Hipoxia inducible factor 1α ou fatori 1α induzido por hopóxia

IC50 Concentração de inibição de 50% da inibição máxima

IFNα Interferon α

IGF-1R Insulin-like growth factor 1 receptor ou receptor do fator de

crescimento 1 do tipo insulina

IL-2 Interleukin-2 ou Interleucina-2

INCA Instituto Nacional do Câncer

JNK c-Jun N-terminal kinase ou cinases c-Jun n-terminal

LC3

Microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3, pode estar

em sua forma citosólica (LC3-I) ou conjugada com

fosfatidiletanolamina (LC3-II)

MAPK Mitogen activated protein kinase – Proteínas cinase ativadas

por sinal mitogênico

Mcl-1 Fator da família Bcl-2 que inibe apoptose, conhecido como

induced myeloid leukemia cell differentiation protein

MDR Multiple drug resistance ou resistência a múltiplas drogas

MDR1 Multiple Drug Resistance protein 1 ou ABCB1

MEK Proteínas cinase da via de MAPK

MelanA Também conhecido como MART-1 (Melanoma antigen

recognized by T-cells 1, ou Antígeno 1 do melanoma

reconhecido pelas células T)

MitF Microphtalmia-associated transcription factor ou fator de

transcrição associado a microftalmia

MM Malignant Melanoma ou Melanoma Maligno

MTA Microtubules targeting agents ou compostos que atuam nos

microtúbulos

mRNA RNA mensageiro

MTT Brometo de (3- (4,5- dimetiltiazol – 2-il) -2,5 difeniltetrazólio

NOXA

Latim para dano, proteína pró-apoptótica também conhecida

como PMAIP1 (phorbol-12-myristate-13-acetate-induced

protein 1)

NRAS Gene da família RAS que codifica a proteína N-Ras (N por sua

identificação inicial em Neuroblastoma)

p21/Cip1 Cdk interacting protein 1 ou proteína 1 que interage com CDK,

é um inibidor de cinases dependentes de ciclina

p27/KIP1 CDK inhibitor 1B ou inibidor de cinase dependente de ciclina

1B

p31/comet Inibidor de SAC (ponto de checagem da mitose)

p34cdc2 também conhecida como Cdc2

p38

p38 mitogen-activated protein kinase ou proteínas cinases p38

ativadas por sinal mitogênico, são proteínas responsivas a

estímulos de estresse

p53 Proteína que regula o ciclo celular e reparo de DNA e morte

celular por apoptose

p62/SQTM1 Proteína adaptadora que se liga a ubiquitina e pode regular a

ativação de NFKB1

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis ou Eletroforese em gel de

poliacrilamida

PARP

Poly ADP ribose polymerase ou polymerase poli ADP ribose,

proteína envolvida em reparo de DNA e morte celular

programada

PBS Phosphate saline buffer ou Tampão fosfato salino

PD-1 Programmed Death – 1 (Receptor) ou Morte Programada - 1

PD-L1 Programmed Death – Ligant 1 ou Ligante de Morte

Programada - 1

PI Propidium iodide ou iodeto de propídeo

PI3K

phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, família de

proteínas envolvidas em funções celulares como crescimento,

proliferação diferenciação, tráfego de vesículas, e motilidade

PTEN Phosphatase and tensin homolog, regula negativamente a via

de sinalização de AKT

PUMA p53 upregulated modulator of apoptosis ou modulador de

apoptose supra-regulado por p53, é um fator pró-apoptótico

PVDF Polyvinylidene fluoride ou Fluoreto de polivinilideno

RAF Rapidly Accelerated Fibrosarcoma, gene que codifica

profeínas da família Raf, envolvidas na cascada de MAPK

RAS

Rat sarcoma, gene que codifica proteínas da família Ras,

envolvidas na via de crescimento celular, diferenciação e

sobrevivência

Rb Retinoblastoma protein ou proteína do retinoblastoma é uma

proteína supressora de tumor que desregulada em tumores

RECIST Response evaluation criteria in solid tumors ou critérios de

avaliação de respostas em tumores sólidos

RES Resveratrol

RNA Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucleico

RNAi RNA de interferência

ROC-1 Regulator of Ccllins-1 ou Regulador de culinas-1

SAC Spindle Assembly Checkpoint ou ponto de checagem de

ligação à fibra do fuso

SBF Soro Bovino Fetal

SCC Squamous Cell Carcinoma – Carcinoma Espinocelular

SDS Sodium dodecyl sulfato ou Dodecil sulfato de sódio

SOD Superoxide dismutase

TMRM Tetrametil rodamina metil ester

VEGF Vascular epithelial growth factor ou fator de crescimento de

epitélio vascular

Wee1 Cinase nuclear que fosforila Cdk1, inibindo-a

Wnt Via de sinalização conservada evolutivamente que regula

aspectos da célula durante o desenvolvimento embrionário

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Resumo de vias de sinalização importantes no melanoma e em sua progressão, mostrando as proteínas mais frequentemente mutadas (marcação com estrelas). Figura modificada de (Smalley, 2010) com dados de (Nikolaou et al., 2012).

11

Figura 2

Culturas de A) FP#30 – Fibroblastos B) MP#30 –

Melanócitos C) KP#30 – Queratinócitos após

separadas. Aumento de 100x. D) FP#30 – Fibroblastos

E) MP#30 – Melanócitos F) KP#30 – Queratinócitos

após separadas. Aumento de 400x

15

Figura 3

Linhagens celulares de melanoma humano

metastático que contém a proteína BRAF V600E.

Coluna da esquerda, células parentais. Coluna central,

células resistentes ao PLX4032. Coluna da direita,

Células duplo-resistentes ao PLX4032 e Trametinib.

Magnificação de 100X.

27

Figura 4

Crescimento de colônias de células da linhagem de

melanoma humano #9 em durante diferentes períodos

de tempo, para padronização do ensaio clonogênico.

29

Figura 5

Diferentes protocolos de tratamento das células com os compostos. A – sem renovar o meio de cultura contendo os compostos. B – Renovando o meio de cultura contendo os compostos 7 dias após o primeiro tratamento.

30

Figura 6

Imunofluorescência das linhagens de melanoma humano metastático indicadas realizadas com os anticorpos MelanA, MitF e HMF45. Notar a eficiência do anticorpo anti-MelanA na marcação de todas as linhagens celulares utilizadas, mostrando sua possível utilização para a identificação de melanomas nos ensaios futuros a serem realizados com a pele reconstituída. Fotografias adquiridas com magnitude

32

de 200X.

Figura 7

Pele artificial reconstituída tratada com veículo (A e C)

e 2ME na concentração de 5µM (B e D). Em ambos os

casos é possível observar a diferenciação da epiderme

em diversas camadas, desde a camada basal até a

camada córnea.

34

Figura 8 Estrutura química do Resveratrol 35

Figura 9 Citotoxicidade do Resveratrol em linhagens de

queratinócito imortalizadas HaCaT. 39

Figura 10

Efeito dose dependente do 2ME nas células primárias

e linhagens de melanoma humano após 24h 48h e

72h.

40

Figura 11 Efeito tempo dependente do RES nas células

primárias e linhagens de melanoma humano. 41

Figura 12

Fotos das células primárias e de melanoma Sk-Mel-19

tratadas com o composto 2-metoxiestradiol por 72h na

concentração de 100µM. Aumento de 100x.

43

Figura 13


Sk-Mel-103 Sk-Mel-147 e Sk-Mel-173 tratadas com o

composto Resveratrol por 72h na concentração de

100µM. Aumento de 100x.

44

Figura 14

Dot-plot das célualas marcadas com Anexina-APC e

PI e submetidas a citometria de fluxo após tratamento

com RES nas concentrações de 50µM e 100µM por

48h e 72h.

45

Figura 15 Histograma da quantificação dos eventos mostrados

no Dot-plot da citometria de fluxo das células de

melanoma Sk-Mel-103 tratadas por 48h (A) e 72h (B)

46

com RES nas concentrações de 50µM e 100µM.

Figura 16

Imunoblotting da proteína que participa da vida

apoptótica Caspase-9, na linhagem de melanoma Sk-

Mel-103 após tratamento com RES por 48h e 72h.

47

Figura 17

Crescimento de colônias de fibroblastos primários e

linhagens de melanoma humano após tratamento com

RES nas concentrações indicadas.

48

Figura 18

Quantificação do número de colônias formadas em

uma das replicatas dos ensaios de formação de

colônias.

49

Figura 19

Efeito do RES administrado nas concentrações acima

indicadas no número total de células após 24h, 48h e

72h de exposição ao composto.

50

Figura 20

Número total de células nas diferentes culturas

primárias e linhagens de melanoma humano após

tratamento com RES nas diferentes concentrações por

24h, 48h e 72h.

51

Figura 21 Estrutura química do 2-Methoxiestradiol 52

Figura 22 Efeito citotóxico do 2-ME em células primárias e de

melanoma por MTT. 55

Figura 23

Ensaio sem replicatas da citotoxicidade do 2ME com

concentrações superiores a 10µM, mostrando um

aumento da densidade ótica não condizente com a

quantidade de células observadas nas placas,

justificando o uso de 10µM como concentração

máxima de 2ME nos experimentos seguintes.

56

Figura 24 Citotoxicidade do 2ME no queratinócito imortalizado

HaCaT. 57

Figura 25

Efeito dose dependente do 2ME nas células primárias

e linhagens de melanoma humano após 24h 48h e

72h.

58

Figura 26 Efeito tempo dependente do 2ME nas células

primárias e linhagens de melanoma humano. 59

Figura 27


tratadas com o composto 2-metoxiestradiol por 72h na

concentração de 10µM. Aumento de 100x.

60

Figura 28

Fotos das células primárias e de melanoma Sk-Mel-28,

Sk-Mel-103, Sk-Mel-147, e Sk-Mel-173 tratadas com o

composto 2-metoxiestradiol por 72h na concentração

de 10µM. Aumento de 100x.

61

Figura 29

Crescimento de colônias de fibroblastos primários e

linhagens de melanoma humano após tratamento com

2ME nas concentrações indicadas.

62

Figura 30

Quantificação do número de colônias formadas em

uma das replicatas dos ensaios de formação de

colônias.

63

Figura 31

Crescimento de colônias de diferentes linhagens de

melanoma humano após tratamento com 2ME nas

concentrações indicadas.

64

Figura 32

Crescimento de colônias de diferentes linhagens de

melanoma humano resistente ou duplo resistente após

tratamento com 1,0µM de 2-ME.

65

Figura 33

Efeito do 2ME administrado nas concentrações acima

indicadas no número total de células após 24h, 48h e

72h de exposição ao composto.

65

Figura 34 Número total de células nas diferentes culturas

primárias e linhagens de melanoma humano após 67

tratamento com 2ME nas diferentes concentrações por

24h, 48h e 72h.

Figura 35

Curvas de crescimento e tempos de dobramentos das

linhagens de melanoma humano indicadas após

tratamento com 2ME nas concentrações de 0,5µM e

1µM.

68

Figura 36

Gráficos da inibição de proliferação verificados por

ensaio de Alamar Blue, após tratamento das linhagens

indicadas com 2ME por 3 dias, 5 dias e 7 dias.

70

Figura 37

Gráficos da inibição de proliferação (preto) e suas

curvas ajustadas ou fit curves (vermelho), após

tratamento das linhagens indicadas com 2ME por 3

dias, 5 dias e 7 dias.

71

Figura 38

Gráficos da inibição de proliferação de linhagens de

melanoma humano com a substitção NRAS Q16R

após tratamento com 2ME por 3 dias.

72

Figura 39 Dot-plot das célualas marcadas com Anexina-APC e PI e submetidas a citometria de fluxo após tratamento com 2ME na concentração de 10µM por 48h e 72h.

73

Figura 40

Histograma da quantificação dos eventos mostrados

no Dot-plot da citometria de fluxo das células de

melanoma #9 tratadas por 48h (A) e 72h (B) com 2ME

na concentração de 10µM.

74

Figura 41

Análise da indução de apoptose por marcação com

Anexina V e TMRM (despolarização de membrana

mitocondrial) após tratamento com as doses indicadas

de 2ME por 5 dias.

75

Figura 42 Western blotting após 3 dias de tratamento com 2ME. 77




Figura 46

Linhagem de melanoma humano Sk-Mel-103

transfectada com GFP-LC3 sob microscopia invertida

após tratamento com 2ME nas condições indicadas,

mostrando a formação de vacúolos autofágicos.

Aumento 160X.

80

Figura 47

Linhagem de melanoma humano Sk-Mel-103 após

tratamento com 2ME nas condições indicadas, e

incubadas com o corante Acridine Orange, mostrando

a formação de vesículas ácidas em vermelho. Controle

sem tratamento fotografado após 72h. Aumento 100X.

81

Figura 48

Western Blotting da proteína LC3 em linhagem de

melanoma Sk-Mel-103 após 72h de tratamento nas

condições indicadas, mostrando as duas isoformas da

proteína: citoplasmática (LC3-I) e lipidada (LC3-II).

82

Figura 49

Western Blotting para a proteína p62/SQTM1 em

diferentes linhagens de melanoma humano tratadas

com as concentrações indicadas de 2ME por 3 dias.

83

Figura 50

Western Blotting para as proteínas Beclin-1, LC3 e

ATG-5 em diferentes linhagens de melanoma humano

tratadas com as concentrações indicadas de 2ME por

3 dias.

84

Figura 51

Histograma da citometria de fluxo mostrando as

populações de células nas diferentes fases do ciclo

celular após 24h de tratamento com o 2ME.

85

Figura 52

Histograma da citometria de fluxo mostrando as

populações de células nas diferentes fases do ciclo

celular após 48h de tratamento com o 2ME.

86

Figura 53

Gráfico de barras representando as populações de

células nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, após

diferentes tratamentos por 24h.

87

Figura 54

Gráfico de barras representando as populações de

células nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, após

diferentes tratamentos por 48h.

87

Figura 55

Western Blotting de proteínas relacionadas à transição

G2/M do ciclo celular em linhagens de melanoma

humano tratadas com 1,0µM de 2ME pelos tempos

indicados.

88

Figura 56

Western Blotting de proteínas relacionadas à transição

G2/M do ciclo celular em linhagens de melanoma

humano tratadas com as concentrações indicadas por

5 dias.

89

Figura 57

Western Blotting de ERK e pERK em linhagens de

melanoma humano tratadas com 1,0µM de 2ME pelos

tempos indicados.

91

Figura 58

Células das linhagens indicadas cultivadas por 5 dias

na presença ou ausência de 1,0µM de 2ME coradas

para β-galactosidase associada à senescência.

Aumento 160X.

92

Figura 59

Western bloting para a proteína Histona H3 trimetilada

na lisina 9 (H3K9me3) em células tratadas por 3 dias

com 2ME nas concentrações indicadas.

93

Figura 60

Western bloting para a proteína Histona H3 trimetilada

na lisina 9 (H3K9me3) em células tratadas com 1,0µM

de 2ME nos tempos indicados

94

Figura 61 Células das linhagens indicadas cultivadas por 5 dias

na presença de 0,5µM, 1,0µM ou 2,0µM de 2ME e 95

depois por mais 3 dias na presença (fotos superiores)

ou ausência (fotos inferiores) deste composto, e então

coradas para β-galactosidase associada à

senescência.

Figura 62

Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da

tubulina na linhagem Sk-Mel-28 após 3 dias de

tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho -

Actina.

97

Figura 63



tratamento. Sobreposição: Azul –DAPI. Verde –

Tubulina. Vermelho – Actina. Barras - 25µm.

97

Figura 64



tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho –

Actina.

98

Figura 65





98

Figura 66




Actina.

99

Figura 67





99

Figura 68 Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da 100


tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho -

Actina

Figura 69




Tubulina. Vermelho – Actina. Barras - 25µm

100

Figura 70

Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-147 após 3 dias de tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina.

101

Figura 71





101

Figura 72




Actina

102

Figura 73





102

Figura 74

Esferóides da linhagem Sk-Mel-28 tratados com

concentrações de 1,0µM e 5,0µM de 2ME e coradas

para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis

(vermelho).

103

Figura 75 Esferóides da linhagem Sk-Mel-103 tratados com

concentrações de 1,0µM e 5,0µM de 2ME e coradas 104


(vermelho).

Figura 76




(vermelho).

105

Figura 77




(vermelho).

106

Figura 78

Quantificação da fluorescência de uma replicata

experimental dos esferóides referente ao experimento

ilustrado nas figuras 75 a 78. Valores da quantificação

da fluorescência vermelha divididos pela fluorescência

verde em relação ao controle (Valor = 1), dando assim

a proporção de células mortas.

107

Figura 79

Esferóides das linhagens Sk-Mel-28, Sk-Mel-28R e Sk-

Mel-28RT tratados com 5,0µM de 2ME e coradas para

evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis

(vermelho).

108

Figura 80

Esferóides das linhagens Sk-Mel-19 e Sk-Mel-19R

tratados com 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar

células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

109

Figura 81

Esferóides das linhagens Sk-Mel-29 e Sk-Mel-29R

tratados com 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar


109

Figura 82

Esferóides da linhagem UACC62 tratados com 1,0µM

ou 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células

viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

110

Figura 83

Esferóides da linhagem UACC62R tratados com

1,0µM ou 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar


111

Figura 84

Quantificação da fluorescência de uma replicata

experimental dos esferóides referente ao experimento

ilustrado nas figuras 93 a 97. Valores da quantificação

da fluorescência vermelha divididos pela fluorescência

verde em relação ao controle (Valor = 1), dando assim

a proporção de células mortas.

112

Figura 85

Peles reconstituídas sem células de melanoma

(controle) coradas com Hematoxilina-Eosina (HE).

Aumento de 100x (esquerda), 200x (centro) e 400x

(direita).

113

Figura 86


(controle). Imunofluorescência para citoqueratina 10

(verde) e involucrina (vermelho). Aumento de 100x

(superior) e 200x (inferior)

113

Figura 87


(controle). Imunofluorescência para BrdU (verde) e

Filagrina (vermelho). Aumento de 100x (superior),

200x (centro) e 400x (inferior).

114

Figura 88


(controle). Imunofluorescência para Laminina (verde) e

Filagrina (vermelho). Aumento de 100x (superior),

200x (centro) e 400x (inferior).

115

Figura 89


(controle). Imuno-fluorescência para MelanA

(marcação de melanoma) em verde (superior),

Filagrina em vermelho (centro) e citoqueratina 14 em

verde (inferior). Aumento de 200x.

116

Figura 90


(controle). Controles negativos de imunofluorescência.

Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

116

Figura 91

Peles reconstituídas com células de melanoma da

linhagem Sk-Mel-28 coradas com Hematoxilina-Eosina

(HE). Aumento de 100x (esquerda), 200x (centro) e

400x (direita).

117

Figura 92

Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-

28 sem tratamento. Imunofluorescência contra

involucrina (vermelho). Aumento de 100x (superior) e

200x (inferior).

117

Figura 93


28 sem tratamento. Imunofluorescência contra o

marcador de melanoma MelanA (verde). Aumento de

100x (superior) e 200x (inferior).

118

Figura 94


28 sem tratamento. Imunofluorescência contra

laminina (verde) e filagrina (vermelho). Aumento de

100x (superior) e 200x (inferior).

119

Figura 95


28 sem tratamento. Controles negativos de

imunofluorescência. Aumento de 200x

119

Figura 96

Peles reconstituídas com células de melanoma da

linhagem Sk-Mel-28 coradas com Hematoxilina-Eosina

(HE). Aumento de 100x (esquerda), 200x (centro) e

400x (direita)

120

Figura 97 Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-

28 tratadas por 5 dias com 2ME. Imunofluorescência

contra involucrina (vermelho). Aumento de 100x

120

(superior) e 200x (inferior).

Figura 98



contra o marcador de melanoma MelanA (verde).

Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

121

Figura 99



contra laminina (verde) e filagrina (vermelho). Aumento

de 100x (superior) e 200x (inferior).

121

Figura 100


28 tratadas por 5 dias com 2ME. Controles negativos

de imunofluorescência. Aumento de 200x.

122

Figura 101

Peles reconstituídas contendo células de melanoma

Sk-Mel-28 na ausência de tratamento (coluna à

esquerda) ou tratadas com 2ME por 5 dias (coluna à

direita). Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)

(linha superior), imunofluorescência para o marcador

de melanoma MelanA em verde (linha central) e,

contra laminina (verde) e filagrina (vermelho) (linha

inferior). Núcleos celulares são evidenciados em azul

por marcação com DAPI. Notar a diferença de

celularidade na derme entre as peles tratadas e não

tratadas, evidenciando a menor invasão e proliferação

das células tumorais

123

Figura 102

Esquema do efeito do 2ME em células de melanoma

humano, mostrando seu efeito na polimerização de

tubulina (linhas vermelhas dentro das células), inibição

de proliferação (principalmente por indução de

senescência), inibição de invasão, e indução de morte

celular.

129

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Listagem das células utilizadas nos experimentos e suas mutações. 13

Tabela 2 Anticorpos primários utilizados nos ensaios de western blotting, os bloqueios e diluições utilizados, bem como os anticorpos secundários.

21

Tabela 3 Anticorpos secundários utilizados nos ensaios de western blotting, e suas diluições. 22

Tabela 4 Anticorpos utilizados nos ensaios de imunofluorescência, e suas diluições utilizados, bem como os anticorpos secundários

25

Tabela 5 Valores de IC50 para as linhagens de melanoma humano indicadas após tratamento com 2ME por 3 dias, 5 dias e 7 dias.

72

ÍNDICE

INTRODUÇÃO 1

1. Câncer de pele e Melanoma 1

2. Terapia molecular direcionada e resistência tumoral 3

OBJETIVOS 12

MATERIAL E MÉTODOS 13

1. Cultura de células 13

2. Extração de células para cultura primária 14

3. Testes de Citotoxicidade - MTT (brometo de (3- (4,5- dimetiltiazol –

2il) – 2,5 difeniltetrazólio))

16

4. Testes de Citotoxicidade - Alamar Blue 16

5. Testes de Citotoxicidade - Exclusão por Azul de Tripan 16

6. Análise do ciclo celular por citometria de fluxo 17

7. Análise de apoptose por citometria de fluxo (Anexina V e Iodeto de

Propídeo)

17

8. Citometria de fluxo para análise de apoptose e potencial de

membrana mitocondrial (Δψm)

18

9. Contagem do número total de células para avaliação da proliferação

celular

18

10. Curvas de Crescimento 19

11. Western Blotting - Obtenção dos extratos protéicos 19

12. Western Blotting - Separação das proteínas no gel de SDS-PAGE e

Transferência para membrana

19

13. Western Blotting - Incubação das membranas com anticorpos 21

primários e secundários

14. Superexpressão do gene LC3 fusionado a GFP em células de

melanoma humano através de lentivírus

22

15. Ensaio Clonogênico ou Ensaio de Formação de Colônias 23

16. Esferóides 23

17. Imunofluorescência 24

18. Obtenção de linhagens resistentes e duplo-resistentes 25

19. Coloração para β-galactosidase associada à senescência 27

20. Pele reconstituída contendo melanoma como modelo biomimético

de invasão

28

PADRONIZAÇÃO DE EXPERIMENTOS 29

1. Padronização do tempo de tratamento do ensaio de formação de

colônias

29

2. Imunofluorescência para padronização de marcação de células de linhagens de melanoma

30

3. Padronização da pele reconstituída para ensaios tridimensionais 33

CAPÍTULO 1 – RESVERATROL 35

1. Resveratrol e câncer 35

CAPÍTULO 1 – RESVERATROL – RESULTADOS 39

1. Citotoxicidade do RES por Azul de Tripan 39

2. Citotoxicidade por indução de apoptose analisada por citometria de

fluxo

45

3. Indução da apoptose verificada por clivagem de caspase 46

4. Ensaio de formação de colônias 48

5. Contagem do número total de células para análise de proliferação 49

CAPÍTULO 2 – 2-METOXIESTRADIOL 52

1. 2-Metoxiestradiol e câncer 52

CAPÍTULO 2 – 2-METOXIESTRADIOL – RESULTADOS 55

1. Citotoxicidade do 2ME por MTT 55

2. Citotoxicidade do 2ME por Azul de Tripan 57

3. Ensaio de formação de colônias 62

4. Contagem do número total de células 65

5. Curvas de Crescimento 68

6. Ensaio de Alamar Blue e IC50 69

7. Análise da externalização de fosfatidilserina e permeabilidade da

membrana celular (Anexina V e Iodeto de Propídeo) por citometria de

fluxo

73

8. Externalização de fosfatidilserina e potencial de membrana

mitocondrial (Anexina V e TMRM) por citometria de fluxo

74

9. Indução da via de sinalização da apoptose 76

10. Análise da indução de vacúolos autofágicos 79

11. Indução de vesículas ácidas 80

12. Proteínas associadas à regulação do processo autofágico 82

13. Análise do ciclo celular por citometria de fluxo 84

14. Análise de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular 88

15. Outras proteínas relacionadas à proliferação 90

16. Ensaios para detecção de Senescência 92

17. Efeitos na polimerização da Tubulina 96

18. Efeito do 2-metoxiestradiol em Modelo de esferóides 103

19. Efeito do 2-metoxiestradiol em Modelo de Pele Reconstituída 113

DISCUSSÃO 124

CPNCLUSÃO 132

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 134

ANEXO 144

1

INTRODUÇÃO

1. Câncer de pele e Melanoma

O câncer é a principal causa de morte em países desenvolvidos, e a

segunda causa de morte em países em desenvolvimento (Jemal et al. 2011),

perfazendo 8,2 milhões das causas de todas as mortes globalmente (Globocan

2014). Nos Estados Unidos são estimados 1.665.540 novos casos de câncer

para 2014, sendo que cerca de 1/3 deste número (585.720) é o estimado para

mortes por esta malignidade (Siegel et al. 2014).

O câncer de pele é o tipo de câncer mais comum na população de pele

clara em todo o mundo (Greinert 2009, Narayanan et al. 2010). Os principais

tipos de cânceres de pele são o Carcinoma Basocelular (BSC – Basal Cell

Carcinoma), Carcinoma Espinocelular (SCC – Squamous Cell Carcinoma) e

Melanoma Maligno (MM – Malignant Melanoma) (Greinert 2009). Só nos

Estados Unidos são estimados mais de 76000 casos de melanoma de pele, e

mais de 9700 mortes por este tipo de câncer (Siegel et al. 2014). No Brasil,

este câncer (melanoma e não melanoma) é o mais freqüente, sendo

responsável por cerca de 25% de todos os tumores malignos registrados (INCA

2014)

O Carcinoma Basocelular é o tipo mais frequente, e não apresenta

lesões precursoras conhecidas. Apesar da alta incidência, este tipo tumoral

raramente gera metástases, não levando a muitos óbitos. A grande maioria

destes tumores se apresenta na região da cabeça e pescoço (86%), e ele pode

invadir regiões de tecidos de menor resistência, levar a lesões de gravidade

estética e se espalhar por tecidos como cartilagem e periósteo (Netscher et al.

2011). A sua etiologia está intimamente relacionada com a desregulação da via

de sinalização de Hedgehog. Análises de microarray mostram que além das

vias de sinalização de Hedgehog e Wnt, as de apoptose, MAPK (mitogen

activated protein kinase) e de ciclo celular também estão alteradas nas células

destes tumores (Greinert 2009).

O Carcinoma Espinocelular, ao contrário do Basocelular, está mais

ligado à lesões pré-malignas. Pode ocorrer em membranas mucosas, na

genitália e metastatiza para linfonodos e de forma hematogênica. O

2

prognóstico deste tipo de tumor depende de algumas características como grau

de diferenciação, localização, tamanho e profundidade do tumor, taxa de

crescimento, recorrência e invasão perineural (Netscher et al. 2011). Para este

tipo tumoral, a etiologia está intimamente ligada à via de sinalização regulada

por p53. A análise de níveis de cDNA indica que lesões pré-malignas mostram

alterações em genes envolvidos na desregulação da produção de matriz

extracelular e no processo apoptótico. Estágios mais avançados mostram

alterações em genes envolvidos no reparo do DNA e na via da sinalização de

MAPK (Greinert 2009).

O melanoma, dentre os tipos de câncer de pele, é o de menor

frequência, sendo responsável por apenas 3%-4% dos casos, porém é letal em

cerca de 75%-80%. O prognóstico de morte para esse tipo de tumor é de 6 a 9

meses, e a taxa de sobrevida por 5 anos é menor que 5% (Gray-Schopfer et al.

2007, Greinert 2009, Nikolaou et al. 2012).

A baixa eficiência de químio-, imuno- e radioterapias no tratamento de

melanoma é uma das características deste tumor devido à sua resistência, o

que torna a busca por novos fármacos e compostos, bem como a busca de

novas estratégias eficientes para seu combate muito necessária e desafiadora

(Gray-Schopfer et al. 2007, Greinert 2009, Ibrahim and Haluska 2009, Nikolaou

et al. 2012). Particularmente, a ineficiência de compostos quimioterápicos e

outros estímulos externos de induzirem morte celular por apoptose nestes

tumores após o tratamento é uma vantagem seletiva para a progressão e

metástase do melanoma, levando à aquisição de resistência às terapias

atualmente vigentes. (Hersey and Zhang 2001, Soengas and Lowe 2003, La

Porta 2007, Ibrahim and Haluska 2009, Nikolaou et al. 2012).

3

2. Terapia molecular direcionada e resistência tumoral

Os melanócitos são células pigmentadas, que produzem melanina,

encontradas nos olhos e na pele, bem como em seus anexos. Na pele, eles se

encontram na camada basal da epiderme. Os melanomas surgem da

transformação maligna desse tipo celular (Gray-Schopfer et al. 2007, Smalley

2010, Aplin et al. 2011, Flach et al. 2011). Os melanócitos são as células que

protegem a pele da radiação UV, e a incidência desta radiação sobre eles leva

à produção de melanina para a sua proteção, bem como de células vizinhas, os

queratinócitos. Após a incidência de radiação ionizante, a maioria dos outros

tipos celulares é levada à morte ou à parada no ciclo celular como resposta

para o reparo do DNA que possa estar danificado em função da radiação. Os

melanócitos e seus precursores são “programados para sobreviver” a esses

efeitos, pois em vez de parada de ciclo e reparo de DNA estas células são

estimuladas a produzir melanina para si mesmas e suas células vizinhas. Além

disso, por estímulos parácrinos estas células têm seus níveis de Bcl-2, um fator

anti-apoptótico, e do fator de transcrição MitF aumentados em situações de

estresse por radiação ionizante, e estes são alguns motivos pelos quais os

melanomas são tão resistentes ao efeito de diversas drogas (Soengas and

Lowe 2003). Além disso, as bombas de efluxo e as enzimas de detoxificação, o

aumento do nível de proteínas anti-apoptóticas e a diminuição dos níveis de

proteínas pró-apoptóticas, são características do melanoma adquiridas de

forma primária, e não durante ou após o tratamento (Soengas and Lowe 2003).

Isso contribui para a quimio-resistência inicial deste tipo de tumor, que

corrobora a hipótese de que estas células, como colocado por Soengas e Lowe

(2003) “nasceram para sobreviver”.

Assim, os melanomas são refratários a diversos tipos de terapia, e

muitos testes clínicos com estratégias de imunoterapia, radioterapia e

quimioterapia falham em aumentar a sobrevida de pacientes que sofrem dessa

malignidade (Soengas and Lowe 2003, Ibrahim and Haluska 2009, Aplin et al.

2011, Nikolaou et al. 2012). A quimiorresistência a fármacos é um problema

crítico na terapia de melanoma. Um dos mecanismos mais conhecidos é o de

resistência a múltiplas drogas (MDR) e em melanomas é ocasionado pela

expressão elevada de transportadores do tipo ATP-binding cassette (ABC),

4

acompanhada pela síntese de P-glicoproteína, produto do gene MDR1/ABCB1.

Várias proteínas da superfamília ABC são responsáveis pelo bombeamento de

compostos antitumorais, externalizando os fármacos e cumprindo, assim, um

papel importante na transformação neoplásica dos melanócitos (Childs and

Ling 1994, Deichmann et al. 2005).

A Decarbazina, um agente metilante, ainda é a quimioterapia aprovada

pela FDA (Food and Drug Administration) mais eficaz para melanomas

metastáticos, mas a sua resposta clínica é de apenas 10-20% ((Lui et al. 2007,

Ibrahim and Haluska 2009, Nikolaou et al. 2012). Imunoterapia com altas doses

de IL-2 (interleucina-2) ou IFN-α (interferon-α) tem respostas clínicas menores

ou até comparáveis com a da Decarbazina, mas os efeitos adversos são mais

intensos (Ibrahim and Haluska 2009, Ji et al. 2010, Nikolaou et al. 2012). A

radioterapia não é eficaz contra melanoma, pois este é extremamente refratário

ao tratamento com radiação, que só é empregada como tratamento paliativo

em paciente com múltiplas metástases (Ibrahim and Haluska 2009).

Uma forma de tratamento é imunoterapia, e avanços no tratamento de

melanoma foram realizados neste campo. Com a vacina com o anticorpo

monoclonal específico para CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen

4) contendo peptídeo gp100 (IPILIMUMAB), que aumenta a sobrevida dos

pacientes que receberam o tratamento para cerca de 10 meses (Hodi et al.

2010, Sondak et al. 2011, Atefi et al. 2014, Mamalis et al. 2014, Sznol 2014),

esta vacina melhora as respostas imunológicas, incluindo as anti-tumorais,

tornando mais eficaz o efeito de outras drogas quando utilizadas em sinergia

(Nikolaou et al. 2012).

Mais recentemente, outro alvo tem sido o foco de imunoterapias. O

receptor PD-1 é induzido na superfície de células T do sistema imune quando

estas são ativadas, e seu ligante PD-L1 é expresso de forma constitutiva em

diferentes tumores, incluindo melanoma (Atefi et al. 2014). Quando expressos

nessas células, ocorre um sinal de inibição das células do sistema imune, as

deixando anérgicas (Atefi et al. 2014, Mamalis et al. 2014). Anticorpos contra

estas proteínas, como nivolumab (Bristol-Meyers) e lambrolizumab (Merk)

impedem esta interação, revertem esta inibição e levam à reativação do

sistema imune (Atefi et al. 2014). Este tipo de tratamento já se mostrou eficaz,

com taxas de resposta de 38% e respostas clínicas objetivas duráveis (Hamid

5

et al. 2013, Mullard 2013, Atefi et al. 2014, Mamalis et al. 2014, Sznol 2014).

Hoje, se propõe o tratamento com a combinação de diferentes anticorpos, bem

como o estudo de outros agentes que bloqueiem a ação de outros mecanismos

inibidores de células T (Sznol 2014). Um exemplo da eficácia dessas

combinações é mostrado em um trabalho recente que combina nivolumab com

ipilimumab, e mostra que esta combinação leva a respostas mais eficazes que

ambas as monoterapias (Wolchok et al. 2013, Mamalis et al. 2014).

Outras descobertas recentes dadas pela análise do perfil molecular,

hibridização comparativa de genomas e análise de mutações por

seqüenciamento de genes mostram diferentes mutações e alterações em vias

de sinalização responsáveis pelo desenvolvimento, progressão e sobrevivência

do melanoma (Gray-Schopfer et al. 2007, Russo et al. 2009, Smalley 2010).

Esses dados sugerem que o melanoma tem uma etiologia muito complexa e

que representa um grupo de tumores muito heterogêneo, com padrões de

mutações oncogênicas, superexpressão de genes e amplificações distintos

(Brose et al. 2002, Ibrahim and Haluska 2009, Smalley 2010, Nikolaou et al.

2012). Um resumo de algumas das mutações presentes em vias de sinalização

importantes em melanoma está apresentado na Figura 1. A descoberta destas

mutações possibilitou estratégias de tratamento direcionadas para alvos

moleculares específicos de cada tipo de melanoma com determinadas vias de

transdução alteradas (como a via de RAS-RAF-MAPK), e a combinação de

drogas direcionadas para estes alvos levaria a uma maior eficiência e

benefícios terapêuticos (Russo et al. 2009, Smalley et al. 2009, Ji et al. 2010,

Nikolaou et al. 2012, Das Thakur et al. 2013).

Com a descoberta de mutações que tornam as proteínas NRAS e BRAF

ativas e subsequente ativação constitutiva da via de sinalização de

sobrevivência das MAPKs (mitogen-activated protein kinase), começou uma

nova fase na busca de compostos para o tratamento de melanomas (Fecher et

al. 2009, Smalley 2010). As proteínas RAS sofrem modificações pós

traducionais, como a farnesilação, gerolinação e isoprenilação, para sua

localização na membrana e posterior ativação. FTIs (farnesyltransferase

inhibitors) foram utilizados para inibir sua ativação, e apesar de citotoxicidade in

vitro testes clínicos de fase II foram interrompidos pelas respostas negativas

dos pacientes (Fecher et al. 2009). BRAF é um sinalizador da via de MAPKs a

6

jusante à proteína RAS. Apesar de NRAS estar mutado em 15% a 20% dos

melanomas (Brose et al. 2002) sabe-se hoje que cerca de 60% dos melanomas

têm mutações em BRAF (Davies et al. 2002). Destas mutações presentes no

gene de BRAF 80% delas resultam numa substituição V600E (Smalley 2010,

Wan et al. 2004).

Um desses alvos específicos, que ocorre em cerca de 60% dos

melanomas metastáticos, é a proteína BRAF, que é mutada no sítio V600E

levando a uma proteína com atividade constitutiva (Brose et al. 2002, Davies et

al. 2002, Gray-Schopfer et al. 2007, Smalley et al. 2009, Ibrahim and Haluska

2009, Puzanov and Flaherty 2010, Nikolaou et al. 2012). Tendo a terapia

direcionada específica como objetivo, um novo fármaco desenvolvido para o

tratamento de melanomas é o inibidor específico de BRAF (Vemurafenibe), que

tem especificidade maior pelo BRAF com a mutação V600E que para o BRAF

selvagem, e compostos como este revolucionaram o tratamento de melanoma

(Smalley 2010, Aplin et al. 2011, Nikolaou et al. 2012, Das Thakur et al. 2013,

Mamalis et al. 2014). Este composto mostrou, em testes clínicos de fase I, que

81% dos pacientes com tumores que apresentavam esta mutação mostraram

resposta objetiva de regressão do tumor por critério RECIST, após o

tratamento com Vemurafenibe (Flaherty et al. 2010). Por outro lado, a melhoria

no período de sobrevida sem tumor não foi muito efetivo, sendo em média de 7

meses (Smalley and Sondak 2010, Aplin et al. 2011, Mamalis et al. 2014),

mostrando que os tumores tornam-se, a longo prazo, resistentes ao tratamento

com este composto.

A resistência ao Vemurafenibe adquirida pelas células tumorais pode ser

devida a diversos fatores, como a reativação da sinalização da via RAF-MEK

por aumento compensatório da expressão de outras moléculas, por alterações

na via reguladora de ciclo celular por ERK1/2, por ativação de vias de

sinalização alternativas, ou por alterações epigenéticas (Nikolaou et al. 2012,

Yap et al. 2013). Um trabalho recente mostra que o tratamento de células

BRAF mutantes com Vemurafenibe pode ser mais eficiente dependendo da

administração deste composto. Verificou-se que as células tratadas

continuamente com esta droga podem se tornar dependentes da reativação da

via de sinalização RAF-MEK-ERK, e que a descontinuidade do tratamento leva

a uma remissão tumoral (Das Thakur et al. 2013). Sendo assim, a

7

administração intermitente do Vemurafenibe mostrou-se mais eficiente que o

tratamento contínuo.

A aquisição da resistência aos inibidores de BRAF em tumores BRAF

mutantes levou a extensa pesquisa dos mecanismos pelos quais os tumores se

tornavam irresponsivos a este tratamento. Diversos trabalhos discutem que

diferentes vias compensatórias são ativadas em tumores que voltam a crescer

em pacientes tratados com Vemurafenibe ou Darbafenibe (Yap et al. 2013,

Luke and Hodi 2013, Larkin et al. 2014, Ma et al. 2014, Long et al. 2014,

Kwong and Davies 2014, Grazia et al. 2014).

Dentre estes mecanismos está a reativação da via das MAPK por

mutações ativadoras de NRAS, amplificação de BRAF V600E ou ativação

independente por receptores tirosina kinase (Flaherty et al. 2012, Luke and

Hodi 2013, Long et al. 2014, Grazia et al. 2014, Kwong and Davies 2014).

Desta forma, foram propostos estudos com combinações de inibidores de

BRAF com inibidores específicos de MEK. Em estudos clínicos, estas

combinações se mostraram eficientes, levando a aumento na sobrevida livre de

tumor, e na rsposta global em pacientes com melanomas BRAF mutantes

(Flaherty et al. 2012, Long et al. 2014, Larkin et al. 2014).

Outros mecanismos de resistência aos inibidores de BRAF V600E

compreendem ativação da via de PI3K/AKT (Menaa 2013, Luke and Hodi 2013,

Grazia et al. 2014). Combinações de inibidores de BRAF com agentes que

inibem esta via foram propostas e estão sendo testadas (Menaa 2013, Lassen

et al. 2014, Kwong and Davies 2014, Grazia et al. 2014). De fato, um estudo

combinando o inibidor de BRAF dabrafenibe com o inibidor de AKT

GSK2141795B mostrou que os dois compostos em conjunto têm efeito

sinérgico na inibição do crescimento tumoral e na indução de morte celular.

Além disso, a adição deste composto no tratamento de células tumorais de

melanoma leva a um retardamento na aquisição de resistência pelas mesmas

(Lassen et al. 2014).

Além da via das MAPKs outras vias são freqüentemente ativadas em

melanomas, é o caso da via de PI3K/AKT, que já foi citada acima como via de

resistência, e está relacionada com sinalização para crescimento celular,

proliferação, motilidade e sobrevivência (Fecher et al. 2009, Smalley 2010).

PTEN é uma proteína que, quando ativada, previne a ativação de AKT, e a

8

expressão de PTEN é perdida em cerca de 30% das linhagens de melanoma

(Lin et al. 2008), e há perda alélica de sua expressão em 58% das metástases

de melanoma (Brick et al, 2000). Somado a isso, cerca de 43% - 50% dos

melanomas possuem atividade constitutiva de AKT3 (Stahl et al. 2004). A

inibição dessa via utilizando inibidores de PI3K, ou estratégia de RNAi

inativando AKT3, reduz o crescimento de melanoma e induz a apoptose (Stahl

et al. 2004). Ensaios pré-clinicos de um inibidor de PI3K (PX-866) mostraram

significativa diminuição do crescimento e invasão em cultura 3D de esferóides

in vitro (Howes et al. 2007).

Outro alvo para novos compostos a serem testados é a via da morte

celular programada do tipo I, ou apoptose. As células tumorais acumulam uma

série de alterações genotípicas que favorecem a evasão de morte celular por

aumento da expressão de membros da família antiapoptótica Bcl-2, como Bcl-

2, Bcl-xL e Mcl-1 (Soengas and Lowe 2003, Verhaegen et al. 2006, Fecher et

al. 2009, Smalley 2010). Além disso, fatores pró-apoptóticos como Apaf-1, BIM

e BAD têm sua atividade diminuída (Datta et al. 1997, Soengas and Lowe

2003, Cartlidge et al. 2008, Smalley 2010). Tudo isso favorece um ambiente

intracelular que protege a célula tumoral da morte celular programada.

Inibidores desses fatores anti-apoptóticos, como o composto ABT-737 não

mostraram resultados pré-clinicos significantes quando usados em

monoterapia, mas quando combinados com compostos citotóxicos como

inibidores de MEK foram capazes de induzir morte celular em melanoma

(Fecher et al. 2009). Outro composto que está sendo usado atualmente em

testes clínicos de fase III e mostrou efeitos positivos em testes de fase II é o

Tasisulam (Eli Lilly and Company, Indianapolis) que mostra efeito anti-

proliferativo e citotóxico com a indução da via mitocondrial de apoptose

(Kirkwood et al. 2011, Garbe et al. 2011).

Outro processo que vem sendo rediscutido no tratamento de câncer é o

processo de autofagia, que pode ser considerado uma forma de “autodigestão”

celular. Esse nome refere-se às vias de degradação de componentes do

citoplasma como proteínas e organelas que são levadas ao lisossomo para sua

degradação. Existem pelo menos três formas de autofagia: mediada por

chaperona, microautofagia e macroautofagia (Rubinsztein et al. 2007, Levine

and Kroemer 2008). Esses processos se diferenciam em relação à forma pela

9

qual os componentes citoplasmáticos são levados ao lisossomo (Levine and

Kroemer 2008). O processo de macroautofagia é o mais estudado em câncer

por conferir resistência às células tumorais.

A resistência ao estresse conferida pela autofagia tem uma função

adaptativa nas células, porém, no contexto do câncer, pode ser considerado

potencialmente um mal adaptativo (Mizushima et al. 2008). Em tumores é muito

comum o estresse metabólico, e a maioria dos agentes quimioterápicos, bem

como a radioterapia, induzem estresse celular. Dessa forma, intensas

investigações são realizadas no sentido de estudar se a sobrevivência devida à

autofagia deve ser bloqueada em tumores para promover a morte celular

destas células (Mizushima et al. 2008). Recentes estudos mostram que inibição

genética ou farmacológica da autofagia aumenta a citotoxicidade de agentes

quimioterápicos no câncer (Kondo et al. 2005, Mizushima et al. 2008, Li et al.

2009). No melanoma as vesículas autofágicas estão intimamente relacionadas

aos melanossomos (Lazova et al. 2010). Como revisado por Fecher e

colaboradores (2010) os melanomas, em especial, contam com esse processo

para sobreviver ao estresse metabólico e terapêutico (Fecher et al. 2009). Em

estudo de Jie Li e colaboradores (2009) foi demonstrado que a inibição da

autofagia pelo composto 3-metiladenina (3-MA) aumenta o efeito da droga 5-

fluorouracil (5-FU) na indução de apoptose em células de câncer de colo retal

(Li et al. 2009). Da mesma forma, Paglin e colaboradores (2001) verificaram

que a inibição de autofagia pelo agente bafilomicina A1 em células de câncer

de colo retal, mama e próstata tratadas com radiação γ, e levou a um aumento

do efeito antitumoral e, por fim, as células morriam por apoptose (Paglin et al.

2001, Kondo et al. 2005). Trabalhos mais recentes também mostraram que, em

melanoma, a indução do processo autofágico pode ser utilizada como alvo

para o desenvolvimento de tratamentos anti-melanoma mais eficientes. Um

estudo em linhagens de melanoma BRAF selvagem mostrou que a combinação

de quimioterápicos com um inibidor de AKT (MK2206) foi eficiente no

tratamento de melanoma, mas a adição de Cloroquina para inibir o processo

autofágico potencializou o efeito desta combinação na morte celular (Rebecca

et al. 2014). Em outro estudo linhagens e tumores de melanoma BRAF

mutantes foram tratados com inibidores de BRAF ou com a combinação de

inibidores de BRAF e MEK, e se observou a indução do processo autofágico de

10

forma citoprotetora. A inibição da autofagia com hidrocloroquina inibiu o

crescimento tumoral e potencializou a indução de morte celular causada por

estes tratamentos (Ma et al. 2014).

Outra abordagem terapêutica, como o bloqueio do sistema ubiquitina-

proteassoma tem sido também usada como via alternativa que pode ser alvo

para o desenvolvimento de novos inibidores farmacológicos com potencial anti-

tumoral (Jesenberger and Jentsch 2002, Fernández et al. 2006, Tormo et al.

2009, Roberti et al. 2011, Brohem et al. 2012, Rebecca et al. 2014).

Em uma revisão recente, Yap e colaboradores (2013) discutem que a

combinação de dois compostos que têm diferentes alvos na mesma via de

sinalização (por exemplo V600E-BRAF e MAPK), alvos em vias de sinalização

paralelas (por exemplo V600E BRAF e AKT), ou mesmo alvos de vias de

sinalização diferentes que conferem mecanismos adaptativos de resistência ao

tumor (por exemplo AKT e Receptor de Fator de Crescimento Insluin-Like (IGF-

1R)) são estratégias válidas para a contenção do desenvolvimento e

crescimento tumoral. O autor também argumenta que novas investigações que

elucidam aspectos pré-clínicos destas combinações são extremamente

necessárias para elaborar testes clínicos mais eficientes (Yap et al. 2013).

Sendo assim, a resistência intrínseca ou adquirida nos melanomas é um

fator limitante importante para a contenção da doença em longo prazo,

indicando que ainda há muito a ser estudado e explorado no que diz respeito

aos mecanismos de desenvolvimento e progressão da doença. Isto torna

imprescindível o uso de terapias combinatórias e a busca de novas moléculas

anti-tumorais, bem como a elucidação dos mecanismos pelos quais a

resistência se desenvolve se torna cada vez mais importante (Smalley 2010,

Smalley and Sondak 2010, Nikolaou et al. 2012, Sznol 2014).

11

Figura 1: Resumo de vias de sinalização importantes no melanoma e em sua progressão, mostrando as proteínas mais frequentemente mutadas (marcação com estrelas). Figura modificada de (Smalley 2010) com dados de (Nikolaou et al. 2012).

12

OBJETIVOS

O presente trabalho tem como objetivo avaliar o efeito dos compostos 2-

metoxiestradiol (2-ME) e Resveratrol na contenção tumoral de linhagens de

melanoma metastático nos modelos de monocamada e pele artificial. Como

ressaltado anteriormente, diversas vias são alteradas em melanoma, e verificar

o modo de ação dos compostos e a sua possível modulação de algumas vias

de sinalização faz parte dos objetivos do projeto, sendo de suma importância

para uma possível utilização futura como composto adjuvante em pesquisas

subseqüentes.

13

MATERIAL E MÉTODOS

1. Cultura de células

As células de melanoma humano (linhagens SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-

Mel-103, SK-Mel-147, SK-Mel-173, os queratinócitos (FK289) e melanócitos

(FM305 e FM307) foram doadas pela Profa. Dra. María Soengas do Centro

Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) Madri, Espanha. É importante

ressaltar que as diferentes linhagens utilizadas possuem diferentes mutações

em diferentes genes (Tabela 1). Algumas destas mutações são comuns em

diversos casos de melanoma. Empregar diferentes linhagens é importante para

mostrar o efeito dos compostos aqui estudados de forma independente das

mutações presentes nas células.

Tabela 1: Listagem das células utilizadas nos experimentos e suas mutações.

Gene Sk-Mel

19 Sk-Mel-

28 Sk-Mel-

103 Sk-Mel-

147 Sk-Mel-

173 UACC62

P53 wt R273H wt wt wt wt

BRAF V600E V600E wt wt wt V600E

N-Ras wt wt Q61R Q61R wt wt

PTEN + + - - -/+ -

As células foram cultivadas à temperatura de 37°C em atmosfera úmida

contendo 5% de CO2. Os fibroblastos e melanomas foram mantidos em meio

DMEM (Sigma, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino e

antibióticos (100 U/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina). Os

queratinócitos foram mantidos em meio Epilife (SKU# M-EPICF-500, Cascade

Biologics) suplementado com Human Keratinocyte Growth Supplement (HKGS

- SKU# S-001, Cascade Biologics). Já os melanócitos foram mantidos com o

meio 254CF (SKU# M-254CF-500, Cascade Biologics), suplementado com

Human Melanocyte Growth Supplement (HMGS - SKU# S-002-5, Cascade

Biologics).

14

Além disso, fibroblastos, melanócitos e queratinócitos humanos oriundos

de cultura primária de pele de prepúcio foram também mantidos como descrito

acima.

2. Extração de células para cultura primária

Para obtenção de cultura primária das células da pele (queratinócitos,

melanócitos e fibroblastos) foram doados tecidos de pele de prepúcio pela Dra

Linda Maximiano, cirurgiã do Hospital Universitário (HU). Para tanto o projeto

passou por apreciação e aprovação do Comitê de Ética do HU (Processo no.

CEP HU 943/09 - ANEXO).

No dia do recebimento da pele de prepúcio é realizada uma lavagem

onde o tecido é passado em etanol 90% e em solução fosfato salina (PBS)

estéril. Para tanto, invertemos o tubo onde se encontra o tecido. Logo após, o

tecido é colocado em uma placa de Petri com 1 mL da Solução A (22,5mM

HEPES, 7,6mM Glicose, 2,25 mM KCl, 100mM NaCl, 0,75 mM Na2HPO4;

pH7,4). Deste fragmento é retirado o tecido adiposo e vasos sanguíneos

presentes e, então a pele de prepúcio é cortada em fragmentos de 3x3mm, e

são adicionados 5mL da Solução A contendo tripsina ou dispase. Após 16-18h

de incubação à temperatura ambiente, a derme e epiderme são separadas com

auxílio de pinças.

A epiderme é colocada em um tubo contendo meio específico para

queratinócitos (Clonetics - KBM-Gold – Lonza) e então é centrifugada por 3

minutos a 2000 rpm e replaqueada em placa de petri contendo meio de

queratinócitos. Após 24h o meio é substituído. Acompanha-se o crescimento

das células provenientes da epiderme ao longo dos dias. Quando a confluência

é atingida, inicia-se o processo de separação das células por meio de

tripsinização, uma vez que os melanócitos possuem uma aderência à placa e

às células muito menor que os queratinócitos. Após 1 ou 2 passagens, as

culturas estão “puras”, ou seja, não contaminadas com outras células (Figura

2). No caso dos melanócitos, são cultivados em meio específico (Cascade

Biologics Medium 254 – Life Technologies) e é adicionado o antibiótico

Gentamicina por 48h para a seleção completa, uma vez que essas células são

resistentes a ação da gentamicina.

15

Figura 2: Culturas de A) FP#30 – Fibroblastos B) MP#30 – Melanócitos C) KP#30 – Queratinócitos após separadas. Aumento de 100x. D) FP#30 – Fibroblastos E) MP#30 – Melanócitos F) KP#30 – Queratinócitos após separadas. Aumento de 400x

A derme é colocada em solução de colagenase tipo I por 4 a 12 horas

em agitação. Após esse período adiciona-se 1mL de Soro Fetal Bovino (SFB),

inativando a enzima, e a derme é centrifugada (3 minutos a 2000 rpm). O

tecido é, então, ressuspenso e colocado em placa de petri contendo 10mL de

meio DMEM suplementado com 10% SFB e antibióticos (100 U/ml de penicilina

e 100 µg/ml de estreptomicina). Após 24h o meio é substituído. Acompanha-se

a cultura dos fibroblastos, até a obtenção de uma placa com aproximadamente

90% de confluência (3-4 dias) (Figura 2).

16

3. Testes de Citotoxicidade - MTT (brometo de (3- (4,5- dimetiltiazol – 2il) – 2,5

difeniltetrazólio))

A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT, que é baseado na

redução do sal pelo sistema enzimático mitocondrial, através das atividades de

desidrogenases que clivam o anel tetrazólico e convertem o MTT em um

produto insolúvel denominado formazan, o qual reflete o normal funcionamento

da mitocôndria e conseqüentemente a viabilidade celular. As células foram

plaqueadas (104 células por poço) em placas de 96 poços por 24 horas, e em

seguida incubadas com diferentes concentrações dos compostos durante 20

horas. Após essa etapa foi adicionado MTT durante as 4 últimas horas de

incubação na concentração final de 5mg/ml, permitindo a formação do

formazan (precipitado). Toda a solução foi retirada da placa, e os cristais de

formazan foram então dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). A absorbância

de cada poço foi lida por um leitor de microplaca em 570nm.

4. Testes de Citotoxicidade - Alamar Blue

As células de melanoma foram plaqueadas (2,5x103 por poço) em

placas de 96 poços em 100µL de meio DMEM contendo 10%SBF. Após

incubação para adesão das células elas foram tratadas com veículo, 50% de

DMSO e concentrações crescentes de 2ME (0,01µM a 30µM). Após 24h, 48h e

72h a atividade metabólica das células foi verificada utilizando-se o reagente

Alamar Blue (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Os

dados utilizados para a plotagem dos gráficos foram os de absorbância a

530nm. As curvas ajustadas e cálculo de IC50 foram realizados utilizando o

software GraphPad Prism 5.0.

5. Testes de Citotoxicidade - Exclusão por Azul de Tripan

A viabilidade celular também foi avaliada pelo ensaio de exclusão do

corante azul de tripan (0,4% em tampão fosfato, PBS) no qual as células são

consideradas não viáveis quando, ao se analisar por microscopia óptica,

apresentavam no seu interior a coloração azul. Sendo assim, as células foram

17

plaqueadas (5x104 por poço) em placas de 24 poços e após 24h o meio foi

trocado por outro com as várias concentrações dos compostos. As células

foram incubadas com essa solução por diferentes tempos de tratamento. Após

essa etapa as células foram coletadas através de tripsinização e à suspensão

delas foi adicionado o corante azul de tripan (0,4%). Após a adição do corante

as células, coradas e não coradas foram contadas em câmaras de Neubauer.

6. Análise do ciclo celular por citometria de fluxo

A linhagem celular SK-Mel-103 foi plaqueada em placas de 6 poços

(5x105 células por poço). Após 24 horas foram tratadas com 2-ME nas

concentrações de 0,5µM; 1µM e 10µM. Após 24h e 48h de tratamento as

células foram coletadas.

Após a coleta das células aderidas e presentes no sobrenadante, as

mesmas foram passadas para um tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 3

minutos. O sobrenadante foi retirado e o pellet foi lavado e ressuspendido com

PBS gelado. Após nova centrifugação a 1000 rpm por 3 minutos as células

contidas no sedimento foram resuspendidas em tampão de lise (PBS contendo

10mg/mL de RNase, 0,1% de triton x-100 e 50µg/mL de Iodeto de Propídio)

Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente a fluorescência

foi medida em um citômetro de fluxo (FACSCantho Beckton Dickinson, CA,

USA) em canal FL2 - 620nm. 10.000 eventos foram analisados por

experimento.

7. Análise de apoptose por citometria de fluxo (Anexina V e Iodeto de

Propídeo)

A apoptose foi realizada pela análise da externalização da

fosfatidilserina (FS), que foi analisada por citometria de fluxo como descrito por

Brohem et al com pequenas modificações (Brohem et al. 2012). A análise por

citometria de fluxo foi feita após a marcação com o conjugado fluoresceína

(FITC) - Anexina V (Anexina V - FITC) ou (APC) – Anexina V. As células foram

lavadas duas vezes com PBS gelado e então ressuspendidas em 100 µL de

18

tampão de ligação (10 mM HEPES/NaOH, 140 mM, NaCl 2.5 mM CaCl2) na

concentração de 1×106 células por mL. Anexina V - FITC ou Anexina V – APC

(1mg/mL) foram adicionadas às células e essas foram então incubadas por 20

min à temperatura ambiente no escuro. Logo após, adicionou-se 10 µL de

solução de IP (100 µg/mL) e 400 µL de tampão de ligação, e as células foram

analisadas por citometria de fluxo. Anexina V é uma proteína ligada a

fosfolipídeos que tem alta afinidade a FS. IP foi utilizado para distinguir células

viáveis de não viáveis. A fluorescência da anexina V-APC foi medida na

fluorescência vermelha (660nm) e IP na fluorescência vermelho-laranja (585/42

nm).

8. Citometria de fluxo para análise de apoptose e potencial de membrana

mitocondrial (Δψm)

Depois do tratamento das células com 2ME por 5 dias, elas foram

lavadas com tampão de ligação de Anexina [10 mmol/L HEPES (pH 7.4), 140

mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl2], ressuspendidas em 100 µL de tampão de

ligação contendo 1 µL Anexina V APC-conjugada (R&D Systems, Minneapolis,

MN) e 25 nmol/L de tetrametilrhodamina metil ester perclorato (TMRM;

Molecular Probes, Eugene, OR), e incubadas a 37°C por 15 min. As células

foram então analisadas para Anexina V (verde) e retenção de TMRM

(vermelho) em citometria de fluxo.

9. Contagem do número total de células para avaliação da proliferação celular

Após o tratamento das diferentes células primárias e linhagens de

melanoma com 2-ME nas concentrações de 0,5µM; 1µM e 10µM e com RES

nas concentrações de 10µM, 50µM e 100µM as células aderidas e presentes

no sobrenadante foram contadas após 24h, 48h e 72h de tratamento, somando

assim o total de células viáveis e não viáveis. A plotagem do número total de

células foi feita sempre em comparação com o controle (não tratado), sendo

este expresso como 100%.

19

10. Curvas de Crescimento

As linhagens celulares de melanoma humano foram plaqueadas (1x104

células por poço) em placas de 24 poços. Após a adesão das células estas

foram tratadas com 0,5µM ou 1µM de 2ME ou cultivadas na ausência deste

composto. As células foram tripsinizadas após 1 dia, 3 dias, 5 dias e 7 dias de

tratamento, e então submetidas a centrifugação. O sobrenadante foi

descartado, e as células foram ressuspendidas em PBS e contadas em câmara

de Neubauer. Os resultados foram plotados e as curvas ajustadas foram

realizadas no software GraphPad Prism 5.0. Da mesma forma, este software foi

utilizado para calcular o tempo de dobramento das células.

11. Western Blotting - Obtenção dos extratos protéicos

Foram utilizados extratos protéicos totais. As células foram plaqueadas (106

por placa) em placas de petri de 100 mm e submetidas a tratamento com

diferentes concentrações de 2-ME, RES e os compostos para controles

experimentais (para apoptose foi realizado tratamento com Doxorrubicina a

1,5mg/mL). As células foram lisadas com tampão RIPA+ (NaCl 150mM; Tris

HCl (pH 7,5) 50 mM; NP-40 5%; EDTA 0,1mM) na presença de inibidores de

proteases (Protease inhibitor cocktail tables – Roche, Mannheim, Germany).

Incubadas a 4ºC por 20 min e então transferidas para microtubo (1,5 mL). Após

centrifugação por 20 minutos a 4ºC, os sobrenadantes foram mantidos a –

80ºC. A concentração protéica foi determinada pelo método de Bradford.

12. Western Blotting - Separação das proteínas no gel de SDS-PAGE e

Transferência para membrana

Para separação das proteínas foi feito gel de SDS-PAGE com 10% de

acrilamida. Em cada canaleta foram colocados 30-50µg de extrato protéico

total em 20 µl de tampão de lise, adicionados de 5 µl de tampão de amostra 5X

(Tris-HCl 62,5mM pH6.8, SDS 2%, Glicerol 10%, Azul de Bromofenol 0,1%,

DTT 50mM) aquecido à 90ºC por 10’ (condições desnaturantes) e 8µl de

20

marcador de peso molecular Rainbow (RPN800V, Amersham Pharmacia

Biotech, NJ, USA) em cada gel. A corrida foi feita à 70V / 30min durante o gel

de empilhamento e a 100V / 1:30h durante o gel de separação.

Em seguida foi realizada a transferência úmida das amostras de

proteína para uma membrana de polivinilidene difluoreto (PVDF) (Hybond-P,

Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) utilizando o Tampão de Transferência

(Tris Base 25mM, Glicina 192mM pH8.3, com 20% de Metanol) à 4ºC / 200mA /

1:30h.

21

13. Western Blotting - Incubação das membranas com anticorpos primários e

secundários

Tabela 2: Anticorpos primários utilizados nos ensaios de western blotting, os bloqueios e diluições utilizados, bem como os anticorpos secundários. Anticorpo Marca N. Cat. Bloqueio Secundário Diluição

ATG5 Cell Signaling #12944

5% BSA em TBST Coelho 1:1000

Bcl-2 Cell Signaling #2872


Beclin-1 Cell Signaling #3495


Beta-actina Sigma-Aldrich A5441

5% Leite em TBST Camundongo 1:5000

Caspase 3 Cell Signaling #9662

5% Leite em TBST Coelho 1:1000





Cdc25A Cell Signaling #3652


Ciclina B1 Cell Signaling #4135


ERK total Cell Signaling #9102


ERK fosforilado

Cell Signaling #9101


GAPDH Sigma-Aldrich G8795

5% BSA em TBST Camundongo 1:5000

Histona H3 H3K9me3

Active Motif #39161


LC3A Cell Signaling #4599


LC3B Cell Signaling #3868


p21-Cip1 BD Laboratory 610233


p27-Kip1 BD Laboratory 6110241


p62 Cell Signaling #8025


Parp Clivado Cell Signaling #9541


Rb total Cell Signaling #9309


Rb fosforilado

Cell Signaling #9308


Wee1 Cell Signaling #4936


22

O bloqueio das membranas foi realizado com solução de PBS-T 0,2%

(137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7,4, Tween-20

0,2%) com 5% de leite (sem gordura) ou com 5% de BSA. A membrana foi

incubada com os anticorpos primários (Tabela 2) overnight a 4ºC ou conforme

as especificações da bula.

Tabela 3: Anticorpos secundários utilizados nos ensaios de western blotting, e suas diluições. Anticorpo Marca Número Catálogo Diluição

Anti-IgG Camundongo GE Healthcare UK NA931V 1:5000

Anti-IgG Coelho GE Healthcare UK NA934V 1:5000

Após 3 lavagens de 10 min cada com PBS-T 0,02%, a membrana foi

incubada com anticorpo secundário anti-coelho ou anticorpo anti-camundongo

durante 1hora à temperatura ambiente.

Após incubação com os anticorpos secundários (Tabela 3), as

membranas foram lavadas 3 vezes / 10 min com TBS-T 0,02%, e em seguida

reveladas com kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) e expostas ao

filme (Amersham Hyperfilm ECL).

14. Superexpressão do gene LC3 fusionado a GFP em células de melanoma

humano através de lentivírus

Para geração de células de melanoma humano com expressão forçada

do gene LC3 fusionado ao GFP foram utilizados plasmídios contendo a

construção GFP-LC3. O vetor lentiviral utilizado foi o pLV e as sequências

foram inseridas no mesmo. O sistema utilizado para empacotamento lentiviral

foi o Mission shRNA (Sigma, USA).

Inicialmente, os plasmídeos lentivirais contendo a sequência do gene de

interesse foram transfectados juntamente com os plasmídeos empacotadores

nas células HEK 293T, de acordo com instruções do fabricante. Os plasmídeos

lentivirais sem a seqüência de interesse foram utilizados para a geração dos

controles. O empacotamento viral gera as partículas virais inativas que são

secretadas no meio de cultura das células HEK 293T. As linhagens de

melanoma humano ou células primárias foram então infectadas com este título

23

viral e os clones transduzidos selecionados de acordo com o plasmídeo

utilizado, sendo que os clones GFP-LC3 são selecionados através de

flurescência (GFP). A eficiência da expressão gênica forçada foi confirmada por

citometria de fluxo no canal FL2 – 620nm com citômetro FACSCantho (BD

Biosciences, CA, USA).

15. Ensaio Clonogênico ou Ensaio de Formação de Colônias

Foram plaqueadas 5000 células em placas de cultura de células de 6

poços. Após 24h, as células, já aderidas, foram tratadas com os compostos 2-

ME nas concentrações de 0,1µM e 0,5µM e RES nas concentrações de 1µM,

2µM e 5µM, ou somente com o veículo (DMSO) e mantidas em cultura por 14

dias, sendo o tratamento realizado novamente após 7 dias.

Após este período o meio de cultura foi descartado, as placas lavadas

com tampão fosfato salino (PBS), e as colônias formadas foram coradas com

solução de glutaraldeídeo 6% e cristal violeta 0,5% diluídos em PBS. As placas

foram fotografadas para comparação do crescimento das colônias nos

diferentes tratamentos em relação ao controle não tratado.

16. Esferóides

Os esferóides de melanoma foram preparados utilizando-se o método de

agarose. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços contendo

agarose (UltraPure Agarose – Life Technologies) 1,5% na concentração de

2,5x103 células por poço. As placas foram incubadas por 72h até que os

esferóides se formassem. Estes foram coletados em tubo falcon utilizando

pipetas P1000. O meio foi removido e os esferóides foram implantados em

400µL de solução de colágeno de rato tipo 1 (BD, Biosciences, edford, MA)

gelificados com meio de cultura Ham’s F12 (Life Technologies) (10X) e tampão

de reconstituição (2,2% NaHCO3, NaOH 0,05M, HEPES 200mM). Após a

solidificação do colágeno com os esferóides embebidos foi adicionado 1mL de

DMEM contendo 10% de SBF por poço overnight. No dia seguinte o meio foi

removido e o tratamento foi realizado com 2ME nas concentrações de 1µM e

5µM levando-se em consideração o volume de colágeno presente no poço.

24

Após 5 dias de tratamento o meio foi removido e os esferóides foram lavados

com PBS por 10 minutos e incubados por 1h a 37°C com Calceina-AM e etídeo

homodímero-1 (LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit, Life Technologies). Após

este tempo tirou-se fotografia dos esferóides em um microscópio invertido de

fluorescência Nikon-300 utilizando o software NIS-Documents.

17. Imunofluorescência

Após o emblocamento das peles reconstituídas em parafina e da

confecção das lâminas com os cortes histológicos foi realizado o ensaio de

imunofluorescência para detecção de proteínas esperíficas. As lâminas

parafinizadas foram incubadas a 60°C por 3h e então desparafinizadas e

hidratadas (Xilol – 2x 10min, Etanol 100% - 2x 10min, Etanol 90% - 2x 10min,

Etanol 70% - 2x 10min e PBS – 2x 10min). Após a etapa de hidratação foi

realizada a recuperação antigênica em panela de vapor por 30 minutos a 95°C

em tampão citrato pH6,0 (Dako Cytomation #S2369). Após o resfriamento das

lâminas à temperatura ambiente elas foram lavadas 3 vezes com PBS e

fixadas com Etanol 80% a 4°C por 15 minutos. Após estes passos os cortes

foram delimintados com caneta especial (ImmEdge Pen – Vector Laboratories,

Burlingame, CA, EUA) para menor gasto de anticorpos.

As imunofluorescências realizadas em células cultivadas em lamínulas

não foram submetidas ao tratamento descrito acima. Células foram plaqueadas

(5x104 células por poço) em lamínulas estéreis colocadas em placas de 12

poços. Após 72h de crescimento o meio de cultura foi retirado e, na própria

placa as lamínulas foram lavadas 3 vezes com PBS e fixadas com formalina

3,7%. A partir da fixação das lamínulas foram novamente lavadas com PBS e

então o procedimento foi o mesmo que o realizado nas lâminas.

Foi realizado bloqueio com soro de cabra por 1h à temperatura ambiente

e então houve a incubação com os diferentes anticorpos primários (Tabela 4) a

4°C até o dia posterior. As lâminas foram lavadas 3 vezes de 5 min com PBS +

0,2% Tween 20 e então incubadas por 1h à temperatura ambiente com o

anticorpo secundário específico. Tabela 4: Anticorpos utilizados nos ensaios de imunofluorescência, e suas diluições utilizados, bem como os anticorpos secundários.

25

Anticorpo Marca No. Cat. Secundário Diluição

BrdU GE Helthcare UK RPN20AB

Camundongo 1:100

Citoqueratina 10 AbCam ab1421 Camundongo 1:150 Citoqueratina 14 AbCam ab7800 Camundongo 1:300 Filagrina AbCam ab24584 Coelho 1:1000 HMB45 AbCam ab787 Camundongo 1:20 Involucrina AbCam ab27495 Coelho 1:1000

Laminina Santa Cruz sc25341

Camundongo 1:50

MelanA AbCam ab785 Camundongo 1:20 MitF AbCam ab12039 Camundongo 1:20

Tubulina Sigma-Aldrich T5168

Camundongo 1:1000

Após esta incubação as lâminas foram lavadas 3 vezes de 5min com

PBS + 0,2% Tween 20 e montadas com Vectashield contendo DAPI (Vector

Lab Inc.). No caso das lâminas que foram submetidas a dupla marcação, houve

incubação com um segundo anticorpo primário por 2h à temperatura ambiente,

3 lavagens de 5min com PBS + 0,2% Tween 20 e incubação por 1h com o

anticorpo secundário específico. Após 3 lavagens de 5 min com PBS + 0,2%

Tween 20, estas lâminas foram montadas da mesma forma que as anteriores.

18. Obtenção de linhagens resistentes e duplo-resistentes

Células de melanoma humano das linhagens Sk-Mel-19, Sk-Mel-28, Sk-

Mel-29 e UACC-62 (Figura 3, coluna esquerda) comportam a mutação V600E

no gene que codifica a proteína BRAF. Esta mutação torna esta proteína

constitutivamente ativa, o que ativa a via de sinalização de ERK, que por sua

vez leva a uma proliferação aumentada. O composto PLX4032 (Vemurafenibe)

é um inibidor desta proteína mutada que é utilizado na clínica para o

tratamento de tumores que possuem esta mutação, porém, como mencionado

anteriormente, estes tumores adquirem resistência ao Vemurafenibe pela

ativação compensatória de outras vias de sinalização que levam à resistência

das células e crescimento do tumor, levando os pacientes a óbito.

As células foram tratadas continuamente com concentrações crescentes

de Vemurafenibe, iniciando por 0,3µM. Duas vezes por semana o meio de

cultura foi trocado. Quando as células voltavam a adquirir confluência nas

26

placas de cultura, a concentração de Vemurafenibe foi aumentada para 0,5µM,

1,0µM e até 3,0µM para a linhagem Sk-Mel-19, e até 6,0µM para as linhagens

Sk-Mel-28, Sk-Mel-29 e UACC62. As linhagens resistentes foram então sempre

mantidas na presença do Vemurafenibe e foram nomeadas Sk-Mel-19R, Sk-

Mel-28R, Sk-Mel-29R e UACC62R (Figura 3, coluna central). Como observado

na Figura 3, algumas alterações morfológicas podem ser notadas, como maior

pigmentação nas linhagens Sk-Mel-19R e Sk-Mel-29R e maior espalhamento

do citoplasma nas linhagens Sk-Mel-28R e UACC62R.

Após a obtenção das linhagens de melanoma resistentes, deu-se início

ao tratamento destas células continuamente com o inibidor de MEK1 e MEK2,

o Trametinibe. As linhagens Sk-Mel-19R, Sk-Mel-28R, Sk-Mel-29R e UACC62R

foram tratadas inicialmente com 10ηM deste composto. O meio de cultura foi

trocado duas vezes por semana, e quando as células se tornavam confluentes

na placa, a concentração foi aumentada para 30ηM e 100ηM nas linhagens Sk-

Mel-19R, Sk-Mel-28R e Sk-Mel-29R. A linhagem UACC62R se mostrou muito

sensível ao tratamento, e a obtenção da linhagem duplo-resistente ainda não

foi possível. As linhagens duplo-resistentes foram então mantidas na presença

de Vemurafenibe e Trametinibe, e foram denominadas Sk-Mel-19RT, Sk-Mel-

28RT e Sk-Mel-29RT (Figura 3, coluna direita). É possível notar algumas

alterações morfológicas em relação às células resistentes apenas ao PLX4032,

como por exemplo, a maior pigmentação da linhagem Sk-Mel-29RT em relação

à linhagem Sk-Mel-29R.

27

Figura 3: Linhagens celulares de melanoma humano metastático que contém a proteína BRAF V600E. Coluna da esquerda, células parentais. Coluna central, células resistentes ao PLX4032. Coluna da direita, Células duplo-resistentes ao PLX4032 e Trametinib. Magnificação de 100X. 19. Coloração para β-galactosidase associada à senescência

As células de melanoma foram plaqueadas em baixa confluência (5x104

células por poço) em placas de 6 poços. No dia seguinte, após a adesão das

células, estas foram tratadas com diferentes concentrações de 2ME. Após o

tempo de tratamento as células foram fixadas para a coloração da β-

28

galactosidase, tiveram seu tratamento renovado, ou foram incubadas com meio

de cultura sem 2ME. Para as células que foram fixadas, o tratamento foi

realizado por 3 dias ou 5 dias. Para as células que foram mantidas em

tratamento, a manutenção do 2ME foi por 5 dias + 3 dias (com ou sem 2ME), e

então estas células foram fixadas. A fixação e coloração da β-galactosidase

associada à senescência foi realizada utilizando o kit Senescence β-

galactosidase Staining Kit #9860 (Cell Signaling Technology) seguindo as

instruções da bula.

20. Pele reconstituída contendo melanoma como modelo biomimético de

invasão

Para a reconstrução da pele artificial nós seguimos o protocolo de

acordo com Brohem et al, 2012. Resumidamente, os equivalentes dérmicos

foram preparados com 1,5x105 fibroblastos em meio a uma matriz de colágeno

tipo 1 (BD, Biosciences, edford, MA). Após a polimerização do equivalente

dérmico, foram plaqueados 1,5x105 queratinócitos e 10^4 melanócitos na

presença ou ausência de 50x104 células de melanoma sobre o equivalente

dérmico. Após a contração do gel de colágeno a estrutura foi transferida para

uma tela de aço permitindo uma interface ar-líquido. A parte inferior fica em

contato com o meio de cultura que consiste de 67.5% de DME, 22.5% de

Ham's F12; 10% de Soro Fetal de Cabra, 5 µg/mL Apo-Transferrina (T-1147,

Sigma, Saint Louis, MO, USA), 5 µg/mL de Insulina (I-1882, Sigma), 0.4 mg/mL

de hidrocortisona hemisuccnato-21-(H-4881, Sigma), 1 ng/mL de EGF (fator de

crescimento epidermal humano, 13247-010, Gibco/ Invitrogen,), e 0.1 nM de

Toxina Colérica (3012, Sigma). Depois de 2 semanas nesta interface os

tratamentos foram adicionados por 72 horas. A pele reconstruída foi lavada

com PBS (pH 7,4) e emblocadas em OCT para cortes e análise da histologia.

29

PADRONIZAÇÃO DE EXPERIMENTOS

1. Padronização do tempo de tratamento do ensaio de formação de colônias

Para a padronização do ensaio de formação de colônias, as células

foram plaqueadas em placas de 60mm e deixadas sob cultivo durante

diferentes períodos de tempo (Figura 4). Após este ensaio, decidiu-se utilizar o

tempo de 15 dias de cultivo, pois nele seria mais fácil observar a diferença de

crescimento entre as células tratadas e não tratadas.

Figura 4: Crescimento de colônias de células da linhagem de melanoma humano #9 em durante diferentes períodos de tempo, para padronização do ensaio clonogênico.

Duas formas diferentes de tratamento foram realizados nas células e

estão ilustrados na figura 5. Após o plaqueamento as células foram tratadas

com os diferentes compostos nas concentrações indicadas, e as placas foram

coradas após 14, sem renovação de tratamento (Figura 5A). A figura 5B mostra

o mesmo ensaio realizado com renovação do tratamento sete dias após o

inicial. Nota-se que a diferença entre as células tratadas e não tratadas é maior

no segundo protocolo, que foi utilizado para os ensaios.

30

Figura 5: Diferentes protocolos de tratamento das células com os compostos. A – sem renovar o meio de cultura contendo os compostos. B – Renovando o meio de cultura contendo os compostos 7 dias após o primeiro tratamento. 2. Imunofluorescência para padronização de marcação de células de linhagens de melanoma

Determinar quais os marcadores de melanoma e as linhagens mais

eficientemente responsivas às marcações é importante para o presente

trabalho, pois a identificação de células de melanoma é necessária para

experimentos que utilizam o ambiente tridimensional da pele reconstituída.

Para tal padronização, diversas linhagens de melanoma metastático

humano foram utilizadas, e estas linhagens continham diferentes mutações e

características genéticas. As linhagens utilizadas foram Sk-Mel-19, Sk-Mel-28,

Sk-Mel-29, Sk-Mel-103, Sk-Mel147, Sk-Mel-173, UACC62 e WM1366. Os

ensaios de imunofluorescência foram realizados com os anticorpos primários

anti-MelanA, anti-MitF e anti-HMB45 (marcação verde) e o marcador nuclear

DAPI (marcação azul) (Figura 6). Para o controle negativo da reação, as

células foram incubadas somente com os anticorpos secundários, sem serem

previamente incubadas com os anticorpos primários.

As linhagens Sk-Mel-19 e Sk-Mel-29 foram fortemente marcadas no

controle negativo (Figura 6, primeira coluna), desta forma as marcações com

os anticorpos em questão foi desconsiderada, e foi dada prioridade à utilização

outras linhagens nos experimentos envolvendo pele reconstituída.

31

O anticorpo anti-MitF não se mostrou eficiente para a detecção das

células de melanoma, não levando a marcação de nenhuma das linhagens

celulares utilizadas (Figura 6, terceira coluna). Desta forma, não se utilizou o

mesmo para a detecção de melanomas na pele.

Um anticorpo que mostrou alguma eficiência de marcação foi o HMB45,

marcando fortemente as linhagens Sk-Mel-19, Sk-Mel-28, Sk-Mel-29 e Sk-Mel-

173 (Figura 6, quarta coluna). Em duas destas linhagens (Sk-Mel-19 e Sk-Mel-

29) a marcação não é confiável, pois houve reação do anticorpo secundário no

controle negativo, porém, para as linhagens Sk-Mel-28 e Sk-Mel-173 esta pode

ser uma opção para a detecção dos melanomas no ambiente tridimensional.

A maior eficiência para detecção das células de melanoma foi dada pelo

anticorpo anti-MelanA. Este anticorpo marcou todas as linhagens celulares,

sem exceção (Figura 6, segunda coluna). Em apenas uma das linhagens

celulares esta marcação foi fraca (Sk-Mel-103). Caso esta linhagem celular

seja utilizada nos experimentos da pele reconstituída, novas padronizações

com concentrações maiores do anticorpo devem ser utilizadas.

Resumidamente, com exceção das linhagens Sk-Mel-19 e Sk-Mel-29,

todas as linhagens podem ser utilizadas para os experimentos de pele artificial.

O anticorpo anti-MelanA se mostrou especialmente eficiente para a marcação

das células de melanoma humano metastático utilizadas, sendo um bom

candidato para a detecção destas células nos experimentos tridimensionais.

32

Figura 6: Imunofluorescência das linhagens de melanoma humano metastático indicadas realizadas com os anticorpos MelanA, MitF e HMF45. Notar a eficiência do anticorpo anti-MelanA na marcação de todas as linhagens celulares utilizadas, mostrando sua possível utilização para a identificação de melanomas nos ensaios futuros a serem realizados com a pele reconstituída. Fotografias adquiridas com magnitude de 200X.

33

3. Padronização da pele reconstituída para ensaios tridimensionais

A pele reconstituída foi padronizada e, como é possível observar na

figura 7 A e C, houve diferenciação da camada da epiderme, sendo evidente a

presença de queratinócitos desde a camada basal até a formação de uma

camada córnea. A derme também está presente e é possível observar a

presença de fibroblastos nesta camada.

A figura 7 B e D mostra a pele reconstituída tratada com o 2ME na

concentração de 5µM a partir do sétimo até o último (décimo-primeiro) dia de

diferenciação. Como é possível observar, a estrutura da epiderme é mantida,

sendo possível identificar as diferentes camadas da epiderme, desde a camada

basal até a camada córnea. Parece haver alguma diferença na quantidade de

fibroblastos presentes na derme, sendo menor na pele tratada com o 2ME,

porém estes ainda estão presentes como é possível notar na figura.

Estes resultados mostram que a concentração utilizada de 2ME é

adequada para os ensaios de pele artificial. Desta forma, os ensaios seguintes

foram realizados com a presença de células de melanoma na pele, para

verificar a ação do 2ME na contenção da proliferação e invasão destas células

no modelo de pele reconstituída.

34

Figura 7: Pele artificial reconstituída tratada com veículo (A e C) e 2ME na concentração de 5µM (B e D). Em ambos os casos é possível observar a diferenciação da epiderme em diversas camadas, desde a camada basal até a camada córnea.

35

CAPÍTULO 1

RESVERATROL

1. Resveratrol e câncer

O Resveratrol (RES – Figura 8), ou trans-3,5,4’-trihydroxy-trans-stilbeno

é um polifenol natural encontrado em plantas como uva, frutas vermelhas,

amendoim, nozes, pinhas e outras plantas medicinais (Larrosa et al. 2003,

Athar et al. 2007, Smoliga et al. 2011). Este composto é uma fitoalexina

produzida pela enzima stilbeno sintase (Athar et al. 2009) em plantas

superiores em resposta a infecções por patógenos (Delmas et al. 2006) ou em

resposta a adversidades climáticas, condições de estresse como exposição a

ozônio, alta incidência de luz solar, metais pesados, e deprivação de nutrientes

(Niles et al. 2003, Baur and Sinclair 2006, Athar et al. 2009, Kim et al. 2011)

Figura 8: Estrutura química do Resveratrol

O Resveratrol foi primeiramente isolado na década de 1940 das raízes

da planta Veratum grandiflorum O. Loes (Takaoka 1940) no Japão. Pouca

importância foi dada ao RES até que em 1992 a sua presença foi descoberta

no vinho tinto, e efeitos cardioprotetores foram atribuídos ao mesmo (H. 1992).

Desde então, diversos artigos vêm mostrando seu efeito na prevenção ou no

retardamento da progressão de diversas doenças humanas (Baur and Sinclair

2006, Vang et al. 2011), como doenças cardiovasculares (Hung et al. 2000),

obesidade (Dal-Pan et al. 2010), diabetes tipo 2 (Palsamy and Subramanian

36

2008), além de efeitos neuroprotetores (Wang et al. 2002), modulação de

resposta inflamatória (Chen et al. 2005), e até no retardamento do

envelhecimento e aumento do tempo de vida de organismos unicelulares

(Howitz et al. 2003) até vertebrados (Wood et al. 2004).

Em 1997, Jang e colaboradores demonstraram o efeito do RES na

prevenção da carcinogênese em camundongos (Jang et al. 1997). Neste

estudo, a aplicação tópica do composto diminuiu o número de tumores na pele

em até 98%, e como conseqüência, o estudo dos efeitos anti-tumorais do

reveratrol aumentou muito (Baur and Sinclair 2006). Estes estudos

demonstraram efeito em diversos tipos tumorais, in vitro e in vivo, bloqueando

a iniciação, promoção e progressão da tumorigênese. Além disso, demonstrou-

se o seu efeito na prevenção de diversos tipos de tumor, como de pele,

gástrico e coloretal, de pulmão, mama, próstata, hepatoma, neuroblastoma,

fibrosarcoma, pancreático e leucemia (Baur and Sinclair 2006, Athar et al.

2007, Athar et al. 2009).

Estudos verificaram o efeito do RES como possível tratamento de

tumores de diversos tipo e origens, como câncer de mama, próstata, colon,

pancreático, hepatoma, espinocelular, ovário, tieróide, gástrico, entre outros.

Estes tumores, quando tratados com este composto, têm diversas vias de

sinalização alteradas, mostrando que ele tem efeito sobre diversos alvos, que

culminam em diferentes respostas celulares, principalmente de morte celular

por apoptose e parada no ciclo celular (Baur and Sinclair 2006, Athar et al.

2007, Athar et al. 2009). Além destes efeitos, já foi demonstrado que este

composto é capaz de modular a angioênese, inibir a invasão tumoral, inibir a

metástase e modular danos no DNA (Athar et al. 2009, Vang et al. 2011).

Quanto aos efeitos na proliferação, o RES é capaz de levar à parada na

fase G1/S do ciclo celular induzindo proteínas como p21Cip1 e p27Kip1, e inibindo

ciclinas e Cdks específicas desta fase (Kim et al. 2006, Athar et al. 2009).

Dependendo do tipo celular este composto pode levar também à parada do

ciclo celular na fase S e G2/M pela inibição de Cdk7 e da kinase p34Cdc2 (Joe

et al. 2002, Liang et al. 2003, Athar et al. 2009). Fica claro que o efeito anti-

proliferativo depende de características das células tratadas e da concentração

de Resveratrol utilizada (Athar et al. 2009). Diversos estudos mostram que a

inibição da proliferação celular é seguida da morte celular por apoptose,

37

mostrando que o resveratrol modula vias de sinalização de morte celular e

outras vias de sobrevivência das células. Em diversos casos foi verificado que

a indução de apoptose está associada à ativação de p53 (Shankar et al. 2007)

seguido do aumento da expressão das proteínas pró-apoptóticas Bax, Bak,

PUMA, Noxa e Bim, e da inibição de proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2,

Bcl-XL e Mcl-1, resultando na ativação da via intrínseca da apoptose, levando à

clivagem de caspase-3 culminando na morte programada por apoptose (Park

et al. 2001, Athar et al. 2009).

Os estudos do efeito do RES em melanomas são escassos, e parte

destes estudos foram realizads com a linhagem murina B16F10. Alguns efeitos

observados após o tratamento foram inibição do potencial de migração e da

invasão destas células através da diminuição da expressão da proteína Akt

(Bhattacharya et al. 2011). Um estudo mostrou também indução de apoptose e

parada no ciclo celular de células B16F10 quimiorresistentes a doxorrubicina

(Gatouillat et al. 2010). Ensaios com células de proveniência humana mostram

um efeito do Resveratrol na indução de apoptose e de parada no ciclo celular

(Niles et al. 2003, Larrosa et al. 2003, Hsieh et al. 2005), porém, como revisado

por Athar e colaboradores, em ensaios in vivo, o tratamento com RES não leva

à regressão do tumor, e sim ao retardamento significativo do crescimento

(Athar et al. 2007, Bhattacharya et al. 2011). Não há estudos comparando o

efeito desta molécula entre melanomas e células primárias da pele, e também

não há estudos do efeito deste composto em uma grande variedade de

linhagens de melanoma humano com diferentes mutações.

Outro potencial efeito do Resveratrol pode ser o de terapêutica

adjuvante. Em um estudo recente, Lin e colaboradores mostraram o efeito do

Resveratrol na potencialização do efeito terapêutico da temozolamida em

gliomas malignos pela inibição da autofagia (Lin et al. 2012). Neste estudo, o

Resveratrol co-administrado em doses baixas levou à inibição do processo

autofágico graças ao potencial anti-oxidante deste composto. Esta inibição na

autofagia foi acompanhada de um incremento na morte celular por apoptose

das células tratadas com temozolamida (Lin et al. 2012). Em um estudo in vivo

com linhagem de melanoma murinho B16F10 resistente a Doxorrubicina, a

menor dose de Resveratrol administrada em camundongos foi a que levou a

maior efeito na inibição do crescimento tumoral (Gatouillat et al. 2010). O RES

38

pode adquirir papel pró-oxidante ou anti-oxidante dependendo da concentração

utilizada e do tipo celular envolvido (Holme and Pervaiz 2007, Lin et al. 2012), e

é possível que esta concentração e o ambiente celular no qual a molécula se

encontra dite os alvos moleculares e os efeitos que o Resveratrol

desempenhará nos modelos nos quais ele é empregado.

Dado o efeito do Resveratrol em diversas vias de sinalização, é

importante verificar o efeito desta fitoalexina no melanoma em processos que

ainda não foram investigados neste modelo, como a autofagia, e efeito no

crescimento de colônias. Após estes estudos será mais fácil determinar a forma

pela qual o Resveratrol regula e influencia tantas vias de sinalização

intracelulares neste modelo, e elucidar como este composto pode ser

empregado sozinho ou como adjuvante no modelo de pesquisa de melanomas

para melhores resultados no tratamento desta malignidade.

39

RESULTADOS

1. Citotoxicidade do RES por Azul de Tripan.

A citotoxicidade foi testada para o RES por ensaio de azul de tripan. As

células primárias e linhagens de melanomas foram tratadas por 24h, 48h e 72h

com diferentes concentrações deste composto

É importante ressaltar que, para estes experimentos, foram utilizadas

diferentes culturas primárias provenientes de pacientes diferentes, mostrando

que as respostas destas células devem-se ao tipo celular e não a um indivíduo

específico. Queratinócitos primários imortalizados (HaCaT) também foram

utilizados para este teste de citotoxicidade, mas não tiveram resposta

semelhante aos queratinócitos primários aqui mostrados, e assim foram

excluídas dos experimentos seguintes (Figura 9).

Figura 9: Citotoxicidade do Resveratrol em linhagens de queratinócito imortalizadas HaCaT.

O Resveratrol mostrou citotoxicidade seletiva para as linhagens de

melanoma. A indução de morte nas linhagens de melanoma Sk-Mel-19, Sk-

Mel-103 e Sk-Mel-147 chegou a 47%, 78% e 75% respectivamente, quando

estas foram tratadas por 72h na concentração de 100µM. Nas mesmas

condições de tratamento os melanócitos tiveram taxa de mortalidade de 35%,

0

50

100

NT DMSO 10uM 50uM 100uM

HaCat

Via

bili

da

de

Concentração de RES

24h

48h

72h

40

os queratinócitos 30%, os fibroblastos 15% e os melanomas Sk-Mel-28 e Sk-

Mel-173 mostraram valores de 15% e 22% de morte, respectivamente (Figura

10). A mesma concentração de Resveratrol foi capaz de induzir cerca de 50%

de morte nas linhagens de melanoma Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147 em 48h, e

cerca de 40% na linhagem Sk-Mel-19, enquanto esta taxa n chega a um

máximo de 30% mas células primárias (melanócitos) (Figura 10). Da mesma

forma, na concentração de 50µM é possível ver indução de morte de cerca de

40% em 72h para as linhagem de melanoma Sk-Mel-19 e Sk-Mel-147, e essa

indução de morte não pode ser observada em nenhuma das linhagens

primárias nessas condições (Figura 10). Além do efeito dose dependente que

se observa na figura 10 é possível notar também um efeito tempo dependente

nas linhagens Sk-Mel-19, Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147 (Figura 11).

Figura 10: Efeito dose dependente do 2ME nas células primárias e linhagens de melanoma humano após 24h 48h e 72h.

41

Figura 11: Efeito tempo dependente do RES nas células primárias e linhagens de

melanoma humano.

Fica claro que o Resveratrol tem um efeito citotóxico seletivo para

linhagens de melanoma, principalmente Sk-Mel-19, Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147.

Podemos observar células tratadas por 72h com Resveratrol na

concentração de 100µM (Figura 12 e 13). O Resveratrol levou a uma alta

citotoxicidade (cerca de 80%) nas linhagens de melanoma Sk-Mel-103 e Sk-

42

Mel-147, e (cerca de 50%) na linhagem de melanoma Sk-Mel-19, e pode-se

notar que as células que ainda estão aderidas apresentam alteração

morfológica, mostrando um aspecto mais alongado em relação às células não

tratadas. Mesmo as células de cultura primária e as da linhagem de melanoma

Sk-Mel-28 e Sk-Mel-173, que não sofreram um efeito citotóxico tão evidente

com o tratamento (~15% e ~20% respectivamente), mostram uma diminuição

no número de células aderidas, podendo também refletir uma inibição da

proliferação causada por este composto. (Figuras 12 e 13).

43

Figura 12: Fotos das células primárias e de melanoma Sk-Mel-19 tratadas com o composto 2-metoxiestradiol por 72h na concentração de 100µM. Aumento de 100x.

44

Figura 13: Fotos das células primárias e de melanoma Sk-Mel-28 Sk-Mel-103 Sk-Mel-147 e Sk-Mel-173 tratadas com o composto Resveratrol por 72h na concentração de 100µM. Aumento de 100x.

45

2. Citotoxicidade por indução de apoptose analisada por citometria de fluxo

O tratamento das células da linhagem de melanoma Sk-Mel-103 foi

realizado também com o RES nas concentrações de 50µM e 100µM pelos

períodos de 48h e 72h. O ensaio mostra o aumento da população de células

positivas para AnexinaV com o aumento da concentração e tempo de

exposição ao composto (Figura 14).

A quantificação das populações analisadas por citometria de fluxo foram

plotadas em histograma, que pode ser observado na figura 15. Fica claro o

efeito citotóxico dose dependente nas células tratadas por 48h (Figura 15A),

bem como a presença de uma população de células necróticas (~20%) nos

tratamentos por 72h com o RES na concentração de 100µM, incrementando

assim o número total de células mortas (Figura 15B).

Figura 14: Dot-plot das célualas marcadas com Anexina-APC e PI e submetidas a citometria de fluxo após tratamento com RES nas concentrações de 50µM e 100µM por 48h e 72h.

46

Figura 15: Histograma da quantificação dos eventos mostrados no Dot-plot da citometria de fluxo das células de melanoma Sk-Mel-103 tratadas por 48h (A) e 72h (B) com RES nas concentrações de 50µM e 100µM. 3. Indução da apoptose verificada por clivagem de caspase

A apoptose pode ser mediada por uma família de enzimas denominadas

de caspases. Estas estão inativas no citosol e com a sua clivagem, se tornam

ativas e, então, são capazes de clivar/degradar diversas proteínas necessárias

para o funcionamento celular. A ativação da caspase-9 por sua clivagem

mostra a particiação da via intrínseca da apoptose, que ocorre com

participação da despolarização da membrana externa mitocondrial. Na figura

16 observa-se que há a clivagem da caspase‐9 na linhagem de melanoma

humano Sk-Mel-103, quando tratadas com Resveratrol a 50 µM e 100µM por

48h e 72h.

0

20

40

60

80

100

Vivas Apop Necro Mortas

48h

% E

ven

tos

NT RES 50 RES 100

0

20

40

60

80

100


72h

% E

ven

tos

NT RES 50 RES 100 A B

47

Figura 16: Imunoblotting da proteína que participa da vida apoptótica Caspase-9, na linhagem de melanoma Sk-Mel-103 após tratamento com RES por 48h e 72h.

Na figura é possível observar um efeito tempo dependente para o

tratamento, já que as bandas do tratamento por 72h aparecem mais intensas

que em 48h. Da mesma forma, observa-se um efeito dose-dependente, tendo a

forma clivada de caspase-9 mais intensa no tratamento com 100µM em relação

ao tratamento com 50µM (Figura 16).

Como controle foi utilizado Doxorrubicina, uma droga que possui uma

larga descrição na literatura por induzir a morte por apoptose dependente de

caspases. Esta clivagem, no entanto, só ficou evidente no tratamento por 72h.

Tubulina

Clivada

Clivada

48

4. Ensaio de formação de colônias

As células foram tratadas por duas semanas com concentrações sub-

tóxicas do composto Resveratrol. Estas concentrações foram escolhidas por

não levarem a nenhum tipo de interferência na viabilidade celular,

possibilitando verificar assim o efeito destes compostos em doses baixas, no

crescimento em longo prazo das linhagens de melanoma utilizadas.

O tratamento com o Resveratrol mostrou um efeito inibitório muito tênue

no crescimento das colônias de linhagens de melanoma humano, como é

possível observar após a coloração das placas (Figura 17). A quantificação das

colônias (Figura 18) não mostra diferença expressiva entre os tratamentos com

o composto.

Neste caso, fica claro que o Resveratrol precisa ser utilizado em doses

mais altas para levar a um efeito de inibição de crescimento, não sendo eficaz

para a inibição do crescimento de melanomas em doses sub-tóxicas.

Figura 17: Crescimento de colônias de fibroblastos primários e linhagens de melanoma humano após tratamento com RES nas concentrações indicadas.

49

Figura 18: Quantificação do número de colônias formadas em uma das replicatas dos ensaios de formação de colônias.

5. Contagem do número total de células para análise de proliferação

Uma forma de verificar o efeito dos tratamentos na proliferação celular é

contar o número total de células presentes (vivas e mortas) após diferentes

períodos de exposição aos compostos, nas concentrações desejadas.

O efeito do tratamento com o RES no número total de células foi

semelhante ao do 2ME, exceto pela indução da proliferação a baixas doses por

24h de exposição como mostrado por formação de colônias. Observa-se que

mesmo após tratamento por 24h, as doses mais altas do Resveratrol (50µM e

100µM) levam a uma inibição no número total de células, de forma mais

expressiva em algumas linhagens de melanoma como Sk-Mel-28, Sk-Mel-103

e Sk-Mel-147 (Figura 19). Este efeito mostra-se tempo dependente, já que o

tratamento por períodos de 48h e 72h inibem ainda mais a proliferação,

refletindo um número total de células menor mesmo na concentração de 10µM

(Figura 19). Esses valores chegam à inibição do número total de células de

50% ou maiores no caso de 72h, para todos os tipos celulares, mostrando que

50

independente da morte celular, o crescimento das células é inibido por este

composto a 100µM (Figura 19).

A Figura 20 mostra os diferentes tipos celulares tratados com o

Resveratrol. É possível verificar uma resposta de inibição de proliferação tempo

dependente principalmente em melanócitos, queratinócitos e melanomas

humanos Sk-Mel-19, Sk-Mel-103 e Sk-Mel-173. Da mesma forma, é possível

observar nestes tipos celulares, um efeito dose dependente do tratamento com

RES.

Figura 19: Efeito do RES administrado nas concentrações acima indicadas no número total de células após 24h, 48h e 72h de exposição ao composto.

51

Figura 20: Número total de células nas diferentes culturas primárias e linhagens de melanoma humano após tratamento com RES nas diferentes concentrações por 24h, 48h e 72h.

52

CAPITULO 2

2-METOXIESTRADIOL 1. 2-Metoxiestradiol e câncer

O 2-Metoxiestradiol (2ME) (Figura 21) é um produto natural derivado do

esteróide estradiol pelo metabolismo do 17β-Estradiol efetuado pelo citocromo

P450 dependente de NADH, (Fotsis et al. 1994, Kirches and Warich-Kirches

2009, Parks et al. 2011). Não se sabia de sua atividade biológica até que em

janeiro de 1994, D’Amato e colaboradores mostraram sua interação com a

tubulina no sítio da colchicina, inibindo sua polimerização e inibindo

angiogênise. Em março do mesmo ano, Fotsis e colaboradores mostraram que

este composto era o que apresentava maior citotoxicidade em células

endoteliais de capilares dentre diversos metabólitos do estradiol, deixando

claro o seu efeito na inibição de angiogênise em tumores in vivo, e a supressão

do crescimento de tumores.

Desde então, este composto foi testado in vitro em uma grande

diversidade de tipos de tumores, como gliomas (Chen et al. 2008, Kirches and

Warich-Kirches 2009), carcinoma de colo (Parks et al. 2011); carcinoma

pancreático (Qanungo et al. 2002); leucemia (Gao et al. 2005) e células

tumorigênicas de epitélio de mama MCF-7 (Stander et al. 2010), mostrando

efeitos anti-angiogênicos, indutores de apoptose e anti-proliferativos, mas seu

efeito mostra-se diferente dependendo do modelo.

Figura 21: Estrutura química do 2-Methoxiestradiol

53

Recentemente foi descrita a capacidade de inibir a angiogênese por

suprimir a dinâmica de polimerização de tubulina de células endoteliais, e

diminuir as expressões de HIF-1α (Hipóxia Inducible Factor 1α) e VEGF

(Vascular Epithelial Growth Factor) (Stander et al. 2010). Além disso, tem efeito

na indução de apoptose em diversas linhagens tumorais, sendo capaz de ativar

os caminhos intrínseco e extrínseco da apoptose (Parks et al. 2011) como

resultado do aumento da expressão de DR5 (Death Receptor 5), da inativação

das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL, e da ativação dos sinalizadores

JNK (c-Jun N-terminal Kinase), ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinase) e

p38-Kinase (Fukui and Zhu 2009, Stander et al. 2010). Finalmente, seu efeito

anti-proliferativo mostra uma não progressão na mitose, ou seja, uma parada

na fase G2/M do ciclo celular (Stander et al. 2010, Parks et al. 2011, Kirches

and Warich-Kirches 2009, Ghosh et al. 2003), e dependendo do modelo celular

pode haver aumento de ciclina B1 e p21, que controlam a progressão no ciclo

celular (Ghosh et al. 2003, Parks et al. 2011).

Outros efeitos do 2ME que podem contribuir para a atividade anti-

tumoral são a sua capacidade de aumentar a quantidade de espécies reativas

de oxigênio pela inibição da enzima SOD (superoxide dismutase) (Gao et al.

2005, Chen et al. 2008) e a de aumentar o processo autofágico em células

tratadas (Chen et al. 2008, Stander et al. 2010, Parks et al. 2011).

Em melanoma, o efeito anti-tumoral do 2ME já foi verificado em alguns

trabalhos. Um deles mostra o efeito no bloqueio do ciclo celular em G2/M bem

como a indução de apoptose em apenas uma linhagem celular humana (WM-

98-1) cultivada in vitro (Ghosh et al. 2003). Outro mostra o efeito in vitro em oito

linhagens de melanoma humano, causando a morte por apoptose dependente

da via intrínseca bem como o bloqueio da progressão no ciclo celular na fase

G2/M, e in vivo, uma das linhagens foi injetada no baço, e o tratamento levou à

regressão do tumor primário bem como a diminuição de metástase para o

fígado (Dobos et al. 2004).

As vias induzidas pelo 2-ME ainda não estão inteiramente elucidadas, e

dependendo do tipo tumoral estas respostas são diferentes (Chen et al. 2008).

A participação do processo autofágico na indução de morte celular induzido

pelo 2-ME parece ser muito importante em outros tipos tumorais (Chen et al.

2008, Stander et al. 2010, Parks et al. 2011), e a importância deste processo

54

na quimiorresistência já foi descrito em diversos artigos, tanto em modelos in

vitro como in vivo, podendo ser crucial neste modelo (Janku et al. 2011). Além

disso, a explicação mais detalhada destas vias e o seu efeito em linhagens

celulares de melanoma de diferentes origens e características genéticas, bem

como seu efeito na quimiorresistência destas linhagens, ainda merecem

esforço científico para serem elucidados.

55

RESULTADOS

1. Citotoxicidade do 2ME por MTT

Os ensaios de citotoxicidade por MTT foram realizados em n=8 para as

linhagens de melanoma SK-Mel-28, SK-Mel-103 e SK-Mel-147 e para os

fibroblastos FF287. Já o melanócito primário (MP#22) foi testado apenas uma

vez. As linhagens foram cultivadas com este composto nas concentrações de

1µM e 10µM por 24h, 48h e 72h.

Pelos resultados da densidade ótica em relação ao controle de cada

uma das linhagens no ensaio de MTT nota-se que para todas as linhagens em

48h e 72h o 2-ME mostra um efeito citotóxico. Esse efeito é maior na linhagem

de melanoma Sk-Mel-103 e não se mostra dose-dependente para nenhuma

das diferentes linhagens. No tempo de 24h há uma tendência ao aumento da

densidade ótica em todas as linhagens exceto no melanoma Sk-Mel-147,

mostrando um efeito proliferativo após o primeiro dia de tratamento com o 2-

ME (Figura 22).

Figura 22: Efeito citotóxico do 2-ME em células primárias e de melanoma por MTT.

56

Apesar de apresentar efeito citotóxico pela metodologia do MTT a

observação das células (e os resultados obtidos por azul de tripan que serão

apresentados a seguir) nos mostra a ausência de células mortas no

sobrenadante. A diminuição da densidade ótica observada neste ensaio pode

então ser devida à uma diminuição do número total de células, levando a um

menor metabolismo do MTT em formazan. Assim sendo, os resultados aqui

apresentados podem refletir uma inibição da proliferação e não a citotoxicidade

propriamente dita do composto. Um menor número de células pode ser

observado nas placas após 72h de tratamento refletindo o efeito da inibição da

proliferação induzido pelo composto 2-ME. Nesse caso é necessário realizar o

ensaio de citotoxicidade por azul de tripan para verificar a indução de morte

celular.

Uma das réplicas do ensaio de MTT foi realizada também em

concentrações superiores a 10µM. Porém, devido a um efeito de aumento da

densidade ótica em relação ao controle nessas concentrações, e um efeito na

morfologia das células igual ao da concentração de 10µM, os ensaios com as

concentrações superiores foram descontinuados (Figura 23).

Figura 23: Ensaio sem replicatas da citotoxicidade do 2ME com concentrações superiores a 10µM, mostrando um aumento da densidade ótica não condizente com a quantidade de células observadas nas placas, justificando o uso de 10µM como concentração máxima de 2ME nos experimentos seguintes.

57

2. Citotoxicidade do 2ME por Azul de Tripan

A citotoxicidade foi então testada para o 2ME por ensaio de azul de

tripan. As células primárias e linhagens de melanomas foram tratadas por 24h,

48h e 72h com diferentes concentrações destes compostos.

É importante ressaltar que as culturas primárias utilizadas foram

provenientes de diferentes pacientes, mostrando que as respostas destas

células devem-se ao tipo celular e não a um indivíduo específico.

Queratinócitos primários imortalizados (HaCaT) também foram utilizados para

este teste de citotoxicidade, mas não tiveram resposta semelhante aos

queratinócitos primários aqui mostrados. O 2ME mostrou um grande efeito

citotóxico nesta linhagem (Figura 24).

Figura 24: Citotoxicidade do 2ME no queratinócito imortalizado HaCaT.

Como esperado, os resultados da citotoxicidade do 2ME obtidos por

azul de tripan foram diferentes daqueles obtidos pela metodologia do MTT. O

2-ME mostrou pouco efeito tóxico sobre quase todas as células tratadas, tanto

primárias quanto de melanomas, chegando a um máximo de 20% de morte

celular na concentração de 10µM em 72h nos queratinócitos e nas linhagens

de melanoma Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147 (Figura 25). As linhagens com maiores

taxas de morte celular foram as de melanoma Sk-Mel-19, chegando a

aproximadamente 80%, e melanoma Sk-Mel-173, chegando a

aproximadamente 30%, ambas na concentração de 10µM em 72h. É possível

0

50

100

NT DMSO 0,5uM 1uM 10uM

HaCat

Via

bili

da

de

Concentração de 2ME

24h

48h

72h

58

notar também que há uma leve tendência a um efeito dose dependente e

tempo dependente em todas as linhagens de melanoma testadas (Figura 25 e

26). Dentre as células primárias, os queratinócitos são as que apresentam

maior taxa de morte celular quando tratadas com o 2ME, porém mesmo as

células não tratadas apresentam uma taxa basal de morte celular de cerca de

10%, dessa maneira, a morte observada para essas culturas primárias tratadas

com o composto não se deve somente ao composto utilizado.

Figura 25: Efeito dose dependente do 2ME nas células primárias e linhagens de melanoma humano após 24h 48h e 72h.

No tratamento com 2-ME é possível notar drástica alteração morfológica

nas células primárias de melanócito e fibroblasto em relação ao controle, as

células perdem o aspecto alongado e mostram seu citoplasma mais espalhado

e uma morfologia mais trapezoidal. Da mesma forma, as linhagens de

melanoma mostram um maior espalhamento do citoplasma, bem como uma

diminuição do número total de células podendo refletir uma inibição da

proliferação causada pelo 2-ME (Figuras 27 e 28).

59

Figura 26 – Efeito tempo dependente do 2ME nas células primárias e linhagens de melanoma humano.

60

Figura 27: Fotos das células primárias e de melanoma Sk-Mel-19 tratadas com o composto 2-metoxiestradiol por 72h na concentração de 10µM. Aumento de 100x.

61

Figura 28: Fotos das células primárias e de melanoma Sk-Mel-28, Sk-Mel-103, Sk-Mel-147, e Sk-Mel-173 tratadas com o composto 2-metoxiestradiol por 72h na concentração de 10µM. Aumento de 100x.

62

3. Ensaio de formação de colônias

As células foram tratadas por duas semanas com concentrações sub-

tóxicas de 2-ME. Estas concentrações foram escolhidas por não interferirem na

viabilidade celular.

O tratamento com o 2ME foi realizado, inicialmente, com as

concentrações de 0,1µM e 0,5µM. A formação de colônias mostrou-se

levemente inibida no tratamento com a concentração de 0,1µM, porém o efeito

foi extremo no tratamento com a concentração de 0,5µM, onde observa-se a

inibição quase total do crescimento de colônias nas linhagens de melanoma

humano, mostrando o potencial deste composto inibir o crescimento destas

células em doses baixas (Figura 29).

Figura 29: Crescimento de colônias de fibroblastos primários e linhagens de melanoma humano após tratamento com 2ME nas concentrações indicadas.

Apesar da inibição na formação de colônias ser evidente, a contagem de

colônias foi realizada em uma replicata experimental, mostrando que não há

alteração na formação de colônias para os Fibroblastos primários, nem para as

linhagens de melanoma tratadas com 0,1µM de 2ME. Já na concentração de

0,5µM o 2ME leva a uma inibição drástica número de colônias formadas nas

placas de melanomas (Figura 30).

63

Figura 30: Quantificação do número de colônias formadas em uma das replicatas dos ensaios de formação de colônias.

É interessante observar que este efeito é seletivo para as linhagens de

melanoma humano, já que o mesmo não ocorre para as células de fibroblastos

primários (Figuras 29 e 30).

Ensaio similar foi realizado também com outras linhagens de melanoma

humano, para verificar se o composto demonstrava o mesmo efeito. Como é

possível observar na figura 31, diferentes linhagens de melanoma mostram

maior ou menor sensibilidade ao 2ME na formação de colônias. A linhagem

M245 teve a formação de colônias quase totalmente inibida na concentração

de 0,3µM enquanto na linhagem M318, para observar o mesmo efeito, foi

necessário tratamento com 1,0µM do composto (Figura 31).

Como apontado acima, a aquisição de resistência após tratamento com

quimioterápicos ou terapias específicas direcionadas (como o Vemurafenib)

são um grande problema na contenção da progressão tumoral e tratamento de

melanomas. Este fato motivou o ensaio de formação de colônias com

linhagens de melanoma resistentes a Vemurafenibe e duplo resistentes a

Vemurafenibe + Trametinibe tratadas com o 2ME (Figura 32).

64

Figura 31: Crescimento de colônias de diferentes linhagens de melanoma humano após tratamento com 2ME nas concentrações indicadas.

É interessante observar que da mesma forma que nas linhagens não

resistentes, as linhagens resistentes e duplo resistente testadas mostraram

inibição quase total da formação de colônias na dose de 1,0µM de 2-ME

(Figura 32), dose esta que não leva à morte celular após 72h de tratamento,

como constatado pelo ensaio de azul de tripan.

65

Figura 32: Crescimento de colônias de diferentes linhagens de melanoma humano resistente ou duplo resistente após tratamento com 1,0µM de 2-ME.

4. Contagem do número total de células

Uma forma de verificar efeito dos tratamentos na proliferação celular é

contar o número total de células presentes (vivas e mortas) após diferentes

períodos de exposição aos compostos, nas concentrações desejadas.

Figura 33: Efeito do 2ME administrado nas concentrações acima indicadas no número total de células após 24h, 48h e 72h de exposição ao composto.

66

A figura 33 mostra o número total de células após tratamento das

diferentes células primárias e linhagens de melanoma humano com diferentes

concentrações de 2ME por 24h, 48h e 72h. O tratamento com o 2ME pode

inicialmente levar a uma indução de proliferação quando administrado em

doses baixas em alguns tipos celulares, porém com o aumento da

concentração, bem como com o aumento do tempo de exposição, fica clara a

diminuição do número total de células. Mesmo em doses que não levam à

morte celular é possível observar uma inibição de cerca de 80% do número

total de células, como é observado para as linhagens de melanoma humano

Sk-Mel-103, Sk-Mel-147 e Sk-Mel-173 após 72h de tratamento com

concentrações de 0,5µM, 1µM e 10µM. É possível observar também que,

apesar de não terem sofrido morte celular, o 2ME diminui o número total de

células primárias, porém de moro não tão expressivo quanto as linhagens de

melanoma humano, como observado nos gráficos de 48h e 72h. Estes

resultados explicam a inibição da proliferação, e apóiam o uso do 2ME como

anti-proliferativo em melanomas humanos mesmo em doses subtóxicas

A Figura 34 mostra as diferentes linhagens celulares tratadas com o 2-

metoxiestradiol em gráficos separados, onde fica mais claro o efeito tempo

dependente dos tratamentos na proliferação celular, principalmente nas

linhagens de melanoma humano. Da mesma forma é possível notar inibição

expressiva no número total de células na concentração de 10µM de 2ME. Fica

evidente também nesta figura, o efeito mais pronunciado da inibição de

proliferação nas linhagens de melanoma humano em relação às células

primárias, mostrando a especificidade do composto.

67

Figura 34: Número total de células nas diferentes culturas primárias e linhagens de melanoma humano após tratamento com 2ME nas diferentes concentrações por 24h, 48h e 72h.

68

5. Curvas de Crescimento

Uma outra forma utilizada para avaliar o efeito do 2-ME na proliferação

celular foi a realização de curvas de crescimento na presença de diferentes

concentrações deste composto. As células foram plaqueadas e coletadas para

contagem após 1, 3, 5 e 7 dias de tratamento com o 2-ME nas concentrações

sub-tóxicas de 0,5µM e 1µM.

Figura 35: Curvas de crescimento e tempos de dobramentos das linhagens de melanoma humano indicadas após tratamento com 2ME nas concentrações de 0,5µM e 1µM.

Os gráficos foram montados de acordo com os valores obtidos nas

contagens celulares, e os tempos de dobramento das diferentes linhagens e

tratamentos foram calculados. É possível observar uma inibição significativa

entre o crescimento das células após tratamento com 2ME na concentração de

2ME 0.0µM 2ME 0.5µM 2ME 1.0µM

NS

NS ***

NS

NS **

***

NS

***

***

NS

***

# cé

lula

s (1

04 )

# cé

lula

s (1

04 )

# cé

lula

s (1

04 )

# cé

lula

s (1

04 )

Tempo de Dobramento

69

1µM em todas as linhagens. Nas linhagens Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147, esta

diferença já é significativa na concentração de 0,5µM (Figura 35).

Os tempos de dobramento calculados, como esperado, aumentam

quando as células são tratadas com 2ME. Sem tratamento os valores do tempo

de dobramento estão entre 30h e 50h. Quando as células são mantidas na

concentração de 0,5µM de 2ME estes valores ficam entre 50h e 120h, e na

concentração de 1,0µM de 2ME o tempo de dobramento fica entre 70h e 430h,

mostrando que a duplicação da população células é mais lenta na presença do

2ME, ficando nítido o efeito dose dependente (Figura 35).

6. Ensaio de Alamar Blue e IC50

O ensaio de Alamar Blue, assim como o ensaio de MTT, é um ensaio de

citotoxicidade que mede metabolismo celular pela redução de Resazurina a

Resofurina na presença de NADH. Sendo assim, este ensaio não mede

somente a indução de morte, mas também a inibição da proliferação nas

células.

Os experimentos de Alamar Blue foram realizados após tratamento das

células com 2-ME em concentrações de 0,01µM a 30µM por 3, 5 ou 7 dias. Os

resultados mostram inibição da proliferação e viabilidade celulares de forma

dose dependente (Figura 36). Após plotagem dos dados nos gráficos, foram

plotadas curvas ajustadas (ou fit curves) para o cálculo dos valores de IC50

(Figura 37).

Nas figuras 36 e 37 é possível observar que após 3 dias de tratamento

com 2-ME já é observada uma inibição na proliferação em todas as linhagens.

Observa-se também que, em todos os tempos nos quais os ensaios foram

realizados, as linhagens Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147 mostraram-se mais

sensíveis ao 2-ME.

A tabela 5 tem os valores de IC50 para as linhagens testadas após 3, 5

e 7 dias. Estes valores evidenciam a maior sensibilidade das linhagens Sk-Mel-

103 e Sk-Mel-147, cujos IC50 estão abaixo de 1,0µM, enquanto os valores de

IC50 das linhagens Sk-Mel-28 e Sk-Mel-173 estão entre 2,0µM e 20µM.

70

Figura 36: Gráficos da inibição de proliferação verificados por ensaio de Alamar Blue, após tratamento das linhagens indicadas com 2ME por 3 dias, 5 dias e 7 dias.

5 DIAS

7 DIAS

3 DIAS

% in

ibiç

ão d

o cr

esci

men

to

% in

ibiç

ão d

o cr

esci

men

to

% in

ibiç

ão d

o cr

esci

men

to

71

Figura 37: Gráficos da inibição de proliferação (preto) e suas curvas ajustadas ou fit curves (vermelho), após tratamento das linhagens indicadas com 2ME por 3 dias, 5 dias e 7 dias.

3 DIAS

5 DIAS

7 DIAS

% in

ibiç

ão d

o cr

esci

men

to

% in

ibiç

ão d

o cr

esci

men

to

% in

ibiç

ão d

o cr

esci

men

to

72

Como descrito anteriormente, as linhagens Sk-Mel-103 e Sk-Mel-

147, que se demonstraram mais sensíveis ao 2ME, possuem uma

característica comum: presença de BRAF selvagem e NRAS com mutação

Q16R. Por possuírem esta característica em comum, a hipótese de que a

presença desta mutação específica pudesse conferir maior sensibilidade das

células ao 2-ME foi levantada. Outras linhagens de melanoma humano com

esta substitução específica foram testadas (Figura 38). Os resultados mostram

que, mesmo entre as 6 linhagens testadas, há diferença na sensibilidade ao

composto. As linhagens WM1366 e M244 se mostraram mais sensíveis que as

linhagens M202, M207, IPC298 e M368. Desta forma, conclui-se que o efeito

do 2ME não depende das mutações presentes nas células e as linhagens

NRAS mutadas não são necessariamente mais sensíveis.

Tabela 5: Valores de IC50 para as linhagens de melanoma humano indicadas após tratamento com 2ME por 3 dias, 5 dias e 7 dias.

IC 50 (µM)

Sk-Mel-28 Sk-Mel-103 Sk-Mel-147 Sk-Mel-173

3 Days 2,744 0,2425 0,7008 19,56

5 Days 6,819 0,5473 0,519 7,635

7 Days 4,406 0,3368 0,686 6,709

Figura 38: Gráficos da inibição de proliferação de linhagens de melanoma humano com a substitção NRAS Q16R após tratamento com 2ME por 3 dias.

De

nsi

da

de

óp

tica

/ C

on

tro

le

3 Dias

Concentração 2ME µM

73

7. Análise da externalização de fosfatidilserina e permeabilidade da membrana

celular (Anexina V e Iodeto de Propídeo) por citometria de fluxo

Células de melanoma Sk-Mel-103 foram tratadas com 2ME a 10µM por

48h e 72h, coletadas e incubadas com Anexina-APC e Iodeto de Propídeo para

análise de morte celular por apoptose. Este ensaio mostrou a presença de

células apoptóticas principalmente após 72h de tratamento. Como pode ser

observado no quadrante inferior direito, 30% das células são positivas para

Anexina-V, mostrando a externalização da Fosfatidilserina, indicando a indução

deste tipo de morte celular programada (Figura 39).

Figura 39: Dot-plot das célualas marcadas com Anexina-APC e PI e submetidas a citometria de fluxo após tratamento com 2ME na concentração de 10µM por 48h e 72h.

Na figura 40 é possível notar o aumento da porcentagem de células

apoptóticas em 72h de tratamento com 2ME em relação ao tratamento por 48h,

mostrando o efeito tempo dependente da citotoxicidade deste composto.

74

Figura 40: Histograma da quantificação dos eventos mostrados no Dot-plot da citometria de fluxo das células de melanoma #9 tratadas por 48h (A) e 72h (B) com 2ME na concentração de 10µM.

8. Externalização de fosfatidilserina e potencial de membrana mitocondrial

(Anexina V e TMRM) por citometria de fluxo

Trabalhos anteriores já verificaram a indução da morte celular

programada do tipo apoptose pelo composto 2-metoxiestradiol, inclusive em

melanoma. No caso aqui descrito, a indução de apoptose foi testada pela

verificação, com a Anexina V, da externalização do fosfolipídeo fosfatidilserina,

e, com o tetrametilrodamina metil ester (TMRM), que mostra alterações no

potencial da membrana mitocondrial, que também está relacionado com a

morte por apoptose.

Em doses baixas de 2ME (0,5µM and 1,0µM), a porcentagem de células

positivas para Anexina V não foi muito expressiva, chegando a valores acima

de 25% somente na linhagem Sk-Mel-147. Somente nas linhagens Sk-Mel-103

e Sk-Mel-147 a morte por apoptose alcançou valores acima de 50%, como

observado pela marcação com Anexina V. Entretando, isto só aconteceu

quando as células foram tratadas com concentrações de 5,0µM and 10,0µM de

2ME, que são valores muito mais altos que as doses necessárias para a

inibição da proliferação (Figura 41).

0

20

40

60

80

100


48h

% E

ven

tos

NT 2ME 10

0

20

40

60

80

100


72h

% E

ven

tos

NT 2ME 10

A B

75

Figura 41: Análise da indução de apoptose por marcação com Anexina V e TMRM (despolarização de membrana mitocondrial) após tratamento com as doses indicadas de 2ME por 5 dias.

76

Resultados similares foram observados na marcação com TMRM. O

potencial de membrana mitocondrial não foi comprometido por baixas doses de

2ME (0,5µM e 1,0µM), exceto na linhagem Sk-Mel-147, onde houve perda

desta marcação em cerca de 30% das células após tratamento com 1,0µM de

2ME. Nas doses mais altas (5,0µM e 10,0µM) deste composto, a porcentagem

de células com despolarização da membrana mitocondrial chegou a valores

próximos de 40% em todas as linhagens celulares (Figura 41, gráficos da

direita).

Fica demonstrado então, que baixas doses de 2ME não causam

quantidade expressiva de morte por apoptose.

9. Indução da via de sinalização da apoptose

As cysteine-aspartic-acid-proteases (Caspases) são proteases

essenciais para o processo apoptótico. A Caspase-9 é uma caspase iniciadora,

que, quando clivada se torna ativa, e capaz de clivar outras proteínas, dentre

elas as Caspases efetoras (Caspases 3 e 7), as ativando, o que culmina na

apoptose celular. Estas estão inativas no citosol e, com a sua clivagem, se

tornam ativas e, então, são capazes de clivar/degradar diversas proteínas

necessárias para o funcionamento celular.

Para confirmar a indução de apoptose por baixas concentrações de

2ME, as células foram tratadas com este composto por 3, 5, 7 e 9 dias. Os

resultados dos western blottings são mostrados nas figuras 42, 43, 44 e 45.

Estes resultados mostram que, mesmo levando à morte celular por apoptose

em uma baixa porcentagem das células, o 2ME foi capaz de modular proteínas

envolvidas neste processo de morte celular programada, como pode ser

observado nas figuras.

A clivagem de Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) pela caspase 3

gera um fragmento de 89KDa, que é utilizado como um marcador da indução

de apoptose. Como verificado nas figuras 42 a 45, as linhagens Sk-Mel-28, Sk-

Mel-147 e Sk-Mel-173 mostram aumento deste produto de PARP clivado em

ao menos um dos tempos de tratamento. Esta clivagem pode ser induzida

mesmo por concentração de 0,5µM de 2ME, como em 3 dias na linhagem Sk-

Mel-147 (Figura 42), e em 5 dias na linhagem Sk-Mel-173 (Figura 43).

77

Figura 42: Western blotting após 3 dias de tratamento com 2ME.


78



79

Uma outra proteína envolvida no processo apoptótico é a B-cell

lymphoma 2 (Bcl-2). Ela faz parte da família de reguladores da apoptose,

atuando como uma inibidora deste processo. No caso do tratamento com 2ME,

pode ser observado que no tempo de 3 dias, ela é inibida nas linhagens Sk-

Mel-147 e Sk-Mel-173 (Figura 42). Em tempos de tratamento mais longos, não

é observada a sua modulação pelo 2ME.

Como ilustrado nas figuras 42 a 45, há um aumento na clivagem de

caspases -3, -7 e -9 induzido por 2ME em todas as linhagens celulares. Por

exemplo, em 3 dias (Figura 42), isto fica muito evidente na linhagem Sk-Mel-

28, onde o tratamento com 1,0µM de 2ME induz a clivagem das três caspases

mencionadas.

Apesar dos ensaios de citometria de fluxo não evidenciarem um

aumento expressivo da morte por apoptose, este processo está sendo induzido

em baixas concentrações do composto 2ME, como evidenciado nas figuras de

western blotting.

10. Análise da indução de vacúolos autofágicos

Células de melanoma humano da linhagem Sk-Mel-103 foram

estavelmente transfectadas com GFP-LC3 e tratadas com puromicina para

seleção das células que expressavam a proteína fluorescente. Estas células

foram tratadas com 2ME a 1,0µM por 24h, 48h e 72h, e avaliadas sob

microscopia de fluorescência para verificar formação de vesículas com GFP-

LC3 (Figura 46). Nota-se que após 24h já há um aumento de pontos de

fluorescência mais intensa no citoplasma da célula, e isto fica ainda mais

pronunciado após 48h e 72h.

Estes resultados mostram que o processo autofágico é induzido pelo

2ME nestas condições na linhagem SK-Mel-103.

80

Figura 46: Linhagem de melanoma humano Sk-Mel-103 transfectada com GFP-LC3 sob microscopia invertida após tratamento com 2ME nas condições indicadas, mostrando a formação de vacúolos autofágicos. Aumento 160X.

11. Indução de vesículas ácidas

As células da linhagem Sk-Mel-103 também foram utilizadas para a

verificação de vesículas ácidas, pois a indução do processo autofágico gera

vacúolos que se fundem com lisossomos, formando maior quantidade de

vesículas acidificadas, que fluorescem em vermelho com o corante “Acridine

Orange”.

Nota-se que após tratamento com 2ME na concentração de 10µM já é

possível observar um aumento na formação destas vesículas em 48h em

relação ao controle não tratado (Figura 47). Após 72h de tratamento é possível

notar um aumento da fluorescência vermelha mesmo nas células tratadas com

81

1,0µM de 2ME, mostrando indução deste processo mesmo em baixas

concentrações do composto.

Figura 47: Linhagem de melanoma humano Sk-Mel-103 após tratamento com 2ME nas condições indicadas, e incubadas com o corante Acridine Orange, mostrando a formação de vesículas ácidas em vermelho. Controle sem tratamento fotografado após 72h. Aumento 100X.

82

12. Proteínas associadas à regulação do processo autofágico

A proteína LC3 existe em sua forma citoplasmática (LC3-I) ou lipidada,

ligada a membranas do vacúolo autofágico (LC3-II). A indução de autofagia

leva ao aumento da isoforma lipidada, mostrando que há maior quantidade de

vacúolos autofágicos nas células.

No intuito de verificar este processo, um ensaio piloto de western blotting

foi realizado, onde células da linhagem Sk-Mel-103 foram tratadas com 2ME na

presença ou ausência de inibidores do processo autofágico. É possível notar

na figura 48 que o 2ME na concentração de 10µM é capaz de aumentar a

isoforma lipidada de LC3 (banda inferior), mostrando uma indução do processo

autofágico após 72h de tratamento. Nota-se também que o inibidor de

autofagia Bafilomicina (Baf) leva a um acúmulo de LC3-II. Este acúmulo ocorre

porque a Baf inibe a fusão do autofagossomo com o lisossomo, levando a um

acúmulo de vacúolos autofágicos quando este processo está induzido.

Figura 48: Western Blotting da proteína LC3 em linhagem de melanoma Sk-Mel-103 após 72h de tratamento nas condições indicadas, mostrando as duas isoformas da proteína: citoplasmática (LC3-I) e lipidada (LC3-II).

Para a confirmação desta indução outras proteínas relacionadas ao

processo autofágico foram analisadas, como a proteína p62/SQTM1, Beclin-1 e

ATG-5. A presença da proteína LC3 também foi analisada em outras linhagens

de melanoma humano.

83

Figura 49: Western Blotting para a proteína p62/SQTM1 em diferentes linhagens de melanoma humano tratadas com as concentrações indicadas de 2ME por 3 dias.

A proteína p62/SQTM1 (p62) forma agregados proteicos que são

degradados no processo autofágico, desta forma, a indução do processo

autofágico leva ao aumento desta degradação, diminuendo assim a expressão

desta proteína na célula. A figura 49 mostra uma replicata experimental de

western blotting realizado para a proteína p62 em células tratadas com 2ME

por 3 dias e o gráfico da quantificação da intensidade das bandas. Com

exceção da linhagem Sk-Mel-28 todas as células testadas mostram uma

diminuição da quantidade desta proteína, o que indica aumento do processo

autofágico. Por outro lado, esta indução ocorre somente quando as células são

tratadas com 10µM de 2ME, concentração com efeitos citotóxicos, e muito

mais alta que as concentrações necessárias para a inibição da proliferação

celular.

A iniciação do processo autofágico depende de diversas proteínas que o

regulam, dentre elas estão Beclin-1 e ATG-5. A indução do início do processo

autofágico eleva a expressão destas proteínas, porém, conforme ilustrado na

84

figura 50, o tratamento com o 2ME não modulou os seus níveis nem quando

concentrações altas (10µM) foram utilizadas para tratar as células. A proteína

LC3 também foi testada em outras linhagens celulares diferentes da testada

anteriormente, e não foi observada indução de sua forma lipidada (LC3-II ou

LC3-B) nem mesmo na linhagem Sk-Mel-103, onde esta lipidação já havia sido

mostrada anteriormente, mostrando que a iniciação do processo autofágico

não é fortemente induzida pelo 2ME mesmo em concentrações citotóxicas.

Figura 50: Western Blotting para as proteínas Beclin-1, LC3 e ATG-5 em diferentes linhagens de melanoma humano tratadas com as concentrações indicadas de 2ME por 3 dias.

13. Análise do ciclo celular por citometria de fluxo

Após serem verificados os efeitos na inibição do crescimento das células

por Alamar Blue e por ensaio de formação de colônias, células da linhagem de

melanoma Sk-Mel-103 foram tratadas com 2ME para análise do efeito deste

composto no ciclo celular por citometria de fluxo.

85

As figuras 51 e 52 mostram a influência do 2ME na distribuição das

populações celulares nas diferentes fases do ciclo celular, respectivamente

após 24h e 48h de tratamento com o composto. O eixo das abscissas mostra a

quantidade de DNA presente em cada evento, demonstrado pela marcação

com iodeto de propídeo (PI), no eixo das ordenadas está plotado o número de

eventos.

Figura 51: Histograma da citometria de fluxo mostrando as populações de células nas diferentes fases do ciclo celular após 24h de tratamento com o 2ME.

Observando as figuras 51 e 52 fica evidente o aumento da população na

fase G2/M do ciclo celular quando as células são tratadas com 10µM de 2ME.

Isto ocorre tanto por 24h (Figura 51) como por 48h (Figura 52). As

concentrações mais baixas de 2ME mostram alteração no ciclo celular destas

células, porém não de forma tão expressiva quando a concentração é de

10µM.

A figura 52 mostra uma parada das células na fase G2/M do ciclo celular

na concentração de 1,0µM de 2ME. Fica evidente, também, o aumento da

população com DNA fragmentado (Sub G1) após tratamento com o 2ME

mesmo em baixas concentrações. Além disso, é possível observar aumento da

86

população de células poliplóides, com conteúdo de DNA maior que G2, tanto

no tratamento com 1µM como 10µM de 2ME.

Figura 52: Histograma da citometria de fluxo mostrando as populações de células nas diferentes fases do ciclo celular após 48h de tratamento com o 2ME.

Com a análise de três experimentos independentes foi possível

quantificar as populações de células nas diferentes fases do ciclo de forma

comparativa, excluindo-se as células com conteúdo Sub G1 e poliplóides,

como mostrado nas figuras 53 e 54, representando os dados referentes aos

tratamentos por 24h e 48h respectivamente.

É possível notar em ambos os casos, a predominância de células na

fase G1 do ciclo celular em todos os tratamentos, tanto em 24h como em 48h,

exceto na presença de 2ME a 10µM, onde a predominância de células está na

fase G2 do ciclo celular. É possível notar também um amento na porcentagem

de células em G1 nos tratamentos por 48h em relação à 24h, salvo pelo

tratamento na maior concentração do composto (Figuras 53 e 54).

87

Figura 53: Gráfico de barras representando as populações de células nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, após diferentes tratamentos por 24h.

Figura 54: Gráfico de barras representando as populações de células nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, após diferentes tratamentos por 48h.

Como controle, células foram privadas de soro fetal bovino, isto é,

carenciadas, mostrando que há uma parada do ciclo celular em G1 tanto em

24h como em 48h de carenciamento (Figuras 53 e 54).

0 20 40 60 80 100

NT

Veiculo

Carenc

2-ME 0,5

2-ME 1

2-ME 10

% de Eventos - 24h

G1

S

G2

0 20 40 60 80 100

NT

Veiculo

Carenc

2-ME 0,5

2-ME 1

2-ME 10

% de Eventos - 48h

G1

S

G2

*

*

88

14. Análise de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular

Após verificar alteração no ciclo celular com parada na fase G2/M do

ciclo celular, e aumento de população de células poliplóides, foram analisadas,

por western blotting, as expressões de proteínas envolvidas no ciclo celular,

especialmente no controle desta fase do ciclo.

A transição entre G2 para a mitose requer formação de complexo

Cdc2/CiclinaB1. Este complexo é ativado por Cdc25, e pode ser inibido por

Wee1 e p21Cip1, dentre outras proteínas. A fosforilação nos resíduos S807/811

da proteína pRb é presente em células proliferativas, e a ausência desta

fosforilação marca células não proliferativas, como células em G0, por exemplo

(Ren and Rollins 2004).

Figura 55: Western Blotting de proteínas relacionadas à transição G2/M do ciclo celular em linhagens de melanoma humano tratadas com 1,0µM de 2ME pelos tempos indicados.

89

A figura 55 mostra a expressão destas proteínas mencionadas, após

tratamento com 2ME a 1,0µM por diferentes tempos, de 1h a 72h. É possível

notar modulação em diversas proteínas, e estas alterações variam conforme a

linhagem celular utilizada. Por outro lado, em todas as linhagens há modulação

de proteínas que culminam na inibição da proliferação.

Figura 56: Western Blotting de proteínas relacionadas à transição G2/M do ciclo celular em linhagens de melanoma humano tratadas com as concentrações indicadas por 5 dias.

A linhagem Sk-Mel-28, por exemplo, apesar de não mostrar inibição de

pRB S807/811, tem aumento da expressão de p21Cip1 e diminuição de Ciclina

B1. Na linhagem Sk-Mel-103, é possível observar, além da inibição de

fosforilação de pRB S807/811, um aumento em p21Cip1 e inibição de Ciclina B1.

A linhagem Sk-Mel-147 tem a inibição quase total da fosforilação nos resíduos

S807/811 de Rb, e a diminuição de expressão de Ciclina B1 em 48h, e além

disso, é observado um aumento expressivo de p21Cip1. Por fim, a linhagem Sk-

90

Mel173 tem inibição de pRB S807/811, aumento da expressão de p21Cip1, além

de um aumento na expressão de Wee1, um inibidor do complexo Cdk/Ciclina

responsável pela transição da fase G2 para a fase de Mitose do ciclo cellular

(Figura 55).

Para confirmar este efeito nas proteínas envolvidas na transição de

G2/M do ciclo celular, as células foram tratadas por 5 dias com doses

crescentes de 2ME, de 0,5µM a 10µM. Os western blottings mostram que em

todas as linhagens há uma inibição de Ciclina B1 e de pRb S807/811, sendo

que em algumas linhagens isso já pode ser observado em baixas

concentrações do composto (0,5µM e 1,0µM). A proteína p21Cip1 está

aumentada em todas as linhagens em concentrações até 1,0µM, exceto na Sk-

Mel-147. Na linhagem Sk-Mel-147, a proteína p21Cip1 está aumentada somente

em doses mais altas, enquanto nestas doses as outras linhagens tiveram sua

expressão diminuída (Figura 56).

15. Outras proteínas relacionadas à proliferação

Outras vias de sinalização também regulam a proliferação celular. Um

exemplo é a via de RAS/RAF/ERK. A proteína ERK fosforilada (p42/p44) induz

fatores transcricionais nucleares e expressão de genes que induzem a

proliferação. Um dos principais compostos anti-melanoma, o Vemurafenib, atua

nesta via de sinalização, inibindo a proteína BRAFV600E, que é

constitutivamente ativa e leva as células a proliferarem. Um ensaio de Western

Blotting foi realizado após tratamento das células com 1,0µM de 2ME por

tempos de 1h a 72h (Figura 57). Como é possível notar, o 2ME não levou a

alterações na fosforilação desta proteína, assim é excluída a hipótese de que o

2ME inibe a proliferação celular também por esta via de sinalização.

91

Figura 57: Western Blotting de ERK e pERK em linhagens de melanoma humano tratadas com 1,0µM de 2ME pelos tempos indicados.

92

16. Ensaios para detecção de Senescência

Uma das hipóteses que explicaria a alteração morfológica das células e

a expressiva inibição na proliferação é a indução de senescência celular, que

tem um fenótipo característico de células com citoplasma mais espalhado, e

que não se proliferam.

As células foram plaqueadas e tratadas com 2-ME por 5 dias e então

coradas para evidenciar a β-galactosidase associada à senescência, em azul.

Nota-se, além do menor número de células totais, uma maior quantidade de

células com citoplasma espalhado e células com coloração azul intensa

quando estas foram tratadas com 2ME (Figura 58), mostrando que este

composto é um indutor de senescência.

Figura 58: Células das linhagens indicadas cultivadas por 5 dias na presença ou ausência de 1,0µM de 2ME coradas para β-galactosidase associada à senescência. Aumento 160X.

93

Uma proteína que caracteriza a senescência induzida pela ativação de

oncogenes ou danos ao DNA é a Histona H3 trimetilada na lisina 9 (H3K9me3).

Como mostrado por western blotting na figura 59, após o tratamento por 5 dias

com 2ME, as linhagens de melanoma Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147 mostraram um

aumento expressivo desta proteína, indicando que este processo está sendo

induzido nestas células. O mesmo foi observado com menor expressividade na

linhagem Sk-Mel-28. Por outro lado, este aumento só foi observado após

tratamento com 10µM de 2ME, não sendo observadas alterações no nível de

H3K9me3 quando as células foram tratadas com a dose mais baixa de 2ME.

Figura 59: Western bloting para a proteína Histona H3 trimetilada na lisina 9 (H3K9me3) em células tratadas por 3 dias com 2ME nas concentrações indicadas.

Com o objetivo de verificar a indução desta trimetilação na lisina 9 da

histona H3 mesmo em concentrações baixas de 2ME foram realizados western

blottings de células tratadas com este composto na concentração de 1,0µM por

1h a 72h. A observação deste western blotting mostra uma leve indução desta

histona nas linhagens Sk-Mel-28, Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147, mostrando que

esta alteração pode ser uma das respostas celulares que contribuem para o

fenótipo senescente das células (Figura 60).

Um ponto importante é verificar se as células entram em senescência de

forma irreversível, ou se após a retirada do composto, elas voltam a ser

proliferativas, caracterizando quiescência. Para testar isso as células foram

plaqueadas e tratadas por 5 dias com 2ME. Depois destes 5 dias elas foram

mantidas na presença ou ausência de 2ME por 3 dias adicionais, e então

coradas para evidenciar β-galactosidase associada à senescência. A figura 61

mostra este tratamento com diferentes concentrações de 2ME para células das

94

linhagens Sk-Mel-28, Sk-Mel-103 e Sk-Mel-173. Fica evidente, principalmente

para a linhagem Sk-Mel-28 tratada com 1,0µM de 2ME que a senescência é

induzida quando as células são mantidas na presença do 2ME (linha superior).

Nota-se também que quando o 2ME é retirado pelos últimos 3 dias de

tratamento (linha inferior), as células senescentes continuam presentes, e o

fenótipo de senescência evidenciado pela coloração da β-galactosidase

associada à senescência em azul ainda está presente. Isto mostra que mesmo

após a retirada do 2ME por 3 dias, não há reversão da senescência induzida

nas células no período de tempo analisado.

Figura 60: Western bloting para a proteína Histona H3 trimetilada na lisina 9 (H3K9me3) em células tratadas com 1,0µM de 2ME nos tempos indicados.

95

Figura 61: Células das linhagens indicadas cultivadas por 5 dias na presença de 0,5µM, 1,0µM ou 2,0µM de 2ME e depois por mais 3 dias na presença (fotos superiores) ou ausência (fotos inferiores) deste composto, e então coradas para β-galactosidase associada à senescência.

96

17. Efeitos na polimerização da Tubulina

Os efeitos do 2-ME na polimerização da tubulina já haviam sido

descritos (D'Amato et al. 1994). Tal efeito foi observado in vitro inclusive em

linhagem de melanoma (Dobos et al. 2004). Aqui foi verificado o efeito do 2ME

na polimerização da tubulina por microscopia confocal. O ensaio de

imunofluorescência foi realizado nas linhagens de melanoma humano Sk-Mel-

28 (Figuras 62, 63, 64 e 65), Sk-Mel-103 (Figuras 66, 67, 68 e 69) e Sk-Mel-

147 (Figuras 70, 71, 72 e 73) após tratamento com 2ME por 3 e 5 dias nas

concentrações de 0,5µM e 1,0µM.

A coloração verde nas figuras 62 a 73 mostra a marcação para a

tubulina, evidenciando os microtúbulos e filamentos desta proteína. Nota-se

que após o tratamento com o 2ME, a disposição destas fibras é diferente. Após

o tratamento, os feixes tornam-se mais densos, em alguns casos mais

espessos, e a coloração verde mais intensa. Este efeito é observado em 3 dias

no tratamento com 1,0µM de 2ME, principalmente nas linhagens Sk-Mel-28 e

Sk-Mel-147 (Figuras 62, 63, 70, 71). Após 5 dias de tratamento, o efeito na

esabilização da polimerização da tubulina é ainda mais evidente, e pode ser

também observado na concentração de 0,5µM de 2ME (Figuras 64, 65, 68, 69,

72, 73). Nestes casos, em especial na maior concentração utilizada do

composto, é possível observar morfologia celular alterada, com células maiores

e com citoplasma mais espalhado, com tubulina disposta por toda a célula em

túbulos densos e mais espessos que na ausência do tratamento.

É possível também observar presença de células multi-nucleadas,

principalmente dentre as células com citoplasma mais espalhado e com

microtúbulos que apresentam morfologia de polimerização mais estável, o que

pode ser devido a defeitos na divisão celular e separação dos núcleos

celulares durante a mitose.

97

Figura 62: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-28 após 3 dias de tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho - Actina.

Figura 63: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-28 após 3 dias de tratamento. Sobreposição: Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina. Barras - 25µm.

98

Figura 64: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-

Mel-28 após 5 dias de tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina

Figura 65: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-28 após 5 dias de tratamento. Sobreposição: Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina. Barras - 25µm.

99

Figura 66: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-103 após 3 dias de tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina. Figura 67: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-

Mel-103 após 3 dias de tratamento. Sobreposição: Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina. Barras - 25µm.

100



101

Figura 70: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-147 após 3 dias de tratamento. Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina.

Figura 71: Efeito do 2-metoxiestradiol na polimerização da tubulina na linhagem Sk-Mel-147 após 3 dias de tratamento. Sobreposição: Azul –DAPI. Verde – Tubulina. Vermelho – Actina. Barras - 25µm

102



103

18. Efeito do 2-metoxiestradiol em Modelo de esferóides

A citotoxicidade também foi testada em modelo tridimensional de

esferóides implantados em colágeno. Para isso as células cresceram livres de

adesão em placa, aderindo-se umas às outras, formando pequenas esferas,

que são similares a tumores em diversos aspectos, como distribuição de

oxigênio e nutrientes. A expressão protéica também pode ser diferenciada

dentro dos esferóides, dependendo da localização da célula e de sua

proximidade à periferia da esfera (Hirschhaeuser et al. 2010).

Desta forma, o teste do composto 2ME neste modelo tridimensional

mostra maior complexidade experimental, assemelhando-se um pouco mais a

uma resposta esperada em um indivíduo.

Figura 74: Esferóides da linhagem Sk-Mel-28 tratados com concentrações de 1,0µM e 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

104

Inicialmente, o 2ME foi testado em linhagens celulares “naïve”, ou seja,

nunca antes expostas a nenhum outro composto. Estas linhagens testadas

foram Sk-Mel-28, Sk-Mel-103, Sk-Mel-147 e Sk-Mel-173 (Figuras 74 a 77). O

2ME mostrou-se eficiente em todas elas, independentemente do status

mutacional das células, causando em algumas linhagens, maior morte celular,

e em outras menor invasão na matriz de colágeno.

Na linhagem Sk-Mel-28 (Figura 74), nota-se menor viabilidade, mostrada

pela diminuição na fluorescência verde quando o esferóide é tratado com 2ME.

Na linhagem Sk-Mel-103 (Figura 75), há um aumento na fluorescência

vermelha após o tratamento com 5,0µM de 2ME, evidenciando a toxicidade

deste composto nesta linhagem celular.

Figura 75: Esferóides da linhagem Sk-Mel-103 tratados com concentrações de 1,0µM e 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho). Nas linhagens Sk-Mel-147 e Sk-Mel-173, não é possível notar diferenças

na intensidade das fluorescências verde ou vermelha, mas a alteração no

105

tamanho dos esferóides fica evidente após o tratamento com 2ME e ambas as

concentrações utilizadas (Figuras 76 e 77).

Figura 76: Esferóides da linhagem Sk-Mel-147 tratados com concentrações de 1,0µM e 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho). O efeito no tamanho do esferóide traduz a capacidade das células

invadirem a matriz de colágeno em volta do esferóide, mostrando que o

composto 2ME, nestes casos, apesar de não ter alterado a viabilidade celular,

alterou a capacidade de invasão.

A quantificação da fluorescência do experimento aqui ilustrado mostra

que em quase todos os casos de tratamento com 2ME a morte celular nos

esferóides é maior que no controle. Este fato é mostrado pelos valores de

Fluorescência Vermelha/Fluorescência Verde maiores que 1. A figura 78

mostra que a proporção de células mortas em relação às células vivas

aumenta quando as células são tratadas com 2ME, principalmente na

concentração de 5,0µM.

106

Figura 77: Esferóides da linhagem Sk-Mel-173 tratados com concentrações de 1,0µM e 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

Após ter mostrado efeito em linhagens nunca antes expostas a outros

compostos, o 2ME foi testado em linhagens com a mutação BRAF V600E

resistentes ao Vemurafenibe (inibidor da proteína mutada) e ao Vemurafenibe

+ Trametinibe (Inibidor de MEK1/2), para verificar se o 2ME continuava

eficiente na contenção de células tumorais, mesmo quando estas mostravam

resistência previamente adquirida.

As linhagens resistentes e duplo resistentes foram testadas

comparativamente às suas contrapartidas parentais. Em todas as linhagens

testadas, o 2ME mostrou algum efeito na viabilidade celular ou potencial de

invasão na matriz de colágeno (Figuras 79 a 80).

A linhagem Sk-Mel-28 parental, por exemplo, já havia mostrado inibição

de viabilidade em testes anteriores. Este resultado foi observado novamente,

107

como se nota na Figura 79. É interessante observar que a linhagem Sk-Mel-

28R, resistente ao Vemurafenibe (6,0µM); e a linhagem Sk-Mel-28RT, duplo

resistente ao Vemurafenibe (6,0µM) e Trametinibe (0,1µM), mostram maior

potencial de invasão na matriz de colágeno em relação à linhagem parental.

Mesmo com maior potencial invasivo e sendo resistentes aos compostos

mencionados, estas linhagens mostraram inibição de viabilidade (maior

fluorescência vermelha) e inibição expressiva da invasão celular no colágeno

após o tratamento com 5,0µM de 2ME.

Figura 78: Quantificação da fluorescência de uma replicata experimental dos esferóides referente ao experimento ilustrado nas figuras 75 a 78. Valores da quantificação da fluorescência vermelha divididos pela fluorescência verde em relação ao controle (Valor = 1), dando assim a proporção de células mortas.

108

Figura 79: Esferóides das linhagens Sk-Mel-28, Sk-Mel-28R e Sk-Mel-28RT tratados com 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

109

Figura 80: Esferóides das linhagens Sk-Mel-19 e Sk-Mel-19R tratados com 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

Figura 81: Esferóides das linhagens Sk-Mel-29 e Sk-Mel-29R tratados com 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

Resultados similares foram observados nas linhagens Sk-Mel-19, Sk-

Mel-19R (Figura 80), Sk-Mel-29 e Sk-Mel-29R (Figura 81). Apesar das

linhagens resistentes não mostrarem potencial invasivo expressivamente maior

110

que as linhagens parentais neste caso, nota-se um leve aumento do tamanho

dos esferóides. Da mesma forma, a presença do 2ME levou à uma diminuição

na viabilidade celular, como observado pelo aumento na fluorescência

vermelha na linhagem Sk-Mel-19 (Figura 80) e pela diminuição na

fluorescência verde após o tratamento com este composto nas linhagens Sk-

Mel-19R (Figura 80), Sk-Mel-29 e Sk-Mel-29R (Figura 81). A diminuição nas

dimensões do esferóide também é notável após o tratamento com o 2ME,

principalmente nas linhagens Sk-Mel-29 e Sk-Mel-29R (Figura 81).

Figura 82: Esferóides da linhagem UACC62 tratados com 1,0µM ou 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho).

A linhagem UACC62 mostrou maior sensibilidade ao 2ME que as

linhagens de melanoma humano mostradas anteriormente. Na presença de

1,0µM do composto, já é possível notar um aumento na fluorescência

vermelha, sendo que a indução de morte celular é ainda mais expressiva

111

quando os esferóides são tratados com 5,0µM de 2ME (Figura 82). Quando o

ensaio foi realizado com a linhagem resistente UACC62R não foi observado o

mesmo que nas outras linhagens resistentes. Os esferóides formados por estas

células mostraram-se menores que os das células parentais. Em relação à

sensibilidade ao 2ME, ela se mostrou menor em relação à linhagem parental,

mostrando diminuição da viabilidade apenas após o tratamento com 5,0µM de

2ME (Figura 83).

Fica claro assim, que todas as linhagens, mesmo a UACC62 em menor

escala, são sensíveis e são levadas à morte celular quando tratadas com 2ME,

independente de resistências previamente adquiridas.

Figura 83: Esferóides da linhagem UACC62R tratados com 1,0µM ou 5,0µM de 2ME e coradas para evidenciar células viáveis (verde) e inviáveis (vermelho)

112

A quantificação do experimento de esferóides, ilustrado nas figuras 79 a

83, está plotada no gráfico da figura 84. É possível notar que em todos os

casos o tratamento com 2ME levou a maior proporção de morte celular nos

esferóides quando comparados ao controle (valores maiores que 1) exceto na

linhagem UACC62R tratada com 1µM de 2ME.

Figura 84: Quantificação da fluorescência de uma replicata experimental dos esferóides referente ao experimento ilustrado nas figuras 93 a 97. Valores da quantificação da fluorescência vermelha divididos pela fluorescência verde em relação ao controle (Valor = 1), dando assim a proporção de células mortas.

113

19. Efeito do 2-metoxiestradiol em Modelo de Pele Reconstituída

O efeito do 2-metoxiestradiol foi testado no modelo de pele

reconstituída. Como mostrado anteriormente, a pele sem melanoma mostrou

diferenciação de células de queratinócito na epiderme e o 2ME na

concentração de 5,0µM não alterou sua diferenciação, nem a morfologia da

derme. A figura 85 mostra a pele sem melanoma e corada com hematoxilina-

eosina (HE) em diferentes aumentos, mostrando a derme e epiderme. A

epiderme possui camada basal, com queratinócitos com núcleos maiores,

extrato espinhoso e extrato granuloso, com queratinócitos em diferenciação, e

camada córnea, com queratinócitos de núcleo pequeno ou ausente, e

marcação forte com eosina. A derme é rica tanto em colágeno como em

fibroblastos (Figura 85).

Figura 85: Peles reconstituídas sem células de melanoma (controle) coradas com Hematoxilina-Eosina (HE). Aumento de 100x (esquerda), 200x (centro) e 400x (direita).

Figura 86: Peles reconstituídas sem células de melanoma (controle). Imunofluorescência para citoqueratina 10 (verde) e involucrina (vermelho). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

114

As peles reconstituídas sem melanoma foram submetidas a

imunofluorescência no intuito de caracterizar a diferenciação da epiderme e

suas diferentes camadas, bem como a lâmina basal e células proliferativas

(Figuras 86 a 90, 92 a 95, 97 a 100). Em todas estas peles os núcleos

celulares foram marcados em azul com DAPI.

A marcação com a citoqueratina 10, evidencia em verde as camadas

supra-basais do epitélio, marcando as camadas diferenciadas do epitélio. Da

mesma forma, a involucrina marca em vermelho os queratinócitos dos extratos

mais diferenciados, marcando todo o epitélio, exceto a camada basal (Figura

86).

Figura 87: Peles reconstituídas sem células de melanoma (controle). Imunofluorescência para BrdU (verde) e Filagrina (vermelho). Aumento de 100x (superior), 200x (centro) e 400x (inferior).

Durante as últimas 24h de diferenciação das peles, elas foram

incubadas com BrdU, para verificar a presença de células com síntese de DNA

e em proliferação. Na figura 87 está evidenciada em vermelho a marcação com

filagrina, que está presente nas camadas mais diferenciadas do epitélio. O

anticorpo anti-BrdU foi utilizado nesta pele reconstituída para mostrar as

células em proliferação. Fica claro que as células proliferativas estão presentes

na camada basal do epitélio, evidenciando os queratinócitos que dão origem às

camadas mais diferenciadas da epiderme. No aumento de 100X é possível

115

notar algumas poucas células da derme marcadas, mostrando que há

fibroblastos na derme que estão em fase de síntese de DNA.

Da mesma forma que na figura anterior, a figura 88 mostra a marcação

com filagrina em vermelho nas camadas mais diferenciadas do epitélio. Com o

objetivo de evidenciar a membrana basal da epiderme, a imunofluorescência

para laminina foi realizada. A marcação em verde evidencia esta proteína na

membrana basal logo abaixo da camada basal de queratinócitos na epiderme.

Nota-se também uma marcação inespecífica de laminina nas camadas mais

diferenciadas do epitélio, porém mais fraca que na membrana basal.

Figura 88: Peles reconstituídas sem células de melanoma (controle). Imunofluorescência para Laminina (verde) e Filagrina (vermelho). Aumento de 100x (superior), 200x (centro) e 400x (inferior).

Um outro marcador utilizado foi o MelanA, que evidencia as células de

melanoma. Como esperado, não há marcação com este anticorpo na pele

reconstituída sem células de melanoma (Figura 89, superior). Como mostrado

anteriormente, a filagrina marca as camadas mais diferenciadas do epitélio

(Figura 89, centro). Uma outra proteína de diferenciação investigada foi a

citoqueratina 14, que marca as camadas mais basais e não diferenciadas do

epitélio, como mostra a figura 89, linha inferior.

116

Figura 89: Peles reconstituídas sem células de melanoma (controle). Imuno-fluorescência para MelanA (marcação de melanoma) em verde (superior), Filagrina em vermelho (centro) e citoqueratina 14 em verde (inferior). Aumento de 200x.

Os controles negativos foram incubados com PBS em vez dos

anticorpos primários, e em seguida incubados com os anticorpos secundários

fluorescentes utilizados neste experimento. A ausência de marcação nos

controles negativos (Figura 90) mostra a especificidade da marcação.

Figura 90: Peles reconstituídas sem células de melanoma (controle). Controles negativos de imunofluorescência. Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

117

A pele também foi reconstituída com a presença de células de

melanoma humano da linhagem Sk-Mel-28. Nota-se inicialmente uma alteração

na morfologia da pele. A diferenciação do epitélio está alterada, com menor

número de camadas, não sendo possível distinguir as camadas basais, estrato

espinhoso e estrato granuloso. Por outro lado, ainda é possível notar a

presença de uma camada córnea (Figura 91).

Figura 91: Peles reconstituídas com células de melanoma da linhagem Sk-Mel-28 coradas com Hematoxilina-Eosina (HE). Aumento de 100x (esquerda), 200x (centro) e 400x (direita).

Nota-se também a presença de focos de maior celularidade na derme,

em regiões próximas à epiderme, evidenciando regiões nas quais as células

tumorais estão invadindo a derme através da membrana basal (Figura 91).

Figura 92: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 sem tratamento. Imunofluorescência para involucrina (vermelho). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

118

A figura 92 mostra marcação de involucrina em vermelho. Esta proteína

está presente em camadas diferenciadas do epitélio. Na pele reconstituída sem

melanoma, ela se mostrou presente em todas as camadas do epitélio, exceto

na basal (Figura 86). Na pele com melanoma, nota-se uma marcação mais

branda de involucrina, e próxima às camadas mais basais, não estando

presentes nos focos de células que invadem a derme, nem em focos de

celularidade presentes nas camadas mais diferenciadas da epiderme (Figura

92). A citoqueratina 10 e a citoqueratina 14 não foram detectadas neste caso.

Da mesma forma, a marcação contra BrdU foi inespecífica e mostrou

precipitados por toda a pele, não sendo possível verificar núcleos de células

proliferativas.

A reação com anticorpo anti-MelanA mostrou marcação (verde)

específica nas áreas ricas em células de melanoma. Com esta coloração fica

evidente que as regiões com maior celularidade na derme são de fato células

de melanoma invadindo a matriz extracelular (Figura 93).

Figura 93: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 sem tratamento. Imunofluorescência para o marcador de melanoma MelanA (verde). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

A marcação de laminina (verde) evidencia a presença de membrana

basal no limite entre a epiderme e a derme das peles reconstituídas na

presença de células da linhagem Sk-Mel-28. Esta membrana basal é

119

degradada pelas células de melanoma e, através dela, as células tumorais

invadem a derme, formando focos de invasão (Figura 94). A mesma figura

mostra a presença da filagrina em vermelho. Da mesma forma que na pele

sem melanoma, a filagrina marca somente as camadas mais distantes da

camada basal, mostrando maior diferenciação destas células. Por outro lado, a

espessura desta camada é muito menor quando comparada à pele

reconstituída na ausência de melanoma (Figuras 87, 88 e 89).

Figura 94: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 sem tratamento. Imunofluorescência para laminina (verde) e filagrina (vermelho). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

Figura 95: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 sem tratamento. Controles negativos de imunofluorescência. Aumento de 200x.

Os controles negativos indicam somente uma marcação muito branda

para a fluorescência verde, mostrando que estes experimentos têm pouca

inespecificidade (Figura 95).

A pele reconstituída com células da linhagem Sk-Mel-28 mostrou

morfologia similar na presença e na ausência do 2ME. Adicionando-se este

composto nos últimos 5 dias de diferenciação da pele também é possível notar

alterações na diferenciação da epiderme em relação à pele normal, onde a

120

camada córnea ainda é evidente, bem como focos de maior celularidade na

derme (Figura 96).

Figura 96: Peles reconstituídas com células de melanoma da linhagem Sk-Mel-28 coradas com Hematoxilina-Eosina (HE). Aumento de 100x (esquerda), 200x (centro) e 400x (direita).

Figura 97: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 tratadas por 5 dias com 2ME. Imunofluorescência para involucrina (vermelho). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

A marcação da involucrina, evidenciada em vermelho na figura 98,

mostra, da mesma forma que na pele com melanoma sem tratamento, uma

fluorescência mais branda que na pele normal. Esta marcação está limitada às

camadas mais distantes da interface entre a derme e epiderme, mostrando as

camadas mais diferenciadas deste tecido. Como no caso anterior, a

citoqueratina 10 e citoqueratina 14 não foram detectadas, e a marcação com

BrdU se mostrou inespecífica, com artefatos e precipitados, sendo impossível

distinguir núcleos de células proliferativas.

121

A coloração específica para delimitar as células de melanoma mostra a

maior quantidade de positividade restrita à epiderme. Alguns aglomerados

celulares com marcação fluorescente verde podem ser observados na derme,

mostrando que este melanoma continua atravessando a membrana basal e

invadindo a matriz extracelular mesmo na presença do 2ME (Figura 98),

apesar de ser inibido expressivamente em compacação com a pele não

tratada.

Figura 98: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 tratadas por 5 dias com 2ME. Imunofluorescência para o marcador de melanoma MelanA (verde). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

Figura 99: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 tratadas por 5 dias com 2ME. Imunofluorescência para laminina (verde) e filagrina (vermelho). Aumento de 100x (superior) e 200x (inferior).

122

Da mesma forma que as peles mostradas anteriormente, peles contendo

melanoma que receberam tratamento com 2ME foram submetidas à

imunofluorescência com anticorpos contra laminina, para evidenciar a

membrana basal, e filagrina, para evidenciar as camadas mais diferenciadas

do epitélio. Nota-se na figura 99 que a membrana basal, definida pela laminina

em verde, limita a maior quantidade de células à epiderme, sendo que há

poucos focos de invasão que atravessam esta barreira, adentrando a derme. A

filagrina, que está presente nas camadas mais diferenciadas do epitélio,

aparece em camadas muito próximas à membrana basal, marcando todas as

células das camadas suprabasais do epitélio, mostrando desorganização do

mesmo quando as células de melanoma estão presentes, mesmo após o

tratamento com o 2ME.

Quando se comparam as peles reconstituídas na presença de

melanoma que foram tratadas com 2ME com aquelas que não foram tratadas,

fica evidente que este composto inibe as células tumorais. Esta inibição pode

se dever à menor proliferação celular, bem como à inibição da capacidade

invasiva destas células, que formam menor quantidade de focos de invasão na

derme, como é observado na figura 101, que mostra lado a lado as peles com

melanoma tratadas e as não tratadas com o 2ME.

Figura 100: Peles reconstituídas com células da linhagem Sk-Mel-28 tratadas por 5 dias com 2ME. Controles negativos de imunofluorescência. Aumento de 200x.

Mais uma vez, os controles negativos mostram uma marcação branda

para a fluorescência verde, limitada à epiderme, indicando que estes

experimentos possuem pouca marcação inespecífica (Figura 100).

123

Figura 101: Peles reconstituídas contendo células de melanoma Sk-Mel-28 na ausência de tratamento (coluna à esquerda) ou tratadas com 2ME por 5 dias (coluna à direita). Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE) (linha superior), imunofluorescência para o marcador de melanoma MelanA em verde (linha central) e, contra laminina (verde) e filagrina (vermelho) (linha inferior). Núcleos celulares são evidenciados em azul por marcação com DAPI. Notar a diferença de celularidade na derme entre as peles tratadas e não tratadas, evidenciando a menor invasão e proliferação das células tumorais

124

DISCUSSÃO

Este trabalho descreve efeitos de dois compostos: o Resveratrol e o 2-

metoxiestradiol, em linhagens tumorais de melanoma humano. O Resveratrol

mostrou um certo efeito na morte celular, como observado por ensaios de azul

de tripan e indução do processo autofágico, porém a investigação de seus

efeitos foi descontinuada por serem necessárias doses altas para observar

efeitos celulares. Assim, o trabalho foi focado nos efeitos do 2-metoxiestradiol,

que já em doses baixas, mostrou alterações expressivas no comportamento

das células aqui utilizadas.

Os efeitos principais do 2ME foram relativos principalmente à

citotoxicidade e à proliferação celular. Foi importante para o trabalho mostrar

que estes efeitos ocorreram em diferentes linhagens celulares,

independentemente das alterações genéticas como mutação em BRAF, NRAS

ou presença de p53, presentes nas células utilizadas, indicando que o

composto é eficiente em melanoma mesmo considerando a sua

heterogeneidade genética. Pela primeira vez também foi mostrado que este

composto tem efeito citotóxico e anti-mitótico em linhagens celulares com a

mutação BRAF V600E que são resistentes ao Vemurafenibe, ou duplo

resistentes a Vemurafenibe + Trametinibe, indicando que o efeito deste

composto ocorre de forma independente à resistência previamente adquiridas.

Por outro lado, é necessário verificar se o mecanismo pelo qual a inibição de

proliferação ocorre nestas células resistentes é similar ao que foi observado

nas linhagens parentais

Trabalhos anteriores mostraram que o 2ME tem efeito anti-proliferativo

em melanoma, porém vias moleculares não foram elucidadas. Dobos e

colaboradores, em 2004, mostraram inibição de proliferação e indução de

apoptose causados por 2ME em algumas linhagens celulares de melanoma

(Dobos et al. 2004). Neste trabalho também mostraram que a polimerização da

tubulina também é afetada pela presença deste composto, mas apesar de

haver efeito anti-mitogénico, os mecanismos e padrões de regulação de

proteínas envolvidas no ciclo celular nunca foram mostrados anteriormente.

Diferentes revisões sobre compostos que agem sobre microtúbulos

(microtubules targeting agents – MTA) citam o 2ME como um um agente anti-

125

câncer que atua pela interferência na polimerização da tubulina, por interagir

com a subunidade da β-tubulina em sítio idêntico ao sítio de ação da colchicina

(Mabjeesh et al. 2003, Jordan and Wilson 2004, Chua et al. 2010). De acordo

com estes artigos, os MTAs constituem um grupo muito diverso de substâncias

anti câncer, que foram usados com grande sucesso para o tratamento de

múltiplos tipos tumorais (Jordan and Wilson 2004).

Embora tenha ação em células normais, existe a justificativa de que as

células tumorais possuem alta taxa mitótica e proliferação muito mais alta que

as células normais, e esta proliferação é descontrolada, portanto drogas dessa

classe de substâncias que possuem efeito na inibição da formação de fibras do

fuso durante a mitose, bem como na dinâmica de polimerização da tubulina,

continuam sendo um grupo importante de quimioterápicos que devem

continuar sendo estudados mais profundamente (Jordan and Wilson 2004,

Mukhtar et al. 2014), apesar de possuírem, muitas vezes, alvos inespecíficos.

Neste trabalho, além do efeito do 2ME na polimerização da tubulina

(Figuras 52 a 63), são mostrados outros efeitos que culminam na inibição de

proliferação, como pode ser concluído pela contagem total de células (Figuras

20 e 21), pelas curvas de crescimento (Figura 35), e por ensaio colorimétrico

de Alamar Blue (Figuras 48 a 50).

A indução de senescência foi observada em todas as linhagens

celulares de melanoma utilizadas, mostrando fenótipo mais expressivo nas

linhagens Sk-Mel-103 e Sk-Mel-147, onde a coloração azul da β-galactosidase

associada à senescência mostrou-se mais intensa (Figura 58). Além disso,

ensaios preliminares mostram que este fenótipo não é reversível mesmo após

a retirada do 2ME das culturas celulares (Figura 61).

Além dos efeitos na indução senescência celular, esta inibição da

proliferação resulta em um aumento da população de células na fase G2/M do

ciclo celular (Figuras 51 a 54). Acompanhando a parada no ciclo celular

observou-se modulação de proteínas que regulam esta fase do ciclo,

mostrando pela primeira vez um possível mecanismo pelo qual o evento

ocorre. Encontrou-se aumento da proteína p21Cip1, que atua como inibidora de

complexos ciclina-Cdk; inibição de pRb (phospo-S807S/S811), que encontra-se

fosforilada em células proliferativas, porém, desfosforilada em células

carenciadas que entram em G0; e inibição da Ciclina B1, que faz parte do

126

complexo ciclina-Cdk responsável pela regulação do ponto de checagem G2/M

do ciclo celular (Figuras 55 e 56).

É importante ressaltar que a longo prazo, a exposição das células

tumorais, mas não fibroblastos, ao 2ME, e a indução destes efeitos anti-

proliferativos discutidos acima, resulta em uma dramática inibição da formação

de colônias mesmo em concentrações baixas deste composto (Figuras 29 a

31). Pela primeira vez este drástico efeito foi observado em linhagens de

melanoma com resistência previamente adquirida a outros compostos (Figura

32), mostrando que além da seletividade para células tumorais, o 2ME

apresenta importante ação também em células quimiorresistentes. No entanto,

o mecanismo molecular de ação do 2ME nas linhagens resistentes precisa ser

confirmado para verificar se ocorre da mesma forma que nas linhagens não

resistentes.

O mecanismo específico de inibição de proliferação com regulação de

proteínas do ciclo celular pode variar conforme o modelo celular utilizado. Em

glioblastomas, por exemplo, foi observado que o 2ME inibe o crescimento

tumoral e a proliferação celular pela inibição do fator HIF1α, e o composto só é

capaz de inibir proliferação celular in vitro e o crescimento tumoral in vivo em

células de glioblastoma que expressam PTEN (Muh et al. 2014). No modelo de

melanoma, o 2ME foi efetivo na inibição de proliferação independentemente do

status de PTEN, já que o mesmo foi testado em células que possuem (Sk-Mel-

28) ou não (Sk-Mel-103) sua expressão.

Outros autores já haviam descrito o efeito do 2ME na indução de

apoptose no modelo de melanoma (Ghosh et al. 2003, Dobos et al. 2004),

como evidenciado aqui pela análise por citometria de fluxo (Figuras 51 a 53), e,

de forma não mostrada anteriormente por western blotting, o mecanismo de

indução desta via de morte celular programada, que mostra clivagem de

caspases e de PARP (Figuras 42 a 45).

Os modelos tridimensionais mostraram resultados que vão de acordo

com os obtidos em monocamada. Os ensaios realizados no modelo de

esferóides mostraram um certo aumento na morte celular mostrada pela

fluorescência vermelha, e uma expressiva inibição da invasão das células na

matriz colagênica, principalmente nas linhagens Sk-Mel-147 e Sk-Mel-173

(Figuras 74 a 84). Mais uma vez, este efeito de maior indução de morte e de

127

inibição da invasão de células dos esferóides pela matriz extracelular foi

observado em linhagens tumorais resistentes de forma similar à observada nas

linhagens parentais, ressaltando o importante efeito anti-tumoral do 2ME. O

tamanho menor dos esferóides após o tratamento com o 2ME pode também

ser explicado pelo efeito antimitogênico deste composto, que mostrou inibição

expressiva da proliferação nos experimentos em monocamada.

Por fim, as peles reconstituídas mostraram que o 2ME possui um efeito

notável na inibição dos tumores também no modelo organotípico. Fica claro

(Figura 101) que as peles tratadas com este composto possuem menor

celularidade referente a focos de invasão tumoral na derme quando

comparadas às peles não tratadas. É possível verificar, pela marcação para

MelanA, a presença de células de melanoma na derme, e observa-se também,

pela marcação contra laminina, que estas células atravessaram a membrana

basal. Com o tratamento, estas ilhas de células de melanoma são menores,

apesar de ainda presentes. Este efeito pode ser devido a inibição de

proliferação e indução de morte celular observados em monocamada, bem

como aos efeitos de inibição de invasão observado no modelo de esferóides, e

mostram eficiência deste composto em um modelo que leva em consideração o

microambiente tumoral em uma estrutura tridimensional próxima à observada

no tecido humano.

Resumidamente (Figura 102), como amplamente demonstrado na

literatura e demonstrado neste trabalho, o 2-metoxiestradiol age nas células de

melanoma estabilizando a polimerização da tubulina. É descrito que a dinâmica

de polimerização da tubulina é importante para a motilidade celular por regular

a polimerização de actina e transporte de vesículas, bem como para a

polarização da célula e direção do movimento (Ganguly et al. 2012). Desta

forma, na célula que não está em divisão celular, o 2ME, pela capacidade de

estabilizar os microtúbulos, inibe a invasão celular como observado nos

ensaios de esferóides e pele reconstituída. Por outro lado, durante a divisão

celular, a estabilização dos microtúbulos pode levar a uma desregulação da

divisão dos cromossomos por influenciar na dinâmica de polimerização das

fibras do fuso. Esta divisão aberrante pode culminar catástrofe mitótica

(Castedo et al. 2004, Vitale et al. 2011), que é, segundo revisado por Vitale e

colaboradores em uma tentativa unificadora de definição deste fenômeno, “um

128

mecanismo oncossupressor que evita a instabilidade genômica” (Vitale et al.

2011). A indução de catástrofe mitótica pode culminar na indução de diversos

mecanismos, nos quais pode ocorrer paralelamente indução de fenótipos de

morte celular por necrose, apoptose e até mesmo indução de senescência

(Castedo et al. 2004, Portugal et al. 2010, Vitale et al. 2011).

Além dos efeitos na morte celular, o efeito causado pelo 2ME nos

microtúbulos leva à uma expressiva inibição na proliferação, que é observada

por um aumento de células na fase G2/M do ciclo celular, como constatado por

citometria de fluxo, bem como uma notável indução de fenótipo senescente nas

células tratadas com este composto. Por fim, as células tratadas podem dividir-

se mesmo com a maior estabilidade dos microtúbulos, o que pode levar à uma

divisão anormal com distribuição assimétrica dos cromossomos, levando à

poliploidia. Eventualmente, em divisões subsequentes, a divisão desta célula

poliplóide pode levá-la à morte ou à parada no ciclo celular, impedindo divisões

subsequentes.

129

Figura 102: Esquema do efeito do 2ME em células de melanoma humano, mostrando seu efeito na polimerização de tubulina (linhas vermelhas dentro das células), inibição de proliferação (principalmente por indução de senescência), inibição de invasão, e indução de morte celular.

É importante notar que o fenótipo senescente e a parada de ciclo celular

pode ser um efeito induzido por agentes que atacam o microtúbulo (Vitale et al.

2011), e a indução de senescência é muitas vezes acompanhada da parada na

fase G2/M do ciclo celular por falhas no ponto de checagem de G2 e no ponto

de checagem da mitose (ligação dos cromossomos no fuso mitótico) (Vitale et

al. 2011, Childs et al. 2014). De fato, diversos artigos recentes mostram que

130

diferentes compostos, bem como expressão de vias de sinalização podem

induzir parada do ciclo celular na fase G2/M seguido de senescência (Yun et al.

2009, Wang et al. 2013, Polewska et al. 2013, Krenning et al. 2014). Um

exemplo de tratamento é com o agente que causa dano no DNA,

Imidazoacrinidinona C-1311, que foi capaz de inibir proliferação de células

humanas de câncer de pulmão na fase G2 do ciclo celular seguida de

senescência com indução de p21 (Polewska et al. 2013). O silenciamento da

expressão de ROC1 (Regulator of Cullins-1) também levou a inibição da

proliferação de células de câncer de bexiga, e inibição do crescimento tumoral

in vivo com parada na fase G2 do ciclo celular, indução de senescência e

indução de p21 (Wang et al. 2013). Da mesma forma, a superexpressão de

p31comet foi capaz de inibir a proliferação de células de câncer de pulmão por

indução senescência dependente do acúmulo de p21, indução de p53 e

inibição de Ciclina B1 (Yun et al. 2009). Um elegante trabalho recente realizado

com células imortalizadas mas não transformadas de epitélio pigmentado de

retina mostrou que a ativação transiente de p53 na fase G2 do ciclo celular foi

suficiente para levar a parada permanente do ciclo celular nesta fase e induzir

senescência (Krenning et al. 2014). Neste trabalho a irradiação com raios γ em

células na fase G2 do ciclo celular levou a um aumento de p53, acúmulo de

p21 e degradação de Ciclina B1, e esta sequência de eventos levou a parada

do ciclo celular na fase G2 e indução de senescência (Krenning et al. 2014).

Todos estes trabalhos mostram efeitos similares aos observados no

melanoma após o tratamento com o 2ME: inibição de proliferação, parada do

ciclo celular na fase G2/M, indução de senescência, acúmulo de p21 e inibição

de Ciclina B1. Estas observações mostram que o efeito aqui observado está

de acordo com o descrito na literatura, e que parte do mecanismo de ação do

2ME nos melanomas foi elucidado.

Por outro lado, o 2ME, quando administrado in vivo, possui

disponibilidade biológica muito limitada e rápido metabolismo pelo fígado

(Foster et al. 2008, Visagie et al. 2013). Por este motivo, recentemente,

diversos compostos promissores análogos ao 2-metoxiestradiol foram

desenvolvidos e têm sido testados para verificar suas atividades anti-tumorais

(Chua et al. 2010, Theron et al. 2013, Visagie et al. 2013, Kambhampati et al.

131

2013, Visagie et al. 2014). Esses análogos mostraram maior biodisponibilidade

e não são catabolizados pelo fígado assim que passam por ele (Stander et al.

2010), entretanto, a análise da atividade estrutural destes compostos mostrou

que estes análogos possuem o mesmo mecanismo de ação do 2ME, agindo

nos microtúbulos, inibindo a proliferação e induzindo apoptose (Stander et al.

2010).

Concluindo, neste trabalho foi mostrado pela primeira vez a forma pela

qual o 2ME age na modulação de proteínas do ciclo celular induzindo a parada

neste bem como a senescência celular, e que o seu mecanismo de ação vai de

acordo com o que já foi descrito na literatura. Ainda mais importante, foi

demonstrado que este mecanismo não se sobrepõe ao mecanismo de ação do

Vemurafenibe, já que as células resistentes aqui utilizadas mostraram efeitos

de inibição na formação de colônias e crescimento tridimensional similares às

células parentais quando foram expostas ao 2ME. Isto prova que este

composto é capaz de superar a resistência intrínseca dos melanomas bem

como a adquirida de forma secundária, causando morte celular e inibição de

proliferação nestas células. Apesar do seu uso não ter sido aprovado para

melanomas pela FDA dos Estados Unidos por causa de sua baixa

biodisponibilidade in vivo, é de suma importância compreender os mecanismos

de ação do 2ME para melhoria de tratamento, teste de possíveis tratamentos

combinatórios e desenvolvimento de novos análogos com maior eficiência. Em

conjunto, estas abordagens podem contribuir a respostas clínicas mais

eficientes que as disponíveis atualmente.

132

CONCLUSÃO

Os objetivos do trabalho foram atingidos com sucesso, mostrando o

efeito dos compostos na citotoxicidade de linhagens de melanoma humano.

Em função dos resultados obtidos com o composto Resveratrol (RES), foi

decidido focar os esforços do trabalho no composto 2-metoxiestradiol (2ME),

que mostrou efeitos citotóxicos e inibidores em concentrações mais baixas.

Desta forma, este trabalho mostrou que:

• O 2ME levou à inibição de proliferação em células de melanoma

humano com diferentes mutações, e esta inibição se mostrou seletiva

para melanomas.

• O 2ME foi capaz de induzir morte celular por apoptose em uma fração

das células, como observado por clivagem de caspases e marcação

com anexina V.

• A indução de autofagia foi verificada, porém este processo não se

mostrou de extrema importância na citotoxicidade das células.

• Foi observada pela primeira vez que a inibição do crescimento de

melanomas causada pelo 2ME acontece também em linhagens BRAF

V600E resistentes ao Vemurafenibe e duplo resistentes ao

Vemurafenibe + Trametinibe.

• A inibição de proliferação está associada à parada das células na fase

G2/M do ciclo celular e modulação de proteínas reguladoras como

p21cip1, Ciclina B1 e pRB.

• A indução do fenótipo de senescência também se mostrou muito

expressivo após o tratamento com o 2ME, sendo um relevante

mecanismo de inibição de proliferação.

• Ensaios com esferóides mostraram que o 2ME tem efeito similar em

culturas tridimensionais, mostrando inibição de invasão e de viabilidade

em células tratadas. Este efeito foi observado independentemente de

quimiorresistência.

133

• O modelo de pele reconstituída mostrou que na ausência do tratamento

focos de invasão de melanoma são observados na derme. Estes focos

de invasão estão diminuídos quando a pele é tratada com 2ME.

134

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