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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

VETERINÁRIAS - PPGCV

GEORGE CÂNDIDO NOGUEIRA

AVALIAÇÃO DO FARNESOL SOBRE O CRESCIMENTO E

FATORES DE VIRULÊNCIA EM CEPAS DO COMPLEXO

CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS IN VITRO

Fortaleza – CE

2011

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AVALIAÇÃO DO FARNESOL SOBRE O CRESCIMENTO E FATORES

DE VIRULÊNCIA EM CEPAS DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS

NEOFORMANS IN VITRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade

de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,

como requisito parcial para obtenção do Grau de

Mestre em Ciências Veterinárias.

Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha

Fortaleza – CE

2011

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N778a Nogueira, George Cândido Avaliação do farnesol sobre o crescimento e fatores de

virulência em cepas do complexo cryptococcus neoforman in vitro / George Cândido Nogueira. – 2011.

74 f.: il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará,

Faculdade de Ciências Veterinárias, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2011.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha. Co-orientação: Profª. Drª. Rossana de Aguiar Cordeiro. 1. Farnesol. 2. Complexo Cryptococcus neoforman in vitro 3.

Inibição do crescimento. I. Título.

CDD: 636.089

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AVALIAÇÃO DO FARNESOL SOBRE O CRESCIMENTO E

FATORES DE VIRULÊNCIA EM CEPAS DO COMPLEXO

CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS IN VITRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade

de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,

como requisito parcial para obtenção do Grau de

Mestre em Ciências Veterinárias.

Aprovada em:__/__/__

___________________________________________

Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha

Universidade Estadual do Ceará

Orientador

_____________________________________________

Profa Dr

a. Rossana de Aguiar Cordeiro

Universidade Federal do Ceará

Co-orientadora

Examinadora

_____________________________________________

Dra Ana Karoline Freire da Costa

Universidade de Fortaleza

Examinadora

5

Dedico este trabalho a minha mãe

que tem sido meu alicerce a cada dia

da minha vida.

6

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária,

da Universidade Estadual do Ceará.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo

apoio financeiro.

Ao Centro Especializado Em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do

Ceará.

A Deus pela vontade a cada dia em seguir em frente.

A minha mãe, a quem devo muito pela minha vida, minha admiração, carinho e respeito

pelo exemplo e infinito esforço para que eu pudesse sempre ir em frente, com

dignidade.

Ao meu sobrinho, Samuel Cândido Amorim por me proporcionar momentos de alegria

e serenidade quando estou ao seu lado.

Ao meu avô materno, Sr. Francisco Cândido, ―in memorian‖ guardo grande carinho

pelo exemplo de respeito e humildade.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pelo aprendizado durante

esses dois anos da minha vida, demonstrando sempre ser uma pessoa paciente e

preocupada com a minha formação como pesquisador.

A minha co-orientadora, Profa Dr

a. Rossana de Aguiar Cordeiro, pelo exemplo de

inteligência, que repassa nos seus conhecimentos e dedicação a qual conduz a pesquisa.

Ao Prof. Dr. José Júlio da Costa Sidrim pela oportunidade, desde o estágio

supervisionado até o mestrado, de poder realizar os meus experimentos e obter

aprendizado no Centro Especializado Em Micologia Médica (CEMM/UFC).

A Profa Dr

a. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante pela oportunidade de ser minha

supervisora na graduação e perseverança na pesquisa.

Ao Prof. Dr. André Jalles Monteiro, pelo apoio estatístico.

Aos professores, Dr. Cláudio Cabral Campello, Dra. Adriana de Queiroz Pinheiro e Dr.

Isaac Neto Góes, com os quais tive a oportunidade de aprender lições que sempre

guardarei por toda minha vida como exemplos de humildade, ética, respeito,

perseverança e dedicação pela carreira acadêmica.

Aos pós-graduandos do PPGCV e colegas, Eudson Maia de Queiroz Junior, Roberta

Nogueira Chaves, Raphael Fernando Braga Gonçalves e Agostinho Soares de Alcântara

Neto pelos momentos de amizade, companheirismo e de descontração.

7

Aos pós-graduandos do CEMM/UFC, em especial Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira,

Charles Ielpo Mourão, Débora Castelo Branco Maia, Lucas Pereira de Alencar, Paula

Bittencourt Vago, Kylvia Rocha de Castro e Silva, Manoel Paiva de Araújo Neto,

Francisca Jakelyne de Farias Marques, Joyce Fonteles Ribeiro, Lívia Gurgel do Amaral

Valente e Rita Amanda Chaves de Lima, pelos bons momentos de aprendizado e

diversão durante a realização do mestrado.

A todos os funcionários do CEMM/ UFC, em especial Terezinha de Jesus dos Santos

Rodrigues e Daniel Teixeira Lima.

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"Nunca perca a fé na humanidade, pois ela é como um oceano. Só porque existem

algumas gotas de água suja nele, não quer dizer que ele esteja sujo por completo."

Mahatma Ghandi

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RESUMO

A resistência antifúngica, in vitro, em organismos do Complexo Cryptococcus

neoformans, apesar de rara, tem sido observada tanto em cepas clínicas como

ambientais, especialmente frente ao itraconazol e fluconazol. Diante do exposto e

considerado que o sesquiterpeno farnesol é capaz de inibir o crescimento de

microrganismos, incluindo alguns fungos, é importante investigar o efeito deste

composto sobre Cryptococcus spp. Por conseguinte, o presente trabalho teve como

objetivo investigar o efeito inibitório in vitro do farnesol em cepas do Complexo C.

neoformans, por meio da análise da concentração inibitória mínima (CIM) em ensaio de

microdiluição. Adicionalmente, foi investigado o efeito do farnesol (CIM/4, CIM/2 e

CIM) sobre a síntese de fosfolipases e proteases – exoenzimas diretamente relacionadas

à patogênese fúngica. Observou-se que o farnesol foi capaz de inibir o crescimento in

vitro de C. neoformans e C. gattii em concentrações que variaram de 0,29 a 75 µM. Foi

observada uma diminuição na produção de fosfolipases em 36,1% (13/36), 38,9%

(14/36) e 41,7% (15/36) das cepas expostas ao farnesol nas concentrações CIM, CIM/2

e CIM/4, respectivamente. Não houve diferença significativa na síntese de proteases

entre os grupos expostos ao farnesol e o controle negativo. Diante desses resultados,

conclui-se que o farnesol é capaz de inibir o crescimento in vitro de C. neoformans e C.

gattii, embora, não influencie significativamente a produção dos fatores de virulência

estudados.

Palavras-chave: Farnesol, Complexo Cryptococcus neoformans, inibição do

crescimento, fosfolipases e proteases.

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ABSTRACT

In vitro resistance among organisms of the Cryptococcus neoformans Species

Complex, although rare, has been observed in clinical and environmental strains,

especially to itraconazole and fluconazole. Based on that and considering that the

sesquiterpene farnesol is capable of inhibiting microbial growth, including some fungi,

it is important o investigate the effect of this compound on Cryptococcus spp. Thus, the

present study aimed at determining the in vitro minimum inhibitory concentration

(MIC) of farnesol against strains of the Cryptococcus neoformans Species Complex

(CNSC), as well as its effect on the synthesis of phospholipase and protease. For such,

36 strains of the CNSC were used, out of which 20 were from veterinary sources, 8

were isolated from human cases and 8 were reference strains. MICs were determined

through broth microdilution, by testing farnesol at 0.29 to 150 µM. Phospholipase and

protease activities were evaluated through growth on egg yolk agar spectrophotometry

at 440 nm, respectively, after pre-incubating the strains at different farnesol

concentrations (MIC/4, MIC/2 and MIC). Farnesol MICs ranged from 0.29 to 75 µM.

Concerning phospholipase secretion, a discrete decrease was observed for 36.1%

(13/36), 38.9% (14/36) and 41.7% (15/36) of the strains exposed to farnesol at the the

concentrations MIC, MIC/2 and MIC/4, respectively. For protease activity, no

statistically significant differences were observed, when comparing the production

before and after pre-incubation at different farnesol concentrations. Based on these

findings, it can be concluded that farnesol inhibits the in vitro growth of C. neoformans

and C. gattii, without significantly altering the synthesis of virulence factors.

Keywords: Farnesol, Cryptococcus neoformans, growth, phospholipases, proteases.

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LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Avaliação da atividade de fosfolipases em cepas do Complexo

Cryptococcus neformans em ágar gema de ovo, (a) representa a

região da placa onde a colônia de Cryptococcus sp. se apresenta

positiva para a produção desta enzima..............................................20

Figura 2 Colônias de Cryptococcus sp. produtoras de melanina, observadas

em meio ágar semente de Níger........................................................22

Figura 3 Produção de cápsula em cepas do Complexo C. neoformans,

visualizada por microscopia óptica em 100x ...................................23

Figura 4 Identificação de Cryptococcus sp. através do meio CGB(a) e do meio

caldo uréia(b) ...................................................................................24

Figura 5 Técnica de microdiluição em caldo para Cryptococcus sp. em placa

de 96 poços ......................................................................................26

Figura 6 Fórmula estrutural do composto farnesol.........................................27

Figura 7 Efeitos biológicos do farnesol: resistência antimicrobiana; formação

de biofilmes imaturos; indutor de apoptose; bloqueio do processo de

quorum sensing; supressão da atividade fagocitária das formas

filamentosas de C. albicans...............................................................29

Table 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of farnesol against strains

of the Cryptococcus neoformans Species

Complex............................................................................................51

Table 2 Phospholipase secretion before and after exposure to farnesol…....52

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AMB Anfotericina B

ATCC American Type Culture Collection

CEMM Centro Especializado Em Micologia Médica

CGB L-Canavanina Glicina Azul de Bromotimol

CIM Concentração Inibitória Mínima

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

DMSO Dimetilsulfóxido

FLC Fluconazol

FNS Farnesol

RPMI Roswell Park Memorial Institute

PCR Polymerase Chain Reaction

PCR-REA Restriction Enzyme Analysis of PCR

Pz Atividade de fosfolipase

QS Quorum sensing

SNC Sistema Nervoso Central

UE Unidade Enzimática

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 13

2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 14

2.1 Complexo Cryptococcus neoformans ......................................................... 14

2.1.1 Histórico ................................................................................................... 14

2.1.2 Espécies e variedades ............................................................................... 14

2.1.3 Aspectos Ecológicos ................................................................................ 15

2.1.4 Fatores de Virulência ............................................................................... 16

2.1.5 Identificação Laboratorial........................................................................ 21

2.1.6 Sensibilidade antifúngica do Complexo C. neoformans..........................

2.2 A molécula de Farnesol............................................................................

25

27

3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 30

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS ......................................................................... 31

5. OBJETIVOS .................................................................................................... 32

5.1 Objetivos Gerais ……………………………………………………..………. 32

5.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 32

6. CAPÍTULO I ................................................................................................... 33

7. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 53

8. PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 54

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 55

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1. INTRODUÇÃO

O Complexo Cryptococcus neoformans é formado por duas espécies distintas,

Cryptococcu neoformans e Cryptococcu gattii, as quais podem ser subclassificados em

duas variedades, cinco sorotipos e pelo menos oito tipos moleculares. Embora

compartilhem muitas características fenotípicas e moleculares, esses fungos se

diferenciam quanto aos aspectos ecológicos e epidemiológicos, bem como na relação

com os hospedeiros. Apesar dessas diferenças, essas espécies são os principais agentes

etiológicos da criptococose em humanos e animais.

Atualmente, o arsenal antifúngico disponível para o tratamento da criptococose é

limitado a poucas classes de drogas, dentre estas, anfotericina B e derivados azólicos.

Apesar do desenvolvimento de novos derivados azólicos, especialistas acreditam que o

número de drogas antifúngicas ainda seja bastante reduzido, o que tem impulsionado a

busca por novos compostos com atividade antifúngica (WILLIS et al., 2007).

Além disso, as espécies do gênero Cryptococcus produzem diversas moléculas

que atuam como fatores de virulência, que participam nos mecanismos de resistência

antifúngica e no sucesso da patogênese do fungo, permitindo a invasão aos tecidos do

hospedeiro (COSTA-DE-OLIVEIRA et al., 2008; CAMPOS e BARONI, 2010).

Adicionalmente, acredita-se que a exposição de Cryptococcus spp. aos antifúngicos

possibilita uma modificação estrutural dos fatores de virulência tornando a cepa mais

patogênica (DOYON, 1996; MARTINEZ-PICADO, 1999; RODRIGUES et al., 2008).

Recentemente, foi observado que a levedura Candida albicans produz uma

molécula chamada farnesol, a qual é importante para o fenômeno de quorum sensing,

sendo, portanto, essencial para a regulação das interações microbianas. Alguns estudos

têm confirmado o efeito inibitório de farnesol sobre o crescimento de várias espécies

microbianas (KOO et al., 2002; JABRA-RIZK et al., 2006; SEMIGHINI; MURRAY;

HARRIS, 2008; DERENGOWSKI et al., 2009). Recentemente, foi mostrado que o

farnesol atua como potente agente antifúngico frente ao patógeno dimórfico

Paracoccidioides brasiliensis (DERENGOWSKI et al., 2009).

O presente trabalho investigou o efeito do farnesol sobre o crescimento e

atividade de fosfolipases e proteases em espécies do Complexo Cryptococcus

neoforman, in vitro.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Complexo Cryptococcus neoformans

2.1.1 Histórico

O primeiro isolamento de Cryptococcus neoformans data de 1894, em uma

paciente que apresentava uma lesão na tíbia, sendo identificado primariamente como

Saccharomyces hominis. Na mesma época, Sanfelice isolou esse organismo em suco de

pêssego, demonstrando sua patogenicidade em animais de laboratório e denominando-o

de S. neoformans (CASADEVALL e PERFECT, 1998). Um ano mais tarde, Sanfelice

isolou o microrganismo de tecido linfóide bovino. A partir de então, casos de

criptococose em animais foram registrados de forma esporádica e somente na década de

1950 foram descritos os primeiros casos em cães e gatos (JUNGERMAN e

SCHWARTZMAN, 1972). Em 1970, uma cepa atípica de C. neoformans foi isolada de

um paciente com leucemia, tendo sido denominada C. neoformans var. gattii

(VANBREUSEGHEM e TAKASHIO, 1970).

Durante a década de 1970 foi possível determinar dois tipos sexuais de C.

neoformans, mating α e mating a, que são capazes de produzir hifas verdadeiras e

basidiósporos férteis, com ocorrência rara em humanos e animais. Por outro lado, a

forma assexuada de blastoconídios é comum em isolados oriundos do ambiente e de

amostras clínicas (KWON-CHUNG e POPKIN, 1976; LIN, 2009). Entre os anos 1940 e

1950, por meio de estudos de caracterização dos antígenos capsulares, a espécie C.

neoformans foi dividido em cinco sorotipos: A, B, C, D e AD (D´SOUZA et al., 2004).

Embora os primeiros estudos de caracterização molecular de C. neoformans

tenham ocorrido na década de 1990, somente em 2005 foi iniciado o seqüenciamento do

genoma do organismo. Desde então, esses estudos têm permitido maior conhecimento

de aspectos importantes relacionados à biologia do microrganismo (HUGHES et al.,

2008; SIDRIM et al., 2010).

2.1.2 Espécies e Variedades

Os fungos do Complexo Cryptococcus neoformans são importantes

microrganismos patogênicos cosmopolitas e os principais agentes causadores da

criptococose, que se caracteriza principalmente por quadros de meningoencefalite em

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hospedeiros imunodeprimidos, cujo maior contingente é representado por indivíduos

com AIDS (RACHID e SCHECHTER, 2008).

Tais organismos são basidiomicetos pertencentes ao clado Filobasidiella, e

taxonomicamente mantidos na Classe Tremellomycetes, ordem Tremellales, família

Tremellaceae. As células mostram-se com formato esférico a ovóide, com diâmetro

entre 2-8 µm, podendo apresentar cápsula espessa durante processo infeccioso ou ainda

condições especiais de cultivo (DE HOOG et al., 2000).

Até o final da década de 1980, a espécie C. neoformans era reconhecida como o

único agente etiológico da criptococose. A espécie era subdividida em duas variedades

distintas, C. neoformans var. neoformans (sorotipos A e D) e C. neoformans var. gattii

(sorotipos B e C), as quais se diferenciavam quanto a padrões bioquímicos, moleculares

e ecológicos (MELO et al., 1993). Em 1999, Franzot et al. propuseram alterações a esse

conceito, descrevendo as cepas de sorotipo A como C. neoformans var. grubii e

restringindo todos os isolados de sorotipo D a variedade neoformans. Em seguida,

estudos filogenéticos e moleculares propuseram a ascensão da variedade gattii ao status

de espécie, sendo então denominada C. gattii (KWON-CHUNG et al., 2002).

Posteriormente, estudos baseados em marcadores moleculares mostraram que C.

neoformans var. neoformans e C. neoformans var. grubii são espécies distintas, sendo

esta última formada por subpopulações, agrupadas como tipos moleculares VNI, VNII e

VNB (LITVINTSEVA et al., 2005; LITVINTSEVA et al., 2006; BOVERS et al.,

2008). Atualmente, admite-se que C. gattii também possa ser subdividido em pelo

menos em quatro espécies crípticas distintas, referidas como tipos moleculares VGI,

VGII, VGIII, e VGIV (BOVERS et al., 2008). Adicionalmente, diversos estudos têm

comprovado a existência de organismos híbridos, principalmente C. neoformans

sorotipo A/D, com padrão molecular tipo VNIII, mas já foram descritos sorotipos AB e

BD e o tipo molecular VNI/VGII (BOVERS et al., 2008; MEYER et al., 2003; XU et

al., 2002).

2.1.3 Aspectos Ecológicos

Os organismos do Complexo C. neoformans têm sido isolados de uma ampla

variedade de hospedeiros, incluindo mamíferos, insetos, aves e seus excrementos, além

de fontes ambientais, como amebas, solo, árvores e ar. A interação entre hospedeiro,

reservatório e os fungos do Complexo C. neoformans possibilita a seleção destes

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microrganismos, no que se refere a uma melhor adaptação ao meio onde vivem

(CASADEVALL e PERFECT, 1998).

Nas aves, devido à sua elevada temperatura corpórea (40-42ºC), esses fungos

geralmente não ocasionam doença. Dados da literatura mostram que, embora C.

neoformans já tenha sido isolado no papo de aves, o microrganismo não foi encontrado

no trato intestinal inferior, sugerindo o papel desses animais como portadores

transitórios do patógeno (KWON-CHUNG, 1998). Solos contaminados com excretas

desidratadas de aves mantêm propágulos de C. neoformans, uma vez que esses

microrganismos são capazes de se manter viáveis em diferentes substratos,

principalmente aqueles com alto teor de nitrogênio, como creatinina, uréia e xantina.

Assim, relata-se uma estreita relação entre esses fungos e o habitat de aves,

caracterizando microfocos importantes, que podem atuar como fontes de infecção

(NILSEN et al., 2007; KWON-CHUNG e BENNETT, 1992).

C. neoformans var. neoformans é considerada uma espécie cosmopolita, embora

ocorra com maior freqüência na Europa. O microrganismo costuma ser isolado de

diversos locais, principalmente, ambientes ricos em substratos orgânicos, tais como,

excretas de aves, morcegos e baratas, além de construções antigas, igrejas, porões e

sucos de frutas (CASADEVALL e PERFECT, 1998; LUGARINI, 2007). C.

neoformans var. grubii corresponde ao microrganismo do Complexo C. neoformans

mais comumente isolado em fontes clínicas e ambientais em todo o mundo, incluindo

regiões temperadas e tropicais. Em contraste, C. gattii é endêmico em regiões tropicais e

subtropicais, com isolamento associado a material vegetal em decomposição (LIN e

HEITMAN, 2006). A despeito das diferenças ecológicas, acredita-se que os organismos

do Complexo C. neoformans possam coexistir em um mesmo ambiente, muito embora

C. gattii apresente menor taxa de crescimento em guano de pombo (MITCHELL e

PERFECT, 1995; LIN, 2009).

2.1.4 Fatores de Virulência

Para que o fungo tenha sua patogênese bem sucedida é necessário que ocorra a

expressão de fatores de virulência, o que permite a invasão com êxito de tecidos e de

células, além de possibilitar a evasão aos mecanismos de defesa do hospedeiro em

resposta a infecções fúngicas. A expressão desses fatores é cepa-dependente, pois pode

variar tanto em freqüência como em intensidade, fenômeno este visto tanto em isolados

de C. neoformans como em C. gattii (MA e MAY, 2009).

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Fatores de virulência são componentes estruturais ou moléculas que contribuem

para o estabelecimento e/ou manutenção do processo infeccioso em um hospedeiro

suscetível (BUCHANAN e MURPHY, 1998). Alguns desses elementos possuem um

papel duplo, contribuindo também para o fitness do microrganismo na natureza

(RODRIGUES et al., 2008). Os principais fatores de virulência produzidos pelas

espécies do Complexo C. neoformans são: a termotolerância, a cápsula e a síntese de

várias enzimas, principalmente como a fenoloxidase (produção de melanina), a urease, a

fosfolipase e a protease (COX et al., 2000; ZARAGOZA e CASADEVALL, 2004;

BOVERS et al., 2008).

Um dos fatores de virulência principais é a capacidade de crescimento na

temperatura corpórea dos mamíferos (KRONSTAD et al., 2011). Contudo, algumas

cepas de C. neoformans sorotipo D e C. gattii são consideradas hipovirulentas por não

crescerem bem a 37 C ocorrendo inibição do crescimento e morte após exposição a

temperaturas elevadas (CASADEVALL et al., 2003).

A cápsula de C. neoformans e C. gattii é formada principalmente por

polissacarídeos, a glucuronoxilomana e a galactoxilomana, e, em menor quantidade, por

manoproteína. A estrutura representa um dos principais fatores de virulência dos fungos

do Complexo Cryptococcus neoformans (ZARAGOZA e CASADEVALL, 2004), uma

vez que exerce efeitos sobre a ativação do sistema de complemento do hospedeiro, inibe

o processo de fagocitose e proporciona a repulsão eletrostática entre o agente e as

células de defesa do hospedeiro (GARCIA-RODAS et al., 2011; ZARAGOZA e

CASADEVALL, 2004).

A fenoloxidase catalisa a síntese de melanina nas espécies do Complexo C.

neoformans e oferece proteção contra espécies reativas de oxigênio, luz ultravioleta,

temperaturas elevadas e antioxidantes, além de aumentar a resistência à fagocitose e aos

antifúngicos. Vale ressaltar que a síntese de melanina que ocorre in vivo se dá

principalmente na presença de catecolaminas (BOVERS et al., 2008) e que mutantes

que não sintetizam essa molécula apresentam menor virulência em modelos

experimentais (SALAS et al., 1996).

A urease é definida como uma metaloenzima que tem como função catalisar a

conversão da uréia em amônia e carbamato, sendo considerado um importante fator de

virulência, por contribuir para a invasão do sistema nervoso central (SNC), uma vez que

aumenta a permeabilidade dos capilares cerebrais (OLSZEWSKI et al., 2004; TORRES-

RODRIGUES et al., 2008).

19

As fosfolipases são um grupo heterogêneo de enzimas que hidrolisam uma ou

mais ligações éster nos glicerofosfolipídios e são consideradas importantes fatores de

virulência para várias espécies fúngicas. Apesar de todas essas enzimas possuírem os

fosfolipídios como substrato, cada uma pode clivar uma ligação éster específica.

Portanto, letras são utilizadas para diferenciar as fosfolipases, indicando a ligação alvo

específica na molécula de fosfolipídio (GHANNOUM, 2000).

Enzimas capazes de hidrolisar os fosfolipídios, como as fosfolipases e as

proteinases, estão provavelmente envolvidas nos processos de ruptura de membrana,

durante a invasão da célula hospedeira (GHANNOUM, 2000). Adicionalmente, as

fosfolipases A2 e C podem remover antígenos processados da superfície das células

apresentadoras de antígenos (IBRAHIM et al., 1995). As fosfolipases extracelulares já

foram implicadas como fatores de virulência de vários organismos, como Clostridium

perfringens, Rickettsia spp., Staphylococcus aureus, Toxoplasma gondii, dentre outros.

O tipo de fosfolipase implicada na virulência varia de acordo com o organismo. C.

perfringens, por exemplo, secreta fosfolipase C, enquanto que T. gondii secreta

fosfolipase A2 (IBRAHIM et al., 1995; GHANNOUM, 2000).

Este grupo de enzimas tem como função principal desestabilização da membrana

citoplasmática, ocasionando a lise da membrana celular do hospedeiro ou alterações na

superfície da mesma, contribuindo para que ocorra aderência e posterior penetração da

célula hospedeira (SAMARANAYAKE et al., 2005; SOARES et al., 2010). Em relação

a cepas de Candida, a elevada atividade de fosfolipase esta relacionada ao aumento da

capacidade de aderência às células epiteliais e a taxa de mortalidade, em modelos

biológicos (SAMARANAYAKE et al., 2005; COSTA et al., 2009).

A secreção destas enzimas pode ser detectada de várias formas, dentre as quais

pode ser citada a metodologia em que observou o crescimento de Candida albicans, em

meio sólido contendo gema de ovo ou lecitina. Em 1975, Pugh e Cawson, por meio de

técnicas de citoquímica, com base na utilização de lecitinas, verificaram a maior

atividade de fosfolipase na porção extrema da hifa em crescimento, garantindo uma

maior capacidade de invadir células e tecidos do hospedeiro (CAMPOS e BARONI,

2010; GHANNOUM, 2000).

Existe também um método de detecção da atividade em placa de Petri,

inicialmente utilizado para Candida sp., podendo ser também utilizado para

Cryptococcus spp. Este método consiste na semeadura das cepas em meio ágar

Sabouraud dextrose com suplementação de sais (CaCl2 e NaCl) e de gema de ovo, uma

20

fonte rica em fosfolipídios. Após a incubação a 35 ºC, a leitura é feita em dias

alternados até o 15º dia. Para os isolados positivos, observa-se a formação de uma zona

de precipitação densa, ao redor da colônia, provavelmente, devido à formação de

complexos de cálcio com os ácidos graxos, em decorrência da ação enzimática sobre os

fosfolipídios do meio (figura 1) (GHANNOUM, 2000).

A atividade de fosfolipase (Pz) é definida como a razão entre o diâmetro da

colônia e o diâmetro total, formado pela colônia e pela zona de precipitação. Quando Pz

é igual a um (Pz = 1), a produção de fosfolipase é ausente, quando o Pz é menor que um

(Pz <1), há produção de fosfolipase, e valores de Pz < 0,64 indicam uma elevada

atividade enzimática (SIDRIM et al., 2010; VIEIRA e ACQUA-COUTINHO,2009). No

entanto, esta técnica não é adequada para cepas que apresentam baixa produção dessa

enzima, sendo necessária a confirmação por outros métodos, como ensaios

colorimétricos e radiométricos específicos (GHANNOUM, 2000).

21

(Fonte: CEMM, 2011)

Figura 1. Avaliação da atividade de fosfolipases em cepas do Complexo Cryptococcus

neformans em ágar gema de ovo, (a) representa a região da placa onde a colônia de

Cryptococcus sp. se apresenta positiva para a produção desta enzima.

As proteases são enzimas importantes durante o processo infeccioso por

degradarem tecidos e proteínas, aumentando a disponibilidade de fontes de nitrogênio

para o metabolismo do fungo e, consequentemente, contribuindo para a invasão tecidual

e colonização. Essas enzimas podem degradar vários substratos, como queratina,

colágeno, albumina, fibronectina e hemoglobina (PICHOVÁ et al., 2001; RAMBACH

et al., 2010). Na levedura C. albicans, a secreção de proteases favorece a aderência dos

blastoconídios às células do hospedeiro e, conseqüentemente, uma melhor invasão dos

tecidos pelas hifas através da degradação proteolítica da queratina e do colágeno, com

isso, sendo observada uma correlação entre a secreção de protease e o grau de virulência

das cepas (SANTOS et al., 2006; SCHEID, 2007).

De acordo com o seu sistema catalítico, as proteases podem ser divididas em

serinas, cisteínas, aspárticas (SAPs) e metaloproteases (NAGLIK et al., 2004). Essas

enzimas são consideradas essenciais para o crescimento microbiano em meios de

cultura em que moléculas de proteínas são as únicas fontes de nitrogênio.

De forma geral, C. neoformans tem baixa atividade proteolítica, mas as

proteases são capazes de realizar a digestão de imunoglobulinas e de parte do sistema

complemento (CASADEVALL e PERFECT, 1998). As alterações estruturais nas

22

proteases fúngicas e processos mutagênicos podem responsáveis pela ocorrência de

resistência a terapia antifúngica, além de levar a alterações estruturais da enzima

(DOYON, 1996; MARTINEZ-PICADO, 1999). Este fato foi observado em estudos in

vitro com Cryptococcus spp. frente aos inibidores de protease (PINTI et al., 2007). A

detecção da atividade desta enzima, pode ser por cromatografia gasosa (BIEN et al.,

2009), além da técnica em que se utiliza meio de cultura contendo albumina sérica

bovina, a qual é utilizada como substrato enzimático, seguida da análise por

espectrofotometria (BRILHANTE et al.,2011; VIDOTTO, 2005).

Dados de pesquisa realizada pelo Centro Especializado em Micologia Médica

mostram que a exposição a concentrações sub-inibitórias de farnesol não alterou a

atividade proteásica em Candida spp. (TEIXEIRA, 2010). Estudos prévios realizados

por Enjalbert e Whiteway (2005) mostraram que a exposição de C. albicans ao farnesol

induziu a superexpressão de genes relacionados a diferentes processos celulares, dentre

eles, o catabolismo protéico. Contudo, alterações do teor protéico, por meio da redução

da atividade proteásica, não foram detectadas (TEIXEIRA, 2010).

2.1.5 Identificação Laboratorial

A identificação do agente consiste em técnicas laboratoriais que se baseiam em

duas vertentes: os aspectos fenotípicos e os moleculares (LAZÉRA, et al., 2004;

SIDRIM et al., 2010). Em relação aos aspectos fenotípicos, o agente pode ser

identificado com base na macromorfologia e na micromorfologia.

Os principais meios utilizados para cultura são ágar Sabouraud glicose 2%, ágar

batata e ágar extrato de malte. Vale ressaltar que, para o isolamento primário de

Cryptococcus spp. a partir de espécimes clínicos, em ágar Sabouraud suplementado com

cicloheximida, a concentração desta substância não deve ultrapassar 0,2%, devido a sua

intensa atividade inibitória sobre o microrganismo. Após a incubação do fungo por um

período de 48-72 horas, a 25-37°C, as colônias de Cryptococcus spp apresentam

tamanho pequeno a médio, com coloração variando de branca a creme brilhante e

textura mucóide (LAZÉRA et al., 2004). Em relação à temperatura de incubação, boa

parte das cepas do Complexo C. neoformans cresce bem na faixa de 30° a 35 °C, sendo

que, em situações experimentais, a maioria das cepas, em especial as do sorotipo A,

tolera até 40°C (MARTINEZ et al., 2001). Quanto à capacidade de produzir melanina,

uma característica indicativa de cepas do Complexo C. neoformans, existem meios de

cultura que induzem a síntese dessa proteína, como o ágar semente de níger, ágar

23

caféico e o ágar L-DOPA, pois são ricos em compostos fenólicos, os quais servem de

substrato para a síntese de melanina. Após a incubação a 37°C por 48 horas, pode-se

observar o crescimento de colônias com coloração marrom, conforme ilustrado na

figura 2 (PEDROSO et al., 2007).

(Fonte: CEMM, 2011)

Figura 2. Colônias de Cryptococcus sp. produtoras de melanina, observadas

em meio ágar semente de Níger.

A presença de cápsula pode ser observada por meio da técnica de coloração

negativa com tinta da China, seguida de observações microscópicas (DE HOOG, 2000),

conforme ilustrado na figura 3. Em determinadas circunstâncias, para que cápsula seja

visualizada, é necessária a estimulação da sua síntese, que pode ser obtida quando as

cepas são semeadas em uma atmosfera rica em dióxido de carbono e que contem de

soro fetal bovino e baixas concentrações de ferro (ZARAGOZA e CASADEVALL,

2004).

24

(Fonte: CEMM, 2011)

Figura 3. Produção de cápsula em cepas do Complexo C. neoformans,

visualizada por microscopia óptica em 100x.

Para uma maior evidência da micromorfologia de Cryptococcus spp., após o

crescimento fúngico em meios de cultura e visualização da cápsula com tinta da China,

pode ser utilizada a técnica de microcultivo, em que a micromorfologia da levedura é

avaliada por meio do crescimento em ágar CornMeal Tween 80 ou Agar arroz Tween 80,

com incubação de cinco dias, a 30°C, sendo visualizado o crescimento de blastoconídios

esféricos grandes e irregulares sem hifas ou pseudo-hifas (COSTA, et al., 2009; DE

HOOG et al., 2000; LAZÉRA, et al., 2004).

As espécies do Complexo C. neoformans também podem ser identificadas por

meio de testes bioquímicos (LAZÉRA et al., 2004). Assim, Cryptococcus spp. não tem

a capacidade de fermentar açúcares, mas pode utilizar como única fonte de carbono, a

galactose, a sacarose, a glicose, a frutose, a maltose, a trealose, a melizitose, D-xilose,

L-raminose, sorbitol, manitol, dulcitol, D-manitol, α-metil-d-glucosídeo, salicina,

inositol (DE HOOG et al., 2000). Quanto às fontes de nitrogênio, não assimilam nitrato e

não reduzem nitrato a nitrito. São diferenciados de leveduras do gênero Candida pela

capacidade de hidrolisar uréia, o que é evidenciado por meio do crescimento em ágar

uréia de Christensen, alterando o pH do meio, ocasionando a mudança de cor do

mesmo, após as cepas serem incubadas por um período de 24-48 horas a 30 °C. Nas

reações positivas para a síntese da urease, ocorre a mudança da coloração do meio de

amarelo para rosa (Figura 4b) (LAZÉRA et al., 2004). Ademais, a capacidade em

utilizar o inositol como fonte de carbono permite diferenciar Cryptococcus spp. de

leveduras do gênero Rhodotorula (WINN JR. et al., 2008).

25

A diferenciação das espécies C. gattii e C. neoformans pode ser realizada por

meio do teste de crescimento em meio CGB (L-canavanina, glicina e azul de

bromotimol). O princípio deste teste baseia-se que C. gattii, diferentemente do C.

neoformans, é resistente a L-canavanina e utiliza como fonte de carbono e nitrogênio a

glicina, sendo capaz de crescer no CGB. Portanto, com o crescimento fúngico, ocorre a

produção de amônia e, conseqüente, elevação do pH, o que altera a coloração do meio

da cor verde para azul (Figura 4a) (BAUTERS et al. 2001).

(Fonte: CEMM, 2011)

Figura 4. (a) Identificação de Cryptococcus sp. por meio do crescimento em

ágar CGB, mostrando a coloração azul, sugestiva de C. gattii e meio com coloração

verde, sugestiva de C. neoformans. (b) Crescimento em caldo uréia, evidenciada pela

turvação do meio e mudança da coloração de amarelo para rosa.

Existe também um teste sorológico que tem como princípio a detecção de

antígenos polissacarídicos capsulares, sendo realizado por aglutinação de partículas de

látex com fluidos e secreções corporais (líquor, soro, leite e urina), em que permite a

identificação das espécies de C. neoformans e C. gattii. Esse teste apresenta como

vantagem a obtenção rápida do resultado e a sensibilidade, mas torna-se desvantajoso

pelo alto custo do reagente (MOREIRA et al., 2006; SPANAMBERG et al.,2009).

Existem também métodos modernos de identificação que, embora demandem

ainda de muitos custos e necessitem de testes complementares na rotina clínica,

superam muitas desvantagens dos testes presuntivos de identificação fenotípica que são

laboriosos e estão sujeitos à ocorrência de variabilidade nos resultados, por erros na

identificação (COSTA,2009; WENGENACK e BINNICKER,2009). No entanto,

(a) (b)

26

embora os sistemas API 20C AUX e VITEK apresentem grande praticidade, são

incapazes de identificar corretamente a espécie C. gattii (CORDEIRO et al., 2011)

Apesar de ainda não serem rotineiramente utilizados na prática laboratorial,

devido aos custos elevados, os métodos moleculares permitem a identificação de

espécies, sorotipos e tipos moleculares, com elevada sensibilidade, especificidade e

acurácia, no intuito de resolver as limitações dos métodos convencionalmente

utilizados. Além disso, fornecem informações sobre a epidemiologia do agente e

permitem associar o sorotipo encontrado às características clínicas como: tipos de

manifestações e perfil de sensibilidade aos antifúngicos (SORRELL, 2001; HOANG et

al., 2004). Dentre as técnicas empregadas, citam-se: Reação em Cadeia da Polimerase –

PCR – fingerprinting, PCR seguida de tratamento com enzimas de restrição (PCR-

REA) e Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), nas quais são empregadas

sequências-alvo para a identificação e tipagem de Cryptococcus, sendo as mais

utilizadas: URA5 (oritidina monofosforilase), CAP59 (produção de cápsula), M13

(sequências minissatélites) e ITS (18S, 5,8S e 28S). (SIDRIM et al., 2011; COSTA,

2009; ENACHE-ANGOULVANT et al., 2007).

A PCR-REA consiste na técnica molecular mais atual, rápida e confiável na

identificação de espécies do Complexo C. neoformans e dos cinco sorotipos. A análise

de enzima de restrição (REA) tem como região-alvo o gene CAP59 – um dos genes

codificadores da cápsula – o qual é submetido à clivagem com diferentes enzimas

BsmFI, HpaII e AgeI, para a análise do perfil de restrição, sendo este especifico para C.

neoformans e C. gattii e seus sorotipos (ENACHE-ANGOULVANT et al., 2007;

SIDRIM et al., 2010).

2.1.6 Sensibilidade antifúngica do Complexo C. neoformans

Após o surgimento da pandemia da AIDS, a ocorrência de micoses sistêmicas,

como a criptococose, tem aumentado (NUCCI; COLOMBO, 2007; COSTA-DE-

OLIVEIRA et al., 2008; ANTONIEWICZ et al., 2009; COLOMBO e ALVES, 2004;

PRADO et al., 2009). Embora o surgimento da terapia antiretroviral tenha reduzido a

incidência da criptococose, estima-se a ocorrência de aproximadamente 1 milhão de

casos de meningoencefalite criptocócica no mundo (PARK et al., 2009). Portanto,

torna-se importante a avaliação da sensilidade in vitro de leveduras do Complexo C.

neoformans, frente a antifúngicos utilizados na terapia contra criptococose, visando

27

monitorar a sensibilidade de isolados clínicos e ambientais (CAPOOR et al., 2008;

CHANDENIER et al., 2004; PERFECT et al., 2010).

Dentre os métodos de teste de sensibilidade antifúngica, os mais utilizados são a

difusão em ágar, incluindo o E-test, e a microdiluição em caldo (CLSI, 2008; KHAN et

al., 2007; COSTA et al., 2009). No E-test, utiliza-se uma fita impregnada com a droga

em diferentes concentrações, a qual é posicionada sobre a superfície de um meio sólido

contendo a cultura fúngica, e apresenta equivalência aceitável para os métodos pelo

CLSI (COLOMBO e ALVES, 2004; COSTA, 2009). Na técnica de microdiluição em

caldo, são utilizadas placas de microdiluição de 96 poços e meio de cultura RPMI 1640

livre de macromoléculas. Por meio do protocolo definido no documento M27-A3 pelo

CLSI é possível ajustar as principais variáveis do teste, tais como concentração do

inóculo, ao tempo de leitura da placa ou aos pontos de corte para cada droga (CLSI,

2008). Embora este protocolo não tenha sido originalmente delineado para

Cryptococcus sp., vários autores têm empregado as suas diretrizes para a análise da

sensibilidade in vitro.

(Fonte: CEMM, 2011)

Figura 5. Técnica de microdiluição em caldo para Cryptococcus sp. em placa de

96 poços.

Em relação à sensibilidade antifúngica, pesquisas demonstram que C.

neoformans e C. gattii oriundos de amostras clínicas e ambientais são sensíveis a

antifúngicos clássicos, como o itraconazol e o fluconazol (COSTA, 2009;

KOBAYASHI et al., 2005; KHAN et al., 2007). No tocante ao perfil de sensibilidade

dos sorotipos, a maioria é sensível aos antifúngicos com CIM de 2 a 256 μg/ml, mas

28

cepas do sorotipo B apresentam resistência ao fluconazol (FERNANDES et al., 2003).

COSTA et al. (2010), avaliando o perfil de sensibilidade de 45 leveduras oriundas de

amostras de pombos e seus excrementos, verificou que apenas uma cepa de C.

neoformans era resistente a itraconazol. PFALLER et al., (2005) avaliaram a

sensibilidade de isolados clínicos de C. neoformans ante a anfotericina B, flucitosina,

fluconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol e observaram resistência in vitro a

esses antifúngicos. Recentemente, Iqbal et al (2010) mostraram que os genótipos VGI e

VGIII geralmente apresentam menores valores de CIM para azólicos e anfotericina B,

ao passo que o genótipo VGII apresenta maiores valores de CIM para esses

compostos.A resistência in vitro em cepas clínicas e ambientais de Cryptococcus spp. é

rara, sendo observada uma resistência para itraconazol e fluconazol em cepas

ambientais (COSTA et al., 2009; PEDROSO et al., 2006).

2.2 A molécula de Farnesol

O farnesol foi inicialmente descrito por Hornby et al., (2001), como uma

molécula quorum sensing sintetizada por C. albicans, tendo o papel de inibir ou

suprimir a conversão da levedura para micélio, sem haver interferência no crescimento

celular (KLEIN e TEBBETS, 2007). O farnesol é produzido pela desfosforilação do

farnesil difosfato, o qual é um precursor da síntese de esteróis na via de biossíntese do

ergosterol (SILVA, 2009). Na levedura C. albicans, acredita-se que o farnesol torne a

cepa mais virulenta por impedir a conversão da forma de levedura para a forma micelial

e por favorecer a entrada do fungo na célula do hospedeiro, em decorrência da sua

propriedade lipofílica (SEMIGHINI et al., 2008).

(Fonte : www.quimicahoje.com.br)

Figura 6. Fórmula estrutural do composto farnesol.

29

O composto farnesol - um álcool sesquiterpeno natural de planta, tais como

Pluchea dioscoridis, Zea mays e Pittosporum undulatum, - formado por três unidades de

isopreno, podendo está presente em muitos óleos essenciais, foi estudada em células de

mamíferos pelo fato de induzir apoptose e/ou ocasionar a parada do ciclo celular em

células cancerígenas, sem afetar células normais (JOO et at., 2007). O farnesol é capaz

de induzir a apoptose através da indução da produção de oxigênio reativo, embora em

estudos com modelo murino intefere na expressão de citocinas no caso havendo

aumento de IL-5 e inibindo INF-γ (NAVARATHNA et al., 2007; SEMIGHINI et al.,

2006).

Além disso, participa de vários processos biológicos, como o controle das

interações microbianas, por meio da inibição do crescimento de microrganismos. Tal

efeito já foi demonstrado nas bactérias Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans,

no fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis e no fitopatógeno Fusarium

graminearum (DERENGOWSKI et al., 2009; JABRA-RISKI et al., 2006).

O efeito do farnesol na formação de biofilmes está bem descrito em

Staphylococcus epidermidis e em leveduras do gênero Candida (ZIBAFAR et al.,

2009). Embora o mecanismo de ação do farnesol em fungos não esteja completamente

entendido, acredita-se que ele cause danos na membrana da célula fúngica, prejudicando

a síntese de ergosterol (DERENGOWSKI et al., 2009).

O mecanismo de ação do farnesol pode estar associado à inibição da

incorporação da colina, na síntese de fosfatidilcolina, pela inibição da ação do pool de

diacilglicerol (DAG), sendo que esta inibição pode estar atribuída a uma transdução de

sinal via fosfolipase D reduzindo o que ativaria um alvo antiapoptotico (Figura 7).

Ademais, o farnesol pode aumentar a degradação de 3-hidroxi-2-metilglutaril (HMG-

CoA) redutase, que se encontra aderida ao reticulo endoplasmático por 8 domínios da

transmebrana, participando das sínteses de esteróis nas suas primeiras fase e ativação

de um receptor farnesóide, integrante da superfamília de receptores nuclear de

hormônios (DERENGOWSKI et al., 2009; SILVA, 2009; TAYLOR et al., 2005).

Pesquisas recentes têm demonstrado que a molécula de farnesol pode

potencializar o efeito de agentes antimicrobianos, como já foi descrito em

Staphylococcus aureus e Escherichia coli (BREHM-STECHER et al.,2003; JIN et al.,

2010; KURODA et al., 2007). Pois tem a capacidade de inibir as reações de oxidação-

redução na bomba de efluxo da célula microbiana ocasionando um aumento da

susceptibilidade. Ademais por culminar em um efluxo de K+

no citoplasma em células

30

humanas, com isso possibilitando o uso do mesmo como um coadjuvante na terapia

antifúngica (JABRA-RISKI et al., 2006).

ApoptoseQuorum sensing

Morfogênese

Resistência antifúngica

Biofilme

Farnesol

Figura 7. Efeitos biológicos do farnesol: resistência antimicrobiana; formação de

biofilmes imaturos; indutor de apoptose; bloqueio do processo de quorum sensing;

supressão da atividade fagocitária das formas filamentosas de C. albicans (Teixeira

2010).

31

3. JUSTIFICATIVA

O farnesol tem sido o foco de pesquisas, visando avaliar seu efeito sobre o

crescimento de microrganismos. Desta forma, este trabalho se justifica pela ausência de

estudos que demonstrem o efeito do farnesol sobre fungos do gênero Cryptococcus.

Logo, a presente pesquisa avaliou o papel biológico deste composto sobre o crescimento

fúngico e a produção de fosfolipases e proteases nas espécies do Complexo C.

neoformans.

32

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

4.1. O farnesol é capaz de inibir o crescimento de isolados do Complexo C.

neoformans;

4.2. O farnesol interfere na síntese de fosfolipases e proteases em cepas do Complexo C.

neoformans.

33

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo Geral

Avaliar o efeito do farnesol sobre o crescimento e síntese de fatores de

virulência de cepas do Complexo C. neoformans.

5.2 Objetivos Específicos

1. Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) do farnesol ante cepas do

Complexo C. neoformans;

2. Investigar o efeito do farnesol sobre a síntese de fosfolipases por cepas do Complexo

C. neoformans;

3. Investigar o efeito do farnesol sobre a síntese de proteases por cepas do Complexo C.

neoformans.

34

6. CAPÍTULO 1

O FARNESOL INIBE O CRESCIMENTO IN VITRO DE ESPÉCIES

DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS, SEM

QUALQUER ALTERAÇÃO RELEVANTE NA ATIVIDADE DE

EXOENZIMAS

Periódico: Veterinary Microbiology (submetido em novembro de 2011)

Fator de Impacto: 3,256

35

Veterinary Microbiology 1

2

3

Farnesol inhibits in vitro growth of the Cryptococcus neoformans Species Complex with 4

no relevant change in exoenzyme activity 5

6

Rossana de Aguiar Cordeiro1,2

, George Cândido Nogueira1,3

, Raimunda Sâmia Nogueira 7

Brilhante1,2

, Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira1,2

, Charles Ielpo Mourão1, Débora de Souza 8

Collares Maia Castelo-Branco1,2

, Manoel de Araújo Neto Paiva1,3

, Joyce Fonteles Ribeiro1,2

, 9

Rita Amanda Chaves de Lima1,2

, André Jalles Monteiro1,4

, José Júlio Costa Sidrim1,2

, Marcos 10

Fábio Gadelha Rocha1,2,3

11

12

1 Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical 13

Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 14

2 Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Postgraduate Program in 15

Medical Microbiology, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil 16

3 School of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of 17

Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 18

4 Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará, Fortaleza-19

CE, Brazil 20

Corresponding Author. R. S. N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese. CEP: 21

60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3295-1736 E-mail: [email protected]. 22

23

24

36

Abstract 25

The present study aimed at determining the effect of farnesol on the growth of strains of the 26

Cryptococcus neoformans Species Complex, through microdilution assays. In addition, the 27

effect of farnesol on the synthesis of phospholipase and protease by C. neoformans e C. gattii 28

was also investigated. A total of 36 strains were studied, out of which 20 were from veterinary 29

sources, 8 were from human cases and 8 were from a reference collection. The minimum 30

inhibitory concentrations (MICs) were determined in accordance with the M27-A3 protocol as 31

described by CLSI and farnesol was tested at a concentration range of 0.29 to 150 µM. 32

Phospholipase and protease activities were evaluated through growth on egg yolk agar and 33

spectrophotometry, respectively, after pre-incubating the strains at different farnesol 34

concentrations (MIC/4, MIC/2 and MIC). It was observed that farnesol has substantial 35

antifungal activity against C. neoformans (MIC geometric mean 6.29 µM) and C. gattii (MIC 36

geometric mean 4.67 µM). Although farnesol did not significantly alter phospholipase 37

activity, a tendency to decrease this activity was observed. Concerning protease, no 38

statistically significant differences were observed when comparing the production before and 39

after pre-incubation at different farnesol concentrations. Based on these findings, it can be 40

concluded that farnesol presents in vitro inhibitory activity against C. neoformans and C. 41

gattii, but has little impact on the production of the analyzed virulence factors. 42

Keywords: Farnesol, Cryptococcus neoformans Species Complex, growth inhibition, 43

phospholipases, proteases. 44

45

46

47

37

Introduction 48

The Cryptococcus neoformans Species Complex is formed by two distinct 49

microorganisms, Cryptococcus neoformans and C. gattii, which are sub-classified in at least 50

two varieties, five serotypes and eight molecular types (Kwon-Chung & Varma, 2006; Bovers 51

et al., 2008; Byrnes et al., 2011). In spite of sharing several phenotypical and molecular 52

characteristics, these species differ from each other, concerning ecological and 53

epidemiological aspects (Lin e Heitman, 2006; Costa et al., 2010). They are the major 54

causative agents of cryptococcal meningoencephalitis, the most frequent clinical 55

manifestation of cryptococcosis, which has a high mortality rate in developing countries 56

(Rachid & Schechter, 2008; Huston & Mody, 2009; Park et al. 2009; Kronstad et al., 2011; 57

Perfect et al., 2010). 58

To succeed in the host environment, Cryptococcus spp. produce a large amount of 59

virulence factors, which directly influence the infectivity of an individual strain (Ma e May, 60

2009). Among these main virulence factors, hydrolytic enzymes able to degrade lipids and 61

proteins have gained attention in the last years (Bien et al., 2009; Chrisman et al., 2011; 62

Chayakulkeeree et al., 2011). Phospholipases are directly related to the destabilization of host 63

cell membranes (Ghannoun et al., 2000; Ma e May, 2009) and proteases have been shown to 64

degrade several host molecules, such as collagen, elastin, complement (Chen et al., 1996), 65

hemoglobin, beta-casein and gamma globulin (Yoo et al., 2004). 66

The antifungal therapy for meningeal cryptococcosis is limited to amphotericin B plus 67

5-flourocytocin and azoles (Pappalardo e Melhem, 2003). Although antifungal resistance in 68

Cryptococcus is not considered a major problem worldwide (Pfaller et al., 2005), some 69

studies have shown that resistance may be a problem in developing countries (Bii et al., 2007; 70

Varma e Kwon-Chung, 2010). This scenario has motivated the search of new compounds that 71

38

present inhibitory effect against Cryptococcus (Steverding et al., 2011, Nguyen et al., 2011; 72

Spitzer et al., 2011). 73

The present study aimed at evaluating the antifungal potential of farnesol against C. 74

neoformans and C. gattii. In addition, the effect of farnesol on phospholipase and protease 75

activities was also investigated. 76

77

Material and Methods 78

Fungal Strains 79

A total of 36 strains from the culture collection of the Specialized Medical Mycology 80

Center of the Federal University of Ceará were included in this study, out of which 20 were 81

from veterinary sources (2 from animal clinical cases and 18 from pigeon excreta) and 8 from 82

human clinical cases. In addition, Candida parapsilosis ATCC 22019 and eight Cryptococcus 83

sp. reference strains obtained from Evandro Chagas Clinical Research Institute, Brazil 84

(IPEC/FIOCRUZ) were used as controls: C. neoformans var. grubii WM 148 (serotype A, 85

VNI/AFLP1), C. neoformans var. grubii WM 626 (serotype A, VNII/AFLP1A), C. 86

neoformans WM 628 (serotype AD, VNIII/AFLP2), C. neoformans var. neoformans WM 629 87

(serotype D, VNIV/ AFLP3), C. gattii WM 179 (serotype B, VGI/AFLP4), C. gattii WM 178 88

(serotype B, VGII/AFLP6), C. gattii WM 175 (serotype B, VGIII/AFLP5), and C. gattii WM 89

779 (serotype C, VGIV/AFLP7), as described by Meyer et al., 2003. All isolates were stored 90

on 2% potato dextrose agar supplemented with glycerol, at -20 oC, and were recovered 91

through growth on 2% potato dextrose agar at 35 oC, for 2 days (Cordeiro et al., 2011). 92

93

94

95

Dilution of Farnesol, Amphotericin B and Fluconazole 96

39

The strains were tested against farnesol diluted with 30% dimethyl sulfoxide (DMSO) 97

at the moment of use, in order to obtain a stock solution at a concentration of 1892 μM. 98

Afterwards, the stock solution was diluted with RPMI1640 to a concentration of 600 μM, in 99

which DMSO was at a concentration of 5%. The tested concentration range was from 0.29 to 100

150 μM. 101

Amphotericin B (Sigma Chemical Corporation, Germany) and fluconazole (Pfizer 102

Pharmaceuticals, USA) were tested against C. parapsilosis 22019 and Cryptococcus reference 103

strains, as quality controls. These drugs were diluted with sterile destilled water, as described 104

by the document M27-A3 of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). The 105

tested concentration ranged from 0.03125 to 16 µg/mL and from 0.125 to 64 µg/ml, for 106

amphotericin B and fluconazole, respectively. Additionally, the effect of DMSO on the 107

viability of Cryptococcus spp. was evaluated, at concentrations that ranged from 0.05 to 30%. 108

The highest DMSO concentration used in microdilution plates was of 1.25%, which presented 109

no antifungal activity. 110

111

Testing in vitro susceptibility to farnesol 112

Fungal inocula were prepared from cultures grown on potato dextrose agar at 28 oC, 113

for 48 hours. Sterile 0.9% saline (5 mL) was added to sterile glass slants and a sample of the 114

colony was added to the saline solution, adjusting its turbidity to 0.5 McFarland scale (CLSI, 115

2008). Afterwards, inocula were diluted to 1:100 and 1:20 with RPMI 1640 medium 116

supplemented with L-glutamine (HiMedia, Mumbai, India), and buffered to pH 7 with 117

0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS). The final inoculum concentration was 0.5 - 118

2.5 x 103 cells/mL

(CLSI, 2008; Costa et al., 2010, Sidrim et al., 2010). 119

The minimum inhibitory concentrations (MICs) of farnesol and the tested drugs 120

against C. neformans and C. gattii strains were determined through broth microdilution 121

40

method, in 96-well microdilution trays, with a capacity of 200 μL/well. These trays were 122

properly prepared and incubated at 35 oC for 48 hours, when they were visually read. MIC for 123

farnesol was defined as the lowest drug concentration able to inhibit 80% of fungal growth, 124

when compared to the farnesol-free control wells. Concerning amphotericin B and 125

fluconazole, MICs were defined as the lowest concentrations capable of inhibiting 100% and 126

50% of fungal growth, respectively (CLSI, 2008). 127

128

Effects of farnesol on phospholipase and protease activities 129

In this step, all strains were grown on 2% Sabouraud Dextrose agar and incubated at 130

37 oC, for 48 hours. Afterwards, the strains were cultured in RPMI 1640 medium, containing 131

three decreasing concentrations of farnesol (MIC, MIC/2 and MIC/4), at 37°C, for 48 hours. 132

A farnesol-free control for each strain was also included. 133

Phospholipase production was evaluated according to Sidrim et al., 2010. Initially, the 134

fungal suspensions in RPMI medium containing different farnesol concentrations were 135

centrifuged at 805 g. Then, from the fungal pellets, yeast inocula were prepared in 0.9% 136

saline, reaching turbidity equivalent to 4.0 McFarland scale. The medium used was 2% 137

Sabouraud dextrose agar, supplemented with 1 mol/L of sodium chloride, 0.05 mol/L of 138

calcium chloride and 8% sterile egg yolk emulsion at 30%. The emulsion was heated to 40 oC 139

and incorporated into the sterile Sabouraud medium after it reached a temperature of 40 oC. A 140

volume of 5 µL of each inoculum was applied onto a 5-mm sterilized filter paper disk, which 141

was placed on the agar surface. The plates were incubated at 35 oC for seven days (Sidrim et 142

al., 2010). 143

Phospholipase activity (Pz) was determined by calculating the ratio between the 144

diameter of the fungal colony and the total diameter, including the colony and the 145

precipitation zone. When Pz = 1, the isolate is phospholipase negative; when 1 > Pz ≥ 0.64 the 146

41

isolate is positive for phospholipase activity; and when Pz < 0.64, the isolate is strongly 147

positive for this enzyme (Price et al., 1982; Vidotto et al., 2005). 148

For protease production, the analyses were performed according to Cenci, 2004, with 149

modifications (Brilhante et al., 2011). Briefly, the strains were incubated in RPMI containing 150

different decreasing farnesol concentrations, under slow agitation of 150 g, for 48 hours, at 28 151

oC. Afterwards, the material was centrifuged for 15 minutes at 805 g to separate the enzymatic 152

extract from the cells. Then, 2 mL of the enzymatic extract was incubated at 37 oC with 2 mL 153

of 0.3% azoalbumine, for 48 hours. After this procedure, the reaction was stopped by the 154

addition of 10% trichloroacetic acid. To the reactional mixture, 2 mL of 0.5 M KOH were 155

added for posterior spectrophotometric analysis at 440 nm. 156

157

Statistical Analysis 158

In order to analyze the effects of farnesol on the growth of strains and the production 159

of virulence factors, the data were analyzed through univariate analysis of variance. Farnesol 160

MICs were evaluated considering species and source of each strain, whereas phospholipase 161

and protease values were analyzed before and after exposure to farnesol. In this analysis, 162

species and source of strains were also considered. P-values lower than 0.05 indicated statistic 163

differences. 164

165

166

167

Results 168

Farnesol presented in vitro inhibitory effects against the tested strains, with MICs 169

varying from 0.29 to 75 µM (p<0.05) for both C. neoformans and C. gattii, with geometric 170

means (GM) of 6.29 and 4.67 µM, respectively. Considering the source of the strains, the 171

42

obtained GMs for C. neoformans were 10.91, 5.56 and 2.33 µM for veterinary, human and 172

reference strains, respectively, while for C. gatti, GMs were 5.30 and 3.30 µM, for veterinary 173

and reference strains, respectively. Additionally, it was observed that the control drugs 174

presented MICs ranging from 0.0625 to 1 µg/mL for amphotericin B and from 4 to 32 µg/mL 175

for fluconazole, against the control strains (Table 1) 176

It was observed that 18 (50%) out of the 36 tested strains secreted phospholipases 177

without being exposed to farnesol (control) (p<0.05). When the 36 strains were pre-incubated 178

at three different concentrations of this compound, it was observed that 11 (30.56%), 13 179

(36.12%) and 15 (41.67%) strains did not exhibit any alteration in phospholipase secretion, 180

after the exposure to farnesol concentrations of MIC/4, MIC/2 and MIC, respectively (Table 181

2) (p<0.05). However, it is interesting to state that under these experimental conditions a 182

tendency to the reduction of the enzymatic activity was observed, once 15 (41.67%), 14 183

(38.89%) and 13 (36.12%) strains presented a reduction in phospholipase secretion, after pre-184

incubated at MIC/4, MIC/2 and MIC of farnesol, respectively (p<0.05). 185

Concerning protease activity, 18 strains (50%) secreted these enzymes without being 186

exposed to farnesol (control). After pre-incubation at different concentrations of this 187

sesquiterpene, no significant differences were observed between control and the tested 188

farnesol concentrations (MIC/4, MIC/2 and MIC), with a mean value of 0.010, 0.011, 0.010 189

and 0.015 EU, respectively (p<0.05). 190

191

Discussion 192

Farnesol is a sesquiterpene alcohol found in plant extracts and also produced by C. 193

albicans as a quorum sensing molecule (Hornby et al., 2001, Derengowski et al., 2009). This 194

autoregulatory compound alters C. albicans morphology and also has a dramatic impact on 195

fungal growth and survival (Shirtliff et al., 2009; Weber et al., 2010). Several studies have 196

43

shown that this molecule also has inhibitory effects against other pathogens, including non-197

albicans Candida species (Weber et al., 2010), Paracoccidioides brasiliensis (Derengowski et 198

al., 2009) and bacteria (Pammi et al., 2011). 199

The mechanisms through which farnesol acts on fungal cells is still unknown 200

(Derengowski et al., 2009; Langford et al., 2010), however, it is believed that it damages the 201

fungal cell membrane and impairs ergosterol synthesis (Jabra-Rizk et al., 2006), considering 202

that farnesol and ergosterol share many precursors in the sterol biosynthetic pathway (Hornby 203

& Nickerson, 2004; Navarathna et al., 2005). In addition, as possible efflux pump inhibitor, 204

farnesol may affect membrane permeability through the disruption of cytoplasmic membranes 205

(Jin et al., 2010). 206

The present article showed that farnesol can also inhibit C. neoformans and C. gattii 207

obtained from veterinary sources. MIC values for both species (GM=6.29 and 4.67 µM for C. 208

neoformans and C. gattii, respectively) were lower than those observed for other fungal 209

pathogens, such as P. brasiliensis, for which inhibition was achieved at 25 µM (Derengowski 210

et al., 2009), and C. parapsilosis, which was inhibited by 50 µM farnesol (Rossignol et al., 211

2007). 212

Even though it has been described that C. gattii is less susceptible to classical 213

antifungal drugs (Trilles et al., 2004; Khan et al., 2007), the farnesol MICs for C. neoformans, 214

serotypes A, D and AD, (GM=6.29 µM) were higher than those for C. gattii, serotypes B and 215

C (GM=4.67 µM). Additionally, it was observed that veterinary strains of C. neoformans and 216

C. gattii presented higher MIC values (GM=10.91 and 5.30 µM, respectively), when 217

compared to those of human C. neoformans (GM=5.56 µM) and C. neoformans and C. gattii 218

reference strains (GM=2.33 and 3.30 µM, respectively). It has been reported that farnesol 219

inhibits efflux pumps of C. albicans (Sharma & Prasad, 2011) and Mycobacterium smegmatis 220

(Jin et al., 2010), thus, the difference in farnesol susceptibility, concerning the source of the 221

44

strains, may be related to an increased expression of efflux pumps in veterinary and human 222

strains, when compared to control ones, possibly, as a result of previous exposure to several 223

chemical compounds, including antifungal drugs. 224

It has been shown that phospholipase and protease production by Cryptococcus spp. is 225

a strain-dependent phenomenon, presenting great frequency and intensity variation (Ma e 226

May, 2009). Similarly, the response to farnesol exposure was strain-dependent and no 227

significantly predominant response pattern was observed, even though, the most frequent one 228

was the decrease in enzymatic production at all tested farnesol concentrations (8 and 9 strains 229

for phospholipase and protease, respectively). In addition, the incubation with farnesol was 230

able to change the enzymatic secretion, turning positive strains into negative, and vice-versa, 231

with the former situation being more common. 232

Phospholipase activity was not significantly influenced by farnesol, even though, more 233

strains were phospholipase negative, after exposure to this compound, when compared to 234

control. As for protease, it is known that Cryptococcus spp. present a low proteolytic activity 235

(Casadevall & Perfect, 1998), as demonstrated in the present study. Overall, no statistically 236

significant alterations were observed after pre-incubation with farnesol, although, more strains 237

were protease negative, after exposure to this compound. 238

The findings concerning the effects of farnesol on the activity of virulence factors may 239

be advantageous, once a tendency to reduce phospholipase and protease secretion was 240

observed. Even though these findings are discrete, they are similar to some previous studies 241

that demonstrated the reduction in protease and urease production, after incubation at sub-242

inhibitory concentrations of a synthetic killer peptide (Cenci et al., 2004) and the protease 243

inhibitor indinavir (Monari et al., 2005). It has been shown that farnesol presents 244

antimicrobial activity and induces the expression of certain genes, interfering with fungal cell 245

homeostasis (Jabra-Rizk et al., 2006; Semighini et al., 2006; Rossignol et al., 2007). 246

45

However, in spite of directly affecting the morphogenesis of C. albicans and its virulence in 247

invasive candidiasis (Navarathna et al., 2005), the direct effect of farnesol on the production 248

of virulence-related exoenzymes, such as phospholipases and proteases, had never been 249

reported for other yeasts, highlighting the importance of this study. 250

251

Conclusion 252

This research showed that farnesol presents an inhibitory effect on strains of the 253

Cryptococcus neoformans Species Complex, with no relevant change in the secretion of 254

virulence-related exoenzymes. These findings create the perspective to further investigate the 255

mechanisms through which this molecule inhibits Cryptococcus spp. and the potential use of 256

this compound, as an alternative for the treatment of cryptococcosis in the future. 257

258

Acknowledgements 259

This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento 260

Científico e Tecnológico (CNPq; Brazil; Processes 302574/2009-3 and 562296/2010-7).We 261

would like to thank the Mycology Laboratory of the Evandro Chagas, Clinical Research 262

Institute in Rio de Janeiro (IPEC/FIOCRUZ) for providing the reference strains from its 263

Cryptococcal Culture Collection. 264

265

Transparency Declaration 266

None to declare. 267

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51

409

Table 1. Minimum inhibitory concentration (MIC) of farnesol against strains of the 410

Cryptococcus neoformans Species Complex. 411

Strain Species Serotype Source FNS FLC AMB

CEMM-05-1-042 C. neoformans A Human 18.75 - -







CEMM-05-1-049 C. neoformans A Human 75 - -

CEMM-05-1-050 C. neoformans A Veterinary 4.68 - -

CEMM-05-3-001 C. neoformans A Veterinary 75 - -



CEMM-03-2-074 C. gattii B Veterinary 4.68 - -

CEMM 03-2-061 C. neoformans A Veterinary 75 - -

CEMM 05-1-090 C. neoformans A Veterinary 2.34 - -



CEMM 03-2-079 C. gattii B Veterinary 75 - -

CEMM 05-3-031 C. gattii B Veterinary 75 - -

CEMM 05-3-032 C. gattii B Veterinary 1.17 - -








CEMM 05-2-087 C.gattii B Veterinary 4.68 - -

CFP55/WM148 C. neoformans A Reference 1.17 16 0.0625

CFP56/WM626 C. neoformans A Reference 0.58 4 1

CFP57/WM628 C. neoformans AD Reference 18.75 4 0.5

CFP58/WM629 C. neoformans D Reference 2.34 8 0.5

CFP59/WM179 C. gattii B Reference 4.68 16 0.0625

CFP60/WM178 C. gattii B Reference 0.58 4 1

CFP61/WM161 C. gattii B Reference 37.5 16 1

CFP62/WM779 C. gattii C Reference 1.17 16 1

FNS: Farnesol (µM); FLC: Fluconazole; AMB: Amphotericin B (µg/mL)

-: Not tested

412

52

Table 2. Phospholipase secretion before and after exposure to farnesol. 413

Phospholipase Secretion MIC/4 MIC/2 MIC

No alteration 11 13 15

Increased activity 10 9 8

Decreased activity 15 14 13

53

7. CONCLUSÕES

1 - O farnesol inibe o crescimento de organismos do Complexo Cryptococcus neoformans;

2- No tocante a sensibilidade não houve diferenças significativas entre C. neoformans e C.

gattii; apesar de ter sido observada menor média geométrica da CIM de farnesol nesta última

espécie;

3- Em relação à origem das cepas não houve diferença entre as cepas humanas e veterinárias,

embora tenha sido notada uma maior média geométrica da CIM de farnesol para C.

neoformans de origem veterinária;

4- O farnesol não interfere de forma significativa na síntese de fosfolipases e proteases por

cepas do Complexo Cryptococcus neoformans.

54

8. PERSPECTIVAS

Considerando que o farnesol inibe o crescimento de C. neoformans e C. gattii, sem,

contudo, alterar a atividade de importantes fatores de virulência, como fosfolipases e

proteases, torna-se importante a realização de experimentos in vivo, com o intuito de ratificar

estes resultados, visando em uma possível ampliação do arsenal contra estes fungos.

55

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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