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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
Rodrigo Scaliante de Moura
Otimização e produção do teste rápido para controle da hanseníase (ML Flow)
Goiânia 2011
ii
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES
E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal
de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de
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1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Rodrigo Scaliante de Moura
E-mail: [email protected]
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Vínculo empregatício do autor Bolsista
Agência de fomento: CNPq Sigla:
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título: Otimização e produção do teste rápido para controle da hanseníase
(ML Flow)
Palavras-chave: Hanseníase, sorologia, imunocromatografia
Título em outra língua: Optimization and production of a rapid test for leprosy control
(ML Flow)
Palavras-chave em outra língua: Leprosy, serology, immunocromatography.
Área de concentração: Imunologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 01/03/2011
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a): Samira Bührer
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):* Mariane Martins de Araújo Stefani
E-mail: [email protected] *Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento:
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________________________________________ Data: ____ / ____ / _____
Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
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RODRIGO SCALIANTE DE MOURA
Otimização e produção do teste rápido para controle da hanseníase (ML Flow)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública, área de concentração Imunologia.
Orientadora: Dra. Samira Bührer Co-orientadora: Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani
Goiânia 2011
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Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno: Rodrigo Scaliante de Moura
Orientadora: Dra. Samira Bührer
Co-orientadora: Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani
Membros:
1. Dra. Samira Bührer
2. Dra. Maria Aparecida de Faria Grossi
3. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
Data: 01/03/2011
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“Quem não compreende um olhar, tampouco compreenderá uma longa explicação”
(Mário Quintana)
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Dedico este trabalho aos meus pais, Paulo Sávio e Márcia e ao meu irmão, Bruno,
é claro.
viii
AGRADECIMENTOS
À Dra. Samira Bührer, pelo profissionalismo e sabedoria de orientadora e o
convívio tão prazeroso de amiga. Por estar sempre presente mesmo enquanto distante,
me permitindo assim aprender com meus próprios erros, mas nunca me deixando cair
sozinho. Por ter me orientado como a mãe que ensina um filho a andar.
À minha co-orientadora, Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani, por ter aberto
as portas do seu laboratório como quem abre os braços a um amigo e por toda paciência
e contribuição com nosso trabalho.
Aos colegas de laboratório Alexsander, Bruna, Emerith, Jannaina, Keila, Lucas,
Ludimila, Mônica, Nathália, Regiane e Yanna pelo convívio, companheirismo e
prontidão para ajudar e em especial a Dra. Ludimila cujo apoio foi fundamental para o
desenvolvimento deste projeto e ao Lucas e Alexsander sem os quais eu não teria
conseguido sequer ser aprovado no programa de mestrado em Imunologia.
Aos demais colegas de pós-graduação pela amizade, companhia principalmente
nos momentos “extra-curriculares” e pela troca de experiências.
Aos meus pais, Paulo Sávio de Moura e Márcia Scaliante Molina de Moura, pela
compreensão, incontestável apoio e orações de mãe. Ao meu irmão Bruno Scaliante de
Moura, pelo companheirismo incondicional.
À todos os professores da Pós-graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
do IPTSP/UFG, pela enorme contribuição para o meu crescimento. A todos demais
profissionais do IPTSP/UFG, desde o corpo administrativo de onde gostaria de citar a
diretora Dra. Regina Maria Bringel Martins, e a vice-diretora Dra. Flávia Aparecida de
Oliveira, os secretários da pós-graduação José Clementino e Kariny, os demais
funcionários, incluindo os funcionários da limpeza, todos tão importantes em propiciar
o ambiente que temos para desenvolver nossos trabalhos.
A todos pesquisadores parceiros deste trabalho, em especial a Marilisa Pedroso
Nogueira Gaeti, pessoa a qual agradeço o apoio do laboratório de Nanotecnologia
Farmacêutica e Sistemas de Liberação de Fármacos sob responsabilidade da Dra. Eliane
Martins Lima. A Dra. Juliana Alves Parente, do laboratório de Biologia Molecular do
Instituto de Biologia da UFG, sob responsabilidade da Dra. Célia Maria de Almeida
Soares pela colaboração fundamental cedendo tempo, equipamento e disponibilidade
ix
para que pudéssemos executar etapas importantes do nosso trabalho em seus
laboratórios. A Dra. Rozana Castorina Silva e a enfermeira Maria do Perpétuo Socorro
Amador, por disponibilizarem as amostras utilizadas nesta pesquisa.
À Coordenação do Programa Nacional para o Controle da Hanseníase do
Ministério da Saúde, nas pessoas da Dra. Maria Aparecida Faria Grossi, Dra. Maria
Leide Wand-del-Rey de Oliveira e as Doutoras Danusa Benjamim, Dra. Sônia Maria de
Freitas Brito, entre outras pelo apoio na obtenção de recurso financeiro para compra de
equipamento e reagentes necessários para o desenvolvimento deste projeto.
Aos funcionários da administração da Universidade Federal de Goiás, em
especial, a Reitoria, a Pró-Reitoria de Administração e Finanças (PROAD), o
Departamento de Material e Patrimônio (DMP) entre outros, que nos ajudaram a
transpor as inúmeras barreiras para a aquisição dos equipamentos e demais burocracias
que vencemos na compra de material importado e parcerias com Instituições
estrangeiras.
Aos amigos músicos, em especial Jarleo Barbosa, Lucas Costa e Leonardo
Sampaio que me ajudaram a aprender algo mais que não só ciência, me livrando assim
da monotonia de ser só um. A todos demais amigos que por medo de ter uma lista muito
longa, me atenho em apenas dizer “vocês sabem quem são”, pelo companheirismo,
paciência e por ajudar a diluir as tensões em cerveja, música e romance.
x
SUMÁRIO
Sumário vii
Lista das Figuras x
Lista de Tabelas xi
Lista de Siglas e Abreviaturas xii
Lista de Anexos xiv
Resumo xvi
Abstract xvii
1. INTRODUÇÃO 18
1.1. Diagnóstico de doenças infecciosas 18
1.2. Importância de testes de diagnóstico rápido 18
1.2.1. Testes Imunocromatográficos (Fluxo Lateral) 20
1.2.2. Componentes do teste imunocromatográfico 22
1.2.2.1. Filtro de Amostra 22
1.2.2.2. Suporte do Conjugado 23
1.2.2.3. Membrana de nitrocelulose 23
1.2.2.4. Filtro Absorvente 24
1.2.2.5. Cassetes plásticos 24
1.2.3. Processo de desenvolvimento de testes rápidos 25
1.2.3.1. Parâmetros de avaliação dos testes 25
1.2.3.2 Conceitos para validação de testes 26
1.3. Hanseníase: Agente Etiológico e Infecção 28
1.4. Classificação 29
1.4.1 Classificação Clínica 30
1.4.2. Classificação operacional 32
1.5. Imunologia da Hanseníase 32
1.5.1. Imunidade Inata 32
1.5.2. Imunidade Adquirida 35
1.6. Incidência e Prevalência da hanseníase 36
1.7. Controle de Hanseníase 37
xi
1.8. Diagnóstico 38
1.9. Tratamento 39
1.10. Reações Hansênicas 40
1.11. Recidiva 40
1.12. Exames laboratoriais 41
1.12.1. Histopatológico 41
1.12.2. Baciloscopia 41
1.12.3. PCR 42
1.12.4. Sorologia 42
2. JUSTIFICATIVA 47
3. OBJETIVOS 48
3.1. Objetivos gerais 48
3.2 Objetivos específicos 48
4. METODOLOGIA 49
4.1. Desenho do estudo 49
4.2. Banco de amostras testadas 49
4.2.1. Amostras de soro para fase I, fase II e Controle de Qualidade 49
4.2.1.1. Critérios de inclusão 50
4.2.1.2. Critérios de exclusão 51
4.3. Procedimentos 51
4.3.1 Teste de ELISA para detecção de anticorpos
anti PGL-I no soro 51
4.3.2. Teste sorológico ML Flow 52
4.3.2.1. Protocolo de execução utilizado na otimização
do teste ML Flow 53
4.3.2.2. Interpretação do teste sorológico ML Flow 53
4.3.2.3. Preparo de nanopartículas de ouro coloidal 54
4.3.2.4. Conjugação de nanopartículas de ouro
coloidal a anticorpos 54
xii
4.3.2.5. Sistema de Impregnação utilizado no preparo
do teste ML Flow 54
4.3.2.6. Treinamento para produção e
Controle de Qualidade dos testes 56
4.3.2.7. Controle de Qualidade dos testes produzidos 56
4.4. Análise Estatística 56
5. RESULTADOS 58
5.1. Classificação das amostras de acordo com a presença de anticorpos
contra o PGL-I quanto ao resultado de ELISA PGL-I 58
5.2. Resultados da fase I do projeto 58
5.2.1. Padronização do programa para impregnação
da linha controle e linha teste do ML Flow. 58
5.2.1.1. Dispensação da linha controle 59
5.2.1.2. Dispensação da linha teste 60
5.2.1.3. Protocolo do programa de sensibilização
do teste ML Flow 60
5.2.2. Montagem dos testes ML Flow 60
5.2.2.1. Seleção do filtro de amostra 61
5.2.2.2. Seleção da membrana de nitrocelulose 61
5.2.2.3. Protocolo final de montagem do teste ML Flow 62
5.2.3. Comparação entre os resultados do teste ML Flow-IPTSP
e ML Flow-KIT 62
5.2.4. Comparação entre os resultados do teste ML Flow-IPTSP
e ELISA 63
5.3. Resultados da fase II do projeto 63
5.3.1. Produção de nanopartículas de ouro coloidal 64
5.3.2. Conjugação de nanopartículpas de ouro coloidal
a anticorpos 64
5.4. Controle de Qualidade dos testes ML Flow-IPSTP 65
6. DISCUSSÃO 66
7. CONCLUSÃO 72
9. REFERÊNCIAS 73
10. ANEXOS 88
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Compontentes de um teste imunocromatográfico 16
Figura 2: Relação entre a taxa de capilaridade e sensibilidade
das membranas de nitrocelulose 18
Figura 3: O caminho “bancada - leito” no desenvolvimento e avaliação
de testes rápidos. 19
Figura 4: Estrutura química do PGL-I 37
Figura 5: Interpretação de teste imunocromatográfico 47
Figura 6: Plataforma dispensadora da série XYZ BioDot 49
Figura 7: Exemplo de programa para sensibilização por BioJet Lines®. 49
Figura 8: Resultados de testes obtidos na padronização da linha controle 53
Figura 9: Resultados discordantes entre ML Flow IPSTP e ML Flow KIT 57
Figura 10: Leitura da absorbância da solução de ouro coloidal. 58
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Descrição dos grupos estudados 44
Tabela 2 – Índice de Kappa 51
Tabela 3: Grupos de amostras de acordo com a presença de anticorpos
contra o PGL-I em ELISA 52
Tabela 4: Parâmetros para otimização da linha controle. 53
Tabela 5: Parâmetros para otimização da linha teste. 54
Tabela 6: Experimentos para escolha do filtro de amostra. 55
Tabela 7: Concordância entre as leituras do teste ML Flow-IPTSP
(fase I) e ML Flow-KIT 56
Tabela 8: Concordância entre as leituras do teste ML Flow IPTSP
(fase I) e ELISA PGL-I 57
Tabela 9 – Síntese dos resultados do controle de qualidade dos
testes ML Flow produzidos na fase I 59
xv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
BAAR – Bacilo Álcool-Ácido Resistente
BB – Borderline borderline
BCG – Bacilo Calmette & Guérin
BL – Borderline Lepromatoso
BSA – Albumina de Soro Bovino
BT – Borderline Tuberculóide
CIM – Concentração Mínima Inibitória
D-BSA – Dissacarídeo ligado diretamente à BSA
DC – Célula Dendrítica
ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay (Ensaio Imunoenzimático)
ENH – Eritema Nodoso Hansênico
FDA – Food and Drug Administration
FLA-ABS – Fluorescent leprosy antibody absorption (Ensaio imunofluorescente para
hanseníase)
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
I – Indeterminada
IB – Índice Baciloscópico
IFN -γ – Interferon gamma
IgA – Imunoglobulina da classe A
IgG – Imunoglobulina da classe G
IgM – Imunoglobulina da classe M
IL-1 – Interleucina 1
IL-12 – Interleucina 12
IL-2 – Interleucina 2
KIT BR – Biomedical Research – Royal Tropical Institute
LL – Pólo lepromatoso
MB – Multibacilar
MHC – Complexo de Histocompatibilidade Principal
M-O-BSA – Monossacarídeo ligado à BSA por um braço octil
MS – Ministério da Saúde
ND-O-BSA – Dissacarídio natural ligado à BSA por um braço octil
NGS – Soro Normal de Cabra
xvi
NK – Natural Killer
NHDP - National Hansen’s Disease Programs
NLR - Netherlands Leprosy Relief
NP – Neural Pura
NT-P-BSA – Trissacarídio natural ligado à BSA por um radical fosfato
OMS – Organização Mundial da Saúde
ONG – Organização Não Governamental
PB – Paucibacilar
PBS – Tampão Salino-Fosfato
PBST – Tampão Salino-Fosfato com Tween 20.
PCR – Polimerase Chain-Reaction
PGL-I – Glicolipídio Fenólico I
PHA - Hemaglutinação Passiva
PNCH – Programa Nacional de Controle da Hanseníase
PRR – Receptor Associado a Patógeno
PQT – Poliquimioterapia
RIA – Radioimunoensaio
RR – Reação Reversa
SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde
TLR – Toll Like Receptors (Receptores Semelhantes a Toll)
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa
TT – Pólo tuberculóide
xvii
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1
Comitê de Ética e Pesquisa do Instituto Evandro Chagas 82
Anexo 2
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Pacientes Hanseníase 83
Anexo 3
Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Eduardo de Menezes 84
Anexo 4
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Controles Chile 86
Anexo 5
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Controles Brasil 87
Anexo 6
Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais 89
Anexo 7
Comitê Nacional de Ética e Pesquisa (CONEP) 90
Anexo 8
POP preparo de soluções – PBS 92
Anexo 9
POP preparo de soluções – TMB 94
Anexo 10
POP preparo de soluções – diluente TMB 96
Anexo 11
POP preparo de soluções – Stop Solution 98
Anexo 12
POP preparo de soluções – Tampão de cobertura 100
Anexo 13
POP procedimentos – cobertura de placa 102
Anexo 14
POP procedimentos – ELISA 104
Anexo 15
POP procedimentos – Preparo do ouro coloidal 108
Anexo 16
POP procedimentos – Sensibilização de Membranas 113
xviii
Anexo 17
POP montagem do teste ML Flow 116
Anexo 18
Relatório do Controle de Qualidade 118
Anexo 19
Artigo Publicado Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 41 Supl.2 (2008) 121
xix
RESUMO
O teste rápido (ML Flow) que detecta anticorpos IgM contra o PGL-I, antígeno
específico do M. leprae, pode ser utilizado para auxiliar a classificação em hanseníase
paucibacilar (PB) e multibacilar (MB) e para identificação de contatos de pacientes MB
com risco elevado de desenvolver a doença. A distinção entre hanseníase PB e MB é
importante para a definição do esquema terapêutico adequado. Os programas de
controle da hanseníase empregam sistema de classificação, proposto pela OMS, baseado
na contagem do número de lesões com perda sensitiva. Esta abordagem simplificada,
sem a realização dos exames auxiliares de baciloscopia e histopatológico de lesão de
pele, pode levar ao subdiagnóstico ou a erros na classificação dos pacientes. A produção
do teste ML Flow originalmente realizada pelo Royal Tropical Institute/KIT/Holanda
foi descontinuada. No Brasil a disponibilidade de um teste auxiliar para classificar
pacientes, como o ML Flow, poderá contribuir para decisões terapêuticas adequadas
consideradas cruciais para interromper a cadeia de transmissão do M. leprae. A
implementação da plataforma automatizada para produção de testes rápidos no
IPTSP/UFG, durante a realização deste estudo, permitiu a padronização das condições
para produção do teste ML Flow utilizando tecnologia de imunocromatografia
empregando-se materiais e reagentes disponíveis no país. Duzentas amostras de soro de
pacientes MB e PB, de controles saudáveis e de pacientes com tuberculose de área
endêmica e não endêmica foram utilizados neste estudo. Foram testadas distintas
combinações de materiais, reagentes e programas de sensibilização, e baseados nos
resultados foram definidos os protocolos para produção do teste ML Flow-IPTSP. Todas
amostras foram avaliadas quanto a presença de anticorpos IgM anti-PGL-I utilizando-se
dois ensaios de referência (ELISA e teste ML Flow, KIT/Holanda) e o teste rápido ML
Flow-IPTSP. A concordância entre os resultados obtidos pelos ensaios de referência e o
ML Flow-IPTSP foi de 98%, (kappa 0,92). Amostras de soro com OD< 0,3 no ELISA
anti-PGL-I tiveram leituras do teste ML Flow negativas confirmando a capacidade deste
teste de detectar pacientes com títulos elevados de anticorpos anti-PGL-I, considerados
como hanseníase MB. Os resultados do presente estudo habilitam o IPTSP/UFG para a
produção de testes rápidos do tipo ML Flow, e indicam o seu potencial para atender a
demanda do Programa Nacional de Controle da Hanseníase. Além disso esta iniciativa é
importante para promover o papel da UFG no cenário nacional de Biotecnologia.
Palavras chave: Hanseníase, Biotecnologia, Cromatografia
xx
ABSTRACT
The ML Flow test, which detects IgM antibodies to PGL-I, a M. leprae specific
antigen, can be used to aid the classification of paucibacillary (PB) and multibacillary
(MB) leprosy and to indentify MB household contacts with a higher risk to develop the
disease. The discrimination between PB and MB leprosy is important to define the
appropriate drug regimen. Leprosy control programs employ a classification system,
proposed by WHO, based on counting the number of skin lesions with sensitive loss.
This simplified approach, which does not include complementary exams such as skin
smears or histopathology may lead to under diagnosis or miss classification. The
production of the ML Flow test, originally taken place at the Royal Tropical
Institute/KIT/Netherlands has been discontinued. The availability of a complementary
test to classify leprosy patients, such as the ML Flow, may contribute to appropiate
therapeutic decision, which is considered crucial to interrupt M. leprae transmission
chain. The implementation of an automated platform for the production of rapid tests at
IPTSP/UFG, which took place during this study, allowed the standardization of
conditions to produce the ML Flow test based on the lateral flow technology using
reagents and materials available in Brazil. Two hundred serum samples from leprosy
patients, healthy controls and tuberculosis patients from endemic and non-endemic
areas were tested. The presence of anti-PGL-I IgM antibodies was assessed by two
reference assays (ELISA and ML Flow test, KIT/Netherlands) and by the ML Flow-
IPTSP. After testing distinct combinations of reagents and materials and sensitization
protocols the final protocols for the production of the ML Flow test were established.
The agreement among the results obtained by the reference assays and the ML Flow
test-IPTSP was 98% (kappa 0,92). ML Flow results were negative for serum samples
with OD< 0,3 by anti PGL-I ELISA, confirming its capacity to discriminate patients
with higher antibody levels, known to be MB leprosy. The results obtained in this study
indicate that IPTSP/UFG is capable to produce the ML Flow test for leprosy and
indicate its potential to supply these tests for the National Leprosy Control Program.
Moreover it indicates that this initiative is also important to promote the institutional
role of UFG in the national biotechnology scenario.
Keywords: Leprosy, Biotechnology, Chromatography
21
1. INTRODUÇÃO
1.1. Diagnóstico de doenças infecciosas
O método mais seguro para se diagnosticar uma infecção é o isolamento e a
caracterização do agente infeccioso. Entretanto isto nem sempre é possível ou prático
por várias razões tais como; localização em sítios de difícil acesso (ex.: encéfalo) ou
pela inexistência de métodos simples, práticos ou seguros para o isolamento ou cultivo
(ex.: infecções por vírus, Mycobaterium leprae), ou devido ao uso de drogas que
impedem o crescimento do agente infeccioso in vitro (Banoo et al., 2006; WHO e TDR,
2010). Nessas circunstâncias, as técnicas de imunodiagnóstico são importantes
ferramentas que permitem confirmar a infecção através da presença de antígenos dos
agentes infecciosos ou, mais freqüentemente, a identificação de componentes das
respostas imunológicas como os anticorpos e os linfócitos (Guyatt et al., 1986).
Os métodos de imunodiagnóstico podem envolver precipitação, floculação,
aglutinação, imunofluorescência, testes imunoenzimáticos e radioimunoensaios. Cada
método apresenta aplicações e limitações próprias. A maioria das técnicas exige a
disponibilidade de equipamento especializado, manipulação de reagentes e podem
representar procedimentos demorados e que exigem treinamento específico. Diante
disso, as técnicas imunoenzimáticas, como ELISA, imunofluorescência e a
imunocromatografia se destacam como ferramentas simples e de fácil execução,
portanto, mais adequadas principalmente na realização de monitoramento de um grande
número de amostras (Nilufer and Boyacioglu, 2002; Korde et al., 2003; Lipigorngoson
et al., 2003; Lee et al., 2004).
1.2 Importância de testes de diagnóstico rápido
Testes de diagnóstico confiáveis e fáceis de utilizar são uma necessidade para o
controle de um amplo espectro de doenças incluindo HIV, tuberculose, malária, dengue,
esquistossomose, hanseníase entre outras. Alguns testes são complexos para serem
aplicados em áreas onde laboratórios são escassos ou mal equipados e onde os recursos
humanos receberam treinamento precário. Nestas circunstâncias há necessidade de
transporte de amostras ou vários deslocamentos do paciente até obter os resultados de
seus exames. Dependendo da disponibilidade de tempo e recursos financeiros o retorno
22
do paciente pode não acontecer acarretando em perda do seguimento ou falha no
tratamento (Peeling et al., 2006). O diagnóstico correto, rápido e precoce permite
intervenções apropriadas, prevenção de seqüelas, interrupção da cadeia de transmissão e
vigilância epidemiológica da infecção (Mabey et al., 2004).
Quando os sintomas não são claros ou suficientemente específicos para permitir
um diagnóstico puramente clínico, os testes rápidos podem apoiar decisões terapêuticas,
ou ainda confirmar ou excluir um diagnóstico baseado em sintomas inespecíficos. A
utilização de testes rápidos na vigilância epidemiológica de doenças pode ser útil desde
a identificação de casos assintomáticos, verificação da prevalência ou eliminação de
doenças em determinadas populações, sendo especialmente importantes na investigação
de surtos (Peeling et al., 2006). Além disso, o surgimento e aumento no número de
patógenos com mutações associadas à resistência a drogas como pode ocorrer na
malária, AIDS e tuberculose, indicam a necessidade de testes diagnósticos que
identifiquem cepas com resistência medicamentosa para se definir novas estratégias de
tratamento. Outra importante abordagem é o desenvolvimento de testes rápidos para
triagem inicial de infecção, especialmente em bancos de sangue e em programas de
prevenção de transmissão de mãe para filho de patógenos como os vírus HIV e o vírus
da Hepatite B (Peeling et al., 2006).
O desenvolvimento de testes imunocromatográficos para doenças infecciosas
comuns nos países em desenvolvimento pode ser considerado um tema negligenciado. A
produção e desenvolvimento de kits diagnósticos para doenças infecciosas
negligenciadas não representam prioridade para grandes empresas de biotecnologia,
pois a demanda concentra-se em países em desenvolvimento ou não exige uma
produção em escala. O envolvimento de fabricantes de pequeno porte e controle de
qualidade inadequado costumam ser frequentes e apesar de haver fabricantes
responsáveis, as informações acerca do desenvolvimento de testes podem não ser
confiáveis. De fato, a responsabilidade de avaliar os testes lançados no mercado que não
passam por processos de avaliação mais rigorosos acaba recaindo sobre os profissionais
de saúde, o que é eticamente inadequado (Ridley R.G., 2006). Além disso, é de
importância estratégica que instituições acadêmicas estejam envolvidas neste processo
de forma a conferir maior credibilidade e entendimento do significado dos processos de
avaliação de testes diagnósticos (WHO e TDR, 2010). A Organização Mundial de Saúde
(OMS) considera que o desenvolvimento de testes diagnósticos rápidos, práticos,
23
sensíveis, específicos e de baixo custo representa uma estratégia essencial para
tratamento adequado, monitoramento, vigilância e controle de doenças infecciosas,
incluindo verificação de eliminação da infecção. Acreditando no caráter promissor da
imunocromatografia, a OMS iniciou a montagem de bancos de amostras e organismos
para implementar programas de avaliação de testes rápidos para várias doenças
infecciosas. Esta iniciativa tem como exemplo o “Programme on Research and Training
in Tropical Diseases” (TDR) que desenvolve ações para fortalecer o controle de
doenças negligenciadas, incluindo a avaliação de testes rápidos para malária, sífilis,
clamídia, gonorréia e leishmaniose visceral e o “Global Programme on Aids” (GPA)
que foi responsável pela avaliação dos testes rápidos para HIV (Bell e Peeling, 2006;
WHO e TDR, 2010).
A escassez de opções de kits para o diagnóstico de doenças negligenciadas no
mercado, aliada ao reduzido acesso a testes diagnósticos de boa qualidade, contribuem
para a enorme carga nos serviços de saúde pública e nos programas de controle. A
disponibilidade de testes sensíveis e específicos, de fácil execução e que forneçam
resultados em curto espaço de tempo, permite redução de custos e maior eficiência no
diagnóstico e controle de doenças infecciosas consideradas negligenciadas. É
importante que estes testes possam ser utilizados diretamente pelos profissionais das
unidades básicas de saúde, que não requeiram equipamentos ou condições especiais de
armazenamento e que apresentem longo prazo de validade (Ridley R.G., 2006). O
investimento na área de desenvolvimento e comercialização de produtos nacionais
competitivos isentos de “royalties” e capazes de gerar divisas é considerado uma
prioridade na área de biotecnologia aplicada à saúde pública.
1.2.1. Testes Imunocromatográficos (Fluxo Lateral)
Um amplo número de testes de diagnóstico rápido baseados em princípios de
imunocromatografia para diversos fins estão disponíveis no mercado. O primeiro teste
foi desenvolvido para detecção de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Atualmente
existem testes disponíveis para monitorar a ovulação, detecção de agentes infecciosos,
drogas de abuso e medição de vários analitos importantes para a fisiologia humana.
Além destes produtos voltados para a área médica, existem testes rápidos voltados para
as áreas forense, ambiental e agropecuária. Enquanto que os testes inicialmente
desenvolvidos apresentavam resultados qualitativos (presença ou ausência) o desenho
24
dos testes tem sido aprimorado no sentido de fornecer resultados semi-quantitativos e
até quantitativos com a implementação de leitores eletrônicos (Ridley R.G., 2006).
A maioria dos testes imunocromatográficos é desenvolvida a partir de um
imuno-ensaio já existente. A imunocromatografia representa uma tecnologia inovadora
que concentra a reação antígeno-anticorpo em uma única fase sólida, podendo ser
mantida em temperatura ambiente e utilizada diretamente no momento do atendimento
ao paciente pelo agente de saúde. Além de possuir sensibilidade e especificidade
elevadas, a imunocromatografia possui baixo custo, pois não exige equipamento
específico para realizar o teste ou interpretar o resultado (Holland e Kiechle, 2005).
Existem vários formatos de testes imunocromatográficos e o mais utilizado é
composto por uma membrana de nitrocelulose para detecção. Esta membrana é
flanqueada em uma extremidade por uma zona receptora de reagente, constituída por
fibra de algodão ou celulose e uma microfibra de vidro contendo o reagente cromógeno
e na outra extremidade por uma zona de absorção (Figura 1). O reagente cromógeno
mais utilizado é composto por nanopartículas de ouro coloidal, um reagente mais
estável que reagentes fluorescentes ou enzimáticos (Tanaka et al., 2006). O reagente
detector (antígeno ou anticorpo) é inserido na forma de uma linha na membrana de
nitrocelulose, denominada linha teste. O alvo para o conjugado é depositado numa
segunda linha paralela à linha teste e funciona como controle do reagente. Este conjunto
é apoiado por um suporte e cortado em fitas com tamanho adequado para caber em
cassete plástico com um receptáculo circular para aplicação da amostra e uma janela
quadrada posicionada sobre a área de detecção. Os testes normalmente são lidos em 15
minutos após aplicação de amostras que podem ser sangue total, soro, urina, saliva, ou
outros líquidos corporais quando se consideram apenas as possibilidades clínicas do uso
da imunocromatografia (Nakamura e Karube, 2003).
25
Figura 1: Compontentes de um teste imunocromatográfico. Desenho
esquemático de um teste imunocromatográfico (fluxo lateral) montado em cassete
plástico (“Housing”) apresentando os filtros para amostra (“Sample Pad”) posicionado
abaixo do receptáculo da amostra (“Sample Port”), suporte do conjugado (“Conjugate
Pad”), e absorvente (“Absorbant Pad”), além da membrana de nitrocelulose
(“Membrane”) com as linhas teste (“Test Line”) e controle (“Control Line”).
1.2.2. Componentes de testes imunocromatográficos
Na escolha dos componentes para o desenvolvimento de um teste rápido devem
ser considerados os seguintes parâmetros: limite de detecção (sensibilidade),
especificidade, tempo de execução do teste, praticidade do protocolo de execução e
interpretação dos resultados, embalagem, armazenamento, validade e custo. A escolha
do filtro de amostra, suporte do conjugado e absorvente leva em consideração várias
características sendo o tempo de fluxo da amostra a principal delas.
1.2.2.1. Filtro de Amostra
O filtro de amostra tem várias funções, sendo que a mais importante é promover
a distribuição controlada e homogênea da amostra sobre o conjugado e a entrada da
solução contendo amostra e conjugado na membrana de nitrocelulose. Há dois tipos de
filtros para amostra, fibras de celulose ou malhas de algodão. Os filtros de celulose
apresentam uma capacidade de receber volumes maiores de amostra sem prejudicar a
uniformidade da dispersão e menor custo. Porém são mais frágeis e menos práticos de
manusear, mas ainda representam o tipo de filtro mais utilizado no desenvolvimento de
26
testes rápidos. Os filtros mais modernos, compostos por fibras mistas, são capazes de
reter as células vermelhas do sangue, liberando apenas o fluxo do plasma. Esta
propriedade confere uma vantagem na aplicação de amostras de sangue total sem que
haja interferência da pigmentação do sangue sobre a janela de leitura visual do teste
(Millipore, 2008).
A escolha do filtro de amostra leva em conta parâmetros que influenciam na taxa
de liberação da amostra, principalmente a espessura e gramatura do filtro e pressão
exercida dentro do cassete. Caso a amostra fique muito tempo em contato com o
conjugado, sem se expor aos antígenos e anticorpos impregnados na membrana, ocorre
competição entre as imunoglobulinas presentes na amostra e aquelas impregnadas na
linha controle. Isto dificulta a coloração da linha controle afetando a validade do teste. A
reação prolongada com o conjugado também limita a reação antígeno-anticorpo na linha
teste. Por outro lado, caso a amostra passe muito rapidamente pela zona de detecção, as
reações antígeno-anticorpo podem não ocorrer de maneira adequada. Portanto, o uso de
filtros inadequados afeta, em última análise a sensibilidade e especificidade do teste
(Millipore, 2008; Alshtrom, 2010).
1.2.2.2. Suporte do Conjugado
O suporte do conjugado ideal deve apresentar as seguintes características: (1)
baixa ligação não específica, evitando que o conjugado ou a amostra analisada fiquem
aderidos ao filtro do conjugado, de forma a reduzir a intensidade de coloração das linhas
do teste; (2) fluxo uniforme, garantindo que o conjugado corra e se deposite de maneira
homogênea ao longo da membrana permitindo o aparecimento de linhas uniformes; (3)
reter um volume homogêneo de material garantindo que todos os testes de um mesmo
lote apresentem a mesma concentração de conjugado (Millipore, 2008).
1.2.2.3. Membrana de nitrocelulose
A membrana de nitrocelulose é, possivelmente, o material mais importante no
desenvolvimento de um teste de fluxo lateral. Características físico-químicas da
membrana influenciam sua capilaridade, que por sua vez afeta o grau de deposição dos
reagentes, sensibilidade e especificidade do teste e a intensidade de coloração das linhas
teste e controle. A escolha da membrana mais adequada passa pelo estudo de uma série
27
de fatores, sendo a taxa de capilaridade o fator mais importante. Há uma correlação
direta entre a capilaridade e a sensibilidade de um teste. Por exemplo, podem ser usadas
membranas com alta capilaridade para testes em que haja excesso de amostra e a
sensibilidade não seja uma preocupação, como testes utilizados para confirmação de
suspeita diagnóstica (Ferreira e Ávila, 1996). Por outro lado, devem ser usadas
membranas de baixa capilaridade onde a amostra é limitada e/ou se exige alta
sensibilidade do teste como os testes utilizados em hemocentros para a exclusão de
eventuais diagnósticos (Figura 2) (Millipore, 2008).
Figura 2: Relação entre a taxa de capilaridade e sensibilidade das membranas de
nitrocelulose.
Adaptado de Millipore 2008.
1.2.2.4. Filtro Absorvente
O filtro absorvente é posicionado na extremidade distal da membrana de
nitrocelulose e tem como função principal aumentar o volume de amostra que adentra a
zona do teste. Este aumento do volume é importante, pois pode ser utilizado para lavar
partículas do reagente detector ligadas fracamente, reduzindo o número de ligações não
específicas (Millipore, 2008).
1.2.2.5. Cassetes plásticos
Muitos testes são fechados em cassetes plásticos, apesar de não ser uma
necessidade. O uso do cassete facilita o manuseio do teste, além de poder fornecer
informações adicionais como posição da linha teste e controle entre outras. O desenho
do cassete deve levar em conta os custos de produção, compatibilidade com o desenho
do teste, principalmente em se tratando dos componentes internos, tais como pinos e
barras para posicionamento adequado da tira de teste. O cassete ainda deve exercer
28
pressão ideal sobre a tira para facilitar o fluxo da amostra enquanto o teste é realizado.
Caso a pressão seja excessiva, o fluxo da amostra pode ser bloqueado (Millipore, 2008).
1.2.3. Processo de desenvolvimento de testes rápidos
O desenvolvimento de um teste rápido geralmente segue um caminho que se
inicia na identificação de alvos para o diagnóstico, como antígenos ou anticorpos
específicos e que possuam imunogenicidade conhecidas, escolha de reagentes e
componentes do teste com o desenvolvimento de um protótipo até este ser utilizado na
rotina médica (Figura 3). Estudos de “prova do princípio” são realizados para
determinar se o teste é capaz ou não de detectar o alvo diagnóstico pretendido. O
protótipo então é submetido a testagem com amostras conhecidas, chamadas “de
conveniência”, quando são avaliados parâmetros de sensibilidade, especificidade e
valores preditivos. Posteriormente o protótipo é submetido a avaliação com a população
alvo. Os resultados destes estudos são utilizados para se obter aprovação em órgãos
reguladores para que o teste possa ser comercializado. Após a aprovação e
comercialização do teste, podem ser realizados estudos de aplicabilidade e
implementação para demonstrar a custo-efetividade do teste (WHO e TDR, 2010).
Figura 3: O caminho no desenvolvimento e avaliação de testes rápidos.
Adaptado de Kettler et al. 2004.
1.2.3.1. Parâmetros de avaliação dos testes
Segundo Kettler et al. (2004) os seguintes parâmetros de um teste em
desenvolvimento devem ser avaliados:
Desempenho: A sensibilidade e especificidade, assim como valores preditivos
positivos e negativos de um teste em desenvolvimento são fatores importantes a se
considerar. É exigida alta sensibilidade de um teste a ser aplicado a doenças em que um
diagnóstico negativo implica em sérias consequências na epidemiologia da doença ou
29
para o paciente. Baixa especificidade importa menos nos casos em que o tratamento não
traz efeitos adversos, porém é uma desvantagem séria no caso do tratamento apresentar
toxicidade.
Praticidade: A complexidade e número dos procedimentos a serem realizados,
assim como necessidade de processamento do material biológico a ser utilizado como
amostra implicam no tempo de treinamento e supervisão.
Condições de uso e armazenamento: O teste deve ser de manuseio seguro, de
fácil execução, rápido, interpretação de resultados simples e não depender de
equipamentos especiais ou refrigeração. Em condições de calor e umidade elevadas a
preleção por testes resistentes condicionados em pacotes individuais com sílica é uma
prioridade.
Validade: Testes com validade prolongada reduzem a pressão na cadeia de
fornecimento e a probabilidade de desperdício de testes. Testes com validade superior a
18 meses são recomendados para atender áreas remotas e de recursos escassos.
1.2.3.2 Conceitos para validação de testes
Como os agentes infecciosos podem compartilhar seqüências antigênicas,
determinado antígeno utilizado em um teste de imunodiagnóstico pode apresentar
reatividade cruzada com anticorpos induzidos por outros agentes infecciosos. A
ocorrência de reações cruzadas dificulta a interpretação dos testes. Entretanto, o teste
deverá apresentar sempre títulos mais elevados na presença de anticorpos específicos
para o antígeno, que para anticorpos decorrentes de reatividade cruzada. Há, portanto,
necessidade de se estabelecer pontos-de-corte (“cut-off”) para cada técnica, ou seja, os
títulos (ou outra medida de quantificação) a partir dos quais os resultados positivos
indicam a presença de anticorpos específicos (Riegelman, 2000).
Para se medir a eficiência de testes para diagnóstico rápido, foram criados os
conceitos de sensibilidade e especificidade. A sensibilidade de um teste sorológico
refere-se à capacidade do teste em detectar corretamente amostras verdadeiramente
positivas, ou seja, a porcentagem de resultados positivos pelo teste na população de
indivíduos doentes (Altman, 1991).
30
A especificidade de um teste sorológico é definida pela porcentagem de
resultados negativos pelo teste nos indivíduos não doentes, ou seja, a habilidade do teste
em detectar amostras verdadeiramente negativas (Altman, 1991).
O Valor Preditivo de um Resultado Positivo (VPP) pode ser calculado pela
proporção de indivíduos doentes entre os resultados positivos obtidos no teste em
estudo, portanto se refere à probabilidade de doença quando o resultado do teste é
positivo (Altman, 1991).
O Valor Preditivo de Resultado Negativo (VPN) pode ser calculado pela
proporção de indivíduos não doentes entre os resultados negativos do teste em estudo,
portanto se refere à probabilidade de não ocorrência de doença quando o resultado do
teste é negativo (Altman, 1991).
Especificidade
verdadeiros negativos
verdadeiros negativos + falsos-positivos.
=
Valor Preditivo Positivo
verdadeiros positivos
verdadeiros positivos + falsos-positivos.
=
Sensibilidade
verdadeiros positivos
verdadeiros positivos + falsos-negativos.
=
31
Estes parâmetros precisam ser definidos baseados na aplicação do teste. Por
exemplo, testes utilizados para confirmar um diagnóstico, preferencialmente apresentam
uma alta especificidade, enquanto testes com alta sensibilidade são utilizados na
exclusão de um diagnóstico provável. No caso do nosso estudo, otimizamos um teste
para a hanseníase (ML Flow) por já dispormos de antígenos e anticorpos específicos
conhecidos e parâmetros de sensibilidade e especificidade já determinados.
1.3. Hanseníase: Agente Etiológico e Infecção
A hanseníase é uma doença granulomatosa crônica que apresenta uma variedade
de manifestações clínicas devido às diferentes formas de resposta imune ao agente
etiológico, o M. leprae (Scollard et al., 2006). O M. leprae é um bacilo álcool-ácido
resistente, de crescimento fastidioso, intracelular obrigatório com tropismo para células
de Schwann e macrófagos. Pesquisas a seu respeito foram dificultadas por este bacilo
não ser cultivável em meios artificiais.
Mediante estudos bioquímicos e de manipulação genética de cepas cultiváveis
como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis e
Mycobacterium bovis (BCG) obteve-se conhecimento sobre a composição de sua parede
celular (Scollard et al., 2006). Moléculas de glicolipídeos fenólicos (PGLs),
fosfatidilinositol e fosfolipídios são liberadas da parede celular destas micobactérias
após sua síntese, formando uma região semelhante à cápsula. O lipídio da parede celular
mais importante na especificidade imunológica até então identificado é o Glicolipídio
fenólico I (PGL-I). Estudos sugerem que o PGL-I esteja envolvido em interações do M.
leprae com a laminina de células de Shwann propondo um envolvimento desta
molécula nas interações do bacilo com as células nervosas (Ng et al., 2000;
Rambukkana, 2001).
Valor Preditivo Negativo
verdadeiros negativos
verdadeiros negativos + falsos-negativos.
=
32
Os mecanismos de transmissão da hanseníase não são completamente definidos.
Van Beers et al. (1999) demonstraram que a transmissão do M. leprae ocorre em
círculos concêntricos ao redor de um paciente, principalmente pacientes com alta carga
bacilar não tratados, semelhante ao modelo de “pedra no lago” descrito para
tuberculose. Características sócio-econômicas, sanitárias e climáticas precárias além de
predisposição genética também parecem desempenhar papel importante no
desenvolvimento da doença (Fine, 1982; Fine et al., 1988; Mira, 2006).
O período de incubação da doença é difícil de ser determinado, geralmente
prolongado, em média compreendendo entre 2 e 5 anos (Noordeen, 1985). Estudos
relatam a ocorrência da doença em recém nascidos (Montestruc e Berdonneau, 1954),
ou veteranos de guerra vivendo em áreas não endêmicas que manifestaram a doença até
30 anos depois de se exporem a regiões endêmicas por curtos períodos (Noordeen,
1985).
A hanseníase é uma doença polar que apresenta um amplo espectro de
manifestações clínicas e histopatológicas. Este espectro depende da capacidade do
hospedeiro em gerar uma resposta imunológica celular frente ao bacilo, primeiramente
descrita por Skinsnes (1964) como um “espectro imunológico”.
1.4. Classificação
Devido ao amplo espectro de manifestações clínicas, a hanseníase tem sido
classificada segundo suas características clínicas e histopatológicas por dois sistemas
principais, o de Madri (1953) e Ridley & Jopling (1966). No sistema de Madri
consideram-se dois pólos estáveis e opostos (virchowiano e tuberculóide) e dois grupos
instáveis (indeterminado e dimorfo). A classificação proposta por Ridley e Jopling é
utilizada em pesquisas e leva em consideração a imunidade dentro de um espectro de
resistência do hospedeiro. São descritas as formas polares tuberculóide (TT) e
lepromatosa (LL) e as formas instáveis que são subdivididas em borderline-tuberculóide
(BT), borderline-borderline (BB) e borderline-lepromatoso (BL) (Ridley e Jopling,
1966). Entretanto, os primeiros sinais da hanseníase dificilmente são notados por
pacientes ou até mesmo por profissionais da saúde e este grupo é denominado como
forma Indeterminada (Jopling, 1959).
Visando facilitar a classificação para fins de tratamento, a OMS introduziu em
33
1982 um sistema de classificação baseado na contagem do número de lesões cutâneas e
espessamento neural e incluía o exame baciloscópico, no fim da década de 90 esta
classificação foi simplificada levando em conta apenas o número de lesões cutâneas
(WHO, 1998b).
1.4.1 Classificação Clínica
Indeterminada (I)
Esta forma foi descrita por Jopling em 1959, e não foi incluída na classificação
apresentada por Ridley e Jopling em 1966. Os primeiros sinais da hanseníase
dificilmente são notados por pacientes ou até mesmo por profissionais da saúde. A
forma indeterminada se apresenta como poucas lesões pálidas (hipopigmentadas) ou
levemente eritematosas, a sensibilidade pode estar preservada ou pouco reduzida e
geralmente estão localizadas em áreas expostas da pele. Essas lesões podem se curar
espontaneamente ou evoluir para formas do espectro da doença (Jopling, 1959).
Forma tuberculóide (TT)
No pólo tuberculóide da doença as lesões são pouco numerosas, e geralmente
menores que 10 cm. Pálidas ou cor de cobre com margens bem definidas. A
hipopigmentação se deve a redução do número normal de melanócitos (Yawalkar S J.,
2002). As lesões TT apresentam bordas elevadas, ásperas, sem pêlos e demonstram
centro com sinais de regressão ou cura. A superfície da lesão é seca devido à deficiência
da sudorese. A perda de sensibilidade e cantos bem definidos das lesões são sinais
característicos da forma tuberculóide da hanseníase. Biópsias destas lesões apresentam
granulomas bem desenvolvidos que podem ser confluentes com raros bacilos
demonstráveis nos tecidos (Scollard et al., 2006).
O acometimento neural é mais comum no pólo tuberculóide (Croft et al., 2000).
É comum observar um nervo cutâneo espessado próximo à lesão. O acometimento pode
provocar perda de sensibilidade, dor, fraqueza muscular e até paralisia (Yawalkar S J.,
2002).
Lesões satélites indicam disseminação da doença devido ao declínio do
mecanismo de defesa do paciente e indicam migração para formas borderline da doença
(Yawalkar S J., 2002).
34
Formas Borderline (BT,BB,BL)
Pacientes com formas borderline podem ser classificados em Borderline
Tuberculóide (BT) Borderline Borderline (BB) e Borderline Lepromatoso (BL). São as
formas mais comuns encontradas em hanseníase. Se os pacientes com estas formas
instáveis da doença não forem tratados, a doença pode evoluir para o pólo lepromatoso.
Quanto mais próximo do pólo lepromatoso o paciente se encontra, mais
numerosas, menos definidas e anestésicas as lesões vão se tornando. Hipoestesia e perda
de pêlos são características de hanseníase borderline mais destacadas na forma
borderline tuberculóide. São nessas formas que se encontram os casos mais severos de
danos neurais (Yawalkar S J., 2002).
Forma Lepromatosa (LL)
Máculas aparecem numa fase inicial da forma lepromatosa e são geralmente
pequenas, numerosas e distribuídas simetricamente. Têm uma superfície brilhosa, de
margens indefinidas. As lesões se tornam mais evidentes após exposição à luz solar.
Como as lesões são assintomáticas, discretas no início e sem distinção, geralmente não
são percebidas pelos pacientes. Lesões infiltradas surgem numa fase mais tardia e a
agressão provocada pelo infiltrado origina nódulos. Os nódulos aparecem geralmente
nas orelhas, face, extremidades, articulações e raramente nas genitálias. Alguns
pacientes não passam pela fase de máculas e os primeiros sinais notórios de hanseníase
podem ser os nódulos, mais comuns nas orelhas. Nariz, testículos e olhos são
frequentemente afetados nesta forma da doença, afetando a qualidade de vida do
paciente (Yawalkar S J., 2002).
Pacientes com a forma LL apresentam uma anergia específica ao M. leprae e não
montam uma resposta imune celular frente ao bacilo, sem apresentar no entanto
deficiência da resposta imune celular a outros patógenos. Os mecanismos responsáveis
por esta anergia ao bacilo nos pacientes LL ainda não foram esclarecidos (Scollard et
al., 2006).
Forma Neural Pura (NP)
A forma neural pura é de difícil diagnóstico, pois não apresenta manifestação
cutânea e o bacilo é difícil de ser identificado. Além disso a biópsia de nervos é um
procedimento invasivo que requer profissionais altamente qualificados (Jardim et al.,
2003). A hanseníase NP caracteriza-se por déficit neural ou espessamento de nervos
35
periféricos. Prejuízo na sensibilidade cutânea, parestesia, dor neuropática e
espessamento neural são os sintomas mais comuns desse tipo de hanseníase (Rodrigues
et al., 1992; Jardim et al., 2003; Jardim et al., 2004; Jardim et al., 2005).
O nervo acometido pode se apresentar sensível à palpação ou espontaneamente
doloroso. A forma NP pode levar a parestesia, hipotonia e atrofia, particularmente dos
músculos das mãos e pés (Yawalkar S J., 2002).
1.4.2.Classificação operacional
Devido à variedade de manifestações clínicas da doença, a OMS recomenda o
uso de uma classificação clínica simplificada, baseada na contagem do número de
lesões de pele, para fins operacionais e de aplicação da poliquimioterapia (PQT) em
serviços de saúde pública. Essa classificação subdivide os pacientes em paucibacilares
(PB), que apresentam infecção localizada com até cinco lesões e em multibacilares
(MB) que apresentam seis ou mais lesões de pele (WHO, 1997).
1.5. Imunologia da Hanseníase
1.5.1. Imunidade Inata
O início da resposta imune inata é dado pelo reconhecimento de padrões
moleculares associados a patógenos (PAMPs), mediante um grupo de receptores
denominados receptores para reconhecimento de padrões (PRRs) presentes em células
do sistema imune inato. Um importante grupo de PRRs são os receptores semelhantes a
Toll (TLRs). Heterodímeros formados por TLR2 e TLR1 (TLR2/1) são ativados por
lipoproteínas triacetiladas presentes no M. leprae. (Brightbill et al., 1999; Aliprantis et
al., 1999; Means et al., 1999; Takeuchi et al., 2002). A associação entre polimorfismos
nas regiões codificadoras das moléculas de TLR2 ou TLR1 e suscetibilidade a
hanseníase foi descrita (Modlin, 2010).
Outros PRRs podem estar envolvidos na resposta imune inata frente a infecção
pelo M. leprae. Dois polimorfismos de uma única base de nucleotídio (SNPs) no gene
de TLR4 estão associados a efeito protetor contra hanseníase (Bochud et al., 2009). O
receptor TLR9 reconhece CpG DNA bacteriano, participando na resposta contra
36
micobactérias (Bafica et al., 2005). Estudos mostraram evidências de associação entre
polimorfismos no gene de TLR8 e resistência a tuberculose e estudos devem avaliar a
participação de TLR8 na suscetibilidade a hanseníase (Montoya e Modlin, 2010).
Receptores citoplasmáticos da família dos receptores semelhantes a NOD reconhecem
peptidoglicanos incluindo aqueles derivados de micobactérias como o muramil-
dipeptídio (MDP) (Yang et al., 2007). A relevância da participação de NOD2 na
resposta contra hanseníase foi demonstrada num estudo que identificou que SNPs de
NOD2 e RIP2 (molécula associada à via bioquímica de sinalização do NOD2) estão
associados à suscetibilidade à hanseníase com maior expressão nas formas MB (Zhang
et al., 2009).
Um mecanismo antimicrobiano importante na ativação de TLRs envolve a
ativação da CYP27b1, enzima que converte a pró-vitamina D (25D) na sua forma ativa
(1,25D), aumento da expressão do receptor de vitamina D (VDR) e indução da síntese
de catalecidinas, peptídios antimicrobianos (Wang et al., 2004; Liu et al., 2007;
Martineau et al., 2007; Krutzik et al., 2008). Polimorfismos na molécula do VDR ou
moléculas associadas a esta via metabólica como a defensina humana β1 (DEFB1) estão
associados à forma MB da hanseníase (Montoya et al., 2009; Prado-Montes de et al.,
2009).
Os PRRs também atuam promovendo a fagocitose, processo que envolve a
captação de partículas ou microrganismos em fagossomas. Vários PRRs da superfície de
macrófagos que identificam componentes de micobactérias já foram identificados,
como receptores de lectina tipo C, que reconhecem especificamente estruturas de
carboidratos encontradas na parede celular (Maeda et al., 2003) ou receptores do
complemento CR1, CR3 e CR4 (Kang e Schlesinger, 1998). O receptor CR3 pode
facilitar a fagocitose de micobactérias através de opsoninas do complemento ou através
de fagocitose mediada por lectinas, na presença do colesterol (Cywes et al., 1996;
Peyron et al., 2000). Geralmente, os fagossomas se desenvolvem e se fundem a
lisossomas promovendo a destruição da partícula ou microrganismo englobado. Porém,
alguns microrganismos, como o M. leprae possuem mecanismos para impedir esta
fusão, como a inibição da supressão de uma proteína rica em triptofano e aspartato
(TACO) induzida por TLR2 (Tanigawa et al., 2009). A TACO é responsável por inibir a
fusão dos fagossomas ao lisossoma e é expressa em altas concentrações em lesões de
pacientes MB (Suzuki et al., 2006).
37
O M. leprae ainda possui mecanismos de sobrevivência que desviam o
metabolismo de lipídeos do hospedeiro de forma a acumular fosfolipídeos oxidados no
interior de macrófagos. Estas moléculas são utilizadas pelo bacilo na síntese de seus
lipídios e fatores de virulência contribuindo para a patogênese da doença (Reed et al.,
2004; Jain et al., 2007).
Além da fagocitose, os macrófagos exercem atividade antimicrobiana na
eliminação de patógenos. Embora o infiltrado rico em macrófagos esteja presente nas
duas formas da hanseníase, nas lesões PB estas células estão ativadas e raramente
contêm bacilos. Nas formas MB, são encontrados inúmeros bacilos e a formação de
células xantomatosas denominadas células de Virchow, que resultam do acúmulo de
lipídios derivados principalmente do bacilo no interior dos macrófagos (Cruz et al.,
2008). O bacilo ainda possui mecanismos para inibir a atividade de reativos do oxigênio
no interior dos macrófagos, como a inibição da síntese de superóxidos provocada pelo
PGL-I (Chan et al., 1989) e a expressão de superóxido-dismutases SodA e SodC que
impedem a ação do óxido nítrico (Williams et al., 2004). O papel do óxido nítrico em
humanos é controverso, porém diversos estudos demonstraram a expressão da enzima
NO sintase induzida (iNOS) detectada por imunohistoquímica no sítio de lesões
causadas por agentes intracelulares a exemplo do M. leprae (Khanolkar-Young et al.,
1998).
Além dos macrófagos, as células dendríticas (DC), denominadas células
apresentadoras de antígeno profissionais (APC) são importantes mediadoras da resposta
imune inata durante a polarização da resposta imune adaptativa. As DC podem
processar e apresentar antígenos protéicos para células T CD8+ através de moléculas de
MHC de classe I, ou para células T CD4+ através de moléculas MHC de classe II. Além
disso, as células dendríticas podem apresentar antígenos não protéicos por meio da
molécula não polimórfica CD1 para linfócitos T restritos a esta molécula (linfócitos
Tγδ). Os linfócitos Tγδ específicos contra antígenos lipídicos de micobactérias
produzem altos níveis de IFN-γ e possuem atividade citolítica contra alvos CD1+
(Sieling et al., 1995).
A captura de bacilos pelas APC com subsequente apresentação para linfócitos T
e síntese de citocinas e quimiocinas controlam a inflamação no sítio de invasão e
polarizam a resposta imune adquirida (Maeda et al., 2005). As APC podem secretar
citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-12 e IL-15. Estas citocinas vão instruir uma
38
resposta adaptativa do tipo Th1 (Modlin, 2010). Os macrófagos podem secretar
citocinas como a IL-4 e IL-10, que vão induzir programas inibitórios nas células
efetoras da imunidade inata e adquirida (Cruz et al., 2008; Montoya et al., 2009).
1.5.2. Imunidade Adquirida
O espectro clínico apresentado pela hanseníase é explicado pelos diferentes
padrões de resposta imune desenvolvida frente à infecção (Ridley e Jopling, 1966). As
células T exercem um papel importante na resistência contra o M. leprae, como
evidenciado em estudos utilizando camundongos timectomizados ou geneticamente
atímicos (Colston e Hilson, 1976). Citocinas produzidas principalmente por células T
como IL-2, IFN-γ, e linfotoxina são predominantes em lesões de pacientes PB, porém
estão praticamente ausentes em lesões de pacientes MB. Por outro lado, ocorre
produção mais proeminente das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 em lesões lepromatosas
quando comparadas ao pólo tuberculóide. Estes dados revelam dois padrões bem
estabelecidos da resposta imune frente a infecção pelo M. leprae. Citocinas
características de respostas do tipo Th1 estão presentes em lesões de pacientes PB que
conseguem limitar o crescimento do bacilo. Por outro lado, citocinas correspondentes a
resposta imune do tipo Th2 são abundantes em lesões do pólo MB que apresentam
grande quantidade de bacilos. A resposta imune do tipo Th2 não é eficaz para limitar a
replicação do bacilo. O perfil de citocinas presentes nas lesões TT e LL reflete a
resposta imune do tipo Th1 e Th2 associadas respectivamente com resistência e
suscetibilidade à doença (Yamamura et al., 1991).
Além de padrões de citocinas bem definidos, em lesões de pacientes PB,
observa-se o dobro de células T CD4+ em relação a células T CD8+. Já no pólo MB
observa-se o dobro de células T CD8+ em relação a T CD4+ é encontrado. As células T
CD4+ encontradas em lesões de pacientes do pólo PB secretam principalmente IFN-γ,
enquanto que em lesões de pacientes MB, estas secretam IL-4 que suprime a resposta
imune inibindo a ativação de macrófagos (Salgame et al., 1991). Attia et al. encontraram
níveis aumentados de células T reguladoras (Treg) em pacientes do pólo TT em
comparação ao pólo LL. Segundo este estudo, a atividade reguladora das células Treg
seria benéfica para pacientes de hanseníase (Attia et al., 2010). O papel destas células
Treg na patogenia da hanseníase não está esclarecido.
39
Células T CD8+ e CD4+ podem atuar como células citotóxicas restritas ao MHC
de classe I e de classe II, respectivamente sendo que ambas conseguem induzir apoptose
de macrófagos infectados pelo M. leprae. (Chiplunkar et al., 1986; Kaleab et al., 1990;
Hancock et al., 1991). A apoptose de células infectadas ocorre mediante perforinas e
proteases como a granzima B, encontrada em linfócitos T e células NK. Outra proteína
importante envolvida na defesa contra bactérias tanto na hanseníase como na
tuberculose, é a granulisina encontrada em linfócitos T citotóxicos (Stenger et al., 1998;
Ochoa et al., 2001).
Estudos sobre a expressão de citocinas em hanseníase descreveram parâmetros
da polarização da doença, na qual as lesões do pólo tuberculóide podem ser
consideradas manifestações de hipersensibilidade tardia enquanto que as lesões
lepromatosas são caracterizadas por evidente produção de anticorpos, mas com
incapacidade de montar uma resposta imune celular eficaz. Entretanto os mecanismos
envolvidos na polarização da resposta imune do tipo Th1 e Th2 e na modulação da
resposta celular ao longo do espectro clínico da doença não foram ainda totalmente
esclarecidos (Scollard et al., 2006).
1.6. Incidência e prevalência da hanseníase
Em 1985, o número estimado de casos de hanseníase no mundo era de 12
milhões de pessoas, correspondendo a uma prevalência de 19 casos para 10.000
habitantes (Noordeen, 1985). Em 2000, essa prevalência atingiu taxa de menos de um
caso para cada 10.000 habitantes, com 597.000 novos casos (Britton e Lockwood,
2004).
Dados da OMS mostram que a prevalência global de hanseníase registrada no
ano de 2009 foi de 211.903 casos, com 244.796 novos casos detectados. Apesar da
drástica redução no número de casos registrados nas últimas duas décadas, a incidência
da doença tem caído lentamente. Em 2009, a Ásia apresentou a maior taxa de detecção,
9,39 casos por 100.000 habitantes, seguida das Américas com 4,58 casos por 100.000
habitantes. Nestas regiões os dados foram fortemente influenciados pelo número de
casos notificados pela Índia com 133.717 novos casos. No Brasil 37.610 casos novos
foram notificados em 2009 representando o segundo país em número de casos que
correspondem a 93% do total de casos novos nas Américas (2010).
40
O declínio apresentado na prevalência de hanseníase com a implementação de
terapias cada vez mais curtas não foi acompanhado de um declínio da incidência,
indicando que a prevalência é um parâmetro inadequado para se avaliar o controle da
infecção. A taxa de detecção representa um parâmetro mais condizente por refletir a
agilidade diagnóstica em função da incidência real. A redução da relação entre a taxa de
detecção e a incidência real resulta em aumento no número de casos não diagnosticados
(prevalência oculta), considerados os maiores responsáveis pela transmissão da doença
(Penna et al., 2008b).
1.7. Controle de Hanseníase
O controle de uma doença infecciosa envolve redução na incidência e na
prevalência da mesma, e por consequência na mortalidade e morbidade. A OMS,
considera a hanseníase eliminada como problema de saúde pública ao se atingir
globalmente uma prevalência inferior a um caso por 10.000 habitantes. O programa de
controle da hanseníase no Brasil tem como meta a detecção de novos casos e tratamento
por PQT incluindo estratégias dos sistemas de saúde que visam diagnóstico, tratamento,
aconselhamento familiar e do paciente, educação da comunidade, prevenção de
deficiências, reabilitação e tratamento de complicações (2010).
Uma crítica a implementação do controle da hanseníase aos sistemas de saúde é
a atuação de profissionais pouco experientes para realizar o diagnóstico e classificação
da doença. Isso ocorre principalmente em regiões em que a hanseníase é considerada
eliminada, e nas quais a doença não é incluída no diagnóstico diferencial (Bührer-
Sékula et al., 2000; Lockwood e Reid, 2001).
Os profissionais de saúde dos programas de controle da hanseníase poderiam se
beneficiar com ferramentas laboratoriais ou testes que fossem eficazes e simples para
auxiliar no diagnóstico precoce, para o monitoramento da terapia ou detecção de
recidiva e para identificar pacientes com risco de reações hansênicas. Estes testes
poderiam contribuir para interromper a cadeia de transmissão podendo auxiliar na
redução da prevalência oculta da doença, considerada a maior responsável pela
transmissão silenciosa (Bührer-Sékula et al., 2000; Penna et al., 2008b).
Contatos domiciliares de pacientes com hanseníase, especialmente das formas
MB estão em risco aumentado para o adoecimento. Evidências apontam para a
41
possibilidade de transmissão da doença na fase pré-clínica e também sobre a possível
infectividade de casos PB (Klatser et al., 1993; Swain et al., 2004). Estudos mais
recentes ressaltam evidências de transmissão extra-domiciliar em áreas hiperendêmicas
e sugerem a ampliação das ações de intervenção para contatos extra-domiciliares
próximos, especialmente os contatos consanguíneos (Meima et al., 1999a; Meima et al.,
1999b; Meima et al., 2004; Calado K et al., 2005; Meima et al., 2008).
Estudos relatam proteção de populações com maior risco de adoecer de
hanseníase, por meio do uso da quimioprofilaxia com uma ou duas doses de
Rifampicina (Moet et al., 2004a; Moet et al., 2004b; Moet et al., 2008). Na nova
estratégia global de controle da doença proposta pela OMS para o período 2011-2015 é
recomendado que as áreas endêmicas avaliem o uso da quimioprofilaxia, de modo a
possibilitar acúmulo de experiência em diferentes contextos (WHO, 2010). No Brasil,
estão sendo realizados estudos de “clusters” para avaliar a eficácia desta estratégia
(Goulart et al., 2008; Penna et al., 2008a).
1.8. Diagnóstico
O diagnóstico de hanseníase é clínico e baseia-se no achado de um ou mais
sinais cardinais (WHO, 1997) como presença de lesões com perda de sensibilidade,
nervos periféricos espessados e presença de bacilo álcool-ácido resistente. A detecção
de bacilo álcool-ácido resistente por baciloscopia tem alta especificidade, mas baixa
sensibilidade já que cerca de 70% dos pacientes apresentam resultado negativo
(Lockwood et al., 2002). Porém este exame é importante, pois pode identificar pacientes
MB que apresentam maior capacidade de transmissão do bacilo e aqueles com maior
risco de recidiva (Britton e Lockwood, 2004) e reações (Verhagen et al., 1999).
A doença ainda pode se apresentar sob a forma neural pura, sem manifestações
cutâneas e escassos bacilos mesmo onde a biópsia de nervos está disponível (Jardim et
al., 2005). A hanseníase neural pura caracteriza-se por déficit neural ou espessamento de
nervos periféricos, prejuízo na sensibilidade cutânea, parestesia e dor neuropática
(Rodrigues et al., 1992; Jardim et al., 2005).
O teste com o uso de monofilamentos para detecção de alterações de
sensibilidade nas lesões apresenta limitações, principalmente quando realizado em
crianças muito novas, adultos incapazes de compreender as instruções dadas antes de
42
sua execução (Araújo, 2003).
Em áreas não endêmicas, é muito comum não considerar a hanseníase no
diagnóstico diferencial podendo levar à detecção tardia de casos (Lockwood e Reid,
2001). Este atraso no diagnóstico pode trazer consequências para os pacientes, como
dano neural irreversível e sequelas em vários graus até a deficiência física (Britton e
Lockwood, 2004).
1.9. Tratamento
O tratamento de hanseníase tem mudado ao longo dos anos. Na década de 1940
a dapsona foi desenvolvida e introduzida na terapia da hanseníase com regime de 100
mg diárias por um período mínimo de 5 anos para tratar pacientes PB e durante toda a
vida para pacientes MB. Até recentemente esta forma de tratamento ainda era utilizada
em algumas áreas (WHO, 1998a).
Na década de 1960 o M. leprae começou a desenvolver resistência a dapsona e
em 1981 a OMS recomendou a introdução da PQT (WHO, 1998a). As drogas
combinadas na PQT incluem a rifampicina, clofazimina e dapsona. Inicialmente, o
tratamento se estendia até a negativação da baciloscopia, sendo limitado, posteriormente
a duração de 24 doses para pacientes MB e seis doses para PB colocando limite à
terapia que antes era por toda a vida e dificultava a adesão dos pacientes. Estudos
posteriores revelaram que a terapia poderia ser mais reduzida resultando em
recomendação de um regime de doze doses para pacientes MB, administradas em até
dezoito meses e seis doses para pacientes PB, administradas em até nove meses (WHO,
1997). A OMS está avaliando a possibilidade de introduzir uma terapia uniforme de 6
doses com rifampicina, clofazimina e dapsona, independente da classificação dos
pacientes.
Quando a PQT é administrada adequadamente, as recidivas são raras, porém o
acompanhamento continuado dos pacientes é importante na vigilância à resistência
medicamentosa. Pacientes que iniciam o tratamento com índice baciloscópico (IB) mais
alto estão mais sujeitos a recidivar. A maioria das recidivas acontece muito tempo após
o término do tratamento, às vezes até mais de 10 anos.
43
1.10. Reações Hansênicas
Episódios reacionais são as maiores complicações em hanseníase podendo
ocorrer em pacientes virgens de tratamento, durante e/ou após tratamento (Naafs, 2000)
e geralmente deixam sequelas. Reação tipo I ou reação reversa (RR) é um episódio de
inflamação aguda na pele e nervos periféricos resultado de uma hipersensibilidade
tardia contra antígenos do bacilo que ocorre em até 30% dos pacientes (Rego et al.,
2007). A reação tipo II geralmente se manifesta como eritema nodoso (ENH) ou
multiforme e pode ocorrer em pacientes do pólo lepromatoso. Reação do tipo II se
apresenta como um quadro febril debilitante com o aparecimento de nódulos papulares
cutâneos acompanhado de inflamação nos nervos, olhos e testículos (Britton e
Lockwood, 2004).
Os diferentes tipos de reação parecem ter mecanismos imunológicos distintos
que ainda são pouco compreendidos.
1.11. Recidiva
A recidiva é consequência de multiplicação e dispersão de bacilos sobreviventes
ao tratamento. O diagnóstico de recidiva é feito através de IB aumentado e a presença
de bacilos íntegros, que pode ser confirmada mediante a inoculação em patas de
camundongo para comprovar a presença de bacilos viáveis (Waters et al., 1986;
Ratledge et al., 1989).
O diagnóstico de recidiva é mais difícil nos pacientes PB, pois seus sinais e
sintomas em muito se assemelham aqueles de reação reversa. Alguns profissionais de
saúde diferenciam recidiva de RR baseados na velocidade do aparecimento dos
sintomas já que a recidiva se estabelece mais gradualmente. Porém, os pacientes
geralmente não sabem dizer se os sinais apareceram ou não de forma gradual.
Diferenciar recidiva de reação tem importância na terapêutica já que a recidiva é tratada
com um novo regime de PQT e reação hansênica com corticoesteróides (Becx-
Bleumink, 1992).
Um parâmetro empregado para diferenciar recidiva de RR é o tempo após fim do
tratamento. Sinais que aparecem dentro de 5 anos após término de PQT são
provavelmente devido à reação e aqueles que aparecem após esse período,
possivelmente representam recidiva (Pannikar et al., 1989). Porém, sabe-se que reações
44
podem ocorrer em pacientes até mesmo dez anos após término de tratamento e não há
dados para afirmar até quando reações tardias podem ocorrer (Pannikar et al., 1989;
Jamet et al., 1994; Jamet e Ji, 1995; Shaw et al., 2000; Shetty et al., 2001; Baohong,
2001; Cellona et al., 2003).
1.12. Exames laboratoriais
Existem poucos exames laboratoriais utilizados na rotina para auxiliar no
diagnóstico da hanseníase, a saber, baciloscopia, histopatologia, teste de Mitsuda,
sorologia e reação em cadeia da polimerase (PCR). O teste considerado padrão ouro
para o diagnóstico de hanseníase é o exame histopatológico de biópsia da borda de lesão
onde podem ser reconhecidos padrões histopatológicos característicos, o envolvimento
de nervos e a presença do bacilo. A baciloscopia é considerada um exame semi-
quantitativo da carga bacilar do paciente (Scollard et al., 2006).
1.12.1. Histopatológico
Os resultados do exame histopatológico de lesões de pele de pacientes de
hanseníase diferem de acordo com a classificação destes pacientes. Em resumo, lesões
de pacientes tuberculóides (TT) apresentam granulomas compostos por células
epitelióides ao redor de elementos neurovasculares e invadindo a zona papilar. Nos
casos borderline (BT, BB e BL) o granuloma é mais difuso que nos casos TT com uma
zona papilar não envolvida. Em pacientes lepromatosos (LL) as lesões apresentam
hansenomas frouxos constituídos principalmente por histiócitos (célula de Virshow).
Uma zona normal de colágeno (Faixa Una) separa a região do infiltrado da epiderme
(El-Darouti et al., 2006).
1.12.2. Baciloscopia
O M. leprae pode ser encontrado na microscopia de raspados intradérmicos ou
material de biópsia corados pela técnica de Ziehl-Neelsen. O M. leprae apresenta-se
como um bacilo curvo com cerca de 0.3µm de espessura e 1-8µm de comprimento,
isolado ou em agrupamentos característicos chamados globias. A carga bacilar é
expressa como um IB que relata o número de bacilos por campo microscópico em
45
escala logarítmica (Scollard et al., 2006). Geralmente o material de quatro sítios
(lóbulos auriculares esquerdo e direito, cotovelos direito e esquerdo ou lesão) é
analisado e a carga bacilar é expressa pelo IB médio dos quatro sítios analisados
(Ministério da Saúde, 2010).
1.12.3. PCR
A identificação do M. leprae pela PCR é usada para fins de pesquisa e não é
recomendado como teste diagnóstico (WHO, 2000). O teste pode ser realizado com
vários tipos de amostras biológicas como pêlo, sangue, secreção nasal e linfa (Santos et
al., 1993), porém, fragmentos de biópsia de pele e nervos, parecem ser de maior
sensibilidade para a amplificação do DNA do bacilo (Gillis e Williams, 1991;
Chemouilli et al., 1996). A sensibilidade do teste com pacientes PB dificilmente
alcança 50%, somado ao custo elevado da técnica, inviabilizando seu uso em países
onde a hanseníase é endêmica, sendo mais útil para esclarecer casos suspeitos em países
onde a doença é rara. Porém, como ainda não existem métodos de cultura do bacilo
disponíveis, a PCR se apresenta como uma ferramenta robusta para a detecção do bacilo
em situações clínicas específicas ou ensaios experimentais (Chemouilli et al., 1996;
Katoch, 2004; Singh et al., 2004; Kramme et al., 2004; Parashar et al., 2006).
1.12.4. Sorologia
As técnicas sorológicas têm como alvo a detecção de anticorpos específicos
contra o M.leprae que reflitam a infecção. Testes sorológicos podem ser úteis no
monitoramento da eficácia de terapia, na determinação da prevalência da doença e na
avaliação da distribuição da infecção em determinada comunidade (Bührer-Sékula et al.,
1998; Moura et al., 2008).
A primeira geração de testes sorológicos descritos para hanseníase foi
constituída pelo radioimunoensaio (RIA) utilizando o antígeno 7 (Melsom et al., 1978),
o teste de imunofluorescência (FLA-ABS) utilizando extrato bruto do M. leprae (Abe et
al., 1980) e a hemaglutinação passiva (PHA) (Jagannath e Sengupta, 1981).
Posteriormente, ensaios imunoenzimáticos (ELISA) utilizando antígenos brutos ou
diferentes proteínas do M. leprae ou outras micobactérias foram descritos (Brett et al.,
1983; Young e Buchanan, 1983; Cho et al., 1984; Douglas e Worth, 1984; Bach et al.,
46
1986; Aguado et al., 1986; Gonzalez-Abreu e Gonzalez, 1987; Hasan et al., 1989).
A descoberta e elucidação da estrutura química do PGL-I, antígeno específico do
M.leprae em 1981 (Hunter e Brennan, 1981), e descrição da sua imunogenicidade em
1982 (Payne et al., 1982), permitiram inovações na área de sorologia em hanseníase. A
molécula do PGL-I é composta por um trissacarídeo, o 3,6-di-O-metil-β-D-
glicanopiranosil-(1→4)-2,3-di-O-metil-α-L-ramnopiranosil-(1→2)-3-O-metil-α-L-
ramnopiranose (Figura 4) e o principal determinante imunogênico é a porção terminal
da molécula. Estudos com anticorpos monoclonais demonstraram que a remoção da
porção glicídica da molécula removeu sua capacidade de se ligar a anticorpos enquanto
a longa cadeia de ácidos graxos não possui efeito imunogênico. Estes e outros
resultados indicaram que a porção sacarídea do PGL-I poderia ser aplicada na sorologia
da hanseníase. Pela dificuldade em se obter grandes quantidades do PGL-I natural, se
avaliou a opção de produção de análogos sintéticos. A porção do açúcar foi sintetizada e
acoplada a molécula de albumina bovina (BSA) ligadas diretamente ou através de
radicais de fosfato (P) ou octil (O). Os seguintes análogos sintéticos foram produzidos:
monossacarídeo ligado à BSA por um braço octil (M-O-BSA) (Fujiwara et al., 1987),
dissacarídeo ligado diretamente à BSA (D-BSA) (Gigg et al., 1985), dissacarídio natural
ligado à BSA por um braço octil (ND-O-BSA) (Chatterjee et al., 1986) e trissacarídio
natural ligado à BSA por um radical fosfato (NT-P-BSA) (Fujiwara et al., 1987).
Figura 4: Estrutura química do PGL-I. O principal determinante imunogênico
é a porção terminal da molécula.
A maioria dos estudos envolvendo o PGL-I utilizou a técnica de ELISA, uma
técnica in-house com protocolo bem definido (Brett et al., 1986). Apesar padronização
47
do teste ser relativamente difícil, o baixo custo do ELISA e os resultados quantitativos
tornaram a sorologia anti-PGL-I amplamente utilizada na pesquisa. Além do ELISA,
foram desenvolvidos ensaios rápidos anti-PGL-I, como o Dipstick (Bührer-Sékula et al.,
1998) e ensaios imunocromatográficos de fluxo lateral - ML Flow (Bührer-Sékula et al.,
2003) e ML ICA (Dr. Ray Cho comunicação pessoal) - que são testes mais simples que
o ELISA e com resultados reprodutíveis, pois dispensam o emprego de equipamentos
laboratoriais ou técnico de laboratório especializado.
Estudo de revisão (Moura et al., 2008) discutiu a utilização da sorologia anti-
PGL-I no controle da hanseníase como ferramenta para classificação dos pacientes,
monitoramento de terapia, diagnóstico e predição de reações e recidiva e busca ativa de
casos entre contatos.
A utilização da sorologia como ferramenta para classificação certamente
reduziria o número de pacientes tratados como MB (Bührer-Sékula et al., 2007) pois
vários estudos demostraram que pacientes com hanseníase no pólo lepromatoso do
espectro produzem grandes quantidades de imunoglobulinas do tipo IgM específicas
contra este antígeno (soropositividade de 80-100%). Por outro lado, pacientes no pólo
tuberculóide apresentam imunoglobulinas específicas em níveis baixos de detecção
(soropositividade em torno de 30%) (Chatterjee et al., 1986; Petchclai et al., 1988;
Chanteau et al., 1989b; Hussain et al., 1990; Klatser et al., 1996; Bührer-Sékula et al.,
1998; Bührer-Sékula et al., 2003; Parkash, 2009).
Em situações em que testes laboratoriais como a baciloscopia e histopatologia
não estão disponíveis, existe uma forte tendência em classificar pacientes como MB. Na
Nigéria 95,7% dos pacientes foram tratados como MB, sendo que somente 19% o
seriam se o critério de classificação da OMS fosse rigorosamente seguido (Bührer-
Sékula et al., 2007). Outro exemplo de dificuldades na classificação de pacientes é
discutido por Declercq (2009) que relata o fato de que nas Filipinas, em 2007 foram
notificados 61% de pacientes MB entre os casos novos diagnosticados aumentando para
90% no ano seguinte.
Os métodos sorológicos anti-PGL-I também podem ser úteis no monitoramento
da terapia. Na maioria dos pacientes os níveis de anticorpos anti-PGL-I caem com o
tratamento, sendo mais acentuada no início do tratamento (Cho et al., 2001) e
geralmente os níveis caem 25 a 50% anualmente (Douglas et al., 1988; Klatser et al.,
1989; Cho et al., 1991; Chaturvedi et al., 1991; Roche et al., 1993). A redução nos
48
níveis de anticorpos varia amplamente entre os pacientes sendo que pode ser linear e
negativar rapidamente ou levar anos após término da terapia (Gelber et al., 1989).
Alguns estudos avaliaram a utilidade da sorologia anti-PGL-I no diagnóstico e
predição de reações hansênicas e recidiva, porém não foi possível identificar fatores de
risco diferenciais para o aparecimento de episódios reacionais após alta e de recidiva.
Na reação pós alta, pacientes com sorologia PGL-I positivo no momento da alta
apresentaram chance 10,4 vezes maior de desenvolver reação quando comparados aos
pacientes com sorologia negativa (Brito et al., 2008). Em ensaio clínico para avaliação
de novos esquemas terapêuticos para hanseníase, a soropositividade anti-PGL-I
mostrou-se importante na predição do risco de recidiva. Apenas um dos nove pacientes
diagnosticados como recidiva não tinha sorologia positiva no início do tratamento e era
um caso de resistência a droga (Bührer-Sékula et al., 2001).
O uso da sorologia anti-PGL-I como ferramenta auxiliar no diagnóstico de
reação tipo I ou II durante o tratamento não se mostrou eficiente, pois níveis
semelhantes de anticorpos podem ser encontrados em pacientes com e sem reação e até
mesmo na população saudável (Stefani et al., 1998). Porém, pacientes com altas
concentrações de IgM anti-PGL-I no início do tratamento apresentaram um risco maior
de desenvolver reação do tipo I. Desta forma a sorologia anti-PGL-I pode identificar
pacientes para monitoramento e tratamento precoce podendo reduzir o dano neural e a
incapacidade (Roche et al., 1991).
A alta prevalência de soropositivos para PGL-I entre contatos de pacientes de
hanseníase MB evidencia que infecção subclínica com M. leprae parece ser comum
(Menzel et al., 1987; Desforges et al., 1989; Saad et al., 1990). A soropositividade anti-
PGL-I está relacionada à classificação do paciente envolvido (Desforges et al., 1989;
Soebono e Klatser, 1991; Chanteau et al., 1993). A detecção de anticorpos contra o
PGL-I identificando contatos infectados sem sinais clínicos aparentes pode ser uma
ferramenta auxiliar para os programas de controle da hanseníase. Estudo realizado no
Rio de Janeiro verificou benefício da descentralização do atendimento pelo incremento
da detecção de novos casos, ampliando a precocidade do diagnóstico e
consequentemente reduzindo o número de pacientes incapacitados (Cunha et al., 2007).
Os resultados da sorologia anti-PGL-I não podem ser utilizadas como testes de
diagnóstico, mas podem ser utilizadas no processo do diagnóstico quando associados
aos dados clínicos. A detecção de anticorpos anti-PGL-I pode ser útil na classificação
49
dos pacientes PB e MB de hanseníase, pois o nível de anticorpos em pacientes PB é
baixo ou indetectável (Bührer-Sékula et al., 2003). Em estudo que avaliou a
possibilidade de implementar o uso do teste ML Flow na rotina dos programas de
controle de saúde se constatou que o teste poderia reduzir o percentual de erro de
classificação e consequentemente o tratamento insuficiente diminuindo a necessidade da
realização do teste baciloscópico (Bührer-Sékula et al., 2007). Estes resultados
ressaltam a importância de um teste simples, de fácil execução e leitura para o sistema
de saúde. A geração de resultados em pouco tempo e com baixo custo poderá auxiliar no
diagnóstico e classificação correta dos pacientes de hanseníase para fins de tratamento.
50
2. JUSTIFICATIVA
Um sistema de classificação da hanseníase focado apenas na contagem do
número de lesões cutâneas pode levar a um sub-diagnóstico de casos de hanseníase MB.
Em situações nas quais os resultados da baciloscopia não estão disponíveis,
profissionais de saúde tendem a super-diagnosticar hanseníase MB numa tentativa de
evitar tratamento insuficiente. Nos programas de controle da hanseníase, um teste que
possa ser realizado no momento do atendimento e na presença do paciente para detectar
anticorpos IgM contra o PGL-I poderia ser usado para orientar decisões terapêuticas.
Pacientes com hanseníase PB e MB apresentam diferentes riscos para reações
hansênicas, comprometimento neural, recidiva e incapacitação. A distinção entre
pacientes com carga bacilar alta e baixa é importante para orientar a conduta clínica
apropriada.
O teste ML Flow não está disponível no mercado. Há falta de interesse por parte
das companhias multinacionais em produzir testes de baixa demanda. Na área da
pesquisa há interesse pelo teste ML Flow, além disto, existe uma demanda do Programa
Nacional de Controle da Hanseníase (PNCH), Secretaria de Vigilância da Saúde (SVS),
Ministério da Saúde (MS) na produção destes testes.
Neste contexto, a padronização e produção do teste rápido ML Flow utilizando
tecnologia de imunocromatografia com materiais disponíveis no Brasil poderá atender
demanda do PNCH/MS e suprir projetos de pesquisa. A disponibilização do teste rápido
ML Flow pelo Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), Universidade
Federal de Goiás (UFG), a ser utilizado como ferramenta para classificação da
hanseníase PB e MB e identificação de contatos com risco elevado de desenvolver
hanseníase não só viabilizará a oferta de testes no mercado como também promoverá a
UFG como um importante parceiro do MS ampliando o seu papel no cenário nacional
de Biotecnologia.
51
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Padronizar as condições para produção do teste rápido para classificação da
hanseníase, ML Flow utilizando tecnologia de imunocromatografia (fluxo lateral) com
materiais disponíveis no Brasil.
3.2. Objetivos específicos
1. Padronizar o teste ML Flow utilizando a plataforma de produção e
materiais disponíveis no Brasil mantendo as características de
sensibilidade e especificidade do teste de referência.
2. Estabelecer o sistema de controle de qualidade do teste ML Flow com
amostras de soro de pacientes de hanseníase do Brasil.
3. Gerar um produto que esteja pronto para ser produzido em escala no
Brasil, atendendo a demanda do Programa Nacional de Controle da
Hanseníase, SVS/MS.
52
4. MÉTODOS
4.1. Desenho do estudo
Trata-se de um estudo de pesquisa translacional, ou seja, possibilitar a aplicação
de resultados das pesquisas básicas na rotina dos serviços de saúde.
O projeto de produção do teste ML Flow no IPTSP/UFG foi programado para
ser realizado em três fases. Na fase I foram sensibilizadas membranas de nitrocelulose e
comparadas com as membranas sensibilizadas no Koninklijk Instituut voor de Tropen –
Instituto Real Tropical (KIT BR) em Amsterdã, utilizando 200 amostras de pacientes e
controles. O conjugado utilizado nesta fase foi produzido e impregnado em microfibra
de vidro no KIT BR (lote 080610TM).
Na fase II foram produzidas nanopartículas de ouro coloidal conjugadas a
anticorpos da classe IgM, material que foi comparado àquele produzido no KIT BR
utilizando as mesmas amostras de soro da fase I. Estabelecidos padrões de qualidade da
sensibilização das membranas e da produção do conjugado e a fase III compreenderá
avaliação da sensibilidade e especificidade do teste completamente produzido no
IPTSP/UFG e está fora do escopo deste estudo.
Para a padronização do teste ML Flow (fases I e II) as amostras de soro foram
agrupadas de acordo com a presença de anticorpos IgM detectados por ELISA em
amostras negativas (OD<0,100), zona indeterminada (OD entre 0,101 e 0,299) e
positivas (OD entre 0,300 e 0,900) ou fortemente positivas (OD>0,901)
desconsiderando os grupos em estudo e a classificação clínica dos pacientes de
hanseníase.
4.2. Banco de amostras testadas
4.2.1. Amostras de soro para fase I, fase II e Controle de Qualidade.
Foram utilizadas 52 amostras de pacientes de hanseníase não tratados,
diagnosticados no município de Ananindeua, Pará (Instituto Evandro Chagas), no
período de março de 2008 a fevereiro de 2010. Foram também incluídas 65 amostras de
indivíduos considerados controles sadios e 26 portadores de tuberculose, moradores de
áreas consideradas endêmicas para hanseníase. Os controles sadios de área endêmica de
53
hanseníase foram profissionais de saúde do Hospital Eduardo de Menezes, Belo
Horizonte – MG, policiais, doadores de sangue e voluntários da população geral, sem
sintomas clínicos de doenças.
A população estudada de área não endêmica de hanseníase foi constituída de 27
pacientes de tuberculose atendidos no “Servicio de Medicina Interna do Hospital Del
Salvador”, em Santiago do Chile (Universidad de Chile, Sede Oriente) e 30
profissionais de saúde do referido serviço, sem sintomas clínicos de doenças.
Tabela 1: Descrição dos grupos estudados
País Grupo N
Brasil Hanseníase 52
Controle 65
Tuberculose 26
Chile Controle 30
Tuberculose 27
Total 200
As coletas das amostras biológicas foram realizadas por pesquisas prévias e
foram devidamente aprovadas pelos respectivos Comitês de Ética e Pesquisa do
Instituto Evandro Chagas (Anexos 1 e 2), do Hospital Eduardo de Menezes, Fundação
Hospitalar do Estado de Minas Gerais, (Anexo 3) pelo Comitê de Ética do Hospital Del
Salvador, em Santiago do Chile (Anexo 4) e pelo Comitê de Ética e Pesquisa da
Universidade Federal de Minas Gerais (Anexos 5 e 6).
Esta pesquisa, incluindo a utilização do banco de amostras de soro coletadas por
pesquisas prévias incluía autorização dos participantes para utilização das amostras em
estudos sorológicos posteriores e foi devidamente aprovada pelo comitê de Ética e
Pesquisa do Hospital das Clínicas de Goiânia e pelo Comitê Nacional de Ética e
Pesquisa (CONEP) (Anexo 7).
4.2.1.1. Critérios de inclusão
1- Casos novos de hanseníase diagnosticados por clínico experiente no
diagnóstico de hanseníase.
54
2- Indivíduos sem sintomas clínicos de hanseníase e outras doenças, e sem
contato conhecido com pacientes de hanseníase.
4.2.1.2. Critérios de exclusão
1- Indivíduos que não aceitaram participar da pesquisa.
2- Menores de 18 anos.
4.3. Procedimentos
As amostras de sangue coletadas por venopunção foram centrifugadas a 4000
rotações por minuto (rpm) por 3 minutos, aliquotadas e armazenadas em freezer -20ºC.
Amostras de sangue foram manuseadas de acordo com as normas de biossegurança e os
materiais utilizados foram devidamente descartados conforme as normas da Vigilância
Sanitária (Ministério da Saúde, 2004; Sociedade Brasileira de Patologia Clínica /
Medicina Laboratorial, 2005).
Todas as amostras de soro foram submetidas aos testes para detecção de
anticorpos IgM anti-PGL-I, ML Flow e ELISA, utilizando o antígeno NT-P-BSA. Estes
testes foram realizados no Laboratório de Imunologia da Aids e da Hanseníase do
IPTSP/UFG.
A leitura do teste sorológico ML Flow foi realizado visualmente e os resultados
registrados de modo qualitativo (positivo ou negativo) e semi-quantitativo (zero, 0.5,
1+, 2+, 3+ e 4+) segundo descrito por Bührer-Sékula et al. (Bührer-Sékula et al., 2003).
4.3.1. Teste de ELISA para detecção de anticorpos anti PGL-I no soro
Teste de ELISA para detecção de anticorpos IgM contra o PGL-I do M. leprae
foi realizada como descrito anteriormente (Brett et al., 1986) usando NT-P-BSA como
análogo sintético do PGL-I. O antígeno foi diluído com base na sua concentração de
açúcar (0,01 µg de açúcar/ml) em tampão volátil de acetato de amônia carbonado (pH
8.2). Placas para ELISA (Nunc Maxisorp) foram sensibilizadas e deixadas para secar
em temperatura ambiente. BSA foi usado como controle na sensibilização das placas.
Os sítios não sensibilizados pelo antígeno nas placas foram bloqueados por incubação
de 60 minutos com solução de PBS 1% (m/v) BSA. Após quatro lavagens com PBS
55
0,1% (v/v) Tween-20 (PBST), adicionou-se soro diluído 1:300 em PBST contendo 10%
(v/v) soro normal de cabra (NGS). As placas foram incubadas a 37oC por 60 minutos,
seguido por outro passo de lavagem. Conjugado anti IgM humana ligada a peroxidase
(Capple) foi adicionado diluído a 1:2000 em PBST-10% NGS. Após incubação a 37oC
por 60 minutos, o procedimento de lavagem foi repetido o substrato líquido (Sigma) foi
adicionado a cada poço. Visando controlar a variação intra teste, um soro de referência
foi incluído em quadruplicata em cada placa. A reação foi interrompida adicionando-se
H2SO4 quando a densidade óptica (OD) do soro de referência atingia um valor de 0.6 a
450 nm. Todas as amostras de soro foram testadas em duplicata e os resultados de
ELISA foram expressos como a média de absorbância das duplicatas. O valor final de
OD foi calculado subtraindo do valor de OD de cada soro frente ao PGL-I a média dos
valores de OD obtidos para cada amostra nos poços sensibilizados com BSA,
considerados ligações inespecíficas (Bührer-Sékula et al., 1998).
Os protocolos operacionais padronizados para execução do teste de ELISA, bem
como para o preparo de soluções utilizadas estão em anexo (Anexos 8 ao 14).
4.3.2. Teste sorológico ML Flow
O teste ML Flow é composto por uma fita de nitrocelulose para detecção. Esta
fita é flanqueada em uma extremidade por uma zona receptora de amostra constituída
por fibra de celulose e uma fita de microfibra de vidro contendo o anticorpo anti IgM
humana marcado com ouro coloidal e na outra extremidade por uma zona de absorção.
O NT-P-BSA (Fujiwara et al., 1984) foi usado como antígeno e foi impregnado na
forma de uma linha na fita de nitrocelulose. IgM humana foi impregnada em linha
posterior paralela à do antígeno e funciona como controle do reagente. A composição
foi apoiada por um suporte e cortado em fitas de 5 mm de largura para encaixar no
cassete plástico. O cassete utilizado possui um receptáculo circular posicionado sobre o
filtro da amostra, onde se aplica a amostra e uma janela quadrada posicionada sobre a
área de leitura. A quantidade de antígeno e reagente de detecção foram padronizados
passo-a-passo usando um painel de soros controles positivo e negativo para anti-PGL-I.
56
4.3.2.1. Protocolo de execução utilizado na padronização do teste ML
Flow
Amostras de soro na quantidade de 5 μl foram adicionadas. Para diluir a amostra
e iniciar o fluxo do teste foram adicionados 130 μl de líquido de solução tamponada
(PBS). Neste procedimento pode-se observar o fluxo da amostra através de uma linha
de coloração rubi movendo-se em direção das zonas de teste e controle. A leitura dos
resultados foi realizada visualmente após dez minutos.
4.3.2.2. Interpretação do teste sorológico ML Flow
O teste ML Flow só é válido se houver coloração da linha controle. A linha teste
deverá corar quando o teste for positivo, o que revela a presença dos anticorpos IgM
específicos para o PGL-I do M. leprae na amostra testada (Bührer-Sékula et al., 2003).
O resultado negativo é indicado pela ausência de uma linha na faixa do teste e a
presença de uma linha na faixa de controle (Figura 5). Se houver a presença de uma
linha tênue na faixa de teste, o resultado é considerado negativo (quantificado como
0,5+), já que o objetivo do teste é detectar indivíduos com carga bacilar relativamente
alta. A positividade do teste é quantificada em 1+, 2+, 3+ e 4+, considerando-se a
intensidade da pigmentação registrada na linha teste (Bührer-Sékula et al., 2003).
Figura 5: Interpretação de teste imunocromatográfico ML Flow
Adaptado de Bührer-Sékula et al. 2003.
57
4.3.2.3. Preparo de nanopartículas de ouro coloidal
Nanopartículas de ouro coloidal com 40nm de diâmetro foram produzidas
segundo protocolo confidencial padronizado no IPTSP-UFG (anexo 15). O tamanho das
partículas foi determinado por leitura em espectrofotômetro utilizando a função de
escaneamento óptico passo a passo com leitura entre 400 e 600nm (wavelength scan). A
solução de ouro coloidal foi armazenada a 4ºC e protegida da luz ambiente.
4.3.2.4. Conjugação de nanopartículas de ouro coloidal a anticorpos
Nanopartículas de ouro coloidal foram conjugadas a anticorpos seguindo
protocolo confidencial padronizado no IPTSP-UFG. A quantidade de imunoglobulina
anti-IgM humana necessária para estabilizar a conjugação foi determinada seguindo
dois protocolos diferentes, sendo um desenvolvido no KIT-BR e outro desenvolvido por
Slot e Geuze (Slot and Geuze, 1985). Os sítios livres nas partículas de ouro coloidal
foram bloqueados com uma solução de BSA 10%. O conjugado de ouro coloidal foi
imediatamente impregnado em microfibra de vidro para manter sua estabilidade e as
tiras de microfibra de vidro foram armazenadas em temperatura ambiente, protegidas da
luz e umidade.
4.3.2.5. Sistema de Impregnação utilizado no preparo do teste ML Flow
Para a produção e desenvolvimento de kits diagnósticos rápidos no IPTSP-UFG
foi realizada a aquisição de uma plataforma computadorizada de dispensação de
antígenos e conjugados (BioDot). Esta plataforma utiliza sistema de seringas
dispensadoras a ar comprimido. As seringas de alta resolução possibilitam dispensar
com precisão por “spray” uma quantidade de microlitros por milímetro quadrado de
material com precisão (Figura 6).
O sistema de impregnação de “BioJet Lines®” dispensa pequenas gotas em
sequência de forma a traçar uma linha. Definir um programa de sensibilização envolve
padronizar vários parâmetros que são, entre outros, taxa de dispensação em µl/cm
(Rate), tamanho da gota em nl (Drop) e intervalo entre uma gota e outra em mm (Pitch).
Os parâmetros citados são os mais importantes na definição das linhas do teste
desenvolvido e podem interferir na sensibilidade e especificidade do teste. Um exemplo
58
de programação para sensibilização com BioJet® está apresentado na Figura 7.
A plataforma computadorizada conta também com um sistema de AirJet®
responsável por realizar as impregnações por spray, como no caso da impregnação do
conjugado de ouro coloidal a IgM em tiras de microfibra de vidro.
Figura 6: Plataforma dispensadora da série XYZ BioDot.
Fonte: BioDot 2009
Figura 7: Exemplo de programa para sensibilização por BioJet Lines®.
Fonte: BioDot 2009
59
4.3.2.6. Treinamento para produção e Controle de Qualidade dos testes
O aluno realizou treinamento com participação ativa na produção de testes em
Novembro de 2009 no departamento de produção da empresa Biotecnologia Industrial
(BTI) sediada na Incubadora de Empresas BioMinas em Belo Horizonte. No período,
foram montados na BTI 250 cartões sensibilizados pelo KIT BR e adquiridos com o
apoio da Fundação Nacional de Saúde através do processo 25000.638904/2009-80. Esta
produção resultou em aproximadamente doze mil testes dos lotes ML7-002 e ML7-002-
1, disponíveis para pesquisadores de todo o país. Além disso, esta produção forneceu as
bases para implementação do sistema de controle de qualidade do ML Flow no IPTSP,
utilizando o sistema original do KIT-BR como referência.
4.3.2.7. Controle de Qualidade dos testes produzidos
Cada etapa de produção do teste ML Flow passa por um controle de qualidade
para o qual foram definidos os seguintes requisitos (Bührer-Sékula et al., 2003):
Especificidade: Os testes produzidos devem apresentar resultados negativos em
100% das amostras negativas no teste de ELISA anti-PGL-I.
Sensibilidade: Os testes devem apresentar os resultados designados a cada
amostra testada. No mínimo 25% mas não mais de 50% das amostras correspondentes a
zona indeterminada poderão apresentar resultados fracamente positivos.
Fluxo: A área de leitura dos testes deve estar limpa após 10 minutos. É tolerado
um fundo rosa claro desde que a linha do controle esteja claramente legível.
Tempo: O tempo de fluxo, ou seja, tempo que a amostra/conjugado levam para
atingir a janela de leitura não pode ser superior a 2 minutos.
4.4. Análise Estatística
Para aferir a confiabilidade do teste ML Flow produzido no Brasil (ML Flow-
IPTSP/UFG), foi avaliada a concordância entre a sua leitura e do teste ML Flow de
referência (ML Flow-KIT).
A concordância entre os testes sorológicos foi avaliada pelo índice de Kappa e,
para a interpretação deste índice, foram utilizados os critérios de Landis & Koch, 1977,
60
(Landis e Koch, 1977) como mostrado na tabela abaixo:
Tabela 2: Índice de Kappa
Índice de Kappa Grau de concordância
< 0,00 POBRE
0,00 – 0,20 MUITO LEVE
0,21 – 0,40 LEVE
0,41 – 0,60 MODERADO
0,61 – 0,80 SUBSTANCIAL
0,81 – 1,00 QUASE PERFEITO
Fonte: LANDIS; KOCH, 1977.
61
5. RESULTADOS
5.1. Classificação das amostras de acordo com a presença de anticorpos contra o
PGL-I em ELISA
A presença de anticorpos IgM contra o PGL-I em todas as amostras foi
determinada e quantificada por ELISA. A partir da quantificação de anticorpos, as
amostras foram agrupadas segundo resultados da Tabela 3.
Tabela 3: Classificação das amostras de acordo com a presença de anticorpos
contra o PGL-I em ELISA
Grupos ELISA PGL-I N
Negativos <0,100 139
Indeterminadas 0,101 a 0,299 24
Positivo 0,300 a 0,900 24
Fortemente Positivas >0,901 13
Total 200
5.2. Resultados da fase I do projeto
Na fase I foram sensibilizadas membranas de nitrocelulose e comparadas com as
membranas sensibilizadas no KIT BR utilizando 200 amostras de pacientes e controles.
Os materiais utilizados para montagem do teste foram definidos nesta fase do estudo. O
conjugado utilizado nesta fase foi produzido e impregnado em microfibra de vidro no
KIT BR (lote 080610TM).
5.2.1. Padronização do programa para impregnação da linha controle e
linha teste do ML Flow.
A impregnação das linhas controle e teste na membrana de nitrocelulose depende
de uma série de parâmetros programáveis que podem afetar diretamente o resultado dos
testes. O programa de dispensação foi definido após definição das concentrações e dos
parâmetros de dispensação das soluções de anticorpos e de antígeno, utilizadas como
controle e teste respectivamente.
62
5.2.1.1. Dispensação da linha controle
Para padronização da linha controle, utilizou-se uma solução contendo IgM
humana a 0,5 mg/ml (Sigma). Vários testes foram realizados utilizando diferentes
programas como exemplificado na tabela 4 até que se adquirisse uma linha semelhante
àquela do teste ML Flow KIT (Figura 8).
Figura 8: Resultados de testes obtidos na padronização da linha controle.
Diferentes programas de sensibilização (Ctrl X, Y e Z) foram utilizados até se conseguir
um padrão de coloração semelhante ao teste de referência (ML Flow KIT).
Tabela 4: Parâmetros para otimização da linha controle.
Ctl X Ctl Y Ctl Z
Rate (µl/cm) 0,875 0,6 1,0
Drop (nl) 35,0 21,0 35,0
Pitch (mm) 0,40 0,35 0,35
On time (ms) 0,30 0,30 0,30
Exemplos de programas para sensibilização da linha controle (Ctl). O parâmetro
“Rate” se refere ao volume de material dispensado por centímetro; “Drop” se refere ao
volume de cada gota dispensada; “Pitch” se refere ao espaço entre as gotas dispensadas
e “On time” se refere ao tempo de abertura e fechamento da válvula de dispensação.
Os dados apresentados na figura 8 exemplificam parâmetros utilizados na
padronização da linha controle. Os parâmetros utilizados no protocolo final são
considerados confidenciais.
63
5.2.1.2. Dispensação da linha teste
A padronização da linha teste empregou uma solução de antígeno NT-P-BSA
(lote Nara XVI 61) a 2,5µg/ml. A otimização da linha teste visou obter uma linha com
características semelhantes a do teste de referência e com a mesma capacidade de
detecção. Os dados apresentados na tabela 5 exemplificam parâmetros utilizados na
padronização da linha teste, os parâmetros realmente utilizados no protocolo final são
classificados como confidenciais.
Tabela 5: Parâmetros para otimização da linha teste.
Ag X Ag Y Ag Z
Rate (µl/cm) 1,5 0,6 1,0
Drop (nl) 50,0 21,0 35,0
Pitch (mm) 0,35 0,35 0,35
On time (ms) 0,30 0,30 0,30
Exemplos de programas para sensibilização da linha teste (Ag). O parâmetro
“Rate” se refere ao volume de material dispensado por centímetro; “Drop” se refere ao
volume de cada gota dispensada; “Pitch” se refere ao espaço entre as gotas dispensadas
e “On time” se refere ao tempo de abertura e fechamento da válvula de dispensação.
5.2.1.3. Protocolo do programa de sensibilização do teste ML Flow
Após experimentos com diferentes programas de sensibilização e diferentes
concentrações das soluções de antígeno e de anticorpos, foi definido o protocolo final
de sensibilização da membrana de nitrocelulose para o teste ML Flow (Anexo 16). Foi
empregada no final uma combinação de parâmetros que gerassem linhas teste e controle
com intensidade de coloração e espessura das linhas e capacidade de detecção e
reprodutibilidade semelhantes ao teste de referência.
5.2.2. Montagem dos testes ML Flow
Devido à descontinuação da fabricação dos filtros utilizados no protocolo
original, foi necessária a testagem de novos filtros que se adequassem ao padrão do teste
de referência. Experimentos de seleção do filtro de amostra, absorvente e membrana de
nitrocelulose foram realizados empregando-se diferentes combinações de filtros e
membranas.
64
5.2.2.1. Seleção do filtro de Amostra
Cinco tipos de filtros de amostra foram testados, sendo dois da marca Millipore
e três da marca Ahlstrom. Os filtros da marca Alshtrom só foram testados na fase II do
estudo, pois durante o andamento da fase I apenas os filtros da marca Millipore estavam
disponíveis. Resultados dos experimentos para escolha do filtro de amostra estão
demonstrados na tabela 6. O filtro que se mostrou mais adequado foi o Alshtrom 02, já
que os demais retêm a amostra prolongando o tempo de incubação com o conjugado,
interferindo nos resultados finais. O filtro Alshtrom 01 apresentou um fluxo mais rápido
em comparação ao teste de referência. Os resultados apresentados na tabela 6
representam a média dos resultados de 10 testes montados com cada filtro. Quando
utilizou-se o filtro Alshtrom 02 o tempo de corrida do teste e de leitura dos resultados
foi compatível com o teste de referência.
Tabela 6: Experimentos para escolha do filtro de amostra.
Filtro de Amostra Tempo 1 Tempo 2 Leitura
Millipore 01 5'20" 7'00" >15'
Millipore 02 1'30" 3'00" 15'
Alshtrom 01 0'45" 1'30" 10'
Alshtrom 02 1'00" 2'00" 10'
Alshtrom 03 1'45" 2'50" 10'
Teste referência 1’00” 2'00" 10'
Os resultados representam a média dos resultados de 10 experimentos com cada filtro. A
coluna Tempo 1 se refere ao tempo medido desde a aplicação da amostra até o momento
em que o conjugado foi visualizado na janela de leitura. A coluna Tempo 2 se refere ao
tempo medido desde a aplicação da amostra até o preenchimento total da janela de
leitura. A coluna Leitura se refere ao tempo necessário para a leitura dos resultados.
5.2.2.2. Seleção da membrana de nitrocelulose
As membranas de nitrocelulose são definidas pela sua capilaridade. A
capilaridade determina a velocidade com a qual a amostra se move ao longo da
membrana. Há uma correlação direta entre a capilaridade da membrana e a sensibilidade
de um teste.
Foram testados três tipos de membrana de nitrocelulose, todas da marca
Millipore por estarem disponíveis no Brasil. Portanto, a membrana indicada no
protocolo original não foi alterada por manter o padrão de capilaridade do teste de
65
referência.
5.2.2.3. Protocolo final de montagem do teste ML Flow
Após testadas as combinações de filtros e membranas, foi definido um protocolo
de montagem dos testes (Anexo 17). No que diz respeito às distâncias entre os
componentes do teste, não foi necessário realizar alterações no protocolo de montagem
original. A sobreposição de membranas e filtros permaneceu em 1 mm. Os
comprimentos do filtro de amostra permaneceu de 17 mm, do suporte do conjugado de
10 mm e do filtro absorvente de 27 mm.
5.2.3. Comparação entre os resultados do teste ML Flow-IPTSP e ML Flow-
KIT
Para avaliar o desenvolvimento do teste ML Flow produzido no IPTSP/UFG,
cada etapa de produção passou por teste comparativo com os testes ML Flow do lote
ML5-017 produzidos pelo KIT BR. Na tabela 7 são apresentados resultados da
comparação entre o teste produzido na UFG com os parâmetros definidos na fase I e o
teste de referência. A concordância entre os testes ML Flow IPTSP e o teste de
referência foi de 98% com índice kappa superior a 0,8.
Tabela 7: Concordância entre as leituras do teste ML Flow-IPTSP (fase I) e ML Flow-
KIT
ML Flow KIT
Pos Neg Total
ML Flow
IPTSP
Pos 27 3 30
Neg 1 169 170
Total 28 172 200
Valor de kappa: 0,9194 (concordância de 98%) Desvio Padrão de κ: 0,0706
Na figura 9 observamos que as quatro amostras que apresentaram resultados
discordantes tiveram leituras muito próximas e a diferença entre os resultados foi de
apenas um ponto, ou seja score 1+ considerado positivo e 0,5 considerado negativo. As
amostras ML Flow IPTSP positivo e ML Flow KIT negativo são do grupo de pacientes
de hanseníase. A amostra com resultado ML Flow IPTSP negativo e ML Flow KIT
positivo pertence ao grupo de pacientes de tuberculose de área endêmica.
66
Figura 9: Resultados discordantes entre ML Flow IPSTP e ML Flow KIT.
5.2.4. Comparação entre os resultados do teste ML Flow-IPTSP e ELISA
Como pode ser observado na tabela 8, o teste ML Flow IPTSP apresenta uma
correlação de 94,5% com o teste ELISA (kappa superior a 0,8). Apenas duas amostras,
ambas de pacientes de hanseníase, apresentaram resultados positivos no teste ML Flow
e negativos no teste ELISA considerando-se um valor de OD 0,300 como ponto de
corte. A maioria dos resultados discordantes (9/11) se refere à amostras com OD
superior a 0,300 que se mantiveram negativas no teste ML Flow.
Tabela 8: Concordância entre as leituras do teste ML Flow IPTSP (fase I) e ELISA
PGL-I
Elisa >0,300
Pos Neg Total
ML Flow
IPTSP
Pos 28 2 30
Neg 9 161 170
Total 37 163 200
Valor de kappa: 0,8032 (concordância de 94,5%) Desvio Padrão de κ: 0,0569
5.3. Resultados da fase II do projeto
Na fase II do projeto foram produzidas nanopartículas de ouro coloidal
conjugadas a anticorpos anti-IgM humana, material que foi comparado ao lote
080610TM produzido no KIT BR utilizando as mesmas amostras da fase I.
67
5.3.1. Produção de nanopartículas de ouro coloidal
Nanopartículas de ouro coloidal com 40nm de diâmetro foram produzidas
segundo protocolo confidencial desenvolvido no KIT BR e adaptado no IPTSP/UFG. O
tamanho das partículas foi determinado por meio de leitura em espectrofotômetro
utilizando a função de escaneamento ótico passo a passo com leitura entre 400 e 600nm
(“wavelength scan”). Segundo o protocolo operacional padrão, a leitura deve apresentar
um pico entre 524 e 526, com absorbância aproximada de 1.2, determinando diâmetro
das partículas em 40nm. O gráfico da leitura está apresentado na figura 10 indicando o
pico de leitura em 526nm com absorbância de 1,175. A solução de ouro coloidal
produzida no IPTSP/UFG foi armazenada a 4ºC e protegida da luz ambiente.
Figura 10: Leitura da absorbância da solução de ouro coloidal. O pico de leitura
(524 - 526nm, absorbância ~ 1.2) indica que as partículas de ouro coloidal apresentam
um diâmetro de 40nm.
5.3.2. Conjugação de nanopartículpas de ouro coloidal a anticorpos
A conjugação de nanopartículas de ouro coloidal a anti-IgM humana foi
realizada seguindo o protocolo confidencial desenvolvido no KIT-BR. Os resultados das
primeiras avaliações não foram satisfatórios. Portanto houve necessidade de revisão de
todo o protocolo original. Revisamos a diluição final do conjugado para impregnação,
expressa pela sua absorbância com finalidade de determinar qual seria a diluição mais
adequada para o uso no teste ML Flow. As definições deste parâmetro são consideradas
confidenciais.
Outro parâmetro do protocolo que foi revisado se refere à quantidade mínima de
anti-IgM necessária para estabilizar a conjugação. Este parâmetro foi avaliado
utilizando dois protocolos distintos e ambos apontaram para uma mesma quantidade de
68
proteína, dez vezes superior à indicada no protocolo original.
5.4. Controle de Qualidade dos testes ML Flow-IPSTP
Os testes produzidos foram submetidos a controle de qualidade utilizando-se
banco de amostras conhecidas e classificadas de acordo com a presença de anticorpos
IgM anti-PGL-I detectados por ELISA (Tabela 3) e pelo teste ML Flow de referência. O
sistema de controle de qualidade implementado no IPTSP utilizou como referência o
sistema original do KIT-BR, utilizado na avaliação do lote ML7-002 produzido em
novembro de 2009. Os testes produzidos durante a fase I deste trabalho foram
considerados aprovados com os seguintes resultados no controle de qualidade:
Todas as amostras negativas apresentaram score 0. Dentre as amostras da zona
indeterminada 21,4% (3/14) apresentaram resultados fracamente positivos (1+). A janela
de leitura foi preenchida pelo conjugado em no máximo 3 minutos em 100% dos testes,
possibilitando a leitura entre 10 e 15 minutos. Durante a fase II, foram testados novos
filtros de amostra que reduziram o tempo de preenchimento da janela de leitura para um
máximo de 2 minutos possibilitando a leitura dos resultados em 10 minutos. Com estas
características, o teste produzido foi considerado aprovado. A tabela 9 resume os
resultados dos testes de controle de qualidade. O relatório completo do controle de
qualidade do teste ML Flow produzido durante a fase I está em anexo (Anexo 18).
Tabela 9: Síntese dos resultados do controle de qualidade dos testes ML Flow
produzidos na fase I
Tipo de Amostra Score
Total T1 médio T2 médio 0 0,5 1 2 3 4
Negativo 5 1 0 0 0 0 6 1'36" 2'10"
Indeterminadas 3 8 3 0 0 0 14 1'33" 2'29"
Positivo 0 1 6 1 0 0 8 1'24" 2'30"
Fortemente Positivo 0 0 1 0 2 1 4 1'34" 2'44"
Total 8 10 10 1 2 1 32 1'30" 2'28"
A coluna T1 médio se refere ao tempo médio desde a aplicação da amostra até a
visualização do conjugado na janela de leitura. A coluna T2 médio se refere ao tempo
médio desde a aplicação da amostra até o preenchimento total da janela de leitura.
69
6. DISCUSSÃO
Dentre as linhas de pesquisa visando aprimorar o controle de doenças
infecciosas o desenvolvimento de vacinas, novos tratamentos e de ferramentas
auxiliares no diagnóstico e acompanhamento de pacientes são considerados prioritários
(Ridley R.G., 2006). Métodos diagnósticos eficazes, seguros e fáceis de usar são
importantes no controle de um amplo espectro de doenças, principalmente as doenças
consideradas negligenciadas, frequentes em populações de países em desenvolvimento,
áreas remotas ou de recursos escassos. Alguns testes diagnósticos são complexos para
uso nessas áreas, pois exigem que as amostras sejam transportadas para um laboratório
com boa infra-estrutura e que o paciente retorne para receber os resultados. Portanto,
testes diagnósticos mais simples, que não exijam refrigeração ou equipamento, que
sejam realizados durante o atendimento ao paciente com resultados imediatos poderão
contribuir para o controle de doenças negligenciadas.
O desenvolvimento de um teste imunocromatográfico exige o conhecimento de
princípios de biologia, química, física e até mesmo de engenharia (Peeling et al., 2006).
É importante saber que variações num único material, reagente ou processo pode ser
suficiente para interferir negativamente no desempenho do teste. Para desenvolver um
teste comercialmente viável é importante que se tenha um desenho básico já
estabelecido e que na medida do possível sejam mantidas as plataformas e protocolos de
produção já estabelecidos. A plataforma de dispensação adquirida pelo Laboratório de
Imunologia da Aids e da Hanseníase do IPTSP/UFG é semelhante à utilizada pelas
grandes produtoras de testes de diagnóstico rápidos, tais como Organon, Chembio e
BioManguinhos. A escolha dos filtros utilizados como filtro de amostra, suporte do
conjugado e absorvente levou em consideração várias características sendo o tempo de
fluxo da amostra a principal delas. O emprego de sigilo no desenvolvimento de testes
diagnósticos dificulta a comparação da escolha de materiais e reagentes entre diferentes
trabalhos.
A escolha do filtro de amostra levou em conta parâmetros que influenciam na
taxa de liberação da amostra, principalmente a espessura e gramatura do filtro e a
pressão exercida dentro do cassete. Entre filtros de celulose ou malhas de algodão
optamos primeiramente por utilizar o de celulose devido a sua capacidade de receber
volumes maiores de amostra sem prejudicar a uniformidade da dispersão e menor custo.
70
Porém este é mais frágil e menos prático de manusear, mas ainda é o tipo de filtro mais
utilizado no desenvolvimento de testes rápidos. Posteriormente, tivemos acesso à filtros
mais modernos, compostos por fibras mistas que são capazes de reter as células
vermelhas do sangue, liberando apenas o fluxo do plasma. Esta característica confere
uma vantagem na aplicação de amostras de sangue total sem que haja interferência da
pigmentação do sangue sobre a janela de leitura. Como este tipo de filtro não foi
utilizado na produção original, o uso de amostras de sangue total era limitado pela
pigmentação da janela de leitura. Com isso, a leitura dos resultados de amostras de
sangue total era realizada com 5 minutos diminuindo a sensibilidade do teste (Bührer-
Sékula et al., 2003; Bührer-Sékula et al., 2007). A aplicabilidade do teste precisa ser
avaliada utilizando amostras de sangue total em campo, portanto, reverter essa limitação
do teste original poderá representar uma melhora no desempenho.
O suporte de conjugado utilizado é composto por microfibra de vidro, material
amplamente utilizado como suporte do conjugado por ser imunologicamente inerte, de
forma a evitar que imunoglobulinas da amostra fiquem retidas no filtro.
Apesar de menos importante a capacidade de absorção de quantidades de
solução tampão suficientes para diluir e carrear a amostra deve ser garantida. Para tanto
optamos por manter o tipo e tamanho de filtro absorvente utilizado pelo protocolo
original desde que este está disponível comercialmente no Brasil.
Como o cassete utilizado no protocolo original da marca BioSigma (modelo
BSD310) está comercialmente disponível no Brasil, optamos por mantê-lo. O uso deste
cassete confere segurança na aplicação da amostra, pois impede que o profissional de
saúde aplique a amostra em algum ponto que não o filtro de amostra, além de fornecer
informações adicionais como posição da linha teste e controle e uma área fosca onde é
possível escrever dados da amostra aplicada. Caso não fosse utilizado o cassete plástico,
certamente o tempo de leitura do teste seria alterado, devido a pressão na medida ideal
exercida sobre a tira para regular o fluxo da amostra. Além disso, o teste, quando não
acondicionado em cassete plástico é mais difícil de manipular e tem um custo de
embalagem elevado, visando manter suas características de validade e forma de
armazenamento prática e segura.
A aplicação dos reagentes sobre a membrana de nitrocelulose e o suporte do
conjugado, além do corte dos cards em tiras de tamanho preciso para montagem em
cassetes são passos que requerem uma uniformidade muito grande visando garantir a
71
reprodutibilidade do teste. Portanto, essas etapas foram automatizadas contando com
uma plataforma computadorizada calibrada e precisa. A montagem dos testes nos
cassetes foi realizada manualmente, porém a automatização do processo de fechamento
dos cassetes uniformizaria a pressão exercida no filtro da amostra, parâmetro que reflete
no tempo de corrida do teste e reprodutibilidade dos resultados quando montados em
grande quantidade numa linha de produção.
Algumas possibilidades de melhoria do teste já foram discutidas em estudos
anteriores, entre elas o uso da detecção de diferentes classes de imunoglobulinas, além
da IgM como no teste ML ICA produzido na Coréia pelo grupo do Dr. Cho (dados não
publicados). Porém, este teste não apresenta ganho aparente na sensibilidade por
detectar anticorpos IgM, IgG e IgA contra o PGL-I quando comparados com a
sensibilidade do ML Flow para detecção apenas de anticorpos IgM (Grassi A.B. et al.,
2008). Provavelmente isto acontece pela natureza glicolipídica do antígeno que não leva
à mudança de classe de anticorpos, como no caso dos antígenos protéicos.
Um componente importante que pode influenciar nos resultados é o tipo de
albumina conjugada ao componente de açúcar dos antígenos semi-sintéticos. A equipe
do Dr. Brennan (Colorado State University, EUA) e Dr. Fujiwara (Nara University,
Japão) recentemente conjugaram os análogos semi-sintéticos do PGL-I ND-O e NT-P,
respectivamente a albumina humana (HSA) (dados não publicados). É esperado que o
uso de albumina humana reduza consideravelmente as ligações não específicas e,
portanto melhore a sensibilidade do teste. Porém, estudos precisam ser realizados para
comprovar esta hipótese.
Os parâmetros de desempenho, praticidade, condições de armazenagem e
validade foram avaliados e descritos nos estudos de desenvolvimento e implementação
do teste ML Flow (Bührer-Sékula et al., 2003; Bührer-Sékula et al., 2007). O foco do
presente estudo foi padronizar a produção utilizando recursos tecnológicos e materiais
disponíveis no Brasil. O teste produzido no IPTSP, durante a fase I, apresentou uma alta
correlação (98%, kappa 0,92) quando comparado ao teste de referência produzido pelo
KIT BR. Os resultados discordantes referem-se a leituras muito próximas. Ao
compararmos o padrão de intensidade de coloração da linha controle, observamos que o
teste de referência apresentava uma coloração mais intensa, talvez indicando uma
quantidade e/ou qualidade superior do conjugado impregnado na microfibra de vidro.
Porém, as diferenças entre lotes de conjugado são conhecidas (Slot e Geuze, 1985) e
72
entre todos os lotes produzidos do ML Flow, o lote utilizado como referência foi o que
apresentou melhor desempenho do conjugado (Bührer-Sékula comunicação pessoal) e
por este motivo foi armazenado para ser utilizado como teste de referência.
Durante a fase II foi possível manipular os parâmetros envolvidos na produção e
impregnação do conjugado. Dentre estes parâmetros, destacamos o grau de diluição do
conjugado, expresso pela sua absorbância em leitura a 530nm, a quantidade de
anticorpo utilizado durante o processo de conjugação e o volume de conjugado
dispensado na tira de microfibra de vidro. Como os resultados obtidos com a utilização
do protocolo original do KIT-BR não apresentaram resultados satisfatórios, todo o
protocolo foi revisto. Verificamos através de duas metodologias diferentes, sendo uma
desenvolvida no KIT-BR e outra desenvolvida por Slot e Geuze (1985), que a
quantidade de anti-IgM humana necessária para estabilizar a conjugação era dez vezes
superior àquela indicada no protocolo original. Esta constatação explicava em grande
parte os problemas que vínhamos encontrando nos experimentos de conjugação, desde
que apesar de controversa, é uma prática comum a utilização de uma quantidade de
proteína 10-20% superior ao mínimo necessário para estabilizar a conjugação (Slot e
Geuze, 1985). Outra alteração no protocolo original se refere à diluição final para
impregnação do conjugado, indicada no protocolo como bem inferior à diluição
utilizada. O protocolo original é um protocolo base, utilizado no desenvolvimento de
outros testes, e que por ser considerado confidencial apresenta modificações propositais
para prevenir casos de uso indevido. Vários reagentes de detecção além do ouro coloidal
podem ser utilizados, a exemplo de beads de látex, colóides de outros metais, partículas
fluorescentes ou magnéticas. Optamos por utilizar o uso do ouro coloidal por não ser
tóxico, apresentar um padrão de coloração mais estável e um custo de produção
relativamente baixo.
Outro detalhe observado foi o grau e tempo de limpeza da janela de leitura do
teste. Notamos que um dos lotes de tampão de corrida preparado no IPTSP deixava um
fundo amarelado após secagem, o que não influenciou na leitura já que o efeito só foi
observado horas após o teste ter sido realizado. Em novos lotes produzidos este efeito
não foi observado, porém não ficou estabelecida a causa do problema. Quanto ao tempo
de limpeza da janela, o teste produzido no IPTSP durante a fase I comumente
apresentou um fundo rosa ainda aos 10 minutos de corrida, o que apesar de tolerado,
não é recomendado, pois pode afetar a leitura semi-quantitativa dos resultados. Durante
73
a fase II foram testados novos filtros de amostra de forma a reduzir o tempo de limpeza
da janela de leitura para o intervalo padronizado, possibilitando a leitura dos resultados
sem interferência de pigmentação em 10 minutos.
Observamos que mesmo com diferenças encontradas entre os testes produzidos
no IPTSP e o teste de referência, no que se refere à quantidade ou qualidade do
conjugado, tempo de fluxo e grau de limpeza da janela de leitura, a concordância entre
os testes permaneceu alta, confirmando a reprodutibilidade dos resultados com os dois
testes. Contudo, se o protocolo de produção definido neste estudo for aplicado para a
produção de testes, os parâmetros de sensibilidade e especificidade deste novo teste
produzido deverão ser avaliados, pois observamos que estas alterações são responsáveis
por variações significativas nestes parâmetros. Porém, como foi possível manter uma
alta correlação entre o teste produzido no IPTSP e o teste de referência, acreditamos que
estes parâmetros poderão se manter próximos dos valores encontrados por Bührer-
Sékula et al. (Bührer-Sékula et al., 2003) que registrou uma sensibilidade de 97,4% em
classificar corretamente os pacientes MB, e especificidade de 90,2%.
Uma observação muito importante pode ser feita quando se comparam os
resultados do teste ML Flow IPTSP com as leituras do teste ELISA-PGL-I. As leituras
do teste ML Flow permaneceram negativas em amostras com OD inferior a 0,300,
demonstrando seu papel em detectar apenas pacientes com títulos elevados de
anticorpos, portanto índices baciloscópicos relativamente altos como encontrado por
diversos autores (Chanteau et al., 1989a; Groenen et al., 1990; Chujor et al., 1991;
Cellona et al., 1993; Bührer-Sékula et al., 1998; Bührer-Sékula et al., 2000; Bührer-
Sékula et al., 2001; Cho et al., 2001; Bührer-Sékula et al., 2003; Schuring et al., 2006;
Bührer-Sékula et al., 2007; Parkash, 2009).
A alta correlação do teste ML Flow com o teste ELISA já havia sido referida por
outros autores (Menzel et al., 1987; Gonzalez-Abreu et al., 1996; Roche et al., 1999;
Tomimori-Yamashita et al., 1999; Bührer-Sékula et al., 2003) indicando que ambos
classificariam pacientes de hanseníase de modo semelhante. Não conseguimos observar
correlação entre a leitura semi-quantitativa tanto do ML Flow IPTSP quanto do ML
Flow KIT e títulos de ELISA, como foi observado por Silva et al. (2008) onde títulos
mais altos em ELISA correspondem a coloração mais intensa no ML Flow. Talvez o
número de amostras testadas não tenha permitido estabelecer esta correlação, desde que
apenas 20% de nossas amostras eram positivas. Porém, a correlação entre a positividade
74
no teste ML Flow e ELISA, independente da classificação semi-quantitativa do ML
Flow, demonstra que o teste é capaz de identificar amostras com maior quantidade de
anticorpos anti-PGL-I e, portanto classificar os pacientes de hanseníase para fins de
tratamento. O uso de uma proporção maior de amostras negativas se justifica pelo
propósito do teste em classificar a hanseníase. Para tanto se exige uma especificidade
maior do teste, ou seja, a sua capacidade comprovada de se manter negativo em
amostras negativas para hanseníase (Riegelman, 2000).
A produção do teste ML Flow no Brasil implica em redução dos custos de quase
250% no valor final do teste produzido. Enquanto o valor do teste importado da
Holanda, com montagem e embalagem realizadas no Brasil por empresa terceirizada
seria de aproximadamente R$5,32 por teste, esse valor cai para cerca de R$2,34 quando
são utilizados tecnologia e materiais disponíveis no mercado brasileiro. É importante
ressaltar que estes valores não contabilizam custos administrativos e transporte, não
significando, portanto o valor final do teste, porém refletem a redução significativa dos
custos de produção. Essa redução de custo é um fator importante desde que o Ministério
da Saúde, através da Coordenação do Programa de Controle da Hanseníase tem
interesse em adquirir e implementar o teste como ferramenta para controle da endemia.
75
7. CONCLUSÃO
Este estudo padronizou o teste ML Flow que pode ser utilizado para
classificação da hanseníase PB e MB e identificar contatos com risco aumentado de
desenvolver a doença. Foi utilizada a plataforma de produção implementada no
Laboratório de Imunologia da Aids e da Hanseníase do IPTSP/UFG e os materiais
disponíveis no Brasil mantendo uma correlação alta (98%, kappa superior a 0,8) com o
teste ML Flow de referência. O teste produzido no IPTSP, por ser simples e fácil de
usar, gerando resultados em poucos minutos poderá atuar no futuro como uma
ferramenta simples e de baixo custo para auxiliar no diagnóstico e classificação correta
dos pacientes de hanseníase para fins de tratamento e na identificação de contatos de
pacientes com hanseníase com risco maior de adoecer. A padronização do teste rápido
ML Flow no IPTSP mediante geração de protocolos para produção, comprovou que o
treinamento de recursos humanos e a montagem de infra-estrutura laboratorial adequada
estabeleceram as bases tecnológicas para a produção de testes rápidos baseados em
imunocromatografia (fluxo lateral) no Laboratório de Imunologia da Aids e Hanseníase
do IPTSP-UFG.. Além disso, o produto desenvolvido apresenta alta viabilidade de
comercialização que depende apenas da montagem de uma linha de produção e
avaliação da sua utilização pelo Programa Nacional de Controle da Hanseníase no país.
76
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Quan,C., Yu,Y.X., Zhang,Z., Shi,B.Q., Zhang,L.H., Cheng,H., Wang,C.Y.,
Lin,Y., Zheng,H.F., Fu,X.A., Zuo,X.B., Wang,Q., Long,H., Sun,Y.P.,
Cheng,Y.L., Tian,H.Q., Zhou,F.S., Liu,H.X., Lu,W.S., He,S.M., Du,W.L.,
Shen,M., Jin,Q.Y., Wang,Y., Low,H.Q., Erwin,T., Yang,N.H., Li,J.Y., Zhao,X.,
Jiao,Y.L., Mao,L.G., Yin,G., Jiang,Z.X., Wang,X.D., Yu,J.P., Hu,Z.H.,
Gong,C.H., Liu,Y.Q., Liu,R.Y., Wang,D.M., Wei,D., Liu,J.X., Cao,W.K.,
Cao,H.Z., Li,Y.P., Yan,W.G., Wei,S.Y., Wang,K.J., Hibberd,M.L., Yang,S.,
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91
9. ANEXOS
Anexo 1 – Aprovação do CEP do Instituto Evandro Chagas
92
Anexo 2 – TCLE pacientes Hanseníase
Termo de Consentimento Pós-informado
(Obrigatório para Pesquisa Clínica em Seres Humanos – Resolução no196 de 10 de 10 de 1996 – CNS)
1) Identificação do paciente ou responsável legal
Nome:
Documento de identidade no: Nascimento: / /
Endereço:
Cidade Estado: Tel.: ( )
2) Dados sobre o estudo
Título: Polimorfismo do gene humano NRAMP1 na susceptibilidade para hanseníase em doentes e contatos do
Estado do Pará
Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa em:
3) Esclarecimento do sujeito:
Você está convidado a participar de um estudo para examinar doentes hansênicos e contatos de pecientes hansênicos
objetivando a aplicação de métodos que possam auxiliar no diagnóstico precoce desta doença. Hanseníase é um
problema de saúde pública no Brasil, ela é causada por micróbios chamados bacilos de Hansen. A maioria das
pessoas é saudável o suficiente para matar os bacilos quando eles invadem os seus corpos.Os serviços de saúde
pública precisam saber se o trabalho deles para acabar com a hanseníase está sendo suficiente para garantir à
comunidade o bem estar social. É muito difícil descobrir se os trabalhos realizados são adequados. Nós estamos
utilizando métodos que talvez ajudem os serviços de saúde pública a buscar maneiras mais efetivas de fazer o
diagnóstico o mais precocemente possível da hanseníase, bem como a prevenção de deformidades. Se você e/ou seu
pai ou responsável concordarem em participar deste estudo, você será submetido a um exame cuidadoso de sua pele
e se houver alguma possibilidade de você estar doente, você será encaminhado para que um médico te examine e te
medique. Depois do exame, nós vamos colher um pouco de sangue (5 ml) de uma veia superficial e um pedacinho de
pele. Você sentirá uma picada leve nos locais da coleta, estas picadas ardem um pouco, mas não representam nenhum
risco para sua saúde.Você receberá toda a assistência à saúde pela equipe do Instituto Evandro Chagas e do Centro de
Referência em Dermatologia Dr. Marcelo Cândia, que poderá ser chamada a qualquer momento, caso haja
necessidade. As despesas decorrentes da participação na pesquisa e indenização por eventuais danos decorrentes da
mesma, serão de total responsabilidade dos pesquisadores principais e suas respectivas instituições de origem.Caso você não deseje participar, não deixará de ser atendido e acompanhado durante todo o seu tratamento se assim o desejar.Socorro Amador: Instituto Evandro Chagas- fone/Fax: (91) 3214-21-12/ 3214-21-14/88426845
Autorizo o uso do material destinado ao laboratório da Unidade de Saúde.
Belém, _____/______/______
Assinatura do paciente ou responsável
93
Anexo 3 – Aprovação do CEP do Hospital Eduardo de Menezes (frente)
94
Anexo 3 – Aprovação do CEP do Hospital Eduardo de Menezes (verso)
95
Anexo 4 – TCLE área não endêmica (Chile)
96
Anexo 5 – TCLE área endêmica (Brasil)
Estudo do comportamento dos Testes Sorológicos ML Flow e ELISA (PGL-I) em áreas
endêmica e não endêmica de Hanseníase
Informações para pacientes
A hanseníase é uma doença que afeta a pele e os nervos. No início os sintomas são
dificilmente notados. Durante o desenvolvimento da doença as lesões de pele são mais
aparentes e os nervos podem ser irreversivelmente danificados resultando em graves
sequelas. Quanto maior a demora para diagnosticar a doença e o tratamento for iniciado,
maior será o dano. Atualmente a hanseníase tem cura e muitos são os esforços para que
ela deixe de ser um problema de saúde pública no Brasil.
Todos os pacientes e contatos de hanseníase em tratamento no Hospital Eduardo de
Menezes fazem o teste sorológico ML Flow ao diagnóstico da doença, com o objetivo
de verificar a carga bacilar de cada um deles e para definir o tempo de tratamento (6
meses ou 1 ano). O teste consiste em retirar uma gota de sangue da ponta do dedo da
mão (podendo ocorrer sensação de dor semelhante à da retirada de sangue para exames
rotineiros), o resultado é dado em cinco minutos, não implicando em riscos para sua
saúde. Quanto ao resultado, se for de interesse, poderá obtê-lo logo em seguida, bem
como será informado e orientado caso apresente algum diagnóstico para hanseníase ou
outra doença, recebendo tratamento no ambulatório do Hospital Eduardo de Menezes,
dentro da sua rotina com agendamentos de consultas garantidos.
Você esta sendo convidado para realizar este mesmo teste que existe possibilidade de
dar positivo em outras doenças que não seja somente a hanseníase. A pesquisa poderá
ou não trazer benefícios a você, mas as informações obtidas por meio deste estudo
poderão ser importantes para a confiabilidade e validade do teste sorológico ML Flow e
para que a hanseníase possa ser diagnosticada precocemente e assim melhor controlada.
Os procedimentos relacionados ao estudo serão inteiramente gratuitos. Quaisquer
dúvidas ou esclarecimentos que julgar necessário no decorrer da pesquisa, poderá
contactar a responsável pelo projeto Dra. Rozana Castorina da Silva pelo telefone (31)
32270092 ou no endereço Avenida do Contorno, 4852, sala 601, Bairro Funcionários,
Belo Horizonte/MG. Ressalto que em todo o momento da pesquisa será mantido
sigilo absoluto dos dados e resultados do paciente, bem como, está livre para não
concordar com esse termo e para se retirar do projeto a qualquer momento sem
penalidades.
Outras informações sobre projetos de pesquisa podem ser obtidas junto ao Comitê de
Ética em Pesquisa - COEP-UFMG Avenida Presidente Antônio Carlos, 6627, Unidade
Administrativa II, 2º andar, Campus Pampulha – Belo Horizonte, telefone (31)3499
4592.
Declaro que tive tempo suficiente para ler e entender as informações acima. Declaro
também que toda a linguagem técnica utilizada na descrição deste estudo de pesquisa
foi satisfatoriamente explicada e que recebi respostas para todas as minhas dúvidas.
Confirmo também que recebi uma cópia do formulário de consentimento. Compreendo
97
que sou livre para me retirar do estudo a qualquer momento, sem perda de benefícios ou
qualquer outra penalidade.
Dou meu consentimento de livre e espontânea vontade para participar como sujeito deste estudo.
----------------------------------------- ---------------------
Nome do participante (em letra de forma) Data
Como responsável legal por ____________________________________________________ dou consentimento de livre e espontânea vontade para que participe como sujeito deste estudo
-------------------------------------------------------- ------------------------
-----
Assinatura do responsável legal para menores de 18 anos Data
Atesto que expliquei cuidadosamente a natureza e o objetivo deste estudo, os possíveis
riscos e benefícios da participação no mesmo, junto ao participante e/ou seu
representante autorizado. Acredito que o participante e/ou seu representante recebeu
todas as informações necessárias, que foram fornecidas em linguagem adequada e
compreensível e que ele/ela compreendeu essa explicação, ficando claro que em todo o
momento da pesquisa será mantido sigilo absoluto dos dados e resultados do
paciente.
----------------------------------------- ----------------------
Nome do pesquisador Data
DECLARAÇÃO
Eu, Rozana Castorina da Silva, na qualidade de pesquisadora responsável pelo,
ESTUDO DO COMPORTAMENTO DO TESTE SOROLOGICO ML FLOW NA
POPULAÇÃO ENDÊMICA E NÃO ENDÊMICA DE HANSENÍASE, reafirmo meu
compromisso assumido na folha de rosto, quanto ao cumprimento dos termos da
resolução 196 DE 10 DE OUTUBRO DE 1996, DO Conselho Nacional da Saúde,
durante todas as fases da pesquisa.
Belo Horizonte, ......................
Rozana Castorina da Silva
Aluna de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Departamento de Clínica Médica
Universidade Federal de Minas Gerais
98
Anexo 6 – Aprovação Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de
Minas Gerais
99
Anexo 7 - Aprovação Comitê Nacional de Ética e Pesquisa
100
Anexo 7 - Aprovação Comitê Nacional de Ética e Pesquisa (cont.)
101
1. Título
Preparo do tampão PBS 10x
2. Propósito
O tampão PBS é utilizado na diluição e lavagem em vários estágios do procedimento de
ELISA
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
Evitar o contato dos reagentes com a pele e olhos.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref NaCl Sigma S5886
Na2HPO4.2H2O Vetec
KH2PO4 Merck 104873
KCl SIGMA P9333
H2O
Equipamento
Bekker 1L
Bastão de vidro
Balança de precisão
Vidro para estoque
6. Procedimento
Registro Preencha a ficha “preparo do tampão PBS”
Preparo 1. Pesar 80g de NaCl;
2. Pesar 14,54g de Na2HPO4.2H2O;
3. Pesar 2g de KH2PO4;
Anexo 8 – Protocolo Operacional Padrão - preparo de soluções – PBS 10x
102
4. Pesar 2g de KCl;
5. Diluir todos reagentes em qsp 1L de H2O.
6. Rotular o recipiente de estocagem.
7. Estocar a temperatura ambiente.
8. Consumir antes de 1 ano.
Obs.: O Na2HPO4.2H2O pode ser substituído por Na2HPO4.12H2O (29,26g) ou
Na2HPO4. (11,6g), de acordo com a disponibilidade dos reagentes no laboratório.
O pH deve estar em torno de 7,4.
Para preparar PBS 1x
o Diluir 100ml PBS 10x completar para 1000mL
Armazenamento
1. Preparar uma etiqueta com os seguintes dados:
a. PBS 10x
b. Data de preparo e data de validade de 1 ano.
c. Nome da pessoa que preparou o PBS.
2. Armazenar a 4oC.
103
1. Título
Preparo da solução TMB
2. Propósito
A solução TMB é utilizada como substrato para a enzima envolvida na reação de
ELISA.
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI), inclusive óculos de proteção devem ser
utilizados durante todo o processo;
O processo deve ser realizado em capela
O TMB é irritante para a pele, olhos e mucosas, em caso de contato com os olhos, lavar
com água abundante e procurar auxílio médico.
O peróxido de hidrogênio com uréia é corrosivo, portanto deve ser estocado em local
adequado e manuseado com cuidado.
O Peróxido de Hidrogênio com Uréia é altamente inflamável
Nunca adicione água ao TMB ou Peróxido de Hidrogênio com Uréia
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
TMB CONF. CONF.
Peróxido de Hidrogênio com Uréia CONF. CONF.
DMSO CONF. CONF.
Equipamento
Tubo eppendorf 5mL
Balança de precisão
Vortex
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “preparo do TMB 10x”
Anexo 9 – Protocolo Operacional Padrão - preparo de soluções – TMB 10x
104
Preparo
1. Pesar CONF.mg do TMB
2. Pesar CONF.mg do Peróxido de Hidrogênio com Uréia
3. Diluir em CONF.ml de DMSO.
4. Colocar em tubo falcon de CONF. ml.
Armazenamento
3. Preparar uma etiqueta com os seguintes dados:
a. TMB
b. Data de preparo e data de validade de 1 ano.
c. Nome da pessoa que preparou.
d. Armazenar a 4ºC.
105
1. Título
Preparo do diluente do substrato TMB.
2. Propósito
O diluente do substrato é utilizado nas diluições da solução de TMB.
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
inclusive luvas e proteção facial.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
Acetato de Sódio (CH3-COONa.0H2O) CONF. CONF.
Ácido cítrico monoidratado CONF. CONF.
H2O Milli-Q
Equipamento
Bekker 1L
Balança de precisão
pHmêtro
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “preparo do diluente substrato”
Preparo
1 - Pesar CONF.g do CH3-COONa.0H2O
2 - Pesar CONF.g do Ácido cítrico monoidratado
3 – Diluir em CONF.L de H2O.
Obs.: O pH deve estar entre 3,9 e 4,1 ou ser corrigido com ácido cítrico 2,5M (52,5g de
ácido cítrico em 100ml de H2O). A solução pode ser agitada com bastão de vidro ou
agitador magnético.
Anexo 10 – Protocolo Operacional Padrão - preparo de soluções – Diluente do substrato
106
Armazenamento
4. Preparar uma etiqueta com os seguintes dados:
a. DILUENTE DO SUBSTRATO TMB
b. Data de preparo e data de validade de 1 ano.
c. Nome da pessoa que preparou o tampão.
5. Armazenar a 4oC.
107
1. Título
Preparo da solução de parada (STOP solution)
2. Propósito
A solução de parada é utilizada para interromper as reações químicas entre substrato e
conjugado durante o processo de revelação do teste ELISA
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI), inclusive óculos de proteção deve ser
utilizado durante todo o processo;
O processo deve ser realizado em capela de fluxo
O ácido sulfúrico é corrosivo, portanto deve ser estocado em local adequado e
manuseado com cuidado, pois pode causar queimaduras severas.
Procedimento em caso de acidente com ácido sulfúrico:
Em caso de inalação: Remova a vítima da área contaminada para local arejado,
mantendo-a deitada, quieta e aquecida. Manter as vias respiratórias livres, removendo
dentes postiços (chapa), se tiver. Ministrar respiração artificial, se necessário.
Administrar oxigênio e manobras de ressuscitação se necessário. Chamar/encaminhar
ao médico.
Contato com a pele: Sem perda de tempo conduzir a vítima toda vestida para um
chuveiro. Retirar roupas e calçados contaminados. Não apalpar nem friccionar as partes
atingidas. Lavar com água corrente abundante por 15 minutos (mínimo). Manter a
vítima aquecida e encaminhar ao médico. A pele poderá ser limpa com algodão
embebido em polietilenoglicol 400.
Contato com os olhos: Sem perda de tempo, lavar com água corrente no mínimo por
15 minutos, levantando as pálpebras para permitir a máxima remoção do produto.
Remova lentes de contato, se tiver. Encaminhar ao médico oftalmologista
imediatamente.
Ingestão: Nunca dê nada pela boca a pessoas inconscientes ou em estado convulsivo.
Devido ao forte poder de corrosão e perfuração do Ácido Sulfúrico, os vômitos são
contra indicados. O acidentado consciente pode ingerir muita água (eventualmente
vários litros), sempre aos poucos para não induzir vômitos. Não administrar bicarbonato
de sódio ou tentar neutralizar o ácido.
• Ações a serem evitadas: Não administrar nada oralmente ou provocar o vômito em
vítima inconsciente ou com convulsão.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
Anexo 11 – Protocolo Operacional Padrão - preparo de soluções – Solução de parada
108
5. Materiais
Item Marca Ref
H2SO4 Synth
H2O
Equipamento
Proveta 1L
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “preparo STOP solution”
1. Acrescentar cerca de 900 ml de água à proveta.
2. Acrescentar 27,4 ml de Ácido Sulfúrico 18,3M.
3. Completar para 1l com H2O.
Armazenamento
6. Preparar uma etiqueta com os seguintes dados:
a. Solução de Parada
b. Data de preparo e data de validade de 2 anos.
c. Nome da pessoa que preparou.
d. Armazenar a 4ºC.
7. Armazenar a 4ºC.
109
1. Título
Preparo do tampão de cobertura volátil (Bicarbonato de Amônio pH 8,0).
2. Propósito
O tampão de cobertura é utilizado para diluição do Antígeno no processo de cobertura
das placas de ELISA.
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
O processo deve ser executado em capela de fluxo laminar.
O bicarbonato de Amônia pode causar irritações na pele, olhos e trato respiratório.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
Bicarbonato de Amônio 0,1M CONF. CONF.
Água Milli-Q
Equipamento
Balança de precisão
pHmetro
Becker 1L
Proveta 1L
Bastão de Vidro
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “preparo do tampão de cobertura”.
Preparo
1 - Pesar CONF.g de (NH4)HCO3
2 - Diluir o bicarbonato de amônio em água Milli-Q, qsp 1 litro.
Obs.: O pH deve estar em torno de 8,0. A solução pode ser agitada com bastão de vidro
Anexo 12 – Protocolo Operacional Padrão - preparo de soluções – Tampão de cobertura
110
ou agitador magnético.
Armazenamento
1. Preparar uma etiqueta com os seguintes dados:
a. TAMPÃO DE COBERTURA (NH4)HCO3
b. Data de preparo e data de validade de 3 meses.
c. Nome da pessoa que preparou o tampão.
2. Armazenar a 4oC.
111
1. Título
Cobertura das placas de ELISA com antígeno NTPBSA, NTPHSA ou NDOBSA
2. Propósito
Cobrir as placas com Antígeno específico para detecção de IgM específicas contra PGL-
I em amostras de soro ou plasma
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
Manter as placas durante a secagem em ambiente limpo evitando movimento de
partículas no ar. Quanto possível, dar preferência para estufa de secagem, capela de
fluxo laminar ou laboratório sem uso durante o período de secagem.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
Antígeno
Tampão Cobertura
BSA solução estoque
Equipamento
Pipeta 50uL
Ponteiras 100uL
Placas de ELISA sem cobertura
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “Coating”.
Preparo do Antígeno
1. Adicionar CONF.μl de água MilliQ ao tubo de antígeno
2. Diluir CONF.μl de antígeno em 100mL de coating buffer (suficiente para 40
placas).
Obs.: Cada tubo contendo CONF.ug de açúcar é capaz de cobrir 200 placas a 0,01ug/ml
de açúcar.
Anexo 13 – Protocolo Operacional Padrão - Procedimentos – Cobertura de Placa
112
Figura 1 – Diagrama de distribuição do antígeno.
Cobertura da placa
(apenas quando placas pré-cobertas não estão disponíveis)
1 - Pipetar 50uL do antígeno NT-P-BSA em concentração de 0,01ug/ml em tampão de
cobertura (ver protocolo de diluição do antígeno) nas colunas A, C, E e G.
2 - Pipetar 50uL de BSA diluído 1:4000 (diluir 300uL do estoque em 1200mL de
tampão) em tampão de cobertura (diluição final 82 ng / poço) nas colunas B, D, F e H.
Estocagem
1. Deixar secar em capela de fluxo laminar por 2 dias ao abrigo da luz direta,
temperatura ambiente e livre de poeira.
2. Abrigar em embalagens plásticas com pacote de sílica a temperatura ambiente e
abrigo da luz.
3. Vedar as embalagens.
Controle de Qualidade
1. Compare resultados entre as placas pré-cobertas e o lote utilizando amostras
positivas, realize os testes de comparação no mesmo dia. Preferencialmente não
utilize placas cobertas há mais de 6 meses. O uso é indefinido porém parece
ocorrer um aumento nas ligações não específicas.
113
1. Título
Procedimento de doseamento do PGL-I através da técnica de ELISA
2. Propósito
Dosar títulos de anticorpos IgM contra o PGL-I em amostras de soro
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
Observe as instruções de uso e precauções no rótulo e manuais dos reagentes e
equipamentos empregados.
4. Condições do Ambiente / Exigências
Todo procedimento deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
PBS
Solução de Lavagem (PBS-T)
Solução bloqueadora
Soro padrão
Soro controle positivo
Soro controle negativo
Conjugado CONF.
Substrato (TMB Homemade)
Stop solution
Placas cobertas CONF. CONF.
CONF.
Leitora de ELISA
6. Soluções utilizadas nesse protocolo
PBS 0,1% Tween 20
Tween -20 2ml
PBS 2 l
Anexo 14 – Protocolo Operacional Padrão - Procedimentos – ELISA
114
PBST 10% NGS(Normal goat serum) PBST a 0,1% 100 ml
NGS 10ml
Fazer alíquotas de 50mL e congelar
PBS 1% BSA (Bovine Serum Albumin)
PBS 1000 ml
BSA 10 g
Fazer alíquotas de 50mL e congelar
Ácido Sulfúrico 2,5 N
H2SO4 (P.A.) 70 ml
H2O 930 ml
7. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “ELISA”
1 - Após cobertura das placas conforme protocolo de cobertura, Lavar a(s) placa(s) por
4 vezes com PBST e após a lavagem, “bater” bem a(s) mesma(s) para retirar o líquido.
2 – Adicionar 100 l por poço de solução bloqueadora. (PBS 1% BSA) em toda a placa
(volume total da placa, 9,6ml).
3 - Incubar a 37º C por 1 hora.
4 - Retirar a solução bloqueadora batendo, virando a placa e colocando a mesma,
emborcada em papel absorvente até uso.
5 - Adicionar 50 l de soro teste diluído (1:300) (ex: 5l em 1,5ml) em solução diluente
de amostra (diluente alternativo: PBST 10% NGS).
Obs: Ter sempre em cada placa, soro padrão (stad.) soros controle positivo e
negativo.
Obs: A diluição, tanto do soro standard, como dos soros positivo e negativo
deverão ser calculadas a partir do número de placas a serem dosadas.
6 - Distribuir as amostras nos poços conforme diagrama de teste
7 - Incubar a 37º C por 1 hora.
8 - Lavar a(s) placa(s) por 4 vezes com PBST e após a lavagem, “bater” bem a(s)
mesma(s) para retirar, bem, o líquido.
115
9 - Adicionar 50 l de conjugado anti-IgM-humana ( IgM-H) ligado a peroxidase
(marca Caplle) diluído (1:2000) em solução diluente de conjugado (diluente alternativo:
PBST 10% NGS).
Diluição do conjugado para uma placa:
2,5 L de anti-IgM humana + 5,0ml de PBST 10% NGS
10 - Incubar a 37º C por 1 hora
11 - Lavar a(s) placa(s) por 4 vezes com PBST e após a lavagem, “bater” bem a(s)
mesma(s) para retirar, bem, o líquido.
12 - Adicionar 50 l do substrato TMB Homemade a temperatura ambiente em cada
poço. Esta e uma das possibilidades para substrato. Se utilizar outro tipo de substrato que já venha
preparado, verificar a DO recomendada para a leitura. Após uso fechar bem o frasco e manter a
4ºC.
13 - Incubar em temperatura ambiente e no escuro por aproximadamente 30’’min.
Dependendo do substrato este tempo varia bastante.
14 - Parar a reação quando ao adicionar 50 l da solução stop 2,5N de H2SO4 no soro
padrão (stand.) apresentar absorbância de 0,55-0,65 em leitura realizada com OD450.
8. Cálculos
A. Subtrair os valores de cada amostra das linhas A e B, anotando o resultado.
B. Subtrair os valores de cada amostra das linhas C e D, anotando o resultado.
C. Calcular a média dos resultados encontrados em (A) e (B)
D. Subtrair os valores de cada amostra das linhas E e F, anotando o resultado.
E. Subtrair os valores de cada amostra das linhas G e H, anotando o resultado.
F. Calcular a média dos resultados encontrados em (D) e (E)
G. O resultado final é obtido diminuindo a média do valor encontrado para BSA da
média do valor encontrado para o antigeno. Ou seja, as ligações não específicas são
descontadas.
116
9. Diagrama do teste
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Stand. Stand. Stand. Stand. Pos.
( + )
Neg.
( - )
1 2 3 4 5 6 NDO
BSA
B BSA
C NDO
BSA
D BSA
E 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 NDO
BSA
F BSA
G NDO
BSA
H BSA
117
1. Título
Preparo do ouro coloidal OD 40nm e conjugação a anticorpos
2. Propósito
O conjugado de ouro coloidal a anticorpos é utilizado no preparo de testes de fluxo
lateral.
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
O processo deve ser executado em capela de fluxo laminar.
O bicarbonato de Amônia pode causar irritações na pele, olhos e trato respiratório.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria, inclusive eletrodos de pHmetro e agitadores magnéticos, deve ser de uso
exclusivo para o preparo do ouro coloidal e estar devidamente limpa.
O cloreto áurico não deve entrar em contato com metais, portanto espátulas metálicas
não devem ser utilizadas para pesagem.
Soluções de cloreto áurico são sensíveis a luz.
5. Materiais
Item Marca Ref
CONF. CONF. CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF.
CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF. CONF. CONF.
CONF.
Azida Sódica
Água Milli-Q
Anexo 15 – Protocolo Operacional Padrão - Procedimentos – Ouro coloidal OD40 e
conjugação
118
Equipamento
Frascos Nalgene
Espátula plástica
Tubos de centrifugação de polialômero de 50 ml.
6. Procedimento
O preparo de conjugados de ouro coloidal é realizado em três passos. Primeiro são
preparadas partículas de ouro OD 20nm a partir do cloreto áurico. As partículas OD 20
são então utilizadas para fazer partículas OD 40nm que são conjugadas aos anticorpos.
Os anticorpos podem ser IgM ou IgG humanas.
5.1. Ouro Coloidal
a. Preparo do ouro coloidal 20nm
Solução de Cloreto áurico 1%:
- Pesar 1g de CONF. em recipiente plástico e utilizando espátula plástica.
- Transferir para um frasco Nalgene contendo 100ml de água Milli Q e
misturar bem.
- Armazenar no escuro e cobrir o frasco com papel alumínio.
Solução de citrato de sódio tribásico 1%
- Pesar 0.05g de CONF.
- Transferir para frasco de vidro contendo 5 ml de água Milli Q.
1. Adicionar 120 ml de água Milli Q em Erlenmeyer de vidro de 500ml.
2. Adicionar CONF. ml da solução AuCl4 1%.
3. Adicionar agitador magnético.
4. Para evitar perda por evaporação, posicione um frasco Erlenmeyer pequeno
invertido na abertura do frasco contendo a solução AuCl4.
5. Coloque o frasco Erlenmeyer sobre um agitador/aquecedor.
6. Aqueça a solução (360C) e agite a 200rpm.
7. Deixe ferver.
8. Utilizando uma pipeta calibrada, adicione 4 ml da Solução de citrato de sódio
tribásico 1. Adicione todo o volume rapidamente sem interrupção no centro da
solução de ouro.
9. Mantenha a fervura e agitação por 8 mins. Durante este período a cor deverá mudar
de roxo escuro a vermelho escuro indicando que se desenvolveram as partículas de
ouro coloidal.
10. Retire o Erlenmeyer contendo a solução de ouro coloidal do aquecedor e o coloque
em container contendo água e gelo. Deixe a solução atingir a temperatura ambiente.
11. Meça a OD da suspensão de ouro coloidal em espectrofotômetro utilizando a função
de varredura de 600nm a 400nm com intervalo de 2nm.
12. O pico de absorção deve estar entre 518 e 520nm.
13. Transferir a suspensão de ouro coloidal OD 20 para um frasco limpo e estocar a
+4C sobre abrigo da luz até utilizar para preparo da partícula OD 40.
119
b. Preparo do ouro coloidal de 40nm.
Materiais
Solução de AuCl4 a 0.6%
- Misture 6 ml da solução estoque AuCl4 1% com 4 ml de água Milli Q.
1. Adicionar 450ml de água Milli Q em Erlenmeyer de vidro de 1000ml.
2. Adicionar 90 ml da suspensão de ouro coloidal OD 20.
3. Adicionar CONF. ml da solução de citrato de sódio tribásico 1%.
4. Adicionar agitador magnético.
5. Para evitar perda por evaporação, posicione um frasco Erlenmeyer pequeno
invertido na abertura do frasco contendo a solução AuCl4.
6. Coloque o frasco Erlenmeyer sobre um agitador/aquecedor.
7. Aqueça a solução (360C) e agite a 200rpm.
8. Deixe ferver.
a. Adicionar 3 ml da solução de AuCl4 a 0.6% rapidamente sem interrupção
no centro da solução em fervura.
b. Aos 3 mins, adicionar 3 ml da solução de AuCl4 a 0.6% pela segunda
vez, rapidamente sem interrupção no centro da solução em fervura
c. Aos 4 mins, após se observer alteração na cor da solução, adicionar 3 ml
da solução de AuCl4 a 0.6% pela terceira vez, rapidamente sem
interrupção no centro da solução em fervura e deixar ferver por até 6
mins.
9. Retire o Erlenmeyer contendo a solução de ouro coloidal do aquecedor e o
coloque em container contendo água e gelo. Deixe a solução atingir a
temperatura ambiente.
10. Meça a OD da suspensão de ouro coloidal em espectrofotômetro utilizando a
função de varredura de 600nm a 400nm com intervalo de 2nm
11. O pico de absorção deve estar entre 524 a 526nm.
12. Transferir a suspensão de ouro coloidal OD 20 para um frasco limpo e estocar a
+4C sobre abrigo da luz até utilizar para conjugação.
5.2. Conjugação
Conjugação de anticorpos a partícula de ouro coloidal 40 nm
A Conjugação de anticorpos a partícula de ouro coloidal 40 nm é realizada em pH e
concentração do anticorpo ótimos predeterminados.
Materiais
Tris.HCl 25mM pH 9.0
- 2.5 ml de Trisbase 1M em água Milli Q q.s.p. 100 ml
- Ajustar o pH 9.0 com HCl 1 N.
Suspensão ouro coloidal OD 40nm pH 9.0.
120
- 100 ml da suspensão de ouro coloidal 40nm ajustar o pH 9.0 com carbonato de
potássio 0.2 M.
Solução de conjugação (Solução C: Tris-HCl 25 mM pH 9.0)
Solução de lavagem (Solução W: Tris-HCl 25 mM pH 9.0 + 1% BSA)
Solução de Estoque (Solução S: Tris.HCl 25mM pH7.2, 150mM NaCl, 1% BSA,
0.5% Azida Sódica).
- CONF. ml Trisbase 1M
- CONF.gr NaCl
- CONF.gr Azida Sódica
- CONF. ml solução BSA a 10%
- Água milli Q q.s.p. 1,000 ml.
- Ajustar o pH 7.2 com HCl 1N.
Procedimento para conjugação com anti-IgM
1. Adicionar 50 ml da solução C em frasco de vidro
2. Agitar a 150rpm.
3. Adicionar 145 l (2.4 mg/ml) anti-IgM humana (adicionar gota a gota)
4. Rapidamente adicionar 100 ml da suspensão de ouro coloidal 40nm pH=9.0.
5. Incubar por 30mins em temperatura ambiente.
6. Adicionar 15 ml da solução BSA 10%.
7. Dividir igualmente a solução em oito tubos para centrifugação.
8. Centrifugar por 30mins a 7,500rpm (6,804 x g) +4C.
9. Retirar o sobrenadante cuidadosamente e suspender o pellet em 20 ml da
solução W.
10. Centrifugar por 30mins a 7,500rpm (6,804 x g) +4C.
11. Remover o sobrenadante.
12. Transferir o pellet para um tubo de 2ml.
13. Centrifugar por 10mins a 7.000rpm (4.500 x g) +4C.
14. Transferir o sobrenadante para um segundo tubo de ensaio
15. Centrifugar por 10mins a 7.000rpm (4.500 x g) +4C.
16. Remover o sobrenadante
17. Transferir o pellet para dois tubos e suspender em aproximadamente 4ml da
solução S para se obter OD 25 a 530nm.
Medição da OD do conjugado de ouro coloidal: - Diluir o conjugado 1:100 em solução S.
- Medir o espectro de luz de 600nm a 400nm fazendo varredura de 2nm.
- O pico de absorção deve estar entre 528 e 532nm.
Rotular e armazenar em tubos a +4C.
121
5.3. Conjugate pad
Aplicação do conjugado ao conjugate pad.
Materiais
Tampão diluente.
- CONF. ml de água Milli Q
- 1ml de tampão Borato100mM pH8.5
- CONF.g de BSA
- CONF.g de sacarose
- CONF.g de trealose
- CONF. ml de Tween 20
- CONF. ml Triton X-100
- Água Milli Q q.s.p. 20 ml.
Tampão Borato 100mM pH8.5
- CONF.g de tetraborato de sódio
- Água Milli Q q.s.p. 100ml
- Ajustar o pH 8,5 com ácido fosfórico 0,1 M.
Procedimento
Preparo do conjugado de ouro coloidal a IgM
1. 80 l de conjugado de ouro coloidal a anti IgM OD25
2. 120 l da Solução S para se obter conjugado com OD=10.
3. Diluir 1:1 com 200 l de tampão diluente (volume final = 400 l)
122
1. Título
Sensibilização de membranas de Nitrocelulose com linha controle e linha de antígeno
com NT-P-BSA
2. Propósito
Sensibilizar as membranas de nitrocelulose com linha controle e teste para produção de
cards ML Flow
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
Manter as membranas durante a secagem em estufa de secagem, capela de fluxo laminar
ou laboratório sem uso durante o período de secagem, em ambiente livre de umidade.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
Antígeno CONF.
IgM Humana CONF. CONF.
PBS estéril
Hidróxido de Sódio 1N CONF. CONF.
Membrana Nitrocelulose CONF. CONF.
Água MilliQ
Equipamento
Tubos 2mL
Tubos 15mL
Pipetas calibradas
Ponteiras
Plataforma XYZ
Sílica
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “Sensibilização de membranas”.
Anexo 16 – Protocolo Operacional Padrão - Procedimentos – Sensibilização de Membranas
123
Preparo do Antígeno
3. Adicionar 100μl de água MilliQ ao tubo de antígeno para se obter uma solução
CONF.μg/ml de açúcar.
4. Adicionar 900μl de PBS a solução CONF.μg/ml de açúcar para se obter uma
solução CONF.μg/ml de açúcar.
5. Adicionar 1000μl de PBS a solução CONF.μg/ml de açúcar para se obter uma
solução CONF.μg/ml de açúcar.
6. Adicionar 2000μl de PBS a solução CONF.μg/ml de açúcar para se obter uma
solução CONF.μg/ml de açúcar.
7. Volume final 4000μl de solução a CONF.μg/ml de açúcar.
8. Rotule o tubo (Conteúdo, data e lote).
9. Armazenar o tubo a 4ºC por no máximo 4 horas.
Preparo do Controle
1. Pipetar 1500μl de IgM humana (0,8mg/ml) em um tubo
2. Adicionar CONF.μl de PBS a IgM humana e misturar bem (concentração final
CONF.mg/ml).
3. Rotule o tubo (Conteúdo, data e lote).
4. Armazenar o tubo a 4ºC por no máximo 4 horas.
Sensibilização das membranas
1. Sensibilize a membrana de nitrocelulose CONF. segundo programa abaixo:
2. Marque com uma caneta a posição das linhas teste e controle na ponta da
membrana
3. Marque as eventuais porções com falha na sensibilização
4. Descarte membranas ou porções de membranas defeituosas
5. Coloque as membranas para secar em estufa a 37ºC por 2 a 4 horas
6. Proceder controle de qualidade das membranas
7. Caso as membranas sejam aprovadas no Controle de Qualidade, embalar com
sílica e a temperatura ambiente até montagem dos testes (não ultrapassar 1 mês).
124
Control line Test line Setting Cheked Setting Cheked File Name ML FLOW Status On On Shape Line Line Device Biojet Biojet Device # 1 2 Z-axis On On Polarize Yes Yes X-start (mm) 0.0 0.0 Y-start (mm) 24.0 24.0 Length (mm) 300.0 300.0 Speed (mm/s) 50 50 Rate (µl/cm) CONF. CONF. Drop (nl) CONF. CONF. Pitch (mm) CONF. CONF. On Time (ms) 0.3 0.3 Repeat Z No No Repeat 1 count 0 0 X-Off 1 (mm) 0.0 0.0 Y-Off 1 (mm) 00 00 Repeat 2 count 0 0 X-Off 2 (mm) 0.0 0.0 Y-Off 2 (mm) 0.0 0.0 Performed by: Date: Reviewed by: Date:
125
1. Título
Montagem de cards para testes ML Flow.
2. Propósito
Preparar cards ML Flow para corte e montagem em cassetes.
3. Precauções
Equipamento de Proteção Individual (EPI) deve ser utilizado durante todo o processo;
Manter as membranas durante a secagem em estufa de secagem, capela de fluxo laminar
ou laboratório sem uso durante o período de secagem, em ambiente livre de umidade.
4. Condições do Ambiente / Exigências
O preparo da solução deve ser realizado em Laboratório a temperatura ambiente.
Toda vidraria deve estar devidamente limpa.
5. Materiais
Item Marca Ref
Membranas sensibilizadas (ver protocolo sensibilização)
Conjugate pad sensibilizado (ver protocolo spray conjugado)
Filtro absorvente CONF.
Pad de amostras CONF.
Embalagem plástica
Sílica
6. Procedimento
Registro
Preencha a ficha “Montagem de cards ML Flow”.
1. Posicione o Filtro Absorvente com 1mm de sobreposição sobre a membrana
de Nitrocelulose pelo lado da linha teste.
2. Posicione o pad de conjugado com 1mm de sobreposição sobre a membrana
de Nitrocelulose pelo lado da linha controle.
3. Posicione o pad de amostras com 1mm de sobreposição sobre o pad do
conjugado.
Anexo 17 – Protocolo Operacional Padrão - Procedimentos – Montagem de testes ML Flow
126
4. Após o posicionamento de cada componente, aplicar pressão sobre o card
com as costas da mão sem tocar a nitrocelulose.
5. Certifique que todos componentes estão alinhados adequadamente e não
ultrapassando o limite do card de vinil
6. Proceder Controle de Qualidade do lote
7. Caso o lote seja aprovado no Controle de Qualidade estocar em embalagem
plástica com sílica até montagem em cassetes.
127
Anexo 18 – Protocolo Operacional Padrão - Procedimentos – Relatório Controle de
Qualidade
128
129
130
Anexo 19 – Artigo Publicado Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 41Supl.2 (2008)