UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DAS RELAÇÕES PARASITO-HOSPEDEIRO

CAROLINA MARTINS TREMÉA

Atividade dos óleos essenciais de Litsea cubeba e Cymbopogon martini sobre isolados do complexo

Cryptococcus neoformans

Goiânia 2015

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [x] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor (a): Carolina Martins Treméa E-mail: carolinatremea@gmail.com Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [x]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor - Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Sigla: CAPES País: Brasil UF: GO CNPJ: 00889834/0001-08 Título: Atividade dos óleos essenciais de Litsea cubeba e Cymbopogon martini sobre isolados do complexo

Cryptococcus neoformans. Palavras-chave: Complexo Cryptococcus neoformans; óleos essenciais; Litsea cubeba; Cymbopogon

martini Título em outra língua: Activity of Litsea cubeba and Cymbopogon martini essential oils against isolates

of Cryptococcus neoformans species complex. Palavras-chave em outra língua: Cryptococcus neoformans species complex; essential oils; Litsea

cubeba; Cymbopogon martini. Área de concentração: Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro Data defesa: (dd/mm/aaaa) 13/04/2015 Programa de Pós-Graduação: Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro Orientador (a): Profª. Dra. Lúcia Kioko Hasimoto e Souza E-mail: luciaksouza@gmail.com Co-orientador (a):* E-mail:

*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [x] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.

O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

Carolina Martins Treméa___ Data: 25 / 04 / 2016 Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

CAROLINA MARTINS TREMÉA

Atividade dos óleos essenciais de Litsea cubeba e Cymbopogon martini sobre isolados do complexo

Cryptococcus neoformans

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre. Orientadora: Lúcia Kioko Hasimoto e Souza

Goiânia 2015

Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG.

Martins Treméa, Carolina Atividade dos óleos essenciais de Litsea cubeba e Cymbopogonmartini sobre isolados do complexo Cryptococcus neoformans[manuscrito] / Carolina Martins Treméa. - 2015.

XCVIII, 97 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Lúcia Kioko Hasimoto e Souza.Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto dePatologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) , Programa de PósGraduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro, Goiânia, 2015. Bibliografia. Anexos. Inclui siglas, abreviaturas, símbolos, gráfico, tabelas, lista de figuras,lista de tabelas.

1. Complexo Cryptococcus neoformans. 2. Óleos essenciais. 3. Litseacubeba. 4. Cymbopogon martini. 5. Citral. I. Kioko Hasimoto e Souza,Lúcia, orient. II. Título.

Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno: Carolina Martins Treméa

Orientador: Lúcia Kioko Hasimoto e Souza

Membros:

1. Lúcia Kioko Hasimoto e Souza

2. Orionalda de Fátima Lisboa Fernandes

3. Josiane Faganello

Data: 13/04/2015

Não entender Não entendo. Isso é tão vasto que ultrapassa qualquer entender. Entender é sempre limitado. Mas não entender pode não ter fronteiras. Eu sinto que eu sou muito mais completo quando eu não entendo. Não entender, do modo como falo, é um dom. Não entender, mas não como um simples estado de espírito. O bom é ser inteligente e não entender. É uma benção estranha, como ter loucura sem ser doido. É um desinteresse manso, uma doçura de burrice. Só que de vez em quando vem a inquietação: eu quero entender um pouco. Não demais: mas pelo menos entender que não entendo.

Clarice Lispector (A descoberta do mundo: crônicas: pág. 178)

Dedicatória

Este trabalho é dedicado aos meus queridos pais, Luiz Carlos Treméa e Ivone

Alexandre Martins Treméa, pelo apoio, amor e atenção incondicionais.

Tudo pode mudar em infinitas perspectivas, o que não muda é que vocês

sempre estão do meu lado prontos para me ajudar. Meu amor por vocês é tão

grande que não existem palavras para descrever.

Tenho muito orgulho de ser filha de vocês, pois são meu maior exemplo de

força, dedicação e persistência.

AGRADECIMENTOS A Deus, que em sua perfeição, criou o universo, o homem e todos os seres da Terra na mais pura riqueza de detalhes. Que foi atencioso em sua criação desde o universo inteiro, galáxias e planetas até uma poeira cósmica, desde um dinossauro até o mais microscópico organismo e principalmente ao criar o homem. Proporcionou-lhe sistemas que funcionam em harmonia ímpar e que conversam entre si com uma perfeição fluida, numa organização única, inteira, desde os órgãos interligados até a mais complexa rota bioquímica e na dinâmica DNA-RNA-proteína. Um organismo com uma emaranhada logística de comunicação entre as células do cérebro e as demais células, que resulta em uma capacidade racional de poder estudar e tentar desvendar ao menos 0,00000001% de tudo que Ele criou. A Deus, por ter me dado a oportunidade de nascer em uma família tão maravilhosa. Agradeço aos meus pais Luiz Carlos Treméa e Ivone Alexandre Martins Treméa, por terem me criado com tanto amor e carinho, por terem me dado todo apoio que precisei para cursar o mestrado. Ao meu irmão preferido, Carlos Eduardo Martins Treméa, pelo companheirismo e compreensão. A minha avó, Dalva Alexandre Martins pelo carinho e cuidado. Aos amigos caninos Filomena, Florentina e Costelinha por todo o amor que sempre fazem questão de transmitir. A Deus, por ter colocado em meu caminho, em 2011, uma orientadora de iniciação científica tão legal e competente, que muito me ensinou sobre micologia, docência, pesquisa, escrita, ciência e sobre a vida também. Que me orientou no trabalho de conclusão de curso, sempre com muito carinho e atenção, assim como me orientou no mestrado. Muito obrigada profa. Lúcia Kioko Hasimoto e Souza. A Deus, por ter me dado amigos preciosos. Agradeço em especial o apoio de Marylia Glenda, Karolina, Wesley, Gabriella e Rayani, que sempre têm uma palavra de incentivo nos momentos mais difíceis. A amiga e instrutora do Método DeRose Mara Amaral, por ter ministrado aulas vigorosas de SwáSthya Yôga que me deixaram mais disposta e enérgica para escrever este trabalho. Agradeço a oportunidade que tive de conviver e aprender com as professoras do laboratório de micologia: Maria do Rosário Rodrigues Silva, Orionalda de Fátima Lisboa Fernandes e Carolina Rodrigues Costa. Agradeço em especial às profas Maria do Rosário e Orionalda por terem lido com tanta atenção este trabalho para a qualificação e terem feito correções que foram fundamentais para a melhoria do trabalho final.

Agradeço também aos amigos que fiz no laboratório de micologia, em especial a Thaísa, Fernando, Ana Flávia e Laís, que me ajudaram muito desde os experimentos de bancada até a escrita, além de me proporcionarem uma amizade que levarei sempre no coração. Também agradeço aos colegas e amigos do laboratório: Mariana, Fábio, Kamila, Flávio, Hildene, Andressa, Viviane, Fernanda, Milton, Reginaldo, Fabyola, Maysa, Franciele, Rodolfo e Cícero. A convivência na “senzala” com certeza deixará saudades e muitas lembranças. Agradeço novamente a Fernando Yano Abrão por ter cedido os óleos essenciais de L. cubeba e C. martini e pelo auxílio em todos os experimentos realizados neste trabalho, desde ao teste de suscetibilidade à citometria de fluxo, assim como pela discussão teórica sobre os mesmos. Agradeço a Bruno Francesco Rodrigues de Oliveira, amigo nos anos de Biomedicina e no mestrado, que me ajudou prontamente sempre que precisei de algum reagente emprestado, assim como a ajuda fundamental na construção de um gráfico mais comum no “lado bacteriano” da força. Agradeço ao Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQM-UFG), em especial a Bruno, Jerônimo e Elviscley, pelo auxílio e pela disponibilidade do espectrofotômetro de varredura sempre que precisei. Agradeço a equipe dos laboratórios multiusuários, em especial ao Alex, pela prontidão em disponibilizar o uso de vários equipamentos e pelo auxílio sempre que precisei. Agradeço ao professor José Realino de Paula da Faculdade de Farmácia da UFG, pelas correções valiosas realizadas neste trabalho para a qualificação. Agradeço as professoras Josiane Faganello, Megmar Aparecida dos Santos Carneiro, Orionalda, Maria do Rosário e Carolina pela prontidão em aceitar o convite para a correção deste trabalho para a defesa. A CAPES pelo auxílio financeiro. A Universidade Federal de Goiás, em especial ao Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública e ao Programa de Pós Graduação em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro pela disponibilidade de toda estrutura e oportunidade para cursar o mestrado. A todos que direta ou indiretamente colaboraram para que este trabalho fosse realizado.

Sumário 1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ............................................................. 3

1.1. Espécies do complexo Cryptococcus neoformans ............................................ 3 1.1.1. Fatores de virulência .................................................................................. 6 1.1.2. Vias de penetração de leveduras do complexo C. neoformans .................. 8 1.1.3. Manifestações clínicas ............................................................................... 9 1.1.4. Panorama da criptococose ....................................................................... 12 1.1.5. Tratamento............................................................................................... 14 1.1.6. Resistência aos antifúngicos convencionais ............................................. 17

1.2. Plantas medicinais .......................................................................................... 18 1.2.1. Óleos essenciais de plantas ..................................................................... 19 1.2.2. Composição e atividade antifúngica dos OEs .......................................... 21 1.2.3. Litsea cubeba (Lour.) Pers. ...................................................................... 23 1.2.4. Cymbopogon martini (Roxb.) Will. Watson ............................................... 25

1.3. Associação entre produtos naturais e fármacos antifúngicos .......................... 27 1.4. Ensaios in vitro para detecção de atividade biológica de compostos naturais . 29

2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 32 3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 34 4. MÉTODOS ............................................................................................................ 35

4.1. Isolados clínicos e cepas padrão .................................................................... 35 4.2. Óleos essenciais ............................................................................................. 35

4.2.1. Obtenção ................................................................................................. 35 4.3. Fármacos antifúngicos .................................................................................... 35 4.4. Testes de suscetibilidade in vitro ..................................................................... 36

4.4.1. Preparo dos óleos essenciais e constituintes majoritários ........................ 36 4.4.2. Preparo do inóculo ................................................................................... 36 4.4.3. Procedimento do teste ............................................................................. 36 4.4.4. Leitura ...................................................................................................... 37 4.4.5. Concentração Fungicida Mínima (CFM) ................................................... 37

4.5. Associação dos OEs e dos compostos majoritários com anfotericina B e fluconazol .................................................................................................................. 38

4.5.1. Procedimento dos testes .......................................................................... 39 4.6. Avaliação da curva de morte celular de C. gattii sob ação do OE L. cubeba e C. martini e seus componentes majoritários ................................................................... 40 4.7. Ensaio de quantificação do ergosterol ............................................................. 41 4.8. Avaliação da ação dos OEs e compostos majoritários sobre a membrana plasmática ................................................................................................................. 43 4.9. Avaliação da citotoxicidade ............................................................................. 44 4.10. Análise estatística ........................................................................................... 45

5. RESULTADOS ...................................................................................................... 46

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 60 7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 70 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 72 ANEXOS ....................................................................................................................... 94

Anexo 1. Parecer do comitê de ética em pesquisa. ................................................... 94 Anexo 2. Laudo técnico – Óleo essencial de C. martini ............................................. 95 Anexo 3. Laudo técnico – Óleo essencial de L. cubeba ............................................. 96 Anexo 4. Valores de CIM e CFM de AMB e fluconazol e valores de ICIF e interpretação do teste de associação. ....................................................................... 97

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Espécies do complexo Cryptococcus neoformans: classificação das espécies, sorotipos e tipos moleculares (Adaptado de Lin & Heitman, 2006). ................................. 4

Figura 2. Morfologia macroscópica e microscópica de C. neoformans. A) Colônia mucoide de C. neoformans em Ágar Sabouraud dextrose B) Leveduras encapsuladas de C. neoformans em tinta nanquim (400x). .................................................................... 5

Figura 3. Colônias de C. neoformans melanizado em meio L-DOPA. Fonte: autoria própria. ............................................................................................................................ 8

Figura 4. Ciclo saprófita e parasitário de Cryptococcus neoformans: leveduras e/ou basidiósporos aerolizados em ambiente associado à excretas de pombos são inalados; atingem os alvéolos pulmonares onde são fagocitados, se reproduzem nos macrófagos e se disseminam (Murray et al. 2009). ............................................................................. 9

Figura 5. Fórmula estrutural plana da unidade isopreno (5-metil-buta-1,3-dieno), dos quais são formados os monoterpenos (2 unidades isopreno) e sesquiterpenos (3 unidades isopreno). ....................................................................................................... 22

Figura 6. Flores de Litsea cubeba (ZhongWeiHorticulturalProducts 2014). ................... 24

Figura 7. Frutos de Litsea cubeba (ZhongWeiHorticulturalProducts 2014). ................... 24

Figura 8. Estrutura do citral (geranial e neral) e do limoneno, principais componentes do OE do fruto de L. cubeba. ............................................................................................. 25

Figura 9. Folhas e flores de Cymbopogon martini (SnowLotus 2014). ........................... 26

Figura 10. Flores de Cymbopogon martini (B&TWorldSeeds 2014). ............................. 27

Figura 11. Estrutura do geraniol e acetato de geranila, principais componentes do OE das folhas de C. martini. ................................................................................................ 27

Figura 12. Placa de microdiluição para o teste de suscetibilidade in vitro dos OEs. Fonte: Autoria própria. ................................................................................................... 37

Figura 13. Teste para avaliação da concentração fungicida mínima. Fonte: autoria própria. .......................................................................................................................... 38

Figura 14 Teste de suscetibilidade antifúngica através do método de Chequerboard. Fonte: autoria própria. ................................................................................................... 40

Figura 15. Curva de morte de C. gattii sob ação dos OEs ou compostos majoritários. Fonte: autoria própria. ................................................................................................... 41

Figura 16. Ensaio de quantificação do ergosterol celular fúngico após ação dos OEs ou constituintes majoritários em diferentes concentrações. ................................................ 42

Figura 17. Porcentagem de isolados do complexo C. neoformans inibidos de acordo com diferentes concentrações do OE de L. cubeba e seu composto majoritário, citral (*p<0,05). ...................................................................................................................... 47

Figura 18. CFMs do OE L. cubeba e seu composto majoritário, citral, sobre isolados do complexo C. neoformans. .............................................................................................. 48

Figura 19. Porcentagem de isolados do complexo C. neoformans inibidos de acordo com diferentes concentrações do OE de C. martini e seu composto majoritário, geraniol (*p<0,05). ...................................................................................................................... 49

Figura 20. CFMs do OE C. martini e seu composto majoritário, geraniol, sobre isolados do complexo C. neoformans (*p<0,05). ......................................................................... 49

Figura 21. Interação da AMB com OE de L. cubeba ou seu componente majoritário, citral sobre 17 isolados do complexo C. neoformans. .................................................... 50

Figura 22. Interação do fluconazol com OE de L. cubeba ou seu componente majoritário, citral sobre 17 isolados do complexo C. neoformans (*p<0,05). .................. 51

Figura 23. Interação da AMB com OE de C. martini ou seu componente majoritário, geraniol sobre 17 isolados do complexo C. neoformans................................................ 52

Figura 24. Interação do fluconazol com OE de C. martini ou seu componente majoritário, geraniol sobre 17 isolados do complexo C. neoformans................................................ 52

Figura 25. Curva de morte de C. gattii 24065 após tratamento com a CFM dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus compostos majoritários, e controle positivo tratado com AMB e negativo não tratado. ......................................................................................... 53

Figura 26. Perfil espectrofotométrico dos esteróis de C. gattii 24065 após tratamento com os OEs e constituintes majoritários. (A) L. cubeba nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 32 (b), 64 (c) e 128 (d). (B) Citral nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 64 (b) e 128 (c). (C) C. martini nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 256 (b), 512 (c). (D) Geraniol nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 256 (b) e 512 (c). (F) Fluconazol nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 4 (b), 8 (c), 16 (d) e 32 (e). ...................................................................... 55

Figura 27. Histogramas de C. gattii ATCC 24065 (A) Controle de autofluorescência, (B) Controle negativo, (C) Controle com álcool etílico 70%. O eixo X mostra, em escala logarítmica, a intensidade de fluorescência das células marcadas com PI. O gate M1 mostra a porcentagem de células não viáveis, marcadas.............................................. 56

Figura 28. Histogramas de C. gattii ATCC 24065 tratado com diferentes concentrações dos OE e composto majoritário. C. martini (D1) 2048 µg/mL (CFM), (D2) 1024 µg/mL (1/2 CFM), (D3) 512 µg/mL (1/4 CFM) e Geraniol (E1) 2048 µg/mL (CFM), (E2) 1024 µg/mL (1/2 CFM) e (E3) 512 µg/mL (1/4 CFM). O eixo X mostra, em escala logarítmica, a intensidade de fluorescência das células marcadas com PI. O gate M1 mostra a porcentagem de células não viáveis, marcadas. ........................................................... 57

Figura 29. Histogramas de C. gattii ATCC 24065 tratado com diferentes concentrações do OE e composto majoritário. L. cubeba (F1) 256 µg/mL (CFM), (F2) 128 µg/mL (1/2 CFM), (F3) 64 µg/mL (1/4 CFM)e Citral (G1) 256 µg/mL (CFM), (G2) 128 µg/mL (1/2 CFM), (G3) 64 µg/mL (1/4 CFM). O eixo X mostra, em escala logarítmica, a intensidade de fluorescência das células marcadas com PI. O gate M1 mostra a porcentagem de células não viáveis, marcadas. ...................................................................................... 58

Figura 30. Ensaio de atividade hemolítica realizado com os OEs de L. cubeba e C. martini, em concentrações de 4096 µg/mL a 8 µg/mL. Controle positivo: Triton X-100 a 1% e controle negativo: sangue em tampão PBS. ......................................................... 59

Figura 31. Ação dos OEs L. cubeba, C. martini, citral e geraniol sobre hemácias. A quantidade de hemoglobina liberada pela lise celular foi determinada por absorbância de 560 nm e comparada ao controle positivo. ............................................................... 59

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Atividade antifúngica dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus compostos majoritários, citral e geraniol, sobre 15 isolados do complexo C. neoformans e duas cepas padrão. ............................................................................................................... 46

Tabela 2. Inibição da biossíntese de ergosterol por L. cubeba, C. martini e seus compostos majoritários em C. gattii 24065. ................................................................... 54

SIGLAS E ABREVIATURAS

5-FC 5-fluorocitosina Aids Síndrome da imunodeficiência adquirida

ASD Ágar Sabouraud Dextrose ATCC American Type Culture Colection AMB Anfotericina B

CFM Concentração Fungicida Mínima CIF Concentração Inibitória Fracionária

CIM Concentração Inibitória Mínima

CLSI Clinical Laboratory Standard Institute

CNA1 Gene codificador da calcineurina A

CSD Caldo Sabouraud Dextrose

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

EDTA Ácido Etilenodiamino tetra-acético GC/MS Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas HAART Terapia antirretroviral altamente ativa

HIV Human Immunodeficiency Virus

ICIF Índice de Concentração Inibitória Fracionária DOPA 3,4-dihidroxifenilanalanina MOPS Ácido 3-(N-morfolino)-propanossulfônico) MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio OEs Óleos essenciais PBS Tampão fosfato-salino

PCR Reação em cadeia da polimerase

PFGE Eletroforese em gel de campo pulsátil

PI Iodeto de Propídio RAPD Amplificação aleatória de DNA polimórfico

RPMI Roswell Park Memorial Institute SNC Sistema Nervoso Central

24(28)DHE 24 (28) Dihidroergosterol

1

RESUMO A criptococose é uma infecção fúngica causada por espécies do complexo Cryptococcus neoformans (C. neoformans e C. gattii) com alta incidência em indivíduos com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids). Os antifúngicos utilizados na terapia dessa infecção são escassos e, além disso, possuem toxicidade evidente e baixa eficácia, o que motiva a busca por novos candidatos a antifúngicos. Os óleos essenciais (OEs) extraídos do fruto de Litsea cubeba (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) e das folhas de Palmarosa (Cymbopogon martini (Roxb.) Will. Watson) e seus constituintes majoritários, citral e geraniol, foram investigados como fontes de ação antifúngica. Os objetivos foram determinar a atividade antifúngica isolada e associada à anfotericina B (AMB) ou fluconazol (FLU) sobre 15 isolados e duas cepas padrão do complexo C. neoformans, além de avaliar a curva de morte, a ação sobre a biossíntese do ergosterol e sobre a membrana celular do fungo e a citotoxicidade dos OEs e constituintes majoritários sobre hemácias humanas. Por meio de testes de suscetibilidade in vitro e de concentração fungicida mínima (CFM), verificou-se melhor atividade para L. cubeba e citral. Os OEs e constituintes majoritários avaliados exibiram concentração inibitória mínima (CIM) entre 16 e 512 µg/mL e CFM entre 64 e 2048 µg/mL, com CIM90 de 128 µg/mL para L. cubeba e citral e de 512 µg/mL para C. martini e geraniol. Para avaliar a associação dos OEs com antifúngicos foi realizado o método de Chequerboard, onde houve indiferença na associação de AMB a L. cubeba (94,1%) e citral (70,6%), e na associação com FLU, L. cubeba foi antagônico (76,5%) e citral indiferente (94,%). C. martini e geraniol apresentaram sinergismo associados a AMB, respectivamente, em 52,9 e 70,6% dos isolados, e indiferença associado ao FLU em 64,7% e 88,2%. A curva de morte de C. gattii 24065 sob ação dos OEs e constituintes majoritários mostrou uma rápida ação fungicida, que ocorreu após uma hora de incubação para L. cubeba, C. martini e geraniol, e em duas horas para o citral. A quantificação do ergosterol após contato com os OEs e constituintes majoritários mostrou que L. cubeba e citral inibiram 100% da biossíntese desse esterol na CIM e 64% para C. martini, o que provavelmente é um mecanismo de ação destes agentes, exceto para o geraniol, que reduziu apenas 12% na CIM. Os OEs e compostos majoritários não apresentaram capacidade de lesionar a membrana plasmática de C. gattii, visto que em média de 2,7% das células foram marcadas com iodeto de propídio e detectadas por citometria de fluxo. O ensaio de citotoxicidade in vitro por hemólise mostrou que os OEs e constituintes majoritários não foram tóxicos nas CIMs e CFMs. Os resultados observados no presente trabalho mostram que os OEs de L. cubeba e C. martini e seus constituintes majoritários, citral e geraniol, são promissores candidatos a antifúngicos.

2

ABSTRACT Cryptococcosis is a fungal infection caused by species of the complex Cryptococcus neoformans (C. neoformans and C. gattii) with high incidence in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Antifungal drugs used in therapy of this infection are scarce and, in addition, have evident toxicity and low effectiveness, which motivates the search for new candidates to antifungals. Essential oils (EOs) extracted from the fruit of Litsea cubeba (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) and leaves of Palmarosa (Cymbopogon martini (Roxb.) Will. Watson) and its major constituents, citral and geraniol, were investigated as antifungal sources. The aims of this work were to determine the isolated or associated antifungal activity of EOs and major constituents with amphotericin B (AMB) or fluconazole (FLU) on 15 isolates and two standard strains of C. neoformans complex, evaluate the time-kill curve, the action on the biosynthesis of ergosterol and on cell membrane, in addition to verify the cytotoxicity of EOs and major constituents on human erythrocytes. By in vitro susceptibility testing and minimum fungicidal concentration (MFC), the best activities were to L. cubeba and citral. The EOs and major constituents exhibited minimum inhibitory concentration (MIC) between 16 and 512 µg/mL and 64 and 2048 µg/mL, with a MIC90 of 128 µg/mL for L. cubeba and citral, and 512 µg/mL for C. martini and geraniol. To evaluate the association of EOs and major constituents with antifungal agents was performed the Chequerboard method, that showed indifference in the association of AMB and L. cubeba (94.1%) or citral (70.6%). In association with FLU, L. cubeba was antagonistic (76.5%) and indifferent (94%) for citral. C. martini and geraniol showed synergism associated with AMB, respectively, in 52.9 and 70.6% of isolates, and showed indifference when associated with the FLU in 64.7% and 88.2%. C. gattii 24065 time-kill curve under the action of EOs and major constituents showed a rapid fungicidal activity, which occurred after one hour incubation for L. cubeba, C. martini and geraniol, and after two hours for citral. The amount of ergosterol was quantified after contact with the EOs and major constituents and showed that L. cubeba and citral inhibited 100% of sterol biosynthesis in MIC and 64% for C. martini. This is the probably mechanism of action of these agents, except for geraniol, which reduced only 12% in MIC. The major compounds of EOs showed no ability to injure the plasma membrane of C. gattii, since an average of 2.7% propidium iodide labeled cells were detected by flow cytometry. The in vitro cytotoxicity assay by hemolysis showed that EOs and major constituents were not toxic in the MIC and MFCs. Taken together, our results showed that the EOs of L. cubeba and C. martini and their major constituents, citral e geraniol are promising as candidates for new antifungal agents.

3

1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1. Espécies do complexo Cryptococcus neoformans

Espécies do complexo C. neoformans são leveduras encapsuladas que

causam infecção em humanos e outros animais (Murray et al. 2009, Negroni

2012). Estas leveduras acometem com maior frequência e gravidade os

indivíduos imunocomprometidos e, no entanto, também podem causar infecção

em hospedeiros saudáveis (Mitchell & Perfect 1995, Pfaller et al. 2009).

Taxonomicamente, as espécies do complexo C. neoformans são

classificadas no reino Fungi, filo Basidiomycota, ordem Tremellales, família

Tremellaceae e gênero Cryptococcus (Hibbett et al. 2007, Kurtzman et al. 2011,

Antinori 2013). De 39 espécies do gênero Cryptococcus (Ma & May 2009), duas

são patógenos humanos: C. neoformans e C. gattii, caracterizando o complexo

C. neoformans (Feng et al. 2008). Este complexo foi classificado a partir de

particularidades genéticas, fenotípicas, de habitat, epidemiológicas, clínicas e de

resposta à terapia antifúngica (Franzot et al. 1999, Boekhout et al. 2001, Ma &

May 2009). Características como habilidade de usar glicina como fonte de

carbono e nitrogênio, resistência a canavanina, urease resistente ao ácido

etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e a morfologia dos basidiósporos, fizeram

com que C. neoformans fosse subdividido nas variedades C. neoformans var.

neoformans e C. neoformans var. grubii (Figura 1) (Lin & Heitman 2006, Ma &

May 2009).

Reações de aglutinação de antígenos presentes na cápsula

polissacarídica permitiram subclassificar as espécies e variedades em cinco

sorotipos: C. neoformans var. grubii sorotipo A, C. neoformans var. neoformans

sorotipo D, sorotipo híbrido AD e C. gattii sorotipos B e C (Ikeda et al. 1982,

Ikeda et al. 1985, Mitchell & Perfect 1995, Lin & Heitman 2006).

Na última década, técnicas de genotipagem como reação em cadeia da

polimerase (PCR), eletroforese em gel de campo pulsátil (PFGE), amplificação

aleatória de DNA polimórfico (RAPD) e estudos de hibridização de ácido

desoxirribonucleico (DNA) têm sido utilizadas no estudo genotípico e

epidemiológico de C. neoformans, classificando em nove tipos moleculares, com

base em polimorfismos na sequência de DNA: sorotipo A (VNI, VNII ou VNB),

4

sorotipo B (VGI, VGII e VGIII), sorotipo C (VGIII ou VGIV), sorotipo D (VNIV) e o

híbrido AD (VNII) (Boekhout et al. 2001, Latouche et al. 2003, Meyer et al. 2003,

Lin & Heitman 2006, Bovers et al. 2008) (Figura 1).

Figura 1. Espécies do complexo Cryptococcus neoformans: classificação das espécies, sorotipos e tipos moleculares (Adaptado de Lin & Heitman, 2006).

C. neoformans e C. gattii crescem em ágar Sabouraud Dextrose formando

colônias de cor branca a creme, brilhantes, mucoides, de margem lisa, após 48

a 72 horas (Chayakulkeeree & Perfect 2006, Moretti et al. 2008, Negroni 2012)

(Figura 2). Ambas as espécies podem crescer na maioria dos meios de cultura

para fungos, em temperatura de 30 a 37ºC, sob condições aeróbias

(Chayakulkeeree & Perfect 2006). Microscopicamente, apresentam-se como

leveduras de 3 a 8 µm de diâmetro, globosas e/ou ovaladas com ou sem

brotamentos e uma típica cápsula mucopolissacarídica, que pode ser

evidenciada em preparações com tinta nanquim ou observada ao microscópio

de contraste de fase (Moretti et al. 2008, Chaturvedi & Chaturvedi 2011, Negroni

2012) (Figura 2).

5

Figura 2. Morfologia macroscópica e microscópica de C. neoformans. A) Colônia mucoide de C. neoformans em Ágar Sabouraud dextrose B) Leveduras encapsuladas de C. neoformans em tinta nanquim (400x).

O ciclo de vida das leveduras do complexo C. neoformans envolve a

forma assexuada e sexuada (basidiósporos). O estágio assexuado é

representado sob a forma de levedura, encontrada em espécimes clínicos, em

cultura, e no meio ambiente, reproduzindo-se por brotamento. As espécies C.

neoformans e C. gattii assumem a forma filamentosa multicelular durante a fase

teleomorfa, quando são denominadas Filobasidiella neoformans e Filobasidiella

bacillispora, respectivamente (Kwon-Chung 1976, Negroni 2012). Nesta fase, a

reprodução acontece em condições de escassez de nutrientes, que estimula a

produção de feromônios e induz a fusão célula-célula (Cerikcioglu 2009). O

cruzamento ocorre geralmente entre os mating types α e a, produzindo

filamentos e basidiósporos de ambos os tipos sexuais (Huston & Mody 2009,

Negroni 2012). A reprodução sexuada permite a troca de genes, como aqueles

envolvidos na virulência e resistência a antimicrobianos entre cepas, e o

rearranjo destes genes possibilita produzir novas combinações, podendo levar

ao aumento da patogenicidade e resistência (Grigg et al. 2001, Campbell &

Carter 2006). A existência de reprodução do tipo assexuada e sexuada, além da

capacidade de recombinação via cruzamento entre o mesmo tipo sexual

aumentam a diversidade genética. Isto também auxilia na adaptação de

Cryptococcus spp. às mudanças de condições ambientais, tais como durante a

infecção ao hospedeiro mamífero ou no meio ambiente (Huston & Mody 2009,

Butler 2010).

6

A reprodução entre mating types α é encontrada em cepas que

apresentam maior virulência, conforme foi observado em cepa de C. gattii

envolvida no surto ocorrido entre 1999 e 2001, na ilha de Vancouver, Canadá

(Stephen et al. 2002, Kidd et al. 2004, Huston & Mody 2009).

Cryptococcus neoformans é ubíquo, ocorre em diversos substratos

orgânicos e está associado ao habitat onde se encontram excretas secas de

aves, que contém fontes de nitrogênio como ureia e creatinina (Casadevall &

Perfect 1998, Moretti et al. 2008, Negroni 2012). Condições favoráveis ao

crescimento abundante desta levedura levam a formação de microfocos,

notadamente relacionados a pombos em centros urbanos (Kobayashi et al.

2005, Moretti et al. 2008), onde formas viáveis do fungo são encontradas por

mais de dois anos (Casadevall & Perfect 1998, Negroni 2012). C. gattii está

associado à madeira em decomposição e a espécies de Eucaliptos, onde é

encontrado na casca, fruto e solo ao redor da árvore (Chayakulkeeree & Perfect

2006, Negroni 2012). Apesar da capacidade de desenvolver um ciclo saprofítico

completo no ambiente, as leveduras do complexo Cryptococcus neoformans

desenvolveram fatores de virulência que permitem a infecção em animais

(Casadevall & Perfect 1998, Jackson & Powderly 2007).

1.1.1. Fatores de virulência

A capacidade de causar infecção está relacionada a mecanismos que

influenciam a patogenicidade de isolados de C. neoformans e C. gattii, entre eles

a presença de cápsula, habilidade de crescer a 37°C, produção de enzimas e de

melanina (Casadevall 2006, Ma & May 2009).

A cápsula é um dos principais fatores de virulência nestes fungos, agindo

como uma barreira contra as defesas do hospedeiro por inibição da fagocitose,

através da resistência à digestão no fagossomo (Tucker & Casadevall 2002, Ma

& May 2009). Essa estrutura é composta de polissacarídeos de alto peso

molecular, predominantemente glucuronoxilomanana, e em menor quantidade,

galactoxilomanana e manoproteínas (Casadevall & Perfect 1998, Casadevall

2006, Moretti et al. 2008). Apresenta importante função no meio ambiente ao

promover proteção contra a dissecação aos raios ultravioleta e à fagocitose

(Casadevall 2006).

7

A habilidade de crescer a 37°C é fundamental para as espécies de C.

neoformans e C. gattii causarem infecção em mamíferos (Idnurm et al. 2005, Ma

& May 2009). Esta capacidade de crescimento em temperatura elevada está

relacionada à presença do gene codificador da calcineurina A (CNA1) que,

quando deletado experimentalmente, torna determinada cepa viável a

temperatura ambiente, mas incapaz de crescer a 37ºC (Odom et al. 1997, Ma &

May 2009).

A produção de diversas enzimas degradativas como proteinases e

fosfolipases é outro fator de virulência importante nestes micro-organismos (Ma

& May 2009, Negroni 2012). As proteinases causam dano tecidual por degradar

proteínas envolvidas na imunidade do hospedeiro, incluindo colágeno, elastina,

fibrinogênio, imunoglobulinas e fatores do sistema complemento (Ma & May

2009). As fosfolipases tem função hidrolítica, resultando na desestabilização das

membranas e lise celular, além de aumentarem a adesão de C. neoformans às

células epiteliais pulmonares (Ma & May 2009). A produção da enzima urease,

que catalisa a hidrólise de ureia para amônia e carbamato, tem papel importante

na invasão do fungo ao sistema nervoso central (SNC). A urease facilita a

transmissão sangue-cérebro durante a disseminação hematogênica do mesmo,

através do aumento do sequestro de leveduras para os microcapilares

(Casadevall 2006, Ma & May 2009)

A melanina, outro fator de virulência importante, tem propriedades

antioxidantes e protege C. neoformans da morte oxidativa por fagócitos (Sabiiti &

May 2012). Pode ainda proteger o fungo contra antifúngicos como anfotericina B

(AMB) e caspofungina, os quais têm ação reduzida em experimentos onde a

célula é melanizada (Emery et al. 1994). A melanina consiste em uma

macromolécula hidrofóbica, que pode ser produzida por C. neoformans na

presença de compostos di ou polifenólicos como 3,4-dihidroxifenilanalanina (L-

Dopa). O repique em meio de cultura contendo L-Dopa resulta em coloração

amarronzada ou preta das colônias e permite a identificação do gênero em

laboratório (Figura 3) (Langfelder et al. 2003, Pedroso & Candido 2006). No

ambiente, a melanina tem função de proteger a levedura contra luz ultravioleta e

dar maior resistência a variações bruscas de temperatura, como congelamento e

descongelamento (Casadevall 2006, Ma & May 2009).

8

Figura 3. Colônias de C. neoformans melanizado em meio L-DOPA. Fonte: autoria própria.

1.1.2. Vias de penetração de leveduras do complexo C. neoformans

As leveduras do complexo C. neoformans causam infecção após a

inalação de propágulos de leveduras ou basidiósporos presentes no ambiente

(Jackson & Powderly 2007, Lin 2009). O contato com os alvéolos pulmonares

produz uma infecção assintomática que pode ser eliminada ou controlada pela

resposta imune mediada por células, ou evoluir para infecção latente com

desenvolvimento de granuloma nos pulmões ou linfonodos hilares (Idnurm et al.

2005).

A ausência de uma eficaz resposta imune mediada por células resulta em

uma alteração na fagocitose de Cryptococcus sp., acarretando em disseminação

e aumento da carga de leveduras (Eisenman et al. 2007, Jackson & Powderly

2007). Desta forma, em indivíduos imunocomprometidos, o fungo pode

disseminar-se dos pulmões para o SNC (Figura 4).

Formas raras de penetração do fungo são relatadas, como inoculação

direta na pele devido a trauma e a entrada pelo trato gastrointestinal

(Chayakulkeeree & Perfect 2006).

9

Figura 4. Ciclo saprófita e parasitário de Cryptococcus neoformans: leveduras e/ou basidiósporos aerolizados em ambiente associado à excretas de pombos são inalados; atingem os alvéolos pulmonares onde são fagocitados, se reproduzem nos macrófagos e se disseminam (Murray et al. 2009).

1.1.3. Manifestações clínicas

A criptococose é uma infecção comum em indivíduos

imunocomprometidos, podendo ocorrer também em indivíduos saudáveis. Três

fatores são determinantes para o estabelecimento da doença: o status

imunológico do hospedeiro, a virulência da cepa de Cryptococcus spp. e o

tamanho do inóculo fúngico inalado (Mitchell & Perfect 1995, Negroni 2012).

Os achados clínicos associados à criptococose são geralmente causados

por anormalidades pulmonares e neurológicas, embora Cryptococcus sp. tenha

a capacidade de disseminar-se para a maioria dos órgãos do corpo, inclusive a

pele, ossos, próstata e olhos (Huston & Mody 2009).

10

1.1.3.1 Pulmões

A forma pulmonar da doença, em imunocompetentes, é geralmente de

resolução espontânea, dependendo da quantidade de inóculo inalado. Um terço

destes pacientes é assintomático, sendo recomendado o tratamento antifúngico

para aqueles que apresentam anormalidades à radiografia torácica, como

nódulos isolados ou múltiplos e infiltrado pulmonar (Chayakulkeeree & Perfect

2006). Indivíduos acometidos por doença pulmonar crônica preexistente podem

desenvolver a forma assintomática ou com sintomas moderados como febre,

mal-estar, tosse com produção de escarro e dispneia (Smith & Kauffman 2012).

Em imunocomprometidos, os sintomas comuns são febre, dor torácica, tosse

seca, hemoptise e dispneia, que pode progredir para síndrome da angústia

respiratória aguda (Mitchell & Perfect 1995, Smith & Kauffman 2012). Nestes

pacientes, a pneumonia por C. neoformans tem curso clínico mais rápido e

tende a disseminar rapidamente dos pulmões para o SNC (Mitchell & Perfect

1995, Negroni 2012).

1.1.3.2 Sistema nervoso central

Meningite ou meningoencefalite é a forma clínica que está presente em

70 a 90% dos casos de criptococose em imunodeprimidos (Satishchandra et al.

2007, Escandon et al. 2012).

A neurocriptococose apresenta como principais sintomas febre, cefaleia,

letargia, vômitos, alterações de personalidade e perda de memória durante duas

a quatro semanas (Mitchell & Perfect 1995, Hasimoto e Souza et al. 2013).

Entretanto, alguns pacientes podem apresentar cefaleia intensa por alguns dias,

outros por meses ou mesmo não apresentar este sintoma (Chayakulkeeree &

Perfect 2006).

Pacientes HIV positivos que recebem terapia antirretroviral (TARV) podem

apresentar a síndrome inflamatória da reconstituição imune (IRIS), que acarreta

em novas manifestações da infecção criptococócica (Bicanic et al. 2009). O

início da TARV leva ao aumento da resposta imune mediada por células contra

as leveduras viáveis, inviáveis ou antígenos dessas leveduras, revelando uma

infecção latente ou apresentando recorrência de sinais e sintomas da infecção

previamente tratada (Bicanic et al. 2009). Os sinais são indistinguíveis da

11

meningite criptococócica, podendo levar a conclusão errônea de falha na terapia

antifúngica, visto que se trata de uma resposta imune do hospedeiro

(Chayakulkeeree & Perfect 2006).

1.1.3.3 Pele

O aparecimento de lesões cutâneas são observadas em cerca de 6% dos

pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) e são uma

expressão da criptococose disseminada (Neuville et al. 2003, Chayakulkeeree &

Perfect 2006). Os pacientes podem manifestar vários tipos de lesões, incluindo

púrpuras, vesículas, nódulos, abcessos, úlceras, pústulas, celulites, placas e

lesões acneiformes, sendo comum pápulas com ulceração central, similar ao

molusco contagioso (Murakawa et al. 1996). Devido à diversidade de

manifestações cutâneas, é necessário o diagnóstico diferencial para herpes,

molusco contagioso, sarcoma de Kaposi e as micoses causadas por

Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis e Penicillium marneffei (Mitchell &

Perfect 1995, Chayakulkeeree & Perfect 2006). Infecções cutâneas primárias em

imunocompetentes são raras, podendo ocorrer em regiões endêmicas, e

descrito também casos de acidentes em laboratório por inoculação direta do

fungo na pele (Casadevall et al. 1994, Neuville et al. 2003). Estas lesões são

tuberculadas, nodulares ou com abcessos no local do trauma, geralmente

benignas e com evolução espontânea (Negroni 2012).

1.1.3.4 Olhos

A disseminação de Cryptococcus spp. a partir dos pulmões pode

acarretar anormalidades oculares em mais de um terço dos pacientes com

meningite criptococócica (Antinori 2013). A hipertensão intracraniana pode

ocasionar o papiledema, que progride para perda parcial ou total da visão. As

leveduras podem infiltrar-se no nervo ótico e produzir cegueira de curso rápido,

com poucos recursos terapêuticos efetivos (Chayakulkeeree & Perfect 2006,

Negroni 2012).

12

1.1.3.5 Infecção em outros locais do corpo

O acometimento da próstata pelo C. neoformans, embora comumente

assintomático, é considerado um refúgio para o fungo durante o tratamento

(Chayakulkeeree & Perfect 2006). Pacientes com alta carga de leveduras podem

ter a infecção latente na glândula, sendo uma potencial fonte de reinfecção após

a conclusão da terapia antifúngica (Ndimbie et al. 1994).

Manifestações menos frequentes incluem lesões ósseas, endocardite,

peritonite e linfadenopatia (Stiefel et al. 1999, Negroni 2012, Bariteau et al.

2014).

1.1.4. Panorama da criptococose

A prevalência relevante da criptococose começou no fim da década de

1970, com o crescente número de pessoas com imunossupressão, associada a

casos de câncer, doenças autoimunes, transplantes e ao tratamento com

corticosteroides (Mitchell & Perfect 1995). Na década de 1980, com o início da

pandemia do HIV, os casos de criptococose aumentaram dramaticamente e se

tornaram pertinente causa de morte em pacientes com aids (Selik et al. 1997,

Levitz & Boekhout 2006). A doença permanece como uma coinfecção importante

nestes pacientes, representando globalmente a quarta causa de morte em

indivíduos com aids e diagnosticada como doença definidora desta síndrome em

20 a 30% dos casos (Chayakulkeeree & Perfect 2006, Park et al. 2009).

Em 1996 foi introduzido nos Estados Unidos um tratamento composto

pela combinação de medicamentos antirretrovirais contra o HIV, a terapia

antirretroviral altamente ativa (HAART), que rapidamente diminuiu os índices de

criptococose e outras doenças oportunísticas associadas a aids em países

desenvolvidos (Palella et al. 1998, Mirza et al. 2003). Na América do Norte,

estudo em duas regiões metropolitanas nos Estados Unidos mostrou queda

gradual dos casos de criptococose, de em média 4,5 casos a cada cem mil

habitantes em 1992 para 0,8 casos a cada cem mil habitantes em 2000 (Mirza et

al. 2003). Em levantamento entre 2004 e 2008 nos Estados Unidos, um estudo

multicêntrico revelou que 50% dos 320 casos de infecções fúngicas ocorridas

em HIV positivos no período eram por leveduras do complexo C. neoformans,

demonstrando a importância desta infecção mesmo na era pós-HAART

13

(Marukutira et al. 2014). No Canadá, a espécie C. gattii é endêmica e foi o

agente etiológico de um surto da doença na ilha de Vancouver, em 2001, onde

foram confirmados 50 casos em humanos e 45 em animais, a maioria

imunocompetentes (Stephen et al. 2002, Kidd 2004).

Estudo de Dromer et al (2004) apresentou a evolução dos casos de

criptococose na França entre 1985 e 2001, onde após a inserção da HAART

houve decréscimo de 46% dos casos de criptococose associada a aids.

Atualmente, os casos de criptococose são de em média 0,3 casos a cada cem

mil habitantes no país (Bitar et al. 2014). Outros países da Europa como

Espanha, Itália e Reino Unido também relatam a prevalência de criptococose

(Viviani et al. 2006, Romeo et al. 2012, Cogliati 2013, Rodriguez-Tudela et al.

2015).

Na Oceania, a maioria dos casos são reportados na Austrália (Cogliati

2013), onde foram descritos 18 casos em imunocompetentes da região rural,

entre 1993 e 2000 (Jenney et al. 2004). As leveduras do complexo C.

neoformans também ocorrem em outros países da Oceania, como Nova

Zelândia e Papua Nova Guiné (Cogliati 2013).

Apesar da distribuição mundial da HAART, a criptococose continuou

prevalente em vários países (Chayakulkeeree & Perfect 2006, Moretti et al.

2008). No continente asiático, a ilha de Taiwan, na China, registrou 219 casos

de criptococose, entre 1997 e 2010, dos quais 24,7% estavam associados a aids

(Tseng et al. 2013). Em Xangai, estudo entre 1997 e 2007 descreveu as

características da doença em 154 pacientes HIV negativos (Zhu et al. 2010). No

Japão, 44 isolados clínicos de C. neoformans var. grubii foram identificados

entre 1992 e 2011(Umeyama et al. 2013). Na Índia, 39 casos foram descritos em

um ano de estudo, dos quais 15 eram de pacientes HIV positivos (Jain et al.

2005).

No continente africano, a incidência de criptococose é elevada (Corbett et

al. 2002, Cogliati 2013, Oladele & Denning 2014). Em Uganda, 136 casos foram

descritos em um ano e meio de estudo com pacientes com aids (Kambugu et al.

2008), enquanto no Quênia 76 casos da doença foram diagnosticadas em um

ano, todos associados a aids (Baldassarre et al. 2014).

Vários países da América Latina reportaram casos de criptococose (Nucci

et al. 2010, Vidal et al. 2013). Na Argentina, entre 2008 e 2013, foram

14

detectados 26 casos da doença, dos quais 69% eram em pacientes HIV

positivos (Cattana et al. 2015). Na Colômbia, foram relatados 526 casos em

quatro anos de levantamento, dos quais 83% eram em HIV positivos (Escandon

et al. 2012). Também já foram descritos casos no Chile e Venezuela (Calvo et al.

2001), México (Ramirez-Crescencio et al. 2013) e Porto Rico (Loperena-Alvarez

et al. 2010).

No Brasil, a criptococose ocorre em todas as regiões do país (Favalessa

et al. 2014). Na região norte, no Amazonas, foram descritas as características de

57 isolados do complexo C. neoformans entre 2006 e 2010, onde 77% eram HIV

positivos (Da Silva et al. 2012). Na região nordeste, foram relatados 62 casos de

criptococose entre 2006 e 2010 na Bahia (Matos et al. 2012), um caso em um

ano de estudo em um hospital universitário em Pernambuco (Couto et al. 2011)

e 20 casos em quatro anos de estudo em um hospital de referência no Piauí

(Soares et al. 2008). A ocorrência de criptococose tem sido relatada em estados

da região sudeste, como Espírito Santo (Ribeiro & Ngamskulrungroj 2008),

Minas Gerais (Nobre et al. 2003) e São Paulo (Matsumoto et al. 2007). Também

há estudos com isolados da região sul do país, no Rio Grande do Sul (Casali et

al. 2003, Leal et al. 2008).

Em Goiás, região Centro-Oeste, verificou-se um predomínio de C.

neoformans (94,4%) em 62 casos ocorridos entre 2009 e 2010, onde 85% dos

pacientes eram HIV positivos (Hasimoto e Souza et al. 2013). No Mato grosso

do Sul, na mesma região, entre 123 casos de criptococose analisados em dez

anos, 84,5% dos pacientes eram HIV positivos (Lindenberg Ade et al. 2008).

Outro estudo no mesmo estado, entre 1998 e 2012, descreveu as características

da doença em 48 indivíduos (Tsujisaki et al. 2013).

1.1.5. Tratamento

1.1.5.1 Antifúngicos

Os fármacos empregados na terapia convencional da criptococose são

AMB, 5-fluorocitosina (5-FC), fluconazol e itraconazol, administrados

individualmente ou em associação, de acordo com as manifestações clínicas

(Chayakulkeeree & Perfect 2006, Negroni 2012).

15

Desenvolvida na década de 50, a partir do produto da bactéria

Streptomyces nodosus, a AMB desoxicolato é um poliênico amplamente

empregado em doenças fúngicas de variadas etiologias (Thompson 2002). Atua

sobre a membrana citoplasmática do fungo, ligando-se ao ergosterol, principal

esterol do fungo, e produzindo canais iônicos que resultam na perda de

metabólitos essenciais, acarretando em morte celular (Rapp et al. 1997, Murray

et al. 2009). A capacidade de se ligar fracamente ao colesterol da membrana

celular humana contribui para o efeito nefrotóxico do fármaco, o que constitui um

problema na terapia com a AMB desoxicolato (Saliba & Dupont 2008). Por outro

lado, a formulação lipossomal da AMB que consiste no fármaco envolvido por

vesículas lipídicas, formadas pela mistura de fosfolipídios e colesterol, diminui a

toxicidade deste fármaco à célula animal e, embora tenha o custo aumentado, é

uma alternativa ao tratamento quando comparado à formulação convencional

(Chayakulkeeree & Perfect 2006). Nas formas graves de criptococose,

principalmente com envolvimento do SNC, a terapia antifúngica é realizada em

três fases (Perfect et al. 2010). A fase de indução consiste na administração de

AMB durante duas semanas associada a 5-FC, e tem por objetivo a negativação

ou redução efetiva da carga fúngica (Jackson & Powderly 2007, Ramos-e-Silva

et al. 2012); seguida da fase de consolidação, com no mínimo oito semanas, que

almeja manter a negatividade micológica e normalizar os parâmetros clínicos e

laboratoriais do paciente (Perfect et al. 2010). A última fase do tratamento é a

terapia de manutenção, que ocorre por no mínimo um ano, dependendo do

status imune do indivíduo (Jackson & Powderly 2007, Perfect et al. 2010).

A 5-FC é uma pirimidina fluorada, que penetra na célula fúngica através

de uma enzima permease, e no citoplasma, é convertida em 5-fluoracil (5-FU)

através de desaminação, atuando como um antimetabólito (Vermes et al. 2000).

Por conseguinte, o 5-FU é convertido em ácido fluorídico, que compete com o

uracil na síntese de RNA, resultando em RNA defeituoso e consequente inibição

do DNA e síntese proteica (Ghannoum & Rice 1999, Pfaller 2012). Este fármaco

é utilizado em associação a outro antifúngico, como a AMB, devido à rápida

emergência de isolados resistentes com a monoterapia de 5-FC (Loyse et al.

2013). A associação entre AMB e 5-FC é empregada no tratamento da

criptococose por produzir um efeito sinérgico potente e fungicida, onde o

primeiro rompe a membrana celular e aumenta a permeabilidade da 5-FC, que

16

inibe a síntese de ácido nucléico (Murray et al. 2009, Loyse et al. 2013). Essa

combinação é considerada padrão ouro para tratamento da meningite

criptococócica, pois além de proporcionar maior sobrevida aos pacientes, produz

uma resposta fungicida mais rápida, comparado à administração isolada de AMB

(Day et al. 2013).

Os efeitos colaterais da 5-FC incluem toxicidade gastrointestinal, com

náusea, diarreia e dores abdominais, hepatotoxicidade e depressão medular,

com leucocitopenia e trombocitopenia (Vermes et al. 2000). Frente a estes

efeitos colaterais que podem ser apresentados pelo paciente, este antifúngico

não deve ser administrado em indivíduos em coma, com vômitos frequentes,

leucopenia menor que 3000 células/µL ou elevação das enzimas hepáticas

acima de três vezes do limite de referência (Negroni 2012, Loyse et al. 2013).

Da classe dos triazólicos, o fluconazol apresenta boa distribuição entre

órgãos e tecidos, inclusive o SNC (Thompson 2002). Atua na membrana

citoplasmática, com alvo na inibição da enzima 14-α-demetilase do lanosterol,

envolvida na conversão do lanosterol em ergosterol. Esta inibição interrompe a

síntese da membrana da célula fúngica, resultando em paralisação do

crescimento da célula ou na morte celular (Ghannoum & Rice 1999, Murray et al.

2009). O fluconazol é empregado na terapia de consolidação e de manutenção

(Fortun 2011). Em pacientes com aids, é recomendável o prolongamento da fase

de manutenção até que o paciente tenha contagens de linfócitos T CD4+

maiores que 350/mm3 e carga viral indetectável durante pelo menos três meses

(Satishchandra et al. 2007, Fortun 2011).

O itraconazol é um triazólico lipofílico, com amplo espectro de atividade e

que pode ser utilizado na terapia de manutenção da criptococose. Apresenta

biodisponibilidade variada e interações medicamentosas, sendo que

ocasionalmente acarreta intolerância gastrointestinal, hipocalemia, dislipidemia,

edema, erupções cutâneas, pancreatite e transaminases elevadas (Thompson

2002, Lionakis et al. 2008). Formas moderadas de criptococose, sem

envolvimento do SNC, podem ser tratadas com fluconazol ou itraconazol,

durante seis meses a um ano (Perfect et al. 2010).

17

1.1.6. Resistência aos antifúngicos convencionais

O uso de fluconazol por longo período na terapia de manutenção pode

estar associado ao desenvolvimento de resistência aos azólicos em pacientes

com aids e criptococose (Sanati et al. 1996). Altas CIMs tem sido associadas a

desfechos ruins e ao avanço das infecções durante o tratamento ou profilaxia

antifúngica (Pfaller 2012). Aller et al (2000) correlacionaram o resultado

alcançado com a terapia antifúngica, pelos pacientes, com o perfil de

suscetibilidade dos isolados ao fluconazol, durante a terapia de manutenção.

Dos 25 pacientes avaliados, cinco apresentaram falha na terapia antifúngica e

alta concentração inibitória mínima (CIM) para os isolados do complexo C.

neoformans (≥16µg/mL), demonstrando correlação indicativa de resistência ao

fluconazol (p<0,05). A falha terapêutica levou a desfechos graves, com óbito de

quatro pacientes (Aller et al. 2000).

Em levantamento realizado por Agudelo et al. (2014), entre 71 episódios

de criptococose, 15 isolados eram resistentes ao fluconazol, não sendo

demonstrado correlação entre falha terapêutica e resistência antifúngica nestes

pacientes. Em contrapartida, entre 27 casos de criptococose analisados na

África do Sul, houve correlação entre a recidiva da doença e a infecção por

isolados resistentes ao fluconazol (Bicanic et al. 2006). Outros estudos reportam

resistência ao fluconazol em leveduras do complexo C. neoformans (Orni-

Wasserlauf et al. 1999, Sar et al. 2004).

A avaliação dos isolados de C. neoformans no teste de suscetibilidade ao

fluconazol e 5-FC na Sérvia demonstraram que em 34 isolados, um (2,9%)

apresentou resistência ao fluconazol e dois a 5-FC (5,9%) (Arsic Arsenijevic et

al. 2014), enquanto na Espanha, entre 317 isolados, 46,6% eram resistentes ao

fluconazol e 4,7% a 5-FC (Perkins et al. 2005).

A resistência de leveduras do complexo C. neoformans a AMB não é

comumente citada na literatura (Powderly et al. 1988, Kelly et al. 1994, Perkins

et al. 2005, Manfredi et al. 2006). Uma das razões apontadas para este baixo

número de relatos é a dificuldade de detecção através do protocolo para teste de

suscetibilidade in vitro M27-A do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)

(Lozano-Chiu et al. 1997, Lozano-Chiu et al. 1998, Nguyen et al. 1998, CLSI

2008). O uso do meio de cultura Antibiótico 3 (caldo Penassay) apresentou

18

melhor discriminação entre isolados suscetíveis e resistentes, enquanto com o

meio RPMI 1640, preconizado pelo CLSI, houve sobreposição das CIMs

(Lozano-Chiu et al. 1998). Nesse estudo, entre 12 isolados analisados, três

apresentaram resistência à AMB (Lozano-Chiu et al. 1998).

Atualmente, o arsenal de antifúngicos disponíveis para tratamento das

micoses é escasso e a velocidade na evolução dos mecanismos de resistência

pelos micro-organismos é rápida, tornando fundamental e contínua a busca por

novas moléculas bioativas. Neste contexto, as plantas já utilizadas na medicina

popular merecem ser averiguadas sobre a bioatividade de seus componentes.

1.2. Plantas medicinais

A principal fonte de agentes terapêuticos para o ser humano durante

séculos foram as plantas (Rishton 2008) e a Organização Mundial de Saúde

afirma que aproximadamente 20.000 espécies são usadas em caráter medicinal

no mundo (Phillipson 1994). Apesar dos grandes avanços na medicina curativa

nas décadas recentes, as plantas medicinais ainda tem uma importante

contribuição na área da saúde humana (Calixto 2000).

A importância médica de moléculas isoladas de produtos naturais não

reside apenas em seus efeitos farmacológicos ou terapêuticos, mas também em

seu papel como modelos para a produção de novos medicamentos (Cragg et al.

1997). Pesquisas com plantas levaram ao isolamento e utilização de glicosídeos

cardíacos, como os digitálicos, e uma vasta gama de alcaloides medicinais,

como atropina (antídoto a inibidores da colinesterase), quinina (antimalárico) e

dicumarol (anticoagulante), além de muitos antibióticos (Phillipson 1994). Mais

de vinte por cento de todos os medicamentos são derivados de plantas ou

semissintéticos (Rishton 2008).

Um alvo importante da indústria farmacêutica é o desenvolvimento de

fármacos para tratamento de doenças infecciosas, por se tratarem de uma

causa relevante de morbidade e mortalidade entre a população em geral (Silva &

Fernandes 2010). Os relatos frequentes de bactérias e fungos resistentes aos

antimicrobianos de uso rotineiro também motivam a busca por novos fármacos

(Perkins et al. 2005, Boucher et al. 2009).

19

Muitos trabalhos científicos sobre a atividade antimicrobiana de plantas de

uso popular têm sido descritos, focando na utilização de seus extratos (Souza et

al. 2003, da Costa et al. 2014), dos óleos essenciais (Giordani et al. 2004, Pinto

et al. 2009, Moreira et al. 2010) de alcaloides (Klausmeyer et al. 2004),

flavonoides (Sohn et al. 2004), lactonas de sesquiterpeno (Lin et al. 2003),

diterpenos (El-Seedi et al. 2002) e triterpenos (Katerere et al. 2003).

A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais (OEs) de plantas tem

sido estudada em larga escala, abrangendo inibição de espécies de fungos e

bactérias avaliados, como aqueles deteriorantes de produtos cosméticos,

medicamentos, alimentos, assim como os que causam infecção em plantas e

animais (Burt 2004, Oliveira et al. 2004, Moreira et al. 2010).

1.2.1. Óleos essenciais de plantas

Entre os metabólitos secundários produzidos por plantas aromáticas

estão compostos complexos, como os OEs (Pichersky et al. 2006, Bakkali et al.

2008). De acordo com a ISO (International Standard Organization), são definidos

como produtos obtidos de partes de plantas utilizando destilação por arraste a

vapor (Da Silva et al. 2012). Os OEs têm como principal característica a

volatilidade, diferente dos óleos fixos, mistura de substâncias lipídicas que

incluem gorduras e ceras, obtidos geralmente de sementes (Da Costa et al.

2008).

Também denominados de óleos voláteis, os OEs são misturas lipofílicas,

líquidos e de forte odor, que podem ser sintetizados por várias partes da planta,

como flores, brotos, sementes, galhos, folhas, cascas, tronco, frutos e raízes

(Burt 2004, Bakkali et al. 2008). Após a síntese destes metabólitos, essas

substâncias são armazenadas em células secretórias, cavidades, canais, células

epidérmicas ou tricomas glandulares da planta. Os OEs exercem importante

papel de proteção à planta como antimicrobiano, inseticida e anti-herbívoros.

Estes metabólitos também têm a função de atrair insetos para facilitar a

dispersão de pólen e sementes (Surburg & Panten 2006, Bakkali et al. 2008).

Os OEs são utilizados desde a antiguidade devido a suas propriedades

aromáticas, flavorizantes e conservantes (Burt 2004, Surburg & Panten 2006).

Há 2000 anos, egípcios, indianos e persas utilizavam a destilação para produção

20

desta substância, técnica que foi aprimorada pelos árabes no século IX (Burt

2004, Surburg & Panten 2006, Bakkali et al. 2008). Conhecidos pelas

propriedades antissépticas, medicinal e sua fragrância, os OEs eram utilizados

no embalsamamento, preservação de alimentos, como antimicrobiano,

analgésico, sedativo, anti-inflamatório, espasmolítico e anestésico local

(Hammer et al. 1999, Sadraei et al. 2001, Surburg & Panten 2006, Bakkali et al.

2008, Zalachoras et al. 2010, Cascaes et al. 2015).

Aproximadamente 3000 OEs são conhecidos, 300 dos quais são

comercialmente importantes especialmente para a indústria farmacêutica,

agronômica, alimentícia, cosmética e de perfumes (Burt 2004, Bakkali et al.

2008). Por possuir propriedades antibacterianas, eles podem ser empregados na

produção de antissépticos (Cox et al. 2000, Burt 2004). Compostos isolados de

OEs como d-limoneno, geranil acetato ou d-carvona são empregados na

produção de perfumes, cremes, sabonetes, como aditivos flavorizantes para

alimentos, fragrâncias para produtos de limpeza e solventes industriais (Bakkali

et al. 2008). Também são utilizados na aromaterapia, que se caracteriza pela

combinação de massagens e uso de aromas para induzir efeitos de bem estar

fisiológico e físico (Edris 2007).

Os OEs são extraídos de plantas aromáticas localizadas em regiões com

climas temperados a quentes, de países tropicais e do Mediterrâneo,

representando parte importante da farmacopeia de vários países (Surburg &

Panten 2006, Bakkali et al. 2008). Para minimizar as variações de qualidade,

quantidade e composição do OE, é necessário que seja extraído nas mesmas

condições climáticas, de solo, mesmo órgão da planta, idade e estágio no ciclo

vegetativo, além de ser utilizado o mesmo processo de extração (Angioni et al.

2006).

Várias técnicas têm sido empregadas na extração destes óleos, como

hidrodestilação, destilação por arraste a vapor d’água, extração com solventes

orgânicos ou com CO2 supercrítico (Da Silva et al. 2012). O método de extração

que melhor preserva as características químicas e organolépticas dos OEs é a

destilação por arraste a vapor d’água, o que tornou este processo extrativo o

mais utilizado convencionalmente (Da Silva et al. 2012, Asbahani et al. 2015).

Neste método, a amostra da planta é colocada em água fervente ou aquecida

por vapor. O calor aplicado é responsável pela ruptura da estrutura celular do

21

material vegetal, liberando assim os compostos aromáticos ou OEs

(Tongnuanchan & Benjakul 2014).

Após a obtenção do OE, a amostra extraída pode ser analisada para

caracterização dos componentes individuais, através de cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massas (GC/MS) (Da Silva et al. 2012). Este

método cromatográfico permite a separação e quantificação das substâncias

constituintes da amostra, de forma seletiva e sensível (Da Silva et al. 2012,

Meng et al. 2014).

1.2.2. Composição e atividade antifúngica dos OEs

De composição natural complexa, os OEs podem conter de 20 a 60

elementos concentrações variadas. São caracterizados por possuir

concentrações elevadas (20-70%) de dois ou três componentes, em

comparação a outros, presentes em quantidades menores (Bakkali et al. 2008).

O OE de orégano (Origanum compactum), por exemplo, apresenta como

componentes majoritários os terpenos carvacrol (37% a 77%) e timol (19 a

79%), enquanto y-terpineno e p-cimeno aparecem em menor quantidade

(Bouhdid et al. 2009).

Em geral, os componentes majoritários são responsáveis pelas

propriedades biológicas dos OEs, e são divididos em dois grupos com origem

biosintética distinta: o principal grupo com terpenos e terpenóides e o segundo

com compostos aromáticos e alifáticos (Bakkali et al. 2008).

Os terpenos são combinações de unidades de isopreno, estruturas com 5

carbonos (5-metil-buta-1,3-dieno) (Figura 5), e os que contém oxigênio são

denominados terpenóides. Os principais terpenos são os monoterpenos (C10 ou

duas unidades isopreno) e os sequiterpenos (C15 ou três unidades isopreno),

sendo que os primeiros representam cerca de 90% da composição dos OEs

(Bakkali et al. 2008). Exemplos de plantas que contém estes componentes são

bergamota (Citrus bergamia), citronela (Cymbopogon winterianus), lavanda

(Lavandula angustifolia), capim limão (Cymbopogon citratus), palmarosa

(Cymbopogon martini), litsea cubeba (Litsea cubeba) e alecrim (Rosmarinus

officinalis) (Bakkali et al. 2008).

22

Figura 5. Fórmula estrutural plana da unidade isopreno (5-metil-buta-1,3-dieno), dos quais são formados os monoterpenos (2 unidades isopreno) e sesquiterpenos (3 unidades isopreno).

Os compostos aromáticos são derivados do fenilpropano e são menos

frequentes do que os terpenos. Alguns vegetais são fonte de compostos

aromáticos como anis (Pimpinella anisum), canela (Cinnamomum cassia), cravo

da índia (Syzygium aromaticum), erva-doce (Foeniculum vulgare) e noz

moscada (Myristica fragrans) (Bakkali et al. 2008).

A atividade antifúngica dos OEs já foi descrita para diferentes fungos e

está relacionada à presença de terpenos, assim como de compostos aromáticos

(Tabassum & Vidyasagar 2013). A grande quantidade do monoterpeno timol no

OE de Thymus vulgaris (tomilho) foi responsável pela alta atividade inibitória

sobre Candida albicans (CIM de 0,016 µL/mL), assim como o carvacrol em

Origanum vulgare (orégano) que inibiu o crescimento em CIM de 0,421 µL/mL

(Giordani et al. 2004, Cleff et al. 2010).

Entre os compostos aromáticos, o eugenol presente no OE de cravo da

índia (Syzygium aromaticum), mostrou boa atividade antifúngica sobre isolados

de C. albicans, C. krusei, C. tropicalis e C. glabrata. Fungos filamentosos como

dermatófitos, Aspergillus flavus, A. fumigatus e A. niger foram inibidos por este

óleo em CIMs entre 0,16 µL/mL a 0,64 µL/mL (Pinto et al. 2009).

A atividade antimicrobiana dos OEs Litsea cubeba e Cymbopogon martini

já foi descrita em estudos anteriores sobre alguns fungos e bactérias (Duarte et

al. 2005, Lodhia et al. 2009, Prasad et al. 2010, Zhang et al. 2012), entretanto a

ação biológica em leveduras do complexo C. neoformans ainda não foi descrita

na literatura.

23

1.2.3. Litsea cubeba (Lour.) Pers.

O gênero Litsea pertence à família Lauraceae, representado por 622

espécies, encontra-se distribuído em regiões tropicais e temperado quentes,

especialmente no sul da Ásia, América do Sul e países da Oceania (Agrawal et

al. 2011).

Litsea cubeba (Lour.) Pers., espécie de nome popular Litsea cubeba, é

uma árvore ou arbusto de 3 a 10 metros, de folhas perenes, nativa na China,

Indonésia, Taiwan e outras partes do sul da Ásia (Si et al. 2012, Zhang et al.

2012). Na medicina popular chinesa, é utilizada para tratamento de doenças

reumáticas, resfriado, soluço e dor estomacal (Feng et al. 2009, Lin et al. 2013).

Utilizada como flavorizante na indústria alimentícia, de cosméticos e cigarros, L.

cubeba proporciona aroma semelhante a uma mistura de pimenta, gengibre e

cítrico (Wang et al. 2009, Liu & Yang 2012).

Diversos trabalhos relatam a atividade farmacológica do extrato de L.

cubeba como anti-câncer, anti-microbiana, anti-oxidante e anti-inflamatória (Choi

& Hwang 2004, Hwang et al. 2005, Ho et al. 2010, Wang & Liu 2010). A

atividade antibacteriana de L. cubeba já foi descrita sobre Staphylococcus

aureus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Enterococcus faecalis e Bacillus subtilis, com CIM entre 100 e 700 µg/mL (Feng

et al. 2009, Wang & Liu 2010). Esta atividade é atribuída aos seus principais

componentes, embora um efeito sinérgico ou antagonista entre os compostos

deste OE possa ser considerado (Wang & Liu 2010).

O óleo essencial de L. cubeba pode ser extraído das flores (Figura 6),

frutos (Figura 7) e raízes, além do tronco e das folhas (Si et al. 2012). Wang e

Liu (2010) avaliaram a composição do OE de diferentes partes de L. cubeba,

demonstrando que a composição depende da parte da planta de onde esse

produto foi extraído. O fruto tem como principais constituintes o citral (mistura

dos isômeros geranial e neral) (64%) e limoneno (7%) (Figura 8). As flores têm

em maior quantidade β-terpineno (33%), cineol (14%) e α-pineno (7,5%),

enquanto as folhas têm cineol (14%), γ-elemeno (8%), cariofileno (8%), linalol

(7%) e limoneno (7%). Nas raízes, foi encontrado majoritariamente o citral B

(22%), citronelal (9%) e linalol (7%) e no caule, β-felandreno (19%), terpineno-4-

ol (12%), limoneno (10%), α-tujanol (9%) e β-pineno (7%) (Wang & Liu 2010).

24

Figura 6. Flores de Litsea cubeba (ZhongWeiHorticulturalProducts 2014).

Figura 7. Frutos de Litsea cubeba (ZhongWeiHorticulturalProducts 2014).

25

Figura 8. Estrutura do citral (geranial e neral) e do limoneno, principais componentes do

OE do fruto de L. cubeba.

1.2.4. Cymbopogon martini (Roxb.) Will. Watson

Cymbopogon martini (Roxb.) Will. Watson (Watson 1882), de nome

popular palmarosa, pertencente à família Poaceae, é uma planta medicinal

conhecida mundialmente (Souza et al. 1975, Mallavarapu et al. 1998, Rosa et al.

2010). As espécies da família Poaceae são cultivadas em larga escala em

regiões tropicais e subtropicais e são naturais de regiões montanhosas,

planícies e zonas áridas da Índia (Souza et al. 1975, Rosa et al. 2010). De um

total de 100 espécies pertencentes ao gênero, 56 são aromáticas e algumas

possuem importância medicinal, farmacológica e industrial (Prakasa et al. 2001,

Rosa et al. 2010).

A planta é estolonífera, ou seja, possui caule rasteiro que produz gemas

de espaço em espaço, com raízes fasciculadas e abundantes, e forma touceiras

densas que podem atingir até 2 metros de altura. O tipo de caule é em colmos,

com nítidos nós e entrenós, alongado e fino, com folhas estreitas e ápice agudo

(Figura 9) (Souza et al. 1975, Rosa et al. 2010). Apresenta flores reunidas em

espigas curtas, terminais, com aspecto piramidal (Figura 10) (Rosa et al. 2010).

O OE extraído de C. martini possui atividade diurética, termogênica,

inseticida, vasodilatadora e broncodilatadora (Prasad et al. 2010, Janbaz et al.

2014). A atividade biológica deste óleo já foi descrita frente a bactérias gram

negativas (Lodhia et al. 2009), C. albicans (Duarte et al. 2005), Microsporum

gypseum e Trichophyton rubrum (Prasad et al. 2010) e Aspergillus fumigatus

(Khan & Ahmad 2011).

26

Tem como principais componentes o geraniol (70 a 90%) e acetato de

geranila (Figura 11), além de pequenas quantidades de linalol, β-cariofileno e

(E)-β-ocimeno, composição que depende do material botânico e do método de

extração do OE (Mallavarapu et al. 1998, Prashar et al. 2003, Surburg & Panten

2006, Rosa et al. 2010).

Figura 9. Folhas e flores de Cymbopogon martini (SnowLotus 2014).

27

Figura 10. Flores de Cymbopogon martini (B&TWorldSeeds 2014).

Figura 11. Estrutura do geraniol e acetato de geranila, principais componentes do OE das folhas de C. martini.

1.3. Associação entre produtos naturais e fármacos antifúngicos

A busca de novas abordagens terapêuticas para a criptococose tem sido

impulsionada por fatores como alta toxicidade da AMB, emergência de isolados

resistentes ao fluconazol e a 5-FC, e aumento das taxas de mortalidade em

imunodeprimidos em consequência da criptococose disseminada (Serena et al.

2005, Krysan 2014). A terapia combinada tem se mostrado boa candidata para

esse propósito, podendo melhorar o sucesso da resposta terapêutica em

pacientes graves (Chamilos & Kontoyiannis 2006). Outros benefícios incluem a

melhora no espectro de eficácia dos antifúngicos, melhor segurança e tolerância

ao fármaco, além de reduzir a possibilidade de surgimento de organismos

resistentes (Mukherjee et al. 2005, Vazquez 2007).

28

Em geral, essa associação relaciona antifúngicos ou compostos naturais

com diferentes mecanismos de ação, que possuam alvos complementares na

célula fúngica (Mukherjee et al. 2005). Um dos métodos laboratoriais mais

empregados para caracterizar a interação de antifúngicos e produtos naturais é

o método de Checkerboard (Johnson et al. 2004). Este método permite

caracterizar a interação entre as substâncias como sinérgica, indiferente ou

antagonista. Quando o efeito da combinação resulta em CIM menor para ambas

substâncias, a interação é caracterizada como sinérgica, enquanto quando não

ocorre alteração das CIMs, indiferente. O antagonismo ocorre quando há

aumento da CIM para pelo menos uma das substâncias no teste (Mukherjee et

al. 2005).

A associação de antifúngicos convencionais com produtos naturais sobre

diferentes fungos tem sido estudada por vários autores com sucesso (Rosato et

al. 2008, Amber et al. 2010, Faria et al. 2011, Khan & Ahmad 2011, Roh & Shin

2014, Pippi et al. 2015). Estudo de Roh & Shin (2014) concluiu que o OE de

Angelica koreana associado ao itraconazol diminuiu a CIM sobre isolados de

Aspergillus sp. e de Trichophyton sp., demonstrando um sinergismo que pode

reduzir a dose efetiva de itraconazol requerida para o tratamento.

O sinergismo de antifúngicos com OEs foi descrito em espécies de

Candida sp., em que o Ocimum sanctum (santo-manjericão) apresentou

sinergismo associado a fluconazol em 69 isolados (93%) e ao cetoconazol sobre

68 de isolados (92%), e sobre cepas fluconazol-resistentes (Amber et al. 2010).

O OE de Pelargonium graveolens (gerânio) apresentou ação sinérgica quando

associado à AMB sobre espécies de Candida conforme relatos de Rosato et al.

(2008).

A atividade de produtos naturais associados a AMB, fluconazol e

itraconazol foi avaliada por Faria et al. (2011) sobre isolados de Candida sp. e

Cryptococcus neoformans. Os compostos fenólicos naturais analisados foram

ácido cinâmico e benzóico, timol e 2,3- e 2,5-dihidroxibenzaldeído, entre os

quais o timol apresentou ação sinérgica com os três antifúngicos sobre ambas

leveduras.

Os estudos mostrando a ocorrência de potencialização dos efeitos de

produtos naturais e antibióticos dão impulso à pesquisa fitomedicinal,

apresentando novas perspectivas para desenvolvimento de fitoterápicos.

29

1.4. Ensaios in vitro para detecção de atividade biológica de compostos naturais

Nos últimos anos, o uso de substâncias derivadas de compostos naturais

como protótipos de moléculas para tratamento de doenças tem crescido

abundantemente (de Paula et al. 2014). Em fase inicial, o desenvolvimento de

medicamentos envolve a identificação de novas entidades químicas de valor

terapêutico potencial, que podem ser obtidas por isolamento a partir de fontes

naturais, por síntese química ou uma combinação de ambos (Krause & Tobin

2013).

Na abordagem tradicional, o alvo do composto natural é exposto a

extratos brutos, e em caso de evidência de atividade farmacológica, o extrato é

fracionado e o composto ativo é isolado e identificado (Rouhi 2003). Essa

abordagem é lenta e laboriosa, e inclui a caracterização das propriedades

químicas e biológicas do composto natural (Krause & Tobin 2013). Entre os

ensaios comumente realizados para a caracterização in vitro da ação biológica

de OEs sobre micro-organismos, estão aqueles empregados para investigar a

atividade antifúngica, como teste de suscetibilidade, curva de morte,

quantificação do ergosterol celular e a citometria de fluxo (Pinto et al. 2009,

Ahmad et al. 2011). E por fim, o teste de citotoxicidade, que permite verificar a

toxicidade do composto avaliado sobre células do hospedeiro in vitro (He et al.

2007).

Existem diferentes métodos para avaliar a suscetibilidade in vitro para

fungos, entre eles estão a macrodiluição e microdiluição em caldo e ensaios com

meio de cultura sólido (Perkhofer et al. 2010). Os métodos para fungos

filamentosos e leveduras padronizados pelo CLSI são os mais utilizados para

esse fim (CLSI 2008, CLSI 2012), por serem padronizados e permitirem a

comparação interlaboratorial dos resultados (Lass-Florl et al. 2010). Além disso,

o teste padronizado pelo CLSI é o mais adequado para determinar a atividade

antifúngica de produtos naturais extraídos de plantas, por apresentar maior

sensibilidade e reprodutibilidade (Scorzoni et al. 2007).

Os testes de suscetibilidade submetem o fungo a diferentes

concentrações do fármaco, em tempo determinado, de acordo com a espécie

avaliada, fornecendo a menor concentração do fármaco capaz de inibir o

30

crescimento do micro-organismo, a CIM (Perkhofer et al. 2010). A importância

clínica deste método é a possibilidade de traçar o perfil de suscetibilidade dos

isolados aos fármacos convencionais, determinando se são sensíveis, dose-

dependentes ou resistentes, interferindo diretamente na decisão terapêutica

(CLSI 2008, CLSI 2012). Na investigação de candidatos a antifúngicos, o ensaio

é frequentemente utilizado para triagem da atividade de produtos naturais e

serve como ponto de partida para outras análises da atividade antifúngica

(Scorzoni et al. 2007, Negri et al. 2014).

Ensaios de curva de morte (time-kill assay) podem ser realizados com o

objetivo de verificar o tempo de morte do micro-organismo após a ação do

composto em investigação, podendo também ser aplicada no estudo do

sinergismo entre compostos (Percin et al. 2014) e como teste de suscetibilidade

antifúngica (Pappalardo et al. 2009). Para verificar a curva de morte, o fungo e o

composto em investigação são incubados em meio de cultura e são retiradas

alíquotas em tempos determinados, que são plaqueadas em meio de cultura

sólido para posterior contagem de colônias (Pappalardo et al. 2009). Os dados

obtidos formam uma curva, que caracteriza em quanto tempo houve a ação

fungicida do composto. Essa informação também é importante para testes de

investigação do mecanismo de ação do composto antifúngico, como a citometria

de fluxo.

A membrana plasmática dos eucariotos contém esteróis que são

essenciais para organização e funções da membrana (Parks & Casey 1995,

Dupont et al. 2012). Em vertebrados, o principal esterol presente na membrana é

o colesterol e em fungos, o ergosterol, diferença fundamental que torna o

ergosterol um alvo seletivo para antifúngicos (Parks & Casey 1995, Dupont et al.

2012). A quantificação deste esterol dos fungos pode ser realizada para verificar

se os compostos com ação antifúngica interferem na sua biossíntese (Ahmad et

al. 2011). Após a incubação do fungo com diferentes concentrações do

composto investigado, é realizado um processo para extração dos esteróis, que

é submetida a espectrofotometria de varredura, resultando em uma curva

característica com quatro picos (Khan et al. 2010). O cálculo da porcentagem de

ergosterol em relação à massa fúngica obtida, após a incubação com os

compostos, permite interpretar se o composto tem a habilidade de inibir a

31

biossíntese de ergosterol realizada pelo fungo (Ahmad et al. 2011, Shreaz et al.

2011).

O mecanismo de ação de produtos naturais sobre micro-organismos

também pode ser investigado por citometria de fluxo, método que permite a

análise de vários parâmetros celulares, como tamanho e complexidade. Para se

obter informações adicionais a estas, podem ser utilizados marcadores

fluorocromos que se ligam a compostos específicos das células, como ácidos

nucleicos, lipídios e proteínas (Alvarez-Barrientos et al. 2000). O iodeto de

propídeo (PI) é um marcador que emite fluorescência ao se ligar aos ácidos

nucléicos, sendo necessário o rompimento da membrana celular da célula para

sua internalização (Ahmad et al. 2011). A observação de fluorescência a partir

das células tratadas com o composto antifúngico indica que o mecanismo de

ação é, inicialmente, por lesão da membrana celular (Pina-Vaz et al. 2001, Pinto

et al. 2006). Outros marcadores podem ser utilizados para analisar o mecanismo

de ação de compostos sobre microorganismos, como FUN-1 para verificar se

houve alteração no metabolismo da célula fúngica, e o marcador SYTO 9 green,

para detecção da indução de morte celular por apoptose (Pushpanathan et al.

2013, El Assal et al. 2014)

Ensaios de toxicidade in vitro representam o primeiro passo para avaliar

se um composto com atividade antifúngica é promissor para se tornar um agente

antifúngico (de Paula et al. 2014). A finalidade destes ensaios é compreender os

efeitos nocivos de compostos investigados sobre células animais. Além de

testes in vitro, abordagens computadorizadas e avaliação in vivo em animais

fornecem dados importantes para melhorar a extrapolação para a toxicidade em

humanos (Eisenbrand et al. 2002). O ensaio de atividade hemolítica é uma

ferramenta de triagem para aferir a toxicidade às células do hospedeiro,

colocando em contato o composto em estudo e hemácias obtidas de doador

saudável (Amber et al. 2010). As hemácias lisadas pelo composto são

identificadas medindo-se a absorbância oriunda da liberação de hemoglobina,

comparada aos controles positivo e negativo, por espectrofotometria. As

vantagens deste teste são a facilidade de obtenção de hemácias humanas, e

que as propriedades de membrana destas células são bem conhecidas (Situ &

Bobek 2000, He et al. 2007).

32

2. JUSTIFICATIVA

A prevalência da criptococose está relacionada com o aumento de

indivíduos com imunodepressão, câncer, doenças autoimunes, transplantes e

submetidos ao tratamento com corticosteroides (Mitchell & Perfect 1995). Com o

início da pandemia do HIV, a doença aumentou dramaticamente e tornou-se

uma relevante causa de morte em pacientes com aids (Selik et al. 1997, Levitz &

Boekhout 2006). A criptococose é uma coinfecção importante nestes pacientes,

representando globalmente a quarta causa de morte em indivíduos com aids e

diagnosticada como doença definidora desta síndrome em 20 a 30% dos casos

(Chayakulkeeree & Perfect 2006, Park et al. 2009).

O tratamento dessa micose é realizado com antifúngicos com diferentes

mecanismos de ação. Entretanto, fatores como ação fungistática, falta de

formulações orais e intravenosas devido a baixa solubilidade, toxicidade do

fármaco e desenvolvimento de resistência por alguns isolados, associado ao alto

custo, limitam a efetividade do tratamento da criptococose (Pinto et al. 2009).

Isso favorece a fundamental importância na busca contínua por novos

componentes antifúngicos envolvendo novos mecanismos de ação, com amplo

espectro de atividade, menos efeitos colaterais e menor custo.

A natureza oferece uma grande diversidade química de produtos naturais

que contribuem como importante fonte para o desenvolvimento de novos

quimioterápicos, e os seus derivados tem atraído muito interesse como

alternativas terapêuticas (Aligiannis et al. 2001, Souza et al. 2003, Khan et al.

2010, Silva et al. 2011).

As plantas têm sido usadas na medicina popular como agentes

antimicrobianos desde os primórdios da humanidade, efeito atribuído à presença

de metabólitos secundários, como os óleos essenciais (OEs), que tem ganhado

grande popularidade e interesse científico. Em geral os OEs são considerados

compostos não tóxicos e potencialmente efetivos contra muitos microrganismos

incluindo fungos patógenos (Oliveira et al. 2004, Chuang et al. 2007, Pinto et al.

2009, Khan et al. 2010, Cavaleiro et al. 2015).

Os OEs de L. cubeba e C. martini demonstraram atividades biológicas em

estudos anteriores, incluindo antimicrobiana (Prasad et al. 2010, Wang & Liu

33

2010, Yang et al. 2010). Atividade inibindo o crescimento de fungos filamentosos

e leveduras têm sido descrita, no entanto não foi estabelecida sua ação sobre

fungos do complexo C. neoformans, o que justifica a realização deste trabalho.

34

3. OBJETIVOS

Objetivo Geral Avaliar a atividade biológica dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus

respectivos componentes majoritários, citral e geraniol, sobre leveduras do

complexo C. neoformans.

Objetivos Específicos

I. Determinar a CIM e CFM dos OEs e seus componentes majoritários

sobre isolados do complexo C. neoformans.

II. Verificar a associação dos OEs e seus componentes majoritários com

fármacos AMB e fluconazol sobre isolados do complexo C. neoformans.

III. Avaliar a interferência dos OEs e componentes majoritários sobre curva

de morte de C. gattii ATCC 24065.

IV. Determinar se os OEs e seus componentes majoritários inibem a

produção de ergosterol por C. gattii ATCC 24065.

V. Avaliar se os OEs e seus componentes majoritários promovem lesão de

membrana sobre C. gattii ATCC 24065.

VI. Avaliar a citotoxicidade in vitro dos OEs e seus principais componentes

sobre hemácias humanas.

35

4. MÉTODOS

4.1. Isolados clínicos e cepas padrão

Os isolados das espécies de Cryptococcus pertencem a Micoteca do

Laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da

Universidade Federal de Goiás. Esses isolados foram obtidos de líquor de

pacientes com aids, do Hospital de Doenças Tropicais Dr. Anuar Auad de

Goiânia, Goiás, em um estudo aprovado pelo Comitê de Bioética do Hospital de

Doenças Tropicais (protocolo no. 004/03) (Anexo 1). Foram usados 11 isolados

de C. neoformans, 4 C. gattii e 2 cepas padrão (American Type Culture

Collection), C. neoformans ATCC 28957, C. gattii ATCC 24065. A cepa Candida

parapsilosis ATCC 22019 foi utilizada como controle para os testes de

suscetibilidade. Antes dos testes, os isolados foram subcultivados em Ágar

Sabouraud Dextrose (ASD) à temperatura ambiente, por 72 horas.

4.2. Óleos essenciais

4.2.1. Obtenção

Os OEs das folhas de Cymbopogon martini (Palmarosa) e dos frutos de

Litsea cubeba (Litsea cubeba) foram adquiridos da Ferquima Indústria e

Comércio Ltda (Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brasil), extraídos das

plantas por arraste a vapor (Anexos 2 e 3). Segundo o laudo técnico dos lotes

obtidos, os principais constituintes dos OEs são geraniol (C. martini)

(aproximadamente 82%) e citral (L. cubeba) (68%) (Anexos 2 e 3).

Os compostos majoritários dos OEs, geraniol 98% e citral ≥96%, foram

adquiridos comercialmente da empresa Sigma-Aldrich.

4.3. Fármacos antifúngicos

Os antifúngicos AMB (Sigma-Aldrich) e fluconazol (Pfizer), utilizados

neste estudo, foram preparados de acordo com o protocolo do CLSI (2008), e

mantidos em solução estoque a -80 °C.

36

4.4. Testes de suscetibilidade in vitro

A avaliação da suscetibilidade de espécies do complexo C. neoformans

aos OEs e constituintes majoritários foi realizada pela técnica de microdiluição

em caldo, de acordo com o protocolo M27-A3 do CLSI (CLSI 2008, CLSI 2012).

Foram determinadas as CIMs dos OEs a partir da avaliação em diluições

seriadas.

4.4.1. Preparo dos óleos essenciais e constituintes majoritários

Os OEs e constituintes majoritários foram solubilizados em

dimetilsulfóxido (DMSO) (1% volume final) e Tween 80 (0,02% volume final),

posteriormente preparada uma solução estoque (20480 μg/mL) em meio

Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), armazenado a -70°C. A solução

de uso foi preparada na concentração final de 2048 μg/mL.

Nos primeiros orifícios da placa de microtitulação foram adicionados

200μL da solução de uso do OE e nos restantes adicionou-se 100μL de RPMI.

Foi realizada diluição seriada até o décimo orifício de cada linha, de forma que

se obtiveram concentrações de 1024 a 2 μg/mL (CLSI 2008, CLSI 2012).

4.4.2. Preparo do inóculo

Uma suspensão de cada amostra de levedura do complexo C.

neoformans foi preparada em solução salina estéril (NaCl 0,85%), ajustada a

1x106 células/mL no espectrofotômetro (85% de transmitância, à 530 nm) e em

seguida diluições de 1/20 e 1/50 foram realizadas em RPMI-1640 tamponado

com ácido 3-N-morfolino-propanossulfônico (MOPS) pH 7,0, de tal modo que a

concentração final obtida foi entre 0,5 a 2,5 x 103 células/mL (CLSI 2008, CLSI

2012).

4.4.3. Procedimento do teste

Na placa de microtitulação contendo a diluição seriada dos OEs foi

adicionado 100μL do inóculo em cada orifício, sendo que a penúltima linha foi

utilizada como controle do crescimento fúngico (Figura 12). Foram avaliados 15

37

isolados diferentes. A suscetibilidade de Candida parapsilosis ATCC 22019 ao

fluconazol foi utilizada como controle de qualidade, de acordo com o esquema

representado na Figura 12. As placas foram incubadas a 35º C por 72 horas.

Figura 12. Placa de microdiluição para o teste de suscetibilidade in vitro dos OEs. Fonte: Autoria própria.

4.4.4. Leitura

A CIM foi interpretada através de leitura visual comparada ao controle de

crescimento, considerada a menor concentração capaz de inibir crescimento

total do fungo (Figura 12). Para a confirmação dos resultados, os experimentos

foram realizados em triplicata. Atividade antifúngica dos OEs foi determinada

quando os valores de CIMs ≤ 256μg/mL (Scorzoni et al. 2007). Para comparação

da variável CIM entre o OE e o composto majoritário, foi utilizado o teste de

Fisher, com nível de significância de 5% (p<0,05).

4.4.5. Concentração Fungicida Mínima (CFM)

A determinação da CFM foi obtida pela retirada de 10 μL de solução nos

orifícios, nas concentrações correspondentes à CIM, 2x CIM e 4x CIM e

38

inoculado em placa de Petri contendo ASD (Figura 13). Após 72 horas de

incubação das placas a 35°C, foi realizada a leitura das placas e a CFM foi

definida como a menor concentração em que não houve crescimento fúngico ou

houve crescimento de até duas colônias (De Logu et al. 2005). Para comparação

da variável CFM entre o OE e o composto majoritário, foi utilizado o teste de

Fisher, com nível de significância de 5% (p<0,05).

Figura 13. Teste para avaliação da concentração fungicida mínima. Fonte:

autoria própria.

4.5. Associação dos OEs e dos compostos majoritários com anfotericina B e fluconazol

Testes de suscetibilidade por combinação foram realizados com o objetivo

de observar a ação entre os OEs de L. cubeba e C. martini com AMB. Utilizou-se

o método de microdiluição em caldo para avaliar as CIMs isoladas,

complementado com a técnica de Chequerboard a fim de determinar as CIMs

para cada associação de OE à AMB (Figura 14) (Ernst & Rogers 2008). Essa

técnica permite o cálculo do índice de concentração inibitória fracionária (ICIF)

para demonstrar se a CIM de um fármaco está reduzida (sinergismo), inalterada

39

(indiferença) ou aumentada (antagonismo) na presença de outro fármaco (Lewis

et al. 2002), conforme cálculo a seguir:

CIF A = CIM fármaco A (óleo essencial)na placa teste sinergismoCIM fármaco A (óleo essencial)na microdiluição em caldo

CIF B = CIM fármaco B (anfotericina B) na placa teste sinergismoCIM fármaco B (anfotericina B) na microdiluição em caldo

ICIF = CIF A + CIF B

Considerou-se sinergismo resultados de ICIF ≤ 0,5, indiferença ou

ausência de interação quando 0,5 < ICIF ≤ 4,0, e antagonismo quando o ICIF >

4,0 (Amber et al. 2010). Para comparação da interpretação do teste de

associação entre o OE e o composto majoritário, foi utilizado o teste de Fisher,

com nível de significância considerado foi de 5% (p<0,05).

4.5.1. Procedimento dos testes

Para a realização dos testes de interação entre os OEs e constituintes

majoritários e os fármacos, tomou-se como base a CIM de cada isolado frente

ao OE analisado e a AMB. Além da CIM, foram avaliadas três concentrações

acima (2x, 4x e 8x a CIM), e quatro concentrações abaixo (1/2, 1/4, 1/8 e 1/16 da

CIM). Numa placa de microtitulação (Placa A), foram feitas diluições seriadas no

eixo horizontal, ficando cada orifício com 50µL de solução de OE quatro vezes a

concentração final desejada. O mesmo procedimento foi feito em outra placa

(Placa B) no sentido vertical, utilizando a solução de AMB. Foram transferidos

50µL da solução todos os orifícios da Placa B para os orifícios correspondentes

da placa A, aos quais foram adicionados 100µL de inóculo. Para controle de

viabilidade do inóculo, outro orifício foi preenchido com 100µL de inóculo e

100µL de RPMI. Para o controle de esterilidade do meio, 200µL de RPMI foram

colocados em um dos orifícios da placa. Seguiu-se um período de incubação de

72 horas em estufa a 35°C e leitura visual das CIMs foi realizada.

40

Figura 14 Teste de suscetibilidade antifúngica através do método de Chequerboard. Fonte: autoria própria.

4.6. Avaliação da curva de morte celular de C. gattii sob ação do OE L. cubeba e C. martini e seus componentes majoritários

O tempo da ação antifúngica dos OEs foi avaliado com a cepa padrão de

C. gattii 24065, através da curva de morte conforme descrito por Pappalardo et

al. (2009) com modificações (Figura 15). C. gattii 24065 foi subcultivado em

placa de ágar batata dextrose, e após 72h, colônias individuais (≥1 mm) foram

suspensas em 10 mL de meio RPMI 1640 com 2% de glicose e L-glutamina e

incubados overnight sob agitação. O inóculo inicial foi ajustado à 85% de

transmitância ao comprimento de onda de 530 nm por espectrofotometria,

correspondendo a 106 UFC/mL. Dez microlitros da suspensão de células

fúngicas foram adicionados a erlenmeyers contendo 10 mL de RPMI 1640 e o

OE ou composto majoritário na CFM. O controle positivo foi realizado com AMB

e o negativo com RPMI. Os erlenmeyers foram incubados sob agitação à

temperatura ambiente. Foram retiradas nos tempos 0h, 6h, 12h, 24h, 48h e 72h

41

alíquotas de 50µL de cada erlenmeyer, e diluídas em 500µL de RPMI 1640 em

eppendorfs. Destas diluições, 100 µL foram plaqueados em ASD, e após 72h a

35°C, a contagem de colônias foi realizada. Os experimentos foram feitos em

triplicata.

Os dados da contagem de colônias (em log10 UFC/mL) foram plotados em

função do tempo para cada OE e composto majoritário. O efeito fungicida dos

OEs e constituintes majoritários foram definidos como inibição ≥99,9% do

crescimento (≤2 colônias).

Figura 15. Curva de morte de C. gattii sob ação dos OEs ou compostos majoritários. Fonte: autoria própria.

4.7. Ensaio de quantificação do ergosterol

A quantidade de ergosterol foi avaliada pelo método descrito por

Arthington-Skaggs (1999) utilizando isolado C. neoformans ATCC 24065. O

fungo foi previamente cultivado em ASD por 72h a 35°C para isolamento de

colônias. Foi adicionada uma colônia isolada a cada erlenmeyer contendo 50 mL

de Caldo Sabouraud Dextrose (CSD) e os OEs ou compostos majoritários nas

concentrações inibitória (CIM) e sub-inibitória (1/2 CIM). C. neoformans com

fluconazol foi utilizado como controle positivo e o fungo sem tratamento em CSD

como controle negativo. Após 48h a 35⁰C em agitação, as células foram lavadas

com água destilada e o peso molhado do pellet foi determinado. Adicionando-se

3 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 25% (25mL KOH, 35mL

42

água e Álcool 100% qsp 100 mL), agitados por 1 minuto e incubados por 4 horas

a 85°C. Após resfriamento, a extração por partição foi feita com a adição de 1

mL de água destilada e 3 mL de n-heptano. A porção apolar foi então transferida

e armazenada a -20°C por 24 horas (Figura 16). Diluiu-se 1 mL dos esteróis em

4 mL de álcool 100% (Diluição 1/5) e submeteu-se esta diluição à leitura em

espectrofotometria de varredura, em comprimento de onda de 230 a 300nm no

aparelho Cary®50 UV-Vis Varian.

Figura 16. Ensaio de quantificação do ergosterol celular fúngico após ação dos OEs ou constituintes majoritários em diferentes concentrações.

Após a leitura, o espectrofotômetro apresenta um gráfico onde a presença

de esteróis é visualizada por uma curva característica com quatro picos e a sua

ausência é indicada por uma linha reta. A diminuição do ergosterol dependente

da dose do fármaco pode indicar, como mecanismo de ação, a diminuição da

quantidade deste esterol. O conteúdo de ergosterol foi calculado como

porcentagem em relação ao peso do precipitado (pellet). O ergosterol constitui

cerca de 80% dos esteróis presentes em leveduras, seguido do

24(28)Dihidroergosterol (24(28)DHE) e de outros esteróis presentes em

43

pequena quantidade, como fecosterol, α-dehidroergosterol e zimosterol (Breivik

& Owades 1957). Sabendo-se que tanto o ergosterol quanto 24(28)DHE, são

absorvidos a 281,5 nm, a quantidade total destes esteróis pode ser calculada

conforme a equação:

(1) % Esteróis = [(𝐴𝐴281,5

290 )𝑥𝑥 𝐹𝐹]

𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑝𝑝𝑃𝑃𝑝𝑝𝑝𝑝𝑃𝑃𝑝𝑝

Onde:

F = fator de diluição do etanol

290 = valor de E (porcentagem por centímetro) determinado pelo ergosterol

cristalino.

A quantidade de 24(28)DHE pode ser calculada separadamente, pois este

esterol é absorvido a 230 nm. Conforme a equação:

(2) % 24(28)DHE = [(𝐴𝐴230518 )𝑥𝑥 𝐹𝐹]

𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑝𝑝𝑃𝑃𝑝𝑝𝑝𝑝𝑃𝑃𝑝𝑝

Onde:

F = fator de diluição do etanol

518 = valor de E (porcentagem por centímetro) determinado pelo 24(28)DHE.

Desta forma, a porcentagem de ergosterol em relação ao pellet pode ser

determinada subtraindo-se do total de esteróis o valor obtido apenas pelo

24(28)DHE:

% de Ergosterol = (1) – (2)

4.8. Avaliação da ação dos OEs e compostos majoritários sobre a membrana plasmática

A ação dos compostos sobre a membrana celular fúngica foi avaliada pela

intensidade de fluorescência emitida pelo marcador PI, através da leitura por

citometria de fluxo (Pina-Vaz et al. 2001, Ahmad et al. 2011). C. gattii ATCC

44

24065 foi cultivado previamente em ASD à temperatura ambiente, por 72h, e

inoculado em 10 mL de RPMI overnight. O inóculo foi preparado em

espectrofotômetro, à 530 nm e 85% de transmitância, correspondendo a

aproximadamente 1x106 UFC/mL. Em tubos falcon, foram adicionados 30µL do

inóculo a 30mL de RPMI e os OEs e constituintes majoritários, a fim de obter a

CFM, ½ CFM e ¼ CFM. O controle de marcação celular pelo PI foi realizado

com a cepa ATCC 24065 de C. gattii tratada com álcool 70% e o controle de

autofluorescência foi realizado com a mesma cepa padrão, sem tratamento. O

controle negativo foi realizado com ATCC 24065 de C. gattii sem tratamento,

incubada na presença do marcador PI. Os tubos foram incubados sob agitação,

durante o tempo determinado previamente pela curva de morte e em seguida,

foram centrifugados a 5000 rpm por 5 minutos. O pellet foi ressuspendido em 1

mL de PBS pH 7,2 e o conteúdo foi transferido para eppendorfs, centrifugado a

5000 rpm por 5 minutos e ressuspendido em 200µL de PBS. Foi então

adicionado 10 µL de PI a cada eppendorf, exceto ao controle de

autofluorescência. Após 30 minutos de incubação, ao abrigo da luz, foi realizada

a leitura ao citômetro de fluxo Accuri C6, no detector de luz vermelha (FL3

670nm LP), em um total de 10.000 eventos.

4.9. Avaliação da citotoxicidade

A citotoxicidade dos OEs foi determinada através do ensaio de atividade

hemolítica de acordo com He et al. (2007) com modificações. Amostras de

sangue de indivíduos saudáveis foram coletadas em tubos contendo EDTA

como anticoagulante. Foram centrifugados 5 mL de sangue total e lavado uma

vez com PBS pH 7,4, e em seguida, as hemácias foram diluídas em 20 mL do

mesmo tampão. Os OEs foram diluídos em tampão PBS pH 7,4 em

concentrações de 4096 a 8 µg/mL e armazenados em tubos eppendorff. Foi

adicionado 50 µL da solução de hemácias a 50 µL de cada concentração dos

OEs. A suspensão foi incubada a 37°C sob agitação durante 30 minutos,

centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos e, 80 µL do sobrenadante de cada

suspensão foi colocado em placa de microtitulação de 96 poços. O experimento

foi realizado em triplicata, e como controle positivo da hemólise foi utilizado

Triton x-100 a 1% e como controle negativo, solução de hemácias com PBS pH

45

7,4. O aparelho Multiskan Thermo Labsystems® foi utilizado para realização da

leitura a 560 nm para determinação da absorbância de cada amostra. A

porcentagem de hemólise foi calculada pela seguinte equação: (A560 da amostra tratada com o óleo essencial – A560 amostra tratada com PBS)

(A560 de solução triton X100 à 1% – A560 amostra tratada com PBS)x 100%

4.10. Análise estatística

Todos os ensaios realizados neste trabalho foram realizados em triplicata,

sendo os dados apresentados um resultado da média obtida. Para análise

estatística dos dados dos testes de suscetibilidade antifúngica, de concentração

fungicida mínima e de associação dos OEs e constituintes majoritários aos

fármacos antifúngicos, foi utilizado o teste de Fisher, com nível de significância

de 5% (p<0,05).

46

5. RESULTADOS

Teste de suscetibilidade antifúngica

Os resultados do teste de suscetibilidade in vitro mostraram que os OEs

de L. cubeba e C. martini apresentaram atividade antifúngica em CIMs de 16 a

512 µg/mL para isolados de C. neoformans e de C. gattii, enquanto as CFMs

foram de 64 a 2048 µg/mL. Os componentes majoritários dos OEs de L. cubeba

e C. martini, respectivamente citral e geraniol, também exibiram CIMs entre 16 e

512 µg/mL e CFMs entre 64 e 2048 µg/mL (Tabela 1). Os resultados de

suscetibilidade in vitro de L. cubeba, C. martini, geraniol e citral sobre 11

isolados de C. neoformans, 4 de C. gattii e 2 cepas padrão de ambas as

espécies estão apresentados na Tabela 1. Todos os isolados foram sensíveis

aos fármacos AMB e fluconazol (Anexo 4). A validação de cada teste de

suscetibilidade realizada com a cepa ATCC 22019 de C. parapsilosis mostrou

CIM de 2 µg/mL para o fluconazol, valor concordante com o parâmetro de

sensibilidade recomendado pelo protocolo do CLSI (CLSI 2008, CLSI 2012).

Tabela 1. Atividade antifúngica dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus compostos majoritários, citral e geraniol, sobre 15 isolados do complexo C. neoformans e duas cepas padrão.

L. cubeba Citral C. martini Geraniol Isolados CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM

C. neoformans L03 64 256 128 256 512 1024 128 512 L04 64 256 32 128 512 1024 256 256 L05 64 64 128 512 256 512 256 512 L14 64 512 128 1024 512 1024 256 512 L15 64 512 128 512 256 1024 256 512 L18 32 512 128 128 512 1024 128 256 L21 128 256 128 256 512 1024 128 512 L23 32 128 128 1024 256 512 128 256 L24 32 128 128 256 256 256 512 1024 L29 64 64 128 256 512 1024 512 1024 L30 64 256 64 128 512 1024 256 512

ATCC 28957 16 128 16 64 128 512 256 512 C. gattii

L01 32 128 128 1024 64 512 256 512 L09 64 128 32 128 512 1024 256 256 L20 32 256 128 128 512 512 128 256 L48 64 128 32 128 256 512 256 256

ATCC 24065 128 256 128 256 512 2048 512 2048 * CIM e CFM expressas em µg/mL.

47

L. cubeba e citral exibiram valores de CIM entre 16 e 128 µg/mL (Tabela

1), sendo que para L. cubeba a CIM50 foi igual a 64 µg/mL e a CIM90 foi igual a

128 µg/mL e para o citral, a CIM50 e CIM90 foram iguais a 128 µg/mL. A diferença

entre a quantidade de isolados inibidos por L. cubeba e citral foi estatisticamente

significante nas concentrações 64 e 128 µg/mL (p<0,05), com a maioria dos

isolados inibidos pelo OE do fruto de L. cubeba a 64 µg/mL (52,9%) e a maioria

por citral a 128 µg/mL (70,6%) (Figura 17).

A ação fungicida do OE de L. cubeba apresentou valores entre 64 a 512

µg/mL, dos quais 35,3% das CFMs foram iguais a 128 µg/mL. As CFMs do citral

foram entre 64 e 1024 µg/mL, sendo 35,3% iguais a 128 µg/mL (Figura 18). Não

houve diferença significativa entre a quantidade de isolados inibidos pelas

diferentes CFMs (p>0,05).

Figura 17. Porcentagem de isolados do complexo C. neoformans inibidos de acordo com diferentes concentrações do OE de L. cubeba e seu composto majoritário, citral (*p<0,05).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

16 32 64 128

5,9

29,4

52,9

11,8 5,9

17,7

5,9

70,6

% d

e is

olad

os

CIM (µg/mL)

L. cubeba

Citral

*

* *

48

Figura 18. CFMs do OE L. cubeba e seu composto majoritário, citral, sobre isolados do complexo C. neoformans.

C. martini exibiu CIMs entre 64 a 512 µg/mL, enquanto seu composto

majoritário, o geraniol, apresentou CIMs entre 128 e 512 µg/mL, com CIM50 igual

a 256 µg/mL e CIM90 igual a 512 µg/mL. Houve diferença estatisticamente

significante entre a quantidade de isolados inibidos por C. martini e geraniol na

CIM igual a 512 µg/mL (p<0,05) (Figura 19), coincidindo esta com a CIM50 e

CIM90 para C. martini.

Foi observado que C. martini apresentou CFM variando de 256 a 2048

µg/mL, das quais 52,9% foram igual a 1024 µg/mL. Para o geraniol, as CFMs

foram entre 256 e 2048 µg/mL, sendo que 512 µg/mL inibiu 47,1% dos isolados

(Figura 20). A ação fungicida de C. martini foi maior do que a apresentada pelo

geraniol em 1024 µg/mL (p<0,05).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

64 128 256 512 1024

11,8

35,3 35,3

17,7

0

5,9

35,3

29,4

11,8

17,6

% d

e is

olad

os

CFM (µg/mL)

L. cubeba

Citral

49

Figura 19. Porcentagem de isolados do complexo C. neoformans inibidos de acordo com diferentes concentrações do OE de C. martini e seu composto majoritário, geraniol (*p<0,05).

Figura 20. CFMs do OE C. martini e seu composto majoritário, geraniol, sobre isolados do complexo C. neoformans (*p<0,05).

Associação dos OEs e dos compostos majoritários com anfotericina B e fluconazol

A associação da AMB com os OEs de L. cubeba ou C. martini e seus

compostos majoritários foi avaliada em isolados de C. neoformans e C. gattii. Os

0

10

20

30

40

50

60

64 128 256 512

5,9 5,9

29,4

58,8

0

29,4

52,9

17,7

% d

e is

olad

os

CIM (µg/mL)

C. martini

Geraniol

*

0

10

20

30

40

50

60

256 512 1024 2048

5,9

35,3

52,9

5,9

35,3

47,1

11,8

5,9

% d

e is

olad

os

CFM (µg/mL)

C. martini

Geraniol

*

50

resultados demonstraram que L. cubeba e AMB interagiram de forma indiferente

(94,1%) e de forma antagônica (5,9%) (Figura 21 e Anexo 4), enquanto que a

associação entre o OE com fluconazol diminuiu o efeito antifúngico de ambos

em 76,5% dos isolados (antagonismo), sendo que os demais não tiveram

interação (indiferença) (Anexo 4 e figura 21).

Para o componente citral, a associação com AMB potencializou a ação

antifúngica em 29,4% e em 70,6% dos isolados avaliados, não houve interação

sinérgica entre os componentes (Anexo 4 e figura 21). A associação com

fluconazol na maioria dos isolados foi indiferente, entretanto, em 5,9% observou-

se sinergismo (Figura 22). A diferença entre o número de isolados que

apresentaram antagonismo para L. cubeba e fluconazol foi estatisticamente

significante, quando comparada à associação de citral e fluconazol (p<0,05). A

porcentagem de indiferença entre citral e fluconazol foi estatisticamente

significante quando comparado a L. cubeba e fluconazol (p<0,05) (Figura 22).

Figura 21. Interação da AMB com OE de L. cubeba ou seu componente majoritário, citral sobre 17 isolados do complexo C. neoformans.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sinérgico Indiferente Antagônico

0

94,1

5,9

29,4

70,6

0

% d

e is

olad

os

Interação do OE ou composto majoritário com a AMB

L. cubeba e AMB

Citral e AMB

51

Figura 22. Interação do fluconazol com OE de L. cubeba ou seu componente majoritário, citral sobre 17 isolados do complexo C. neoformans (*p<0,05).

A associação do OE de C. martini com AMB demonstrou que em 52,9%

dos isolados houve uma diminuição da CIM, configurando um efeito sinérgico

(Figura 23). Por outro lado, sua associação com o fluconazol não promoveu

alteração na CIM em 64,7% dos isolados (Figura 23).

Ao analisar o geraniol, foi demonstrado que a associação à AMB

promoveu sinergismo em 70,6% dos isolados (figura 23), enquanto a associação

com fluconazol resultou em indiferença em 88,2% (figura 24).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sinérgico Indiferente Antagônico

0

23,5

76,5

5,9

94,1

0

% d

e is

olad

os

Interação do OE ou composto majoritário com a AMB

L. cubeba e fluconazol

Citral e fluconazol

*

*

52

Figura 23. Interação da AMB com OE de C. martini ou seu componente majoritário, geraniol sobre 17 isolados do complexo C. neoformans.

Figura 24. Interação do fluconazol com OE de C. martini ou seu componente majoritário, geraniol sobre 17 isolados do complexo C. neoformans.

Avaliação da curva de morte de C. gattii sob ação do OE L. cubeba e C. martini e seus componentes majoritários A curva de morte de C. gattii 24065 sob a ação dos OEs na concentração

correspondente à fungicida (CFM) revelou que, comparado ao controle negativo,

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Sinérgico Indiferente Antagônico

52,9

35,3

11,8

70,6

29,4

0

% d

e is

olad

os

Interação do OE ou composto majoritário com a AMB

C. martini e AMB

Geraniol e AMB

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Sinérgico Indiferente Antagônico

0

64,7

35,3

0

88,2

11,8

% d

e is

olad

os

Interação do OE ou composto majoritário com o fluconazol

C. martini e fluconazol

Geraniol e fluconazol

53

houve um decréscimo na contagem de colônias do fungo de acordo com o

tempo de incubação. A figura 25 mostra a quantidade de colônias, em log10

UFC/mL, versus o tempo de exposição na presença dos OEs e seus

componentes majoritários em suas respectivas CFMs. Também pode ser

visualizado o aumento crescente do número de colônias do controle negativo

(sem tratamento) ao decorrer do tempo de incubação, assim como a rápida

inibição do crescimento apresentada no controle positivo com o antifúngico AMB

(Figura 25).

A ação fungicida de L. cubeba e C. martini sobre C. gattii 24065 foi

demonstrada em 1 hora para ambos os OEs, nas concentrações de 256 µg/mL e

2048 µg/mL, respectivamente. Os compostos majoritários citral e geraniol

apresentaram ação fungicida em 256 e 2048 µg/mL, após 2h e 1h de incubação,

respectivamente. O controle com AMB (1 µg/mL) foi fungicida após 1h de

incubação.

Figura 25. Curva de morte de C. gattii 24065 após tratamento com a CFM dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus compostos majoritários, e controle positivo tratado com AMB e negativo não tratado.

Quantificação do ergosterol celular A inibição da biossíntese do ergosterol foi avaliada através da

quantificação do ergosterol celular, que mostrou que em 64 µg/mL (½ CIM) o OE

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 12 24 48 72

Log

10 (U

FC/m

L)

Tempo (horas)

Controle

AMB

L. cubeba

Citral

C. martini

Geraniol

54

de L. cubeba não alterou a produção de ergosterol nas leveduras do complexo

C. neoformans em relação ao controle, enquanto que seu principal composto,

citral, promoveu uma redução de 23,3% de ergosterol na mesma concentração

(Tabela 2). Foi observado que estes dois agentes inibiram 100% da produção de

ergosterol na CIM (128 µg/mL) em relação ao controle negativo (Figura 26). Para

C. martini houve redução de 64,4% do ergosterol na CIM (512 µg/mL) e de

12,3% para o geraniol (Tabela 2). O fluconazol, utilizado como controle positivo,

não apresentou redução do ergosterol na CIM (2µg/mL) e em 2xCIM (4 µg/mL),

enquanto em 4xCIM mostrou uma redução de 20,5% do ergosterol, zerando a

detecção deste esterol em 16 µg/mL (8xCIM) (Tabela 2 e figura 26). A

porcentagem de ergosterol presente em cada extração e a porcentagem de

redução em relação ao controle está apresentada na Tabela 2. Tabela 2. Inibição da biossíntese de ergosterol por L. cubeba, C. martini e seus compostos majoritários em C. gattii 24065.

Quantidade de ergosterola (% de redução em relação ao controleb) L. cubeba Citral C. martini Geraniol

½ CIM 0,0073 (0) 0,0056 (23,3) 0,0071 (2,7) 0,0073 (0)

CIM 0 (100) 0 (100) 0,0026 (64,4) 0,0064 (12,3) a Expressa em porcentagem em relação ao peso molhado (pellet) de células. b Controle 0,0073.

55

Figura 26. Perfil espectrofotométrico dos esteróis de C. gattii 24065 após tratamento com os OEs e constituintes majoritários. (A) L. cubeba nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 32 (b), 64 (c) e 128 (d). (B) Citral nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 64 (b) e 128 (c). (C) C. martini nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 256 (b), 512 (c). (D) Geraniol nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 256 (b) e 512 (c). (E) Fluconazol nas concentrações (µg/mL) 0 (a), 4 (b), 8 (c), 16 (d) e 32 (e).

Avaliação da ação dos OEs e compostos majoritários sobre a membrana plasmática O efeito dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus compostos

majoritários, citral e geraniol sobre a membrana plasmática fúngica foi avaliado

56

através da análise das células marcadas com PI por citometria de fluxo. Como

controle positivo foi utilizado o álcool etílico 70% sobre as células de C. gattii

ATCC 24065, que ocasionou lesão de membrana em 99,5% das células

analisadas (Figura 27, histograma C). O controle negativo foi realizado com C.

gattii não tratado, marcado com o PI, evidenciando 3,2% de células com lesão

de membrana (Figura 27, histograma B). O controle de autofluorescência

mostrou que não houve interferência das células fúngicas na fluorescência

emitida pelo PI (Figura 27, histograma A).

Após período de incubação de 1h a 37°C para L. cubeba, C. martini e

geraniol e 2h para citral, conforme determinado pela curva de morte realizada,

foi observado que o OE de L. cubeba apresentou, em média, 0,5% de células

que sofreram lesão de membrana, enquanto seu principal componente, citral,

promoveu lesão em, em média, 1,3% das células de C. gattii 24065 (Figura 29).

C. martini e geraniol apresentaram respectivamente, em média, 5% e 3,9% de

morte celular por lesão de membrana (Figura 28).

Figura 27. Histogramas de C. gattii ATCC 24065 (A) Controle de autofluorescência, (B) Controle negativo, (C) Controle com álcool etílico 70%. O eixo X mostra, em escala logarítmica, a intensidade de fluorescência das células marcadas com PI. O gate M1 mostra a porcentagem de células não viáveis, marcadas.

57

Figura 28. Histogramas de C. gattii ATCC 24065 tratado com diferentes concentrações dos OE e composto majoritário. C. martini (D1) 2048 µg/mL (CFM), (D2) 1024 µg/mL (1/2 CFM), (D3) 512 µg/mL (1/4 CFM) e Geraniol (E1) 2048 µg/mL (CFM), (E2) 1024 µg/mL (1/2 CFM) e (E3) 512 µg/mL (1/4 CFM). O eixo X mostra, em escala logarítmica, a intensidade de fluorescência das células marcadas com PI. O gate M1 mostra a porcentagem de células não viáveis, marcadas.

58

Figura 29. Histogramas de C. gattii ATCC 24065 tratado com diferentes concentrações do OE e composto majoritário. L. cubeba (F1) 256 µg/mL (CFM), (F2) 128 µg/mL (1/2 CFM), (F3) 64 µg/mL (1/4 CFM)e Citral (G1) 256 µg/mL (CFM), (G2) 128 µg/mL (1/2 CFM), (G3) 64 µg/mL (1/4 CFM). O eixo X mostra, em escala logarítmica, a intensidade de fluorescência das células marcadas com PI. O gate M1 mostra a porcentagem de células não viáveis, marcadas.

Avaliação da citotoxicidade Os OEs e compostos majoritários avaliados promoveram a lise em menos

de 1,5% das hemácias quando comparadas aos controles, em concentrações

menores ou iguais às respectivas CFMs (Figura 30). O controle positivo com o

agente hemolisante Triton-X a 1% mostrou 100% de lise sobre as hemácias,

enquanto o controle negativo apresentou, em média, 0,25% de hemólise. Para L.

cubeba a concentração 4096 µg/mL (8x a CFM) promoveu lise em 36,6% das

hemácias tratadas e para C. martini, na mesma concentração, houve hemólise

de 41,4% (Figuras 30 e 31). Os compostos isolados citral e geraniol

apresentaram atividade hemolítica de 5,3 e 18,4%, respectivamente, a 4096

µg/mL. O fármaco AMB promoveu hemólise a partir de 100 µg/mL (Figura 31).

59

Figura 30. Ensaio de atividade hemolítica realizado com os OEs de L. cubeba e C. martini, em concentrações de 4096 µg/mL a 8 µg/mL. Controle positivo: Triton X-100 a 1% e controle negativo: sangue em tampão PBS.

Figura 31. Ação dos OEs L. cubeba, C. martini, citral e geraniol sobre hemácias. A quantidade de hemoglobina liberada pela lise celular foi determinada por absorbância de 560 nm e comparada ao controle positivo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096

Hem

ólis

e (%

)

Concentração dos agentes avaliados (µg/mL)

L. cubeba C. martini Citral Geraniol Anfotericina B

60

6. DISCUSSÃO

Nas últimas décadas, houve um aumento no número de micoses graves,

influenciado por fatores como o uso de antibioticoterapia de amplo espectro,

quimioterapia para neoplasias, terapias imunossupressivas e de pacientes com

aids, contribuindo para um sistema imune comprometido como porta de entrada

para infecções oportunísticas (Shao et al. 2007). A criptococose é uma das mais

importantes infecções fúngicas devido, em grande parte, a sua prevalência como

causa de meningoencefalite em pacientes com HIV/aids, associada a alta taxa

de mortalidade (Chayakulkeeree & Perfect 2006, Park et al. 2009). Plantas

medicinais representam uma alternativa econômica, acessível e aplicável a

várias patologias e tem sido frequentemente investigadas para verificar a

viabilidade e sustentabilidade para o uso como medicamentos alternativos

(Ashcroft & Po 1999). Estudos recentes tem demonstrado a atividade antifúngica

de OEs (Pinto et al. 2009, Cleff et al. 2010, Vale-Silva et al. 2010) e

consequentemente, tem aumentado a possibilidade de aplicar estes produtos na

prevenção e/ou tratamento de doenças fúngicas (Negri et al. 2014).

Os OEs de L. cubeba e C. martini e alguns de seus componentes têm

ampla atividade antimicrobiana conhecida (Feng et al. 2009, Lodhia et al. 2009,

Palmeira-de-Oliveira et al. 2009, Prasad et al. 2010, Wang & Liu 2010). A

atividade biológica dos OEs está intimamente relacionada à sua composição

química, que varia de acordo com o clima, composição do solo, órgão, idade e

estágio de ciclo vegetativo da planta de que foi extraído (Angioni et al. 2006,

Bakkali et al. 2008).

Embora existam muitas variáveis que interferem na composição do OE,

estudos mostram que o componente majoritário está presente em maior

quantidade, independente das amostras extraídas em diferentes condições. Ao

ser analisado por GC/MS, o OE extraído das folhas de C. martini apresentou o

geraniol como principal componente em três estudos, com 81,4%, 60,9% e

50,7% dos constituintes do OE (Prasad et al. 2010, Katiki et al. 2011, Khan &

Ahmad 2011). O OE dos frutos L. cubeba apresenta como principal constituinte

o citral, conforme já descrito na literatura, representando 68,3% e 63,7% dos

componentes, em diferentes análises (Wang & Liu 2010, Li et al. 2014). Essas

61

informações, associado ao laudo técnico do fabricante, nos levou a considerar e

realizar os ensaios de atividade biológica dos OEs de L. cubeba e C. martini,

utilizando o citral e geraniol, respectivamente, como compostos majoritários

(Anexos 2 e 3).

A atividade antifúngica de extratos, OEs e compostos puros isolados pode

ser quantitativamente avaliada através da determinação de CIM e CFM,

utilizando o método de diluição em caldo (Roser Vila et al. 2013). Este teste

proporciona melhor distribuição do óleo no meio de cultura comparado ao teste

em meio sólido, sendo mais efetivo para determinação da concentração inibitória

(Kalemba & Kunicka 2003). O teste de microdiluição padronizado pelo CLSI

representa um método mais sensível e reprodutível entre os métodos

disponíveis (Mesa-Arango et al. 2009), e é frequentemente utilizado para avaliar

a atividade de OEs (Pinto et al. 2009, Khan et al. 2010, Ahmad et al. 2011).

Não existe um consenso sobre o nível aceitável que represente a

atividade antimicrobiana significativa para materiais oriundos de plantas (Mesa-

Arango et al. 2009). Borges-Argaez et al. (2007) consideram que valores de CIM

entre 100 e 200 µg/mL são aceitáveis, enquanto Aligiannis et al. (2001) sugerem

uma classificação baseada nos resultados de CIM, como forte inibição (até 500

µg/mL), moderada (entre 600 e 1500 µg/mL) e fraca inibição (maior que 1600

µg/mL). Considerando esses critérios, o OE de L. cubeba demonstrou maior e

melhor atividade antifúngica entre os OEs e compostos isolados avaliados, visto

que a maioria dos isolados do complexo C. neoformans foram inibidos a 64

µg/mL (p<0,05).

A atividade antifúngica destes OEs sobre isolados do complexo C.

neoformans não são reportados, tornando de grande importância o presente

trabalho. Relato de Yang et al. (2010) demonstra que o OE do fruto de L.

cubeba, possui atividade fungicida com inibição de 50% do crescimento dos

fungos fitopatógenos Thanatephorus cucumeris e Sclerotinia sclerotiorum, nas

concentrações de 116 e a 152 µg/mL respectivamente. A atividade

antimicrobiana desses OEs também foi relatada para as bactérias gram-

positivas Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus com CIMs de 100 e 200

µg/mL e entre 500 e 620 µg/mL para as gram negativas Escherichia coli e

Pseudomonas aeruginosa (Wang & Liu 2010).

62

O citral apresentou bons resultados, com forte inibição de acordo com

critério de Aligiannis et al. (2001), sendo que 70,6% dos isolados de C.

neoformans e C. gattii foram inibidos a uma concentração de 128 µg/mL

(p<0,05), fato que comprova sua participação na atividade do OE de L. cubeba.

A ação do citral já foi reportada sobre leveduras do gênero Candida sp., em

especial C. albicans, com CIM de 64 µg/mL (Leite et al. 2014) e 512 µg/mL

(Lima et al. 2012). da Silva et al. (2008) avaliaram a ação do citral sobre isolados

de C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis, através do

testes de difusão em disco, sendo demonstrado halo de inibição entre 29 e 50

mm. Fungos filamentosos dos gêneros Fusarium sp. e Mucor sp. tiveram seu

crescimento inibido em concentração correspondente a 100 µg/mL de citral ao

analisar 15 diferentes componentes isolados de OEs sobre fungos filamentosos

(Moleyar & Narasimham 1986).

A CFM pode ser definida como a menor concentração capaz de inibir

totalmente o crescimento em ágar, correspondente a morte de 99% dos micro-

organismos. Quanto aos resultados de CFMs obtidos para o OE de L. cubeba e

para citral, observou-se que não houve diferença significativa na ação fungicida

entre OE e composto majoritário. Estes dados, associados aos valores de CIM

obtidos, corroboram a responsabilidade do citral na atividade antifúngica

inibitória e fungicida de L. cubeba. A melhor atividade inibitória de L. cubeba

quando comparada ao citral pode ser explicada pela ação sinérgica de um ou

mais componentes do OE com o composto majoritário, potencializando a ação

antifúngica (Bakkali et al. 2008).

O OE de C. martini inibiu 58,8% dos isolados em uma concentração de

512 µg/mL sendo considerada moderada atividade antifúngica (Aligiannis et al.

2001). Alguns estudos indicam que o OE de C. martini possui potencial atividade

inibitória frente a alguns fungos. Duarte et al. (2005) encontraram CIM maior que

2000 µg/mL para C. martini em um estudo para triagem da atividade de

diferentes OEs sobre C. albicans ATCC 10231. Em fungos filamentosos, a

atividade de C. martini foi observada em Aspergillus flavus, A. niger, A.

fumigatus, Trichophyton mentagrophytes, T. verrucosum e T. violaceum, inibindo

entre 61 e 92% do crescimento na concentração de 200 ppm (Prasad et al.

2010). A atividade também foi descrita por Bansod &Rai (2008), que estudando

alguns OEs de plantas medicinais da Índia, observaram alta atividade de C.

63

martini sobre A. fumigatus e A. niger, quando comparados ao controle com

miconazol. Além disso, tem sido demonstrado que C. martini tem atividade

descrita frente a bactérias gram negativas e positivas, como E. coli e S. aureus

(Lodhia et al. 2009).

O geraniol, principal constituinte do OE de C. martini, apresentou forte

atividade inibitória, com 52,9% dos isolados inibidos a 256 µg/mL (Aligiannis et

al. 2001). A ação antifúngica deste monoterpeno observada neste trabalho

também foi descrita em estudos sobre leveduras e fungos filamentosos (Moleyar

& Narasimham 1986, Zore et al. 2011, Leite et al. 2015). A atividade sobre

leveduras foi descrita em C. neoformans, segundo Viollon & Chaumont (1994),

em diluição do composto em ASD, com CIM de 100 µL/L. Leite et al. (2015)

verificaram a atividade frente a 10 isolados de C. albicans, com CIM90 igual a 16

µg/mL, enquanto que Bard et al. (1988) observaram CIM de 309 a 463 µg/mL

sobre três isolados e para de Sacharomyces cerevisiae, a uma concentração

463 µg/mL. A ação frente a fungos filamentosos como A. niger, Fusarium

oxysporum e Mucor sp mostrou CIM de 100 µg/mL (Moleyar & Narasimham

1986) e um estudo de Khan & Ahmad (2011) observou 95% de inibição do

crescimento de T. rubrum e A. fumigatus expostos a 0,16% v/v de geraniol.

Ao comparar os valores de CIM do OE de C. martini (512 µg/mL) e

geraniol (256 µg/mL), para a maioria dos isolados avaliados, associado aos

resultados da CFM de C. martini, observou-se que os valores de maior

relevância foram de 2x a CIM, no valor de 1024 µg/mL (52,9%, p<0,05), assim

como para geraniol, com 256 µg/mL (47,1%). Estes dados indicam que o

componente majoritário pode ser um importante fator na atividade antifúngica do

OE.

A combinação entre OEs de plantas e fármacos antimicrobianos pode

produzir um efeito sinérgico ou aditivo, que tem sido referido como uma

estratégia no combate aos micro-organismos (Wagner & Ulrich-Merzenich 2009).

O efeito sinérgico de antifúngicos otimiza a terapia e reduz a dose requerida

para ambos expressarem a atividade fungistática ou fungicida. Desta forma,

efeitos colaterais como nefrotoxicidade, para AMB e hepatotoxicidade, para o

fluconazol, podem ser amenizados pela co-administração (Silva et al. 2011).

Outro inconveniente evitado por esta estratégia é a ocorrência de isolados

64

resistentes, frequentemente relatados para o fluconazol na prática clínica

(Huang et al. 2008, Agudelo et al. 2014).

Para o estudo da associação entre produtos naturais e fármacos

antifúngicos, em geral os métodos de Chequerboard e de estudos de curva de

morte são empregados (Huang et al. 2008). O primeiro é de realização e

interpretação mais prática e o segundo, fornece informações adicionais sobre a

interação antifúngica, ajudando a elucidar a farmacodinâmica da combinação

dos compostos em análise (Lewis et al. 2002). Neste trabalho, o método de

Chequerboard foi executado por ser de melhor aplicabilidade, tendo em vista a

análise de vários isolados, associados a combinações de dois fármacos

antifúngicos com OEs e compostos majoritários.

A associação entre o OE de L. cubeba e seu composto majoritário citral e

AMB não promoveu alteração na CIM para a maioria dos isolados do complexo

C. neoformans avaliados, sendo que importante resultado observou-se para o

citral, onde a associação resultou em uma potencialização da atividade

antifúngica em 29,4% dos isolados. Lima (2011) utilizou o método de curva de

morte (time-kill) para avaliar a interação entre citral e AMB sobre C. albicans, e

observou que também não há alteração da CIM para essa espécie. Khan et al.

(2012) verificaram que citral associado à AMB ou fluconazol apresentou

atividade sinérgica sobre 20 cepas de C. albicans resistentes ao fluconazol, das

quais 13 também eram resistentes a AMB. A variação nas interações

observadas experimentalmente é relatada em estudos de combinação entre

antifúngicos, modificando-se entre espécies e também entre diferentes cepas

avaliadas (Cuenca-Estrella 2004). A associação de 5-FC e AMB, por exemplo,

tem diferentes interações de acordo com o micro-organismo em teste, sendo

antagônica para Aspergillus sp. (Denning et al. 1992), indiferente para C.

albicans e sinérgica diante de C. neoformans (Keele et al. 2001).

A associação de L. cubeba com fluconazol resultou em interação

antagônica (76,5%) estatisticamente significante comparado a seu composto

majoritário. Para o citral, observou-se que 5,9% dos isolados demonstraram

atividade sinérgica nesta combinação e para a maioria dos isolados avaliados

(94,1%), a associação não promoveu alteração em seus respectivos valores de

CIM (indiferença). O antagonismo apresentado por L. cubeba comparado à

indiferença do citral indica que os demais constituintes do OE provavelmente

65

podem interagir diminuindo a atividade antifúngica dos compostos na presença

de fluconazol ou vice-versa, resultando em aumento da CIM.

A interação de C. martini com AMB mostrou que em 52,9% dos isolados

houve uma diminuição da CIM, demonstrando uma melhora na atividade

antifúngica (sinergismo). Esta mesma característica foi observada em seu

composto majoritário em 70,6% dos isolados do complexo C. neoformans

avaliados. O geraniol, composto majoritário do OE de Thymus glabrescens,

também apresentou sinergismo associado ao cloranfenicol, com significativa

redução da CIM sobre bactérias gram-negativas (Ilic et al. 2014). Outros estudos

mostraram resultados semelhantes na associação desse fitoconstituinte com o

cetoconazol, demonstrando forte sinergismo quando avaliado sobre os

dermatófitos T. shoenleinii e T. soudanense (Shin & Lim 2004). Isto demonstra

que o composto majoritário de C. martini pode representar uma alternativa para

uma terapia antifúngica efetiva e menos tóxica (Giordani et al. 2004), revelando-

se como uma possível estratégia terapêutica para infecções fúngicas.

A associação do OE de C. martini e de geraniol ao fluconazol foi

predominantemente indiferente, comportamento semelhante aos de Khan &

Ahmad (2011) que investigaram a associação entre C. martini e geraniol com

fluconazol e também verificaram indiferença nessa interação sobre A. fumigatus.

Por outro lado, o sinergismo entre esses compostos e o fluconazol foi observado

sobre isolado de T. rubrum avaliado no mesmo estudo.

A avaliação de novos agentes antimicrobianos in vitro pode ser realizada

também através do método de curva de morte, pois permite uma avaliação mais

dinâmica da interação entre o agente antimicrobiano e um dado micro-

organismo, mostrando utilidade clínica maior do que determinações estáticas

como a CFM (Pfaller et al. 2004). Neste trabalho, o estudo da curva de morte

sob ação dos OEs e componentes majoritários foi abordado sob este aspecto,

com o objetivo de comprovar a ação fungicida, determinada pela CFM em ágar e

observar a cinética dessa ação frente a cepa padrão de C. gattii ATCC 22019.

A ação dos OEs de L. cubeba e C. martini e seus compostos majoritários

sobre a curva de morte de C. gattii ainda não foi documentada na literatura,

dificultando a comparação dos resultados. A ação do OE de L. cubeba mostrou

alta toxicidade deste OE na CFM, reduzindo 99,9% do inóculo inicial (<1 log10

UFC/mL) após uma hora de incubação. O citral exerceu ação fungicida após

66

duas horas em contato com C. gattii. Lima (2011) realizou a curva de morte de

um isolado de C. albicans sob ação do citral em diferentes concentrações (512

µg/mL (CIM), ½ CIM e ¼ CIM) e observou que houve uma redução no número

de colônias dessa espécie, em relação ao controle não tratado, de maneira

dose-dependente. Zore et al. (2011) avaliaram a curva de morte de C. albicans

sob ação do citral, em uma concentração de 0,0064% v/v, correspondente a CIM

e seu resultado mostrou ausência de células viáveis após duas horas de

incubação. A cinética de inibição do citral também foi avaliada sobre dois

isolados de C. albicans nas concentrações ½ CIM, CIM (64 µg/mL) e 2xCIM por

Leite et al. (2014) que observou atividade fungicida nas concentrações

referentes à CIM e a 2x CIM após quatro horas de incubação, revelando a ação

fungicida dose-dependente deste fitoconstituinte. Estes dados corroboram a

ação fungicida de L. cubeba e citral sobre leveduras do complexo C.

neoformans, apresentando ação rápida sobre estes micro-organismos, uma vez

que em duas horas não havia células viáveis.

A ação fungicida de C. martini e geraniol ocorreu após uma hora de

incubação para ambos os compostos. A atividade fungicida de geraniol foi

observada sobre leveduras, como C. albicans, onde Leite et al. (2015)

demonstraram ação após duas horas, na concentração de 2xCIM (32 µg/mL),

para uma cepa padrão e, após quatro horas, para um isolado clínico. O controle

positivo para o ensaio de curva de morte foi realizado com C. gattii sob a ação

de AMB em concentração de 1 µg/mL, apresentou decréscimo na contagem de

células viáveis para <1 log10 UFC/mL após uma hora de incubação. Khan et al.

(2013) mostrou que esta concentração também foi fungicida ao avaliar C.

albicans, entretanto, a atividade ocorreu somente após 34 horas de incubação.

Os resultados apresentados neste trabalho comparados aos dados da literatura

mostram que C. martini e geraniol apresentam rápida ação fungicida sobre

leveduras do complexo C. neoformans.

O possível mecanismo de ação dos componentes testados sobre a

membrana plasmática foi avaliado através do estudo do efeito dos OEs e

compostos majoritários na quantidade de ergosterol produzida por C. gattii

24065 (Tian et al. 2012). O ergosterol é o maior componente da membrana

celular fúngica e responsável por manter a integridade e função celular

(Rodriguez et al. 1985). Por ser um esterol exclusivo dos fungos, esse se torna

67

um alvo para os fármacos (Ghannoum & Rice 1999) e a ação de alguns OEs

tem sido relatada como inibidores da biossíntese deste componente celular

presente no fungo (Ahmad et al. 2010, Ahmad et al. 2011).

A quantificação do ergosterol celular foi realizada para verificar se os OEs

e compostos majoritários se comportaram com mecanismo de ação similar aos

antifúngicos azólicos, reduzindo a quantidade de ergosterol de C. gattii 24065.

Os resultados apresentados neste trabalho demonstram uma redução de 100%

da biossíntese de ergosterol quando testado na CIM comparado ao controle

negativo, apresentado pelo OE de L. cubeba e seu composto majoritário. Rajput

&Karuppayil (2013) avaliaram a eficácia de 25 moléculas de origem vegetal

sobre isolados de Candida sp., entre elas o citral, e assim como o presente

trabalho, verificaram inibição da biossíntese do ergosterol em 100% na CIM. Hua

et al. (2014) avaliaram a ação do citral sobre a biossíntese de ergosterol em

Aspergillus ochraceus e observaram que em 200 µg/mL houve completa inibição

da produção deste esterol, confirmando a ação do citral sobre o ergosterol. Os

resultados obtidos neste trabalho sugerem que, como o fluconazol, moléculas

que alteram o perfil do esterol podem exercer seu efeito antifúngico através da

inibição da biossíntese do ergosterol e podem ser candidatos para o

desenvolvimento de fármacos específicos (Rajput & Karuppayil 2013).

O geraniol apresentou-se irrelevante na inibição da síntese do ergosterol

neste trabalho (12,3%), dado que é confirmado por estudos em C. albicans que

mostraram não haver interação do geraniol com ergosterol exógeno (Bard et al.

1988, Leite et al. 2015). A inatividade do geraniol sobre a síntese de ergosterol,

associada a uma inibição em 64,4% da produção de ergosterol por C. martini,

indica que outros componentes deste OE podem ser responsáveis pela inibição

do ergosterol observada e que provavelmente o mecanismo de ação de seu

composto isolado não está relacionado a redução na biossíntese do ergosterol.

A capacidade dos OEs e compostos majoritários de lesionar a membrana

plasmática de C. gattii, como mecanismo de ação, também foi investigada neste

trabalho. Para isso, as células fúngicas tratadas com diferentes concentrações

dos OEs e compostos majoritários foram colocadas em contato com o marcador

fluorescente PI e submetidas à análise em citômetro de fluxo.

Os resultados obtidos mostraram que os OEs e seus constituintes

majoritários agiram sobre 0,9% das células acarretando lesão de membrana

68

para L. cubeba e citral e em 4,5% para C. martini e geraniol. Estes dados

mostram que os OEs e constituintes majoritários avaliados neste trabalho não

apresentaram mecanismo de ação que envolva uma lesão primária de

membrana celular que compromete a viabilidade da célula. Isso foi evidenciado

pela pequena quantidade de células inviabilizadas, que são marcadas pelo PI

em consequência de uma extensa lesão de membrana. Observações

semelhantes são relatadas por Abrão (2013), que investigou a lesão de

membrana celular ocasionada por OEs Pelargonium graveolens e Cymbopogon

flexuosus que possuem geraniol e citral como composto majoritário,

respectivamente. Esse estudo mostrou que o OE de P. graveolens não

apresentou como mecanismo de ação a lesão da membrana celular de

leveduras do complexo Cryptococcus spp, visto que na CFM (512 µg/mL),

apenas 2% das células foram marcadas com PI e 1% para C. flexuosus (CFM 16

µg/mL).

A ação de OEs sobre a membrana tem sido avaliada para outros fungos

como Candida sp. Khan et al. (2013) estudaram a atividade antifúngica dos

constituintes majoritários cinamaldeído e eugenol, presentes em Cinamommum

verum e Syzygium aromaticum, respectivamente. Foi observado que estes

componentes aromáticos produziram lesão de membrana, inviabilizando 50,9%

das células para eugenol e 40,2% para cinamaldeído, em concentração igual a

4x a CIM. Pinto et al. (2009) observaram resultado semelhante ao avaliar a ação

do OE de S. aromaticum e o seu componente majoritário, eugenol, que

apresentaram mais de 90% de células de Candida albicans inviáveis após

tratamento com os agentes, em concentração igual a 4x a CIM. Outros

fitoconstituintes isolados de OEs têm como mecanismo de ação a alteração da

integridade da membrana celular, como os monoterpenos timol e carvacrol, que

ocasionaram morte de 60% e 90% das células de Candida sp. ao serem tratadas

com a CIM e 2x a CIM, respectivamente (Ahmad et al. 2011).

O teste de citotoxicidade in vitro é o primeiro ensaio para avaliação do

comportamento de um fármaco em células de mamíferos, sendo que essa

verificação da toxicidade é antecessora aos testes in vivo. Neste trabalho, optou-

se por realizar o ensaio de atividade hemolítica como teste de citotoxicidade. Foi

observado que os OEs e compostos majoritários avaliados não apresentaram

hemólise significativa em suas respectivas CFMs (<1,5%). Para os OEs de L.

69

cubeba e C. martini, foi detectada uma hemólise após incubação com alta

concentração destes OEs (4096 µg/mL), com 36,6 e 41,4%, respectivamente.

Os constituintes majoritários citral e geraniol apresentaram menor toxicidade que

os OEs nesta concentração, com 5,3 e 18,4% de hemólise, respectivamente. O

controle positivo com AMB mostrou que este fármaco só apresentou toxicidade

em altas concentrações (8x a CIM), assim como os OEs de L. cubeba e C.

martini e seus compostos majoritários.

Dados da literatura confirmam os resultados de baixa toxicidade in vitro

observados no presente trabalho. A citotoxicidade de C. martini foi avaliada

utilizando linfócitos humanos tratados com o OE e posteriormente corados com

azul de tripan, não observando toxicidade em concentrações entre 50 e 200

µg/mL (Sinha et al. 2011). A atividade citotóxica do composto majoritário de C.

martini foi verificada por Zore et al. (2011) sobre células HeLa, e na CIM (561

µg/mL) foi observado que o geraniol não apresentou atividade citotóxica. O

constituinte majoritário de L. cubeba também não apresentou atividade citotóxica

na CIM (0,064% v/v) em estudo sobre sua toxicidade nestas células (Zore et al.

2011).

Produtos naturais fornecem uma vasta fonte de estruturas químicas com

diversas atividades biológicas, e tem um profundo impacto na perspectiva de

descoberta de novos fármacos antimicrobianos (Khan et al. 2010). Os resultados

deste trabalho sugerem opções para expandir a utilidade dos óleos essenciais

de plantas e seus componentes ativos, como candidatos a agentes antifúngicos.

70

7. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir:

• Os OEs de L. cubeba e C. martini e compostos majoritários citral e

geraniol apresentaram atividade antifúngica significativa sobre

isolados do complexo C. neoformans, sendo que os menores valores

de CIM e CFM foram obtidos pelo OE de L. cubeba e citral.

• A associação do OE de L. cubeba ou citral com AMB não demonstrou

melhora na atividade antifúngica, enquanto para o OE de C. martini e

geraniol apresentaram importantes resultados de sinergismo quando

associados com AMB, podendo ser associados na perspectiva de

diminuição dos efeitos tóxicos deste fármaco.

• A associação de L. cubeba com fluconazol promoveu um aumento da

CIM de ambos, induzindo antagonismo indesejável em uma possível

associação terapêutica.

• A curva de morte em leveduras de C. gatti ATCC 24065, ao ser tratado

com os OEs, mostrou que para L. cubeba, C. martini e geraniol o

tempo para a ação fungicida foi de uma hora, enquanto que para citral,

de duas horas. A determinação da cinética de inibição foi importante

para avaliar o momento da efetiva ação fungicida dos OEs e

constituintes majoritários sobre o fungo.

• A ação antifúngica de L. cubeba, citral e C. martini promoveu uma

diminuição na síntese do ergosterol, o que não foi observado para o

geraniol. Provavelmente, os agentes que mostraram capacidade de

reduzir este esterol interferem em sua via biossintética.

• Os OEs e compostos majoritários não apresentaram como mecanismo

de ação a lesão da membrana plasmática de C. gattii ATCC 24065,

que foi demonstrado pela pequena quantidade de células inviáveis na

CFM.

• Os OEs e compostos majoritários não apresentaram atividade

hemolítica nas CIMs e CFMs obtidas, demonstrando baixo potencial

71

toxicológico, tornando-se promissores candidatos ao desenvolvimento

de antifúngicos.

72

REFERÊNCIAS

Abrão FY (2013). Atividade biológica de óleos essenciais em leveduras do complexo Cryptococcus neoformans. Mestrado, Universidade Federal de Goiás. Agrawal N, Choudhary AS, Sharma MC and Dobhal MP. Chemical constituents of plants from the genus Litsea. Chem Biodivers 8(2): 223-243, 2011. Agudelo CA, Munoz C, Ramirez A, Tobon AM, de Bedout Bact C, Cano LE and Restrepo A. Response to therapy in patients with cryptococcosis and AIDS: Association with in vitro susceptibility to fluconazole. Rev Iberoam Micol, 2014. Ahmad A, Khan A, Akhtar F, Yousuf S, Xess I, Khan LA and Manzoor N. Fungicidal activity of thymol and carvacrol by disrupting ergosterol biosynthesis and membrane integrity against Candida. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 30(1): 41-50, 2011. Ahmad A, Khan A, Manzoor N and Khan LA. Evolution of ergosterol biosynthesis inhibitors as fungicidal against Candida. Microb Pathog 48(1): 35-41, 2010. Aligiannis N, Kalpoutzakis E, Mitaku S and Chinou IB. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. J Agric Food Chem 49(9): 4168-4170, 2001. Aller AI, Martin-Mazuelos E, Lozano F, Gomez-Mateos J, Steele-Moore L, Holloway WJ, Gutierrez MJ, Recio FJ and Espinel-Ingroff A. Correlation of fluconazole MICs with clinical outcome in cryptococcal infection. Antimicrob Agents Chemother 44(6): 1544-1548, 2000. Alvarez-Barrientos A, Arroyo J, Canton R, Nombela C and Sanchez-Perez M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev 13(2): 167-195, 2000. Amber K, Aijaz A, Immaculata X, Luqman KA and Nikhat M. Anticandidal effect of Ocimum sanctum essential oil and its synergy with fluconazole and ketoconazole. Phytomedicine 17(12): 921-925, 2010. Angioni A, Barra A, Coroneo V, Dessi S and Cabras P. Chemical composition, seasonal variability, and antifungal activity of Lavandula stoechas L. ssp. stoechas essential oils from stem/leaves and flowers. J Agric Food Chem 54(12): 4364-4370, 2006. Antinori S. New Insights into HIV/AIDS-Associated Cryptococcosis. ISRN AIDS 2013: 471363, 2013. Arsic Arsenijevic V, Pekmezovic MG, Meis JF and Hagen F. Molecular epidemiology and antifungal susceptibility of Serbian Cryptococcus neoformans isolates. Mycoses, 2014.

73

Arthington-Skaggs BA, Jradi H, Desai T and Morrison CJ. Quantitation of ergosterol content: novel method for determination of fluconazole susceptibility of Candida albicans. J Clin Microbiol 37(10): 3332-3337, 1999. Asbahani AE, Miladi K, Badri W, Sala M, Addi EH, Casabianca H, Mousadik AE, Hartmann D, Jilale A, Renaud FN and Elaissari A. Essential oils: From extraction to encapsulation. Int J Pharm 483(1-2): 220-243, 2015. Ashcroft DM and Po AL. Herbal remedies: issues in licensing and economic evaluation. Pharmacoeconomics 16(4): 321-328, 1999. B&TWorldSeeds (2014). Information and prices for Cymbopogon martini. France, http://b-and-t-worldseeds.com/cartall.asp?species=Cymbopogon%20martinii&sref=65631. Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D and Idaomar M. Biological effects of essential oils--a review. Food Chem Toxicol 46(2): 446-475, 2008. Baldassarre R, Mdodo R, Omonge E, Jaoko W, Baddley J, Pappas P, Mirjam-Colette K, Aban I, Odera S, Suleh A and Jolly PE. Mortality after Clinical Management of Aids-Associated Cryptococcal Meningitis in Kenya. East Afr Med J 91(5): 145-151, 2014. Bansod S and Rai M. Antifungal activity of essential oils from indian medicinal plants against human pathogenic Aspergillus fumigatus and A. niger. World Journal of Medical Sciences 2: 7, 2008. Bard M, Albrecht MR, Gupta N, Guynn CJ and Stillwell W. Geraniol interferes with membrane functions in strains of Candida and Saccharomyces. Lipids 23(6): 534-538, 1988. Bariteau JT, Waryasz GR, McDonnell M, Fischer SA, Hayda RA and Born CT. Fungal osteomyelitis and septic arthritis. J Am Acad Orthop Surg 22(6): 390-401, 2014. Bicanic T, Harrison T, Niepieklo A, Dyakopu N and Meintjes G. Symptomatic relapse of HIV-associated cryptococcal meningitis after initial fluconazole monotherapy: the role of fluconazole resistance and immune reconstitution. Clin Infect Dis 43(8): 1069-1073, 2006. Bicanic T, Meintjes G, Rebe K, Williams A, Loyse A, Wood R, Hayes M, Jaffar S and Harrison T. Immune reconstitution inflammatory syndrome in HIV-associated cryptococcal meningitis: a prospective study. J Acquir Immune Defic Syndr 51(2): 130-134, 2009. Bitar D, Lortholary O, Le Strat Y, Nicolau J, Coignard B, Tattevin P, Che D and Dromer F. Population-based analysis of invasive fungal infections, France, 2001-2010. Emerg Infect Dis 20(7): 1149-1155, 2014.

74

Boekhout T, Theelen B, Diaz M, Fell JW, Hop WC, Abeln EC, Dromer F and Meyer W. Hybrid genotypes in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans. Microbiology 147(Pt 4): 891-907, 2001. Borges-Argaez R, Canche-Chay CI, Pena-Rodriguez LM, Said-Fernandez S and Molina-Salinas GM. Antimicrobial activity of Diospyros anisandra. Fitoterapia 78(5): 370-372, 2007. Boucher HW, Talbot GH, Bradley JS, Edwards JE, Gilbert D, Rice LB, Scheld M, Spellberg B and Bartlett J. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 48(1): 1-12, 2009. Bouhdid S, Abrini J, Zhiri A, Espuny MJ and Manresa A. Investigation of functional and morphological changes in Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus cells induced by Origanum compactum essential oil. J Appl Microbiol 106(5): 1558-1568, 2009. Bovers M, Hagen F, Kuramae EE and Boekhout T. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol 45(4): 400-421, 2008. Breivik ON and Owades JL. Yeast Analysis, Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Journal of Agricultural and Food Chemistry 5(5): 3, 1957. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol 94(3): 223-253, 2004. Butler G. Fungal sex and pathogenesis. Clin Microbiol Rev 23(1): 140-159, 2010. Calixto JB. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytotherapeutic agents). Braz J Med Biol Res 33(2): 179-189, 2000. Calvo BM, Colombo AL, Fischman O, Santiago A, Thompson L, Lazera M, Telles F, Fukushima K, Nishimura K, Tanaka R, Myiajy M and Moretti-Branchini ML. Antifungal susceptibilities, varieties, and electrophoretic karyotypes of clinical isolates of Cryptococcus neoformans from Brazil, Chile, and Venezuela. J Clin Microbiol 39(6): 2348-2350, 2001. Campbell LT and Carter DA. Looking for sex in the fungal pathogens Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. FEMS Yeast Res 6(4): 588-598, 2006. Casadevall A. Cards of virulence and the global virulome for humans. Microbe 1(8): 6, 2006.

75

Casadevall A, Mukherjee J, Yuan R and Perfect J. Management of injuries caused by Cryptococcus neoformans--contaminated needles. Clin Infect Dis 19(5): 951-953, 1994. Casadevall A and Perfect JR (1998). Chapter 3: Ecology of Cryptococcus neoformans. The American Society for Microbiology Press: 41-70. Casali AK, Goulart L, Rosa e Silva LK, Ribeiro AM, Amaral AA, Alves SH, Schrank A, Meyer W and Vainstein MH. Molecular typing of clinical and environmental Cryptococcus neoformans isolates in the Brazilian state Rio Grande do Sul. FEMS Yeast Res 3(4): 405-415, 2003. Cascaes MM, Guilhon GM, Andrade EH, Zoghbi M and Santos Lda S. Constituents and Pharmacological Activities of Myrcia (Myrtaceae): A Review of an Aromatic and Medicinal Group of Plants. Int J Mol Sci 16(10): 23881-23904, 2015. Cattana ME, Fernandez MS, Rojas FD, Sosa ML and Giusiano G. [Genotypes and epidemiology of clinical isolates of Cryptococcus neoformans in Corrientes, Argentina.]. Rev Argent Microbiol, 2015. Cavaleiro C, Salgueiro L, Goncalves MJ, Hrimpeng K, Pinto J and Pinto E. Antifungal activity of the essential oil of Angelica major against Candida, Cryptococcus, Aspergillus and dermatophyte species. J Nat Med 69(2): 241-248, 2015. Cerikcioglu N. [Mating types, sexual reproduction and ploidy in fungi: effects on virulence]. Mikrobiyol Bul 43(3): 507-513, 2009. Chamilos G and Kontoyiannis DP. The rationale of combination antifungal therapy in severely immunocompromised patients: empiricism versus evidence-based medicine. Curr Opin Infect Dis 19(4): 380-385, 2006. Chaturvedi V and Chaturvedi S. Cryptococcus gattii: a resurgent fungal pathogen. Trends Microbiol 19(11): 564-571, 2011. Chayakulkeeree M and Perfect JR. Cryptococcosis. Infect Dis Clin North Am 20(3): 507-544, v-vi, 2006. Choi EM and Hwang JK. Effects of methanolic extract and fractions from Litsea cubeba bark on the production of inflammatory mediators in RAW264.7 cells. Fitoterapia 75(2): 141-148, 2004. Chuang PH, Lee CW, Chou JY, Murugan M, Shieh BJ and Chen HM. Anti-fungal activity of crude extracts and essential oil of Moringa oleifera Lam. Bioresour Technol 98(1): 232-236, 2007. Cleff MB, Meinerz AR, Xavier M, Schuch LF, Schuch LF, Araujo Meireles MC, Alves Rodrigues MR and de Mello JR. In vitro activity of origanum vulgare essential oil against candida species. Braz J Microbiol 41(1): 116-123, 2010.

76

CLSI CaLSI- (2008). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard - Third Edition. CLSI document M27-A3 (ISBN 1-56238-666-2). Pensilvânia, Estados Unidos: 21. CLSI CaLSI. M27-S4: Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Fourth Informational Supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute 32(17): 28, 2012. Cogliati M. Global Molecular Epidemiology of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii: An Atlas of the Molecular Types. Scientifica (Cairo) 2013: 675213, 2013. Corbett EL, Churchyard GJ, Charalambos S, Samb B, Moloi V, Clayton TC, Grant AD, Murray J, Hayes RJ and De Cock KM. Morbidity and mortality in South African gold miners: impact of untreated disease due to human immunodeficiency virus. Clin Infect Dis 34(9): 1251-1258, 2002. Couto FM, Macedo DP and Neves RP. Fungemia in a university hospital: an epidemiological approach. Rev Soc Bras Med Trop 44(6): 745-748, 2011. Cox SD, Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson JE, Warmington JR and Wyllie SG. The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J Appl Microbiol 88(1): 170-175, 2000. Cragg GM, Newman DJ and Snader KM. Natural products in drug discovery and development. J Nat Prod 60(1): 52-60, 1997. Cuenca-Estrella M. Combinations of antifungal agents in therapy--what value are they? J Antimicrob Chemother 54(5): 854-869, 2004. Da Costa MAC, Jesus JG, Nogueira JCM, De Oliveira ALR and Ferri PH. Variação estacional do óleo essencial em arnica (Lychnofora Ericoides Mart.). Rev. Biol. Neotrop. 5(1): 12, 2008. da Costa MP, Bozinis MC, Andrade WM, Costa CR, da Silva AL, Alves de Oliveira CM, Kato L, Fernandes Ode F, Souza LK and Silva Mdo R. Antifungal and cytotoxicity activities of the fresh xylem sap of Hymenaea courbaril L. and its major constituent fisetin. BMC Complement Altern Med 14: 245, 2014. Da Silva BK, Freire AK, Bentes Ados S, Sampaio Ide L, Santos LO, Dos Santos MS and De Souza JV. Characterization of clinical isolates of the Cryptococcus neoformans-Cryptococcus gattii species complex from the Amazonas State in Brazil. Rev Iberoam Micol 29(1): 40-43, 2012. da Silva CD, Guterres SS, Weisheimer V and Schapoval EES. Antifungal activity of the lemongrass oil and citral against Candida spp. Brazilian Journal of Infectious Diseases 12(1): 63-66, 2008.

77

Da Silva FR, Junior AW, Filho VC and Nunes DS. Chemical composition of essential oil from the bark of Croton cajucara Bentham. Acta Scientiarum 34(3): 4, 2012. Day JN, Chau TT, Wolbers M, Mai PP, Dung NT, Mai NH, Phu NH, Nghia HD, Phong ND, Thai CQ, Thai le H, Chuong LV, Sinh DX, Duong VA, Hoang TN, Diep PT, Campbell JI, Sieu TP, Baker SG, Chau NV, Hien TT, Lalloo DG and Farrar JJ. Combination antifungal therapy for cryptococcal meningitis. N Engl J Med 368(14): 1291-1302, 2013. De Logu A, Saddi M, Cardia MC, Borgna R, Sanna C, Saddi B and Maccioni E. In vitro activity of 2-cyclohexylidenhydrazo-4-phenyl-thiazole compared with those of amphotericin B and fluconazole against clinical isolates of Candida spp. and fluconazole-resistant Candida albicans. J Antimicrob Chemother 55(5): 692-698, 2005. de Paula ESAC, Costa-Orlandi CB, Gullo FP, Sangalli-Leite F, de Oliveira HC, da Silva Jde F, Scorzoni L, Pitangui Nde S, Rossi SA, Benaducci T, Wolf VG, Regasini LO, Petronio MS, Silva DH, Bolzani VS, Fusco-Almeida AM and Mendes-Giannini MJ. Antifungal Activity of Decyl Gallate against Several Species of Pathogenic Fungi. Evid Based Complement Alternat Med 2014: 506273, 2014. Denning DW, Hanson LH, Perlman AM and Stevens DA. In vitro susceptibility and synergy studies of Aspergillus species to conventional and new agents. Diagn Microbiol Infect Dis 15(1): 21-34, 1992. Dromer F, Mathoulin-Pelissier S, Fontanet A, Ronin O, Dupont B, Lortholary O and French Cryptococcosis Study G. Epidemiology of HIV-associated cryptococcosis in France (1985-2001): comparison of the pre- and post-HAART eras. AIDS 18(3): 555-562, 2004. Duarte MC, Figueira GM, Sartoratto A, Rehder VL and Delarmelina C. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. J Ethnopharmacol 97(2): 305-311, 2005. Dupont S, Lemetais G, Ferreira T, Cayot P, Gervais P and Beney L. Ergosterol biosynthesis: a fungal pathway for life on land? Evolution 66(9): 2961-2968, 2012. Edris AE. Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituents: a review. Phytother Res 21(4): 308-323, 2007. Eisenbrand G, Pool-Zobel B, Baker V, Balls M, Blaauboer BJ, Boobis A, Carere A, Kevekordes S, Lhuguenot JC, Pieters R and Kleiner J. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol 40(2-3): 193-236, 2002. Eisenman HC, Casadevall A and McClelland EE. New insights on the pathogenesis of invasive Cryptococcus neoformans infection. Curr Infect Dis Rep 9(6): 457-464, 2007.

78

El-Seedi HR, Sata N, Torssell KB and Nishiyama S. New labdene iterpenes from Eupatorium glutinosum. J Nat Prod 65(5): 728-729, 2002. El Assal FE, Paula JA, Capeletti LS, Abrao FY, Ataides FS, Sa FA, Costa CR, Fernandes Ode F, Souza LK and Silva Mdo R. Pimenta pseudocaryophyllus inhibits virulence factors and promotes metabolic changes in Candida yeast. Rev Soc Bras Med Trop 47(5): 618-623, 2014. Emery HS, Shelburne CP, Bowman JP, Fallon PG, Schulz CA and Jacobson ES. Genetic study of oxygen resistance and melanization in Cryptococcus neoformans. Infect Immun 62(12): 5694-5697, 1994. Ernst EJ and Rogers PD. Antifungal Agents: Methods and Protocols. Human Press Inc.: New Jersey, 2008. Escandon P, de Bedout C, Lizarazo J, Agudelo CI, Tobon A, Bello S, Restrepo A, Castaneda E and Grupo Colombiano para el Estudio de la C. Cryptococcosis in Colombia: results of the national surveillance program for the years 2006-2010. Biomedica 32(3): 386-398, 2012. Faria NC, Kim JH, Goncalves LA, Martins Mde L, Chan KL and Campbell BC. Enhanced activity of antifungal drugs using natural phenolics against yeast strains of Candida and Cryptococcus. Lett Appl Microbiol 52(5): 506-513, 2011. Favalessa OC, de Paula DA, Dutra V, Nakazato L, Tadano T, Lazera Mdos S, Wanke B, Trilles L, Walderez Szeszs M, Silva D and Hahn RC. Molecular typing and in vitro antifungal susceptibility of Cryptococcus spp from patients in Midwest Brazil. J Infect Dev Ctries 8(8): 1037-1043, 2014. Feng T, Xu Y, Cai XH, Du ZZ and Luo XD. Antimicrobially active isoquinoline alkaloids from Litsea cubeba. Planta Med 75(1): 76-79, 2009. Feng X, Yao Z, Ren D and Liao W. Simultaneous identification of molecular and mating types within the Cryptococcus species complex by PCR-RFLP analysis. J Med Microbiol 57(Pt 12): 1481-1490, 2008. Fortun J. [Antifungal therapy update: new drugs and medical uses]. Enferm Infecc Microbiol Clin 29 Suppl 5: 38-44, 2011. Franzot SP, Salkin IF and Casadevall A. Cryptococcus neoformans var. grubii: separate varietal status for Cryptococcus neoformans serotype A isolates. J Clin Microbiol 37(3): 838-840, 1999. Ghannoum MA and Rice LB. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin Microbiol Rev 12(4): 501-517, 1999. Giordani R, Regli P, Kaloustian J, Mikail C, Abou L and Portugal H. Antifungal effect of various essential oils against Candida albicans. Potentiation of

79

antifungal action of amphotericin B by essential oil from Thymus vulgaris. Phytother Res 18(12): 990-995, 2004. Grigg ME, Bonnefoy S, Hehl AB, Suzuki Y and Boothroyd JC. Success and virulence in Toxoplasma as the result of sexual recombination between two distinct ancestries. Science 294(5540): 161-165, 2001. Hammer KA, Carson CF and Riley TV. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. J Appl Microbiol 86(6): 985-990, 1999. Hasimoto e Souza LK, Costa CR, Fernandes Ode F, Abrao FY, Silva TC, Tremea CM and Silva Mdo R. Clinical and microbiological features of cryptococcal meningitis. Rev Soc Bras Med Trop 46(3): 343-347, 2013. He M, Du M, Fan M and Bian Z. In vitro activity of eugenol against Candida albicans biofilms. Mycopathologia 163(3): 137-143, 2007. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE, Huhndorf S, James T, Kirk PM, Lucking R, Thorsten Lumbsch H, Lutzoni F, Matheny PB, McLaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Koljalg U, Kurtzman CP, Larsson KH, Lichtwardt R, Longcore J, Miadlikowska J, Miller A, Moncalvo JM, Mozley-Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schussler A, Sugiyama J, Thorn RG, Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka K, Yao YJ and Zhang N. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycol Res 111(Pt 5): 509-547, 2007. Ho CL, Jie-Pinge O, Liu YC, Hung CP, Tsai MC, Liao PC, Wang EI, Chen YL and Su YC. Compositions and in vitro anticancer activities of the leaf and fruit oils of Litsea cubeba from Taiwan. Nat Prod Commun 5(4): 617-620, 2010. Hua H, Xing F, Selvaraj JN, Wang Y, Zhao Y, Zhou L, Liu X and Liu Y. Inhibitory effect of essential oils on Aspergillus ochraceus growth and ochratoxin A production. PLoS One 9(9): e108285, 2014. Huang S, Cao YY, Dai BD, Sun XR, Zhu ZY, Cao YB, Wang Y, Gao PH and Jiang YY. In vitro synergism of fluconazole and baicalein against clinical isolates of Candida albicans resistant to fluconazole. Biol Pharm Bull 31(12): 2234-2236, 2008. Huston SM and Mody CH. Cryptococcosis: an emerging respiratory mycosis. Clin Chest Med 30(2): 253-264, vi, 2009. Hwang JK, Choi EM and Lee JH. Antioxidant activity of Litsea cubeba. Fitoterapia 76(7-8): 684-686, 2005.

80

Idnurm A, Bahn YS, Nielsen K, Lin X, Fraser JA and Heitman J. Deciphering the model pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Nat Rev Microbiol 3(10): 753-764, 2005. Ikeda R, Nishikawa A, Shinoda T and Fukazawa Y. Chemical characterization of capsular polysaccharide from Cryptococcus neoformans serotype A-D. Microbiol Immunol 29(10): 981-991, 1985. Ikeda R, Shinoda T, Fukazawa Y and Kaufman L. Antigenic characterization of Cryptococcus neoformans serotypes and its application to serotyping of clinical isolates. J Clin Microbiol 16(1): 22-29, 1982. Ilic BS, Kocic BD, Ciric VM, Cvetkovic OG and Miladinovic DL. An in vitro synergistic interaction of combinations of Thymus glabrescens essential oil and its main constituents with chloramphenicol. ScientificWorldJournal 2014: 826219, 2014. Jackson A and Powderly WG. Cryptococcal infection. Handb Clin Neurol 85: 159-167, 2007. Jain N, Wickes BL, Keller SM, Fu J, Casadevall A, Jain P, Ragan MA, Banerjee U and Fries BC. Molecular epidemiology of clinical Cryptococcus neoformans strains from India. J Clin Microbiol 43(11): 5733-5742, 2005. Janbaz KH, Qayyum A, Saqib F, Imran I, Zia-Ul-Haq M and de Feo V. Bronchodilator, vasodilator and spasmolytic activities of Cymbopogon martinii. J Physiol Pharmacol 65(6): 859-866, 2014. Jenney A, Pandithage K, Fisher DA and Currie BJ. Cryptococcus infection in tropical Australia. J Clin Microbiol 42(8): 3865-3868, 2004. Johnson MD, MacDougall C, Ostrosky-Zeichner L, Perfect JR and Rex JH. Combination antifungal therapy. Antimicrob Agents Chemother 48(3): 693-715, 2004. Kalemba D and Kunicka A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Curr Med Chem 10(10): 813-829, 2003. Kambugu A, Meya DB, Rhein J, O'Brien M, Janoff EN, Ronald AR, Kamya MR, Mayanja-Kizza H, Sande MA, Bohjanen PR and Boulware DR. Outcomes of cryptococcal meningitis in Uganda before and after the availability of highly active antiretroviral therapy. Clin Infect Dis 46(11): 1694-1701, 2008. Katerere DR, Gray AI, Nash RJ and Waigh RD. Antimicrobial activity of pentacyclic triterpenes isolated from African Combretaceae. Phytochemistry 63(1): 81-88, 2003. Katiki LM, Chagas AC, Bizzo HR, Ferreira JF and Amarante AF. Anthelmintic activity of Cymbopogon martinii, Cymbopogon schoenanthus and Mentha

81

piperita essential oils evaluated in four different in vitro tests. Vet Parasitol 183(1-2): 103-108, 2011. Keele DJ, DeLallo VC, Lewis RE, Ernst EJ and Klepser ME. Evaluation of amphotericin B and flucytosine in combination against Candida albicans and Cryptococcus neoformans using time-kill methodology. Diagn Microbiol Infect Dis 41(3): 121-126, 2001. Kelly SL, Lamb DC, Taylor M, Corran AJ, Baldwin BC and Powderly WG. Resistance to amphotericin B associated with defective sterol delta 8-->7 isomerase in a Cryptococcus neoformans strain from an AIDS patient. FEMS Microbiol Lett 122(1-2): 39-42, 1994. Khan A, Ahmad A, Akhtar F, Yousuf S, Xess I, Khan LA and Manzoor N. Ocimum sanctum essential oil and its active principles exert their antifungal activity by disrupting ergosterol biosynthesis and membrane integrity. Res Microbiol 161(10): 816-823, 2010. Khan MS and Ahmad I. Antifungal activity of essential oils and their synergy with fluconazole against drug-resistant strains of Aspergillus fumigatus and Trichophyton rubrum. Appl Microbiol Biotechnol 90(3): 1083-1094, 2011. Khan MS and Ahmad I. In vitro antifungal, anti-elastase and anti-keratinase activity of essential oils of Cinnamomum-, Syzygium- and Cymbopogon-species against Aspergillus fumigatus and Trichophyton rubrum. Phytomedicine 19(1): 48-55, 2011. Khan MS, Ahmad I and Cameotra SS. Phenyl aldehyde and propanoids exert multiple sites of action towards cell membrane and cell wall targeting ergosterol in Candida albicans. AMB Express 3(1): 54, 2013. Khan MS, Malik A and Ahmad I. Anti-candidal activity of essential oils alone and in combination with amphotericin B or fluconazole against multi-drug resistant isolates of Candida albicans. Med Mycol 50(1): 33-42, 2012. Kidd PM. Bipolar disorder and cell membrane dysfunction. Progress toward integrative management. Altern Med Rev 9(2): 107-135, 2004. Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL, Huynh M, Bartlett KH, Fyfe M, Macdougall L, Boekhout T, Kwon-Chung KJ and Meyer W. A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia, Canada). Proc Natl Acad Sci U S A 101(49): 17258-17263, 2004. Klausmeyer P, Chmurny GN, McCloud TG, Tucker KD and Shoemaker RH. A novel antimicrobial indolizinium alkaloid from Aniba panurensis. J Nat Prod 67(10): 1732-1735, 2004. Kobayashi CC, Souza LK, Fernandes Ode F, Brito SC, Silva AC, Sousa ED and Silva Mdo R. Characterization of Cryptococcus neoformans isolated from urban

82

environmental sources in Goiania, Goias State, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 47(4): 203-207, 2005. Krause J and Tobin G (2013). Discovery, Development, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Krysan DJ. Toward improved anti-cryptococcal drugs: Novel molecules and repurposed drugs. Fungal Genet Biol, 2014. Kurtzman CP, Fell JW and Boekhout T. The yeasts: a taxonomic study. ACM Press: Nova York, 2011. Kwon-Chung KJ. A new species of Filobasidiella, the sexual state of Cryptococcus neoformans B and C serotypes. Mycologia 68(4): 943-946, 1976. Langfelder K, Streibel M, Jahn B, Haase G and Brakhage AA. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genet Biol 38(2): 143-158, 2003. Lass-Florl C, Perkhofer S and Mayr A. In vitro susceptibility testing in fungi: a global perspective on a variety of methods. Mycoses 53(1): 1-11, 2010. Latouche GN, Huynh M, Sorrell TC and Meyer W. PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the phospholipase B (PLB1) gene for subtyping of Cryptococcus neoformans isolates. Appl Environ Microbiol 69(4): 2080-2086, 2003. Leal AL, Faganello J, Bassanesi MC and Vainstein MH. Cryptococcus species identification by multiplex PCR. Med Mycol 46(4): 377-383, 2008. Leite MC, Bezerra AP, de Sousa JP, Guerra FQ and Lima Ede O. Evaluation of Antifungal Activity and Mechanism of Action of Citral against Candida albicans. Evid Based Complement Alternat Med 2014: 378280, 2014. Leite MC, de Brito Bezerra AP, de Sousa JP and de Oliveira Lima E. Investigating the antifungal activity and mechanism(s) of geraniol against Candida albicans strains. Med Mycol 53(3): 275-284, 2015. Levitz SM and Boekhout T. Cryptococcus: the once-sleeping giant is fully awake. FEMS Yeast Res 6(4): 461-462, 2006. Lewis RE, Diekema DJ, Messer SA, Pfaller MA and Klepser ME. Comparison of Etest, chequerboard dilution and time-kill studies for the detection of synergy or antagonism between antifungal agents tested against Candida species. J Antimicrob Chemother 49(2): 345-351, 2002. Li WR, Shi QS, Liang Q, Xie XB, Huang XM and Chen YB. Antibacterial activity and kinetics of Litsea cubeba oil on Escherichia coli. PLoS One 9(11): e110983, 2014.

83

Lima IO (2011). Atividade antifúngica e toxicidade dos monoterpenos citral e carvacrol. Doutorado, Universidade Federal da Paraíba. Lima IO, de Medeiros Nobrega F, de Oliveira WA, de Oliveira Lima E, Albuquerque Menezes E, Cunha FA and Formiga Melo Diniz Mde F. Anti-Candida albicans effectiveness of citral and investigation of mode of action. Pharm Biol 50(12): 1536-1541, 2012. Lin B, Zhang H, Zhao XX, Rahman K, Wang Y, Ma XQ, Zheng CJ, Zhang QY, Han T and Qin LP. Inhibitory effects of the root extract of Litsea cubeba (lour.) pers. on adjuvant arthritis in rats. J Ethnopharmacol 147(2): 327-334, 2013. Lin F, Hasegawa M and Kodama O. Purification and identification of antimicrobial sesquiterpene lactones from yacon (Smallanthus sonchifolius) leaves. Biosci Biotechnol Biochem 67(10): 2154-2159, 2003. Lin X. Cryptococcus neoformans: morphogenesis, infection, and evolution. Infect Genet Evol 9(4): 401-416, 2009. Lin X and Heitman J. The biology of the Cryptococcus neoformans species complex. Annu Rev Microbiol 60: 69-105, 2006. Lindenberg Ade S, Chang MR, Paniago AM, Lazera Mdos S, Moncada PM, Bonfim GF, Nogueira SA and Wanke B. Clinical and epidemiological features of 123 cases of cryptococcosis in Mato Grosso do Sul, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 50(2): 75-78, 2008. Lionakis MS, Samonis G and Kontoyiannis DP. Endocrine and metabolic manifestations of invasive fungal infections and systemic antifungal treatment. Mayo Clin Proc 83(9): 1046-1060, 2008. Liu TT and Yang TS. Antimicrobial impact of the components of essential oil of Litsea cubeba from Taiwan and antimicrobial activity of the oil in food systems. Int J Food Microbiol 156(1): 68-75, 2012. Lodhia MH, Bhatt KR and Thaker VS. Antibacterial activity of essential oils from palmarosa, evening primrose, lavender and tuberose. Indian J Pharm Sci 71(2): 134-136, 2009. Loperena-Alvarez Y, Ren P, Li X, Schoonmaker-Bopp DJ, Ruiz A, Chaturvedi V and Rios-Velazquez C. Genotypic characterization of environmental isolates of Cryptococcus gattii from Puerto Rico. Mycopathologia 170(4): 279-285, 2010. Loyse A, Dromer F, Day J, Lortholary O and Harrison TS. Flucytosine and cryptococcosis: time to urgently address the worldwide accessibility of a 50-year-old antifungal. J Antimicrob Chemother 68(11): 2435-2444, 2013. Loyse A, Thangaraj H, Easterbrook P, Ford N, Roy M, Chiller T, Govender N, Harrison TS and Bicanic T. Cryptococcal meningitis: improving access to

84

essential antifungal medicines in resource-poor countries. Lancet Infect Dis 13(7): 629-637, 2013. Lozano-Chiu M, Nelson PW, Lancaster M, Pfaller MA and Rex JH. Lot-to-lot variability of antibiotic medium 3 used for testing susceptibility of Candida isolates to amphotericin B. J Clin Microbiol 35(1): 270-272, 1997. Lozano-Chiu M, Paetznick VL, Ghannoum MA and Rex JH. Detection of resistance to amphotericin B among Cryptococcus neoformans clinical isolates: performances of three different media assessed by using E-test and National Committee for Clinical Laboratory Standards M27-A methodologies. J Clin Microbiol 36(10): 2817-2822, 1998. Ma H and May RC. Virulence in Cryptococcus species. Adv Appl Microbiol 67: 131-190, 2009. Mallavarapu GR, Rajeswara Rao BR, Kaul PN, Ramesh B and Bhattacharya AK. Volatile constituents of the essential oils of the seeds and the herb of palmarosa (Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats. var. motia Burk.). Flavour and fragrance journal 13: 3, 1998. Manfredi R, Fulgaro C, Sabbatani S, Legnani G and Fasulo G. Emergence of amphotericin B-resistant Cryptococcus laurentii meningoencephalitis shortly after treatment for Cryptococcus neoformans meningitis in a patient with AIDS. AIDS Patient Care STDS 20(4): 227-232, 2006. Marukutira T, Huprikar S, Azie N, Quan SP, Meier-Kriesche HU and Horn DL. Clinical characteristics and outcomes in 303 HIV-infected patients with invasive fungal infections: data from the Prospective Antifungal Therapy Alliance registry, a multicenter, observational study. HIV AIDS (Auckl) 6: 39-47, 2014. Matos CS, de Souza Andrade A, Oliveira NS and Barros TF. Microbiological characteristics of clinical isolates of Cryptococcus spp. in Bahia, Brazil: molecular types and antifungal susceptibilities. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31(7): 1647-1652, 2012. Matsumoto MT, Fusco-Almeida AM, Baeza LC, Melhem Mde S and Medes-Giannini MJ. Genotyping, serotyping and determination of mating-type of Cryptococcus neoformans clinical isolates from Sao Paulo State, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 49(1): 41-47, 2007. Meng J, Chen X, Yang W, Song J, Zhang Y, Li Z, Yang X and Yang Z. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of essential oils from five parts of Chaihu (Radix Bupleuri Chinensis). J Tradit Chin Med 34(6): 741-748, 2014. Mesa-Arango AC, Montiel-Ramos J, Zapata B, Duran C, Betancur-Galvis L and Stashenko E. Citral and carvone chemotypes from the essential oils of Colombian Lippia alba (Mill.) N.E. Brown: composition, cytotoxicity and antifungal activity. Mem Inst Oswaldo Cruz 104(6): 878-884, 2009.

85

Meyer W, Castaneda A, Jackson S, Huynh M, Castaneda E and IberoAmerican Cryptococcal Study G. Molecular typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerg Infect Dis 9(2): 189-195, 2003. Mirza SA, Phelan M, Rimland D, Graviss E, Hamill R, Brandt ME, Gardner T, Sattah M, de Leon GP, Baughman W and Hajjeh RA. The changing epidemiology of cryptococcosis: an update from population-based active surveillance in 2 large metropolitan areas, 1992-2000. Clin Infect Dis 36(6): 789-794, 2003. Mitchell TG and Perfect JR. Cryptococcosis in the era of AIDS--100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin Microbiol Rev 8(4): 515-548, 1995. Moleyar V and Narasimham P. Antifungal activity of some essential oil components. Food Microbiology 3: 5, 1986. Moreira AC, de Oliveira Lima E, Wanderley PA, Carmo ES and de Souza EL. Chemical composition and antifungal activity of Hyptis Suaveolens (L.) Poit leaves essential oil against Aspergillus species. Braz J Microbiol 41(1): 28-33, 2010. Moretti ML, Resende MR, Lazera MS, Colombo AL and Shikanai-Yasuda MA. [Guidelines in cryptococcosis--2008]. Rev Soc Bras Med Trop 41(5): 524-544, 2008. Mukherjee PK, Sheehan DJ, Hitchcock CA and Ghannoum MA. Combination treatment of invasive fungal infections. Clin Microbiol Rev 18(1): 163-194, 2005. Murakawa GJ, Kerschmann R and Berger T. Cutaneous Cryptococcus infection and AIDS. Report of 12 cases and review of the literature. Arch Dermatol 132(5): 545-548, 1996. Murray P, Rosenthal K and Pfaller M. Microbiologia médica. Elsevier: Rio de Janeiro, 2009. Ndimbie OK, Dekker A, Martinez AJ and Dixon B. Prostatic sequestration of Cryptococcus neoformans in immunocompromised persons treated for cryptococcal meningoencephalitis. Histol Histopathol 9(4): 643-648, 1994. Negri M, Salci TP, Shinobu-Mesquita CS, Capoci IR, Svidzinski TI and Kioshima ES. Early state research on antifungal natural products. Molecules 19(3): 2925-2956, 2014. Negroni R. Cryptococcosis. Clin Dermatol 30(6): 599-609, 2012. Neuville S, Dromer F, Morin O, Dupont B, Ronin O, Lortholary O and French Cryptococcosis Study G. Primary cutaneous cryptococcosis: a distinct clinical entity. Clin Infect Dis 36(3): 337-347, 2003.

86

Nguyen MH, Clancy CJ, Yu VL, Yu YC, Morris AJ, Snydman DR, Sutton DA and Rinaldi MG. Do in vitro susceptibility data predict the microbiologic response to amphotericin B? Results of a prospective study of patients with Candida fungemia. J Infect Dis 177(2): 425-430, 1998. Nobre V, Braga E, Rayes A, Serufo JC, Godoy P, Nunes N, Antunes CM and Lambertucci JR. Opportunistic infections in patients with AIDS admitted to an university hospital of the Southeast of Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 45(2): 69-74, 2003. Nucci M, Queiroz-Telles F, Tobon AM, Restrepo A and Colombo AL. Epidemiology of opportunistic fungal infections in Latin America. Clin Infect Dis 51(5): 561-570, 2010. Odom A, Muir S, Lim E, Toffaletti DL, Perfect J and Heitman J. Calcineurin is required for virulence of Cryptococcus neoformans. EMBO J 16(10): 2576-2589, 1997. Oladele RO and Denning DW. Burden of serious fungal infection in Nigeria. West Afr J Med 33(2): 107-114, 2014. Oliveira CMA, Silva MRR, Kato L, Silva CC, Ferreira HD and Souza LK. Chemical composition and antifungal activity of the essential oil of Hyptis ovalifolia Benth. (Lamiaceae). Journal of the Brazilian Chemical Society 15(5): 3, 2004. Orni-Wasserlauf R, Izkhakov E, Siegman-Igra Y, Bash E, Polacheck I and Giladi M. Fluconazole-resistant Cryptococcus neoformans isolated from an immunocompetent patient without prior exposure to fluconazole. Clin Infect Dis 29(6): 1592-1593, 1999. Palella FJ, Jr., Delaney KM, Moorman AC, Loveless MO, Fuhrer J, Satten GA, Aschman DJ and Holmberg SD. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators. N Engl J Med 338(13): 853-860, 1998. Palmeira-de-Oliveira A, Salgueiro L, Palmeira-de-Oliveira R, Martinez-de-Oliveira J, Pina-Vaz C, Queiroz JA and Rodrigues AG. Anti-Candida activity of essential oils. Mini Rev Med Chem 9(11): 1292-1305, 2009. Pappalardo MC, Szeszs MW, Martins MA, Baceti LB, Bonfietti LX, Purisco SU, Baez AA and Melhem MS. Susceptibility of clinical isolates of Cryptococcus neoformans to amphotericin B using time-kill methodology. Diagn Microbiol Infect Dis 64(2): 146-151, 2009. Park BJ, Wannemuehler KA, Marston BJ, Govender N, Pappas PG and Chiller TM. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS 23(4): 525-530, 2009.

87

Parks LW and Casey WM. Physiological implications of sterol biosynthesis in yeast. Annu Rev Microbiol 49: 95-116, 1995. Pedroso RS and Candido. Diagnóstico Laboratorial da Criptococose. NewsLab, 2006. Percin D, Akyol S and Kalin G. In vitro synergism of combinations of colistin with selected antibiotics against colistin-resistant Acinetobacter baumannii. GMS Hyg Infect Control 9(2): Doc14, 2014. Perfect JR, Dismukes WE, Dromer F, Goldman DL, Graybill JR, Hamill RJ, Harrison TS, Larsen RA, Lortholary O, Nguyen MH, Pappas PG, Powderly WG, Singh N, Sobel JD and Sorrell TC. Clinical practice guidelines for the management of cryptococcal disease: 2010 update by the infectious diseases society of america. Clin Infect Dis 50(3): 291-322, 2010. Perkhofer S, Mrazek C, Hartl L and Lass-Florl C. In Vitro Susceptibility Testing in Fungi: What is its Role in Clinical Practice? Curr Infect Dis Rep 12(6): 401-408, 2010. Perkins A, Gomez-Lopez A, Mellado E, Rodriguez-Tudela JL and Cuenca-Estrella M. Rates of antifungal resistance among Spanish clinical isolates of Cryptococcus neoformans var. neoformans. J Antimicrob Chemother 56(6): 1144-1147, 2005. Pfaller MA. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med 125(1 Suppl): S3-13, 2012. Pfaller MA, Diekema DJ, Gibbs DL, Newell VA, Bijie H, Dzierzanowska D, Klimko NN, Letscher-Bru V, Lisalova M, Muehlethaler K, Rennison C, Zaidi M and Global Antifungal Surveillance G. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study, 1997 to 2007: 10.5-year analysis of susceptibilities of noncandidal yeast species to fluconazole and voriconazole determined by CLSI standardized disk diffusion testing. J Clin Microbiol 47(1): 117-123, 2009. Pfaller MA, Sheehan DJ and Rex JH. Determination of fungicidal activities against yeasts and molds: lessons learned from bactericidal testing and the need for standardization. Clin Microbiol Rev 17(2): 268-280, 2004. Phillipson JD. Natural products as drugs. Trans R Soc Trop Med Hyg 88 Suppl 1: S17-19, 1994. Pichersky E, Noel JP and Dudareva N. Biosynthesis of plant volatiles: nature's diversity and ingenuity. Science 311(5762): 808-811, 2006. Pina-Vaz C, Sansonetty F, Rodrigues AG, Costa-Oliveira S, Tavares C and Martinez-de-Oliveira J. Cytometric approach for a rapid evaluation of susceptibility of Candida strains to antifungals. Clin Microbiol Infect 7(11): 609-618, 2001.

88

Pinto E, Pina-Vaz C, Salgueiro L, Goncalves MJ, Costa-de-Oliveira S, Cavaleiro C, Palmeira A, Rodrigues A and Martinez-de-Oliveira J. Antifungal activity of the essential oil of Thymus pulegioides on Candida, Aspergillus and dermatophyte species. J Med Microbiol 55(Pt 10): 1367-1373, 2006. Pinto E, Vale-Silva L, Cavaleiro C and Salgueiro L. Antifungal activity of the clove essential oil from Syzygium aromaticum on Candida, Aspergillus and dermatophyte species. J Med Microbiol 58(Pt 11): 1454-1462, 2009. Pippi B, Lana AJ, Moraes RC, Guez CM, Machado M, de Oliveira LF, Lino von Poser G and Fuentefria AM. In vitro evaluation of the acquisition of resistance, antifungal activity and synergism of Brazilian red propolis with antifungal drugs on Candida spp. J Appl Microbiol, 2015. Powderly WG, Kobayashi GS, Herzig GP and Medoff G. Amphotericin B-resistant yeast infection in severely immunocompromised patients. Am J Med 84(5): 826-832, 1988. Prakasa E, Ganesha R and Puttana K. Studies on in situ soil moisture conservation and additions of phosphorus and potassium in rainfed palmarosa (Cymbopogon martinii var. motia) in a semi-arid tropical region of India. Europ. J. Agronomy 14: 5, 2001. Prasad CS, Shukla R, Kumar A and Dubey NK. In vitro and in vivo antifungal activity of essential oils of Cymbopogon martini and Chenopodium ambrosioides and their synergism against dermatophytes. Mycoses 53(2): 123-129, 2010. Prashar A, Hili P, Veness RG and Evans CS. Antimicrobial action of palmarosa oil (Cymbopogon martinii) on Saccharomyces cerevisiae. Phytochemistry 63(5): 569-575, 2003. Pushpanathan M, Gunasekaran P and Rajendhran J. Mechanisms of the antifungal action of marine metagenome-derived peptide, MMGP1, against Candida albicans. PLoS One 8(7): e69316, 2013. Rajput SB and Karuppayil SM. Small molecules inhibit growth, viability and ergosterol biosynthesis in Candida albicans. Springerplus 2(1): 26, 2013. Ramirez-Crescencio MA, Velasquez-Perez L, Ramirez-Crescencio MA and Velasquez-Perez L. Epidemiology and trend of neurological diseases associated to HIV/AIDS. Experience of Mexican patients 1995-2009. Clin Neurol Neurosurg 115(8): 1322-1325, 2013. Ramos-e-Silva M, Lima CM, Schechtman RC, Trope BM and Carneiro S. Systemic mycoses in immunodepressed patients (AIDS). Clin Dermatol 30(6): 616-627, 2012. Rapp RP, Gubbins PO and Evans ME. Amphotericin B lipid complex. Ann Pharmacother 31(10): 1174-1186, 1997.

89

Ribeiro MA and Ngamskulrungroj P. Molecular characterization of environmental Cryptococcus neoformans isolated in Vitoria, ES, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 50(6): 315-320, 2008. Rishton GM. Natural products as a robust source of new drugs and drug leads: past successes and present day issues. Am J Cardiol 101(10A): 43D-49D, 2008. Rodriguez-Tudela JL, Alastruey-Izquierdo A, Gago S, Cuenca-Estrella M, Leon C, Miro JM, Nunez Boluda A, Ruiz Camps I, Sole A, Denning DW and University of Manchester in association with the LpaEahwL-wo. Burden of serious fungal infections in Spain. Clin Microbiol Infect 21(2): 183-189, 2015. Rodriguez RJ, Low C, Bottema CD and Parks LW. Multiple functions for sterols in Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 837(3): 336-343, 1985. Roh J and Shin S. Antifungal and Antioxidant Activities of the Essential Oil from Angelica koreana Nakai. Evid Based Complement Alternat Med 2014: 398503, 2014. Romeo O, Scordino F, Chillemi V and Criseo G. Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii species complex in southern Italy: an overview on the environmental diffusion of serotypes, genotypes and mating-types. Mycopathologia 174(4): 283-291, 2012. Rosa Y, Blank F, Costa L, Arrigoni-Blank MF, Passos L and Machado S. Influência do horário de colheita no óleo essencial de diferentes partes da planta de dois genótipos de palmarosa (Cymbopogon martinii). Scientia Plena 6(10): 6, 2010. Rosato A, Vitali C, Gallo D, Balenzano L and Mallamaci R. The inhibition of Candida species by selected essential oils and their synergism with amphotericin B. Phytomedicine 15(8): 635-638, 2008. Roser Vila BF, Freixa B and Canigueral S (2013). 2. Antifungal compounds from plants. Recent Advances in Pharmaceutical Sciences III. D. Muñoz-Torrero, A. Cortés and E. L. Mariño, Transworld Research Network: 23-43. Rouhi AM. Rediscovering natural products. Chemical & Engineering News 81(41): 77-+, 2003. Sabiiti W and May RC. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future Microbiol 7(11): 1297-1313, 2012. Sadraei H, Asghari GR, Hajhashemi V, Kolagar A and Ebrahimi M. Spasmolytic activity of essential oil and various extracts of Ferula gummosa Boiss. on ileum contractions. Phytomedicine 8(5): 370-376, 2001. Saliba F and Dupont B. Renal impairment and amphotericin B formulations in patients with invasive fungal infections. Med Mycol 46(2): 97-112, 2008.

90

Sanati H, Messer SA, Pfaller M, Witt M, Larsen R, Espinel-Ingroff A and Ghannoum M. Multicenter evaluation of broth microdilution method for susceptibility testing of Cryptococcus neoformans against fluconazole. J Clin Microbiol 34(5): 1280-1282, 1996. Sar B, Monchy D, Vann M, Keo C, Sarthou JL and Buisson Y. Increasing in vitro resistance to fluconazole in Cryptococcus neoformans Cambodian isolates: April 2000 to March 2002. J Antimicrob Chemother 54(2): 563-565, 2004. Satishchandra P, Mathew T, Gadre G, Nagarathna S, Chandramukhi A, Mahadevan A and Shankar SK. Cryptococcal meningitis: clinical, diagnostic and therapeutic overviews. Neurol India 55(3): 226-232, 2007. Scorzoni L, Benaducci T, Almeida AMF, Silva DHS, Bolzani VS and Gianinni MJSM. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazillian Journal of Microbiology 38: 6, 2007. Selik RM, Karon JM and Ward JW. Effect of the human immunodeficiency virus epidemic on mortality from opportunistic infections in the United States in 1993. J Infect Dis 176(3): 632-636, 1997. Serena C, Fernandez-Torres B, Pastor FJ, Trilles L, Lazera Mdos S, Nolard N and Guarro J. In vitro interactions of micafungin with other antifungal drugs against clinical isolates of four species of Cryptococcus. Antimicrob Agents Chemother 49(7): 2994-2996, 2005. Shao PL, Huang LM and Hsueh PR. Recent advances and challenges in the treatment of invasive fungal infections. Int J Antimicrob Agents 30(6): 487-495, 2007. Shin S and Lim S. Antifungal effects of herbal essential oils alone and in combination with ketoconazole against Trichophyton spp. J Appl Microbiol 97(6): 1289-1296, 2004. Shreaz S, Bhatia R, Khan N, Muralidhar S, Basir SF, Manzoor N and Khan LA. Spice oil cinnamaldehyde exhibits potent anticandidal activity against fluconazole resistant clinical isolates. Fitoterapia 82(7): 1012-1020, 2011. Si L, Chen Y, Han X, Zhan Z, Tian S, Cui Q and Wang Y. Chemical composition of essential oils of Litsea cubeba harvested from its distribution areas in China. Molecules 17(6): 7057-7066, 2012. Silva F, Ferreira S, Duarte A, Mendonca DI and Domingues FC. Antifungal activity of Coriandrum sativum essential oil, its mode of action against Candida species and potential synergism with amphotericin B. Phytomedicine 19(1): 42-47, 2011.

91

Silva NCC and Fernandes A. Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases 16(3): 402-413, 2010. Sinha S, Biswas D and Mukherjee A. Antigenotoxic and antioxidant activities of palmarosa and citronella essential oils. J Ethnopharmacol 137(3): 1521-1527, 2011. Situ H and Bobek LA. In vitro assessment of antifungal therapeutic potential of salivary histatin-5, two variants of histatin-5, and salivary mucin (MUC7) domain 1. Antimicrob Agents Chemother 44(6): 1485-1493, 2000. Smith JA and Kauffman CA. Pulmonary fungal infections. Respirology 17(6): 913-926, 2012. SnowLotus (2014). Palmarosa Essential Oil 10 ml. http://www.snowlotus.org/palmarosa-essential-oil.aspx. Califórnia. Soares VY, Lucio Filho CE, Carvalho LI, Silva AM and Eulalio KD. Clinical and epidemiological analysis of patients with HIV/AIDS admitted to a reference hospital in the northeast region of Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 50(6): 327-332, 2008. Sohn HY, Son KH, Kwon CS, Kwon GS and Kang SS. Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider, Broussnetia papyrifera (L.) Vent, Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis Nakai. Phytomedicine 11(7-8): 666-672, 2004. Souza CJ, Medina DM and Filho HFL. Estudos preliminares para o melhoramento da palmarosa. Instituto Agronômico de Campinas 34: 4, 1975. Souza LK, de Oliveira CM, Ferri PH, de Oliveira Junior JG, de Souza Junior AH, Fernandes Ode F and Silva Mdo R. Antimicrobial activity of Hyptis ovalifolia towards dermatophytes. Mem Inst Oswaldo Cruz 98(7): 963-965, 2003. Stephen C, Lester S, Black W, Fyfe M and Raverty S. Multispecies outbreak of cryptococcosis on southern Vancouver Island, British Columbia. Can Vet J 43(10): 792-794, 2002. Stiefel P, Pamies E, Miranda ML, Martin-Sanz MV, Fernandez-Moyano A and Villar J. Cryptococcal peritonitis: report of a case and review of the literature. Hepatogastroenterology 46(27): 1618-1622, 1999. Surburg H and Panten J. Common fragrance and flavor materials: Preparation, properties and uses. Wiley: Alemanha, 2006. Tabassum N and Vidyasagar GM. Antifungal investigations on plant essential oil: a review. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 5(2): 9, 2013.

92

Thompson LM. Antifungal Drugs. Revista Chilena de Infectología 19: 4, 2002. Tian J, Ban X, Zeng H, He J, Chen Y and Wang Y. The mechanism of antifungal action of essential oil from dill (Anethum graveolens L.) on Aspergillus flavus. PLoS One 7(1): e30147, 2012. Tongnuanchan P and Benjakul S. Essential oils: extraction, bioactivities, and their uses for food preservation. J Food Sci 79(7): R1231-1249, 2014. Tseng HK, Liu CP, Ho MW, Lu PL, Lo HJ, Lin YH, Cho WL, Chen YC and Taiwan Infectious Diseases Study Network for C. Microbiological, epidemiological, and clinical characteristics and outcomes of patients with cryptococcosis in Taiwan, 1997-2010. PLoS One 8(4): e61921, 2013. Tsujisaki RA, Paniago AM, Lima Junior MS, Alencar Dde S, Spositto FL, Nunes Mde O, Trilles L and Chang MR. First molecular typing of cryptococcemia-causing cryptococcus in central-west Brazil. Mycopathologia 176(3-4): 267-272, 2013. Tucker SC and Casadevall A. Replication of Cryptococcus neoformans in macrophages is accompanied by phagosomal permeabilization and accumulation of vesicles containing polysaccharide in the cytoplasm. Proc Natl Acad Sci U S A 99(5): 3165-3170, 2002. Umeyama T, Ohno H, Minamoto F, Takagi T, Tanamachi C, Tanabe K, Kaneko Y, Yamagoe S, Kishi K, Fujii T, Takemura H, Watanabe H and Miyazaki Y. Determination of epidemiology of clinically isolated Cryptococcus neoformans strains in Japan by multilocus sequence typing. Jpn J Infect Dis 66(1): 51-55, 2013. Vale-Silva LA, Goncalves MJ, Cavaleiro C, Salgueiro L and Pinto E. Antifungal activity of the essential oil of Thymus x viciosoi against Candida, Cryptococcus, Aspergillus and dermatophyte species. Planta Med 76(9): 882-888, 2010. Vazquez JA. Combination antifungal therapy: the new frontier. Future Microbiol 2(2): 115-139, 2007. Vermes A, Guchelaar HJ and Dankert J. Flucytosine: a review of its pharmacology, clinical indications, pharmacokinetics, toxicity and drug interactions. J Antimicrob Chemother 46(2): 171-179, 2000. Vidal JE, Penalva de Oliveira AC, Dauar RF and Boulware DR. Strategies to reduce mortality and morbidity due to AIDS-related cryptococcal meningitis in Latin America. Braz J Infect Dis 17(3): 353-362, 2013. Viollon C and Chaumont JP. Antifungal properties of essential oils and their main components upon Cryptococcus neoformans. Mycopathologia 128(3): 151-153, 1994.

93

Viviani MA, Cogliati M, Esposto MC, Lemmer K, Tintelnot K, Colom Valiente MF, Swinne D, Velegraki A, Velho R and European Confederation of Medical Mycology Cryptococcosis Working G. Molecular analysis of 311 Cryptococcus neoformans isolates from a 30-month ECMM survey of cryptococcosis in Europe. FEMS Yeast Res 6(4): 614-619, 2006. Wagner H and Ulrich-Merzenich G. Synergy research: approaching a new generation of phytopharmaceuticals. Phytomedicine 16(2-3): 97-110, 2009. Wang H and Liu Y. Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from different parts of Litsea cubeba. Chem Biodivers 7(1): 229-235, 2010. Wang Y, Jiang Z-T and Li R. Complexation and molecular microcapsules of Litsea cubeba essential oil with β-cyclodextrin and its derivatives. Eur Food Res Technol 228: 8, 2009. Watson W. Himalayan Districts of the North-Western Provinces of India. Gaz. NW India 10: 392, 1882. Yang Y, Jiang J, Qimei L, Yan X, Zhao J, Yuan H, Qin Z and Wang M. The fungicidal terpenoids and essential oil from Litsea cubeba in Tibet. Molecules 15(10): 7075-7082, 2010. Zalachoras I, Kagiava A, Vokou D and Theophilidis G. Assessing the local anesthetic effect of five essential oil constituents. Planta Med 76(15): 1647-1653, 2010. Zhang W, Hu JF, Lv WW, Zhao QC and Shi GB. Antibacterial, antifungal and cytotoxic isoquinoline alkaloids from Litsea cubeba. Molecules 17(11): 12950-12960, 2012. ZhongWeiHorticulturalProducts (2014). Litsea cubeba seed. http://www.cnseed.org/litsea-cubeba-seed.html. República Popular da China. Zhu LP, Wu JQ, Xu B, Ou XT, Zhang QQ and Weng XH. Cryptococcal meningitis in non-HIV-infected patients in a Chinese tertiary care hospital, 1997-2007. Med Mycol 48(4): 570-579, 2010. Zore GB, Thakre AD, Jadhav S and Karuppayil SM. Terpenoids inhibit Candida albicans growth by affecting membrane integrity and arrest of cell cycle. Phytomedicine 18(13): 1181-1190, 2011. Zore GB, Thakre AD, Rathod V and Karuppayil SM. Evaluation of anti-Candida potential of geranium oil constituents against clinical isolates of Candida albicans differentially sensitive to fluconazole: inhibition of growth, dimorphism and sensitization. Mycoses 54(4): e99-109, 2011.

94

ANEXOS

Anexo 1. Parecer do comitê de ética em pesquisa.

95

Anexo 2. Laudo técnico – Óleo essencial de C. martini

96

Anexo 3. Laudo técnico – Óleo essencial de L. cubeba

97

Anexo 4. Valores de CIM e CFM de AMB e fluconazol e valores de ICIF e interpretação do teste de associação.

Suscetibilidade antifúngicaa Teste de associaçãob AMB Fluco L. cubeba Citral C. martini Geraniol

Isolados CIM CFM CIM CFM AMB Fluco AMB Fluco AMB Fluco AMB Fluco

C. neoformans L03 0,5 1 2 8 0,563 (In) 8,25 (A) 0,56 (In) 3 (In) 0,136 (S) 4,02 (A) 0,087 (S) 2,125 (In) L04 0,5 0,5 2 4 1,063 (In) 1,06 (In) 0,75 (In) 0,37 (S) 2,016 (In) 2,02 (In) 0,281 (S) 2,031 (In) L05 0,25 0,5 2 8 1,063 (In) 8,25 (A) 0,49 (In) 3 (In) 1,031 (In) 2,03 (In) 1 (In) 2 (In) L14 0,5 1 1 8 0,563 (In) 2,06 (In) 0,75 (In) 3 (In) 0,136 (S) 4,02 (A) 0,375 (S) 5 (A) L15 0,5 0,5 2 4 0,563 (In) 8,06 (A) 2 (S) 3 (In) 0,281 (S) 2,03 (In) 0,151 (S) 2,031 (In) L18 0,5 0,5 4 16 0,625 (In) 4,13 (A) 0,5 (S) 3 (In) 0,136 (S) 1,02 (In) 0,5 (S) 2 (In) L21 0,5 1 4 16 1,031 (In) 4,06 (A) 0,75 (In) 3 (In) 1,016 (In) 2,03 (In) 0,562 (S) 4,031 (A)

L23 0,125 0,125 4 8 0,625 (In) 0,63 (In) 0,5 (S) 3 (In) 2,5 (In) 1,03 (In) 1,25 (In) 2 (In)

L24 0,25 0,5 1 4 1,125 (In) 16,13 (A) 1 (In) 3 (In) 1,031 (In) 8,03 (A) 0,516 (S) 0,625 (In)

L29 0,125 0,125 2 8 2,063 (In) 8,06 (A) 0,98 (In) 3 (In) 4,016 (A) 2,0 (In) 2,015 (In) 1,062 (In)

L30 0,125 0,125 2 4 4,063 (A) 1,06 (In) 1,48 (In) 3 (In) 4,016 (A) 8,02 (A) 2 (In) 1,062 (In)

ATCC 28957 0,5 0,5 0,5 1 1,25 (In) 12 (A) 1 (In) 3 (In) 0,183 (S) 8,06 (A) 0,531 (S) 2 (In) C. gattii

L01 0,25 0,5 2 8 1,125 (In) 8,25 (A) 0,75 (In) 3 (In) 0,365 (S) 2,13 (In) 0,531 (S) 2,031 (In) L09 0,25 0,5 2 8 1,063 (In) 4,06 (A) 0,49 (S) 3 (In) 0,256 (S) 2,02 (In) 0,531 (S) 2 (In) L20 0,5 0,5 4 16 1,063 (In) 8,13 (A) 0,75 (In) 3 (In) 1,016 (In) 2 (In) 0,375 (S) 1,25 (In)

L48 0,125 0,5 2 8 1,063 (In) 8,06 (A) 2 (In) 3 (In) 0,256 (S) 2,03 (In) 1,5 (In) 1,06 (In)

ATCC 24065 0,5 1 2 8 0,75 (In) 8,25 (A) 0,5 (S) 2,06 (In) 0,136 (S) 4,02 (A) 0,281 (S) 1,125 (In) a Resultados de CIM e CFM em µg/mL. b Expresso em [ICIF (Interpretação do teste de associação (in) Indiferente, (S) sinérgico e (A) Antagônico)]