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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Análise do polimorfismo Arg72Pro do gene TP53 e da freqüência de alterações nucleares em pacientes com câncer de cabeça e pescoço submetidos à radioterapia
ORIENTADA: Latife Pereira ORIENTADOR: Prof. Dr. Wilham Jorge CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Maria Cristina Lima de Castro
BELO HORIZONTE Dezembro - 2007
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Sumário Sumário ................................................................................................................................. 2 Lista de Figuras ..................................................................................................................... 3 Lista de Tabelas .................................................................................................................... 4 Lista de abreviaturas.............................................................................................................. 5 Resumo ................................................................................................................................. 6 Abstract ................................................................................................................................. 7 1 Introdução...................................................................................................................... 8
1.1 TP53........................................................................................................................ 9 1.2 Alterações Nucleares............................................................................................. 12
2 Objetivos...................................................................................................................... 19 2.1 Objetivos gerais ..................................................................................................... 19 2.2 Objetivos específicos............................................................................................. 19
3 Material e métodos....................................................................................................... 20 3.1 Caracterização da amostra.................................................................................... 20 3.2 Coleta do material.................................................................................................. 20 3.3 Processamento do material, análises citogenética e molecular ............................. 20 3.4 Análise estatística.................................................................................................. 22 3.5 Aspectos Éticos ..................................................................................................... 23
4 Resultados e discussão ............................................................................................... 24 5 Conclusões .................................................................................................................. 30 6 Referências bibliográficas ............................................................................................ 31 7 ANEXOS...................................................................................................................... 38
ANEXO 1. Questionário ................................................................................................... 38 ANEXO 2. Fotografias de lesões clínicas......................................................................... 40 ANEXO 3. Fotografias de alterações nucleares ............................................................... 41 ANEXO 4. Protocolo para extração de DNA de swab bucal ............................................. 43 ANEXO 5. Termo de consentimento livre e esclarecido................................................... 44 ANEXO 6. Declaração de concordância........................................................................... 45 ANEXO 7. Tabelas de caracterização da amostra ........................................................... 46
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Lista de Figuras Figura 1. Esquema dos domínios da proteína p53............................................................... 10 Figura 2. Célula esfoliada contendo dois micronúcleos........................................................ 12 Figura 3. Esquema de formação de micronúcleos .............................................................. 13 Figura 4. Cariorréxis (A), cariólise (B), picnose (C) e cromatina condensada (D)................. 16 Figura 5. Esquema dos fragmentos dos alelos após a digestão .......................................... 22 Figura 6. Distribuição dos indivíduos quanto ao sexo (A) e idade (B)................................... 24 Figura 7. Distribuição dos indivíduos quanto aos hábitos: ingerir bebida alcoólica (A) ......... 24 Figura 8. Tratamento concomitante com quimioterapia (A) e tratamento cirúrgico prévio (B)
............................................................................................................................................ 25 Figura 9. Grau de parentesco com indivíduos afetados com câncer .................................... 25 Figura 10. Grau histológico do tumor (A), estádio da doença (B) e presença de linfonodos
com metástase (C)............................................................................................................... 26 Figura 11. Gel de agarose 1% mostrando os genótipos Pro/Pro (1), Arg/Arg (2) e Arg/Pro (3)
............................................................................................................................................ 26 Figura 12. Lesão de lábio inferior......................................................................................... 40 Figura 13. Lesão tumoral de palato...................................................................................... 40 Figura 14. Células esfoliadas bucais com um micronúcleo (magnitude 1000x).................... 41 Figura 15. Células esfoliadas bucais binucleadas com dois micronúcleos (magnitude 1000x)
............................................................................................................................................ 41 Figura 16. Célula esfoliada bucal com ponte nucleoplasmática (magnitude 1000x)............. 41 Figura 17. Célula esfoliada bucal heptanucleada (magnitude 1000x) .................................. 42 Figura 18. Célula esfoliada bucal com núcleo grande (magnitude 400x).............................. 42 Figura 19. Célula esfoliada bucal normal servindo como controle de coloração para as
células em cariólise (magnitude 400x) ................................................................................. 42
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Lista de Tabelas Tabela 1. Características dos micronúcleos (TOLBERT e cols.,1992) ................................. 14 Tabela 2. Características de células apoptóticas (FENECH e cols., 2003) .......................... 16 Tabela 3. Características de células necróticas (FENECH e cols., 2003) ............................ 16 Tabela 4. Critérios para inclusão de células na contagem (TOLBERT e cols., 1992)........... 21 Tabela 5. Critérios para inclusão de micronúcleo na contagem (TOLBERT e cols., 1992)... 21 Tabela 6. Freqüências alélicas e genotípicas dos indivíduos ............................................... 27 Tabela 7. Análise das variáveis cariólise e cariorréxis ......................................................... 28 Tabela 8. Caracterização da amostra em relação à idade e sexo........................................ 46 Tabela 9. Caracterização da amostra em relação ao hábito de fumar.................................. 46 Tabela 10. Caracterização da amostra em relação ao hábito de ingerir bebida alcoólica..... 46 Tabela 11. Pacientes em tratamento quimioterápico, linfonodos invadidos e tratamentos
realizados antes da radioterapia (remoção cirúrgica da lesão) ............................................ 46 Tabela 12. Estadiamento da doença e grau histológico do tumor ........................................ 46 Tabela 13. Casos de câncer em familiares de pacientes ..................................................... 46
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Lista de abreviaturas
Arg Arginina
BAX BCL2-associated X protein
CEC carcinomas espinocelulares
DNA ácido desoxirribonucleico
GL grau de liberdade
He heterozigosidade esperada
Ho heterozigosidade observada
HPV human papillomavirus
hsp70 heat-shock protein 70
INCA Instituto Nacional do Câncer
LOH loss of heterozygosity
Mdm2 murine double minute 2
MN micronúcleo
pb par de bases
PCR reação em cadeia da polimerase
Pro Prolina
rpm rotações por minuto
SDS dodecil sulfato de sódio
SE sodium EDTA
TAFII32 TFIID-associated factors (subunidade 32)
TAFII70 TFIID-associated factors (subunidade 70)
TE tris EDTA
UV Ultravioleta
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Resumo
A etiologia do câncer é multifatorial e tem grande influência genética. O gene TP53 é
um gene supressor tumoral importante no controle da divisão celular e possui um
polimorfismo no códon 72 (Arg72Pro) que influencia no efeito apoptótico e no reparo de
lesões no DNA. Quando o DNA é danificado a célula promove o reparo da lesão ou, quando
o reparo não é possível, a célula é encaminhada para a apoptose. Se uma célula entrar em
divisão celular com alguma lesão no DNA podem ocorrer alterações nucleares chamadas
micronúcleos. O objetivo do presente trabalho é avaliar a atividade das variantes da proteína
p53 (p53Arg e p53Pro) na promoção da morte celular e no reparo a danos no DNA através
da análise da freqüência de micronúcleos e de células apoptóticas e necróticas em
pacientes com câncer de cabeça e pescoço sob tratamento radioterápico. A diferença nas
freqüências de células em cariorréxis entre os genótipos (Arg/Arg, Arg/Pro e Pro/Pro) foi
significativa, sendo a maior freqüência encontrada no genótipo Pro/Pro, sugerindo que a
variante p53Pro tenha um efeito apoptótico maior. A freqüência de células micronucleadas
aumentou significativamente após a radioterapia, entretanto não foi encontrada diferença
significativa entre as coletas realizadas nas regiões sadia do paciente e no indivíduo
controle e entre os genótipos. Portanto, de acordo com nossos resultados, o polimorfismo
Arg72Pro influencia na capacidade apoptótica celular e não interfere na capacidade de
reparo no DNA ou de promover necrose celular.
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Abstract
The etiology of cancer is multifactorial and is greatly influenced by genetic factors.
TP53 is a tumor suppressor gene important in the control of cell division and has a
polymorphism at codon 72 (Arg72Pro) that influences the apoptotic effect and repair of DNA
lesions. When DNA is damaged, the lesion is repaired by the cell machinery; when that is not
possible the cell takes the apoptotic pathway. If a cell enters cell division bearing a DNA
lesion nuclear alterations called micronuclei may be formed. The objective of the present
work was to evaluate the activity of the variants of the p53 protein (p53Arg and p53Pro) in
the promotion of cell death and in the repair of DNA damages through the analysis of the
frequency of micronuclei, apoptotic and necrotic cells in patients with head and neck cancer
under radiotherapy treatment. The difference in the frequencies of cells in karyorrhexis
between the genotypes (Arg/Arg, Arg/Pro and Pro/Pro) was significant, and the highest
frequency was found in the Pro/Pro genotype, suggesting that the p53Pro variant has a
greater apoptotic effect. The frequency of micronuclei cells increased significantly after
radiotherapy. However, no significant difference was found between the sampling done in the
healthy areas of the patient and in the control individual and between the genotypes.
However, according to our results, the Arg72Pro polymorphism influences the apoptotic
ability of the cell and does not interfere in DNA repair nor promotes cell necrosis.
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1 Introdução
O câncer é uma doença multifatorial causada por um crescimento celular
descontrolado e, mesmo na ausência de componente hereditário aparente, resulta de
mutações em células somáticas. Entre os tumores malignos do organismo, o câncer de boca
ocupa uma posição de destaque devido à sua incidência, mortalidade e aos traumas
causados por cirurgias mutilantes. Tumores iniciais são altamente curáveis por cirurgia ou
radioterapia e a escolha do tratamento é feita com o objetivo de um melhor resultado
estético e funcional (PARKER e cols.,1991).
A etiologia do câncer bucal envolve fatores de risco como consumo de tabaco,
álcool, exposição excessiva ao sol e à radiação. A grande maioria (95%) dos tumores de
cabeça e pescoço é constituída por carcinomas espinocelulares (CEC) e pode ser precedida
por lesões pré-cancerosas (OLIVEIRA FILHO, 1996) como leucoplasias e eritroplasias.
Foram estimados cerca de 8.000 novos casos para o ano de 2006 no Brasil, com o câncer
de cavidade oral ocupando o oitavo lugar entre todos os cânceres que atingem homens e
mulheres (INCA, 2007), sendo as maiores estimativas encontradas para as regiões sul
(2.520 novos casos) e sudeste (7.730 novos casos).
A progressão de um epitélio normal para um estágio de carcinoma com potencial
metastático envolve mudanças no controle da proliferação e diferenciação celular. Esses
controles agem de maneira positiva ou negativa e a aquisição de um fenótipo maligno pode
resultar da ativação de um gene que promove proliferação (oncogene) ou da perda de um
gene que suprime o potencial neoplásico das células (gene supressor tumoral). O fenótipo
maligno pode ser induzido pela mudança em um simples par de bases (mutações de ponto),
por alterações que envolvem os cromossomos, a exemplo de aneuploidias e por
translocações que podem afetar genes envolvidos na proliferação e diferenciação celular
(NUSSBAUM e cols., 2002). A instabilidade cromossômica pode contribuir para a
progressão do tumor pelos seguintes mecanismos: (1) perda de cromossomos que possuem
genes que codificam reguladores negativos da progressão do ciclo celular, proteínas
envolvidas na apoptose ou senescência, ou supressores de outros fenótipos associados
com câncer; (2) ganho de cromossomos extras que possuem genes que codificam
reguladores positivos da progressão do ciclo celular (oncogenes), ou proteínas anti-
apoptóticas (CARROLL e cols., 1999).
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1.1 TP53
Quando o DNA é danificado, um dos pontos de controle do ciclo celular é ativado para
prevenir a sua progressão. Isso, presumivelmente, impede a célula de replicar o DNA
danificado ou segregar, durante a mitose, um cromossomo alterado. O gene TP53 é um dos
genes supressores de tumor responsáveis pelo controle do ciclo celular. Está localizado no
braço curto do cromossomo 17 (17p13.1), contém 11 éxons e 20 kb. Codifica a proteína p53
que possui 393 aminoácidos e atua como fator de transcrição de genes reguladores do
crescimento celular. Apresenta funções fisiológicas diversas, como regulação do ciclo e do
crescimento celular, controle da apoptose e da proliferação celular bem como bloqueio da
transformação neoplásica.
Em células normais, os níveis da proteína p53 são baixos, como resultado da meia-
vida curta de 2 horas da sua forma selvagem (YEARGIN e HAAS, 1995; ZILFOU e cols.,
2001). Em resposta a danos ao DNA, os níveis da proteína p53 aumentam, ativando genes
que levam à inibição do ciclo celular na fase G1, permitindo que ocorra reparo no DNA ou
apoptose antes da replicação do DNA. A parada no ciclo celular resulta da transativação de
várias moléculas, como a p21, que atuam na inibição de proteínas envolvidas na progressão
do ciclo celular. Esse procedimento impede que células altamente mutadas, com potencial
para se tornarem células tumorais, continuem a divisão (SARASIN, 2003). A função da p53
é controlada por interações com reguladores negativos, como o Mdm2, que induz a sua
degradação e previne o acúmulo em células normais. Esta interação é rompida pela
estabilização e ativação da proteína p53 (através de fosforilação e acetilação) quando a
célula detecta dano ao DNA ou outro estresse.
Em células normais, a apoptose (ou morte celular programada) ocorre através de
uma cascata de eventos bioquímicos e morfológicos, podendo ser gerada por danos não
reparados ao DNA antes que as mesmas entrem na fase S. Mutações do gene regulador
TP53 resultam na transição de células danificadas da fase G1 para S. Se isso ocorrer, o
genoma danificado é replicado e poderá ser passado para as células filhas. Várias respostas
celulares após a ativação da p53 têm sido descritas e a escolha da resposta depende de
fatores tais como: tipo celular, ambiente celular e outras alterações oncogênicas (VOUSDEN
e cols., 2002).
A maioria das interações entre a p53 e proteínas-alvo acontece em uma seqüência
específica do domínio central da proteína. A região amino terminal da proteína contém um
domínio de transativação transcricional. A região carboxila terminal contém o domínio de
tetramerização, um sinal de exportação nuclear e um sinal de localização nuclear (Figura 1).
A região final da terminação carboxila possui altos níveis de aminoácidos básicos que
parecem regular o domínio central, o qual é mais comumente mutado, seguido pelo domínio
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de tetramerização (3,4%), domínio rico em prolina (2,3%) e domínio de transativação (1%).
A maioria dessas mutações (73%) é de sentido trocado (BODE e DONG, 2004).
Figura 1. Esquema dos domínios da proteína p53
Meek (2004) cita em seu trabalho que a discriminação entre apoptose e interrupção
do ciclo celular depende da afinidade dos promotores. Promotores de genes de interrupção
do ciclo celular (p21) possuem sítios de união com a p53 de alta afinidade, enquanto
promotores de genes apoptóticos (BAX) contém sítios de união com a p53 de baixa
afinidade. Este modelo explica as observações de que o nível ou a atividade aumentados da
p53 podem levar à apoptose e que mutantes p53 com conformações alteradas retém
atividade suficiente para induzir a interrupção do ciclo celular, mas não a apoptose.
O gene TP53 apresenta um polimorfismo comum que resulta da substituição de um
aminoácido prolina (CCC) por um arginina (CGC) na posição do códon 72, éxon 4. Este
polimorfismo provoca alterações na estrutura primária da proteína, mas apesar dessa
diferença, ambas podem ser consideradas indistinguíveis estruturalmente (THOMAS e cols.,
1999). Este polimorfismo ocorre no domínio rico em prolina, necessário para a indução da
apoptose. Além disso, observou-se que a variante p53Arg induz a apoptose mais
eficientemente que a p53Pro, indicando que as duas variantes são funcionalmente distintas
e que esta diferença pode influenciar o risco de desenvolver o câncer (DUMONT e cols.,
2003). Thomas e cols. (1999) mostraram em seu trabalho que a p53Pro e p53Arg são
indutoras de apoptose em níveis iguais, mas a p53Arg é considerada mais eficiente por ter
uma cinética de morte celular mais rápida. Com relação à ativação transcricional, a p53Pro
tem ação duas vezes maior que a p53Arg, o que pode ser justificado pelos níveis
significativamente maiores de união com os fatores de transcrição TAFII32 e TAFII70.
Vários tipos de estress provocam um acúmulo de p53 nas mitocôndrias de células
malignas e não malignas. Marchenko e cols. (2000) mostram em seu trabalho que esse
acúmulo é um processo ativo que antecede mudanças na membrana mitocondrial, liberação
de citocromo c e ativação de procaspase-3. Dados de seu estudo sugerem que a principal
localização da p53 na mitocôndria é no compartimento entre as membranas interna e
externa, provavelmente após a importação pela proteína hsp70 (heat-shock protein 70). A
variante p53Arg tem uma associação melhor com a proteína hsp70 que a variante p53Pro, o
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que explica a maior concentração da p53Arg na mitocôndria. Esta maior concentração da
proteína p53Arg na mitocôndria sugere que a sua exportação nuclear seja mais eficiente
que da p53Pro. Uma justificativa para essa hipótese seria que a p53Arg tem maior
associação com a Mdm2 (murine double minute 2), uma ubiquitina ligase E3, o que leva a
uma maior exportação nuclear da p53Arg (DUMONT e cols., 2003).
Existem evidências de que o domínio rico em prolina da p53 (aminoácidos 64-92)
prejudica a habilidade da p53 (através do domínio de união à Mdm2 – aminoácidos 17-23)
de unir à Mdm2, pois deleções do domínio rico em prolina fornecem uma maior habilidade à
p53 em se unir à Mdm2 e ser ubiquitinada por ela. Dados indicam que a ubiquitinação da
p53, talvez em aminoácidos particulares, pode encaminhar essa proteína para a
mitocôndria, o que justifica a p53Arg não ser encaminhada para a degradação
imediatamente após a ubiquitinação (DUMONT e cols., 2003). A ausência da região rica em
prolina deixa a p53 mais susceptível à ubiquitinação, à exportação nuclear e à degradação
mediada pela Mdm2 (BERGER e cols., 2001). A proteína co-repressora Sin3 interage com a
região dos aminoácidos 61 a 75 da p53, os quais estão dentro do domínio rico em prolina e
inibe a degradação da p53 por proteassomos (ZILFOU e cols., 2001).
Marin e cols. (2000) relataram em seu trabalho que existem certos mutantes
conformacionais da p53 que podem unir e inativar a proteína homóloga p73. Essa inativação
fornece uma explicação para a observação de que a superexpressão de certos mutantes
p53 afeta o comportamento de células tumorais. As diferentes mutações existentes de TP53
nos tumores podem ser evidenciadas, pelo menos em parte, por diferenças no metabolismo
e exposição do tecido a carcinógenos (MARIN e cols., 2000). Existe uma correlação
significativa entre o polimorfismo Arg72Pro e indução de apoptose, na qual o alelo Arg
parece prevenir a apoptose em carcinomas de cabeça e pescoço (SCHNEIDER-STOCK e
KULESZ-MARTIN, 2004). Porém não foi encontrada correlação entre o polimorfismo no
códon 72 e a indução de apoptose em pacientes com leucemia (STURM e cols., 2005). Em
relação ao câncer de pele não-melanoma, o polimorfismo Arg72Pro não é considerado um
agente etiológico; outros fatores provavelmente são promotores mais fortes dessa lesão
(BENDESKY e cols., 2007). Orsted e cols. (2007) não encontraram associação entre o
polimorfismo Arg72Pro e o risco de desenvolver câncer ou outra doença, mas sugeriram que
este polimorfismo tem efeito na sobrevivência no período de 5 anos após o diagnóstico do
câncer. Através de um acompanhamento, também foi observado que a sobrevivência de
pacientes com genótipo Pro/Pro após o desenvolvimento do câncer foi maior que dos
pacientes com genótipo Arg/Arg. Devido ao polimorfismo Arg72Pro ter funções celulares
bem conhecidas, esses resultados são improváveis de ser devido a outro polimorfismo que
esteja em desequilíbrio de ligação com Arg72Pro.
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Resultados do trabalho de Storey e cols. (1998) apontam que a maior
susceptibilidade da proteína p53Arg à degradação induzida pela oncoproteína E6
correlaciona com os achados clínicos de maior freqüência desse alelo em tumores,
sugerindo que esse tipo de degradação da p53 seja importante no desenvolvimento de
tumores cervicais. Deste modo, mantendo-se os fatores de risco em igualdade, um indivíduo
homozigoto para o alelo arginina (Arg/Arg) é 7 vezes mais provável de desenvolver câncer
cervical associado com HPV que um heterozigoto Arg/Pro. Esses autores ainda comentam
que a taxa de perda de heterozigosidade (LOH) neste lócus é baixa, indicando que esse não
é um mecanismo importante para a maior freqüência do genótipo Arg/Arg em células de
tumores cervicais. Na verdade, isso sugere que os tumores surgem em indivíduos que eram
predispostos ao seu desenvolvimento por terem um genótipo homozigoto para arginina. Tal
diferença na freqüência do polimorfismo não tem sido encontrada em outros tipos de
tumores (STOREY e cols., 1998). Entretanto dados de Baek e cols. (2000) e Nishikawa e
cols. (2000) mostram que não existe relação entre o polimorfismo Arg72Pro e o
desenvolvimento de câncer cervical.
1.2 Alterações Nucleares O núcleo pode sofrer várias agressões durante o ciclo celular, em conseqüência
disso, ocorrem alterações morfológicas nucleares. Uma dessas alterações, os micronúcleos
(MN), são estruturas com características morfológicas semelhantes ao núcleo principal, mas
de tamanho menor (Figura 2). Eles se originam de fragmentos cromossômicos ou
cromossomos inteiros que atrasam, em relação aos demais, na migração para os pólos da
célula ou migram irregularmente na anáfase. Esses fragmentos podem ter origem de pontes
anafásicas quebradas, formadas por rearranjos cromossômicos que deram origem a
cromossomos dicêntricos (HEDDLE e cols., 1991) (Figura 3).
Figura 2. Célula esfoliada contendo dois micronúcle os
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Durante a telófase, os fragmentos ou cromossomos íntegros são incluídos nas
células filhas, onde podem ficar contidos no núcleo principal ou podem formar um ou mais
núcleos secundários, menores que o principal (FENECH e CROTT, 2002). Um micronúcleo
maior, composto de cromossomos inteiros, pode se originar após um dano no aparato do
fuso mitótico da célula (efeito aneugênico) e micronúcleos menores, de fragmentos
cromossômicos ou cromatídicos, resultam de aberrações estruturais cromossômicas (efeito
clastogênico) (BLOCHING e cols., 2000; NORPPA e FALCK, 2003). Os centrômeros são
caracterizados por repetições em tandem de 171 pb . A presença ou ausência de
centrômero nos micronúcleos pode ser determinada usando hibridização in situ com sondas
de DNA que identificam o DNA α-satélite ou através do uso de anticorpos anti-CREST
(NORPPA e FALCK, 2003). Segundo Tolbert e cols. (1992), os micronúcleos devem conter
as características contidas na tabela 1.
Figura 3. Esquema de formação de micronúcleos
As células esfoliadas epiteliais são células que foram desprendidas da superfície da
cavidade bucal ou de qualquer outro epitélio. De certa forma, a presença de micronúcleos
nas células esfoliadas serve para medir a extensão do dano que um determinado agente
ambiental pode ter causado ao DNA. As células bucais têm uma característica própria
relacionada com a renovação celular deste tecido, a freqüência de micronúcleos alcança um
pico em torno de 7 dias após tratamento quimioterápico e retorna à freqüência inicial em 2 a
3 semanas (SARTO e cols., 1990). Segundo Tolbert e cols. (1991) os micronúcleos em
células esfoliadas refletem eventos genotóxicos que ocorreram na camada de células basais
em divisão em 1 a 3 semanas antes da esfoliação.
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14
Tabela 1. Características dos micronúcleos (TOLBERT e cols .,1992)
As mutações em genes que determinam a fidelidade da síntese de DNA ou em
genes que codificam proteínas responsáveis pela apoptose aumentam consideravelmente a
taxa de mutação basal e podem explicar as múltiplas mutações encontradas em células
tumorais (SARASIN, 2003). Vários pesquisadores têm encontrado uma freqüência maior de
células com micronúcleos espontâneos em indivíduos com idades mais avançadas, o que
pode indicar um aumento da vulnerabilidade do genoma com a idade (HUBER e cols., 1989;
HANDO e cols., 1994; NORPPA e FALCK, 2003). O cromossomo X é particularmente
prevalente em MN de mulheres e pode ser responsável pela maioria dos MN em mulheres
com idade avançada (NORPPA e FALCK, 2003). Mas, de acordo com Ochi-Lohmann e cols.
(1996), uma alta freqüência de micronúcleos espontâneos e a sensibilidade à radiação
ionizante parecem não estar associadas com a idade.
A principal lesão causada pela radiação ionizante é quebra da dupla fita de DNA. Se
a lesão não for reparada pode ocorrer a formação de micronúcleos, dentre outras
anormalidades. Considerando que pacientes com carcinoma basocelular desenvolvem mais
micronúcleos, pode-se concluir que existe uma menor eficiência no reparo desse tipo de
quebra nesses pacientes do que em indivíduos saudáveis (OCHI-LOHMANN e cols., 1996).
Aberrações cromossômicas têm sido aceitas como parâmetro razoavelmente seguro para
avaliar o dano induzido por radiações ionizantes, pois existe uma forte relação dose-
resposta entre exposição à radiação ionizante e níveis de células micronucleadas em
tecidos esfoliados (STICH e ROSIN, 1983; SARTO, 1987). De acordo com Maffei e cols.
(2002) o dosímetro usado para monitorar técnicos em radiologia controla apenas altas doses
de radiação e não fornece informações sobre o risco à exposição por longo período a baixas
doses. Isso dificulta o estabelecimento da relação dose-efeito, ou seja, entre dano
cromossômico e exposição a baixos níveis de radiação.
Segundo Shibamoto e cols. (1998) há controvérsias se a freqüência de MN
representa a radiossensibilidade celular. A freqüência de MN reflete apenas lesão recente
ao DNA, sugerindo então a necessidade da supressão em longo prazo do aparecimento de
MN para se observar um impacto sobre a incidência de câncer. Foi encontrada correlação
Tamanho igual ou menor que 2/3 do núcleo principal
Forma arredondada ou ovalada
Não estão ligados ou conectados ao núcleo principal
Podem tocar, mas não sobrepor o núcleo principal e o limite do micronúcleo deverá ser
distinguível do limite nuclear
Possuem a mesma intensidade de cor que o núcleo principal, mas ocasionalmente
podem corar mais intensamente
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entre alta freqüência de MN em células tumorais e resposta favorável do tumor ao
tratamento com radiação (SHIDNIA e cols., 1990). Alterações como MN, multinucleação,
cariólise, cariorréxis, broto nuclear e picnose podem ser usadas como teste de prognóstico
para radiossensibilidade de câncer oral (BINDU e cols., 2003). Em teste realizado com
pacientes portadores de câncer oral submetidos à radioterapia foi encontrada correlação
entre radiossensibilidade e multinucleação. Esse resultado implica que dano no aparato
citocinético é um importante fator determinante da radiossensibilidade em câncer oral
(BHATTATHIRI e cols., 1998).
A análise do número de micronúcleos pode ser usada como estratégia para
identificar o dano genotóxico em células humanas que forem expostas a carcinógenos ou
mutágenos. O aumento no número de micronúcleos em células esfoliadas da mucosa bucal
indica um aumento no risco de câncer de boca e o número de células com micronúcleos
pode ser usado como indicador para monitorar ou predizer a eficácia de estratégias de
intervenção ao câncer (BELIËN e cols., 1995). Os resultados de Ochi-Lohmann e cols.
(1996) indicam que a freqüência de células com micronúcleos e o número de micronúcleos
podem ser usados como um parâmetro para estimar instabilidade genética e resposta a
mutágenos ambientais.
Antes da esfoliação, grande parte das células da mucosa oral sofre apoptose e
várias mudanças nucleares acontecem. Essas mudanças são classificadas como: (1)
cariorréxis (fragmentação nuclear); (2) cariólise (dissolução progressiva da cromatina); (3)
cromatina condensada; (4) broto nuclear (brotamento sem separação definida do núcleo
principal) e; (5) picnose (núcleo de tamanho menor altamente condensado) (Figura 4). Um
epitélio não queratinizado pode apresentar picnose, cromatina condensada e cariólise como
resposta adaptativa a um dano (PINDBORG e cols., 1980). Devido a esses fenômenos
serem relativamente comuns em células esfoliadas, a classificação equivocada de outras
mudanças morfológicas com MN é potencialmente significativa (TOLBERT e cols., 1992),
sendo necessária a inclusão de células em apoptose (picnose, cariorréxis e cromatina
condensada) e em necrose (cariólise, picnose, cariorréxis, cromatina condensada) na
contagem realizada para os MN (TOLBERT e cols., 1991; RAMÍREZ e SALDANHA, 2002;
BINDU e cols., 2003; SANTOS e cols., 2003; CERQUEIRA e cols., 2004). O broto nuclear é
formado através de amplificação gênica, via ciclos de quebra-fusão-ponte (BFB) e em
seguida, com uma aproximação da periferia do núcleo, o DNA amplificado é eliminado via
brotamento nuclear (FENECH, 2000; FENECH e CROTT, 2002).
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Figura 4. Cariorréxis (A), cariólise (B), picnose ( C) e cromatina condensada (D)
Fenech e cols. (2003) definem em seu trabalho características de células apoptóticas
e necróticas (Tabelas 2 e 3).
Tabela 2. Características de células apoptóticas (F ENECH e cols., 2003) Cromatina condensada dentro do núcleo ou um núcleo fragmentado
Citoplasma e membrana citoplasmática intactos
Coloração citoplasmática mais forte que em células viáveis
Tabela 3. Características de células necróticas (FE NECH e cols., 2003) Numerosos vacúolos no citoplasma e no núcleo, ou
Perda do citoplasma e membrana nuclear irregular ou danificada.
Geralmente com perda de material no limite da membrana nuclear
Coloração do citoplasma e núcleo mais fraca que em células viáveis
Altos níveis de genotoxicidade e citotoxicidade em tecidos expostos à radiação
(radiografia panorâmica), identificados por células em apoptose e necrose respectivamente,
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podem ser fatores que diminuem a freqüência de células com micronúcleos (CERQUEIRA e
cols., 2004). Bindu e cols. (2003) encontraram um aumento significativo de cariólise,
cariorréxis, picnose, broto nuclear e multinucleação dependente da dose de radiação
incidida e concluíram que essas alterações podem ser usadas como teste preditivo para
radiossensibilidade de cânceres orais. Segundo a pesquisa de Sarto (1987) a freqüência de
células em degeneração é muito influenciada pelo estado inflamatório da mucosa, pelo
processo de reparo celular e pela força utilizada durante uma coleta.
Estudos realizados em pacientes com todos os tipos de cânceres, antes e após a
radioterapia, mostraram que a freqüência de micronúcleos antes do tratamento era maior
nos pacientes que nos controles e na metade do tratamento de radioterapia os valores
ficaram duas vezes maiores que nas amostras antes do tratamento (ZAMBLOGOU e cols.,
1991; JAGETIA e cols., 2001; JIANLIN e cols., 2004; RIMPU e cols., 2005). Bloching e cols.
(2000) estimaram o risco de desenvolvimento de câncer em pessoas fumantes com mais
que 19,5MN/1000 células como oito vezes maior. Existe uma maior incidência de todos os
tipos de cânceres em indivíduos com alta e média freqüência de micronúcleos e dentre os
que desenvolvem o câncer a sobrevida é menor (LEAL-GARZA, 2002; NERSESYAN e cols.,
2002; JIANLIN e cols., 2004; BONASSI e cols., 2007). O número de células com
micronúcleos também é maior no grupo de pacientes que no intervalo de 18 meses teve
recorrência do tumor primário (BINDU e cols., 2003). Entretanto, Carvalho e cols. (2002) não
encontraram correlação entre a freqüência de MN e o aumento de recidivas locais e, em sua
pesquisa, o paciente que não apresentou nenhum MN foi que, durante o acompanhamento,
apresentou múltiplas lesões.
Um aumento de MN e de proteína p53 em lesões pré cancerosas sugere que eles
sejam eventos iniciais na progressão de carcinomas de cabeça e pescoço (DELFINO e
cols., 2002). De acordo com os resultados de Minicucci e cols. (2005) não existe diferença
na freqüência de MN entre pacientes com câncer de cabeça e pescoço e indivíduos controle
antes do tratamento radioterápico. Níveis aumentados de micronúcleos foram observados
em pacientes com mais de 60 anos de idade e naqueles com tumores de tamanho maior
que 4 cm. Portanto, seus dados mostram que a radioterapia tem um potente efeito
clastogênico em células da mucosa bucal dos pacientes, mas que a freqüência basal não
serve como marcador para o câncer de cabeça e pescoço. Tumores de tamanho maior (T3
e T4) possuem maior freqüência de MN que em pacientes com tumores menores (T1 e T2),
dado difícil de ser explicado, pois o aparecimento dessas alterações é devido à presença de
carcinógenos na superfície do tecido e não ao tamanho do tumor (CARVALHO e cols.,
2002).
Bloching e cols. (2000) e Dietz e cols. (2000) não encontraram nenhuma correlação
entre freqüência de micronúcleos e consumo de álcool, mas uma forte correlação com
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consumo de cigarros por dia e consumo de mate. A detecção de micronúcleos é referente
apenas à exposição genotóxica atual, por isso a duração do consumo de cigarro não
influencia na freqüência de micronúcleos.
O Teste de MN em células epiteliais esfoliadas tem a vantagem de ser de baixo
custo, uma vez que não requer procedimentos de cultura, e de fácil execução, podendo
assim ser aplicado em programas de biomonitoramento que incluem grandes populações.
Outra vantagem é que, enquanto os linfócitos devem ser estimulados a sofrer mitose,
introduzindo certos problemas de interpretação, as células epiteliais não necessitam ser
estimuladas. A utilização do Teste de Micronúcleo em células esfoliadas da mucosa bucal
propicia um grande número de células viáveis e requer um procedimento extremamente
simples de coleta, constituindo-se em prática não invasiva e indolor, fator esse que permite
amostragens repetidas e propicia a adesão voluntária (STICH e cols., 1983).
As desvantagens e limitações inerentes a esse teste são a necessidade da
ocorrência de divisão celular para que o micronúcleo seja formado, a incapacidade para
detecção de trocas e rearranjos cromossômicos e a subestimativa da real ocorrência de
danos cromossômicos. Essa subestimativa deve-se ao fato de que, dependendo do tecido, a
migração das células oriundas da camada basal para a superfície pode levar alguns dias e
durante este período as células com micronúcleo podem sofrer lise antes de atingir a
camada basal (SARTO e cols., 1990).
O Teste de MN é, portanto, uma ferramenta muito útil na avaliação de danos
biológicos que ajudam a identificar a radiossensibilidade do tumor. Este teste pode ajudar
em decisões de métodos apropriados de tratamento, permitir monitorar a resposta ao
tratamento, e pode ser proveitoso no prognóstico ao final da terapia.
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2 Objetivos
2.1 Objetivos gerais
Avaliar a atividade das variantes da proteína p53 (p53Arg e p53Pro) na promoção da
morte celular e no reparo a danos no DNA através da análise da freqüência de células
apoptóticas e necróticas e de células micronucleadas, respectivamente, em pacientes com
câncer de cabeça e pescoço sob tratamento radioterápico.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar a capacidade de reparo das variantes da proteína p53 (p53Arg e p53Pro)
através da contagem de células micronucleadas;
Avaliar o efeito das variantes da proteína p53 (p53Arg e p53Pro) sobre a morte celular
através da contagem de células apoptóticas (cariorréxis) e necróticas (cariólise);
Comparar a freqüência de células micronucleadas entre pacientes e indivíduos
controle;
Averiguar as freqüências alélicas e genotípicas das variantes p53Arg e p53Pro nas
amostras de pacientes e controles;
Investigar associação entre a freqüência de células micronucleadas e idade, sexo,
características dos tumores, hábitos de fumar e ingerir bebida alcoólica.
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3 Material e métodos
3.1 Caracterização da amostra
O grupo amostral do estudo incluiu 40 indivíduos. Deste total, 20 indivíduos foram
pacientes com diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço (confirmado por exame
histopatológico) iniciando o tratamento radioterápico. O grupo controle foi composto de 20
indivíduos clinicamente saudáveis e sempre que possível os acompanhantes dos pacientes
eram requisitados para serem os controles. A amostra foi composta por indivíduos de ambos
os sexos, de idades entre 20 e 80 anos, usuários ou não de tabaco e/ou álcool.
Foi aplicado um questionário contendo perguntas sobre hábitos de fumar e ingerir
bebida alcoólica e, para os pacientes, incluiu-se dados pertinentes ao tratamento e à doença
(ANEXO 1). Além disso, uma avaliação do grau de parentesco entre pacientes e outros
indivíduos afetados com câncer foi realizada para montar um heredograma do paciente
quando a doença é muito frequente na família.
3.2 Coleta do material
Todas as coletas foram realizadas no Centro de Radioterapia do Hospital
Luxemburgo, Belo Horizonte (Minas Gerais).
Foram feitas quatro coletas em cada paciente e duas em cada controle, sendo que
uma coleta de cada indivíduo foi destinada à extração de DNA.
O material foi coletado por meio de uma escova cervical na área perilesional antes e
10 dias após a primeira sessão de radioterapia de acordo com Cerqueira e cols., 2004. Duas
outras coletas, para análise microscópica e molecular, foram realizadas na mucosa jugal
clinicamente saudável dos pacientes (antes da radioterapia) e dos indivíduos controle.
Sempre que possível a captura de imagem digital da lesão foi realizada (ANEXO 2).
3.3 Processamento do material, análises citogenétic a e molecular As células foram espalhadas diretamente sobre uma lâmina de microscopia contendo
uma gota de soro fisiológico. As lâminas foram fixadas com metanol e ácido acético 3:1 por
10 minutos. Após 24 horas as lâminas foram hidrolisadas com ácido clorídrico 5N por 30
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minutos, coradas com corante Schiff por 90 minutos (FEULGEN e ROSSENBECK, 1924) e
contra-coradas com fast green por 1 minuto.
A análise citogenética foi realizada em microscópio óptico de luz e as células
incluídas na análise seguiram os critérios adotados por Tolbert e cols. (1992) (Tabelas 4 e
5).
Tabela 4. Critérios para inclusão de células na con tagem (TOLBERT e cols., 1992) Citoplasma intacto
Pequena ou nenhuma sobreposição com células adjacentes
Pequeno ou nenhum “debris”
Núcleo normal e intacto, perímetro nuclear liso e distinto
Tabela 5. Critérios para inclusão de micronúcleo na contagem (TOLBERT e cols., 1992) Ser redondo ou oval, com perímetro liso sugestivo de membrana
Ter menos que um terço do tamanho total do núcleo principal
Coloração com intensidade similar ao núcleo principal
Possuir textura similar à do núcleo principal
Situar no mesmo plano focal do núcleo principal
Não ter sobreposição ou ponte com o núcleo principal
Foi analisado um mínimo de 2000 células por lâmina para contagem de
micronúcleos, conforme Lucero e cols. (2000), Ramirez e Saldanha (2002), Carvalho e cols.
(2002), Maffei e cols. (2002) e Ray e cols. (2005) e de 1000 células para contagem de
células em apoptose. A captura de imagem digital de diversas alterações nucleares foi
realizada (ANEXO 3).
Para a análise molecular, a escova contendo células bucais foi agitada em 1 mL de
TE e em seguida foi feita a extração do DNA , de acordo com o protocolo de Miller e cols.
(1988) com algumas modificações (ANEXO 4). O DNA foi amplificado por reação em cadeia
da polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos iniciadores (primers) que resultam em uma
banda de 1411 pares de bases (pb) (Forward: 5’ – TCCCCCTTGCCGTCCCAA – 3’ e
Reverse: 5’ – TCAGGCGGCTCATAGGGC - 3’). A PCR foi realizada em um volume total de
25µL contendo DNA genômico, 10 pmol de cada primer, tampão 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,4
mM de cada dNTP, 8% de DMSO, 1 unidade de Taq polimerase. As condições de ciclagem
foram: uma fase de desnaturação inicial a 94° C por 5 minutos, 30 ciclos a 94ºC por 30
segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos e um passo final de extensão a
72ºC por 5 minutos. O desempenho da PCR foi verificado por eletroforese de uma alíquota
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(5 µL) do produto amplificado em um gel de agarose na concentração de 1,0 %, corado por
brometo de etídeo por 30 minutos e fotografado sob luz ultravioleta (UV) por meio de uma
câmera digital. Em seguida 10µL do produto de amplificação foi digerido com 10 unidades
da enzima Acc II, conforme Baccouche e cols. (2003), durante 12 horas à temperatura de
37ºC e analisado também por meio de eletroforese em gel de agarose 1%.
O produto de PCR contém dois sítios de restrição da enzima Acc II (BstU I). O alelo
que codifica uma arginina no códon 72 forma três bandas, uma como controle interno de
PCR com 280 pb e duas outras bandas, com 109 pb e 1022 pb. O alelo que codifica a
prolina forma um banda de controle interno (280 pb) e outra com 1131 pb (Figura 5).
Figura 5. Esquema dos fragmentos dos alelos após a digestão
3.4 Análise estatística
A análise estatística dos dados consistiu: (1) em relação ao gene TP53, cálculo das
freqüências alélicas e genotípicas, das heterozigozidades observadas e esperadas sob
equilíbrio de Hardy-Weinberg, teste de excesso de heterozigotos (por meio do Teste Exato
de Fisher) e análise da diferenciação alélica e genotípica entre as amostras de pacientes e
de controles; (2) em relação às variáveis número de cariorréxis, cariólise e micronúcleo,
análise da freqüência de ocorrência por indivíduo e análise de variância da freqüência
transformada, no sentido de atender ao pressuposto de distribuição normal.
As freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo Arg72Pro e a diferença entre
as populações (por meio do Teste Exato de Fisher) foram estimadas utilizando o software
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gratuito TFPGA, versão 1.3 (MILLER, 1997), disponível on-line no site
http://www.marksgeneticsoftware.net.
A análise para verificar se as amostras estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg
(por meio do Teste Exato de Fisher) foi realizada utilizando o programa GENEPOP ON THE
WEB v3.4 (RAYMOND e ROUSSET, 1995) disponível on-line no site
http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/.
A análise de variância foi realizada para verificar a significância das diferenças nas
freqüências de cariorréxis, cariólises e micronúcleos entre as quatro coletas, entre os três
genótipos e na interação coleta x genótipo. Para a análise de variância, a variável freqüência
de cariorréxis foi normalizada através de transformação logarítmica e a freqüência de
micronúcleo normalizada através da transformação √(Y+0,5) (SOKAL e ROHLF, 1969). Não
houve necessidade de transformação no caso da variável freqüência de cariólise. O modelo
de análise adotado foi: Yijk = µ + b(tn – t) + gi + cj + gcij + eijk, em que Y é uma observação de
uma das variáveis, µ é a média geral, b(tn – t) é o efeito da idade de cada indivíduo,
considerada como variável contínua, gi é o efeito do i-ésimo genótipo, cj é o efeito da j-ésima
coleta, gcij é o efeito da interação entre o i-ésimo genótipo e a j-ésima coleta, e eijk é o erro
experimental. Também foi analisada a influência dos hábitos de fumar e ingerir bebida
alcoólica na freqüência de células micronucleadas, por meio de procedimentos não
paramétricos (teste de Wilcoxon e teste de Kruskal-Wallis).
Em todos os testes, o nível de significância adotado foi de 5%.
3.5 Aspectos Éticos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Minas
Gerais (CAAE – 0037.0.203.000-07) e pelo Comitê de Ética do Hospital Luxemburgo.
Após a leitura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO 5) os
participantes assinaram uma Declaração de Concordância (ANEXO 6).
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4 Resultados e discussão
Através do questionário, todos os indivíduos foram classificados em relação ao sexo,
idade, hábitos de fumar e ingerir bebida alcoólica e dados pertinentes à doença e tratamento
(ANEXO 7). Foi encontrado um maior número de indivíduos do sexo masculino entre os
pacientes e já que os acompanhantes foram requisitados para participar como controle, este
grupo foi composto por um número maior de indivíduos do sexo feminino (Figura 6A).
A classe com idade superior a 60 anos teve maior número de indivíduos no grupo de
pacientes que no grupo controle e na classe com idade menor que 40 anos o grupo controle
teve maior número de indivíduos (Figura 6B).
Figura 6. Distribuição dos indivíduos quanto ao sex o (A) e idade (B)
A maioria dos pacientes interrompeu os hábitos de ingerir bebida alcoólica e de
fumar há menos de 1 ano (geralmente quando a lesão foi diagnosticada) e a maioria dos
indivíduos controle nunca ingeriu bebida alcoólica ou fumou (Figuras 7A e B).
Figura 7. Distribuição dos indivíduos quanto aos há bitos: ingerir bebida alcoólica (A)
e fumar (B)
A grande maioria dos pacientes (90%) não fazia quimioterapia no momento da coleta
(Figura 8A). Uma coleta perilesional, e não uma coleta lesional, foi necessária devido a
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existência de muita secreção purulenta (quando a lesão estava presente) e também devido
ao grande número de remoção cirúrgica do tumor (70%) antes da radioterapia (Figura 8B).
Figura 8. Tratamento concomitante com quimioterapia (A) e tratamento cirúrgico prévio (B)
Com relação à avaliação do grau de parentesco, muitos pacientes tiveram parentes
de 1° grau e 2° grau afetados (55%), mas poucos tiveram mais de 1 parente afetado (Figura
9). Devido à baixa freqüência de parentes afetados em cada família não foi necessária a
construção de heredograma em nenhum caso.
Figura 9. Grau de parentesco com indivíduos afetado s com câncer
O estadiamento da doença é feito de acordo com o tamanho do tumor, presença de
metástase em linfonodos e presença de metástase à distância, sendo o estádio 4 o mais
avançado. Na maioria dos pacientes, os tumores eram grau histológico 3 (75%), o estádio
da doença 3 e 4 (82%) e a maioria dos pacientes (55%) tinha metástase em linfonodos
(Figura 10).
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Figura 10. Grau histológico do tumor (A), estádio d a doença (B) e presença de linfonodos com
metástase (C)
A genotipagem dos indivíduos foi realizada através da técnica de PCR-RFLP com
digestão com a enzima restrição AccII, havendo uma clara separação entre as bandas
(Figura 11). O uso de 10 unidades da enzima garantiu a digestão total do produto da PCR
(BACCOUCHE e cols., 2003; BAEK e cols., 2000).
Figura 11. Gel de agarose 1% mostrando os genótipos Pro/Pro (1), Arg/Arg (2) e Arg/Pro (3)
A diferença encontrada entre pacientes e controles na freqüência alélica e genotípica
do gene TP53 foi estatisticamente significativa, sendo o genótipo Arg/Arg mais freqüênte
nos controles e o genótipo Arg/Pro nos pacientes (Tabela 6). Apesar de não ter sido feita a
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genotipagem dos tumores, o alelo p53Arg é mais freqüente no grupo controle do que nos
pacientes de nossa amostra, refletindo maior número de homozigotos Arg/Arg. Esses
resultados diferem dos resultados encontrados por Marin e cols. (2000) em que existem
mais alelos p53Arg em tumores que alelos p53Pro. Essa maior freqüência do alelo p53Arg
em tumores pode ser explicada pela união mais estável da proteína p53Arg com a p73
diminuindo assim a eficácia da apoptose mediada pela p73. Com essa diminuição na
apoptose, os danos presentes no DNA são passados para células filhas durante a divisão
mitótica com maior freqüência, aumentando assim, a predisposição ao câncer. Storey e cols.
(1998) também encontraram resultado diferente e seu trabalho sugere que os tumores
surgem em indivíduos que eram predispostos por terem um genótipo Arg/Arg.
A freqüência de indivíduos Pro/Pro na amostra foi apenas de 10%. Este valor sugere
que, para futuros estudos de correlação entre o polimorfismo Arg72Pro e a freqüência de
micronúcleos, o número amostral deve ser ampliado a fim de se obter um número adequado
de indivíduos dos três genótipos.
As amostras de pacientes e controles se encontram em Equilíbrio de Hardy-
Weinberg, o que foi demonstrado através do Teste exato de Fisher.
Tabela 6. Freqüências alélicas e genotípicas dos in divíduos
Freqüência alélica Freqüência genotípica Arg Pro Arg/Arg Arg/Pro Pro/Pro p
Pacientes 0,53 0,47 0,21 0,63 0,16 0,38* Controles 0,73 0,24 0,58 0,37 0,05 1*
* valores significativos (p < 0,05)
Os modelos testados, para cariorréxis e cariólise, tiveram R2 com valores de 34% e
19% respectivamente e somente o modelo da variável cariorréxis foi considerado
significativo. Em relação à variável freqüência de cariorréxis houve diferença significativa
entre os três genótipos (Arg/Arg, Arg/Pro e Pro/Pro) e entre as quatro coletas realizadas
(região perilesional antes e depois da radioterapia e região sadia dos pacientes e controles).
Quando foi avaliada a interação genótipo x coleta, a variável cariorréxis não teve diferença
significativa. Schneider-Stock e Kulesz-Martin (2004) encontraram resultado semelhante ao
nosso, em que o genótipo com maior freqüência de cariorréxis foi o Pro/Pro sugerindo que a
variante p53Arg parece prevenir a apoptose em carcinomas de cabeça e pescoço. Porém,
Dumont e cols. (2003) e Thomas e cols. (1999) encontraram que a variante p53Arg induz a
apoptose mais eficientemente que a p53Pro. A menor freqüência de cariorréxis foi
encontrada no genótipo mais freqüente nos pacientes, sugerindo que uma menor eficiência
na apoptose pode ter aumentado a probabilidade das alterações nucleares de serem
passadas para as células filhas durante a divisão celular.
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A freqüência de cariorréxis sofreu influência significativa e positiva da idade. A
variável cariólise não teve diferença significativa entre genótipos, entre coletas, na interação
genótipo e coleta, e entres a idades (Tabela 7). Entretanto, Ramírez e Saldanha (2002)
encontraram em seu trabalho um aumento significativo no número de cariólise com o
aumento da idade em pacientes com câncer.
A freqüência de cariorréxis foi menor após a radioterapia e a freqüência de cariólise,
apesar de não significativa, foi maior após a radioterapia. Cerqueira e cols. (2004) obtiveram
resultados diferentes, em que a freqüência de cariorréxis e cromatina condensada tiveram
um aumento estatisticamente significativo na freqüência após a exposição ao raio-X para
tomada de radiografia panorâmica. Seus resultados sugerem que a resposta celular ao raio-
X não inclui efeito citotóxico que leva à necrose, mas como em nosso trabalho a radiação
incidida nos pacientes (durante a radioterapia) é superior à da tomada radiográfica, a
freqüência de cariólise pode ter sido maior decorrente de necroses e a freqüência de
cariorréxis menor devido ao aumento de cariólises.
Tabela 7. Análise das variáveis cariólise e cariorr éxis Quadrado médio p Fontes de variação GL Cariorréxis Cariólise Cariorréxis Cariólise
Genótipo 2 6,928 14160,9 0,0302* 0,625 Coleta 3 8,514 9901,5 0,006* 0,8029
Genótipo*Coleta 6 2,916 35924,5 0,1744 0,3174 Idade 1 25,593 12337,9 0,0005* 0,523
* valores significativos (p < 0,05)
A freqüência de células com broto nuclear, cromatina condensada e picnose não foi
suficiente para qualquer tipo de análise.
Com os dados da freqüência de células micronucleadas normalizados foi realizada a
análise de variância, sendo que o modelo foi significativo (p<0,0001) com o R2 no valor de
49%. A diferença entre as coletas foi estatisticamente significativa (p<0,0001). Não foi
encontrada relação entre a freqüência de células micronucleadas e a idade dos pacientes,
resultado esse semelhante ao de Ramírez e Saldanha (2002). Entretanto outros trabalhos
mostraram uma freqüência maior de MN em indivíduos com idades mais avançadas,
sugerindo que esse aumento seja decorrente de um aumento da vulnerabilidade do genoma
com a idade (HUBER e cols., 1989; HANDO e cols., 1994; NORPPA e FALCK, 2003). Do
mesmo modo, não foi encontrada nenhuma relação quando analisada a freqüência de
células micronucleadas, sexo, hábito de fumar e de beber. As maiores freqüências de
células micronucleadas observadas nos materiais foram de pacientes que nunca beberam
ou fumaram, entretanto Ramírez e Saldanha (2002) relacionam em seu trabalho a
freqüência de micronúcleos com a exposição da superfície do tecido a carcinógenos.
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A diferença entre as coletas realizadas na região perilesional antes e após a
radioterapia foi estatisticamente significante. O número de células micronucleadas foi maior
após a radioterapia em todos os genótipos, porém teve uma tendência de aumento maior no
genótipo Arg/Arg que no genótipo Pro/Pro. As freqüências basais de células micronucleadas
foram maiores na região sadia do que na região perilesional dos pacientes e semelhantes
quando comparadas a região sadia do paciente e a região controle (diferenças não
significativas). Essa diferença encontrada entre as coletas também foi encontrada nos
trabalhos de Zamblogou e cols. (1991), Jagetia e cols. (2001), Jianlin e cols. (2004),
Minicucci e cols. (2005), Rimpu e cols. (2005).
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5 Conclusões
Os resultados do presente trabalho permitem concluir que as freqüências alélicas e
genotípicas do gene TP53 entre as amostras de pacientes e controles são significativamente
diferentes, sendo o alelo Arg e o genótipo Arg/Arg mais freqüentes na amostra de controles
e o genótipo Arg/Pro nos pacientes.
A diferença nas freqüências de células em cariorréxis entre os genótipos foi
significativa, sendo a maior freqüência encontrada no genótipo Pro/Pro, sugerindo que a
variante p53Pro tenha um efeito apoptótico maior.
A radiação emitida durante a radioterapia aumenta significativamente o número de
células micronucleadas.
As regiões sadias dos pacientes e indivíduos controles são semelhantes em relação
à freqüência de células micronucleadas.
A idade influencia positivamente na freqüência de cariorréxis.
Portanto, de acordo com nossos resultados, o polimorfismo Arg72Pro influencia
apenas na atividade apoptótica celular, e não na capacidade de promover necrose celular
ou reparar o DNA.
Os dados obtidos, nesse trabalho, entretanto não permitem estabelecer o uso do
polimorfismo Arg72Pro do gene TP53 e da análise de células micronucleadas para
monitorar ou predizer a eficácia de estratégias de intervenção ao câncer.
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7 ANEXOS
ANEXO 1. Questionário
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
QUESTIONÁRIO
Data: / / Caso n.: _____________
Tipo de Carcinoma: ____________________ Idade: ____ _______________
Sexo: __ F __ M Profissão: ___________________
1. FUMA ATUALMENTE OU JÁ FUMOU?
__ Nunca fumou
__ Fuma atualmente cigarro industrializado? __ sim __ não
quantos cigarros por dia? ______
há quanto tempo? ______
__ Já fumou, mas parou cigarro industrializado? __ sim __ não
quantos cigarros por dia? ______
durante quanto tempo? ______
parou há quanto tempo? ______
2. TEM OU JÁ TEVE HÁBITO DE INGERIR BEBIDA ALCOÓLIC A?
__ Nunca ingeriu bebida alcoólica
__ Ingere bebida alcoólica atualmente há quanto tempo? ______
freqüência: ____ dias/semana
quantidade: ____ copos (200 ml)
__ Já teve hábito de ingerir, mas parou durante quanto tempo? ______
freqüência: ____ dias/semana
quantidade: ____ copos (200 ml)
há quanto tempo parou? _____
3. FAZ USO DE ANTISSÉPTICO BUCAL?
__ Não
__ Sim há quanto tempo? ___________
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__ Já fez uso, mas atualmente não faz
fez uso durante quanto tempo? _________
parou há quanto tempo? _______________
4. JÁ FEZ OU ESTÁ FAZENDO QUIMIOTERAPIA?
__ Não
__ Sim data de início:
data de término:
5. HÁ OUTROS CASOS DE CARCINOMA NA FAMÍLIA?
__ Não
__ Não sabe
__ Sim grau de parentesco: ________
região: ___________________
6. OBSERVAÇÕES DO TRATAMENTO E CARACTERÍSTICAS DA LESÃO
• Data do exame histopatológico: / /
• Linfonodos invadidos:
__ sim __ não
• Estádio: _______________
• Grau histológico: ________________
• Tratamentos anteriores: __________________
• Número de campos: _____________________
• Número de aplicações: ___________________
• Aparelho utilizado: ______________________
• Dose/área/dia: _________________________
→ As sessões de radioterapia são diárias para todos os pacientes, não sendo realizadas
apenas nos dias de sábado e domingo.
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ANEXO 2. Fotografias de lesões clínicas
Figura 12. Lesão de lábio inferior
Figura 13. Lesão tumoral de palato
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41
ANEXO 3. Fotografias de alterações nucleares
Figura 14. Células esfoliadas bucais com um micronú cleo (magnitude 1000x)
Figura 15. Células esfoliadas bucais binucleadas co m dois micronúcleos (magnitude 1000x)
Figura 16. Célula esfoliada bucal com ponte nucleop lasmática (magnitude 1000x)
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Figura 17. Célula esfoliada bucal heptanucleada (ma gnitude 1000x)
Figura 18. Célula esfoliada bucal com núcleo grande (magnitude 400x)
Figura 19. Célula esfoliada bucal normal servindo c omo controle de coloração para as células
em cariólise (magnitude 400x)
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ANEXO 4. Protocolo para extração de DNA de swab buc al
1. Soltar as células da escova cervical em 1 ml de TE
2. Centrifugar 2000 rpm, temperatura ambiente, por 10 minutos, 90 segundos de
parada
3. Desprezar sobrenadante e deslocar o pellet
4. Adicionar 300 µl de TE
5. Centrifugar 2000 rpm, temperatura ambiente, 10 minutos, 90 segundo de parada
6. Desprezar o sobrenadante e deslocar o pellet
7. Adicionar: 500 µl de SE
25 µl de SDS
10 µl de Proteinase K 20%
8. Colocar em banho-maria 56°C over-night
9. Adicionar 150 µl NaCl e vortexar
10. Centrifugar 6500 rpm, temperatura ambiente, 5 minutos, 90 segundos de parada
11. Numerar tubos novos, transferindo o sobrenadante para eles
12. Centrifugar novamente a 6500 rpm, 5 minutos, 90 segundos de parada
13. Numerar tubos novos e transferir sobrenadante para eles
14. Precipitar fragmentos menores com Acetato de sódio 1/10 volume. Misturar por
inversão
15. Adicionar etanol 100% (2:1). Misturar levemente por inversão
16. Centrifugar 13000 rpm, temperatura ambiente, 15 minutos, 90 segundos de parada
17. Adiciona 1ml de etanol 70%
18. Centrifugar 13000 rpm, temperatura ambiente, 5 minutos, 90 segundos de parada.
Despreza o etanol 70%
19. Centrifuga 6500 rpm, 3 minutos, retira o excesso de etanol e deixa secar
20. Adicionar TE de acordo com a quantidade de pellet.
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ANEXO 5. Termo de consentimento livre e esclarecido
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Aos pacientes voluntários
O projeto “Análise da freqüência de micronúcleos e polimorfism o do gene TP53
em pacientes tratados com radioterapia ” tem como objetivo avaliar o efeito da radiação nas células de pacientes com câncer de boca e faringe. Esta avaliação será feita através da freqüência de danos genéticos em células esfoliadas da mucosa desses pacientes. Nossos esforços se concentram no sentido de fornecer, futuramente e dependendo dos nossos resultados, uma melhor condução do tratamento.
Para as análises a serem realizadas, serão coletadas células através da raspagem da mucosa com uma escova cervical descartável e com uso de luvas descartáveis. A raspagem é um procedimento indolor que não causa nenhum desconforto ou risco à saúde do paciente, e será realizada imediatamente antes da primeira sessão de radioterapia e 10 (dez) dias depois, na mucosa com lesão e na mucosa saudável do paciente. O mesmo procedimento será realizado no indivíduo sem lesão, sendo a coleta realizada na mucosa jugal (bochecha) normal apenas uma vez.
O material coletado será transportado para os Laboratórios de Citogenética e Genética de Neoplasias e Mutagêneses do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, onde será manipulado o mesmo, sob responsabilidade do Professor Wilham Jorge.
O paciente não terá nenhum ganho financeiro e nenhuma despesa, sendo assim não terá direito a ressarcimentos. Será garantido o sigilo de seus dados pessoais e a proteção da sua privacidade.
O termo de consentimento poderá ser retirado, a qualquer momento durante a pesquisa, sem penalizações.
As pessoas que concordarem em colaborar com a pesquisa deverão assinar este termo de consentimento e fornecer, através de um questionário a ser aplicado, dados pessoais (nome, idade, endereço) sobre hábitos, e sobre o tratamento.
Wilham Jorge (orientador) Maria Cristina Lima de Castro (co-orientadora)
Av. Antônio Carlos, 6627 – Pampulha - Av. Antônio Carlos, 6627 - Pampulha
CEP 31.270-901 CEP 31.270-901
Belo Horizonte- MG - Tel: (31) 3499-2612 Belo Horizonte - MG - Tel: (31) 3499-2527
Latife Pereira (pesquisadora responsável) Stella Sala Soares Lima (colaboradora)
Av. Antônio Carlos, 6627 – Pampulha Rua Gentios, 1350 - Luxemburgo
Belo Horizonte – MG - CEP 31.270-901 Hospital Luxemburgo
Instituto de Ciências Biológicas Belo Horizonte - MG - CEP 30.380-490
Bloco E3 – sala 179 - Tel: (31) 3499-2596 Tel: (31) 3299-9041
Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG
Av. Antônio Carlos, 6627 – Pampulha - CEP 31270-901 – Belo Horizonte – MG
Reitoria 7° andar - Tel: (31) 3499-4027
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ANEXO 6. Declaração de concordância
DECLARAÇÃO DE CONCORDÂNCIA
Eu, ________________________________________________________________,
documento (tipo e número) __________________________________________,
endereço____________________________________________________________
__________________________________________________________________
concordo em participar da pesquisa da UFMG “Análise da freqüência de
micronúcleos e polimorfismo do gene TP53 em pacientes tratados com radioterapia”.
Declaro que li e entendi as informações contidas no Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido e concordo em doar uma amostra de esfregaço bucal, sem nenhum
pagamento, e autorizo o uso desse material para trabalhos científicos.
Belo Horizonte ________ de ___________________ de 2007
______________________________________________________________
assinatura do paciente
Testemunha:
Nome:_______________________________________________
Documento: __________________________________________
Assinatura: ____________________________________________
Obs: Caso o participante não saiba ler, o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido e a Declaração de Concordância serão lidos e explicados para o
mesmo. Neste caso, será colhida a assinatura de uma testemunha.
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ANEXO 7. Tabelas de caracterização da amostra
Tabela 8. Caracterização da amostra em relação à id ade e sexo Idade Sexo Indivíduos 20-40 40-60 60-80 F M
Pacientes 0,05 0,65 0,3 0,15 0,85 Controles 0,45 0,5 0,05 0,7 0,3
Tabela 9. Caracterização da amostra em relação ao h ábito de fumar Fuma atualmente
cigarro industrializado cigarro palha Parou de fumar Indivíduos Nunca
fumou < 5/dia > 5/dia < 5/dia > 5/dia < 1 ano > 1 ano
Pacientes 0,1 0,1 0 0,05 0,05 0,6 0,1 Controles 0,8 0 0,05 0 0 0 0,15
Tabela 10. Caracterização da amostra em relação ao hábito de ingerir bebida alcoólica
Bebe atualmente Parou de beber Indivíduos Nunca bebeu
< 2x/semana > 2x/semana < 1 ano > 1 ano
Pacientes 0,1 0 0,05 0,45 0,40 Controles 0,5 0,3 0 0,1 0,1
Tabela 11. Pacientes em tratamento quimioterápico, linfonodos invadidos e tratamentos realizados antes da radioterapia (remoção cirúrgica da lesão)
Quimioterapia Linfonodos invadidos
Tratamentos anteriores
sim 0,1 0,55 0,7 não 0,9 0,25 0,3 não
avaliáveis x 0,2 x
Tabela 12. Estadiamento da doença e grau histológic o do tumor Estádio do tumor Grau histológico do tumor 1 0,05 x 2 0,05 0,25 3 0,2 0,75 4 0,7 x
Tabela 13. Casos de câncer em familiares de pacient es Casos na família
sim 1° grau 0,4 2° grau 0,15
não 0,35 não sabe 0,1
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