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Universidade Federal de PelotasCentro de Biotecnologia
Caracterização molecular de isolados de leptospira
Odir Antônio Dellagostin, [email protected]
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TAXONOMIA
Leptospira interrogans
Leptospira weilii
Leptospira borgpetersenii
Leptospira noguchii
Leptospira santarosai
Leptospira alexanderi
Leptospira kirschneri
Leptospira genospecies 1
Leptospira wolffii
Patogênicas
Intermediárias
Saprófitas
19 espécies genômicas >250 sorovares
Leptospira biflexa
Leptospira meyeri
Leptospira wolbachii
Leptospira genospecies 3
Leptospira genospecies 4
Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei
Leptospira broomii
Leptospira inadai
Leptospira licerasiae
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Caracterização sorológica
Baseada na reação antígeno x anticorpo
Detecta variações antigênicas (proteínas,
mas principalmente LPS)
Difícil de ser realizada pois requer bateria
de soros bem caracterizados
Só realizado em centros de referência
Caracterização sorológica x molecular
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Caracterização sorológica x molecular
Caracterização molecular
Baseada no DNA
Detecta variações na seqüência de nucleotídeos
ou no tamanho de fragmentos de DNA
Requer apenas equipamentos comuns de biologia
molecular
Pode ser realizada em qualquer laboratório
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Principais técnicas de caracterização molecular
Seqüenciamento de DNA
Pulsed Field Gel Electrophoresis – PFGE
Variable Number of Tanden Repeats – VNTR
Multi Locus Sequence Typing – MLST
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Seqüenciamento do gene 16S rDNA
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Extração de DNA e PCR
Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA
PCR
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Seqüenciamento de DNA
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http
://w
ww
.life
.uiu
c.ed
u/ib
/335
/del
etio
ns.jp
g
(Fonte: Morey et al., 2006)
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PFGEEletroforese em Campo Pulsado
Equipamento
PrincípioDNA Bacteriano
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Árvore Filogenética
Resultado de uma análise por PFGE
Eletroforese de DNA de diferentes amostras
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PFGE
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VNTR
VNTR 7
VNTR 2 VNTR 11
VNTR 10
VNTR 4
VNTR 9
VNTR 19
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VNTR
Caracterização Molecular
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MA B
Eletroforese
250 pb
100 bp
CÓPIAS
5
2
A
B
VNTR 1= 50 pb
VNTR
VNTR 1
VNTR 1
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VNTR
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N° ordem Origem do isolado VNTR7
VNTR10 VNTR19 TipificaçãoVNTR (sorovar)
1 Canino - Canis familiaris (M5/90) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae
2 Canino - Canis familiaris (M12/90) 10 3 10 Canicola
3 Canino - Canis familiaris (M5/91) 10 3 10 Canicola
4 Humano - Homo sapiens (M21/96) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae
5 Rato - Rattus norvegicus (M9/99) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae
6 Rato - Rattus norvegicus (M11/99) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae
7 Rato - Rattus norvegicus (M10/99) 10 3 10 Canicola
8 Canino - Caninus familiaris (LO1) 10 3 10 Canicola
9 Canino - Caninus familiaris (LO2) 10 3 10 Canicola
10 Canino - Caninus familiaris (LO5) 10 3 10 Canicola
11 Canino - Caninus familiaris (LO6) 10 3 10 Canicola
12 Canino - Caninus familiaris (LO8) 10 3 10 Canicola
13 Canino - Caninus familiaris (LO11) 10 3 10 Canicola
14 Canino - Caninus familiaris (LO12) 10 3 10 Canicola
15 Suíno- Sus scrofa domestica (L03) 10 3 10 Canicola
16 Suíno- Sus scrofa domestica (L04) 10 3 10 Canicola
VNTR de isolados brasileiros de L. interrogans
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VNTR de isolados de Pelotas
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MLST – Multi Locus Sequence Typing
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(Ahme et al., 2006)d
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Conclusão
• Seqüenciamento do gene 16S rDNA – Permite a identificação da espécie.
• PFGE – Possibilita a identificação do sorovar na maioria dos casos. Difícil de ser realizada.
• VNTR – Permite a identificação de sorovar, porém apenas de L. interrogans.
• MLST – Técnica mais aprimorada. Permite a diferenciação de isolados de um mesmo sorovar. Ideal para o estudo de surtos.
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Universidade Federal de PelotasCentro de Biotecnologia
Grupo de pesquisa em leptospirose
UFPel – Centro de Biotecnologia• Odir A. Dellagostin• Éverton F. da Silva• Fabiana K. Seixas• Sandra D. Jouglard• José Antônio Aleixo• Gustavo Cerqueira• Daiane Hartwig• Karine Forster• Danieli Hartmann• Michel Fagundes• André Grassmann
CPqGM – Fiocruz - BA• Albert Ko• Alan McBride• Flávia da Cruz - UFBA
Financiamento• Bio-Manguinhos (Fiocruz• CNPq, CAPES, NIH
Bio-Manguinhos - Fiocruz• Marco Medeiros• Ana Paula Argondizzo
UFPel – CCZ• Claudiomar Brod• Cláudia Fernandes
FMVZ - USP• Silvio A. Vasconcellos• Fabiana Miraglia
UFF• Walter Lilenbaum
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Muito obrigado!
www.ufpel.edu.br/cenbiot
www.ufpel.edu.br/cenbiot/biomol