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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ - UFPI
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO - PRPPG
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO -
MESTRADO
JOSYANNE ARAÚJO NEVES
INTERFERÊNCIA DA FARINHA DE TRIGO NA QUALIDADE MICOLÓGICA E
MICOTOXICOLÓGICA DO PÃO TIPO FRANCÊS
Teresina
2013
JOSYANNE ARAÚJO NEVES
INTERFERÊNCIA DA FARINHA DE TRIGO NA QUALIDADE MICOLÓGICA E
MICOTOXICOLÓGICA DO PÃO TIPO FRANCÊS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição
da Universidade Federal do Piauí, como
requisito parcial para obtenção do título
de Mestre em Alimentos e Nutrição.
Área: Qualidade de Alimentos.
Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches
Muratori.
Teresina
2013
JOSYANNE ARAÚJO NEVES
INTERFERÊNCIA DA FARINHA DE TRIGO NA QUALIDADE MICOLÓGICA E
MICOTOXICOLÓGICA DO PÃO TIPO FRANCÊS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição
do da Universidade Federal do Piauí,
como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Alimentos e Nutrição.
Área: Qualidade de Alimentos.
Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches
Muratori.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________
Profª. Drª. Maria Christina Sanches Muratori - UFPI
(Orientadora/Presidente)
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Alberto da Rocha Rosa - UFRRJ
1º Examinador
___________________________________________________________________
Profª. Drª. Lidiana de Siqueira Nunes Ramos – IFPI
2º Examinador
DEDICATÓRIA
Dedico esta conquista
a minha amada mãe Osmarina Araújo, por seu imenso amor e apoio a todo instante.
Ao meu querido e admirado pai Juarez Barros (in memoriam), por seu exemplo de
obstinação e esforços desprendidos para proporcionar-me educação sólida.
A minha irmã Josynaria Araújo, companheira de muitas alegrias,
tristezas e superações. Ao meu amado Thyago Camelo, por
seu companheirismo, apoio, compreensão, preocupação
e amor em todos os momentos desse percurso.
AGRADECIMENTOS
Poucas tarefas são tão agradáveis como o reconhecimento de minha
gratidão a todos que colaboraram neste trabalho de formas tão diferentes e tornaram
essa etapa menos árdua. Entre esses quero agradecer:
À DEUS, por ter derramado sobre mim as bênçãos necessárias para que
pudesse concluir está etapa de minha jornada.
À Universidade Federal do Piauí, por meio do Programa de Pós-graduação
em Alimentos e Nutrição, em especial a coordenação do mestrado pelo trabalho que
executam.
Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição,
pelo conhecimento transmitido.
Especialmente, à Prof. Drª. Maria Christina Sanches Muratori, por ter
conduzido a minha orientação, pela transferência de saberes, confiança,
acolhimento e ensinamentos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela bolsa de estudos concedida.
À todas as companheiras do Programa de Pós-Graduação, com os quais
compartilhei experiências e incentivo, pois não poderia deixar de expressar o meu
carinho por vocês e em especial: Ana Paula, Amanda Romero, Érika Pinheiro,
Janice Lustosa, Mariana de Morais e Rosália Torres, que habitam meu coração!
Ao professor Dr. João Batista, membro da banca examinadora da
qualificação do projeto, por sua solicitude e gentileza, além das preciosas
contribuições oferecidas. E aos professores da banca examinadora da dissertação:
Dr. Carlos Alberto da Rocha Rosa, Drª. Lidiana de Siqueira Nunes Ramos,
Drª. Maria Marlúcia Gomes Pereira, pessoas que respeito e admiro pela
competência profissional que possuem, por terem contribuído com meu
conhecimento técnico-científico, pela atenção dispensada e valiosas sugestões
apresentadas.
À Profª. Drª. Waleska Albuquerque por ter contribuído com a realização
desta pesquisa ao ceder gentilmente o laboratório para execução das análises.
À amigas para vida toda que conquistei nessa jornada: Julliet Texeira,
Raizza Escórcio, Verbena Alves e Cristiane Evangelista, pelo apoio e inestimável
colaboração na realização das análises laboratoriais. Sinto-me abençoada por ter a
preciosa e imprescindível amizade de todas!!!
À toda família NUEPPA (Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de
Alimentos), especialmente aos amigos: Rodrigo Calvet e Cecília Guimarães pelos
ensinamentos, solicitude e atenção sempre.
Aos meus amigos, pelo incentivo e pela paciência com as minhas ausências.
Aos proprietários e funcionários das panificadoras onde foram realizadas as
coletas amostrais pela contribuição para que o trabalho fosse concretizado.
À todos vocês, e àqueles que eu possa ter deixado de nomear, muito
obrigada!
“Compreendi que tudo em nossas vidas,
todas as coisas que gastam tanto do nosso
tempo e da nossa energia para construir,
tudo é passageiro, tudo é feito de areia; o
que permanece é só o relacionamento que
temos com as outras pessoas. Mais cedo ou
mais tarde, uma onda virá e destruirá ou
apagará o que levamos tanto tempo para
construir. E quando isso acontecer, somente
aquele que tiver as mãos de outro alguém
para segurar, será capaz de rir e recomeçar”.
William Shakespeare
RESUMO
O trigo é um cereal que compõe expressiva parte da dieta de aproximadamente um
terço da população mundial. Os grãos de cereais em função de suas características
estão sujeitos à contaminação por fungos, incluindo aqueles produtores de
micotoxinas. Essa contaminação pode ocorrer no campo, durante a colheita e no
armazenamento. As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos que podem
ocasionar efeitos adversos, como: carcinogênese, teratogênese, nefrotoxicidade e
imunossupressão. Aspergillus, Penicillium e Fusarium são os gêneros mais
frequentemente envolvidos em casos de micotoxicoses em humanos. Em geral, as
micotoxinas são compostos termoestáveis que permanecem viáveis mesmo quando
submetidas a elevadas temperaturas, o que justifica sua presença em alimentos
produzidos a partir de cereais contaminados. Objetivou-se por meio do presente
estudo verificar a interferência da farinha de trigo na qualidade micológica e
micotoxicológica do pão tipo francês. Para isso, foram efetuadas, uma vez por
semana, durante 15 semanas, em duas panificadoras de Teresina, PI, coletas de:
farinha de trigo e de pão tipo francês preparados a partir da farinha de trigo contida
na mesma embalagem coletada para análises. As variáveis avaliadas foram:
temperatura ambiental; umidade relativa do ar (URA); atividade de água (Aa);
contagem de fungos filamentosos e leveduras; isolamento e identificação de gêneros
micotoxigênicos; perfil toxígeno de espécies fúngicas por cromatografia de camada
delgada (CCD); e detecção de aflatoxina B1 e ochratoxina A por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE). Os valores médios das contagens de fungos
filamentos e leveduras nas amostras de farinha de trigo e de pães tipo francês foram
inferiores a 3,00 UFC.g-1 em log10(x+1). Os gêneros fúngicos prevalentes foram:
Cladosporium, Aspergillus e seus teleomorfos, Penicillium e Mucor. No estudo foi
isolada uma cepa de A. niger, porém essa não apresentou potencial toxígeno. Na
totalidade amostral não foram detectadas aflatoxina B1 e ochratoxina A, o que pode
ser explicado pelas condições de URA e de Aa não favoráveis à síntese de
micotoxinas. Concluiu-se que a farinha de trigo empregada na fabricação de pães
tipo francês intervém na qualidade micológica e micotoxicológica dos pães
preparados; e que os produtos sob os aspectos micotoxicológicos averiguados são
seguros ao consumo.
Palavras-chaves: Fungos. Aflatoxina B1. Ochratoxina A.
ABSTRACT
Wheat is a cereal that composes a significant part of the diet of approximately one
third of the world population. Cereal grains due to its characteristics are exposed to
contamination by fungi, including those mycotoxins producers. This contamination
may occur in the field, during harvest and storage. Mycotoxins are toxic secondary
metabolites that can cause adverse effects, such as: carcinogenesis, teratogenesis,
nephrotoxicity and immunosuppression. Aspergillus, Penicillium and Fusarium are
the more frequently genres involved in cases of mycotoxicosis in humans. In general,
mycotoxins are thermostable compounds that remain viable even when exposed to
high temperatures, which justifies its presence in foods produced from contaminated
cereals. The objective of this study was to verify the interference of wheat flour in the
mycological and mycotoxicological quality of French type breads. For this, were
made, once a week, during 15 weeks, in two bakeries in Teresina, PI, collections of:
wheat flour and French type bread prepared from wheat flour contained in the same
package collected for analysis. The variables evaluated were: ambient temperature,
air relative humidity (RH), water activity (Aw); filamentous fungal and yeasts plate
counts; isolation and identification of mycotoxigenic genres; toxigenic profile of fungal
species by thin layer chromatography (TLC), and detection of aflatoxin B1 and
ochratoxin A by high performance liquid chromatography (HPLC). The mean values
of filamentous fungal counts and yeasts in samples of wheat flours and French type
breads were less than 3.00 CFU g-1 in log10(x+1). The prevalent fungal genres were
Cladosporium, Aspergillus and its teleomorphs, Penicillium and Mucor. One strain of
A. niger was isolated in the study, but these didn’t present toxigenic potential.
Aflatoxin B1 and ochratoxin A were not detected in total sample, which can be
explained by the RH and Aw conditions not favorable to the synthesis of mycotoxins.
It was concluded that the wheat flour used in the French type bread manufacturing
affects the mycological and mycotoxicological quality of breads made, and the
products under the mycotoxicological aspects analyzed are safe for consumption.
Keywords: Fungi. Aflatoxin B1. Ochratoxin A.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura da amilose e da amilopectina presentes no amido da
farinha de trigo..............................................................................
22
Figura 2 - Fluxograma resumido da produção de farinha de
trigo................................................................................................
23
Figura 3 - Estruturas químicas de micotoxinas encontradas em
alimentos.......................................................................................
31
Figura 4 - Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero
Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições
de temperaturas...........................................................................
39
Figura 5 - Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero
Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N
em três regimes de temperatura (5, 25 e 37 °C)...........................
39
Figura 6 - Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos
diferentes meios de cultivo até sua identificação final...................
40
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Fungos e micotoxinas de importância mundial............................. 30
Tabela 2 - Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pão
tipo francês produzidos em duas panificadoras
teresinenses.................................................................................
45
Tabela 3 - Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha
de trigo e pão tipo francês adquiridos em panificadoras de
Teresina, PI................................................................................
46
Tabela 4 - Gêneros de fungos filamentosos isolados em amostras de
farinha de trigo e pão tipo francês adquiridas em panificadoras
de Teresina, PI..............................................................................
48
Tabela 5 - Espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium
isoladas em amostras de farinha de trigo e pão tipo francês
adquiridos em panificadoras de Teresina, PI................................
50
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
a.C Antes de Cristo
Aa Atividade de Água
ABIP Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria
AF Aflatoxinas
AFB1 Aflatoxina B1
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BDA Ágar Dextrose Batata
°C Graus Celsius
CCD Cromatografia de Camada Delgada
CLA Ágar Carbation-Leaft
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
CY20S Ágar Extrato de Levedura Czapek Sacarose 20%
CYA Ágar Extrato de Levedura Czapek
DON Deoxinivalenol
DRBC Dichloran Rose Bengal Cloranfenicol
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
g Grama
G25N Ágar Glicerol Nitrato 25%
IARC Agência Internacional Para Pesquisa Sobre o Câncer
ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for
Foods
JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee On Food Additives
Kg Quilograma
LMT Llimites Máximos Tolerados
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MEA Ágar Extrato de Malte
mg Miligrama
mL Mililitro
ng Nanograma
nm Nanômetro
OTA Ochratoxina A
pH Potencial Hidrogeniônico
RDC Resolução de Diretoria Colegiada
SNA Ágar Spezieller Nalvistoffarmer
T2 Toxina T-2
UFC Unidade Formadora de Colônia
URA Umidade Relativa do Ar
USDA United States Department of Agriculture
UV Ultravioleta
WHO World Health Organization
ZEA Zearalenona
μL Microlitros
% Percentual
° Graus
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 15
2 OBJETIVOS......................................................................................................
17
2.1 Objetivo Geral................................................................................................
2.2 Objetivos Específicos.....................................................................................
17
17
3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................
18
3.1 Produção e Consumo do Trigo...................................................................... 19
3.2 Derivados do Trigo......................................................................................... 20
3.2.1 Farinha de Trigo.......................................................................................... 20
3.2.2 Pão.............................................................................................................. 24
3.3 Fungos e Micotoxinas em Alimentos.............................................................. 25
3.3.1 Aflatoxinas................................................................................................... 32
3.3.2 Ochratoxinas............................................................................................... 33
3.3.3 Legislação Brasileira para Micotoxinas....................................................... 35
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................
36
4.1 Coleta das Amostras...................................................................................... 36
4.2 Temperatura Ambiental e Umidade Relativa do Ar (URA)............................. 37
4.3 Análise da Atividade de Água (Aa)................................................................. 37
4.4 Contagem de Fungos Filamentosos e Leveduras.......................................... 37
4.5 Isolamento e Identificação Fúngica................................................................ 38
4.6 Perfil Toxígeno das Espécies Isoladas.......................................................... 41
4.6.1 Produção de Aflatoxinas por Aspergillus da seção Flavi............................ 41
4.6.2 Produção de Ochratoxina A por Aspergillus da seção Nigri....................... 41
4.7 Detecção e Quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) em Amostras de Farinha de Trigo e Pães Tipo
Francês................................................................................................................
42
4.7.1 Extração e Purificação dos Extratos........................................................... 42
4.7.2 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de
Aflatoxina B1.........................................................................................................
43
4.7.3 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de
Ochratoxina A.......................................................................................................
43
4.8 Análise Estatística.......................................................................................... 44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................
45
6 CONCLUSÃO...................................................................................................
54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 55
15
1 INTRODUÇÃO
Os cereais desempenham papel fundamental na alimentação humana,
em âmbito de saúde, como fonte de nutrientes e fibras e, tecnologicamente, em
decorrência de suas múltiplas formas de consumo (SCHEUER et al., 2011;
PAÍGA et al., 2012). Dentre os cereais cultivados, o trigo
(Triticum aestivum L.) é um dos mais consumidos, juntamente com o milho e o
arroz, sendo considerado alimento básico de aproximadamente um terço da
população mundial, em virtude da sua diversidade de utilização, suas
características nutricionais e sua facilidade de armazenamento
(ZANÃO JÚNIOR et al., 2009; FIOREZE, 2011).
Dentre as farinhas dos distintos cereais, apenas a do trigo possui a
propriedade de formar uma massa viscoelástica que retém os gases liberados
durante a fermentação da massa e forneamento de produtos de panificação, e as
proteínas do glúten são as principais responsáveis por essa particularidade
(GALERA, 2006; KIRINUS et al., 2010). Isso permite que aproximadamente 70%
da produção mundial de trigo sejam utilizadas como alimento, predominantemente
na forma de farinha em massas alimentícias, cereais matinais, biscoitos, bolos e
pães (CARDOSO, 2007).
O pão constitui parte da cultura de muitos povos, exibindo significado
importante em distintas religiões, sendo um dos produtos mais consumidos no
mundo (SILVA; MADEIRA, 2011). Apresenta relevância por fornecer mais
nutrientes para a população global do que qualquer outra fonte única de
alimentação. É particularmente importante como fonte de carboidratos, proteínas
e vitaminas B e E. Esse alimento é um produto de consumo diário, altamente
demandado e, por vezes, de estocagem longa, o que pode propiciar o surgimento
de contaminações microbianas (JUAN et al., 2008).
Grãos de cereais, como o trigo, são facilmente colonizados por fungos
sintetizadores de micotoxinas, contaminando os grãos no campo, antes mesmo
da colheita ou durante o armazenamento, permanecendo nos alimentos e rações
destinados ao consumo humano e animal (RUPOLLO et al., 2006;
SIEGEL; BABUSCIO, 2011; ALBORCH et al., 2012).
16
As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos produzidos por
fungos filamentosos, predominantemente dos gêneros Aspergillus, Penicillium e
Fusarium, sob condições ambientais oportunas (OUESLATI et al., 2011).
Alimentos que repetidamente são associados à contaminação com micotoxinas
incluem: trigo, milho, arroz, cevada, leite, queijo, amendoim e algodão
(SOLEIMANY et al., 2011). Em geral, essas toxinas são compostos
termorresistentes (KABAK, 2009) que não se degradam completamente sob
temperaturas elevadas (MURPHY et al., 2006). Assim, as micotoxinas podem
contaminar diversos alimentos derivados de cereais e intoxicar os consumidores
desses gêneros (OERKE et al., 2010; IBÁÑEZ-VEA et al., 2011).
A Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (IARC) cientifica
que a contaminação por micotoxinas é preocupante para a saúde humana e
animal, pelos efeitos: carcinogênicos, teratogênicos e mutagênicos (IARC, 2002).
Estima-se que 25 a 40% dos cereais consumidos mundialmente estão
contaminados por micotoxinas (RIBA et al., 2010), existindo, desse modo, uma
exigência permanente de se resguardar a saúde da população consumidora,
restringindo sua exposição a essas toxinas (RASCH et al., 2010).
O Brasil, por ser um país tropical, possui condições climáticas favoráveis
para a proliferação de fungos micotoxigênicos, além de, por vezes, apresentar
condições inadequadas de plantio, colheita, secagem, transporte e de
armazenamento de produtos agrícolas. Nos países tropicais, as perdas
acarretadas por fungos podem chegar até 30%, sobretudo, em decorrência das
elevadas temperaturas e umidades relativas (LOPES et al., 2005).
O trigo é um alimento que exerce significativa importância como
componente alimentar fazendo parte da alimentação humana diária, o que requer
um controle de qualidade eficiente quanto à presença de fungos e micotoxinas,
uma vez que esses podem estar presentes tanto na farinha de trigo, quanto em
seus derivados, mesmo quando submetidos a tratamentos térmicos, posto que as
micotoxinas são termorresistentes.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Verificar a interferência da farinha de trigo na qualidade micológica e
micotoxicológica do pão tipo francês.
2.2 Objetivos Específicos
Efetuar a contagem dos fungos filamentosos e leveduras presentes
em farinhas de trigo e pães tipo francês;
Isolar e identificar espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e
Fusarium presentes em farinhas de trigo e pães tipo francês;
Caracterizar o perfil toxígeno das espécies fúngicas isoladas por
cromatografia em camada delgada (CCD);
Detectar e quantificar aflatoxina B1 e ochratoxina A em farinhas de
trigo e pães tipo francês por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE).
18
3 REVISÃO DE LITERATURA
O trigo (Triticum aestivum L.) é considerado como um cereal básico para a
civilização e seu cultivo acompanha paralelamente à história da humanidade
(VALÉRIO et al., 2009). A planta trigo resultou do cruzamento de espécies
silvestres de gramíneas que existiam nas proximidades dos rios Tigre e Eufrates,
na Ásia, por volta de 10.000 a 15.000 a.C (BOSCHINI, 2010). Esse cereal foi um
dos primeiros vegetais cultivados pelo homem, entre 7.000 e 9.000 a.C.,
passando por amplo processo de expansão por todo o mundo, e por 8.000 anos
tem sido à base da alimentação das principais civilizações da Europa, Ásia e
África (VESOHOSKI et al., 2011).
Dentre as distintas espécies de trigo cultivadas, a de maior relevância é a
Triticum aestivum, ou trigo comum, que representa cerca de 90% do total do trigo
produzido nos Estados Unidos, um dos grandes produtores mundiais. As outras
espécies são Triticum durum, Triticum compactum, Triticum turgidum, Triticum
dicoccum, Triticum spelta e Triticum polonicum (CARDOSO, 2007).
O trigo exprime significativa importância para o mundo, havendo crescente
demanda da população por derivados desse cereal. Os principais fatores que
limitam ou comprometem a sua produtividade estão relacionados: às condições
climáticas das principais regiões produtoras, do Brasil e dos países
tradicionalmente fornecedores; e às várias doenças agressoras dessa cultura
(DEL PONTE et al., 2004; TANAKA et al., 2008).
Os danos acarretados por doenças na cultura do trigo são variados
notadamente porque múltiplos fatores interferem no estabelecimento e
desenvolvimento das epidemias, como as condições ambientais, a maior ou
menor suscetibilidade das cultivares, a agressividade dos patógenos, a época do
início da infecção, entre outros (MARINI et al., 2011).
As doenças bióticas do trigo podem ser distribuídas em quatro grandes
grupos: doenças causadas por fungos; por bactérias; por vírus e por nematoides
(GARCIA JÚNIOR, 2006). As doenças fúngicas que acometem a parte aérea
dessa cultura, como a ferrugem da folha e as manchas foliares, assim como as
19
que injuriam a espiga com os grãos, como a fusariose, podem ser responsáveis
pela redução da produtividade e aumento do custo de produção, em virtude da
necessidade contínua de utilização de fungicidas para o seu controle
(TANAKA et al., 2008; LENZ et al., 2011). As alterações causadas por fungos no
trigo, como: odor, descoloração, produção de toxinas, diminuição de peso,
aquecimento, mudanças bioquímicas e redução do poder germinativo da
semente; afetam substancialmente sua qualidade, contribuindo para a
desvalorização desse cereal e produtos derivados (ROCHA JÚNIOR, 2003).
O trigo, em condições inadequadas de secagem e armazenamento, pode
sofrer alterações enzimáticas e não enzimáticas, reológicas, físicas, químicas e
microbiológicas (DELIBERALI et al., 2010).
A microbiota dos grãos de cereais, como o trigo, é formada
majoritariamente por micro-organismos oriundos do solo, que podem ser
classificados em dois tipos: os que, por vezes, desaparecem depois da colheita, e
os que persistem nos grãos durante o armazenamento (MOLARD;
GAHAGNIER, 1993). Outros micro-organismos contaminam os grãos durante o
processamento, por falhas de higiene durante o processo de fabricação da farinha
(ICMSF, 2005).
Grãos de cereais íntegros comumente possuem reduzida carga
microbiana, contudo, em consequência da umidade ambiental e ineficientes
procedimentos de limpeza dos equipamentos, tal carga pode aumentar com
destaque para os fungos, principalmente dos gêneros Aspergillus, Eurotium e
Penicillium (LOPES; FRANCO, 2006). Conídios de fungos existentes em farinhas
podem resistir por diversos anos, e, portanto, cuidados devem ser tomados no
armazenamento da farinha (GASHGARI et al., 2010). O controle da umidade é
particularmente importante, visto que farinhas com umidade inferior a 12% não
permitem a multiplicação microbiana (ICMSF, 2005).
3.1 Produção e Consumo do Trigo
O trigo é o segundo alimento mais produzido, em volume, no mundo,
superado apenas pelo milho. Na safra de 2012/2013, a produção mundial de trigo
20
foi de 655,110 milhões de toneladas e os maiores países produtores foram: China
(17,77%), Índia (12,46%) e os Estados Unidos (9,27%). A produção do Brasil foi
de 4,8 milhões de toneladas (0,73% da produção mundial) (USDA, 2013), sendo
que os Estados do Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina responderam por
90% da produção total (CONAB, 2012; EMBRAPA, 2013).
Conforme a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), em 2012, o
Brasil consumiu 10,4 milhões de toneladas desse cereal, importando grande parte
da Argentina e dos Estados Unidos. No entanto, a produção brasileira não tem
sido suficiente para atender à demanda interna, situação essa agravada pela
elevada quantidade de grãos perdidos ou colhidos com qualidade inferior por
causa do ataque de pragas, germinação na espiga e redução de matéria seca que
acontecem pelo retardo na colheita (GUTKOSKI et al., 2008). A falta de incentivo
à produção, a pequena área cultivada e os baixos tetos de produtividade também
cooperam para o déficit anual na produção brasileira de trigo. Contudo, a cultura
do trigo no Brasil vem alcançando, a cada dia, maior importância frente aos
países produtores e exportadores, alicerçada nos ganhos de produtividade, na
rentabilidade e na melhoria da qualidade industrial (TIBOLA et al., 2008;
BOSCHINI, 2010).
O consumo de trigo nos países tropicais tem aumentado de 2,0 a 5,0% ao
ano (COSTA et al., 2008). No Brasil, o consumo da farinha de trigo distribui-se
entre padarias (47%), consumo doméstico (20%), indústria de massas (14%),
indústria de biscoitos (8,0%), indústria de pães (5,0%) e outros segmentos (6,0%)
(COSTA, 2009).
3.2 Derivados do Trigo
3.2.1 Farinha de Trigo
A Instrução Normativa Nº 8, de dois de junho de 2005 do MAPA, define
farinha de trigo como: produto elaborado com grãos de trigo (Triticum aestivum L.)
ou outras espécies de trigo do gênero Triticum, ou combinações por meio de
trituração ou moagem e outras tecnologias ou processos (BRASIL, 2005).
21
A farinha de trigo, em base seca, é composta por aproximadamente 12%
de proteínas, 72 a 78% de carboidratos, 2,5% de lipídios e menos de 0,5% de
cinzas (SINGER, 2006). No entanto, essa composição pode ser modificada de
acordo com a variedade do trigo e o grau de extração (MATUDA, 2008).
As proteínas totais do trigo dividem-se em solúveis e insolúveis do glúten
(FONSECA, 2006). As solúveis (albumina e globulina) representam 15% do total e
são classificadas em razão da funcionalidade como proteínas não formadoras do
glúten. E as insolúveis do glúten (gliadina e gluteína) constituem 85% das
proteínas e conferem as propriedades de panificação da farinha. Quando
completamente hidratada, a gliadina produz uma massa fluida e viscosa,
enquanto que a gluteína forma uma massa extremamente rígida e elástica. A
gliadina (com pontes dissulfeto intramoleculares) é coesiva e apresenta alta
extensibilidade e baixa elasticidade. Em outras palavras, é altamente capaz de
ser esticada com a aplicação de uma força, todavia apresenta capacidade
limitada de retornar à forma inicial após a supressão dessa força. A gluteína (com
pontes de dissulfeto inter e intramoleculares), por outro lado, apesar de também
ser coesiva, apresenta uma baixa extensibilidade e alta elasticidade. É capaz de
ser esticada até certo limite, mas retrocede velozmente à sua forma original com a
remoção da força empregada. O glúten, por conseguinte, possui propriedades
viscoelásticas que combinam os dois componentes
(EL-DASH, 1990; ESTELLER, 2004; MATUDA, 2008).
As características principais do glúten que afetam sua qualidade de
panificação são: tipo de proteínas presentes; quantidade e proporção dos grupos
proteicos. Farinhas com quantidades idênticas de proteína podem diferir em
qualidade, em função de diferenças nas proporções e nas características das
frações da proteína do glúten (CARDOSO, 2007).
O principal carboidrato componente da farinha de trigo é o amido,
responsável por aproximadamente 65% da sua composição. O amido apresenta-
se em forma de grânulos, sendo seu tamanho e formato característicos de sua
origem botânica. A Figura 1 evidencia os maiores componentes do amido:
amilose (23%) e amilopectina (73%). A amilose é um polímero de cadeia linear
com ligações glicosídicas α-1,4, enquanto que a amilopectina é uma estrutura
22
altamente ramificada formada por ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6
(STAUFFER, 1998).
Fonte: MATUDA (2008).
Figura 1 - Estrutura da amilose e da amilopectina presentes no amido da
farinha de trigo.
Da farinha de trigo consumida no Brasil, apenas pode-se considerar
genuinamente nacional aquela farinha proveniente dos grãos de trigo cultivados
nesse país. Assim, no Brasil, consomem-se farinhas obtidas de grãos de trigo de
origem nacional, farinhas obtidas de grãos de trigo importados processadas no
país de origem, bem como farinhas produzidas a partir de grãos de trigo
importados processadas no território brasileiro (COSTA et al., 2008). O
fluxograma simplificado da produção da farinha de trigo encontra-se na Figura 2.
23
Fonte: LOPES e FRANCO (2006).
Figura 2 - Fluxograma resumido da produção de farinha de trigo.
A farinha de trigo, por ser um produto resultante do beneficiamento de uma
matéria-prima alimentar em estado bruto, constitui um alimento passível de sofrer
alterações na sua qualidade nutricional e tecnológica durante a operação de
transporte envolvida no processo de importação. O ágio e deságio na avaliação
do mercado do trigo, seja ele na forma de grãos ou na forma já processada de
farinha, são determinados por diferenças de peso hectolitro, força geral do glúten,
tempo de mistura, estabilidade da massa, porcentagem de mistura de grãos
danificados, presença de resíduos de agrotóxicos, além da quantidade de
micotoxinas (COSTA et al., 2008).
Os grãos de trigo armazenados com teor de atividade de água igual ou
menor que 0,70 (<14,5% de umidade em peso), comumente, não estão sujeitos à
deterioração por fungos e a síntese de micotoxinas. O trigo sofre sua primeira
transformação em processos de moagem para a fabricação de farinha. A farinha
de trigo apresenta características que podem promover o desenvolvimento de
RECEPÇÃO DOS GRÃOS
ESTOCAGEM
LIMPEZA
MOLHAGEM
MOAGEM
ESTOCAGEM DA FARINHA
ENSACAMENTO
ESTOCAGEM
EXPEDIÇÃO
24
fungos e a produção de micotoxinas (ALDRED; MAGAN, 2004). Sendo que
farinhas de trigo com micotoxinas podem transferir sua contaminação para seus
produtos derivados, como o pão. A fonte de contaminação do pão por micotoxinas
pode ser direta, uma vez que possíveis micotoxinas na farinha de trigo não são
suficientemente eliminadas durante a fermentação e o cozimento
(VALLE-ALGARRA et al., 2009), ou indireta, visto que a farinha pode contaminar
o ar do local de sua manipulação, e esse os pães cozidos ali presentes
(DUARTE, 2010b).
3.2.2 Pão
A Resolução RDC nº 263, de 22 de setembro de 2005, define pão como o
produto obtido da farinha de trigo e/ou outras farinhas, adicionado de líquido,
resultante do processo de fermentação ou não e cocção, podendo conter outros
ingredientes, desde que não descaracterizem o produto. Pode apresentar
cobertura, recheio, formato e textura diversos (BRASIL, 2005).
O pão é composto de farinha de trigo, água, fermento biológico e sal
(cloreto de sódio). Entretanto, outros componentes podem ser adicionados como
gorduras, açúcares, ovos, leite, aditivos, entre outros (CANELLA-RAWLS, 2005;
GANDRA et al., 2008). Esses ingredientes apresentam maior ou menor nível de
importância em função do tipo de pão que se deseja fabricar. Contudo, de
maneira geral, os ingredientes complementares melhoram aspectos de maciez e
textura dos produtos, aumentam a vida de prateleira dos pães, bem como
modificam o sabor e o valor nutricional (PIMENTEL et al., 2011).
Cada vez mais pesquisas relacionadas ao pão vêm sendo desenvolvidas,
sobretudo sob o aspecto nutricional. Esse alimento possui elevado valor calórico,
fornecendo, em média, 19% das necessidades energéticas diárias, além de
conter ácidos graxos, aminoácidos, elementos minerais e as vitaminas A, B1, B2,
C, D, E e K (GUTKOSKI et al., 2007).
O pão é considerado um produto popular, podendo ser consumido na
forma de lanches ou junto com refeições (BORGES et al., 2011). No Brasil, o pão
tipo francês é o mais consumido (ABIP, 2012), sendo definido como produto
25
fermentado, preparado, obrigatoriamente, com farinha de trigo, sal (cloreto de
sódio) e água, que se caracteriza por apresentar casca crocante de cor uniforme
castanho-dourada e miolo de cor branco-creme de textura e granulação fina não
uniforme (BRASIL, 2000).
O consumo de pão pela população brasileira é de 33,5 Kg.habitante-1.ano-1,
quantidade inferior à recomendada por órgãos mundiais de alimentação como a
WHO (World Health Organization), cuja recomendação é de
60,0 Kg.habitante-1.ano-1 e à sugerida pela FAO (Food and Agriculture
Organization of the United Nations) (50,0 Kg.habitante-1.ano-1). Em relação a
outros países, o consumo no Brasil também é baixo, por exemplo, na Argentina,
são consumidos 82,5 Kg.habitante-1.ano-1 e, no Chile, 98,0 Kg.habitante-1.ano-1
(ABIP, 2012).
O segmento da panificação é um dos que mais se desenvolvem na
economia brasileira, estando entre os seis maiores segmentos industriais. Sua
participação no setor industrial de produtos alimentícios é de 36,2%, e na indústria
de transformação é igual a 7,0%; incorporando em torno de 63,2 mil empresas em
todo o país, onde por volta de 60,0 mil são de micro ou pequeno porte. Essas
recebem cerca de 43,23 milhões de clientes, gerando 780 mil empregos diretos e
1,8 milhões indiretos. No ano de 2011, o faturamento do segmento de panificação
atingiu, aproximadamente, 62,99 bilhões de reais (ABIP, 2012).
Porém, gêneros de panificação são facilmente contaminados por micro-
organismos, sendo esses tidos como os principais causadores de deteriorações, o
que gera prejuízos econômicos. Degradações ocasionadas por fungos
representam perdas entre 1,0 e 5,0% da produção, dependendo da estação do
ano, do tipo de produto a ser produzido e do método de transformação
empregado (GUYNOT et al., 2002; OSNAYA et al., 2006).
3.3 Fungos e Micotoxinas em Alimentos
Os micro-organismos de interesse em alimentos são distribuídos em três
grandes grupos: bactérias, leveduras e fungos. Certos vírus e parasitas são,
26
também, geradores de problemas de saúde pública, podendo ser veiculados por
alimentos (ANDRADE, 2006).
Os fungos são organismos eucarióticos cujos núcleos são dispersos em um
micélio continuo ou septado e a sua nutrição é obtida por absorção. São
organismos saprofíticos, parasitas facultativos ou biotróficos. Crescem como
célula única (leveduras) ou como colônias filamentosas multicelulares (fungos
filamentosos). Localizam-se em abundância no solo, no água e nos vegetais e se
reproduzem por meios de ciclos telemorfos e anamorfos (TRABULSI et al., 2008).
Os fungos constituem um grupo diversificado de organismos que
apresentam significância ecológica e econômica. Cerca de 70 mil espécies de
fungos já foram descritas, entretanto, estima-se que o número total seja de
aproximadamente 1,5 milhão. Esses organismos são importantes por múltiplas
razões: são os decompositores primários em todos os ecossistemas terrestres,
constituem associações simbióticas com plantas vasculares (micorrizas),
compõem a maioria dos patógenos de plantas, oferecem sistemas genéticos para
os biologistas moleculares, e são cruciais para a biotecnologia industrial
(LI et al., 2000).
Amplamente distribuídos na natureza, os fungos necessitam de substratos
para o seu crescimento. Por isso são contaminantes corriqueiros de alimentos,
grãos e rações, os quais contêm nutrientes como carboidratos, proteínas e
lipídeos, constituintes apropriados para o pleno desenvolvimento desses micro-
organismos (GOURAMA; BULLERMAN, 1995; MEIRELLES et al., 2006).
O homem tem conhecimento dos fungos que crescem em alimentos desde
a antiguidade, e os tem utilizado em seu benefício próprio como alimento direto,
para melhorar alimentos e notadamente para fins terapêuticos (antibióticos). Mas,
em decorrência de espécies de fungos contaminarem alimentos, ocasionando
degradações e produção de micotoxinas, esses são responsáveis por perdas
econômicas relevantes em todo o mundo (SILVA et al., 2008;
AMORIM et al., 2010).
A palavra micotoxina deriva do grego mikes (fungo) e do latim toxicum
(veneno), ou seja, toxina produzida por fungos em condições específicas
27
(SCUSSEL, 1998). Os fungos produtores de micotoxinas são conhecidos como
micotoxigênicos, podendo sintetizar uma ou mais micotoxinas (RAUBER, 2006).
A produção de micotoxinas depende do crescimento fúngico, por
conseguinte pode ocorrer em qualquer época de cultivo, colheita ou estocagem
dos alimentos, e essas podem permanecer nos grãos mesmo após o
desaparecimento de seus fungos produtores; porém, o desenvolvimento fúngico e
a produção de toxinas não são sinônimos, visto que nem sempre as melhores
condições de crescimento coincidem com as de síntese
(TANIWAKI; SILVA, 2001; KAWASHIMA, 2004). Os fungos micotoxigênicos
podem crescer em vários substratos, mas as condições em que micotoxinas são
formadas são específicas de um gênero ou até mesmo de uma espécie fúngica
(COPPOCK; JACOBSEN, 2009).
O crescimento de fungos em alimentos e a produção de micotoxinas são
influenciados por fatores abióticos e bióticos e suas complexas interações. Dentre
esses fatores destacam-se: pH, atividade de água (Aa), concentração de soluto,
temperatura, umidade, composição química do alimento e tempo de
armazenamento. Todavia, Aa e temperatura são os principais determinantes do
crescimento fúngico (BOURAS et al., 2009; GARCIA et al., 2011).
Embora não haja correlação direta entre o crescimento fúngico e a síntese
de micotoxinas, a prevenção do crescimento de fungos conduz eficazmente a
prevenção do acúmulo de micotoxinas (GARCIA et al., 2009).
As micotoxinas são substâncias de ocorrência universal, mas preponderam
em regiões de climas tropicais e subtropicais, onde o desenvolvimento fúngico é
beneficiado pela umidade e temperatura. Os grãos, por exemplo, quando
inadequadamente armazenados, sob condições de elevadas umidade e
temperatura, oferecem condições ideais para o desenvolvimento fúngico e para a
formação de micotoxinas (MALLMANN et al., 2007; TORRADO et al., 2010).
A síntese dessas substâncias é favorecida em teores de umidade relativa do ar
acima de 80% e temperatura ambiental superior a 20 °C (SANTOS et al., 2001).
Os gêneros fúngicos mais associados à produção de micotoxinas
compreendem: Aspergillus, Penicillium e Fusarium (SKRBIC et al., 2011).
28
Os gêneros Aspergillus e Penicillium são comumente deparados como
contaminantes de produtos durante a secagem e o armazenamento, sendo
encontrados numerosamente em armazéns, moinhos, silos, moendas,
elevadores, equipamentos e nos lugares onde são processados produtos
agrícolas (ALHADAS et al., 2004). Já Fusarium são patógenos de plantas e
produzem micotoxinas antes da colheita ou imediatamente após ela
(HERMANNS et al., 2006).
A identificação das espécies fúngicas contaminantes de alimentos é um
sinalizador essencial quanto à presença de micotoxinas nos substratos, e indica o
caminho para precaver a sua síntese. Apesar disso, o isolamento e a identificação
desses fungos não implicam na detecção de micotoxinas em produtos
investigados. Mesmo dentro de um gênero potencialmente toxígeno, nem todas
as espécies produzem toxinas considerando que existem cepas dentro de uma
mesma espécie que não possuem a capacidade para síntese de micotoxinas
(CASTRO et al., 1995; FARIAS et al., 2000).
As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos de fungos filamentosos
e os mecanismos que iniciam sua síntese e deflagram sua súbita interrupção são
desconhecidos. Essas promovem efeitos adversos em seres humanos e animais
(ZARZUELA et al., 2002; RAHMANI et al., 2011) e são encontradas em ampla
escala de produtos agrícolas, como: produtos crus, condimentos, cereais e
alimentos processados fabricados a partir de ingredientes contaminados
(TRUCKSESS; SCOTT, 2008; BERTUZZI et al., 2011;
FREITAS-SILVA; VENÂNCIO, 2011). Dentre os alimentos frequentemente
contaminados com essas toxinas, sobressaem-se: trigo, milho, arroz, aveia,
nozes, leite, queijo, amendoim e algodão (SOLEIMANY et al., 2011;
SIEGEL; BABUSCIO, 2011).
De acordo com a FAO, estima-se que até 25% das culturas alimentares do
mundo, incluindo alimentos básicos, são afetadas por fungos micotoxigênicos e
as perdas globais de alimentos por causa das micotoxinas situam-se na faixa de
1,0 bilhão de toneladas por ano. Apesar dos anos de pesquisa, bem como da
introdução de boas práticas na cadeia de produção, armazenamento e
distribuição de alimentos, essas toxinas continuam a ser um problema, havendo
29
necessidade constante de se proteger a saúde dos suscetíveis, ao limitar sua
exposição à micotoxinas (DUARTE et al., 2010a; FAO, 2013).
A exposição humana à micotoxinas pode acontecer de forma direta, pela
ingestão de alimentos vegetais, e indiretamente por meio de alimentos de origem
animal, quando os animais consomem rações contaminadas (SILVA, 2005).
As micotoxinas, em geral, não são produtos voláteis e permanecem
associados à estrutura dos fungos, conídios ou no substrato em que crescem
(FERNANDES, 2004). Estudos diversos têm demonstrado que as micotoxinas
não são destruídas durante a maioria dos procedimentos de processamento de
alimentos (BULLERMAN; BIANCHINI, 2007; SCUDAMORE et al., 2008;
ALBORCH et al., 2012). Isso significa que os produtos infestados devem ser
destruídos. O problema não pode ser solucionado, por exemplo, misturando
produtos contaminados a grãos sadios ou ainda, dando-os aos animais, posto que
as toxinas acumuladas nesses, podem ser veiculadas ao homem por meio do leite
ou da carne (FAO, 1997a).
O consumo de alimentos contaminados com micotoxinas tem sido
associado a casos de intoxicação humana ou micotoxicoses, resultando até em
morte (GARCIA et al., 2011). Dado que são altamente tóxicas, apresentando
propriedades imunossupressoras, alergênicas, teratogênicas, mutagênicas e/ou
carcinogênicas (GARCIA et al., 2009; KHOMUTOV et al., 2011). Sendo capazes
de desencadear amplos efeitos biológicos em concentrações relativamente
baixas, na faixa de miligrama por quilo a micrograma por quilo (ONO et al., 2004).
Pitt (2012) relata que é importante distinguir-se os efeitos das toxinas
bacterianas em relação ao efeito das micotoxinas. As clássicas toxinas
bacterianas são proteínas que produzem sintomas característicos algumas horas
depois que o corpo as reconhece, com produção de antígenos. Micotoxinas, por
outro lado, são quase todas combinações químicas de baixo peso molecular, que
não são detectadas por antígenos e consequentemente não produzem nenhum
sintoma óbvio. Micotoxinas são venenos insidiosos.
Mais de 500 tipos de micotoxinas são conhecidos, com ampla diversidade
estrutural, o que resulta em diferentes propriedades químicas e físico-químicas
30
(KÖPPEN et al., 2010). As importantes por sua ocorrência e toxicidade são:
aflatoxinas (AF), ochratoxina A (OTA), deoxinivalenol (DON), fumonisinas,
zearalenona (ZEA) e toxina T-2 (T2) (ORTIZ et al., 2006;
LAZICKA; ORZECHOWSKI, 2010).
Espécies de fungos micotoxigênicos pertencentes aos gêneros Aspergillus,
Penicillium e Fusarium que têm importância mundial devido à capacidade de
causar enfermidades e reduzir a produtividade animal foram listadas pela FAO
(2003) e podem ser observadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Fungos e micotoxinas de importância mundial.
Espécie de fungo Micotoxinas producidas
Aspergillus parasiticus Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2
Aspergillus flavus Aflatoxinas B1 e B2
Aspergillus ochraceus Ochratoxina A
Penicillium verrucosum Ochratoxina A
Fusarium sporotrichioides Toxina T-2
Fusarium graminearum Deoxinivalenol, Zearalenona
Fusarium moniliforme Fumonisina B1
Fonte: FAO (2003).
As estruturas químicas das micotoxinas produzidas por fungos são
diversas (Figura 3), assim como as características das micotoxicoses causadas
por esses (ICMSF, 1996).
Com relação à sua carcinogenicidade, as micotoxinas foram classificadas
como: Grupo 1 - carcinogênica para humanos: Aflatoxina B1 (AFB1); Grupo 2 -
possivelmente carcinogênicas: ochratoxina A (OTA) e a fumonisinas; e Grupo 3 -
não carcinogênicas para humanos: tricotecenos e zearalenona
(IARC, 1993, 2002).
31
As técnicas rotineiramente empregadas para a determinação de
micotoxinas são, principalmente: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),
cromatografia em camada delgada (CCD) e imunoensaio enzimático
(ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay). Todavia, qualquer que seja a
técnica escolhida, essa deve ser reprodutível e apresentar baixo limite de
detecção, posto que os limites máximos permitidos para tais compostos são
baixos (ROCHA et al., 2008).
Fonte: MURPHY et al. (2006).
Figura 3 - Estruturas químicas de micotoxinas encontradas em alimentos.
32
3.3.1 Aflatoxinas
As aflatoxinas começaram a ser estudadas em 1960 quando ocorreu um
surto de uma doença denominada Doença "X" dos perus, na Inglaterra, matando
cerca de 100 mil perus e outros animais do campo (CHEN et al., 2001). Essa
doença foi causada por um componente da ração, o farelo de amendoim
proveniente do Brasil, que estava fortemente mofado por Aspergillus flavus. Na
análise química da ração foi descoberta uma série de compostos fluorescentes,
mais tarde denominados aflatoxinas, responsáveis pelo surto
(ZOVICO et al., 1999).
As aflatoxinas são furocumarinas complexas que apresentam intensa
fluorescência quando expostas à luz ultravioleta em ondas longas. São
classificadas de acordo com a cor da fluorescência, em B (blue-azul) ou
G (green-verde), sendo essa propriedade importante para sua identificação em
diversos tipos de alimentos. Essas substâncias são instáveis à luz, porém
estáveis a temperaturas acima de 100 ºC (YOUSEF; MARTH, 1985).
As aflatoxinas são micotoxinas produzidas por linhagens de fungos do
gênero Aspergillus, sobretudo pelas espécies A. flavus e A. parasiticus, as quais
naturalmente podem se desenvolver em alimentos. Essas micotoxinas têm sido
detectadas em sementes de culturas com importância mundial, como: milho,
amendoim, feijão, arroz, trigo, algodão, sorgo, frutas (FACCA; DALZOTO, 2010).
Aflatoxinas possuem elevada toxicidade aguda e crônica, devido à
capacidade de ligar-se a ácidos nucleicos e nucleoproteínas celulares, resultando
em efeitos deletérios sobre a síntese de proteína celular. Todas as aflatoxinas
produzem efeitos adversos e a aflatoxina B1 exprime maior toxidade, seguida
pelas aflatoxinas G1, B2 e G2. Aflatoxina B1 é uma das substâncias mais tóxicas
que ocorrem naturalmente, relatadas até agora. Ingestão de AFB1 por humanos e
animais pode causar hepatite tóxica, hemorragia, edema, imunossupressão,
carcinoma hepático e consequente morte (NAKAI et al., 2008; IDRIS et al., 2010;
ORZETE et al., 2011). Em alimentos contaminados com aflatoxinas, a AFB1,
geralmente, corresponde a 75% dessas (AYUB et al., 1997).
33
Aydin et al. (2008) analisando 100 amostras de farinha de trigo,
encontraram contaminação por AFB1 em 45% das amostras, com teores entre
0,05 µg.kg-1 e 14,01 µg.kg-1. Zinedine et al. (2007) relataram que a incidência de
AFB1 em farinha de trigo comercializada em Marrocos foi de cerca de 17,6%, e
que os níveis de contaminação variaram entre 0,03 µg.kg-1 a 15 µg.kg-1.
Ibáñez-vea et al. (2011) analisando 24 amostras de cereais matinais a base de
trigo quanto à presença de aflatoxinas verificaram ausência de aflatoxinas na
totalidade amostral
3.3.2 Ochratoxinas
As ochratoxinas são micotoxinas encontradas em alimentos, naturalmente
produzidas por fungos das espécies Aspergillus ochraceus, Aspergillus
carbonarius e Penicillium verrucosum. Existem sete tipos de ochratoxinas, e
dentre elas a ochratoxina A (OTA) é a mais abundante e tóxica
(MAGNOLI et al., 2004; WELKE et al., 2009; MARZIERO; BERSOT, 2010).
A OTA foi originalmente descrita como um metabólito secundário de
A. ochraceus, e posteriormente como um metabólito secundário de outros
Aspergillus spp. e Penicillium spp. (CABAÑES et al., 2002; GARCIA et al., 2011).
É caracterizada como um composto formado por uma β-fenilalanina ligada a uma
isocumarina (RUPOLLO et al., 2006).
A ochratoxina A tem sido extensivamente documentada como
contaminante de ampla variedade de alimentos, incluindo: trigo, cevada, milho,
aveia, pão, café, especiarias, nozes, frutas secas, cerveja, vinho, uvas e suco de
uva (KHOURY et al., 2008; KAPETANAKOU et al., 2011). Aproximadamente, 50%
das amostras de trigo, arroz, feijão e milho, analisadas no Brasil, apresentaram
níveis de ochratoxina A (CALDAS et al., 2002).
Estudos têm demonstrado que essa molécula pode ter múltiplos efeitos
toxicológicos, tais como: nefrotóxico, hepatotóxico, neurotóxico, citotóxico,
cancerígeno, teratogênico e imunossupressor. E pode provocar mutações
gênicas, embora o mecanismo de genotoxicidade ainda não tenha sido elucidado
(ALMELA et al., 2007; DUARTE et al., 2010a; EL KHOURY; ATOUI, 2010;
34
LLORENT-MARTÍNEZ et al., 2013), representando risco para a saúde humana e
animal (JECFA, 2001; GIROLAMO et al., 2011). A Agência Internacional para a
Pesquisa sobre o Câncer classificou a ochratoxina A como um possível
cancerígeno humano (categoria 2B) (IARC, 1993).
Com base na avaliação de risco realizada pelo Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food Additives (JECFA), cereais e seus subprodutos contribuem
com mais de 50% da exposição de humanos à OTA (JECFA, 2001).
Conforme Duarte et al. (2010b) essa micotoxina termoestável resiste aos
processos alimentares mais tecnológicos, permitindo sua presença em produtos
fabricados a partir de matérias-primas contaminadas. Desse modo, os fatores que
determinam o nível de incidência e contaminação de grãos de cereais são
ecoados em maior ou menor medida no teor de OTA em produtos derivados.
Esse também é o caso da tecnologia de fabricação de pães, que não é suficiente
para reduzir os níveis de OTA pré-existentes na farinha de trigo
(VALLE-ALGARRA et al., 2009).
Ochratoxina A foi detectada em baixas concentrações no trigo (ARAGUA'S
et al., 2003) e produtos derivados, tal como o pão (LEGARDA; BURDASPAL,
2001). Zinedine et al. (2007) avaliaram 100 amostras de pão vendidos a varejo
em Marrocos e detectaram a presença de OTA em 48% dessas, e os níveis
encontrados variaram entre 0,14 ng.g-1 a 149 ng.g-1. Juan et al. (2008)
examinando os níveis de ochratoxina A em 31 amostras de pão de trigo em
Portugal, encontraram OTA em quatro amostras (12,9%), e a concentração média
foi de 0,02 ng.g-1. Osnaya et al. (2007) encontraram níveis entre 0,04 ng.g-1 e
19,61 ng.g-1 em pão convencional espanhol. Outro estudo espanhol níveis
relatados OTA em pão inferiores a 0,25 ng.g-1 (BLESA et al., 2004).
Embora seja impossível eliminar totalmente a presença de substâncias
indesejáveis como micotoxinas, o monitoramento dessas é importante para
reduzir o seu teor na alimentação humana e animal. O conhecimento e controle
da contaminação por micotoxinas e sua distribuição é objetivo mundial de
produtores, fabricantes e órgãos investigadores e regulamentadores, devido ao
35
impacto econômico e à necessidade de se elevar a segurança alimentar e a
saúde humana (CHELI et al., 2008).
3.3.3 Legislação Brasileira para Micotoxinas
Com o intuito de proteger a saúde dos consumidores contra os efeitos
nocivos das micotoxinas, as legislações têm sido aplicadas em variados países,
estabelecendo os níveis máximos de tolerância, em alimentos in natura e
processados e também em rações para animais de abate e de estimação.
Diversos são os fatores que influenciam o estabelecimento de limites de
tolerância das micotoxinas, como: a) disponibilidade de dados toxicológicos; b)
distribuição das micotoxinas no alimento; c) ocorrência de micotoxinas no
alimento; d) disponibilidade de métodos analíticos; e) proporção de consumo do
alimento na dieta; e f) relações comerciais com outros países. Regulamentos
desnecessariamente restritivos provocam dificuldades aos países importadores
para obter os suprimentos alimentares para a sua população e aos países
exportadores, que terão problemas em encontrar compradores para seus
produtos (CAST, 2003).
Informações coligidas até o ano de 2003 demonstram que cerca de 100
países já dispõem de legislação para regulamentar os limites de micotoxinas em
alimentos e rações. Isso representa um acréscimo de 30% em relação ao ano de
1995. Os países cobertos por essas legislações englobam aproximadamente 90%
da população mundial (FAO, 2003).
Em 2011, foi publicada no Brasil a RDC nº 7 pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) que dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT)
para micotoxinas em alimentos. Segundo essa legislação, em cereais e produtos
de cereais, como é o caso da farinha de trigo e do pão tipo francês, o limite
máximo tolerado de aflatoxina B1, B2, G1 e G2, é de 5,0 g.Kg-1. Concernente a
ochratoxina A, esse limite corresponde a 10,0 g.Kg-1 (BRASIL, 2011).
36
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coleta das Amostras
As amostras (farinha de trigo e pão tipo francês) foram adquiridas em duas
panificadoras (“A” e “B”) localizadas no município de Teresina, PI. Esses
estabelecimentos foram selecionados aleatoriamente a partir do grupo de
panificadoras de médio porte da referida cidade, cujos proprietários assinaram
termo de aceite para participação da pesquisa em questão.
De cada estabelecimento selecionado, foram realizadas, uma vez por
semana, durante 15 semanas, coletas de 300 g de farinha de trigo recolhidos
diretamente de uma embalagem em uso pelos panificadores e 300 g de pães tipo
francês, elaborados a partir de farinha do trigo presente no mesmo fardo que foi
coletada a amostra para as análises. O período total de coletas foi compreendido
entre os meses maio e agosto de 2012.
As farinhas de trigo empregadas pelas panificadoras para o preparo dos
pães tipo francês eram da mesma marca comercial e estavam acondicionadas em
suas embalagens de origem (25,0 Kg) dispostas sob estrados em local comum à
área de preparo dos pães. Os pães produzidos nas referidas panificadoras
apresentavam ingredientes equivalentes em suas formulações (farinha de trigo,
água, cloreto de sódio e fermento) em proporções diferenciadas.
As amostras foram recolhidas, individualmente, em sacos de polietileno de
uso alimentar e encaminhadas ao Laboratório de Análise de Alimentos, do
Departamento de Farmacologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Piauí, para realização das posteriores análises.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com dois
tratamentos e 15 repetições. Os tratamentos foram constituídos pela farinha de
trigo e pelo pão tipo francês.
37
4.2 Temperatura Ambiental e Umidade Relativa do Ar (URA)
No momento das coletas amostrais nos estabelecimentos supracitados, em
pontos próximos às amostras foram efetuadas medições, em duplicata, da
temperatura ambiental e da umidade relativa do ar (URA), por meio de um
termohigrômetro digital Inconterm®.
4.3 Análise da Atividade de Água (Aa)
A análise da atividade de água (Aa) da farinha de trigo e do pão tipo
francês foi efetuada em triplicata por meio de equipamento portátil, modelo PawKit
digital, marca Decagon®, previamente calibrado, conforme metodologia
recomendada pelo fabricante.
4.4 Contagem de Fungos Filamentosos e Leveduras
A contagem de fungos filamentosos e de leveduras em unidades
formadoras de colônias por grama de alimento (UFC.g-1) foi realizada segundo
metodologia de diluição decimal seriada em placas descrita por Pitt e Hocking
(2009).
Foram homogeneizados 25,0 g de cada amostra em 225,0 mL de água
peptonada a 0,1% esterilizada. A partir dessa diluição inicial (10-1) foram
preparadas diluições decimais seriadas até 10-3. A inoculação de cada uma das
diluições foi efetuada em duplicata com alíquotas de 0,1 mL por placa de Petri, na
superfície do meio de cultivo dichloran rose bengal cloranfenicol (DRBC) com
auxílio de alça de Drigalski esterilizada (KING; HOCKING; PITT, 1979). As placas
com DRBC foram incubadas a 25 °C durante sete dias em estufas microbiológicas
com controle eletrônico de temperatura. Transcorrido tal período, todas as placas
foram observadas, sendo selecionadas para contagem aquelas que continham de
10 a 100 UFC.g-1 (DALCERO et al., 1997; DALCERO et al., 1998).
38
4.5 Isolamento e Identificação Fúngica
A identificação, em nível de gênero, de todas as colônias consideradas
como diferentes foi realizada segundo Samson et al. (2000), de acordo com suas
características macro e microscópicas. As colônias fúngicas identificadas como
Aspergillus e Penicillium foram subcultivadas em tubos inclinados de ágar extrato
de malte (MEA) e as de Fusarium utilizaram ágar Spezieller Nalvistoffarmer (SNA)
para a posterior identificação em espécies.
As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Aspergillus spp. foram
identificadas utilizando as chaves de identificação descritas por Klich (2002)
baseada na semeadura padrão em três meios básicos (Figura 4): ágar extrato de
levedura Czapek (CYA); ágar extrato de levedura Czapek sacarose 20% (CY20S);
ágar extrato de malte (MEA). Em microtubos previamente esterilizados preparou-
se o inóculo das cepas isoladas, de acordo com a metodologia descrita por Pitt e
Hocking (1999). Preparou-se uma suspensão de conídios em 0,5 mL de meio
ágar semi-sólido constituído de 0,2% de ágar-ágar e 0,05% de Tween®80. A
suspensão de conídios foi inoculada por meio de alça de platina em forma de
agulha em placas de Petri contendo os meios de cultivo. A agulha foi introduzida
na suspensão e o inóculo foi distribuído para três pontos equidistantes nas placas
com os diferentes meios. Após a inoculação as placas foram incubadas a 25 ºC
por sete dias. Após a incubação, visando à identificação das espécies, foram
observadas suas estruturas micromorfológicas e as características macroscópicas
das colônias (diâmetro, textura, forma, aspecto da superfície e do reverso,
pigmentação dos conídios e pigmento solúvel, produção e cor de exsudado).
39
Fonte: Adaptado de KLICH (2002).
Figura 4 - Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero
Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições
de temperaturas.
As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Penicillium spp. foram
identificadas utilizando as chaves de identificação descritas por Pitt (1988),
baseadas na semeadura em três meios básicos: ágar extrato de levedura Czapek
(CYA); ágar extrato de malte (MEA); e ágar glicerol nitrato 25% (G25N) (Figura 5).
Para maior eficiência e aproveitamento do sistema, inoculou-se as placas de Petri
com duas cepas diferentes a serem testadas; a preparação do inóculo e
inoculação nos meios de cultivo foram igual à utilizada para Aspergillus spp.
Fonte: Adaptado de PITT (1988).
Figura 5 - Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero
Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N
em três regimes de temperatura (5, 25 e 37 °C).
37 ºC
1 1
1
1 1
1
1 1
1
1 1
1
CYA 25 ºC CYA 37 ºC MEA 25 ºC CY20S 25 ºC
CYA
25 ºC
1 1
1
CYA
25 ºC
1 1
1
MEA 5 ºC
CYA
1
2 2
1
2 2
2
MEA
2 2
2
G25N
1
2 2
1
CYA
1
2 2
1
40
As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Fusarium sp. isoladas foram
identificadas pelo método de diluição em placa recomendado por Booth (1971). A
suspensão conidial de cada cepa de Fusarium sp. foi incubada em ágar-ágar
1,5% em placa de Petri em temperatura ambiente por 16 a 18 horas. Decorrido
esse tempo, os conídios foram identificados por microscopia (x 30) e transferidos
com uma agulha para o meio ágar dextrose batata (BDA) e também para o meio
ágar folhas de bananeira (BLA), modificando a metodologia original que emprega
o meio ágar folhas de cravo (CLA), alteração essa descrita por Keller (2009).
Após incubação por 7 a 14 dias (Figura 6), as colônias foram identificadas usando
critérios microscópicos e macroscópicos segundo a chave taxonômica de
Nelson et al. (1983).
Fonte: Adaptado de NELSON et al. (1983) e Keller (2009).
Figura 6 - Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos
diferentes meios de cultivo até sua identificação final.
Colônia crescida NSA
Subcultivo em meio BDA
Cultivo Monospórico
BLA BDA
Classificação
Incubação: 7 dias a 24 ºC Luz branca 12h Luz negra 12h
41
4.6 Perfil Toxígeno das Espécies Isoladas
4.6.1 Produção de Aflatoxinas por Aspergillus da seção Flavi
Para provar a capacidade de produzir aflatoxinas pelas espécies de
Aspergillus da seção Flavi foi utilizada a metodologia descrita por Geisen (1996).
As cepas foram cultivadas em placas de MEA a 25 ºC por sete dias. O micélio foi
transferido para um microtubo tipo Eppendorf e foram adicionados 1000 μL de
clorofórmio. A mistura foi agitada a 4000 rpm por 20 min em temperatura
ambiente, o micélio foi removido e o extrato clorofórmico evaporado. O resíduo foi
re-dissolvido em 200 μL de clorofórmio. Os extratos foram analisados por
cromatografia em camada delgada (CCD) em cromatofolha de sílica gel 60 G de
20 x 20 cm, 0,25 mm de espessura (Merk®, Alemanha). Foram aplicados na
cromatofolha 20 µL de cada extrato e do padrão em pontos equidistantes. A fase
móvel utilizada foi clorofórmio: acetona (90:10, v/v). Após o desenvolvimento por
50 minutos em cromatotanque (cuba) saturado, a cromatofolha foi observada em
cromatovisor sob radiação UV de λ = 365 nm, para evidenciação das manchas
fluorescentes características.
4.6.2 Produção de Ochratoxina A por Aspergillus da seção Nigri
Para provar a capacidade de produzir ochratoxina A pelas espécies de
Aspergillus da seção Nigri foi empregada a metodologia descrita por
Bragulat et al. (2001). As cepas foram cultivadas em ágar extrato de levedura
Czapek (CYA) a 28 ºC por sete dias no escuro. Três pedaços do ágar foram
retirados da área central da colônia, pesados e introduzidos em microtubo tipo
Eppendorf. Um volume de metanol (1000 μL) foi adicionado a cada microtubo, a
mistura de amostras e solvente foi centrifugada por 10 min a 14000 rpm, e o
sobrenadante foi filtrado e evaporado até secagem. O resíduo foi re-dissolvido em
200 μL de metanol. Os extratos foram analisados por cromatografia em camada
delgada (CCD) em cromatofolha de sílica gel 60 G de 20 x 20 cm, 0,25 mm de
espessura, sem indicador de fluorescência (Merk®, Alemanha), segundo a
metodologia da AOAC (Official Method 973.37) (NESHEIM et al., 1973).
42
A cromatografia foi desenvolvida em uma cuba, cujo solvente de corrida foi
composto de tolueno: metanol: ácido acético (90:5:5 v/v). Em seguida, a
cromatofolha foi observada em cromatovisor sob radiação UV de λ = 365 nm.
4.7 Detecção e Quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) em Amostras de Farinha de Trigo e Pães Tipo
Francês
4.7.1 Extração e Purificação dos Extratos
A extração e purificação dos extratos foram realizadas de acordo com a
metodologia descrita por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) e modificada por
Teixeira et al. (2008). Para extração foram utilizados 25 g de amostra, na qual
adicionaram-se 70,0 mL de metanol e 10,0 mL de solução de cloreto de potássio
4,0%. Em seguida a amostra foi submetida a agitação em liquidificador doméstico
por cinco minutos. Após a homogeneização foram adicionados 75,0 mL de
solução clarificante (sulfato de amônio 30%) e 7,5 g de celite. Posteriormente, a
amostra foi submetida novamente a agitação por cinco minutos, seguido de
repouso de 20 minutos. Em seguida, o extrato resultante foi filtrado com auxílio de
papel de filtro Whatman n° 4 (Whatman, Inc., Clifton, New Jersey, E.U.A.).
Do filtrado foi retirada uma alíquota de 50 mL para um frasco tipo Becker, seguida
de adição de 50 mL de água destilada, essa mistura foi transferida para um balão
de decantação de 500 mL, no qual foram adicionados 20 mL de clorofórmio e
agitou-se manualmente por cinco minutos. Decorrido esse tempo, foi aberta a
torneira do balão para retirada do líquido decantado que foi recolhido para um
frasco tipo Erlenmeyer com capacidade para 50 mL, depois foram adicionados
20 mL de clorofórmio ao balão e procedeu-se mais uma agitação manual com
posterior retirada do líquido decantado, de forma a obter 35 mL da fase
clorofórmica no frasco tipo Erlenmeyer. Em seguida, o solvente foi evaporado em
banho-maria a 60 °C por aproximadamente 15 minutos. O extrato seco resultante
foi suspenso em 1,0 mL de clorofórmio e em seguida homogeneizado em agitador
tipo Vortex. Após a suspensão, foi acondicionado em frasco âmbar com
capacidade de 4,0 mL para posterior evaporação do solvente em capela de fluxo
43
laminar. O extrato seco resultante foi armazenado em freezer até o momento da
análise de aflatoxina B1 e ochratoxina A.
4.7.2 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de
Aflatoxina B1
Para determinação e quantificação de AFB1 foi utilizado um cromatógrafo
líquido de alta eficiência (CLAE) SHIMADZU modelo Prominence com detector de
fluorescência (excitação: 360 nm e emissão: 460 nm) modelo RF-10AXL SUPER,
loop de 20 µL, de acordo com a metodologia proposta por Trucksess et al. (1994).
As separações cromatográficas foram realizadas por uma coluna de fase reversa
de sílica gel (150 x 4,6 mm id., 5,0 μm de tamanho de partículas, VARIAN®,
Inc. Palo Alto, EUA).
Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 uL de acetonitrila,
homogeneizado em agitador tipo Vortex, e filtrado com filtro Millex em polietileno
com membrana PTFE 0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). Em
seguida, foi retirada uma alíquota de 200 µL do extrato filtrado e acrescido de
700 µL de solução derivatizante composta de ácido trifluoracético: ácido acético
glacial: água (20:10:70 v/v). A fase móvel utilizada foi acetonitrila: metanol: água
(17:17:66 v/v) a uma vazão de 1,5 mL.min-1. Foram feitas diluições seriadas do
padrão de AFB1 (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, purity > 99%) e análise
no cromatógrafo líquido de alta eficiência para obtenção da curva de calibração,
de onde foram extraídos os limites de detecção e quantificação da técnica.
O limite de detecção do método analítico foi de 0,4 ng.g-1.
4.7.3 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de
Ochratoxina A
Para determinação e quantificação de ochratoxina A foi utilizado um
cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) SHIMADZU®, modelo Prominence
com detector de fluorescência (excitação: 330 nm e emissão: 440 nm) modelo
44
RF-10AXL SUPER, loop de 20 µL, conforme metodologia proposta por
Scudamore e Mcdonald (1998). As separações cromatográficas foram realizadas
por uma coluna de fase reversa de sílica gel (150 x 4,6 mm id., 5,0 μm de
tamanho de partículas, VARIAN®, Inc. Palo Alto, EUA).
Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 uL de metanol,
agitado em Vortex e filtrado com filtros Millex em polietileno com membrana PTFE
0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). A fase móvel utilizada foi
acetonitrila: água: ácido acético (99:99:2 v/v) a uma vazão de 1,0 mL.min-1. Foram
feitas diluições seriadas do padrão de OTA (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO
USA, purity > 99%) e análise no cromatógrafo líquido de alta eficiência para
obtenção da curva de calibração, de onde foram extraídos os limites de detecção
e quantificação da técnica. O limite de detecção do método foi de 0,02 ng.g-1.
4.8 Análise Estatística
Os dados da análise de atividade de água foram submetidos a cálculo de
média ± DP. Os dados das contagens de fungos filamentosos e leveduras foram
transformados em log10(x+1), realizou-se o teste da normalidade e em seguida a
análise de variância e teste U de Wilcoxon Mann-Whitney para comparação das
médias pelo pacote estatístico SigmaStat® v.3,5 (Systat Software, San Jose, CA,
2005) com significância de 5,0%.
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores médios e desvio padrão da temperatura ambiental e da
umidade relativa do ar das panificadoras “A” e “B” foram respectivamente: 32,6 °C
± 2,9 e 43,6% ±17,6; 31,1 °C ±2,7 e 44,3% ±11,4. Segundo Fonseca (2006)
temperaturas maiores que 25 ºC e teores de umidade entre 70 a 100% são
propícios à rápida proliferação de fungos. Desse modo, a temperatura média
verificada nas duas panificadoras proporcionou condições favoráveis à
multiplicação fúngica nas amostras analisadas, no entanto, a umidade relativa do
ar média registrada nas mesmas, apresentou-se como fator limitante.
Os valores médios obtidos de atividade de água em farinha de trigo e pão
tipo francês encontram-se listados na Tabela 2.
Tabela 2 - Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pão
tipo francês produzidos em duas panificadoras teresinenses
Segundo Franco e Landgraf (2008) o valor de atividade de água de 0,60 é
limitante para a multiplicação dos micro-organismos, onde fungos filamentosos
xerofílicos e leveduras osmofílicas desenvolvem-se em Aa com valores mínimos
de 0,65 e 0,60, respectivamente. Assim, o teor médio de atividade de água
determinado em farinha de trigo das panificadoras A e B de respectivamente 0,52
e 0,50 (Tabela 2) situou-se abaixo do limite de multiplicação microbiana, porém,
segundo Gashgari et al. (2010), conídios de fungos podem estar presentes em
farinhas, podendo sobreviver por vários anos.
Embora a atividade de água da farinha de trigo seja baixa para propiciar o
crescimento microbiano em farinhas contaminadas, mudanças no teor de
umidade de 1% ou 2% podem ser suficientes para promover o crescimento de
Panificadoras/
Amostras
Atividade de água (Aa)
Farinha de trigo Pão francês
A 0,52 ± 0,04 0,85 ± 0,02
B 0,50 ± 0,03 0,85 ± 0,03
46
fungos e a produção de micotoxinas (WEIDENBÖRNER et al., 2000;
CABAÑAS et al., 2008; GASHGARI et al., 2010).
Concernente à análise de atividade de água em pães tipo francês, o teor
médio obtido de 0,85 nas panificadoras A e B (Tabela 2) demonstrou-se favorável
ao crescimento de micro-organismos.
Os valores médios das contagens de fungos filamentosos e leveduras em
farinha de trigo e pão tipo francês estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha
de trigo e pão tipo francês adquiridos em panificadoras de
Teresina, PI
Panificadoras/
Amostras
Contagem média de fungos filamentosos e leveduras
(UFC.g-1 em log10(x+1))
Farinha de
trigo CV% Pão francês CV%
A 2,34a ± 1,15 0,5 2,23a ± 1,00 0,4
B 2,14a ± 1,24 0,6 2,90a ± 1,53 0,5
a letras iguais em coluna e linhas, resultados semelhantes (P>0,05) pelo teste de
Mann-Whitney. UFC.g-1 em log10(x+1) = unidades formadoras de colônias por
grama, em logaritmos da base dez, acrescentados de uma unidade.
As panificadoras pesquisadas apresentaram resultados similares em
relação às contagens de fungos filamentosos e de leveduras (P>0,05) nas
amostras de farinha de trigo e de pão tipo francês (Tabela 3). Pode-se constatar
também que a quantidade de fungos isolada na farinha de trigo foi semelhante à
encontrada no pão tipo francês nos dois estabelecimentos analisados, refletindo
que a contaminação pré-existente pode estar presente no produto final, podendo
posteriormente promover alterações organolépticas como sugerem Weidenbörner
et al. (2000) e Berghofer et al. (2003).
47
Ressalta-se que embora tenha níveis baixos de atividade de água, a
farinha de trigo pode conter micro-organismos (BERGHOFER et al., 2003;
CABAÑAS et al., 2008) que, por sua vez, podem contaminam o ambiente. Essa
contaminação ambiental provavelmente foi responsável (WEIDENBÖRNER et al.,
2000) pelas contagens de fungos filamentosos e de leveduras obtidas nos pães
tipo francês analisados que apesar de processado em temperaturas que levam à
inativação fúngica, ainda apresentaram presença de fungos. Ademais, os pães
tipo francês analisados estavam expostos, em ambas as panificadoras, à
temperatura ambiente em prateleiras confeccionadas de aço e vidro, onde foi
possível constatar acesso de insetos voadores, como moscas, aos produtos. Esse
fato também pode ter favorecido a contaminação fúngica, em virtude de tais
insetos poderem atuar como veículos transmissores de conídios.
Os valores médios das contagens de fungos filamentos e leveduras nas
amostras de farinha de trigo e de pães do tipo francês foram inferiores a
3,00 UFC.g-1 em log10(x+1) (Tabela 3). Resultados semelhantes foram obtidos por
Riba et al. (2010) e Berghofer et al. (2003), e valores superiores por
Abdullah et al. (1998), Potus e Suchet (1989) e Spicher (1986) em amostras de
farinha de trigo analisadas em diversos países. Apesar da legislação vigente
(BRASIL, 2001) não dispor de parâmetros para contagens fúngicas em farinha de
trigo e pães tipo francês, Cast (2003) considera que valores superiores a
3,00 UFC.g-1 em log10 em alimentos são considerados elevados. Caso ocorra um
aumento da umidade, os fungos filamentosos e leveduras presentes nos pães
podem se desenvolver alterando as características organolépticas do produto e se
for o caso, produzir micotoxinas. Desse modo, a síntese dessas substâncias na
farinha de trigo é preocupante, pois pode representar risco da presença em seus
derivados, mesmo quando esses são submetidos a tratamento térmico.
Os gêneros de fungos filamentosos isolados em amostras de farinha de
trigo e pão tipo francês encontram-se expressos na Tabela 4.
48
Tabela 4 – Gêneros de fungos filamentosos isolados em amostras de
farinha de trigo e pão tipo francês adquiridas em panificadoras
de Teresina, PI
Farinha de trigo Pão francês
Gêneros fúngicos
Números
de
isolados
Ocorrência
(%)
Números
de
isolados
Ocorrência
(%)
Cladosporium spp. 14 31,8 23 76,6
Aspergillus spp. e
teleomorfos 13 29,5 3 10
Penicillium spp. 12 27,3 1 3,3
Fusarium spp. 2 4,5 1 3,3
Mucor spp. 1 2,3 2 6,7
Byssoclamys spp. 1 2,3 - -
Chrysonilia spp. 1 2,3 - -
Total 44 100 30 100
Foram isoladas 74 cepas pertencentes a sete gêneros fúngicos na farinha
de trigo e no pão tipo francês (Tabela 4). Os gêneros prevalentes nas amostras
de farinha de trigo foram: Cladosporium 31,8%, Aspergillus e seus teleomorfos
29,5% e Penicillium 27,3%; e nas de pão tipo francês foram: Cladosporium 76,6%,
Aspergillus 10% e Mucor 6,7%. Os gêneros Cladosporium, Aspergillus e
Penicillium também foram registrados entre os predominantes em farinhas de
trigo por Gashgari et al. (2010), Cabañas et al. (2008) e Berghofer et al. (2003).
Segundo Weidenbörner et al. (2000), a população fúngica apresentada em
subprodutos do trigo, provavelmente, deve-se: a contágios posteriores
(recontaminações) ocorridos no ambiente de processamento, principalmente
pelos propágulos fúngicos presentes nas partículas de farinha suspensas no ar; e
em menor proporção por uma resistência ao tratamento térmico. Como pode ser
49
observado na Tabela 4, os números de isolados pertencentes aos gêneros
Cladosporium e Mucor obtidos a partir de amostras de pães tipo francês foram
superiores aos encontrados nas farinhas de trigo empregadas em seu preparo.
Essa diferenciação deve-se, possivelmente, a uma significativa contaminação
ambiental por propágulos desses gêneros, que por sua vez, contaminaram os
pães.
Apesar do Fusarium spp. ser um gênero com prevalência significativa em
pesquisas com trigo e seus derivados (BERGHOFER et al., 2003;
KOBAYASTI; PIRES, 2011), a detecção desse, no presente estudo, pode ter sido
prejudicada pela alta incidência de fungos saprofíticos (no caso Cladosporium
spp.) uma vez que esses organismos competem com o Fusarium pela superfície
do substrato a ser colonizado, pelo alimento e umidade do ar (GARCIA JUNIOR
et al., 2008).
O gênero Cladosporium presente nos isolados estudados, é um frequente
causador de alergias, sendo essas do Tipo I ou alergias comuns causando febre
do feno e asma; e do Tipo III que é agente de pneumonite por hipersensibilidade
(Testing Laboratory for Mold, 2012). Além disso, Cladosporium, presente em
grãos de trigo armazenados, podem produzir toxinas fusariais que quando
consumidas favorecem a ocorrência de aleucia tóxica alimentar (OLIVEIRA; LIMA,
2013). Essa enfermidade também pode ser aplicada ao consumo de subprodutos
do trigo, como farinha e pães, entretanto, essas toxinas não foram analisadas no
presente estudo, não sendo possível, portanto, avaliar esse risco nas amostras
pesquisadas.
A presença de fungos nos alimentos é indesejável, principalmente dos
gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium, pois compreendem espécies
capazes de produzir enzimas deteriorantes, bem como micotoxinas que
representam risco de contaminação ambiental, acarretando prejuízos à saúde
humana. As toxinas produzidas por espécies desses gêneros podem estar
presentes em alimentos, como os derivados do trigo, que constituem a principal
fonte de exposição para o homem (CORRÊA et al., 1997; BANDO et al., 2007).
50
As espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium isoladas em
amostras de farinha de trigo e pão tipo francês adquiridos em panificadoras de
Teresina, PI encontram-se listados na Tabela 5.
Tabela 5 - Espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium
isoladas em amostras de farinha de trigo e pão tipo francês
adquiridos em panificadoras de Teresina, PI
Espécies
Farinha de trigo Pão francês
Número de
isolados
Ocorrência
(%)
Número de
isolados
Ocorrência
(%)
A. candidus 3 12,5 - -
A. caespitosus 2 8,3 - -
A. oryzae 2 8,3 - -
A. japonicus 1 4,2 - -
A. terreus 1 4,2 - -
A. ostianus 1 4,2 1 20
A. niger agregados - - 1 20
A. versicolor - - 1 20
P. corylophilum 6 25 1 20
P. fellutanum 2 8,3 - -
P. lividum 2 8,3 - -
P. decumbens 1 4,2 - -
P. paxilli 1 4,2 - -
F. graminearum 2 8,3 1 20
Total 24 100 5 100
Dentre as espécies fúngicas identificadas na farinha de trigo, destacou-se o
P. corylophilum com 25% de ocorrência e no pão tipo francês foram encontrados:
A. ostianus, A. niger agregados, A. versicolor, P. corylophilum e F. graminearum
51
(Tabela 5). Excetuando A. ostianus, P. corylophilum e F. graminearum, os demais
fungos isolados na farinha de trigo não estavam presentes nos pães tipo francês,
provavelmente em decorrência da inativação pelo calor durante o processamento.
A ocorrência dos fungos principalmente A. niger agregados e A. versicolor
isolados nos pães pode ter sido proveniente de contaminações por propágulos
fúngicos presentes no ambiente, e pela presença de moscas que infestavam o
ambiente das panificadoras.
Weidenbörner et al. (2000), encontraram prevalência de Aspergillus spp.,
onde o A. candidus foi o fungo preponderante em farinha de trigo. Riba et al.
(2010) isolaram predominantemente espécies de Aspergillus da seção Flavi, em
especial: Aspergillus flavus e Aspergillus tamarii, em trigo e produtos derivados.
Cabañas et al. (2008), identificaram principalmente: Aspergillus flavus, Aspergillus
candidus e Aspergillus versicolor em farinha. Kobayasti e Pires (2011)
encontraram: Cladosporium cladosporioides, Bipolaris sorokiniana, Fusarium
graminearum e Pyricularia grisea em grãos de trigo.
Na presente pesquisa, foi detectado apenas um isolado (Aspergillus niger)
com possível capacidade toxígena, encontrado no pão tipo francês (Tabela 5). Tal
isolado foi submetido ao teste de perfil toxígeno, todavia o mesmo não apresentou
essa habilidade. Devido a não detecção de isolados de Aspergillus pertencentes à
seção Flavi, o teste de perfil toxígeno para aflatoxina não pode ser realizado no
presente estudo como se objetivou.
Cabañas et al. (2008) isolaram em farinha de trigo as espécies
potencialmente produtoras de OTA: A. niger, A. ochraceus e A. ostianus, que
foram testadas quanto ao perfil toxígeno, mas nenhuma demonstrou positividade.
Weidenbörner et al. (2000) constataram contagens baixas de espécies
potencialmente produtoras de micotoxinas, a citar: A. niger, A. petrakii e
P. verrucosum. No entanto, a capacidade toxígena dessas espécies não foi
testada no estudo desses pesquisadores.
A triagem da ocorrência de AFB1 e OTA em farinha de trigo e pães tipo
francês não evidenciou contaminação detectável na totalidade amostral na atual
pesquisa.
52
No presente estudo, como supracitado, foi isolada uma espécie
possivelmente toxígena. Porém, a presença do fungo no alimento não implica,
obrigatoriamente, em produção de micotoxinas (DINIZ, 2002;
PEREIRA et al., 2002; MURPHY et al. 2006; GARCIA et al., 2009), visto que as
condições ótimas de umidade, temperatura e Aa para a produção de micotoxinas
são mais restritivas do que aquelas para o crescimento de fungos (MAGNOLI
et al., 2007). Os teores médios de umidade relativa do ar registrados situaram-se
abaixo do teor favorável à síntese de micotoxinas (superior a 85%), como
reportam Queiroz et al. (2006). Os valores médios de atividade de água obtidos
para farinha de trigo e pão tipo francês (Tabela 2) também se encontraram abaixo
da faixa propícia para a produção de micotoxinas que, de acordo com
Northolt et al. (1979) situa-se entre 0,95 e 1,0. Referente ao pão tipo francês
deve-se considerar que esse também apresenta como fator limitante à produção
de micotoxinas, o fato de ser um produto de rápido consumo e elevada
rotatividade em panificadoras, onde após sua fabricação, o tempo de exposição
para venda não excede seis horas. Pereira (2001) reportou que a presença de
aflatoxina no pão tipo francês ocorreu após alguns dias de armazenamento e que
a micotoxina tende a migrar para o substrato adjacente, não permanecendo retida
no micélio dos fungos.
Segundo dados da FAO (1997b), micotoxinas não são produzidas em
alimentos devidamente secos, por isso a secagem eficiente dos produtos e a sua
conservação sem umidade é uma medida eficaz contra o crescimento de fungos e
a produção de toxinas, sendo que a quantidade crítica de água para o
armazenamento seguro corresponde à atividade da água próxima a 0,7.
A incidência de AFB1 em farinha de trigo e derivados (em pães) tem sido
relatada por autores em distintos países: Riba et al. (2010) detectaram
contaminação em 56,6% das amostras, com níveis de variando entre 0,13 µg.Kg-1
e 37,42 µg.Kg-1; Zinedine et al. (2007), encontraram em 17,6% de suas amostras,
com valores entre 0,03 µg.Kg-1 e 15 µg.Kg-1; Aydin et al. (2008), encontraram
contaminação em 45% das amostras, com teores entre 0,05 µg.Kg-1 e
14,01 µg.Kg-1; Abdullah et al. (1998) encontraram contaminação em 1,2% das
53
amostras, com concentração média de 25,6 µg.Kg-1. Porém, Behfar et al. (2008),
não detectaram essa aflatoxina em sua totalidade amostral.
A ocorrência da Ochratoxina A tem sido reportada em farinha de trigo e
derivados, como o pão, por vários pesquisadores: Juan et al. (2008) detectaram
OTA em 12,9% das amostras de pães e o com teor médio encontrado foi de
0,02 ng.g-1 em Portugal; Zinedine et al. (2007) constataram em 48% das
amostras com contaminação média de 13,0 ng.g-1 em Marrocos; Osnaya et al.
(2006) encontraram OTA em níveis entre 0,04 ng.g-1 e 19,61 ng.g-1 e Blesa et al.
(2004) em valores inferiores a 0,25 ng.g-1 em pão espanhol. Ibáñez-vea et al.
(2011) analisando cereais matinais a base de trigo quanto à presença de
aflatoxinas e OTA, verificaram ausência de aflatoxinas na totalidade amostral,
contudo, OTA, foi detectada em 67% das amostras, com níveis de contaminação
variando entre 0,15 μg.Kg-1 e 1,12 μg.Kg-1.
A não detecção desses metabólitos tóxicos, nas amostras estudadas pode
ser atribuída: às condições de armazenamento não favoráveis à multiplicação
fúngica e a produção de micotoxinas; bem como aos isolados fúngicos, por não
possuírem capacidade para síntese desses compostos. Dessa forma, tanto a
farinha de trigo quanto os pães tipo francês sob os pontos micotoxicológicos
analisados são seguros para consumo.
54
6 CONCLUSÃO
A farinha de trigo utilizada para preparo de pães tipo francês interfere na
qualidade micológica e micotoxicológica dos pães produzidos.
A quantidade de fungo encontrada no pão tipo francês é semelhante à
contaminação observada na farinha de trigo, ambos não apresentam fungos com
capacidade toxígena, nem para aflatoxina B1 e bem como para ochratoxina A.
A farinha de trigo e os pães tipo francês analisados são seguros para
consumo sob o aspecto micotoxicológico por não apresentarem aflatoxina B1 e
ochratoxina A.
55
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