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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CATANIA
FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE “M. La Greca”
CAMPO FLAVIA
VALUTAZIONE DELLA VITALITA’ SPERMATOZOARIA IN
LIQUIDI SEMINALI CON DIAGNOSI DI
ASTENOZOOSPERMIA GRAVE
Tes i d i l au r ea i n B io log i a d e l l o s v i luppo
Relatrice:
CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO
Correlatore:
DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA
ANNO ACCADEMICO 2006-07
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CATANIA
FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE “M. La Greca”
VALUTAZIONE DELLA VITALITA’ SPERMATOZOARIA IN
LIQUIDI SEMINALI CON DIAGNOSI DI
ASTENOZOOSPERMIA GRAVE
S i r i ng r az i a i l c en t ro As t e r d i d i agno s i e cu r a d e l l a s t e r i l i t à
p r e s so l a c l i n i c a d e l Med i t e r r aneo d i Ragusa n e l l e p e r sone de l
do t t . G iovann i B racch i t t a e d e l do t t . Nunz io Minn i t i p e r
l ’ o sp i t a l i t à d imos t r a t a e l e i n f o rmaz ion i r i c evu t e .
Relatrice:
CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO
Correlatore:
DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA
ANNO ACCADEMICO 2006-07
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Indice
Premessa pag. 3
Introduzione pag. 5
Apparato genitale maschile
- Gonadi pag. 8
- Vie spermatiche pag. 10
- Ghiandole annesse pag. 12
- Organi genitali esterni pag. 13
La riproduzione sessuata
- La meiosi pag. 15
- Gametogenesi pag. 16
- Spermatogenesi pag. 17
- Spermioistogenesi pag. 19
- Capacitazione pag. 22
Il liquido seminale
- Fisiologia pag. 23
- Caratteristiche macroscopiche pag. 24
- Caratteristiche microscopiche pag. 27
Concentrazione nemaspermica
Valutazione della motilità
Morfologia
Vitalità spermatozooaria
- 2 -
Scopo del lavoro pag. 40
Materiali e metodi
- Tecniche per la vitalità spermatozooaria pag. 41
Eosina
Eosina-nigrosina
Swelling test
Risultati e conclusioni pag. 49
Bibliografia pag. 59
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PREMESSA
Si parla d’infertilità di coppia, secondo la definizione dell’O. M. S.
(Organizzazione Mondiale della Sanità), quando una coppia in età
fertile, dopo 12-24 mesi di rapporti regolari non protetti non riesce a
procreare, la sterilità, riguarda invece le coppie affette da una precisa
patologia irreversibile o che restano non fertili anche dopo un iter
diagnostico e terapeutico esauriente e svolto in un tempo ragionevole.
La maggior parte delle coppie che incontra difficoltà, ad avere un
bambino è inizialmente incredula, in effetti, molte persone, credono
che la gravidanza arrivi naturalmente nel momento in cui si decide di
concepire e/o dopo che s’interrompe la contraccezione, quando ciò
non avviene, quando mettere al mondo un figlio diventa un’ossessione
e alla ferita dell’impotenza si aggiunge il senso di colpa, è inevitabile
sentirsi diversi dagli altri.
Scoprire che quella che per gli altri è una funzione naturale è invece
un serio problema, può causare un disagio psichico.
Complessivamente, l’infertilità riguarda tra il 10% - 20% delle
coppie in età fertile, in Italia ogni anno 50.000 coppie chiedono un
consulto per infertilità e questa cifra continua a crescere, su una scala
mondiale significa che 50-80 milioni di persone soffrono di questo
problema, le cause sono molteplici e di diversa natura: età avanzata,
fumo, inquinamento, stress e patologie organiche.
Per alcune di loro, le più diffuse, si può intervenire con cure e terapie
adeguate, per altre, è necessario ricorrere alla procreazione
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medicalmente assistita. Ai nostri giorni i miglioramenti in questo
campo hanno permesso di aumentare la diversità e la disponibilità
degli interventi e grazie a numerosi esami specifici il medico può
identificare il problema e proporre un orientamento terapeutico.
A tracciare l’identikit delle coppie che in Italia si rivolgono ai centri
per la fecondazione assistita, è la prima ricerca promossa
dall’Osservatorio Sociale sull’infertilità, basata sui dati raccolti da 249
coppie provenienti da 17 regioni tra il marzo 2003 e il marzo 2004.
L’età in cui le coppie si rivolgono per la prima volta alla fecondazione
assistita, corrisponde all’età nella quale le donne non infertili hanno il
primo figlio e che è diventata sempre più alta negli ultimi anni: basti
pensare che è salita dai 25,7 anni del 1961 ai 27,1 del 1981, ai 28,2 del
1996 agli attuali 30,8 anni.
Le ragioni che spingono le donne o meglio le coppie a rimandare la
gravidanza, sono del tutto comprensibili.
Prima, occorre raggiungere una ragionevole sicurezza economica, la
maturità per una giusta organizzazione familiare.
Tutto questo, però, richiede tempo e quando finalmente si ritiene di
potere avere un figlio è spesso troppo tardi.
Il periodo più fertile per una donna è tra i 20 e i 25 anni, resta alto fino
ai 35, subisce un calo dai 35 ai 40, è bassissimo oltre i 40.
Con l’età, infatti, invecchiano i gameti femminili e aumenta il rischio
di malattie connesse all’infertilità-sterilità.
L’età dell’uomo è molto meno rilevante, ma ciò non nasconde il fatto
che secondo molti studi, anche la fertilità maschile si sia ridotta
notevolmente negli ultimi 50 anni.
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INTRODUZIONE
Nell’infertilità di coppia, il “fattore”o la “responsabilità”maschile si
calcola intorno al 40-45%, pari cioè a quello femminile.
Tale percentuale fino ad un ventennio fa, era valutata sul 20%.
L’incremento del dato è imputabile a due fattori: da un lato un
elemento socio-statistico.
L’infertilità maschile, prima nascosta come una vergogna e quindi non
indagata, oggi è riconosciuta come un’entità clinica ben definita, e
nelle coppie sterili, è esaminata la situazione seminologica del partner
in prima istanza, mentre in passato le indagini si concentravano sulla
donna.
Questo miglioramento culturale ha fatto uscire allo scoperto, casi
d’infertilità maschile prima ignorati.
Accanto a questi fattori un altro, più importante, è l’incremento delle
cause che influiscono negativamente sull’apparato riproduttivo
maschile.
Su di esso infatti, oltre alle condizioni soggettive, chiaramente
patologiche (criptorchidismo di lunga data), sembrano influire anche,
alterazioni nella produzione del liquido seminale, condizioni
ambientali e lo stile di vita (incluso stress e fumo).
Anomalie del plasma seminale nella produzione e nella maturazione
degli spermatozoi, sono la causa più comune d’infertilità maschile.
Anche se prodotti in quantità adeguate, gli spermatozoi possono essere
immaturi, mal conformati o incapaci di muoversi in maniera corretta.
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Queste alterazioni possono essere causate da infiammazioni, fattori
endocrini, quindi disfunzioni nella produzione di testosterone, inoltre,
tra le principali sostanze lesive della spermatogenesi sono possibili
annoverare le seguenti:
Pesticidi, metalli pesanti, (piombo, mercurio, presenti negli alimenti
oltre che nell’aria), farmaci, droghe.
A parte i difetti genetici, (aplasia germinale, sindrome delle sole
cellule di Sertoli), tutte le altre cause possono essere ridotte o
addirittura annullate da una consapevole prevenzione applicata sia a
livello medico-sanitario, che a livello educazionale.
Un’ accorta prevenzione delle cause dell’infertilità maschile o la loro
correzione una volta individuate, consentirebbe un aumento delle
percentuali di nascite, anche in considerazione del fatto che vari studi
di popolazione e risultati delle tecniche medicalmente assistite
dimostrano che esiste una riduzione della capacità di concepire che
aumenta nel tempo.
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APPARATO GENITALE MASCHILE
Nella specie umana come in tutte quelle caratterizzate da sessi
separati, è possibile distinguere un apparato riproduttore maschile e
uno femminile, differenti per anatomia e fisiologia, il primo in grado
di donare il seme e il secondo capace di accoglierlo ed elaborarlo
biologicamente al fine di formarne una nuova creatura.
L’apparato genitale maschile ha due importanti funzioni:
� La produzione di gameti maschili (spermatozoi).
� La secrezione d’ormoni sessuali (androgeni).
E’ costituito dalle gonadi, dalle vie spermatiche, dalle ghiandole
annesse e dai genitali esterni.
Figura 1 - Apparato genitale maschile.
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Le Gonadi
Le gonadi, sono la principale sede di secrezione degli ormoni
steroidei, nel maschio sono rappresentate dal testicolo o Didimo, un
organo pari, contenuto in un sacco cutaneo di forma ovoidale detto
scroto, sede di produzione di spermatozoi e della secrezione degli
ormoni sessuali maschili.
E’ rivestito da una spessa tonaca albuginea formata da fasci di fibre
collagene, che conferisce loro la caratteristica consistenza.
Dalla superficie interna di questa tonaca, prendono origine numerosi
setti, che convergono verso il mediastino e suddividono il testicolo in
200-300 spazi di forma piramidale con la base rivolta verso l’esterno,
denominati logge.
All’interno di loro si trova del connettivo lasso che dà sostegno e
nutrizione ai tubuli seminiferi contorti e alle cellule interstiziali di
Lejdig.
Figura 2 – Costituzione del testicolo.
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Le cellule interstiziali di Lejdig stimolate dall’ormone ipofisario FSH,
sintetizzano ormoni androgeni (testosterone, Androstenedione) che
stimolano la spermatogenesi.
I tubuli seminiferi contorti possono raggiungere una lunghezza di 300
metri, nascono in prossimità dell’albuginea, convergono nei tubuli
retti e sboccano nella rete testis del mediastino.
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Figura 3 – Sezione trasversale di un tubulo seminifero.
La parete dei tubuli seminiferi è costituita da un epitelio
pluristratificato detto epitelio germinativo, con le cellule germinali,
stratificate secondo un gradiente di maturazione che và dalla lamina
basale al lume, dagli spermatogoni agli spermatidi, e con le cellule di
Sertoli unite fra loro mediante giunzioni serrate che occupano l’intero
spessore dell’epitelio seminifero. Queste ultime, svolgono diverse
funzioni:
� Sostegno per l’epitelio seminifero
� Protezione dagli agenti esterni
� Nutritiva, perché effettuano scambi metabolici con le cellule
germinali
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� Stimolate dall’ormone ipofisario FSH, producono la proteina
ABP (androgen-binding protein), capace di legare il
testosterone prodotto dalle cellule di Lejdig, in modo che
l’ormone possa agire sugli spermatogoni dando inizio alla
spermatogenesi.
Figura 4 – Sezione trasversale tubulo seminifero.
Vie spermatiche
Rappresentano i condotti che portano gli spermatozoi dalla gonade
all’uretra, seguendo il seguente ordine:
I tubuli seminiferi retti, sboccano nella rete testis, le lacune della rete
continuano nei condotti efferenti formando la testa dell’epididimo,
nell’epididimo possiamo quindi distinguere: testa, corpo e coda che
continua nel condotto deferente e termina alla base della prostata.
Il condotto deferente prima di raggiungere l’uretra, alla base della
prostata, riceve il condotto della vescichetta seminale e dà origine al
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condottino eiaculatore che attraversa il parenchima della prostata per
sboccare nell’uretra.
Il funicolo spermatico è costituito dal dotto deferente, e dai vari nervi
del testicolo.
La sua funzione è quella di sostegno del testicolo all’interno dello
scroto.
Figura 5 – Sezione longitudinale dell’apparato riproduttore maschile,
percorso seguito dagli spermatozoi dalla nascita alla loro emissione dal pene.
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GHIANDOLE ANNESSE DELL’APPARATO
GENITALE MASCHILE
Le vescichette seminali
Sono degli organi cavi pari, a forma di coni appiattiti, posti tra la base
della vescica e la faccia anteriore del retto. Producono un liquido
debolmente basico che costituisce circa il 60% del liquido seminale
cd ha il compito di stimolare la mobilità degli spermatozoi.
La prostata
Organo impari con la base rivolta verso l’alto e l’apice che poggia sul
diaframma urogenitale, è costituito, da due lobi laterali ed uno
anteriore. Nel suo interno vi sono circa 40 ghiandole esocrine disposte
radicalmente dalla periferia verso il centro dell’organo e convergono
con i loro dotti escretori verso l’uretra prostatica dove versano il loro
secreto.
Le ghiandole bulbo uretrali di Cowper
Sono due piccole ghiandole giallastre, situate nello spessore del
diaframma urogenitale, secernenti un muco debolmente alcalino che
ha il compito di neutralizzare l’eventuale acidità dell’uretra e
lubrificarne il lume. Questo muco è immesso nell’uretra
immediatamente prima dell’eiaculazione.
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ORGANI GENITALI ESTERNI
Lo scroto
Sacco cutaneo contenente il testicolo, l’epididimo e le prime porzioni
del dotto deferente e che mantiene una temperatura inferiore di un
paio di gradi rispetto a quella interna del corpo.
Il pene
È l’organo copulatore maschile, ed è formato dal corpo e dal glande.
Il corpo presenta due cilindri laterali detti corpi cavernosi del pene,
elementi erettili avvolti da una guaina di tessuto fibroso poco elastico:
la tonaca albuginea, e da un cilindro mediano ventrale detto corpo
cavernoso o spungioso dell’uretra. Il corpo cavernoso del pene si và
restringendo nel collo, mentre il corpo cavernoso dell’uretra si dilata
formando il glande.
Ciascun elemento erettile è rivestito da un connettivo fibroso, dalla
tonaca albuginea ed i tre corpi cavernosi sono tenuti assieme dalla
fascia del pene e da un involucro cutaneo.
Quest’ultimo, a livello del glande, forma un cappuccio: il prepuzio,
che può liberamente scorrere sul glande, essendo trattenuto solo dal
frenulo.
In base alla quantità e pressione del sangue contenuto all’interno del
tessuto erettile, s’instaura un meccanismo che tende a riempire sempre
più i corpi cavernosi e determina il fenomeno dell’erezione.
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Figura 6 – Sezione trasversale delle strutture componenti il pene.
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LA RIPRODUZIONE SESSUATA
La riproduzione sessuata è caratterizzata dalla fusione dei genomi di
due genitori, di sesso rispettivamente maschile e femminile, così da
dare origine ad individui tra loro geneticamente diversi e diversi da
ciascuno dei genitori.
Il ciclo riproduttivo sessuato prevede la formazione nei due sessi di
cellule aploidi (gameti), così che con la fecondazione si ripristini il
corredo diploide delle cellule somatiche. Il dimezzamento del corredo
cromosomico, cui per altro si accompagna la ricombinazione genetica
tra i cromosomi omologhi d’origine paterna e materna, si ottiene con
la meiosi, modalità di divisione esclusiva delle cellule germinali. Da
essa risulta infatti che le cellule germinali hanno corredo aploide, ma
sono anche caratterizzate da cromosomi che, grazie alla
ricombinazione, hanno nuove combinazioni di geni, che rendono
ciascun gamete unico.
LA MEIOSI
E’ una sequenza di due divisioni cellulari, dette prima e seconda
divisione meiotica, che ha lo scopo di dimezzare il numero dei
cromosomi e scambiarne tratti tra i cromosomi omologhi.
Ciascun gamete passa attraverso: profase, metafase, anafase, telofase,
si generano 4 cellule con cariotipo aploide, grazie alla segregazione
degli omologhi ed alla successiva separazione dei cromatidi fratelli.
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La divisione meiotica è limitata, come già ricordato, alle cellule
germinali ed è parte integrante del complesso processo differenziativo
che porta alla formazione dei gameti maschili e femminili,
rappresentato dall’ovogenesi e dalla spermatogenesi.
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Figura 7- Stadi della meiosi.
GAMETOGENESI
L’ovogenesi e la spermatogenesi hanno inizio durante lo sviluppo
embrionale con la comparsa di cellule germinali primordiali o
protogoni. Dalla parete del sacco vitellino, esse migrano nelle creste
genitali, che evolvono successivamente in ovaio nella femmina e
testicolo nel maschio.
Nelle creste genitali, le cellule germinali primordiali si dividono per
mitosi dando origine ad un elevato numero di ovogoni nella femmina
e spermatogoni (o spermatogoni di tipo A) nel maschio.
A partire da questo punto, le modalità con cui i processi evolvono
sono nettamente differenti nei due sessi, anche se il risultato finale è
fondamentalmente lo stesso, vale a dire la produzione di cellule
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germinali mature lungo tutto il periodo di vita fertile dell’individuo
adulto.
SPERMATOGENESI
A questo punto ha inizio la spermatogenesi, processo di produzione e
maturazione degli spermatozoi che avviene nei tubuli seminiferi dei
testicoli, sotto il controllo ipotalamo-ipofisario e che continuerà per
tutta la vita a partire dalla pubertà e decrescerà in età senile.
Nei mammiferi la spermatogenesi dura parecchie settimane e può
essere divisa in tre fasi:
Fase mitotica, fase meiotica, spermiogenesi.
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Figura 8 – Fasi della spermatogenesi.
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Fase mitotica
In questa fase il numero di spermatogoni aumenta sensibilmente.
Nei mammiferi si riscontrano diversi tipi di spermatogoni che
rappresentano stadi successivi della maturazione, denominati:
spermatogoni di tipo A
Sono elementi indifferenziati che si dividono indefinitamente e
assicurano il continuo rifornimento di spermatogoni.
Spermatogoni di tipo intermedio
Sono più differenziati rispetto al tipo A e danno origine al B.
Spermatogoni di tipo B
Hanno un nucleo sferico molto più piccolo dei precedenti tipi ed un
grosso nucleolo situato al centro.
Cessata l’attività mitotica, gli spermatogoni cominciano ad accrescersi
attraverso il processo d’ auxocitosi e prendono il nome di spermatociti
di primo ordine, al livello del quale inizia la meiosi.
Fase meiotica 13-18 giorni
Lo spermatocita di primo ordine, alla prima divisione meiotica
(riduzionale) è diploide e riduce appunto il proprio patrimonio
genetico, dando luogo a due cellule aploidi
(n-23 cromosomi ciascuno con 2 cromatidi), dette spermatociti di
secondo ordine.
Questi, vanno incontro alla seconda divisione meiotica (equazionale)
durante la quale si formeranno due spermatidi, sempre aploidi, ma in
questo caso il DNA a disposizione della cellula sarà dimezzato
(sempre n ma i 23 cromosomi hanno un solo cromatidio).
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SPERMIOISTOGENESI
Con il completamento della meiosi, si conclude la spermatogenesi e
ha inizio la spermioistogenesi, con la quale gli spermatidi andranno
incontro a un complesso processo di differenziamento che li porterà a
diventare spermatozoi, nello specifico nemaspermi, per differenziarli
dagli anemaspermi sprovvisti di flagello.
È caratterizzata da 4 fasi:
Fase del golgi, fase del cappuccio, fase dell’acrosoma e fase di
maturazione.
Nella fase del Golgi, l’apparato del Golgi si trova con le sue vescicole
attorno al diplosoma (i 2 centrioli) a formare l’idiosoma, all’ interno,
dei quali ci sono dei granuli di natura polisaccaridica detti
preacrosomiali che man mano si fondono formando l’acrosoma, esso,
posto anteriormente al nucleo, ha la funzione di perforare la cellula
uovo grazie ad enzimi litici ricchi in fosfatasi acida.
I pesci costituiscono un’eccezione, infatti, sono privi di acrosoma, ed
in molti casi tra acrosoma e nucleo si trova un materiale ricco di
actina che prende il nome di perforatore o perforatorium (nei
mammiferi uomo compreso è assente).
Durante la fase del cappuccio, e durante la fase di maturazione, la
vescicola acrosomiale si accresce notevolmente e si sviluppa un
cappuccio che si poggia anteriormente alla membrana nucleare.
A questo punto, la cromatina nel nucleo assume un aspetto compatto,
il diplosoma e il resto dell’apparato del Golgi migrano dietro il nucleo.
Il citoplasma si porta verso il polo distale in una sacca, lasciando
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attorno al nucleo solo una sottile pellicola, ed in parte è eliminato e
fagocitato dalle cellule di Sertoli, che per mezzo dei loro lisosomi lo
digeriranno.
Il citoplasma non eliminato, si condensa alla base del nucleo
formando il collo ed un sottile rivestimento del flagello.
In definitiva lo spermatozoo maturo dei vertebrati è formato da una
testa e dal flagello.
I due centrioli rappresentano il punto di partenza per la formazione del
flagello.
Il centriolo prossimale ha probabilmente la funzione di organizzare la
regione del collo.
Dal centriolo distale si origina l’anello terminale (anello di jensen o
annulus), perde la sua forma caratteristica, si allunga ed organizza i
microtubuli dell’assonema e i 9 grossi filamenti esterni.
Il flagello è distinto in:
� Una parte intermedia
� Una coda
La parte intermedia si estende dal collo all’anello terminale.
È formata dall’assonema, a sua volta costituito da 11 microtubuli, di
cui 9 coppie di microtubuli esterni e 2 centrali, circondato da una
spira mitocontriale.
Sul raggio d’ogni doppietta dei microtubuli dell’assonema vi sono 9
grossi filamenti formati da proteine fibrose che probabilmente danno
maggiore consistenza al flagello.
La coda è divisa in:
� Un tratto principale
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� Un tratto terminale.
Il tratto principale è formato all’esterno dalla membrana plasmatica,
internamente dall’assonema che via via perde i microtubuli. Il numero
dei grossi filamenti esterni si riduce progressivamente e distalmente,
inoltre all’anello terminale mancano i mitocondri.
Il tratto terminale è formato: all’esterno dalla membrana plasmatica ed
internamente dall’assonema.
Figura 9 – Spermioistogenesi.
Lo spermatozoo libero che lascia il tubulo seminifero (spinto dalla
pressione del liquido seminale) deve trascorrere una fase di ulteriore
“maturazione” nell’epididimo.
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In tale sede:
Acquisisce motilità
Cambia metabolismo
E’ decapacitato, ossia perde la capacità fecondante, che sarà
riacquistata con la permanenza nelle vie genitali femminili.
La motilità degli spermatozoi è acquisita durante la sosta nell’ultimo
tratto dell’epididimo.
Si ritiene che la motilità sia dipendente da reazioni che coinvolgono
segnali di membrana e che comportano l’attivazione d’adenilato
ciclasi e la mobilitazione di calcio intracitoplasmatico.
CAPACITAZIONE
Gli spermatozoi depositati in vagina vanno incontro all’ultima tappa
della maturazione: la capacitazione, quel processo mediante il quale lo
spermatozoo subisce cambiamenti biochimici e strutturali della
membrana plasmatica della testa, che gli conferisce la capacità di
fecondare.
Lo spermatozoo capacitato ha una motilità iperattiva ed ha subito la
reazione acrosomiale, ossia attivazione degli enzimi proteolitici
contenuti nell’acrosoma, che permette l’attraversamento da parte dello
spermatozoo degli strati che circondano l’ovocita ed il legame alla
zona pellucida.
Grazie alla reazione corticale, ovvero il rilascio da parte dei granuli
corticali di sostanze chimiche che ne modificano la membrana e la
zona pellucida, sarà impedita la penetrazione d’altri spermatozoi.
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IL LIQUIDO SEMINALE
Per spermiogramma, s’intende l’analisi mediante microscopia ottica,
del liquido seminale maschile, oggi rappresenta il più comune esame
per la valutazione della fertilità maschile.
FISIOLOGIA
Il liquido seminale è un fluido organico prodotto dai testicoli e dagli
organi riproduttivi maschili secondari ed è costituita da spermatozoi
sospesi nel plasma seminale, la cui funzione è quella di fornire un
mezzo nutritivo d’ osmolarità e di volume idoneo al raggiungimento
da parte degli spermatozoi del muco endocervicale.
Le varie frazioni che nel loro insieme costituiscono il liquido seminale
sono:
Frazione Testicolare
Gli spermatozoi che costituiscono circa il 5% dell’intero volume del
liquido seminale, sono per lo più immagazzinati nella porzione
ampollare dei deferenti, finché sono liberati nel processo
d’eiaculazione; in questa sede gli spermatozoi possono sopravvivere
per un periodo anche superiore ad un mese.
Frazione delle Vescichette seminali
Circa il 60% del liquido seminale deriva dalle vescichette seminali; a
pH neutro o leggermente alcalino è spesso di colore giallo o molto
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pigmentato per il suo alto contenuto in flavina, che è responsabile
della fluorescenza dello sperma a luce ultravioletta. Le vescichette
seminali producono il fruttosio che rappresenta la maggiore fonte di
nutrimento per gli spermatozoi. Dalle vescichette seminali viene
anche prodotto acido citrico, piccole quantità d’acido ascorbico e il
substrato responsabile della coagulazione dello sperma che avviene
dopo l’eiaculazione.
Frazione Prostatica
La prostata fornisce circa il 20% del volume totale dello sperma.
Questo fluido è leggermente acido ( pH di circa 6,5 ) per l’alto
contenuto in acido citrico.
Nel processo d’eiaculazione si ha una mescolanza di tre frazioni ben
distinte che entrano nell’uretra in rapida successione.
La prima frazione, è formata da un fluido chiaro, vischioso, che si
pensa che provenga in gran parte o esclusivamente dall’uretra o dalle
ghiandole di Cowper ed è priva di spermatozoi. E’ probabile che serva
a pulire e lubrificare l’uretra. La seconda frazione contiene la quasi
totalità degli spermatozoi ed in piccola parte la secrezione degli
epididimi. La frazione finale è costituita quasi interamente da una
secrezione mucosa ricca in fruttosio, dovuta allo svuotamento delle
vescichette seminali.
ESAME MACROSCOPICO
Il campione è sottoposto ad una valutazione macroscopica, per la
determinazione di una serie di caratteristiche chimico-fisiche:
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1- Liquefazione
Subito dopo l’eiaculazione, un campione normale coagula e
successivamente si liquefà entro 5-40 minuti a temperatura ambiente,
sebbene generalmente questo avvenga entro 15 minuti. Alcuni
campioni possono contenere granuli gelatinosi (corpi amilacei) che
non si liquefanno e possono presentare strie di muco, segno
d’incompleta liquefazione. In alcuni casi, quando i campioni non si
liquefanno può essere necessario una mescolatura meccanica o una
digestione enzimatica. Tutte queste procedure possono in ogni modo
interferire sulla motilità e sulla morfologia spermatozooaria.
2- Viscosità
La viscosità del campione liquefatto ( spesso definita “ consistenza”)
potrà essere valutata aspirando delicatamente il liquido seminale in
una pipetta di 5 ml dall’imboccatura ampia, e lasciato gocciolare per
gravità, osservando la lunghezza del filamento ottenuto: un campione
normale lascia la pipetta come piccole gocce distinte. In caso
d’anormale viscosità la goccia formerà un filamento superiore ai 2 cm.
Una viscosità anomala può interferire nella determinazione del
numero e della motilità degli spermatozoi.
3- Aspetto
Il liquido seminale normale ha un aspetto grigio opalescente, può
apparire meno opaco se la concentrazione di spermatozoi è molto
bassa, di colore rosso-brunastro se ci sono emazie.
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La contaminazione da parte dell’urina può produrre colorazione gialla
più pronunciata.
4- Volume
Il volume dell’eiaculato dovrebbe essere misurato usando un cilindro
graduato a base conica o pesando contenitori standard con e senza il
liquido seminale.
È considerato normale se è > di 2,0 ml, sotto i 0,5 ml si parla
d’ipospermia, sopra i 6,0 ml si parla di iperspermia.
5- pH
Il pH deve essere sempre misurato entro un’ora, su un’apposita cartina
indicatrice e il colore che assume deve essere confrontato con la scala
delle colorazioni per leggerne il valore.
I valori normali sono compresi tra 7,2 e 8,0.
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Figura 11 – Cartina indicatrice.
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Figura 10 – Provetta.
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ESAME MICROSCOPICO
Durante l’esame microscopico del campione, si può determinare la
concentrazione degli spermatozoi, la motilità, la morfologia, la
presenza d’agglutinati e di cellule diverse dagli spermatozoi come i
leucociti e le cellule rotonde (cellule germinali immature).
� Concentrazione nemaspermica
Un volume fisso di liquido seminale, generalmente 10 microlitri, si
dispone su un vetrino portaoggetto con sopra il coprioggetto, il
preparato si esamina a fresco al microscopio ottico a 400x. Un
campione privo di spermatozoi è definito azoospermico, oligospermia,
normozoospermia, polizoospermia si riferiscono a campioni di seme
che presentano rispettivamente concentrazioni di spermatozoi inferiori
alla norma ( valori di riferimento WHO <20milioni/ml), nella norma
(valori di riferimento WHO tra 20 e 250 milioni/ml), superiori alla
norma (valori di riferimento WHO >250milioni/ml). La
concentrazione degli spermatozoi può essere determinata utilizzando
un emocitometro (camera di Burker, di Neubauer), previa diluizione
del seme in un liquido immobilizzante (in genere 1: 20, sarà 1: 10 per
concentrazioni più basse).
Per maggiore praticità si possono utilizzare apparecchi elettronici o la
microcamera di Makler, che offre il vantaggio di non dover ricorrere
alla diluizione del campione;
- 28 -
QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Figura 12 – Camera di Makler.
Dieci microlitri del campione in esame sono depositati nel
portaoggetti della camera e coperti con uno speciale vetrino
coprioggetti dotato di ghiera metallica, che consente di creare un
monostrato di 10 microlitri di spessore, e di griglia di conta.
� Valutazione della motilità
La motilità dello spermatozoo costituisce uno dei parametri qualitativi
più importanti dell’esame del liquido seminale.
Dipende sia da fattori intrinseci allo spermatozoo (struttura del
flagello), sia da fattori estrinseci (composizione biochimica del mezzo
extracellulare in cui si trova lo spermatozoo).
Tale parametro, deve essere distinto dalla vitalità, infatti, gli
spermatozoi per essere vitali, non devono essere necessariamente
mobili.
Un esempio di tale situazione è rappresentato dalla mancanza
congenita dei bracci di dineina nell’assonema nemaspermico.
- 29 -
La valutazione della motilità è espressa come percentuale totale di
spermatozoi mobili e come percentuale delle diverse categorie di
velocità e direzione degli spermatozoi mobili.
La motilità d’ogni spermatozoo è definita “a”, “b”, “c”, o “d”, se esso
mostra:
a. Motilità progressiva rapida (> 25 um/s a 37°C e > 20 um/s a 20°C);
b. Motilità progressiva lenta o irregolare;
c. Motilità non progressiva;
d. immobili
La camera di Makler è usata anche per l’osservazione della
motilità spermatozooaria: una goccia di seme si colloca nella camera e
si esegue l’osservazione microscopica con obiettivo 200x, la griglia
della camera facilita la classificazione degli spermatozoi mobili in
categorie.
� morfologia
La morfologia dello sperma è valutata attraverso la conta differenziale
di spermatozoi normali ed anormali su strisci colorati. La miglior
colorazione per evidenziarne la morfologia è la colorazione di
Papanicolaou che permette la colorazione della regione acrosomiale e
post acrosomiale della tasta, i residui citoplasmatici, il tratto
intermedio ed il flagello.
Un metodo di colorazione più rapido è il Diff-Quik, con queste
colorazioni la testa si colora di blu pallido nella regione acrosomiale e
di blu scuro in quella postacrosomiale, il tratto intermedio assume una
- 30 -
colorazione rossastra, la coda di rosso o blu, i residui citoplasmatici si
colorano di verde con la colorazione di Papanicolaou.
� Classificazione della morfologia degli spermatozoi.
Perchè uno spermatozoo possa essere considerato normale è
necessario che siano normali la testa, il collo, il tratto intermedio e la
coda dello spermatozoo. La testa deve avere forma ovale, dovrebbe
essere presente una regione acrosomiale ben definita, che occupa il
40-70% dell’area della testa e posteriormente il nucleo, il pezzo
intermedio deve essere circa una volta e mezzo la lunghezza della
testa, la coda deve essere diritta, uniforme, più sottile del tratto
intermedio, non arrotolata e lunga approssimativamente 4um. Alcune
forme anomale sono:
- anomalie della testa:
Testa grande (macrocefalia);
Testa piccola (microcefalia);
Testa a punta;
Testa piriforme;
Testa doppia o multipla;
acefalia;
Difetti dell’acrosoma (meno del 40% dell’area del capo);
- 31 -
Figura 13 Teste Normali.
Figura 14 Macrocefalia Figura 15
Microcefalia Testa piriforme
- 32 -
Figura 16
Testa a punta testa piriforme testa amorfe.
Figura 17 Testa doppia.
- 33 -
- anomalie del collo e del tratto intermedio:
Tratto sottile;
Tratto spesso;
Inserzione asimmetrica della coda;
Figura 18 Inserzione asimmetrica della coda.
- anomalie della coda:
Coda assente;
Coda mozza;
Coda rigonfia;
Coda arrotolata;
Coda doppia o multiplo;
- 34 -
Figura 19 coda rigonfia. Figura 20 coda arrotolata.
- persistenza di residuo citoplasmatico
Figura 21 Residui citoplasmatici.
- 35 -
• Vitalità spermatica
La vitalità degli spermatozoi è definita dalla percentuale di
spermatozoi vivi.
Se la percentuale di spermatozoi immobili è superiore al 50%, la
percentuale di spermatozoi vivi deve essere determinata utilizzando
tecniche di colorazione, basate sul principio che le cellule morte, con
membrana danneggiata, hanno la capacità di lasciare passare alcuni
coloranti.
Ovviamente la percentuale degli spermatozoi non vitali non dovrà
superare quella degli immobili. La presenza di un elevato numero di
elementi immobili vitali può essere indicativa di difetti strutturali del
flagello, la presenza di un elevato numero di spermatozoi morti può
invece essere indicativo di un danno alla membrana plasmatica.
L’integrità e l’attività funzionale della membrana sono requisiti
cruciali per la motilità e per i cambiamenti fisiologici che avvengono
sulla superficie dello spermatozoo durante la sua vita e durante il
processo di fecondazione.
I componenti strutturali della membrana, subiscono cambiamenti
soprattutto durante la maturazione epididimaria: cambi di carica in
superficie, nella fluidità di membrana, nella composizione in lipidi,
nella composizione proteica, nella quantità di zuccheri e glicoproteine,
inoltre, l’alta attività di sintesi del colesterolo nell’epididimo, durante
la maturazione dello spermatozoo, gli permette di viaggiare attraverso
i microambienti ostili lungo il tratto genitale femminile.
- 36 -
Quando lo spermatozoo risiede nel testicolo, possiede proteine
intrinseche e quelle di superficie, durante la maturazione alcune di
queste cambiano la loro posizione altre sono sostituite da nuove
d’origine epididimaria.
Raggiunta la maturità, alcune di queste glicoproteine stabilizzano la
membrana plasmatica impedendo premature reazioni acrosomiali.
Biochimica seminale
L’applicazione di test biochimici per quantificare i componenti
essenziali coinvolti nella funzione dello spermatozoo umano ha
permesso l’analisi dei meccanismi cellulari che la controllano. Sono
state così comprese sia le basi molecolari della normale funzione
spermatica che la natura biochimica delle disfunzioni.
Il plasma seminale è il prodotto dell’azione secretoria combinata delle
ghiandole accessorie del tratto genitale maschile.
I principali gruppi di sostanze in esso presenti possono essere così
riassunti: ioni liberi e legati, proteine, enzimi, carboidrati, lipidi e
ormoni, prostaglandine, acido citrico.
Il secreto prostatico rappresenta il 30% dell’intero eiaculato, ricco in
acido citrico, zinco, fosfatasi acida.
Acido citrico: prodotto a livello della prostata è un indice della sua
funzione, valuta la risposta secretoria allo stimolo androgenico.
Fosfatasi acida: prodotta a livello della prostata, partecipa a numerosi
processi enzimatici.
Ioni: lo zinco, contribuisce a stabilizzare la cromatina nucleare
spermatica agendo come stabilizzatore dei ponti disolfuro, insieme al
- 37 -
calcio è coinvolto nei meccanismi che portano alla capacitazione e alla
reazione acrosomiale.
Il secreto delle vescicole seminali ne costituisce più del 50%, le
sostanze più importanti in esso contenute sono il fruttosio e l’acido
ascorbico.
Fruttosio: prodotto a livello delle vescicole seminali è indice della loro
funzione, è utilizzato per lo studio della pervietà dei dotti eiaculatori,
inoltre è importante per il metabolismo e quindi per la motilità dello
spermatozoo.
Il secreto epididimario ne costituisce il 30% ed è ricco in carnitina,
alfa glucosidasi, glicerofosforilcolina.
Carnitina: prodotta nell’epididimo è indice della sua funzione, è utile
per la diagnosi della pervietà epididimodeferenziale.
Aiuta la maturazione degli spermatozoi ed essendo un costituente
proteico, è in grado di migliorare la struttura proteica degli
spermatozoi, aumentandone la motilità e la vitalità.
In uno studio del 2003, svolto dal dipartimento di seminologia e
immunologia riproduttiva dell’università la sapienza di Roma,
pubblicato sul numero di febbraio di “fertility and sterility” 86
pazienti infertili sono stati trattati per due mesi con L-carnitina e
hanno mostrato un netto miglioramento della motilità e della capacità
fecondante degli spermatozoi.
Accanto allo studio biochimico del plasma seminale, d’estremo
interesse è lo studio biochimico dello spermatozoo, che può aiutare a
capire quali sono le cause che possono determinare una riduzione
della motilità e vitalità spermatozooaria.
- 38 -
Stress ossidativo: la molecola d’ossigeno è fondamentale per le
attività cellulari, ma può risultare molto tossica per gli organismi
viventi. La sua riduzione in acqua produce specie reattive ossigenate
(ROS), quali l’anione superossido(O-2), il perossido d’idrogeno
(H2O2), il radicale ossidrile (HO-).
Le proteine, il DNA, i carboidrati e in particolare gli acidi grassi
insaturi di membrana rappresentano i principali substrati per l’attacco
delle ROS.
Fino a poco tempo fa, le ROS erano considerate esclusivamente
tossiche per lo spermatozoo, tuttavia studi più recenti, hanno
evidenziato come piccole quantità di ROS sono necessarie allo
spermatozoo per promuovere la capacitazione e la reazione
acrosomiale.
Tra i sistemi antiossidanti enzimatici presenti nel plasma seminale e
nello stesso spermatozoo vi sono tre enzimi che costituiscono la base
di questo sistema di protezione: il Superossido Dismitasi (SOD) che
accelera la dismutazione dello ione superossido in perossido di
idrogeno, la Catalasi (CAT) che permette la degradazione del
perossido di idrogeno in acqua e ossigeno ed il sistema glutatione per
ossidasi/reduttasi che catalizza la degradazione del perossido di
idrogeno e degli idroperossidi lipidici, utilizzando il glutatione ridotto.
Tra le principali fonti di produzione delle ROS ci sono da una parte gli
spermatozoi e dall’altra i leucociti neutrofili infiltrati nel seme.
Le membrane degli spermatozoi sono molto sensibili ai danni
provocati dai radicali liberi, a causa del loro contenuto d’acidi grassi
insaturi. La distruzione della membrana plasmatica da parte delle ROS
- 39 -
rappresenta il processo di lipoperossidazione. La presenza di doppi
legami permette agli ossidanti di attaccare le catene di carbonio degli
acidi grassi insaturi, producendo radicali lipidici i quali, in condizioni
d’aerobiosi, reagiscono con l’ossigeno per formare un radicale
perossile.
Una volta cominciata la perossidazione lipidica, le reazioni dei
radicali coinvolgono tutta la membrana a causa della stretta vicinanza
degli acidi grassi insaturi. Gli attacchi dei radicali e la conseguente
reazione d’ossidazione lipidica alterano l’architettura della membrana,
diminuendo la sua funzionalità.
ATP nemaspermico: l’ATP rappresenta la principale fonte di energia
di cui necessita lo spermatozoo per iniziare a mantenere i suoi
movimenti di progressione.
Pazienti dispermici con deficit qualitativo e/o quantitativo della
motilità hanno una significativa riduzione dei valori di ATP
nemaspermico rispetto ai controlli fertili.
Isoenzima della lattato deidrogenasi (LDH-X): noxae fisico-chimiche
possono danneggiare irreversibilmente la membrana dello
spermatozoo, determinando come effetto immediato l’aumento della
permeabilità di membrana con la liberazione di costituenti
intracellulari nel plasma seminale.
Dal momento che l’isoenzima LDH-X, normalmente presente solo
all’interno dello spermatozoo, può essere differenziato da altri
isoenzimi presenti nel plasma seminale, il dosaggio di tale enzima può
rappresentare un marker sufficientemente attendibile di un eventuale
danno della membrana nemaspermico.
- 40 -
Scopo del lavoro
Scopo del seguente lavoro è stato quello di valutare la vitalità
spermatozooaria, in campioni di liquidi seminali di pazienti con
diagnosi d’astenozoospermia grave, ai fini di differenziare gli
spermatozoi immobili vivi dagli immobili morti, nello specifico, se
tutti o la maggior parte degli immobili sono morti, si potrebbe
ipotizzare un’alterazione metabolica, di membrana, una tossicità del
plasma seminale ecc, se invece tutti o la maggior parte degli immobili
sono vivi l’ipotesi tenderebbe ad un danno dell’apparato flagellare
nella sua componente meccanica e/o energetica e quindi la strategia
terapeutica applicabile sarebbe chiaramente diversa.
- 41 -
Materiali e metodi
I test di vitalità che sono stati utilizzati, al fine di valutare tale
parametro in liquidi seminali azoospermici, sono quelli con: la sola
eosina, eosina-nigrosina e lo swelling test.
Tecniche per la vitalità spermatozooaria
Eosina
Reagenti
Soluzione 5 g/l d’eosina y in una soluzione acquosa di cloruro di sodio
di 9 g/l.
Procedura
Mescolare una goccia di sperma con una goccia della soluzione
d’eosina su un vetrino portaoggetti, coprire con un coprioggetto ed
osservare dopo 30 sec al microscopio ottico a 400x.
Gli spermatozoi vivi appaiono bianchi; i morti di rosso.
Si contano 200 spermatozoi differenziando i vivi dai morti.
Eosina-Nigrosina
Materiali
Eosina y
Nigrosina
Acqua bidistillata
- 42 -
Filtri 0,22 nm
Provette 0.5 ml
preparazione
Eosina y: 0,1gr/ 10ml acqua bidistillata
Nigrosina: 1gr/ 10ml acqua bidistillata
Procedura
Mescolare una goccia di sperma con 2 gocce d’eosina y, dopo 30sec,
aggiungere 3 gocce di nigrosina e mescolare.
Mettere una goccia di miscela sperma-eosina-nigrosina, su un vetrino
portaoggetti ed eseguire uno striscio entro 30 sec. dall’aggiunta di
nigrosina, lasciare asciugare all’aria ed osservare con olio da
immersione (1000x) ad un microscopio ottico.
Gli spermatozoi vivi sono bianchi, quelli morti si colorano di rosso.
La nigrosina dà una colorazione di fondo scura che rende più agevole
l’analisi.
- 43 -
Figura 22 - Esempio di spermatozoi vivi e morti differenziati con eosina-
nigrosina.
Figura 23 - Esempio di spermatozoi vivi e morti differenziati con eosina-
nigrosina.
- 44 -
Figura 24 - Esempio di spermatozoi vivi e morti differenziati con eosina-
nigrosina.
Figura 25 - Esempio di spermatozoi vivi e morti differenziati con eosina-
nigrosina.
- 45 -
Test di Swelling
Si tratta di un test di valutazione dell’integrità della membrana
spermatozoaria.
Quando lo spermatozoo è incubato in un medium ipoosmotico, se la
membrana è integra, l’acqua entra per ristabilire l’equilibrio osmotico
tra ambiente intra- e quello extracellulare.
L’ingresso d’acqua determinerà il rigonfiamento della cellula e,
l’arrotolamento del flagello.
Materiali
Citrato di sodio bi-idrato
Fruttosio
Acqua bidistillata
Filtri 0,22nm
Provette 0,5ml
Preparazione
Citrato di sodio bi-idrato: 0,735gr
Fruttosio: 1,351gr
Sciogliere in 100ml d’acqua bidistillata
Filtrare
Aliquotare
Procedura
Aggiungere in 1 ml di soluzione ipo-osmotica, 0,1 ml di sperma e
mescolare con una pipetta.
- 46 -
Mantenere per almeno 30 min. a 37C° ed osservare con un
microscopio a contrasto di fase.
Il rigonfiamento del flagello indica gli spermatozoi vivi, quindi si
contano gli spermatozoi rigonfi su un totale di 200 e si calcola la
percentuale media.
Il test va considerato normale quando almeno il 60% degli
spermatozoi va incontro a rigonfiamento della coda, se meno del 50%
mostra il rigonfiamento, l’eiaculato è anomalo.
Figura 26 - Esempio di spermatozoi vivi e morti differenziati con swelling test
- 47 -
Figura 27 - Esempio di spermatozoo vivo evidenziato con swelling test
Figura 28 - Esempio di spermatozoi morti evidenziati con swelling test
- 48 -
Risultati e Conclusioni
Durante il periodo d’attività svolto da Settembre a Maggio 2007, nel
Centro A.S.T.E.R. di Diagnosi e Cura della Sterilità, presso la Clinica
del Mediterraneo in Ragusa, è stato esaminato il liquido seminale di
50 pazienti rivolti al centro per motivi di sterilità. In base alle
caratteristiche di motilità, tali campioni sono stati classificati nel
seguente modo:
• (Motilità progressiva rapida) A > 25%: NORMALE.
• 15%> A < 25%: ASTENOZOOSPERMICO LIEVE
• 5% > A < 15%: ASTENOZOOSPERMICO MODERATO
• A < 5%: ASTENOZOOSPERMICO GRAVE
In tutti questi campioni è stato eseguito il test di vitalità (eosina –
nigrosina & swelling test) al fine di valutare, tra la popolazione di
spermatozoi immobili presenti, il numero di spermatozoi immobili
vivi e quello degli spermatozoi immobili morti.
Come riportato nelle tabelle successive, in tutti i campioni, tra gli
immobili, è stata riscontrata la presenza di spermatozoi vivi e di morti
in diverse percentuali.
- 49 -
CAMPIONI ANALIZZATI
Cod. Pz Mobili Tot % Immobili % Mobili A % Diagnosi
Immobili Vivi %
Immobili Morti %
Morti su 100% Immobili %
1 26 74 4 Asteno G 4 70 94,59
2 42 58 5 Asteno G 8 50 86,21
3 70 30 30 Normo 10 20 66,67
4 30 70 3 Asteno G 15 55 78,57
5 28 72 3 Asteno G 7 65 90,28
6 50 50 6 Asteno M 0 50 100,00
7 21 79 0 Asteno G 3 76 96,20
8 38 62 4 Asteno G 7 55 88,71
9 62 38 35 Normo 12 26 68,42
10 12 88 0 Asteno G 4 84 95,45
11 21 79 5 Asteno G 5 74 93,67
12 21 79 0 Asteno G 3 76 96,20
13 20 80 0 Asteno G 3 77 96,25
14 15 85 1 Asteno G 6 79 92,94
15 69 31 3 Asteno G 0 31 100,00
16 18 82 3 Asteno G 0 82 100,00
17 54 46 6 Asteno M 11 35 76,09
18 80 20 38 Normo 5 15 75,00
19 22 78 2 Asteno G 18 60 76,92
20 71 29 7 Asteno M 4 25 86,21
21 89 11 8 Asteno M 0 11 100,00
22 73 27 28 Normo 8 19 70,37
23 86 14 2 Asteno G 2 12 85,71
24 45 55 4 Asteno G 11 44 80,00
25 43 57 1 Asteno G 7 50 87,72
26 79 21 1 Asteno G 3 18 85,71
27 88 12 2 Asteno G 0 12 100,00
28 76 24 31 Normo 8 16 66,67
29 23 77 0 Asteno G 1 76 98,70
30 81 19 6 Asteno M 0 19 100,00
31 58 42 28 Normo 16 26 61,90
32 85 15 25 Asteno L 1 14 93,33
33 80 20 6 Asteno M 0 20 100,00
34 84 16 15 Asteno L 2 14 87,50
35 80 20 8 Asteno M 1 19 95,00
36 85 15 42 Normo 3 12 80,00
37 66 34 10 Asteno M 2 32 94,12
38 76 24 2 Asteno G 0 24 100,00
39 74 26 18 Asteno L 2 24 92,31
40 91 9 11 Asteno M 3 6 66,67
- 50 -
Cod. Pz Mobili Tot % Immobili % Mobili A % Diagnosi
Immobili Vivi %
Immobili Morti %
Morti su 100% Immobili %
41 94 6 6 Asteno M 0 6 100,00
42 77 23 7 Asteno M 4 19 82,61
43 74 26 35 Normo 3 23 88,46
44 80 20 1 Asteno G 0 20 100,00
45 75 25 7 Asteno M 0 25 100,00
46 79 21 12 Asteno M 0 21 100,00
47 75 25 31 Normo 6 19 76,00
48 50 50 0 Asteno G 10 40 80,00
49 53 47 26 Normo 18 29 61,70
50 61 39 3 Asteno G 4 35 89,74
DISTRIBUZIONE CAMPIONI
Normo
20%
Asteno L
6%
Asteno M
26%
Asteno G
48%
- 51 -
CAMPIONI NORMALI
Cod. Pz Mobili Tot % % Mobili A Immobili % % Immobili Vivi % Immobili Morti % Morti su 100%
Immobili
3 70 30 30 10 20 66,67
9 62 35 38 12 26 68,42
18 80 38 20 5 15 75,00
22 73 28 27 8 19 70,37
28 76 31 24 8 16 66,67
31 58 28 42 16 26 61,90
36 85 42 15 3 12 80,00
43 74 35 26 3 23 88,46
47 75 31 25 6 19 76,00
49 53 26 47 18 29 61,70
Medie
spz mobili 70,60
spz imm vivi 8,90
spz imm morti 20,50
Totale 100,00
Nei campioni normali, abbiamo riscontrato in media il 70,60% di
mobili, invece la percentuale degli immobili si è divisa nell’8,90% di
spermatozoi immobili vivi e nel 20,50% di spermatozoi immobili
morti.
8,90
20,50
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
spz imm vivi spz imm morti
Normo - Immobili
- 52 -
CAMPIONI CON ASTENOZOOSPERMIA LIEVE
Cod. Pz Mobili Tot % % Mobili A Immobili % % Immobili Vivi % Immobili Morti % Morti su
100% Immobili
32 85 25 15 1 14 93,33
34 84 15 16 2 14 87,50
39 74 18 26 2 24 92,31
1,67
17,33
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
spz imm vivi spz imm morti
Asteno L - Immobili
Medie
spz mobili 81,00
spz imm vivi 1,67
spz imm morti 17,33
Totale 100,00
Nei 3 campioni con astenozoospermia lieve, abbiamo riscontrato in
media l’81% di spermatozoi mobili, invece la percentuale degli
immobili si è divisa nell’1,67% di immobili vivi e nel 17,33% di
immobili morti.
- 53 -
CAMPIONI CON ASTENOZOOSPERMIA MODERATA
Cod. Pz Mobili Tot % % Mobili A Immobili % % Immobili Vivi % Immobili Morti % Morti su 100%
Immobili
6 50 6 50 0 50 100,00
17 54 6 46 11 35 76,09
20 71 7 29 4 25 86,21
21 89 8 11 0 11 100,00
30 81 6 19 0 19 100,00
33 80 6 20 0 20 100,00
35 80 8 20 1 19 95,00
37 66 10 34 2 32 94,12
40 91 11 9 3 6 66,67
41 94 6 6 0 6 100,00
42 77 7 23 4 19 82,61
45 75 7 25 0 25 100,00
46 79 12 21 0 21 100,00
1,92
22,15
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
spz imm vivi spz imm morti
Asteno M - Immobili
Medie
spz mobili 75,92
spz imm vivi 1,92
spz imm morti 22,15
Totale 99,99
Nei campioni con astenozoospermia moderata, abbiamo riscontrato in
media il 75,92% di mobili, invece la percentuale degli immobili si è
divisa nell’1,92% di immobili vivi e nel 22% di immobili morti.
- 54 -
CAMPIONI CON ASTENOZOOSPERMIA GRAVE
Cod. Pz Mobili Tot % % Mobili A Immobili % % Immobili Vivi % Immobili Morti % Morti su
100% Immobili
1 26 4 74 4 70 94,59
2 42 5 58 8 50 86,21
4 30 3 70 15 55 78,57
5 28 3 72 7 65 90,28
7 21 0 79 3 76 96,20
8 38 4 62 7 55 88,71
10 12 0 88 4 84 95,45
11 21 5 79 5 74 93,67
12 21 0 79 3 76 96,20
13 20 0 80 3 77 96,25
14 15 1 85 6 79 92,94
15 69 3 31 0 31 100,00
16 18 3 82 0 82 100,00
19 22 2 78 18 60 76,92
23 86 2 14 2 12 85,71
24 45 4 55 11 44 80,00
25 43 1 57 7 50 87,72
26 79 1 21 3 18 85,71
27 88 2 12 0 12 100,00
29 23 0 77 1 76 98,70
38 76 2 24 0 24 100,00
44 80 1 20 0 20 100,00
48 50 0 50 10 40 80,00
50 61 3 39 4 35 89,74
5,04
52,71
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
spz imm vivi spz imm morti
Asteno G - Immobili
Medie
spz mobili 42,25
spz imm vivi 5,04
spz imm morti 52,71
Totale 100,00
- 55 -
CAMPIONI CON ASTENOZOOSPERMIA GRAVE
(>75% immobili)
Cod. Pz Mobili Tot % % Mobili A Immobili % % Immobili Vivi % Immobili Morti % Morti su 100%
Immobili
7 21 0 79 3 76 96,20
10 12 0 88 4 84 95,45
11 21 5 79 5 74 93,67
12 21 0 79 3 76 96,20
13 20 0 80 3 77 96,25
14 15 1 85 6 79 92,94
16 18 3 82 0 82 100,00
19 22 2 78 18 60 76,92
29 23 0 77 1 76 98,70
4,78
76,00
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
spz imm vivi spz imm morti
Asteno G - Immobili
Medie
Spz Immobili 80,78
spz mobili 19,22
spz imm vivi 4,78
spz imm morti 76,00
Totale 100,00
- 56 -
I campioni con astenozoospermia grave sono risultati (24) il 48% dei
totali, di questi, 9 presentavano una percentuale di mobili del 19,22%,
di immobili superiore al 75%, per l’esattezza l’80,78%.
% DI SPERMATOZOI MORTI SU TOTALE IMMOBILI
Categoria % Morti su 100% Immobili
Normo 71,52
Asteno L 91,05
Asteno M 92,36
Asteno G 94,04
71,52
91,05 92,3694,04
60,00
65,00
70,00
75,00
80,00
85,00
90,00
95,00
Normo Asteno L Asteno M Asteno G
- 57 -
Si è deciso di porre l’attenzione proprio sui campioni che potevano
soddisfare entrambi, i due criteri d’inclusione nel lavoro e
precisamente:
1. Campione con Grave astenozoospermia
2. Campione con frazione di spermatozoi immobili > 75% del
totale.
Per tali campioni si è evidenziata una percentuale di spermatozoi
immobili vivi del 4,78 % sul totale, contro il 76,00 % di spermatozoi
immobili morti; nel contempo abbiamo osservato che la frazione di
spermatozoi immobili morti aumentava all’aggravarsi della
astenozoospermia.
Questi dati indicherebbero un arresto della motilità dello spermatozoo
per effettiva perdita di vitalità dello stesso, escludendo, quindi,
l’ipotesi di un’anomalia genetica come causa dell’estesa immobilità.
Tali risultati confermerebbero il razionale per l’esecuzione del test di
vitalità nei campioni di liquido seminale con grave astenozoospermia,
ma non è stato possibile associare alla condizione di astenozoospermia
grave alcun probabile fattore causale precedentemente descritto data
l’esiguità della dimensione campionaria e del gruppo di controllo ai
fini della significatività statistica.
- 58 -
Si ringrazia il centro A.S.T.E.R di diagnosi e cura della
sterilità presso la clinica del Mediterraneo di Ragusa nelle
persone del dott. Giovanni Bracchitta e del dott. Nunzio
Minniti per l’ospitalità dimostrata e le informazioni ricevute.
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