universitatea de ŞtiinŢe agricole Şi medicinĂ · uleiul volatil extras din pin a fost studiat...

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Specializarea: Genetica și ameliorarea plantelor

Ing. LAURA ȘTEFANA GANEA

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

STUDIUL DIVERSITĂŢII ŞI DISTRIBUŢIEI SPAŢIALE

A FONDULUI GENETIC ÎN POPULAŢII DE PIN SILVESTRU (PINUS

SYLVESTRIS L. ) ÎN VEDEREA AMELIORĂRII

Conducător ştiinţific

Prof. dr. Constantin Botez

CLUJ-NAPOCA

2011

Drd. Ing. Laura Ștefana GANEA Rezumatul tezei de doctorat

CUPRINS

CAPITOLUL 1- IMPORTANŢA ECONOMICĂ ................................................................ 5

1.1 INTRODUCERE ............................................................................................................. 5

1.1.1 Scurt istoric a pădurilor din Europa .................................................................................. 5

1.1.2 Pădurile din România ........................................................................................................ 5

1.1.3 Managementul forestier în România ................................................................................. 5

1.1.4 Pinul Silvestru ................................................................................................................... 6

1.1.4.1 Clasificarea ştiinţifică a speciei Pinus sylvestris după Ciocârlan(CIOCÂRLAN, 2000) 6

1.1.4.2 Varietăţi de Pinus sylvestris ........................................................................................... 6

1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru ............................................................................................... 6

1.1.4.4 Distribuţia geografică şi pe altitudine ............................................................................ 7

1.1.4.5 Limitările topografice şi climatice ale habitatului .......................................................... 7

1.1.5 Utilizări .............................................................................................................................. 7

1.1.6 Genetica spaţială ............................................................................................................... 8

1.1.6.1 Privire de ansamblu asupra geneticii spaţiale ................................................................ 8

1.1.6.2 Genetica spaţială: pinul .................................................................................................. 8

1.1.7 Genetica spaţială a Pinului silvestru în România .............................................................. 8

1.1.8 Genetica pinului, diversitatea genetică .............................................................................. 9

CAPITOLUL 2 METODE MOLECULARE DE ANALIZĂ A DIVERSITĂȚII

GENETICE .............................................................................................................................. 9

2.1. ISTORICUL DEZVOLTĂRII AMELIORĂRII PLANTELOR PE CRITERII

MOLECULARE ....................................................................................................................... 9

2.2 DEFINIŢIA MARKERILOR GENETICI ŞI MOLECULARI ................................... 10

2.3 TIPURI DE MARKERI GENETICI .............................................................................. 10

2.3.1 Markeri morfologici ........................................................................................................ 10

2.3.2 Markeri biochimici .......................................................................................................... 10

2.3.3 Markeri moleculari .......................................................................................................... 10

2.4 IMPORTANŢA MARKERILOR MOLECULARI ...................................................... 10

2.5 UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ........................................................ 10

2.5.1 Microsateliții (SSR) ......................................................................................................... 11

2.5.1.1 Evoluţia microsateliţilor: mecanismele de mutaţie și de variaţie SSR ......................... 11

2.5.1.2 Dezvoltarea markerilor microsateliţi ............................................................................ 11

2.5.1.3 Dezvoltarea de microsateliți, transferaea inter-specifică sau inter-genică ................... 11

2


2.6 PARAMETRI GENETICI UTILIZAŢI PENTRU EVALUAREA

VARIABILITĂŢII GENETICE INTRAPOPULAŢIONALE. ......................................... 11


VARIABILITĂŢII GENETICE INTERPOPULAŢIONALE .......................................... 12

2.8 MOTIVAŢIA CERCETĂRII…………………………………….………….……..….12

2.9 SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI ACTIVITĂŢILE DE CERCETARE

ŞTIINŢIFICĂ………………………………………………………………………………..12

CAPITOLUL 3 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE PE TEREN ........................................ 13

3.1 PARTICULARITĂŢI ŞI ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE .............................. 14

3.1.1 Populaţii de Pinus silvestris din România și Ungaria ..................................................... 14

CAPITOLUL 4 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE ÎN LABORATOR ............................. 15

4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI .......................................................... 15

4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI ŞI PREPARAREA SOLUŢIEI DE AND ..................... 15

4.3 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PURITĂŢII ŞI

CONCENTRAŢIEI DE ADN ............................................................................................... 15

4.3.1 Tehnica PCR ................................................................................................................... 15

4.3.1.1 Caracteristici ................................................................................................................. 15

4.3.1.2 Utilizări ......................................................................................................................... 16

4.4 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA MARKERILOR SSR M13.......................... 16

4.5 SEPARAREA ELECTROFORETICĂ ŞI ANALIZA CROMATOGRAFICĂ ......... 16

4.6 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA AMORSELOR SSR PREMARCAŢI

FLUORESCENT .................................................................................................................... 16

4.7 PCR MULTIPLEX .......................................................................................................... 17

4.8 PACHETE INFORMATICE ŞI METODE STATISTICE APLICATE ÎN ANALIZA

ŞI INTERPRETAREA DATELOR ...................................................................................... 17

CAPITOLUL 5 REZULTATE ŞI DISCUŢII ..................................................................... 17

5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII

ŞI CALITĂŢII ACESTUIA .................................................................................................. 17

5.2 REZULTATE OBŢINUTE LA TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA

MARKERILOR SSR M13, PREMARCAŢI FLOURESCENT ŞI ÎN MULTIPLEX .... 17

5.3 DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA ŞI

UNGARIA ............................................................................................................................... 18

5.3.1 Diversitatea genetică intra- şi inter-populaţională .......................................................... 18

5.3.2 Frecvenţele alelice în populaţiile din Romania şi Ungaria ............................................. 18

3


5.4STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE DE PIN

SILVESTRU ........................................................................................................................... 19

5.4.1 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice. .................................................... 19

5.4.2 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice şi a domeniilor teritoriale. ........... 22

5.4.3 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza metodelor de coordonare ....................................... 23

5.4.4 Testul Mantel ................................................................................................................... 23

5.4.5 Coeficientul de consangvinizare ..................................................................................... 25

6 CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI ................................................................................... 25

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ............................................................................................ 28

4


CAPITOLUL 1- IMPORTANŢA ECONOMICĂ

1.1 INTRODUCERE

1.1.1 Scurt istoric a pădurilor din Europa

La sfârşitul Evul Mediu şi după (secolul al cincisprezecelea-șaptesprezecelea),

suprafeţele împădurite au scăzut drastic datorită modificării modelelor de utilizare a

terenurilor. Mai mult, o exploatare intensivă a pădurilor rămase naturale, a început şi

ca urmare, aceste păduri au devenit mai accesibile datorită tăierilor arbitrare

(KUSTER, 1998). În unele ţări, producţia de cărbune pentru industria fierului,

construcţii navale şi extracţia de sare a dus la despădurirea completă a unor suprafeţe

mari. La începutul secolul al optsprezecelea în unele ţări cerinţele legale au intrat în

vigoare pentru a evita o criză de aprovizionare cu lemn şi de a îmbunătăţi starea

pădurilor degradate (CARLOWITZ, 1713).

1.1.2 Pădurile din România

Datorită varietăţii condiţiilor climatice şi de altitudine, România este ţara cu cea

mai mare variaţie din Europa temperată, în ceea ce priveşte vegetaţia în general,

fondul forestier în special. Condiţiile variază de la climat est-mediteranean (Marea

Neagră) până la climat continental şi de la altitudini joase cum ar fi şesurile inundabile

şi zonele de coastă până la munţi înalţi, cu păduri şi arbuşti de-a lungul lizierei şi mai

sus de ea în Carpaţii Meridionali (OSZLANYI, 2004).

Compoziţia pădurilor româneşti cuprinde Fagus care acoperă cea mai mare

suprafaţă 31,5%, pădurile de Quercus 18%, păduri de răşinoase 29,9%., diverse tari

15,7% şi diverse moi 4,9% (RNP, 2009) în pădurile de conifere Pinus 2,1%.

1.1.3 Managementul forestier în România

În perioada comunistă, România a investit masiv în gestionarea pădurilor,

educând unii dintre cei mai buni silviculturii şi specialişti tehnici din Europa (WORLD

BANK, 2002).

În ultimul deceniu suprafaţa împădurită a fost regenerată cu circa 20000 ha

anual, regenerare naturală, reprezentând aproximativ 50% din total. Regenerarea

naturală a pădurilor este o prioritate şi se aplică în mai mult de 90% din suprafaţa

pădurilor. Suprafeţele exploatate prin tăieri la ras şi alte tăieri care trebuie regenerate,

5


reprezintă puţin sub 10% din suprafaţa anuală de împădurit, care este de 10 - 16000 ha.

Activităţile de împădurire au fost reduse după 1990.

1.1.4 Pinul Silvestru

Pinul este un component foarte important al vegetaţiei, ocupând cca. 143

milioane ha (37% din suprafaţa împădurită a globului, 70% din suprafaţa împădurită a

emisferei nordice (MIROV, 1967)). Este cel mai răspândit conifer din lume, după

Juniperus communis.

1.1.4.1 Clasificarea ştiinţifică a speciei Pinus sylvestris după Ciocârlan

(CIOCÂRLAN, 2000)

Regnul: Plantae, Încrengătura: Pinophyta, Clasa: Pinopsida, Ordinul: Pinales,

Familia: Pinaceae, Sub-familia: Pinus, Genul: Pinus, Specia: P. sylvestris.

1.1.4.2 Varietăţi de Pinus sylvestris

Cea mai mare diversitate a genului îl găsim în Mexic şi California. Peste 100 de

varietăţi au fost descrise în literatura botanică, dar numai trei sau patru sunt acum

acceptate. Diferenţele morfologice sunt minime, însă analiza genetică şi a metaboliţilor

secundari (compoziţia răşină) ne dezvăluie diferenţe mai pronunţate.

1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru

Face parte din genul Pinus, un mare gen în cadrul familiei Pinaceae

(Abietineae) din care fac parte arbori şi arbuşti veşnic verzi. Nativ pentru Europa,

Asia, America de Nord, America Centrală, Africa de Nord şi insulele din apropiere

(DALLIMORE, 1948).

Pinul silvestru este un conifer veşnic verde care poate creşte în înălţime până la

25 m, în mod excepţional 35-45m în parcele foarte productive și cu diametrul

trunchiului matur de până la 1 m.

Prezintă două ace în teacă. Este un arbore cu creştere monopoidală, ramurile

sunt dispuse în spirală şi nu prezintă nici un mugure lateral între spirale. Creşterea

monopodială nu este la fel de marcantă ca în cazul Picea abies, iar forma generală

variază de obicei de la coroane înguste spiralate cu ax bine definit până la formaţiuni

stufoase fără nici un ax principal definit. (CARLISLE, 1968).

Arborele este hermafrodit unele exemplare sunt predominant de un anumit sex,

masculin sau feminin.

6

http://ro.wikipedia.org/w/index.php?title=Pinoidea&action=edit&redlink=1


Pinii sunt specii de arbori cu ciclu de viaţă foarte lung. Longevitate medie,

poate ajunge până la 600 de ani. Cel mai bătrân pin încă în viaţă este considerat a fi

Pinus aristata ce are 2435 ani (BRUNSTEIN, 1992).

1.1.4.4. Distribuţia geografică şi pe altitudine

Pinul silvestru (Pinus sylvestris; familia Pinaceae) prezintă cea mai mare

distribuţie geografică, fiind nativ în cea mai mare parte a emisferei nordice, în Europa

şi Asia.

Limita de nord a distribuţiei pinului silvestru în Europa este la 70°29'N în

Norvegia (CARLISLE, 1958) limita sudică este la 37°N în sudul Spaniei. Limita

continentală în partea de vest fiind la 7° W, în nord-vestul Portugaliei (CARLISLE,

1968) iar limita de est la aproximativ 138°E, existând câţiva arbori mai în est,

ajungând pe coasta Pacificului (MALEV, 1955). Limita insulară a Pinului silvestru

este în Scoţia, la 5°38'W. O descriere mai detaliată a distribuţiei P. sylvestris a fost

realizată de STEVEN în 1959.

1.1.4.5. Limitările topografice şi climatice ale habitatului.

Tolerează o gamă largă de condiţii climatice, de la climatul arctic din nordul

Siberiei până la climatul mediteranean din sudul Spaniei şi de la poalele Alpilor

Liguriei, precum şi climatul oceanic umed, de pe coasta de vest a Scoţiei, până la

climatul continental uscat din Europa Centrală şi Asia. Limita de vest este determinată

de bariera creată de Oceanul Atlantic, iar limita de est de către Oceanul Pacific,

excepţia făcând nord-estul Rusiei, unde Munţii Verhoiansk previn în mod eficient

migraţia spre est. Limita de nord a pin scoţian este probabil determinată de

temperatură, deşi nu este clar până la ce temperaturi acest arbore își desfăşoară ciclul

de viaţă.

1.1.5 Utilizări

Uleiul volatil extras din pin a fost studiat încă din antichitate şi este folosit în

special pentru beneficiile aduse în tratarea afecțiunilor respiratorii, ameliorează stările

de oboseală, este antiseptic şi stimulează circulaţia sanguină. Polenul de asemenea se

folosește în tratamente naturiste ca şi energizant, în tratarea afecțiunilor respiratorii,

este recomandat de asemenea pacienţilor hipertensivi, în cazul afecţiunilor renale sau

articulare. Acele, crengile şi scoarţa tuturor speciilor de pin conţin o răşină lipicioasă,

7


cu miros plăcut ce conţine substanţe, cum ar fi colofoniu, terebentină şi uleiuri

esenţiale, care sunt extrase şi folosite cu succes în diferite afecţiuni. Gudronul

medicinal este folosit, în special în medicina veterinară, pentru proprietăţile sale

antiseptice, dar şi ca stimulent, diuretic şi diaforetic. Pinul silvestru este o specie

lemnoasă de mare importanţă comercială în Europa. Lemnul este uşor de prelucrat, cu

proprietăţi mecanice bune şi are multe utilizări. Pădurea boreală, din nordul Europei şi

a Asiei, este zona cu cea mai extinsă pădure de conifere din lume iar pinul este o parte

importantă a ecosistemului său (BONAN et al., 1992). Pinul silvestru este foarte

rezistent la poluare urbană, este predispus la boli parazitare şi a fost folosit ca plantă

pionier pe terenurile degradate, fiind utilizat în reîmpădurirea şi controlul eroziunii,dar

şi ornamental în parcuri și spaţii verzi. (PUPLETT, 2011). Cheresteaua, de asemenea,

este larg întrebuinţată la fabricarea unei game largi de produse, de la bărci la traverse

de cale ferată, mobilier şi jucării. În Statele Unite, din anii 1950 până prin anii 1980,

pinul a fost foarte popular ca şi pom de Crăciun.

1.1.6 Genetica spaţială

1.1.6.1 Privire de ansamblu asupra genetici spaţiale

Înţelegerea proceselor care determină asemănările şi diferenţele dintre

populaţiile izolate spaţial este impetuos necesară pentru biologia evoluţionistă. Atât

speciile vegetale cât și cele animale au fost şi sunt direct influenţate de condițiile de

mediu, implicit de distribuţia spațială şi barierele geografice care intervin în transferul

genelor de la o populaţie la alta.

1.1.6.2 Genetica spaţială: pinul

Pinus sylvestris L. creşte în condiţii ecologice şi geografice diferite, fapt ce a

dus, în procesul de evoluţie, la formarea unui număr mare de forme, ecotipuri şi

subspecii.

1.1.7 Genetica spaţială a Pinului silvestru în România

Pinul silvestru este întâlnit în Munţii Harghitei şi Ciucului, o specie de

importanţă ecologică (BOSCAIU et al., 1999; BĂNĂRESCU, 1973) A fost, de

asemenea, o specie predomină în această zonă (BĂNĂRESCU, 1973). Structura

populaţiei a suferit schimbări dramatice datorită glaciaţiunii, introducerii speciei Picea

abies şi datorită tăierilor excesive. În prezent doar 0,2% din pădurile naturale de Pinus

8


sylvestris mai populează aceeste regiuni. Reducerea drastică a dus la distribuţia

fragmentată a populaţiilor de Pinus sylvestris iar micropopulaţiile izolate au suferit o

scădere a diversităţii genetice, ca urmare a driftului genetic, fluxul genetic redus,

reducerea calităţii habitatului.

1.1.8 Genetica pinului, diversitatea genetică

Au existat numeroase tentative de a subdiviza imensa zonă de distribuție a

pinului în diverse subspecii, care sunt mai degrabă neconvingătoare din cauza lipsei

discontinuităţi clare în distribuţie. În condiţii naturale pinul scoţian nu este infertil în

relaţie cu alte specii de pin, de asemenea, au fost raportaţi hibrizi cu P. nigra, P.

densiflora şi P. mugo. Spre deosebire de alţi taxoni, speciile de pin prezintă o robustă

incompatibilitate de hibridare. Pinul este considerat specia cu cea mai mare

variabilitate genetică din toate speciile, dovedit prin măsuri ale variabilităţii genetice

cantitative (CORNELIUS, 1994) şi diversitatea în studiile aloenzimelor (HAMRICK

et al., 1979).

CAPITOLUL 2 METODE MOLECULARE DE ANALIZĂ A DIVERSITĂȚII

GENETICE

2.1. ISTORICUL DEZVOLTĂRII AMELIORĂRII PLANTELOR PE CRITERII

MOLECULARE

În ziua de azi populaţia globală are o rată de creştere numerică mai mare ca

niciodată. Se presupune că până în anul 2050, populaţia mondială se va dubla şi va

ajunge până la 12 miliarde de indivizi. De fapt s-a estimat că pe plan mondial

producţia de hrană va trebui să se dubleze în următorii 45 de ani. Suprafeţele agricole

cât şi cele forestiere sunt limitate. Cel puţin în ceea ce priveşte viitorul apropiat,

ameliorarea plantelor va avea un rol important. Selecţia fenotipurilor superioare din

populaţiile segregante încă stă la baza ameliorării convenţionale. Ameliorarea pe

termen lung mizează programe bazate pe cicluri repetate de recombinare şi selecţie.

Este importantă exploatarea tuturor posibilităţilor disponibile pentru a maximiza

câştigul genetic pe unitatea de timp şi pentru a reduce scăderea diversităţii genetice

(LINDGREN and MULLIN, 1997; ROSVALL et al., 1998). În cazul în care

heritabilitatea juvenilă este destul de mare, selecţia fenotipică poate fi o metodă

eficientă de a reduce costurile de testare ulterioară a descendenţilor în câmp şi

9


creşterea generală a câştigului genetic (NAMKOONG, 1970; COTTERILL and

JAMES, 1981; WU, 1998).

2.2 DEFINIŢIA MARKERILOR GENETICI ŞI MOLECULARI

Markerii moleculari pun în evidenţă diferenţele dintre secvenţele nucleotidice,

marcând totodată prezenţa unei anumite gene în ADN-ul extras de la diferiţi indivizi.

Formarea sau dispariţia unui marker molecular este determinată de modificarea unei

singure nucleotide dintr-o genă sau chiar de la nivelul ADN-ului repetitiv.

Markerii genetici evidențiază orice diferenţă genotipică sau fenotipică specifică

unui individ, care se transmite în descendenţă, sunt de fapt alele mutante care pot fii

urmărite de-a lungul generaţiilor.

2.3 TIPURI DE MARKERI GENETICI

2.3.1 Markerii morfologici

Markerii morfologici controlează caractere morfologice uşor de evidenţiat,

controlate genetic de către o singură genă.

2.3.2 Markerii biochimici

Controlează însuşiri biochimice care sunt controlate de mai multe gene şi se

bazează pe proprietatea proteinelor de a fi separate prin electroforeză

2.2.3 Markerii moleculari

Markerii moleculari evidenţiază polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear şi

citoplasmatic.

2.4 IMPORTANŢA MARKERILOR MOLECULARI

Caracteristicile markerilor moleculari permit procesul de identificare, selecţie şi

clonare a genelor de interes, precum şi observarea naturii informaţionale a materialului

analizat.

2.5 UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI

Cele mai importante utilizări ale markerilor sunt:

• Stabilirea variabilităţii genetice şi caracterizarea colecţiilor de germoplasmă;

• Amprentarea genetică a varietăţilor, identificarea şi accelerarea dezvoltării

indivizilor care combină alelele favorabile, contribuind la performanţele presupuse

ale hibrizilor

• Estimarea distanţelor genetice între populaţii, şi producerea de seminţe;

10


• Detecţia QTL(qualitative trait loci ) şi monogene;

• Puritatea şi stabilitatea seminţelor şi a materialului vegetal;

• Identificarea de secvenţe utile, gene candidat etc.

2.5.1. Microsateliții (SSR)

Disponibilitatea unei largi game de tehnici de marcare moleculară a condus la

studii comparative între ele, (POWELL et al., 1996). Dintre toate acestea, markerii

SSR au câştigat considerabil importanţă în genetica şi ameliorarea plantelor ca urmare

având multe atribute de dorit, inclusiv disponibilitate, natura multialelică, moştenire

codominantă, reproductibilitate, abundenţă relativă, acoperire extinsă a genomul

(inclusiv la nivelul organelelor), locaţie specifică pe cromozom, posibilitatea

automatizării şi detalii în genotipizare (PARIDA et al., 2009a)

2.5.1.1 Evoluţia microsateliţilor: mecanismele de mutație și de variaţie SSR

Evoluţia SSR, adică orice modificare, creştere sau descreştere a numărului de

repetări, este asociată cu rata de mutaţie. Geneza microsateliţilor este un proces

evolutiv dinamic care s-a dovedit a fi extrem de complex (ELLEGREN, 2004).

2.5.1.2. Dezvoltarea markerilor microsateliți

În ciuda aplicabilităţii largi a markerilor SSR în genetica plantelor, dezvoltarea

lor rămâne o mare problemă la majoritatea speciilor mai ales în cazul culturilor

minore. Acest lucru se datorează faptului că markerii SSR ar trebui să fie izolaţi de

novo la majoritatea speciilor.

2.5.1.3 Dezvoltarea de microsateliți, transferarea interspecifică sau intergenică

Studiile de genetică comparativă au dovedit că atât genele cât şi ordinea lor în

genom sunt înalt conservate în cadrul speciilor înrudite. Datele obţinute în urma

secvenţierilor realizate la mai multe specii de plante au dovedit suficientă similaritate

între genomurile a două sau mai multe genuri/specii strâns legate. Datorită acestui fapt

markerii SSR pot fi transferaţi la specii din acelaşi gen.


VARIABILITĂŢII GENETICE INTRAPOPULAŢIONALE.

Prin populaţie se înţelege un grup de indivizi al unei specii care coexistă în

aceeaşi arie geografică. Pentru fiecare populaţie în parte se calculează separat

parametrii variabilităţii genetice intra-populaţionale. Sunt calculate valori medii ale

11


acestor parametri pentru mai multe populaţii, după care acestea se compară între ele cu

ajutorul datelor obţinute.


VARIABILITĂŢII GENETICE INTERPOPULAŢIONALE

Distanţa genetică Nei (1972)

Printr-o distanţă genetică se pot cuantifica deosebirile şi asemănările între

structura genetică a două populaţii, atât la nivel genic cât și genomic. Metoda de

calculare a distanţei genetice promovată de Nei presupune că diferențele genetice sunt

datorate atât drift-ului genetic cât şi mutației (NEI et al., 1972).

2.8 MOTIVAŢIA CERCETĂRII

În cadrul acestei lucrări a fost propusă studierea, cu ajutorul tehnicilor de

biologie moleculară (PCR, SSR) a unor populaţii de Pin silvestru din România şi

Ungaria.

2.9 SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI ACTIVITĂŢILE DE CERCETARE ŞTIINŢIFICĂ

Cercetările prezentate au ca scop studierea diversităţii genetice intra- şi inter-

populaționale şi a structurii genetice spaţiale a populaţiilor de pinului silvestru (Pinus

sylvestris L.) în arealul studiat, cu ajutorul markerilor moleculari (nSSR). Aceste

elemente sunt de un interes major în procesul de adaptabilitate climatică, producţie şi

conservare a resurselor genetice forestiere a acestei specii. În acest proiect au fost

studiate 15 populaţii provenite din România şi Ungaria de la diferite altitudini şi

latitudini.

Cercetările efectuate au urmărit în primul rând evaluarea diversităţii genetice în

vederea caracterizării structurii genetice şi a identificării modelului de distribuţie a

variaţiei genetice în populaţii naturale de pin silvestru din România şi Ungaria.

Analiza comparativă între populaţiile naturale, precum şi utilizarea unor metode

noi de cuantificare a fluxului de gene a avut ca scop estimarea unui posibil efect al

utilizării de materiale forestiere de reproducere de origine necunoscută asupra

integrităţii genetice a surselor autohtone de pin silvestru.

Obiectivele urmărite şi activităţile desfăşurate în cadrul proiectului de cercetare:

1. Recoltarea materialului vegetal. Pentru aceasta etapă a fost necesară

stabilirea populaţiilor ţintă în arealul luat în studiu, populaţii rezervaţii de seminţe,

12


surse genetice, şi recoltarea propriuzisă a probelor biologice (ace şi muguri) de la 20

de indivizi din fiecare populaţie, aflaţi la minim 50 de metri distanţă.

2. Testarea şi transferarea unor markeri SSR disponibili la alte specii de pin la

Pinus sylvestris prin studiul bibliografiei de specialitate în vederea alegerii markerilor

utilizabili, testarea markerilor candidaţi şi optimizarea reacţiei de amplificare.

3. Dezvoltarea sistemului multiplex bazat pe markerii aleşi şi folosirea sondelor

marcate fluorescent în vederea automatizării procesului genotipizare.

4. Caracterizarea locilor luaţi în studiu, utilizând amorse nemarcaţi, marcaţi

fluorescent şi în multiplex.

5. Evaluarea diversităţii genetice intra- şi inter-populaţionale în populaţii

naturale de pin autohton din zona luată în studiu, cu ajutorul markerilor nSSR;

6. Analiza structurii genetice spaţiale, în populaţii naturale reprezentative sub

raportul tipului de ecosistem forestier şi al nivelului altitudinal;

7. Stabilirea coeficientului de consangvinizare a populaţiilor studiate.

8. Formularea de recomandări pentru o conservare eficientă a resurselor

genetice forestiere de pin şi privind controlul transferului materialelor forestiere de

reproducere.

CAPITOLUL 3 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE PE TEREN

În cadrul acestui studiu au fost luate în considerare 13 populaţii naturale de pin

silvestru din România și 2 populaţii din Ungaria. Alegerea populaţiilor a fost făcută în

aşa fel încât să cuprindă o arie de distribuție geografica a pinului cât mai vastă, atât în

interiorul arcului Carpatic cât şi în exterior, conform Catalogului Rezervaţiilor Surse

de Seminţe, catalog întocmit la nivelul Regiei Naţionale a Pădurilor, care cuprinde

întreaga suprafaţă a ţării.

13


Tab 1

Locațiile alese pentru recoltare. Sites for sampling

Nr. No.

Țara Country

Judeţul County

Localitatea Location

Latitudine Latitude

Longitudi ne Longitude

Altitu dine Altitu de

Nr. probe No. samples

1.1 Romania Alba Baia de Arieş 46°24’33” 23°20’00” 514m 20

1.2 Romania Alba Pianu de Sus 45°53’32” 23°30’09” 426m 20

1.3 Romania Harghita Toplița 46°54’40” 25°20’35” 750m 20

1.4 Romania Mureş Gurghiu 46°46’28” 24°51’16” 609m 20

1.5 Romania Mureş Reghin 46°53’02 24°31’42” 484m 20

1.6 Romania Sibiu Agnita 46°00’53” 24°45’47” 557m 20

2.1 Romania Braşov Zărneşti 45º33’59” 25º19’31” 747m 17

2.2 Romania Caraş-Severin Anina 45º05’60” 21º51’41” 615m 20

2.3 Romania Hunedoara Pui 45º31’24” 23º06’05” 476m 19

2.4 Romania Suceava Poiana Stampei 47º20’59” 21º51’12” 917m 20

2.5 Romania Timişoara Nădragu 45º39’00” 21º11’00” 850m 19

2.6 Romania Vâlcea Voineasa 45º28’12” 23º52’01” 1240m 16

2.7 Romania Vrancea Tulnici 45º55’18” 26º38’57” 702m 20

3.1 Ungaria Győr-Moson-Sopron

Fenyőfő 47º5’20” 17º45’47” 264m 20

3.2 Ungaria Vas Velemér 46º44’04” 16º22’35” 213m 18

3.1 PARTICULARITĂŢI ŞI ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE

3.1.1 Populaţii de Pinus silvestris din România și Ungaria

Recoltarea materialului vegetal s-a desfășurat în doua etape.

Prima etapa s-a desfășurat în aprilie-mai 2010.Aceasta etapa a fost coordonata

de colega mea drd. Ing. Valentina Floran. Populaţiile incluse în aceasta etapa s-au

concentrat în judeţele: Alba, Harghita, Mureş şi Sibiu.

A doua etapă s-a desfășurat în perioada 27 septembrie-20 octombrie 2010.

Recoltarea a fost efectuată în judeţele: Braşov, Caraş-Severin, Hunedoara, Suceava,

Timişoara, Vâlcea şi Vrancea. De asemenea am extins aria de studiu şi în afara ţării,

14

http://en.wikipedia.org/wiki/Gy%C5%91r-Moson-Sopron

http://en.wikipedia.org/wiki/Gy%C5%91r-Moson-Sopron


luând în considerare doua populaţii de pe teritoriul Ungariei cu scopul desluşirii

distribuţiei spațiale a pinului în zonă şi nu numai pe teritoriul ţării noastre.

CAPITOLUL 4 ACTIVITĂŢI DE CERCETARE ÎN LABORATOR

4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI

1. Izolarea ADN-ului din probele recoltate în perioada aprilie-mai 2010 a fost

realizată în cadrul Departamentului de Biotehnologii a Universităţii de Științe Agricole

şi Medicină Veterinară, Cluj-Napoca. ADN-ul a fost extras după protocolul publicat de

LODHI şi colaboratorii în 1994 şi modificat de RODICA POP şi colaboratorii în 2003

2. Izolarea ADN-ului din probele recoltate în perioada septembrie-octombrie

2010 a fost realizată în laboratoarul centrului de cercetare Umea Plant Science Center

(UPSC) sub egida Swedish University of Agriculture (SLU Umea, Sweden). În acest

caz protocolul folosit a fost cel dezvoltat de DOYLE și DOYLE în 1987.

4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI ŞI PREPARAREA SOLUŢIEI DE ADN

Din punct de vedere practic, purificarea ADN-ului presupune: îndepărtarea din

lizat a tuturor componenţilor, cu excepţia ADN-ului şi⁄sau fracţionarea ADN-ului,

adică separarea diferitelor specii de ADN în categorii distincte. Au fost efectuate

diluţii la concentraţia de 50 ng/µl.

4.3 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PURITĂŢII ŞI

CONCENTRAŢIEI DE ADN

În cazul probelor luate în studiu a fost folosit Spectrofotometru Nanodrop®

ND-1000 și Fluorometrul Qubit.

4.3.1 Tehnica PCR

Această metodă a fost descoperită în anul 1988 de către Karl Mullis şi

colaboratorii lui, pentru care a primit premiul Nobel pentru Chimie. Tehnica PCR

(Polymerase Chain Reaction), reacţia de polimerizare în lanţ, are la bază o tehnologie

în vitro care imită capacitatea naturală de replicare a ADN-ului şi care constă în

generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvenţe nucleotidice ţintă (ADN sau

ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific.

4.3.1.1 Caracteristici

Metoda este foarte sensibilă la "contaminare" cu ADN străin; o cantitate cât de

mică de ADN provenit de la alt individ poate compromite rezultatul analizei genetice.

15


Amplificarea nespecifică poate constitui o problemă; aceasta este posibilă

datorită faptului că polimeraza poate fi activă şi la temperaturi joase

Amplificarea este posibilă, adesea, utilizând amorse care au fost

"fabricate"pentru alte specii iar lungimea maximă a segmentelor amplificate este de

aproximativ 5000 baze pentru PCR standard şi maximum 35 kb pentru kiturile "Long

PCR".

4.3.1.2 Utilizări

Amplificarea unei anumite secvenţe de ADN cunoscute se realizează prin

tehnica PCR; produşii de amplificare pot fi utilizaţi fie pentru secvenţiere, fie pentru

clonare sau pentru alte utilizări; marcarea PCR se poate utiliza şi în contextul selecţiei

asistate de markeri; markerii PCR sunt de tip codominant - se poate face genotipizarea

indivizilor pentru o anumită genă.

4.4 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA MARKERILOR SSR M13

După studiul articolelor de specialitate în grupul nostru au fost testate peste 300

de perechi de amorse SSR nemarcate fluorescent, transferate la Pinus sylvestris de la

alte specii ale genului Pinus. Au fost alese pentru acest studiu un număr de 9 amorse

SSR M13.

4.5 SEPARAREA ELECTROFORETICĂ ŞI ANALIZA CROMATOGRAFICĂ

Lungimea ampliconilor a fost măsurată cu ajutorul electroforezei capilare

Beckman coulter CEQ 8000 sequencer.

4.6 TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA AMORSELOR SSR PREMARCATE

FLUORESCENT

Din colecţia de amorse disponibilă în grupul nostru (peste 300 de amorse testate

iniţial de drd Sara Abrahamsson) am ales un număr de 94 de amorse care au fost

testate din nou în diferite condiţii. Scopul final al acestui test a fost dezvoltarea unui

sistem de amplificare multiplex pentru a reduce costurile de rulare a electroforezei

capilare, şi am decis că folosirea amorselor premarcate fluorescent va reduce

amplificarea nespecifică, astfel cromatogramele putând fi analizate. Au fost alese

pentru acest studiu un număr de 34 de perechi de amorse SSR.

16


4.7 PCR MULTIPLEX

După testarea iniţială au fost alese 34 de perechi de amorse, în funcţie de

similaritatea condiţiilor de amplificare (temperatură şi concentraţie de MgCl2) şi de

dimensiunea ampliconului (100pb-350pb). Pe baza dimensiunii ampliconilor au fost

concepute două combinaţii de amplificare multiplex a probelor cu ajutorul amorselor

premarcate fluorescent produse de Sigma. Fluorocromii folosiţi pentru marcarea

acestor amorse au fost: Cy5- semnalul emis este albastru, Cy5.5- semnalul emis este

verde, D2- semnalul emis este negru.

4.8 PACHETE INFORMATICE ŞI METODE STATISTICE APLICATE ÎN

ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR

Datele obţinute în urma interpretării cromatogramelor, au fost prelucrate

statistic, în vederea evidenţierii diversităţii genetice, la nivelul markerilor nucleari, în

populaţiile luate în studiu. Pachetele informatice au cuprins diferite programe de

analiză genetică: FSTAT 2.9.3 (GOUDET, 1995), ARLEQIUN (EXCOFFIER, 2005),

COANCESTRY 1.0 (WANG, 2007), BAPS 5.3 (CORANDER, 2003), TESS

(DURAN et al., 2009) şi AIS (MILLER, 2005), fiind determinați diferiţi parametrii.

CAPITOLUL 5 REZULTATE ŞI DISCUŢII

5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA

CANTITĂŢII ŞI CALITĂŢII ACESTUIA

În urma procesului de extracţie ADN am obţinut concentraţii cuprinse între

1000 ng/µl şi 6000 ng/µl într-un volum final de 50 µl. Puritatea probelor a fost

estimată cu ajutorul spectrofotometrului. Raportul optim este 1,5-2,0 observat şi în

cazul probelor noastre. Nu a fost observată o fragmentare a ADN-ului în probele

obţinute.

5.2 REZULTATE OBŢINUTE LA TRANSFERAREA ŞI OPTIMIZAREA

MARKERILOR SSR M13, PREMARCAŢI FLOURESCENT ŞI ÎN MULTIPLEX

Amplificările nespecifice datorate ataşării sondelor fluorescente M13 direct la

ADN-ul genomial şi nu la amorsei specifici au făcut analizarea populaţiilor imposibilă.

Calitatea amplificării a fost net superioară în cazul folosirii kitului de la Qiagen,

comparând cu rezultatele obţinute cu ajutorul reactivilor de la VWR în cazul amorselor

nemarcate fluorescent și a celor premarcate fluorescent.

17


În urma acestor experimente a fost observată o transferabilitate de 10% la Pinus

sylvestris în cazul markerilor dezvoltaţi la Pinus taeda.

Pe baza acestor rezultate au fost dezvoltate două complexe multiplex:

(M1):PtTx 3013, PtTx 3016, PtTx 3020, PtTx 4011, PtTx 3049; (M2): Ctg 4363,

SPAC 12:5, Ctg 1376, PtTx 3107, PtTx 4001.

5.3 DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA ŞI

UNGARIA

Diferenţele dintre indivizii unei populaţii/specii pot fi puse în evidenţă cu

ajutorul markerilor moleculari. Secvenţele de ADN amplificate au fost separate în

funcţie de mărimea lor prin electroforeză capilară. Vizualizarea s-a realizat cu ajutorul

senzorului de fluorescenţă deoarece au fost folosite amorse marcate fluorescent.

5.3.1 Diversitatea genetică intra- şi inter-populaţională

Pe baza rezultatelor obţinute au fost calculați parametrii diversităţii şi

diferenţierii genetice. Au fost analizat astfel 10 loci nucleari. Nu toţi locii s-au dovedit

a fi polimorfici pentru toate populaţiile analizate, putând fi observată prezenţa alelelor

nule pentru care este necesară o analiză mai amănunţită în viitor.

5.3.2 Frecvenţele alelice în populaţiile din Romania şi Ungaria

La nivelul celor 10 loci analizaţi în cele 15 populaţii (13 din Romania şi 2 din

Ungaria), au fost identificate un număr de 170 de alele, media de alele pe locus de 17

(numărul total de alele/numărul de loci analizaţi). Numărul maxim de alele per locus

găsit a fost de 45 pentru locusul SPAC 12:5 iar numărul minim de 9 alele pentru

locusul PtTx 3020. Aceste frecvenţe au fost calculate cu ajutorul programelor FSTAT

2.9.3 (GOUDET, 1995) şi ARLEQIUN (EXCOFFIER, 2005).

Diferenţierea genetică între populaţiile din România şi Ungaria, la nivelul

ADN-ului nuclear a înregistrat o valoare de Gst=0,053 ceea ce indică o diferenţiere a

populaţiilor semnificativă. Nivelul diversităţii genetice totale (HT) se situează în jurul

valorii de 62%. Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice a fost găsită în

populaţia din Brașov (71%) iar cea mai scăzută în populația din Sebeș (54%) și Vâlcea

(55%).

Pentru a testa dacă populaţiile au suferit o constrângere (fenomenul de

bottleneck) de-a lungul anilor, indicele Garza-Williamson a fost calculat înregistrând

18


valori cuprinse între 0,26 în popluaţia din Agnita şi 0,37 în populaţia din Suceava,

Romania. ). Toate populațiile studiate au prezentat o diversitate genetică substanțială

însă și semene ale unei depresiuni demografice (bottleneck). Indicele FK este apropiat

de 0, evidențiind faptul că toate populațiile sunt în echilibru Hardy-Weinberg, cu un

mic deficit de heterozigoţi.

Indicele de diferențiere FST

Acest indice a fost propus de WEIR și COCKERHAM (1984). Cu cât valoarea

acestuia este mai apropiată de 1, cu atât populațiile respective sunt mai diferențiate

genetic.

Cele mai mici diferențieri genetice (FST) au fost observate între populaţiile

dintre Sebeș și Velemér (-0.00119), cea mai mare diferențiere a fost observată între

populațiile din Baia de Arieș și Agnita (0.15761). Între majoritatea populațiilor a fost

observată o diferențiere semnificativă de peste 0,05.

5.4 STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE DE PIN

SILVESTRU

5.4.1 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice.

Pentru realizarea acestui obiectiv am folosit programul BAPS 5.3 (Bayesian

Analysis of Population Structure) (CORANDER, 2003) care funcționează pe baza

frecvenţei alelelor markerilor moleculari şi numărul de grupuri deviate din punct de

vedere genetic dintr-o populaţie variabile alese aleatoriu. Acest program nu ia în

considerare barierele geografice.

Inițial am rulat programul considerând fiecare individ ca făcând parte dintr-un

singur cluster, grupând astfel indivizi. Au fost calculate 5, 10 şi respective 15 clustere

de indivizi.

Distribuţia indivizilor din clusterul 1 este în majoritatea populaţiilor excepţie

făcând populaţia din Vâlcea. Cea mai mare pondere de indivizi din clusterul 1 fiind

regăsită în populaţia din Suceava. Indivizii aparţinând clusterului 2 sunt răspândiţi în

majoritatea populaţiilor excepţie făcând populaţiile din Agnita, Baia de Arieş,

Hunedoara, Topliţa şi Timiş. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup fiind

observată în cadrul populaţiei din Fenyőfő. Indivizii aparţinând clusterului 3 sunt

distribuiţi în majoritatea populaţiilor, singura excepţie fiind populaţia din Baia de

19


Arieş. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup poate fi observată în populaţia

din Agnita. Distribuţia indivizilor aparţinând clusterului 4 este observată în 60% din

populaţii, lipsind din populaţiile din Baia de Arieş, Braşov, Caraş-Severin, Reghin,

Vâlcea şi Vrancea. Cea mai mare pondere a indivizilor din acest grup poate fi

observată în populaţia din Hunedoara.

Observând distribuţia indivizilor aparţinând clusterului 5 putem spune ca

aceștia sunt regăsiți în toate populaţiile neexistând excepţie. Cea mai mare pondere a

acestor indivizi se regăseşte în populaţia din Timiş. Inexistența unei structuri clare în

distribuţia indivizilor din clusterele mai sus menţionate se datorează fluxului de gene

puternic. Acesta este datorat polenizării libere existente la pin și nu se poate fi

observată o reducere a variabilităţii în populaţii. De asemenea recombinarea la nivelul

AND-ului nuclear a adus un aport semnificativ în diversitatea populaţiilor, la nivelul

markerilor nucleari.

De departe câteva populaţii se diferenţiază datorită proporțiilor de indivizi din

diferitele clustere. Populaţia din Agnita, care prezintă o proporţie foarte ridicată a

indivizilor din clusterul 3 de indivizi (peste 75%) însă compensează prin prezenţa de

indivizi din alte 3 clustere. Populaţia din Baia de Arieş, datorită lipsei de variabilitate

prin prezenţa indivizilor din doar 2 clustere, însă aceste doua clustere sunt cele mai

răspândite, compensând astfel. Populaţia din Suceava, datorită proporției mari de

indivizi din clusterul 1 (peste 60%) şi variabilitatea mare în populaţie datorită

prezenţei indivizilor din toate clusterele într-o proporţie mai mare sau mai mică. Şi nu

în ultimul rând populaţiile din Vâlcea şi Hunedoara cu o proporţie mare de indivizi din

clusterul 3 (50% şi respectiv 45%) şi prezenţa indivizilor din alte două clustere.

Gruparea indivizilor în 10 sau 15 clustere a dovedit o mare variabilitate în

populaţii fiind observaţi indivizi cu genotipuri unice care formează clustere unice.

Utilizând în analiză, în loc de indivizi unici, populaţiile ca unitate structurală

am obţinut rezultate similare. Cerând gruparea populaţiilor în maxim 5 clustere am

obținut un număr de 3 clustere.

Primul cluster, conţine o singură populaţie, populaţia din Agnita, evidenţiind

diferenţe puternice între această populaţie şi restul. Aceste diferenţe se regăsesc în

frecvenţa genelor (prezentate în subcapitolul anterior) şi mai ales în prezenţa alelelor

20


private la nivelul acestei populaţii. Al doilea cluster grupează majoritatea populaţiilor

indicând un flux genetic puternic, între populaţii. Al treilea cluster grupează o singură

populaţie, cea din Vâlcea.

Această populaţie se diferenţiază de toate celelalte datorită provenienţei

indivizilor din doar 3 grupuri, în proporţii total diferite de celelalte populaţii, datorită

frecvenţelor alelelor foarte diferite de media populaţiilor (prezentat în subcapitolul

anterior) şi datorită prezenţei unui număr mare de alele private la nivelul acestei

populaţii. Aceste rezultate sunt susţinute şi de studiul realizat de ROBLEDO-

ARNUNCIO şi ROUSET în 2010 în care a fost dovedită o diferențiere mai mare între

populaţiile aflate pe versanţii opuşi ai aceluiaşi lanţ muntos, faţă de populaţiile aflate

pe versanţi opuși în două lanţuri muntoase diferite, situate în aceeaşi vale. În cazul

nostru populaţiile din Agnita şi Vâlcea se află în aceleaşi condiţii, explicând astfel

diferenţierea şi respective gruparea în clustere diferite.

Forţând gruparea populaţiilor studiate în 2 clustere am observat gruparea

populaţiei din Agnita cu celelalte populaţii, identificând astfel o similaritate genetică

mai ridicată a acestei populaţii cu celelalte comparative cu populaţia din Vâlcea. Acest

lucru se datorează probabil numărului mai mare de clustere dispuse în această

populaţie, comparând-o cu populaţia din Vâlcea.

Datorită faptului că acest program nu ia în considerare datele geografice, care

influențează puternic distribuţia spaţială, am impus separarea populaţiilor în două

grupuri, un grup în partea de centru vest a României, luând în considerare populaţiile

din Transilvania şi Banat, împreună cu populaţia din nord vestul Ungariei, Fenyőfő, şi

un grup al populaţiilor în afara Arcului Carpatic, populaţiile din Vâlcea, Vrancea,

Suceava împreună cu populația din vestul Ungariei, Velemér.

Analizând populaţiile din primul grup, impunând 5 clustere, am obţinut un

maxim de 3 clustere. Primul cluster conţinând populaţia din Agnita, care am observat

din nou ca se diferenţiază de restul populaţiilor, un al doilea cluster conţinând

majoritatea populaţiilor, inclusiv populaţia din Ungaria, care nu se diferenţiază la

nivelul markerilor nucleari de celelalte populaţii, şi un al treilea cluster care conţine

populaţia din Baia de Arieş. Observând frecvenţa indivizilor din analiza grupării pe

indivizi, observăm o lipsă de variabilitate comparativ cu celelalte populaţii. În această

21


populaţie fiind incluşi indivizi din doar două clustere. Acest lucru se poate datora

managementului forestier, datorită folosiri de puieți, proveniţi din aceeași sursă de

seminţe, la înființarea acestei suprafeţe forestiere.

Forţând gruparea populaţiilor în două clustere observăm alipirea populaţiei din

Baia de Arieş la clusterul conţinând restul populaţiilor, rămânând un alt cluster

conținând populaţia din Agnita. Acest lucru se datorează faptului ca populaţia din Baia

de Arieş conţine indivizi din cele două cele mai frecvente clustere de indivizi, de aici

şi similaritatea ridicată, comparativ cu populaţia din Agnita.

Analiza grupului de populaţii din exteriorul Arcului Carpatic, impunând

formarea de 5 clustere, am obţinut un maxim de 3 clustere. Primul cluster conţinând

populaţia din Suceava, aceasta datorându-se variabilităţii mari întâlnite la nivelul

acestei populaţii. Acest lucru poate fi observat prin prezenţa în această populaţie a

indivizilor din toate cele 5 clustere de indivizi, dar separarea se datorează şi prezenţei

unui număr mare de indivizi din primul cluster, mai mare comparativ cu populaţia din

Vrancea, acest grup de indivizi neregăsindu-se în populaţia din Vâlcea. Al doilea

cluster grupează populaţiile din Vrancea şi Velemér, datorită similarităţii distribuţiei

alelelor. Al treilea cluster conţine populaţia din Vâlcea, despre diferenţierea căreia am

discutat deja.

Forţând formarea a numai 2 clustere, se observă gruparea populaţiei din

Suceava în clusterul format anterior de populaţiile din Vrancea şi Velemér. Populaţia

din Vâlcea rămâne în continuare în cluster diferit.

Populaţia din Vâlcea pare sa fie cea mai diferită populaţie dintre cele luate în

studiu în cadrul acestei populaţii au fost observate atât frecvenţe alele alelelor mult

diferite faţă de medie cât şi prezenţa unui număr mare de alele private. Următoarea

populaţie care se diferenţiază de restul populaţiilor este cea din Agnita şi este urmată

de populaţiile din Baia de Arieş şi Suceava.

5.4.2 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza datelor genetice şi a domeniilor

teritoriale.

Acest tip de algoritm se bazează pe teselaţia liberă, şi se numește aşa deoarece

poligoanele sunt independente de situl de prelevare a probelor. Ideea centrală este ca

indivizii vecini au o probabilitate mai mare sa fie similari. Analiza datelor prin această

22


metodă necesită două etape. Prima, definirea vecinilor, în cazul teselaţiei, vecinătatea

indivizilor se bazează pe vecinătatea poligoanelor de care aparţin. A doua, modelarea

probabilităţii ca indivizii vecini sa fie și similari. Rezultatul analizei este reprezentarea

grafică a poligoanelor în diferite culori. Fiecare culoare reprezintă aparţinerea

populaţiei sau a populaţiilor, din acel poligon, unui cluster. Această metodă este greoi

de interpretat şi necesită experienţă, deoarece fiecare grafic este generat diferit în

funcţie de schema de recoltare a probelor.

Se poate observa lipsa unei structuri, între populaţiile luate în studiu. Clustere

unice au fost observate la nivelul populaţiilor din Timiş, Hunedoara, Sebeş,Vâlcea,

Agnita, Vrancea, Suceava şi Baia de Arieş. Aceste Rezultate susţin rezultatele obţinute

în urma analizei distribuţiei spaţiale cu ajutorul programului BAPS. Populaţiile

menţionate mai sus prezentând diferenţieri profunde la nivelul frecvenţelor alelelor.

5.4.3 Analiza distribuţiei spaţiale pe baza metodelor de coordonare

Cea mai populară metodă este PCA (principal components analysis). Metoda

transformă un set de observaţii a unor variabile posibil corelate în valori necorelate

numite componente principale care ulterior pot fi ordonate (JOMBART et al., 2009

review).

Analiza PCA a componentelor principale calculate pe baza frecvenței alelelor a

dovedit existența unei zone cu frecvente scăzute, și anume populațiile din Baia de

Arieș, Sebeș, Hunedoara și Vâlcea. În aria de studiu pot fi observate și două zone unde

PCA a determinat o frecvență foarte ridicată, prima zonă fiind în centrul țării și

cuprinde populațiile din Agnita, Gurghiu, Reghin și Toplița, a doua zonă cuprinde

populația din Timiș și Caraș-Severin. Cu valori medii ale frecvenței alelelor s-au

prezentat populațiile din Brașov, Fenyőfő, Velemér, Suceava și Vrancea. În cadrul

acestei analize observam formarea a 5 clustere, două cu frecvențe alelice ridicate, două

cu frecvențe alelice medii, și un cluster cu frecvența alelică scăzută.

5.4.4. Testul Mantel

Testele Mantel (MANTEL, 1967) sunt folosite, de obicei, pentru a evalua

corelaţia dintre asemănările şi diferenţele între matrici (MANTEL 1967; SOKAL şi

ROHLF 1995).

23


Corelaţia dintre distanţa genetică şi distanţa geografică, a fost determinată prin

testul Mantel în programul AIS “Allele în Space” (MILLER, 2005).

Rezultatele testului Mantel indică o valoare negativă a coeficientului de

corelaţie (r) între distanţa genetică şi distanţa geografică de -0,0582 nesemnificativ

statistic, cum de altfel se aştepta luând în calcul aşezarea geografică şi orografia

regiunii luate în studiu.

Analiza autocorelaţiei spaţiale a fost folosită în vederea evidențierii structurii

genetice spaţiale.

Această analiză a urmărit analiza distribuţiei spaţiale a frecvenţelor alelice

pentru fiecare populaţie. În cazul de faţă, coeficientul de autocorelaţie a fost calculat

ca medie a tuturor locilor polimorfici, pentru 10 clase de distanţă a câte 100 km

fiecare. Calculele privind autocorelaţia spaţială au fost efectuate cu ajutorul

programului AIS (MILLER 2005).

Pentru populaţiile din România şi Ungaria pe baza rezultatelor ADN-ului

nuclear valoarea distanţei genetice calculată pentru fiecare clasă de distanţă Ay a avut

valori cuprinse între 0.53 şi 0.63. Pentru media distanţei genetice s-a înregistrat o

valoare de Ay = 0.5870 ceea ce denotă faptul că indivizii din fiecare clasă de distanţă

sunt diferiţi din punct de vedere genetic.

Se observă însă lipsa autocorelaţiei spaţiale în cazul datelor analizate. Nu există

o izolare a populaţiilor, diferențele dintre populații nu sunt datorate distanței, de

exemplu populaţiile din Ungaria şi cea din Suceava sau Vrancea sunt situate la o

distanţă foarte mare una de cealaltă însă diferențele genetice nu sunt datorate distanței.

Aceste rezultate sunt similare cu rezultatele Testului Mantel, evidențiind

aceeași idee şi anume, lipsa unei corelaţii între distanţa genetică dintre

indivizi/populaţii şi distanţa geografică. Diversitatea dintre indivizi, respectiv populaţii

s-a datorat mai degrabă orografiei, munţilor.

Metoda interpolării a fost folosită pentru vizualizarea modelerelor diversităţii

genetice în conformitate cu terenul/relieful zonei analizate. Am utilizat această metodă

pentru a “întării”, confirma rezultatele obţinute cu ajutorul programului BAPS și

TESS. Cum a fost de așteptat nu există o grupare clară a populațiilor, structura lipsind.

24


5.4.5 Coeficientul de consangvinizare

Deși nu există o evidențiere a unei structuri spațiale specifice iar analizele

efectuate au evidențiat o depresiune populațională foarte evidentă în toate populațiile,

aceste lucruri nu sunt datorate consangvinizării.

Folosind programul Coancestry (WANG, 2007), am obținut coeficientul de

înrudire după RIRLAND, 1996. Acesta este, nesemnificativ pentru toate populațiile.

6 CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

Extracţia ADN a dat rezultate satisfăcătoare cu ambele protocoale folosite.

Markerii SSR nucleari sunt markerii ideali pentru determinarea variabilității și

diferențierii în populații de pin silvestru. Deși disponibilitatea de markeri este limitată

la această specie, ei pot fi cu succes transferați de la alte specii ale aceluiași gen.

În cadrul acestui studiu s-a reuşit transferarea de amorse SSR de la Pinus taeda

la Pinus sylvestris.

Amorsei SSR M13 prezintă amplificare nespecifică de aceea nu au putut fi

folosiţi în acest studiu.

S-a reușit dezvoltarea a doua protocoale multiplex la Pinus sylvestris.

În cazul stemelor multiplex, ampliconii cu dimensiuni mici au emis un semnal

fluorescent mult mai puternic decât cei cu dimensiuni mari, datorită timpului necesar

pentru elongaţie diferit. Semnalul ampliconilor mici a fost suficient de puternic sa

inducă o eroare senzorului laser, semnalul fluorocromului albastru fiind perturbat cu

semnalul fluorocromului verde, semnalul fluorocromului verde fiind perturbat cu

semnalul fluorocromului albastru iar semnalul fluorocromului negru fiind perturbat cu

semnalul fluorocromului albastru, datorită absorbanţei similare.

Concentraţia iniţială recomandată de manualul de utilizare a kitului a fost

schimbată, concentraţia amorselor cu ampliconi mici a fost scăzută iar concentraţia

amorselor cu ampliconi mari a fost crescută pentru a putea observa semnalul emis de

aceştia. Balansarea concentraţiilor amorse a fost realizată la fiecare placă în parte

încetând sa obţinem cromatograme cu semnal cât mai curat. De asemenea a fost

observat un semnal mult mai slab al fluorocromului D2, de aceea nu au fost folosiți.

Volumul final al amestecului de amplificare a fost redus şi el la 10 µl (2,5 µl

Master mix, mix de amorse cu volum variabil, apă ultra pură în volum variabil, 0,1 µl

25


Q, 1 µl ADN 50ng⁄µl) pentru a reduce costurile de analiză, ţinând cont ca pentru

migrarea în electroforeza capilară a fost nevoie de 1 µl de produs PCR.

De asemenea volumul bufferului de încărcare şi volumul de standard intern din

kitul de analiza prin electroforeza capilară au fost reduse pentru reducerea costurilor.

Volumul de Formamida folosit şi volumul de standard intern au fost reduse din acelaşi

considerent. Volumul pentru restul reactivilor a rămas neschimbat pentru buna

funcționare a electroforezei capilare.

După optimizarea sistemului multiplex la pinul silvestru, putem concluziona că

această metodă a crescut eficienţa procesului de genotipizare, a redus substanţial

costurile şi timpul de lucru necesar pentru genotipizarea unui număr mare de probe.

Toate probele prelevate din România şi Ungaria au fost analizate folosind

sistemul multiplex cu amorsei testaţi în multiplexul 1 și 2. A fost observat un

polimorfism crescut în ceea ce privește locusul amplificat de amorsa SPAC 12:5,

locusul amplificat de amorsa PtTx 3020, au prezentat un polimorfism scăzut, iar restul

locilor amplificaţi au prezentat polimorfism mediu.

La locusul SPAC 12:5 au fost observate 45 de alele iar la locusul PtTx 3020 au

fost evidențiate 9 alele.

Markerii nucleari sunt ideali în analiza variabilității în populații, spre deosebire

de markerii mitocondriali și cloroplastici care sunt folosiți în special pentru a evidenția

structura genetica a populațiilor în timp și spațiu.

La nivelul markerilor nuclear nu a fost observată o structură spațială clară.

Acest lucru se datorează atât transmiterii pe cale maternal cât și pe cale paternală a

acestor marker, cât și datorită proceselor de recombinare.

Gruparea anumitor populații în clustere diferite se datorează alelelor private

evidențiate la diferiți loci.

Diferenţierea genetică a populaţiilor de pe teritoriul României nu se datorează

distanţei geografice dintre acestea ci mai degrabă datorită orografiei, munţilor. În acest

sens Munții Carpaţii au funcţionat ca o barieră cu privire la diversitatea genetică dintre

populaţiile de pin silvestru, respectiv în procesul de reproducere, (diseminare a

seminţelor, polenului) şi schimbului de gene între populaţii.

26


În toate populațiile studiate pot fi observate, pe baza rezultatelor obținute,

evidențe clare a unei depresiuni genetice anterioare. Declinul populațional își are

originea în era glaciară (acum 1000 de generații, 20000 de ani) și continuă și astăzi.

Rezultatele obținute demonstrează clar că populațiile de pin silvestru din România și

Ungaria au fost timp îndelungat sub influența driftului genetic și a presiunii selective.

Această ipoteză a fost verificată cu ajutorul analizei M-stat propusă de GARZA și

WILLIAMSON în 2001.

Fluctuațiile observate în populații, alelele unice, gruparea populațiilor în

clustere și diferențierea populațiilor pot fi folosite în conturarea strategiilor de

conservare.

Efecte profunde ale acestui proces de depresie explică valori așa de scăzute la

nivelul acestui indice. Simulări realizate de GARZA și WILLIAMSON în 2001 au

arătat că unei populații, care a suferit un declin major și dimensiunea populației

rămâne mică, îi sunt necesare câteva sute de generații pentru ca acest indice a crească

la nivelul normal.

Posibilitatea ca o parte populațiile din România sa fie la rândul lor relict glacial,

împreună cu cele din Ungaria și Bulgaria. În plus față de efectele migrației post

glaciale, istoria și izolarea geografică a putut contribui la depresia populațională

observată din analizele efectuate.

Analizele statistice au dovedit ca nu există consangvinizare între populații.

Se recomandă menținerea resurselor genetice în această distribuție prin

folosirea in repopulare a puieților proveniți din surse de semințe situate în aceeași zonă

geografică.

Recomandăm de asemenea continuarea cercetărilor în ceea ce privește

populațiile de pin silvestru din România, prin intermediul studiilor bazate pe urmărirea

caracterelor fenotipice. Acest lucru poate fi realizat prin înființarea de loturi

experimentale, în diferite regiuni ale țării, cu diferite proveniențe de pin silvestru,

pentru evaluarea acestor caractere.

27


Bibliografie selectivă

Selective references

1. AL-RABAB’AH M.A., WILLIAMS C.G. 2004, An ancien bottleneck în the

Lost Pines of central Texas. Mol Ecol 13:1075–1084

2. AUCKLAND L.D., BUI T., ZHOU Y., SHEPHERD M., WILLIAMS C.G.

2002. Conifer Microsatellite Handbook. College Station, TX, USA Texas A & M .

University

3. DOYLE J.J.D. ŞI DOYLE J.L., 1987, A rapid DNA isolation procedure for

small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin of the American

Mathematical Society 19: 1-15.

4. GARZA J.C., WILLIAMSON E. 2001 Detection of reduction in population size

using data from microsatellite DNA. Molecular Ecology 10: 305-318

5. MANTEL, N.A. 1967. The detection of disease clustering and a generalized

regression approach. Cancer Res. 27: 209 – 220

6. MILLER M.P. 2005. Alleles In Space: Computer software for the joint analysis

of interindividual spatial and genetic information. J Hered 96: 722–724.

7. NAYDENOV K.D., M.K. NAYDENOV, F. TREMBLAY, A.

ALEXANDROV, L.D. AUBIN-FOURNIER 2011. Patterns of genetic diversity that

result from bottlenecks în Scots Pine and the implications for local genetic

conservation and management practices în Bulgaria. New Forest 42:179–193

8. NEI M.,1972 Genetic distance between populations. The American Naturalist,

vol.106,pp. 291-296.

9. OSZLANYI J., GRODZINSKA K., BADEA O., SHPARYK Y., 2004, Nature

conservation în Central and Eastern Europe with a special emphasis on the Carpathian

Mountains. Environ Pollut 130: 127-134.

10. ROBLEDO-ARNUNCIO J.J., F. ROUSSET 2010 Isolation by distance în a

continuous population under stochastic demographic fluctuations. J Evol Biol

23(1):53–71

11. WANG J., 2007 Triadic IBD coefficients and applications to estimating parwise

relatedness. Genet. Res. 89:135-153

28


12. WORLDBANK 2002. Romania-Forest Development Program. Report No.

PID8602. The World Bank,Washington, USA.

29

universitatea de ŞtiinŢe agricole Şi medicinĂ · uleiul volatil extras din pin a fost studiat...

Documents