UROLITÍASE E HEPATOTOXICIDADE RELACIONADOS AO

TRANSPORTADOR DE ÂNIONS SAT1 EM CAMUNDONGOS

Bruna de Carvalho Sorrentino Tiago Henriques Moreira

Fisiologia Renal 3º período – Medicina

Universidade Federal do Rio de JaneiroMacaé, 25 de Julho de 2012

Sat1: Transportador de ânion sulfato 1;

Também denominado Slc26a1;

Localizado na membrana basolateral dos rins e segmentos distais do intestino (íleo distal, ceco e cólon proximal); e na membrana sinusóide dos hepatócitos;

Medeia o transporte epitelial de oxalato e sulfato;

Importante papel na homeostase do oxalato e sulfato.

O gene do Sat 1 está localizado no Exon 2/ Íntron 2 do gene da alfa-L- iduronidase (IDUA).

Urolitíase: O oxalato de cálcio, produto da excreção

urinária, pode formar cristais que ao se agregarem podem formar cálculos renais no sistema urinário.

Hepatotoxicidade: O sulfato é essencial para a fase II da

detoxificação no fígado, e é altamente reabsorvido pelos rins.

Objetivo principal do estudo:

Determinar as funções fisiológicas do transportador Sat1 na regulação da homeostase do oxalato e do sulfato.

Métodos e

Resultados:

1. Construção do vetor alvo: Fragmentos de Sat 1 foram multiplicados por

PCR para se criar o fragmento alvo. A estratégia utilizada para a criação do fragmento alvo consiste da troca do Exon 3 por um cassete de resistência à Neomicina.

2. Criação e identificação de camundongos Sat1-/- : O fragmento alvo é eletroporado para

células embrioblásticas de camundongo;

Células embrioblásticas positivas são injetadas em blastócitos CD1, que são implantados na fêmea receptora;

Camundongos quiméricos foram cruzados com heterozigóticos, a fim de produzir camundongos Sat1-/-.

3. Determinação do genótipo dos

camundongos: O fragmento do alelo recombinante de Sat

1 foi amplificado por PCR, a fim de se obter o genótipo dos camundongos;

O transportador Sat 1, nos camundongos Sat1-/-, encontra-se ausente nas vesículas da membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal, ceco, cólon proximal.

4. Análise do RNA: RNA total é separado em gel em estado tampão, e

transferido para membranas de nylon.

Os borrões formados são injetados com cDNA de Sat1;

RNA total foi transcrito reversamente usando hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa virótica (Progen);

Primer P8 (exon 2) e P9 antisense (exon 4) foram usados para amplificar os fragmentos de cDNA Sat1;

5. Preparação da vesícula de membrana

e estudos de transporte: Vesículas de membrana basolateral (BLMVs) e da borda

em escova (BBMVs) foram isoladas do rim, fígado e intestino, e pré-incubadas em solução tampão;

A absorção de sulfato e oxalato foi medida pela técnica de filtração rápida;

Proteínas da BLMV foram separadas em gel e transferidas para a membrana de nylon;

Protéínas Sat1 foram detectadas usando anticorpos para Sat1.

Sat1-/- : Diminuição no transporte de oxalato e sulfato na membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal, ceco e cólon proximal.

6. Análise bioquímica: Sangue: coletado da veia submandibular; Urina: coletada por micção espontânea prévia à coleta de sangue; HCl foi adicionado a amostras de plasma e urina; as amostras

foram congeladas para evitar a precipitação de oxalato e oxalogênese.

Os níveis de atividade do gene IDUA no rim e fígado foram avaliados;

Foram medidos os níveis de:• Sulfato;• Oxalato;• Creatinina;• PO4- , Na+ , K+ , Cl- , Ca2+ plasmáticos;• Glicolato urinário;• Proteínas na urina;• pH;• H2O cecal;

7. Análise histopatológica:

Tecidos foram dissecados em ~ 50 volumes com 10% de tampão de formalina, fixados por 3 dias, e imersos em parafina;

Tecidos foram seccionados, marcados para detecção de cristais de oxalato de cálcio, e examinados por microscopia de luz;

Seções do fígado apresentaram degeneração e necrose severas.

Urolithiasis in Sat1–/– mice. (A and B) Representative H&E-stained kidney sections showing infiltration of leukocytes (arrow) around the renal cortical vessels in 100% of Sat1–/– mice (n = 8), absent in Sat1+/+ mice.(C–F) Representative Yasue-stained kidney (C and D) and bladder (E and F) sections showing calcium oxalate stones (dark staining) in kidney tubules of 47% Sat1–/– mice (n = 15) and bladders of 26% Sat1–/– mice (n = 19), but not in any Sat1+/+ mice (n = 10). Gross histological analyses of additional tissues in which Sat1 is expressed (liver and brain) showed no structural differences between Sat1–/– and Sat1+/+ mice (not shown). Scale bars: 100 ìm (A and B); 500 ìm (C and D); 2 mm (E and F).

8. Administração de APAP: Acetaminofeno (APAP) foi dissolvido em

soro, filtrado e esterilizado;

Com ~ 3 meses, os camundongos receberam injeção de APAP, morrendo entre 2 a 12 hs após administração.

(C and D) Representative H&E-stained liver sections of Sat1+/+ and Sat1–/– mice (n = 6–7 per group) 12 hours after administration of 250 mg/kg APAP, showing liver necrosis in Sat1–/– mice.

Necrose hepática após administração de APAP:

Não aconteceram diferenças no peso corporal, tamanho do rabo ou outra característica corporal que distinguisse camundongos Sat1-/- dos Sat1+/- ou Sat1+/+. Porém, foram observadas diferenças histológicas;

As veias corticais renais sofreram infiltração por leucócitos: sugestiva de obstrução ureteral ou uropatia obstrutiva;

Cristais de oxalato foram observados nos túbulos corticais renais e na bexiga;

Aumento da concentração plasmática do oxalato e diminuição da concentração do sulfato;

Aumento do sulfato e diminuição do oxalato no conteúdo cecal.

Nos camundongos Sat1-/- :

Sat1 e IDUA:

Os genes Sat1 e IDUA são sobrepostos;

Distorções seletivas no gene IDUA não levaram a alterações nos níveis de RNAm para Sat1;

Ausência de mudanças na atividade funcional do IDUA em Sat1-/- sugere que efeitos antisense não atuem de forma relevante na regulação da expressão dos genes Sat1 e IDUA.

Sat1-/- e oxalato: Os níveis elevados de oxalato no plasma,

aumento da razão oxalato/creatinina na urina,

manutenção da razão glicolato/creatinina na urina (indicador da produção hepática de oxalato),

e redução no transporte de oxalato na membrana basolateral de segmentos do intestino distal:

SUGEREM QUE >

Hiperoxalúria e hiperoxalemia:

A hiperoxalúria nos camundongos Sat1-/- é devido à hiperoxalemia,

e não a alterações do oxalato nos túbulos renais.

Sat1-/- e sulfato:

Diminuição significante do sulfato no soro,

aumento da razão sulfato/creatinina na urina,

e aumento no índice de excreção fracionada (FEI) de sulfato:

SUGEREM QUE >

Hiposulfatemia: Ocorre provavelmente devido à elevada excreção

renal de sulfato em camundongos Sat1-/-.

Há grande redução do transporte de sulfato através da membrana basolateral renal e sinusoidal hepática,

sugerindo que Sat1 é o transportador de sulfato predominante na membrana basolateral do túbulo proximal renal, e na membrana sinusoidal dos hepatócitos.

Sat1-/- e a hepatotoxicidade:

O esgotamento de sulfato pela ausência de Sat1 nas membranas sinusoidais dos hepatócitos, onde facilitam o importe de sulfato para as reações de sulfonação, e a hiposulfatemia, acarretam em lesões hepáticas induzidas por fármacos como o APAP.

Referência bibliográfica:

Dawson PA, Russell CS, Lee S, McLeay SC, Van Dongen JM, Cowley DM, Clarke LA, Markovich D. Urolithiasis and hepatotoxicity are linked to the anion transporter Sat1 in mice. J Clinical Investigation. 2010; 120 (3):706-712.