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RESUMEN
El estrés salino es el principal problema en la producción agrícola, causando grandes pérdidas
financieras. El estrés salino es un estrés iónico, que utiliza y modula el transporte iónico de
una célula vegetal. Las poliaminas putrescina, espermidina y espermina y las especies
reactivas de oxigeno, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo regulan varios procesos
fisiológicos. Se ha visto un aumento en sus niveles en tejidos vegetales ante diferentes
estreses, ayudando a la tolerancia. Los mecanismos específicos de su integración a la respuesta
a estrés aun no están establecidos. En esta revisión veremos como éstas moléculas,
participando en varias rutas de señalización y modulando el transporte iónico pueden brindan
tolerancia al estrés salino.
ABSTRACT
The salt stress is a major problem in the agricultural production, causing great financial losses.
The salt stress is a ionic stress, that use and modulate the ionic transport in a vegetal cell. The
polyamines putrescine, spermidine, and spermine and the reactive oxygen species, hydrogen
peroxide and hydroxyl radical, regulate many physiological processes. The polyamines and
the reactive oxygen species increasing its production in many stress, and help tolerance. In this
review we will see how these molecules participate in various signaling pathways and how
that ionic modulation may provide tolerance to salt stress.
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INTRODUCCIÓN
Actualmente la población mundial es de 6,400 millones, se espera que a principios de 2012 se
alcancen los 7,000 millones, cifra que llegaría en 2050 a 9,000 millones, mientras que la
producción de cultivos decrece rápidamente, gracias al creciente impacto negativo de varios
estreses. Según la ONU estima que para el 2030 la demanda de productos agrícolas será 60%
mayor que el actual (La Jornada, en línea).
Los estreses se dividen en:
• Estrés abiótico causado por radiaciones, hiperoxia, anoxia, deficiencia mineral, frío,
calor, sequía, NaCl, choque osmótico y por las especies reactivas de oxigeno (ERO).
• Estrés biótico causado por patógenos (bacterias, hongos y virus), insectos, herbívoros
y roedores.
• Estrés por xenobióticos causado por herbicidas redox-cíclicos (paraquat y diquat),
contaminantes atmosféricos (SO2, NO, NO2 y O3) y metales pesados (Cd2+).
El estrés abiótico es la principal causa de daño a cultivos y el problema de la salinidad es el
más severo (Mahaja y Tuteja, 2005). Las fuentes de este problema se dividen en:
• Fuentes naturales: erosión hídrica (los minerales presentes en las rocas, sedimentos y
suelos, producen sales minerales disueltas, cuya principal vía de desembocadura
después de las lluvias son los océanos). Aunque si en los lugares hay mayor
evaporación de agua que lluvias, los suelos no pueden ser lavados, formándose áreas
con alto contenido en sales, tal como sucede en las zonas áridas. Los vientos de estas
regiones, arrastran gran cantidad de sales a otras áreas, salinizándolas, lo que se
denomina erosión eólica. Los cambios climáticos mayores, como el calentamiento
global que derrite los polos rapidamente y los huracanes, pueden introducir a la tierra
considerable cantidad de sales provenientes del mar (Fitzpatrick et al., 1994).
• Fuentes antropogénicas: sales presentes en los desechos animales, uso de fertilizantes
químicos y regar la tierra con agua de mala calidad. La extracción intensiva de aguas
subterráneas y la utilización de estas para fines más rentables y exigentes que el
agrícola, causan que se produzcan agua con contenidos cada vez más elevados en sales
solubles. La demanda de alimentos ha provocado la extensión del regadío incluso a
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suelos marginales hasta ahora no cultivados y al regar tierras agrícolas con el agua de
mala calidad, las convertimos en salinas.
Las diferentes especies vegetales difieren notablemente en sus respuestas de desarrollo frente a
la salinidad, clasificándose en:
Halófitas (plantas saladas) algunas especies toleran hasta 200 mM NaCl:
• Plantas muy tolerantes: césped alcalino, espárrago, palmera y tamariz.
• Plantas moderadamente tolerantes: pino, olivo ruso, betabel, cebada y algodón.
Glicófitas (plantas dulces) toleran bajas concentraciones salinas (50-100 mM):
• Plantas moderadamente sensibles: alfalfa, tomate, calabaza, lechuga, uva, papa,
espinaca, avena, mostaza, pimiento, caña de azúcar, maíz, canola, apio, brócoli,
pepino, flores en general, coliflor, sandía, rábano, chícharo, chayote, nabo y pimienta.
• Plantas muy sensibles: A. thaliana, manzana, grosella, cereza, pera, ciruela, frambuesa,
rosa, frijol, zanahoria, berenjena, chirivía, fresa, los cítricos y cebolla (Blaylock, 1994).
Ya que la mayoría de las plantas son glicófitas y el problema de la salinidad aumenta, es
necesario aplicar biotecnología vegetal para poder crear cultivos de plantas transgénicas
tolerantes al estrés, con alto rendimiento y sin afectar sus etapas de desarrollo, germinación,
crecimiento y reproducción.
Para producir estas especies, debemos de entender tanto a nivel genético, molecular como en
la planta entera, los eventos que suceden ante salinidad u otros estreses, o la combinación
entre éstos, como ocurre en la vida real. Por ejemplo ante salinidad, donde las plantas sufren
estrés iónico, osmótico-hídrico, nutrimental y oxidativo.
Si bien Drosophila melanogaster siguen siendo el modelo genético animal más empleado en
el mundo, A. thaliana es el caballo de batalla para toda clase de estudios vegetales, solo por su
valor científico definido, ya que no tiene utilidad alimenticia, medicinal ni industrial. Aunque
recientemente se ha obtenido el genoma completo del arroz (Oryza sativa). Pese a que los
genomas de otros cereales tardarán en llegar, se ha indicado que el maíz tiene seis veces más
ADN que el arroz y el del trigo casi 50 veces más.
Si bien cada tipo de estrés presenta sus características, todas tienen en común la acumulación
de poliaminas (PAs) y de ERO. Estas moléculas por mecanismos aun no dilucidados del todo
ayudan a la tolerancia al estrés salino en las plantas. En esta revisión veremos cuales son los
posibles mecanismos para este fin, por ejemplo, las PAs modulando varios canales iónicos,
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mejoran la homeostasis K+/Na+ citosólica (Zhao et al., 2007) y junto con las ERO promueven
el cierre de estomas para aliviar el estrés hídrico que se da ante salinidad (Zhu, 2003).
Las PAs actúan como atrapadoras de las ERO. Las PAs y ERO promueven la expresión de
enzimas antioxidantes para reducir el estrés oxidativo y prevenir la peroxidación lipídica
(Yang y Poovaiah, 2002; Verma y Mishra, 2005; Rhee et al., 2007; Mittler et al., 2004; Tang y
Newton, 2005), así como también regulan la expresión de genes para ayudar a la tolerancia a
la salinidad. Las PAs pueden estabilizar la membrana plasmática (MP), restaurando el nivel de
fosfolipídos dañados ante el estrés salino, así como también mantienen la estructura de varias
enzimas (Zhao y Qin, 2004; Mansour et al., 2002).
Entendiendo el mecanismo de acción de estas moléculas en respuesta al estrés, sería posible
desarrollar nuevas estrategias enfocadas a incrementar la supervivencia de las plantas ante
diferentes condiciones ambientales adversas.
CAPÍTULO 1. ESTRÉS SALINO
1.1 Problema de salinidad en suelos para agricultura
El estrés abiótico es la principal causa de daño a cultivos y el problema de la salinidad es el
más severo (Mahaja y Tuteja, 2005).
La salinidad en los suelos se estima de acuerdo a la habilidad para conducir la electricidad del
extracto de pasta saturada (conductividad eléctrica: ECe). Las unidades se dan en
deciSiemens/metro (dS/m). Si el suelo tiene una ECe ≤ 4 dS/m (≈ 40 mM NaCl; Marschner
1995) se considera un suelo salino, con esto se determino que una tercera parte de las áreas de
regadío del mundo, que suponen unos 300 millones ha, están afectadas por la salinidad, de
estas, 70 millones ha fueron causadas por la actividad humana (FAO, 2005).
La República Mexicana cuenta con una superficie de 1 millón 958 mil 201 km2, de los cuales
el 52% corresponde a regiones áridas y semiáridas, con predomino de climas secos (Conaza,
1994).
La productividad promedio nacional de Phaseolus vulgaris (frijol común) es de alrededor de
200-500 kg/ha en condiciones de temporal, cuando en condiciones óptimas de riego y manejo
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de plagas y malezas es de 3-5 ton/ha. Ya que existen variables de frijol como el Pinto Villa
que pueden vivir a las orillas del mar, obtener la secuencia del genoma del frijol representa per
se una prioridad nacional (Estrada et al., 2006).
1.2 La Salinidad Produce Estrés Iónico, Osmótico-Hídrico, Nutrimental y Oxidativo en
Plantas
Osmótico: en condiciones de salinidad, se sufre un estrés osmótico por la gran [solutos]
disueltos en la zona radicular. Entre más solutos existan más se reduce el potencial del soluto
(Ψs) o potencial osmótico.
Hídrico: el potencial hídrico (Ψw) se define como el estado de energía libre de las moléculas
de agua y depende principalmente del Ψs, como vimos, ante salinidad se disminuye el Ψs por
lo que también se reduce el Ψw del suelo, lo que significa que las moléculas de agua irán de
una solución menos concentrada (célula) a una más concentrada (suelo), resultando en
plasmólisis (disminución de la turgencia de la planta). Por ello se habla que la salinidad es un
problema osmótico que provoca un estrés por déficit hídrico. Iónico: la excesiva absorción de Na+ y Cl- pueden ayudar al potencial osmótico de las células
de la planta, aunque desencadena problemas de toxicidad si estos iones no son
compartimentalizados, exportados o secretados apropiadamente.
Nutricional: se afecta el crecimiento y desarrollo de las plantas por la disminución en la
absorción de K+, NO3 y agua (McCue y Hanson, 1990).
Oxidativo: todos los estreses anteriores causan estrés oxidativo.
A continuación se explicará en detalle cada uno de estos estreses.
1.3 Estrés iónico
Bajo condiciones fisiológicas normales, las plantas mantienen una [K+]cit alta (100-200 mM)
(Cuin et at., 2003) y de [Na+ ]cit baja (1-10 mM) (Sairam y Tyagi, 2004).
Veremos a continuación, las principales vías por las que se da el masivo influjo de Na+ y el
eflujo de K+ ante el estrés salino en las plantas. Este desbalance en la homeostasis iónica
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intracelular (K+/Na+) provoca el llamado estrés iónico, además de que la alta concentración de
Na+ resulta toxica para cualquier célula.
1.3.1 Mecanismos de transporte iónico durante el estrés
El gran potencial negativo (-140 mV) de la MP de las células vegetales favorece el transporte
de Na+ a las células de la epidermis y corteza de la raíz (ver Cap. 4). En salinidad la gran
concentración de Na+ en los suelos penetra a las células principalmente por canales catiónicos
no selectivos independientes de voltaje (NSCC-IV) (1), que nosotros llamamos VIC situados
en la MP de las células de la raíz (Amtmann y Sanders, 1999; Demidchik y Tester, 2002). Otro
canal responsable del influjo de Na+ a la célula son los canales HKT (transportador histidina
kinasa) (2), que normalmente permiten el influjo del esencial K+ (Rus et al., 2002; Mäser et
al., 2002; Platten et al., 2006).
El gran influjo de Na+ causa una significativa despolarización de la MP (60-80 mV) (3)
(Shabala et al., 2003, 2005, 2006; Cuin et al., 2008), esta despolarización reduce la fuerza
electroquímica para la toma de Na+, pero principalmente activa a los canales KOR
dependientes de despolarización, causando un drástico eflujo de K+ tanto en células de raíz (4)
(Shabala y Cuin, 2008), como de mesófilo (Shabala, 2000; Shabala et al., 2006). El tetraetil
amonio (TEA) es un bloqueador de estos canales (5). La despolarización (DA) también activa
a los NSCC activados por DA (NSCC-DA), con la concomitante entrada de Na+ y la salida de
K+ (6). Sin embargo, la elevada [Na+] y [Ca2+] externas pueden bloquear a KOR y prevenir la
perdida de K+ (Shabala et al., 2006).
El aumento en la [Ca2+]cit durante el estrés salino se da vía receptores presentes en la
membrana de las plantas que perciben el estrés salino, la señal es transmitida y activa a la
fosfolipasa C (PLC) y a proteínas G, las cuales generan segundos mensajeros como el inositol
trifosfato (IP3), este ultimo puede aumentar la [Ca2+]cit (Mahajan y Tuteja, 2005), una posible
vía es por la activación de canales de Ca2+ dependientes de fosfoinositidos presentes en el RE.
El Ca2+ entra al citoplasma también a través del los NSCC (VIC) (1), que no discriminan entre
Na+, K+ y Ca2+ (Demidchik et al., 2002a).
Recientemente, en A. thaliana se ha visto que ante NaCl en la célula se aumentan los niveles
de GMPc, no se sabe muy bien el mecanismo, pero este GMPc puede activar a un tipo de
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NSCC activado por GMPc (CNGC) (7), este canal permite el influjo de Ca2+ y no permite la
entrada de Na+ a la célula (Donaldson et al., 2004), contribuyendo a la tolerancia a la salinidad
y al gran aumento en la [Ca2+]cit.
Figura 1. Modelo que explica los efectos iónicos y celulares implicados en el estrés salino en las plantas, así
como los mecanismos que median la tolerancia.
La alta [Ca2+]cit produce estrés oxidativo al activar a la NADH oxidasa (NOX) (8), esta enzima
es una fuente para la producción de ERO (9), a partir del O2 produce grandes cantidades de
O2·- en el apoplasto, el O2
·- es dismutado por la SOD para producir H2O2 (Densen y Wirtz,
2001) y a partir de H2O2 mediante una reacción tipo Fenton se genera HO· (Thannickal y
Fanburg, 2000). Esta ultima ERO puede activar al NSCC-HO· (10) que media tanto la entrada
de más Ca2+ y Na+ a la célula, como la pérdida de más K+ (11) (Demidchik et al., 2003). No
obstante a altas concentraciones, el HO· es muy dañino, puede inducir a la peroxidación
lipídica y a la muerte celular programada (PCD) (Affenzeller et al., 2009).
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La resultante caída en la [K+]cit (12) por varios tipos de NSCC y KOR podría activar a las
caspasas guiando a la PCD (13) (Hughes y Cidlowski, 1999; Affenzeller et al., 2009). En el
sistema animal, la caspasa-3 induce a la apoptosis celular. No se han identificado caspasas en
el genoma de la planta, sin embargo, ocho enzimas parecidas a las caspasas han sido
reportadas (Bonneau et al., 2008).
Li et al. (2007) mostró que el tratamiento con 10 µM La3+ fue efectivo para prevenir la PCD
inducida por estrés salino en raíces de arroz. El La3+ es un bloqueador inespecífico de los
NSCC (14), por lo que se confirma la participación de estos canales y que su bloqueo es
benéfico para la relación K+/Na+ citoplasmática.
1.3.2 Elementos Celulares y Iónicos de la Tolerancia ante Estrés Salino
La homeostasis K+/Na+ citosólica es crucial para el metabolismo celular y es considerada un
componente clave de la tolerancia a la salinidad en las plantas (Niu et al., 1995; Maathuis y
Amtmann, 1999; Hasegawa et al., 2000; Shabala, 2000; Carden et al., 2003; Tester y
Davenport, 2003; Volkov et al., 2004; Chen et al., 2007; Cuin et al., 2008). Uno de los
mecanismos que se activa ante salinidad para ayudar a la tolerancia a la salinidad, incluye una
una cascada de señalización, inicia con la señal del Ca2+ e intervienen proteínas codificadas
por el sistema de alta sensibilidad a la sal (SOS) (Zhu, 2002). A continuación se explicarán los
elementos celulares y iónicos activados:
Ante el aumento en la [Ca2+]cit bajo salinidad, una proteína de unión al Ca2+ llamada CBL, por
su parecido a la calcineurina B (CBL) y a los sensores de Ca2+ neuronales (NCS), censa el
Ca2+ (1) (Bartels y Sunkar, 2005). La CBL con ayuda del Ca2+ interactúa físicamente con una
serina/treonina kinasa (CIPK) y la activa (Halfter et al., 2000), este complejo es llevado a la
MP vía una unión covalente de una cadena de acido graso miristoilo o palmitoilo (2). El
complejo CBL/CIPK en la MP es capaz de fosforilar a un antiportador H+/Na+ de la MP que
exporta Na+ fuera de la célula (3) (Munns y Tester, 2008).
El complejo CBL/CIPK inhibe a HKT, un transportador histidina kinasa que media la entrada
de Na+ en la MP en condiciones de salinidad (4) y puede activar a AKT1, canal que permite el
influjo de K+ (5) (Zhang et al., 2004; Zhu, 2002; Mahajan y Tuteja, 2005).
9
En el tonoplasto, los blancos de activación del complejo CBL/CIPK son un antiportador
H+/Ca2+ de la familia CAX, que introduce Ca2+ a la vacuola para ayudar a la homeostasis del
Ca2+ (Sies y Haeussinger, 2009, Zhang et al., 2004; Zhu, 2002) y el antiportador H+/Na+ de la
familia NHX (6) (Sies y Haeussinger, 2009) que se encarga de compartimentalizar el exceso
de Na+ tóxico en la vacuola (Shi y Zhu, 2002).
En A. thaliana al suprimir CBL o CIPK se incrementa la acumulación de Na+ en el citoplasma
(Zhu, 2002) y al sobreexpresar el antiportador H+/Na+ de la MP se aumenta la tolerancia a la
salinidad (Shi et al., 2003).
Además de la CBL, la actina F que se encuentra formando parte del citoesqueleto, también
podría constituir una señal de estrés, ya que algunos trabajos mostraron una regulación de la
organización de los microtúbulos por la presión de turgencia (Iwata et al., 2001). Los
microtúbulos y los microfilamentos del citoesqueleto han estado implicados en el desarrollo de
señales en plantas bajo estrés por frío (Viswanathan y Zhu, 2002). Esto podría estar dado a que
el citoesqueleto conecta diferentes organelos de la célula con la MP, y este podría detectar
cambios en el volumen celular por estrés osmótico y transducir la señal de cambio a otros
componentes de señalización.
La Ca2+-ATPasa del RE (ACA2) y de la vacuola (ACA4) encontradas en A. thaliana, son dos
bombas importantes activadas en mayor medida ante estrés salino, estas depletan el Ca2+
citosólico (7). Mediante la señalización de este ion o mediante la calmodulina (CaM), se ha
visto que se activa a NHX vacuolar, de esta forma se da una tolerancia alternativa al estrés por
NaCl (Anil et al., 2008).
Tanto el complejo CBL/CIPK como ACA4 activan a NHX mediante señalización con el Ca2+
(8), aunque hay reportes que indican que cuando la CaM se une al C-terminal de NHX
vacuolar, se disminuye la Vmax de antitransporte (Yamaguchi et al., 2005).
Las rutas de señalización que son dependientes al Ca2+ envuelven a c-Jun N-terminal kinasas,
PKC, MAPK (9) y a rutas de calcineurina (Shim y Karin, 2002). AtMPK6 y AtMPK3 son dos
kinasas que se activan bajo estrés osmótico en A. thaliana. Otras MAPK aun no identificadas
pueden activar genes para la producción de enzimas antioxidantes como SOD, APX, TPX
(Amaya et al., 1999) y CAT (10) (Sekmen et al., 2007). Las MAPK puede activar la síntesis
de solutos compatibles (Sairam y Tyagi, 2004) llamados osmoprotectores porque
proporcionan protección al estrés osmótico (ver 1.4.1).
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Chung et al. (2008) reportaron que la producción de ERO mediaba la regulación de la
estabilidad del RNAm del antiportador H+/Na+ de la MP. El H2O2 puede activar a OXI1, una
proteína serina/tirosina kinasa responsable de la activación de MPK3 y MPK6 (Rentel et al.,
2004).
El sistema de transporte electrónico de la mitocondria es afectado por la salinidad y produce
ERO (11). El estrés salino y la sequía aumentan la actividad de PmitoKATP (canal selectivo a
K+ sensible a ATP situado en la membrana interna de la mitocondria), ya que ante tales
estreses se aumenta la producción de O2·- y esta puede estimular a PmitoKATP, aunque la
activación de PmitoKATP puede reducir hasta en un 60% la producción de ERO (Pastore et al.,
1999). Sugiriéndose que PmitoKATP mediante una retroalimentación negativa protege a la
mitocondria y a la célula del exceso de producción de ERO bajo estrés.
El hecho de que el citoplasma ocupa únicamente un 5-10% del volumen del protoplasma, y el
apoplasto ~3% del volumen del mesófilo, la vacuola es un organelo muy importante para
acumular azucares, aminoácidos y sales tóxicas, como el Na+. Éste organelo ayuda a mantener
baja la [Na+] y aumenta la [K+] en el citoplasma.
Los niveles de K+ en la vacuola son variables (10-200 mM). En ella se compartimentaliza el
Na+ gracias a un antiportador H+/Na+ de la familia NHX (Shi y Zhu, 2002), pero el canal SV
media la salida de Na+ de la vacuola (12). Finalmente en la vacuola, el canal VK se encarga
del eflujo de K+ (13).
Los antiportadores H+/Na+ de la MP y NHX del tonoplasto utilizan como fuente de energía el
gradiente de protones establecido por la bomba de protones H+-ATPasa de la MP (14) y del
tonoplasto respectivamente (15) (Shi y Zhu, 2002). Las pirofosfatasas (PP-ATPasa) del
tonoplasto contribuyen en menor medida, para la generación del gradiente de protones.
1.4 Estrés osmótico e hídrico
Una de las primeras respuestas fisiológicas ante la pérdida de la turgencia ocurrida ante el
estrés osmótico e hídrico provocado por el estrés salino es el aumento en la síntesis y
redistribución de la fitohormona, acido abscísico (ABA), la cual es también llamada hormona
de la sequía o antitranspirante.
11
En la fotosíntesis, el CO2 tomado por los estomas, brinda los carbonos para la producción de
compuestos orgánicos, como azucares, el alimento de la planta.
ABA inicia la activación del cierre de estomas ante estrés salino, por lo que se disminuyen los
niveles de CO2 y por consiguiente la fotosíntesis, conduciendo al estrés oxidativo.
1.4.1 Señalización Mediada por ABA y Especies Reactivas de Oxigeno
ABA inicia una complicada red de señalización con el fin de que los estomas se cierren para
que no haya más pérdida de agua (Véry et al., 1998). Los estomas son como grandes
“ventanas” que por ejemplo, durante la transpiración, donde los estomas están abiertos,
permiten la perdida de ~95% de agua de las células guarda y la entrada de grandes cantidades
de CO2 y Na+.
Los estomas están situados en la epidermis de las hojas, tallos jóvenes y raíces. Están
flanqueadas por dos células epidérmicas especializadas que reciben el nombre de células
guarda.
Recientemente, el H2O2 y especies reactivas del NO han sido identificadas como moléculas
clave para el cierre de estomas inducido por ABA, se ha identificado a la NADH oxidasa de la
MP como la responsable de la generación de O2.- en el apoplasto (Sagi y Fluhr, 2006; Bedard y
Krause, 2007), mientras que la nitrato reductasa (NR) ha sido identificada como una fuente
para NO.
ABA activa a un receptor aun no identificado en la MP (1) y ante esto se activa a la NADH
oxidasa (NOX) (2) (Kwak et al., 2003), enzima que produce O2.- (3) a partir de O2, el O2
.- es
precursor para la conversión a H2O2 y OH· en el apoplasto, aunque estas ERO se piensa que
participan en la señalización en el citoplasma de las células guarda ya que el H2O2 puede
atravesar la membrana del estoma (4).
El H2O2 activa a canales HACC- H2O2 (5), y HO· activa a HACC- HO· (Foreman, 2003;
Köhler et al., 2003; Pei, 2000) los cuales permiten la entrada de Ca2+ al citoplasma (6).
Paralelamente, ante la señal de ABA, se da la activación de la subunidad α de las proteínas G
que puede activar a la PLC (7), aunque se ha observado que ABA activa directamente a PLC
(Wang et al., 2001), la PLC sintetiza IP3 (8), el cual puede activar canales de Ca2+
dependientes de IP3 intracelulares, esto resulta en una elevación adicional de la [Ca2+]cit (9).
12
Últimos estudios, reportan al fosfolípido esfingosina-1-fosfato (SIP) (una molécula
movilizadora de Ca2+) (10) activada ante la señalización por ABA para el cierre de estomas
(Hetherington, 2001).
La elevación en la [Ca2+]cit y H2O2 activan a dos tipos de canales aniónicos (Hedrich, 1994;
Trouverie et al., 2008), a los tipo-S (Schroeder y Keller, 1992) y R (Grabov et al., 1997)
directamente (11) o a través de fosforilación vía una proteína kinasa dependiente de Ca2+
(CDPK). Ambos canales median la liberación de aniones desde la célula guarda (12). La
entrada de Ca2+ por los NSCC-MP y el eflujo de aniones por los canales S y R de la MP
causan la despolarización de la MP (13).
Otra causa de despolarización de la MP es la inactivación de la bomba H+-ATPasa de la MP
tanto por las ERO (14), como por la alta [Ca2+]cit (15) (Kinoshita et al., 1995).
La despolarización causa la desactivación de canales de K+ rectificadores entrantes (KIR) (16)
(abiertos por la hiperpolarización mediada por la H+-ATPasa-MP), pero causa la activación de
canales rectificadores salientes en las células guarda (GORK) (17) (Blatt, 1992). La activación
de GORK resulta en un eflujo masivo de K+ desde las células guarda. Además de que los
canales KOR son activados directamente por la alcalinización del medio efectuada por las
ERO (Miedema y Assmann, 1996). La alcalinización regula a la baja a los canales aniónicos
tipo R (Schulz-Lessdorf et al., 1996).
El eflujo sostenido de aniones y K+ por los canales aniónicos y por los GORK
respectivamente, contribuyen a la pérdida de turgencia, la cual conlleva al cierre de estomas.
Pero para poder salir de la célula, tanto los aniones y K+, primero deben de salir de la vacuola.
Las vacuolas tienen cerca del 90% del volumen de las células guarda, más del 90% de iones
deben ser exportados desde la vacuola al citosol.
La elevada [Ca2+]cit activa a los canales vacuolares aniónicos aumentando el eflujo de Cl- y
malato y a VK que media la liberación al citosol de K+ (18). Las bombas del tonoplasto crean
un gradiente mediante la entrada de H+ a la vacuola, acción realizada principalmente por la H+-
ATPasa del tonoplasto (19), permitiendo que se den los eflujos tanto de aniones como de K+
del tonoplasto. El aumento en la compartimentalización de H+ por las bombas del tonoplasto
provoca que se aumente el pH citoplasmático, lo que activa más a los canales GORK (20).
Se ha reconocido que se induce una reorganización del citoesqueleto durante el movimiento de
estomas (Schroeder et al., 2001).
13
La deshidratación causa plasmólisis (disminución de la turgencia) de las células y acelera la
biosíntesis de ABA tanto en hojas como en raíz, como lo estudiamos anteriormente. La
plasmólisis también destruye a los microtúbulos del citoesqueleto y a la geometría de la pared
celular (PC), esta información se transmite a los microtúbulos para que respondan.
Figura 2. Modelo de la señalización mediada por ABA y especies reactivas de oxigeno ante estrés por
deshidratación causado por la salinidad y los mecanismos de defensa activados en la célula.
ABA provoca la ruptura de microtúbulos corticales, mediante la señalización de AtRac1, se
rompen las cadenas de actina (21) (Jiang et al., 1996) provocando el cierre de estomas en las
células guarda.
Las Rho GTPasas (Rhops) en plantas son una familia con 11 miembros de pequeñas GTPasa
en las plantas, y algunos están implicados en la reorganización del citoesqueleto. Dos
miembros de esta familia, ROP6 (también llamado AtRAC1) (Lemichez, et al., 2001) y
ROP10, han sido implicados en la respuesta de ABA en células guarda. Estudios con líneas de
14
A. thaliana transgénicos, indican que ROP6 y ROP10 son reguladores negativos en la
respuesta de ABA y estas especies la germinación de las semillas y la elongación de la raíz se
ven afectadas, ya que las ROP son reguladores de la germinación, crecimiento y desarrollo de
las plantas (Zheng et al., 2002).
La respuesta adaptativa de la planta conlleva a “encender” genes de respuesta al estrés, de
hecho más de 1000 genes son regulados por ABA para hacer frente al estrés hídrico.
Las MAPK pueden activar la síntesis de solutos compatibles (Sairam y Tyagi, 2004), por
ejemplo, carbohidratos (sucrosa, sorbitol, manitol, glicerol y polioles cíclicos como el mio-
inositol), compuestos nitrogenados [proteínas, glicinabetaina (Mahajan y Tuteja, 2005), PAs
(Cuin y Shabala, 2007), glutamato, glicina, colina] y ácidos orgánicos e inorgánicos (oxalato,
malato y prolina) (Hasegawa et al., 2000). Estos compuestos son llamados osmoprotectores
porque proporcionan protección al estrés osmótico-hídrico, ya que siendo osmolitos, regulan
el Ψs y facilitan la retención de agua en el citoplasma. Aunque hay controversias, ya que la
suma de todos los osmolitos no parece ser necesaria para contrarrestar la gran concentración
de solutos en el suelo. Se ha visto que los polioles permiten el secuestro de Na+ en la vacuola y
en el apoplasto (Bohnert, 1995) y también protegen a las membranas celulares del daño
oxidativo provocado por las ERO, sobreregulando las actividades de varios antioxidantes (Yan
et al., 2000).
El estrés osmótico inhibe la división celular y la expansión directamente. Algunas plantas son
tan sensibles al estrés que el solo “pánico” resulta en que cese el crecimiento cuando ocurre un
leve estrés. Por lo contrario, algunas plantas que no son sensibles corren el riesgo de morir por
continuar creciendo cuando el estrés es serio.
Un importante enlace entre el estrés y la división celular fue revelado por la inducción de
ICK1 en Arabidopsis por ABA. ICK1 es un inhibidor de proteína kinasa dependiente de
ciclina necesaria para la división celular. Más aún, ante sequía o frío se expresan los genes
CBF1, DREB1 y ATHB7, genes que no se expresan en condiciones normales de crecimiento y
causan bajo crecimiento en plantas transgénicas (Zhu, 2001).
1.5 Estrés Nutrimental
Por las similaridades químicas entre el Na+ y el K+ se asume generalmente que compiten por
15
los mismos sitios de absorción en la raíz, resultando ante salinidad una deficiencia de K+.
El K+ es un mineral nutritivo, en plantas glicófitas, contribuye a más del 6% del peso seco de
la planta.
Se requieren grandes cantidades de este catión en el citoplasma de las células vegetales para el
metabolismo, osmoregulación, mantenimiento de la turgencia, expansión celular, transporte
floemático, crecimiento (Zhu, 2003; Marschner, 1995) movimiento de estomas, tropismo,
movimiento celular, función de enzimas donde se requieren 10-50 mM K+ para su máxima
actividad (mientras que 100 mM Na+ inhibe las enzimas), y 100 mM K+ o más para la síntesis
de proteínas (Zhu, 2003; Niu et al. 1995).
Varios genes relacionados con el metabolismo de las ERO son significativamente
sobreregulados por la deficiencia de K+ citoplasmática y se da un aumento en la producción de
ERO en la raíz, justo debajo de la zona de elongación. La inhibición de la NADPH oxidasa en
A. thaliana (rhd2), la cual es una fuente para la producción de ERO, previene la
sobreregulación de genes que normalmente son inducidos por la deficiencia de K+, esos genes
están relacionados con el transporte de K+ a la célula (Shin y Schachtman, 2004). Por lo que la
aplicación de H2O2 reestablece la expresión de genes y ayuda a la homeostasis del K+.
Este catión pude neutralizar el efecto de los aniones, en el caso de estrés por NaCl al Cl-.
El Na+ no se debe considerar solo como un ion tóxico para las células vegetales, sino que a
bajas concentraciones, se ha probado que el Na+ estimula el crecimiento en espárrago, brócoli,
algodón, chícharo, tomate, rábano, apio, betabel, entre otras (Harmer y Benne, 1945), aunque
en todas las plantas, altos niveles de Na+ si son tóxicos.
CAPITULO 2. ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO
2.1 Particularidades de las Especies Reactivas de Oxigeno
Parece ser que la vida se originó espontáneamente hace 3.500 millones de años a partir de los
aminoácidos, nucleótidos y otras sustancias químicas básicas. Estas moléculas fueron el
16
producto de componentes simples reducidos de la atmósfera primitiva, sometidos a reacciones
por radicales libres, iniciadas esencialmente por la intensa radiación ionizante del sol.
Figura 3. Generación de diferentes especies reactivas de oxigeno (ERO). Por excitación 1O2 o por la reducción
univalente secuencial del oxigeno.
Debido a que los organismos se desarrollan en presencia de oxígeno, están expuestos a la
generación de especies reactivas de oxigeno (ERO).
La mayoría de las ERO derivan del oxígeno, que en la naturaleza aparece en forma molecular
o diatómica (O2) y otras ERO derivan del N.
Las ERO incluyen al singlete de oxígeno (1O2) que puede ser formado por absorción directa de
radiación, que después es secuencialmente reducido a O2·- (radical superóxido), peróxido de
hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (HO·), para finalmente producirse dos moléculas de H2O
(Fig. 3). En las plantas las ERO son continuamente producidas como bioproductos en varias
rutas metabólicas localizadas en diferentes compartimentos celulares, especialmente donde se
da la transferencia de electrones, como en las mitocondrias y cloroplastos. En los peroxisomas,
glioxisomas (un tipo de peroxisomas), RE, apoplasto, pared celular (PC), MP y citoplasma
también hay producción de ERO (Amirsadeghi et al., 2007; Van Breusegem y Dat, 2006). El
equilibrio entre la producción y atrapamiento de las ERO puede ser perturbado por un gran
número de efectos adversos ambientales. Como resultado de estos disturbios, los niveles
intracelulares de ERO pueden aumentar rápidamente.
La ERO son responsables del daño oxidativo de macromoléculas biológicas como el DNA,
lípidos, carbohidratos y proteínas (Halliwell y Gutteridge, 2007).
17
Tabla 1. Particularidades de las especies reactivas de oxigeno ERO Particularidades HO· Se desplaza no más de 3-5 radios moleculares y destruye lo que encuentra
en ese corto recorrido, como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Fridovich, 1998). Puesto que la formación de HO· requiere un metal de transición, la mayor parte del daño tiene lugar en sitios de unión de este metal a biomoléculas. Entre las proteínas, Rubisco y glutamina sintetasa son blancos preferidos, pero es concebible que la mayor parte del daño ocurra a nivel del ADN, por daños a la doble hélice en regiones donde se ha unido hierro (Fridovich, 1998). Tiene gran afinidad por las moléculas biológicas en su sitio de producción, reaccionando con velocidades controladas de difusión (K>109 M-1 s-1). Puede captar los electrones de los tioles, por lo que interactúa con las bases nitrogenadas del ADN. Puede sustraer un H+ de un ácido graso insaturado (AGI), iniciando la reacción de la peroxidación lipídica dañando así a las proteínas (Halliwell y Gutteridge, 2007).
H2O2 Es relativamente estable, no es tan reactivo y es eléctricamente neutro, es capaz de atravesar membranas y de alcanzar lugares remotos desde su sitio de producción (Dat et al., 2000). Se encuentra en células en lignificación (Thordal- Christensen et al., 1997). Tiene baja toxicidad, si reacciona con Fe2+ y Cu2+ se produce HO·.
(R·, RO·, ROO·)
Se producen cuando una ERO ataca moléculas orgánicas (particularmente a los ácidos grasos poliinsaturados, AGPI), lo que produce formas reactivas de estas moléculas, que pueden a su vez dañar a moléculas vecinas, en una reacción en cadena.
1O2 Es el O2 en el primer estado excitado. Tiene la capacidad para sustraer un H+ de un AGPI, iniciando la reacción de peroxidación lipídica. 1O2 puede ya sea transferir su energía de excitación a otra molécula o continuar con ella, y formar endoperoxidasas o hidroperoxidasas (Halliwell y Gutteridge, 2007).
O2
·- No ataca de manera significativa a AGPI o al ADN. No puede pasar por las membranas y es rápidamente dismutado a H2O2. Por otro lado, puede actuar como una base de Brönsted, captando un electrón y dando lugar al radical perhidroxilo o hidroperóxido (HO2
·). Es el primer ERO formado en la mitocondria y se utiliza como precursor para H2O2 y HO· (Fridovich, 1998).
O3 Disminuye la asimilación de CO2 en células guarda. En la atmósfera alta es altamente benéfico como filtro UV, pero en la tierra es un contaminante serio (Torsethaugen, Pell y Assmann, 1999).
NO Puede actuar como pro-oxidante al generar NO· y ONOO-, o como
18
antioxidante al unirse al Fe2+ catalítico y O2- evitando así reacciones tipo Fenton. Participa en procesos como el cierre estomático, biosíntesis de etileno, ácido jasmónico (AJ) y ácido salicílico (SA), modulación en la expresión génica, desarrollo y senescencia, y en la respuesta de las plantas a estreses abióticos y bióticos. El efecto del NO· reside en su capacidad de reacción con el hierro de proteínas intracelulares, principalmente mitocondriales, siendo inactivadas por él. Puede reaccionar con el ADN dando lugar a mutaciones y roturas.
Tabla 2. Tiempo de vida media y origen de las especies reactivas de oxigeno
ERO t1/2 37°C (s)
Origen
HO· 10-9 Reacción de Haber-Weiss: O2
·- + H2O2 → HO· + OH- + O2
Reacción de Fenton (más efectivo): H2O2 + Fe2+ (Cu+) → Fe3+ (Cu2+) + HO· + OH-
O2·- 10-6 Formado en reacciones de auto-oxidación (flavoproteínas,
como la NOX y en el ciclo redox):
NO· 1-10 Se origina por la reducción del nitrato o nitrito, catalizada por la nitrato o nitrito reductasa (NR), repectivamente.
NO2 NO
H2O2 Estable o 10-3
Se origina a partir de peroxidasas de la pared celular. Dismutación del O2
·- (espontánea o catalizada por SOD). K> 4 × 105 M-1 s-1, pH 7.
2O2·- + 2 H+
→ H2O2 + O2
Origen: Reducción enzimática de O2
O2 + 2e- + H+ → H2O2
(R·, RO·, ROO·)
10-8, 10-
6) y 10-2 R-H + 1O2
R-H R· ROO· ROOH RO · HO · H2O O2 RH R· Fe+2 Fe+3 + OH-
19
1O2 10-6 hv O2 → 1O2
O2 >102
2.2 Antioxidantes Todas las células aeróbicas están sujetas a estrés oxidativo. El organismo ha desarrollado una
serie de mecanismos de defensa antioxidante enzimática y no enzimática, diseñados para
protegerse de la acción de las ERO. Halliwell, definió antioxidante como “cualquier sustancia
que, en bajas concentraciones comparado con el sustrato oxidable, disminuye
significativamente o inhibe la oxidación de este sustrato”.
Tabla 3. Particularidades y localización de los agentes antioxidantes Antioxidante Particularidades Localización Ácido ascórbico
Es la molécula antioxidante más abundante en las plantas. Se sintetiza en la mitocondria, aunque está presente en todos los compartimentos celulares. Casi todos los animales pueden sintetizarlo, excepto los seres humanos y alguna otra excepción. La forma reducida del ácido ascórbico inactiva directamente a las ERO, o actúa como sustrato de enzimas antioxidantes, aunque puede actuar también como pro-oxidante (Foyer et al., 1994). Cuando el Asc se oxida, se forman sus derivados MDHA y DHA.
Apo, cit, chl, mit, per.
AOX Acepta electrones del sistema de ubiquinona y los usa para reducir el O2 a H2O, sin conservación de la energía a través de la formación de un gradiente de protones en la membrana mitocondrial interna. Bajo varios estreses (oxidativo) se aumenta la producción de ERO en los tejidos y los niveles de AOX (Foyer et al., 1994).
Chl y mit.
APX Usa la forma de ascorbato reducido como un reductor en el primer paso del ciclo, siendo la PX más importante en la detoxificación del H2O2. Su velocidad de reacción es de 2 M-1s-1.
2Asc + H2O2 → 2DHA + 2H2O
Apo, cit, chl (mem tilacoidal, lumen y estroma), per y estroma mit.
Carotenoide
Sistema de atrapamiento no enzimático.
Chl (mem tilacoidal).
CAT Es el mayor antioxidante en A. thaliana (Yang y Poovaiah, 2002). Su Km es relativamente baja ~ 8x10-10 mM, sin
Per, glioxisomas.
20
embargo su Vmax es muy alta. Por lo que sólo es activa cuando se encuentran altas concentraciones de H2O2. Se inhibe a T bajas y ante shock térmico (Dat et al., 2000). 2H2O2 → 2H2O + O2 (sin necesidad de un poder reductor)
DHAR Ciclo del ascorbato-glutatión
DHA + 2GSH → Asc + GSSG
Cit, chl y mit.
Fd Sistema de atrapamiento no enzimático
GPX Catalizan la reducción de hidroperóxidos orgánicos y peróxidos de lípidos, tales como los que se originan en las membranas en situación de estrés, utilizando GSH como donador de electrones:
ROOH + GSH → ROH + GSSG H2O2 + 2GSH → 2H2O + GSSG
Se inducen por la salinidad y otros estreses abióticos y bióticos (Eshdat et al., 1997).
Cit, chl, mit y RE.
GR Ciclo del ascorbato-glutatión
GSSG + NAD(P)H → 2GSH + NAD(P)-
Apo, cit, chl y mit.
MDAR
Ciclo del ascorbato-glutatión
MDHA + NAD(P)H + H+ → 2Asc + NAD(P)-
Cit, chl y mit.
PrxR Son una familia de PX no hémicas, que catalizan la reducción del H2O2 a H2O, depende de la presencia de al menos una cisteina en su centro catalítico. Esta cisteina es regenerada por la acción de las tiorredoxinas o glutarredoxinas (Vieira Dos Santos y Rey, 2006)
2P-SH + H2O2 → P-S-S-P + 2 H2O Y de los peróxidos orgánicos a los correspondientes alcoholes:
ROOH + R´(SH)2 → ROH + H2O + R´S2
Cit, chl, mit, mem, núcleo.
PX Necesitan un agente reductor para llevar a cabo su reacción (H2A: ascorbato, glutatión, etc.), pero tienen mayor afinidad por el H2O2 que la CAT.
Cit, chl, mit, PC, per, vac.
21
Funciones: a) Oxidan compuestos en reacciones con un sentido fisiológico sin relación con el estrés oxidativo (ej. lignificación de las paredes vegetales) b) Eliminan H2O2 u otros radicales orgánicos, derivados de procesos de estrés oxidativo. Existen peroxidasas que son capaces de realizar ambas funciones.
H2A + H2O2 → A + 2H2O H2A + ROOH → A + ROH + H2O
SOD La reacción catalizada por SOD es 10000 veces más rápida
que la dismutación espontánea. La velocidad de reacción de CuZn-SOD es de 2x109 M-1s-1 (Mittler et al., 2004).
2O2·- + 2H+
→ H2O2 + O2
MnSOD: mit, per. FeSOD: chl. CuZnSOD: chl, cit, apo y per. No hay en espacio EC.
Trx Disulfuro oxidoreductasa con dos grupos cisteína en su dominio conservado. Cataliza las reacciones de reducción que incluyen la conversión de los puentes S-S a los grupos –SH.
Trx-h:cit Trx-f y Trx-m: Chl.
α-tocoferol Una molécula de tocoferol es capaz de proteger a 1000 moléculas lipídicas de la propagación en cadena de la peroxidación lipídica.
Mem, plastos, cit.
AOX: Oxidasa alterna; Apo: Apoplasto; APX: Ascorbato peroxidasa; Asc: Ascorbato; CAT: Catalasa; Chl:
Cloroplastos; Cit: Citoplasma; DHA: Dehidroascorbato; DHAR: Dehidroascorbato reductasa; EC: Extracelular;
Fd: Ferredoxina; GPX: Glutatión peroxidasa; GR: Glutatión reductasa; GSH: Glutatión reducido; GSSG: Oxi-
glutatión; LOOH: Hidroperoxisomas; LOH: Lípido estable (ácido graso); MDHA: Monodehidroascorbato; Mem:
Membrana; Mit: Mitocondria; MR: Monodehidroascorbato reductasa; Per: Peroxisomas; PX: Peroxidasas; PrxR:
Peroxiredoxina; SOD: Superóxido dismutasa; Trx: Tiorredoxina; Vac: Vacuola.
2.3 Fuentes Fisiológicas de Especies Reactivas de Oxigeno y su Remoción Mediante
Moléculas Antioxidantes
2.3.1 Cloroplasto
22
En los cloroplastos se producen O2·- y H2O2 durante la fotosíntesis (Fig. 4), por lo que es
natural que los componentes plastídicos se conviertan en blancos preferidos del daño
oxidativo, aunque también cuentan con varios mecanismos antioxidantes, por ejemplo,
comparado con otros compartimentos celulares, los cloroplastos contienen altos niveles de
acido ascórbico y glutatión, 25 y 5 mM, respectivamente (Noctor y Foyer, 1998).
Figura 4. Fotosíntesis con la concomitante generación de ERO y la participación de sus antioxidantes.
En el interior de los cloroplastos, en el fotosistema II (PSII), bajo condiciones anaeróbicas,
pero con la adición de 3O2, el centro de reacción clorofílico absorbe la energía luminosa a una
longitud de onda de 680 nm excitándose (3P680*), después transfiere la energía de excitación
al O2 cayendo a 1P680 y generando 1O2 (Apel y Hirt, 2004; Halliwell y Gutteridge, 2007). El 1O2 degrada rápidamente lípidos, pigmentos y proteínas que se encuentren próximas a su sitio
de producción. El complejo citocromo b6/f recibe los electrones de PSII transfiriéndolos a la
plastocianina (PC) y esta los cede al P700, convirtiéndose en P700*, AOX puede impedir esta
exitación. Se ha visto en plantas transgénicas que la falta de AOX hace que aumente la
susceptibilidad al estrés oxidativo causando la PCD. El PSI (P700*) transfiere los electrones a
la ferredoxina soluble (Fd). Por último, una flavoproteína soluble asociada a la membrana, la
ferredoxina-NADP reductasa (FNR), reduce el NADP+ a NADPH en el estroma. El
fotosistema I (PSI) es especialmente vulnerable al daño por ERO. La Fd aceptora de los
electrones de PSI es un reductor muy fuerte que puede reducir fácilmente el O2 a O2·-, a través
de la reacción de Mehler. El O2·- es el causante de la peroxidación lipídica. Pero en el
23
cloroplasto existen enzimas como CuZn-SOD y Fe-SOD que convierten el O2·- a O2 y H2O2,
esta ultima ERO es convertido a H2O por PrxR y por el ciclo de ascorbato-glutatión catalizado
por APX del estroma, lumen y membrana (Asada, 1999).
2.3.2 Mitocondria
Figura 5. Cadena de transporte electrónico en la respiración mitocondrial como la responsable en la generación
de ERO y la participación de sus antioxidantes.
Los organismos aerobios utilizan el O2 como aceptor final de electrones durante el proceso de
la respiración mitocondrial que tiene como fin la síntesis de energía en forma de ATP (Fig. 5).
El O2 involucrado en la respiración celular es utilizado por la citocromo oxidasa en un 95-
99%, mientras que la producción de ERO corresponde al 1- 5% restante (Boveris y Chance,
1973). Este hecho es conocido como “la paradoja del oxígeno”, ya que el O2 es imprescindible
para la vida en los organismos aerobios, pero puede al mismo tiempo matarlos. La mitocondria
es la fuente principal de especies como: O2·-, HO·, H2O2, NO· y ONOO-.
24
El complejo I o NADH deshidrogenasa es un gran complejo multienzimático que cataliza la
transferencia de electrones de NADH a la ubiquinona o coenzima Q en la cadena respiratoria.
El complejo II o succinato deshidrogenasa dona también sus electrones a la ubiquinona. El
complejo III o complejo citocromo bc1, obtiene dos electrones desde QH2 y se los transfiere a
dos moléculas de citocromo c en el espacio intermembranal (EIM) de la mitocondria. El
complejo IV o citocromo c oxidasa; capta cuatro electrones del citocromo c y los transfieren al
oxígeno (O2), para producir dos moléculas de agua. Al mismo tiempo se translocan cuatro H+
al EIM por los cuatro electrones. Además "desaparecen" de la matriz cuatro H+ que forman
parte del H2O. Finalmente a partir de ADP se forma ATP gracias a la ATP sintasa.
La reducción directa de O2 a O2·-
tiene lugar en la región flavoproteína del segmento NADH
deshidrogenasa y en la ubiquinona.
La MnSOD mitocondrial actúa sobre el radical O2·- transformándolo en H2O2, que a su vez
puede ser reducido por iones Fe2+ o Cu+ a radicales HO• en reacciones tipo Fenton (Thannickal
y Fanburg, 2000), causando daño oxidativo a lípidos, proteínas y ADN, si el daño es mayor se
causa la disfunción y muerte celular (Fig. 5).
En las mitocondrias también se genera NO que puede interferir con la actividad del complejo
III.
La mitocondria vegetal censa el estrés celular tempranamente y regula la PCD (Rhoads et al.,
2006).
La mitocondria juega el papel más importante en el entrecruzamiento entre los organelos bajo
estrés ambiental/oxidativo por señalización con cloroplastos (Millar et al., 2001) y por inducir
alteración en la expresión de genes a través de señalización desde la mitocondria hasta el
núcleo. Al menos tres diferentes enzimas de rutas de antioxidantes de plantas se han visto que
son blanco en la mitocondria y cloroplastos, sugiriendo un alto grado de coordinación en la
respuesta defensiva entre estos dos compartimentos (Rhoads et al., 2006).
2.3.2.1 Ciclo Ascorbato-Glutatión
El ciclo ascorbato-GSH o ciclo de Halliwell-Asada está constituido por cuatro enzimas, siendo
la más abundante la APX, que requiere ascorbato para reducir el H2O2 a H2O. El MDHA
puede ser reducido a ascorbato de nuevo por la monodeshidroascorbato reductasa (MR), que
25
requiere NADH, o bien puede desproporcionarse a ascorbato y DHA. A continuación, la
deshidroascorbato reductasa (DR) regenera el ascorbato a partir de DHA utilizando GSH
como reductor. El ciclo se completa con la reducción del GSSG a GSH mediante la actividad
glutatión reductasa (GR) utilizando la NADPH (Sairam y Tyagi, 2004).
2.3.3 Peroxisoma
Figura 6. Producción de ERO en los peroxisomas y su remoción.
Los peroxisomas son organelos derivados del RE que llevan a cabo una gama de actividades
metabólicas en respuesta a cambios ambientales y demanda celular.
Una gran interacción metabólica existe entre los peroxisomas, mitocondrias y cloroplastos en
las hojas de las plantas en donde los peroxisomas convierten el glicolato, formado en la
fotosíntesis en glicoxalato (Reumann y Weber, 2006), pero un porcentaje de glicolato es
convertido a H2O2 en los peroxisomas por acción de la glicolato oxidasa (Fig. 6). Los
glioxisomas, un tipo de peroxisomas, se caracterizan por la presencia de una serie de enzimas
que llevan a cabo el ciclo del glioxilato y al igual que en los peroxisomas se produce H2O2.
26
El H2O2 puede ser degradado por la CAT o convertirse en HO·. El HO· e hidroperoxidasas
pueden inducir a la peroxidación lipídica. Los hidroperóxidos formados en este proceso
pueden ser neutralizados por la GPX. Algo de H2O2 puede escapar al citoplasma y puede ser
convertido a H2O por AOX o GPX, o también puede ser atrapado por AOX de la membrana de
los peroxisomas o del citoplasma. El O2·- pueden convertirse en H2O2 tanto por la Mn-SOD y
por la CuZn-SOD (Densen y Wirtz, 2001).
El O2·- se origina en la matriz por acción de la xantina oxidasa y puede salir al citoplasma (Fig.
6). En cambio, no se ha identificado todavía la enzima productora de NO que está presente en
peroxisomas de hojas de guisante, pero se sabe que tanto O2·- y NO participan en la
señalización celular.
2.3.4 Apoplasto y Citoplasma
Figura 7. Diagrama esquemático de la NADH oxidasa vegetal.
La familia de NADH oxidasas (NOX) son proteínas situadas en la MP de células animales,
plantas y hongos, y catalizan la producción de las ERO. La NOX2 induce la producción de
ERO en humanos por activación de las células fagocíticas en la sangre ayudando así a la
destrucción del patógeno. En plantas, los homólogos de la NOX han sido llamados homólogos
de la oxidasa de la explosión respiratoria (Rboh) y participan en la producción de ERO ante la
27
respuesta a patógenos (Sagi y Fluhr, 2001; Torres et al., 2006). El descubrimiento de nuevos
tipos de genes para la NOX animal y nuevas funciones para los genes Rboh de plantas, nos
indican que además estas proteínas participan en el desarrollo, biosíntesis hormonal y
transducción de señales celulares (Foreman et al., 2003; Kwak et al., 2003). Las NOX
contienen dominios de unión a NADPH y FAD (Fig. 7). En general el aceptor final es el O2 y
el producto en el apoplasto de la transferencia de electrones es el O2·- (Sagi y Fluhr, 2006;
Bedard y Krause, 2007). En plantas la NOX es estimulada directamente por Ca2+, mediado por
motivos de unión Ca2+ (EF-hand) situados en el dominio N-terminal de la NOX (Sagi y Flur,
2001) (Fig. 7). El O2·- es dismutado para generar H2O2 en el apoplasto, ya que como sabemos,
esta ERO puede viajar a más distancia que el O2·-.
Otras fuentes de H2O2 en el apoplasto son gracias a enzimas como amino peroxidasas de la
PC, amino oxidasas (PAO y DAO), otras enzimas que contengan flavina y oxalato oxidasas
(Apel y Hirt, 2004; Mittler et al., 2004; Bowler y Fluhr, 2000; Cona et al., 2006).
Intracelularmente, H2O2 puede ser producido por PAO citoplasmática (Cona et al., 2006;
Moschou et al., 2008) o difundir en el citosol desde organelos.
La cuantificación zonal de H2O2 en el apoplasto durante el crecimiento de las raíces todavía no
se ha registrado, pero todo el H2O2 del apoplasto en A. thaliana se ha estimado entre 0.6 y 7
mM (Veljovic-Jovanovic et al., 2001). En las semillas de Zea, es cerca de 0.1-0.2 mM,
aumentando a 10 mM después de estrés por frío (Prasad et al., 1994).
Otra importante fuente de ERO que ha recibido poca atención son las reacciones de
detoxificación catalizadas por el citocromo P450 en el citoplasma y RE (Dybing et al., 1976).
Un jugador anónimo en la red de señalización de ERO es la vacuola, sus antioxidantes y
productores potenciales de ERO no se conocen aun. Es posible que este organelo, por tener un
gran volumen, juegue un inesperado papel esencial en el control del metabolismo de ERO. Al
mismo tiempo la capacidad antioxidante y papel de señalización del apoplasto y peroxisomas
apenas se están descubriendo.
2.4 Evaluación de las Especies Reactivas de Oxigeno
Debido a la gran reactividad de las ERO y a su escasa vida media (ver Tabla 2), estas especies
no han podido ser detectadas experimentalmente hasta el advenimiento de las técnicas de
28
citometría de flujo y microscopía confocal. Estas técnicas han permitido mediante el uso de un
amplio número de moléculas fluorescentes como la rodamina 123 (Rh123),
diclorofluoresceína (DCF), hidroetidio (HE), entre otros, detectar específicamente a las ERO
en el momento de su generación en las células vivas.
El diacetato de 2´, 7-dihidro dicloro fluoresceína (H2DCF-DA) es un compuesto apolar que
entra a las células (Allan y Fluhr, 1997), donde se convierte en un compuesto más polar, el
diclorodihidrofluoresceína (H2DCF), por acción de unas esterasas intracelulares. Este
compuesto no presenta fluorescencia, pero al ser oxidado por el H2O2, catalizado por las
peroxidasas, se convierte en fluoresceína (DCF) altamente fluorescente (verde) (Cathcart et
al., 1983).
2.5 Papel Fisiológico de las Especies Reactivas de Oxigeno
Las ERO no solo deben de ser consideradas como agentes tóxicos producidos por el
metabolismo aerobio, sino que ahora se han reconocido como agentes regulatorios y de
señalización (Apel y Hirt, 2004; Mittler et al., 2004; Foyer y Noctor, 2005). Las ERO están
envueltas en la regulación de respuestas de defensa y muerte celular (Zhang et al., 2003),
gravitropismo (Joo et al., 2001), apertura de estomas (Kwak et al., 2003; McAinsh et al., 1996;
Murata et al., 2001; Pei et al., 2000; Zhang et al., 2001a, b, c); crecimiento polar y expansión
celular (Coelho et al., 2002; Foreman et al., 2003; Gapper y Dolan, 2006) crecimiento y
desarrollo floral y crecimiento de los pelos radicales (Foreman et al., 2003).
Las ERO producidas ante el estrés abiótico actúan como señales de cambio, regulan la
expresión de genes (Pei et al., 2000; Desikan et al., 2001; Pastori y Foyer, 2002; Mittler et al.,
2004; Shin y Schachtman, 2004) y regulan la actividad de canales iónicos (Foreman et al.,
2003). Así como se da una acumulación de estas moléculas ante el estrés biótico, las ERO
pueden ayudar o matar al patógeno (Sagi y Fluhr, 2006; Torres et al., 2006).
Los mecanismo mediante los cuales llevan a cabo estas distintas respuestas, se complementa
con la producción de enzimas y de antioxidantes (Mittler et al., 2004), además de que
necesitan una serie de proteínas y lípidos para poder transmitir las respuestas, como
fosfolipasas y ácidos fosfatídicos (Zhang et al., 2003), ROP GTPases y MAP kinasas (Rentel y
Knight, 2004).
29
2.6 Estrés oxidativo
2.6.1 Peroxidación Lipídica
Los mecanismos por los cuales ERO inducen modificaciones en la permeabilidad en la
membrana se piensa que envuelven la peroxidación de los fosfolipídos de la membrana (Fig,
8), la oxidación de grupos sulfihidrilo localizados en las proteínas (Fig. 9), la inhibición de
enzimas regulatorias unidas a la membrana e interrupción de fosforilación oxidativa y niveles
de ATP (Kourie, 1998).
Los AGPI son fundamentales para la célula, ya que forman parte de los fosfolípidos,
constituyentes principales de la bicapa lipídica de todas las membranas y son los responsables,
en buena medida, de la fluidez e integridad de estas. Los AGPI son moléculas biológicas más
susceptibles al estrés oxidativo y su degradación se denomina peroxidación lipídica.
Esta peroxidación oxidativa es el efecto más importante de las ERO sobre la célula, ya que la
destrucción de los AGPI de la MP junto con la formación de puentes disulfuro de las cadenas
proteicas y la ruptura de éstas, provoca un desmoronamiento de la estructura de la membrana
conduciendo a una pérdida de la permeabilidad y, posteriormente, a la muerte celular. La
susceptibilidad de las membranas biológicas a la peroxidación depende, en gran medida, del
grado de instauración y de la posición de los dobles enlaces y del Fe2+.
La primera etapa de peroxidación lipídica se denomina iniciación (Fig. 8), comienza cuando el
HO· ataca a un carbono de la cadena alifática de una ácido graso, y se extrae un átomo de
hidrogeno para producir H2O y el radical alquílico. Esta reacción se produce
significativamente en los carbonos contiguos a doble enlaces de los AGPI, ya que los radicales
formados se estabilizan por resonancia con el doble enlace del resto acilo y se forman los
conjugados dienos. El HO· no es una molécula muy estable, por lo que reacciona rápidamente
con O2 y forma un ROO· que tampoco es estable, este reacciona con otros ácidos grasos libres
produciendo otras moléculas como ROOH, endoperóxidos y cicloperóxidos, si reacciona con
el mismo (Curtis et al., 1984), de este modo se produce la propagación (Fig. 8). Cuando un
radical reacciona, siempre produce otro radical, lo que es llamado “mecanismo de reacción en
cadena”, la reacción solo termina cuando una ERO reacciona con otro y producen una especie
no reactiva, esto solo pasa cuando la concentración de ERO es suficientemente alta para que
30
halla la probabilidad de que las dos ERO reaccionen. También se termina la peroxidación
lipídica cuando las ERO interaccionan con moléculas antioxidantes, o bien mediante la
fragmentación de los ácidos grasos en gran número de productos hasta que se agota el sustrato,
lo que implica la muerte celular (Halliwell y Gutteridge, 2007).
Figura 8. Pasos de la peroxidación lipídica. De forma esquemática, la reacción de la peroxidación lipídica se
divide en: iniciación, propagación, ramificación y terminación.
En plantas la peroxidación lipídica también puede ser iniciada por lipoxigenasas. La pérdida
de uniones Fe2+ son también capaces de catalizar la descomposición de peróxidos lipídicos
resultando en la formación de radicales alcoxilo y peroxilo que estimulan las reacciones de
peroxidación lipídica. La estructura física de la membrana que tiene los ácidos grasos muy
próximos facilitan la propagación autocatalítica de la peroxidación lipídica (Halliwell y
Gutteridge, 2007).
En la peroxidación lipídica por ataque de un radical X · (Fig. 9b, c y d) se forman un radical
peroxilo y un conjugado dieno. El radical peroxilo es convertido a hidroperóxido lipídico
mediante la adición de tocoferol (Fig. 9e) y el radical tocoferol resultante puede ser reparado
31
por el ascorbato (Fig. 9f) y el radical ascorbato puede ser regenerado por un sistema
enzimático. La PLA2, GPX, y A-CoA cooperan para la detoxificación y reparación de las
cadenas de acido graso oxidadas de los fosfolipídos. A medida que se produce el daño se
activan los sistemas de defensa (Buettner, 1993).
2.6.2 Daño Oxidativo a Proteínas
Figura 9. Modificación de proteínas por ERO. Peroxidación lipídica y reparación por antioxidantes.
La modificación de proteínas puede ser por formación de puentes disulfuro entre una proteína
y otra, entre la misma proteína ya sea creando puentes intra o extramoleculares, reacciones
mediadas por H2O2. También se puede dar la oxidación de residuos cisteína por H2O2 o O2.-,
aunque también son susceptibles a modificación oxidativa los residuos tirosina, metionina,
triptófano e histidina sin la formación de grupos carbonilo (Dröge, 2002; Stadtman, 1992).
Algunos aminoácidos como lisina, prolina y arginina, se oxidan dando lugar a grupos
carbonilo, de modo que el contenido en carbonilos de las proteínas se puede emplear como un
indicador de daño oxidativo a las mismas (Stadtman, 1992).
La oxidación de proteínas puede dar lugar a un cambio conformacional irreversible de la
proteína y, por tanto, a una pérdida o modificación de su función biológica o puede darse la
desnaturalización de ésta. Se pueden formar puentes disulfuro entre una misma proteína o
entre una proteína u otra que contengan aminoácidos como la cisteína (Fig. 8a).
32
CAPÍTULO 3. POLIAMINAS
3.1 Propiedades Químicas y Funciones Fisiológicas de las Poliaminas
Las poliaminas (PAs) son abundantes compuestos policatiónicos de bajo peso molecular
teniendo grupos amino primarios y/o secundarios, se encuentran desde bacterias y algas hasta
plantas y animales superiores, en plantas las cantidades presentes varían desde micromolares
hasta más de milimolares (Kusano et al., 2008). Las principales PAs son putrescina (Put2+)
(butano-1,4-diamina), espermidina (Spd3+) [N-(3-aminopropilo) butano-1,4-diamina] y
espermina (Spm4+) [N,N´-bis(3-aminopropilo) butano-1,4-diamina]. Su historia se remonta a
1678, cuando Anton Van Leeuwenhoek al observar al microscopio muestras de semen
desecadas describió los cristales de Spm, ésta y su precursor Spd se encuentran en gran
cantidad en el líquido seminal y son los responsables de su típico olor (Dudley et al., 1927).
Put y Cad son llamadas así por contribuir al olor de lo putrefacto o del cadáver
respectivamente (Goldberg, 1994).
Las PAs son compuestos que a pH fisiológico están cargados positivamente, esto los convierte
en compuestos de interés ya que pueden interactuar más fuerte y específicamente que otros
cationes como Mg2+ o Ca2+ con proteínas, esto es porque sus cargas positivas en distancias
definidas participan en más interacciones hidrofóbicas (Thomas y Thomas, 2001). Las PAs
pueden interactuar electrostáticamente con macromoléculas con cargas negativas y modular su
actividad, como con algunas proteínas, por ejemplo, canales iónicos, transportadores y
bombas, así como con fosfolípidos, pectinas, cromatina, ADN, ARN, entre otros (Feuerstein et
al., 1990; Apel y Hirt, 2004).
El genoma de E. Coli no contiene un gen que codifique para SPMS, por lo que la síntesis de
Spm no es necesaria para el crecimiento normal de éstas células (Xie et al., 1993) y
mutaciones en un gen para la síntesis de Spm el Saccharomyces cerevisia indican que tampoco
es necesaria esta PA para el crecimiento de las levaduras. En contraste, mutación en el splice
del gen de SPMS en células humanas, se ha asociado con el síndrome Snyder-Robinson, un
desorden de retraso mental (Cason et al., 2003). Este descubrimiento sugiere que Spm si se
33
requiere para el crecimiento en células eucarioticas. De hecho en las plantas, las PAs son
clasificadas como moléculas reguladores del crecimiento.
La PAs modulan la división celular, proliferación y diferenciación, dormancia o dormición de
las semillas, morfogénesis, desarrollo floral, maduración de frutos, regula la expresión de
genes, participa en la PCD y responden ante estrés ambiental (Evans y Malmberg, 1989). Se
ha reportado que las PAs también poseen actividad antioxidante (Drolet et al., 1986; Tiburcio
et al., 1994; Rhee et al., 2007).
3.2 Biosíntesis y Degradación de las Poliaminas
Figura 10. Biosíntesis y degradación de poliaminas. Abreviaturas. Enzimas de síntesis de PA están indicados en
azul: ADC: Arginina descarboxilasa; ODC: Ornitina descarboxilasa; AIH: Iminoil iminohidrolasa; CPA: N-
carbamoilputrescina amidohidrolasa; SPDS: Espermidina sintetasa; SPMS: Espermina sintetasa; SAMS: S-
adenosilmetionina sintetasa; SAMDC: S-adenosilmetionina descarboxilasa; LDC: Lisina descarboxilasa.
Enzimas de degradación de PA están indicados en morado: DAO: Diamina oxidasa; PAO: Poliamina oxidasa.
Inhibidores específicos de la síntesis de PA están indicados en rojo: DFMA: α-Difluorometilarginina; DFMO: α-
Difluorometilornitina (Zepeda-Jazo et al., 2008).
34
Hay dos rutas para la biosíntesis de las PAs, la descarboxilación de la Arginina por la ADC y
la descarboxilación de la Ornitina por la ODC, para obtener en ambas Put, y con las enzimas
SPDS y SPMS, se agregan dos grupos aminopropilo a la Put y se produce Spd y Spm
respectivamente, el grupo aminopropilo se obtiene por la descarboxilación de la S-
adenosilmetionina que es sintetizada desde la metionina en dos reacciones secuenciales por
SAMS y SAMDC (Dudley et al., 1927; Slocum y Flores, 1991).
La ruta ODC puede ser inhibido por la α-difluorometilornitina (DFMO) (Metcalf, 1978) y la
ADC por la α-difluorometilarginina (DFMA) (Kallio, 1981). Metilgliosal-bis-guanilidrazona
(MGBG) puede inhibir a la SAMDC y la ciclohexilamina (CHA) puede inhibir a la SPDS
(McCann, 1987) (Fig. 10).
En A. thaliana no existen genes ODC (Hanfrey et al., 2001), pero se han reportado dos para
ADC, ADC1 y ADC2 (Watson et al., 1997). La ruta ADC es la mayor activada bajo estrés. La
actividad de ADC y ODC se localiza en el citosol, cloroplasto, mitocondria y núcleo, por lo
que es en estos sitios donde se encuentran las PAs, además de encontrarse en el apoplasto y
PC (Kumar et al., 1997).
Los genes SPDS1 y SPDS2 codifican para SPDS (Hanzawa et al., 2002) y SAMDC1,
SAMDC2, SAMDC3 y SAMDC4 para SAMDC (Urano et al., 2003).
En plantas, las enzimas DAO y PAO catalizan la oxidación de las PAs con la concomitante
producción de H2O2 (Tang y Newton, 2005; Zimmermann et al., 2004).
Impacto de Poliaminas sobre la Resistencia de Plantas a la Salinidad
Se da aumento en la síntesis de PAs en las células vegetales en respuesta a una variedad de
estreses, por ejemplo, Spd aumenta significativamente ante estrés hídrico, congelamiento,
salinidad, hiperosmosis y paraquat.
Ante NaCl, sequía y deshidratación se aumenta la expresión de los genes:
• ADC1 y ADC2 (Urano et al., 2003; Hummel et al., 2004; Zimmermann et al. 2004;
Alcázar et al., 2005),
• SPMS, SAMDC1 y SAMDC2 (Li y Chen, 2000; Urano et al., 2003; Zimmermann et al.
2004)
• DAO y PAO.
35
El aumento de PAs no es justamente colateral, pero representa un componente integral de la
tolerancia al estrés.
La ausencia de enzimas para la biosíntesis de Spm en A. thaliana causa un defecto en la
homeostasis del Ca2+, resultando en una hipersensibilidad en el estrés iónico inducido por
estrés salino (Yamaguchi et al., 2006). Sin embargo la acumulación de PAs parece ser toxico
en las plantas bajo condiciones normales y por lo tanto su sobreexpresión constitutiva tal vez
no sea la forma apropiada para obtener tolerancia al estrés (Bartels y Sunkar, 2005).
Las PAs protegen a la célula del estrés salino modulando de manera directa o indirecta el
transporte iónico, con el fin de mantener baja [Na+] y alta [K+] en el citosol (Zhao et al., 2007)
(ver Cap. 6) y ayudan a la compartimentalización del Na+ (Zhao y Qin, 2004).
Ya que ante salinidad hay más soluto en el suelo que en las células de la planta, las células
pierden su turgencia y las PAs y otros solutos compatibles, actúan como osmoprotectores
restableciendo el Ψs y protegiendo a las células de la perdida de agua. Sin embargo esto no ha
sido probado del todo (Cuin y Shabala, 2007).
Las PAs también actúan como antioxidantes (Drolet et al., 1986; Tiburcio et al., 1994; Rhee et
al., 2007) o inducen la expresión de enzimas antioxidantes como, APX, GR, CAT y SOD
(Verma y Mishra, 2005) y disminuyen la peroxidación lipídica en Virginia Pine (Tang y
Newton, 2005).
Ante salinidad, se disminuye el contenido de fosfolipídos de la MP y vacuolar, provocando la
pérdida de la integridad de las membranas biológicas y haciendo a las células más sensibles a
la salinidad (Mansour et al., 2002). La aplicación de PAs puede restablecer los niveles de
fosfolipidos y estabilizar de esta manera las membranas, restaurando el daño producido por la
salinidad, así como mantienen la estructura y actividad de varias enzimas (Zhao y Qin, 2004;
Mansour et al., 2002).
Cuando la planta tiene poca agua tiende a cerrar los estomas, resultando en una reducción de
la toma de CO2 en las hojas. Esto permite que los electrones en lugar de ser usados en la
cadena de transporte electrónico para la fotosíntesis, sean usados para la producción de ERO.
Sin embargo Farooq et al., (2009), determinaron que la aplicación de Spm aumenta la
tolerancia a la sequía (condición dada ante salinidad), mejorando el estatus del agua de las
hojas, la fotosíntesis y las propiedades de membrana.
36
CAPÍTULO 4. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL TRANSPORTE IÓNICO EN
PLANTAS
4.1 Sistemas de Transporte Iónico
El K+ es movido desde el suelo a la superficie de las raíces predominantemente por difusión y
entra al simplasto vía canales y transportadores en la MP. Desde ahí, puede viaja a los tejidos
vasculares, es descargado desde el xilema por varios transportadores a distancia hasta llegar a
las hojas.
Figura 11. Transporte de Na+ a través de la membrana plasmática. Las mismas rutas para el infujo de K+ son
utilizadas por el Na+ y el antiportador SOS1 media la salida de Na+ utilizando el gradiente de H+ generado por la
bomba H+-ATPasa.
Existen dos mecanismos para el transporte de K+, uno media la entrada de K+ con gran
afinidad, a concentraciones externas de K+ > 1mM (sistema I o transportadores). El otro
(sistema II o canales iónicos) opera bajo altas concentraciones de K+ externo y es un
mecanismo de toma de K+ de baja afinidad.
En el sistema I ante bajo K+, se aumenta la expresión de genes y la actividad de este sistema,
mientras que el sistema II no se ve influenciado por el estado de K+ en la planta, ni discrimina
entre K+ y Na+.
Dentro del sistema I está el cotransportador K+/H+ (HKT) permite el influjo de K+ junto con
H+, con una estequiometria 1:1 (Maathuis y Sanders, 1993). El HKT se activa a
concentraciones micromolares externas de K+. El antiportador Na+/ H+ (SOS1) permite el
37
eflujo de Na+ (Fig. 11). En el tonoplasto está un sistema parecido al SOS1, es el NHX (Fig.
12) (Yamaguchi et al., 2005).
El sistema II incluye a los canales iónicos, en el caso del K+, este es transportado a través de la
MP por los canales NORC, NSCC (VIC y HACC) y AKT (Fig. 11). Y en el tonoplasto solo se
han encontrado tres tipos de canales que median el transporte de cationes, los canales SV, FV
y el selectivo a K+, el VK (Fig. 12).
El transporte iónico y de solutos a través de la MP y tonoplasto es dependiente de la actividad
de las H+-ATPasas de la MP (Fig. 11) y tonoplasto (Fig. 12) y de la PPi-asa del tonoplasto.
Estas bombas transportan los H+ hacia afuera del citosol, estableciendo el gradiente eléctrico y
de protones a través de la membrana, estos gradientes constituyen la fuerza protón motriz a
través de la membrana que es usada para procesos de transporte secundario de varios solutos y
iones en contra de su gradiente electroquímico.
Figura 12. Transporte de Na+ a través del tonoplasto. El canal SV y el antiportador NHX podrían ayudar a la
compartimentalización del Na+ y el canal VK principalmente media el influjo de K+. El antiportador NHX utiliza
el gradiente de H+ generado por las bombas de protones (H+-ATPasa y PP-ATPasa del tonoplasto).
En la Tabla 4 se muestran los principales canales, transportadores y bombas presentes tanto en
la MP y en tonoplasto, su correlato molecular, lugar de expresión y según el sitio, la función
que desempeña. También se incluye su dependencia de voltaje.
38
Tabla 4. Poliaminas y especies reactivas de oxigeno como reguladoras del transporte iónico en plantas
Clase
Genes Expresión Dependencia de Voltaje
Función Sensible a ERO/PA
Canales de K+
tipo Shaker
Canales K+- 2P
AKT1
AKT2/3
AKT5/6
KAT1/2
GORK
SKOR
KCO2-6
CG 1
Raíz madura 2
Mesófilo
Floema, xilema,
mesófilo y epidermis4
CG1
CG y flor5
CG 1, 6,11
Sistema vascular11
CG12
Tallo, pelos radicales y epidermis13
Periciclo de la raíz y células
parénqui-matosas
Polen, CG,
raíz y mesófilo15
KIR-HP
WIR
?
KIR
KOR
IV
Apertura de estoma
Toma de K+2
Balance de carga3
Carga floemática, balance de carga, osmoregulación,
transporte a grandes distancias4
?
?
Apertura de estomas1
Carga de K+ en el floema
Cierre de estomas13
Eflujo y censo de K+
Carga del xilema14
ND
ND
ND
ND
ND
ND
(-) H2O27,8, O3
9 y PA10
ND
(-) H2O27,8 y O3
9
ND
ND
ND
39
NSCC-MP
DA
HACC- HO·
HACC-H2O2
VIC
NSCC-vacuolar
SV
TCP34
Mesófilo, epidermis de raíz madura, CG, xilema de raíz
Mesófilo, CG, epidermis de hojas y raíz 21,22
Tomate24, CG25,26, pelos radicales27 zona de elongación de la epidermis y madura 28-31 y en células rizoides de alga32
Vacuolas
DA
IR y OR
HP
IV
DA/HA
Censa el K+ en el xilema. Homeostasis de cationes monovalentes y toma de divalentes. Redistribución de K+ en semillas. Perdida de K+ en salinidad. Toma Na+ 16-20
Toma de nutrientes Ca2+ (zona de elongación), Mg2+, NH4+, Mn2+ y Zn2+ y iones malignos (Na+, Pb+2, Cd+2)17.
El crecimiento y nutrición del ápice de la raíz para la elongación polar depende del influjo de Ca2+ 23, 27,28
Crecimiento y elongación. Censan los metales de transición. Cierre de estomas. Entra Na+27,33,47 Eflujo de K+22.
¿Señalización por Ca2+?29
ND
(+) HO· 31
(+) H2O2 zona madura26,23,7
(+) HO· zona de elongación > madura30, (-)
PA60
(-) H2O235 y
PA36, 38, 39
40
FV
¿CNGC o GLR?40,
41
Vacuolas
¿Potencial del tonoplasto, intercambio de cationes monovalentes?37,42
(-) PA36, 38, 39
Canal selectivo a K+ VK
TPK43/ KCO44
Vacuolas, solo TPK4 en MP43,44
Afecta la homeostasis del K+, germinación de semillas, función de estomas
(-) PA45
Canal selectivo a Ca2+
BCC146 RE46 Trans: (-) H2O2
Cis: H2O2 no efecto46
Canales aniónicos
AC-DA
ARAC
IRAC
QUAC
SLAC
IRAC
Epidermis y raíz
Raíz47yCG48
Raíz49
Raíz49
Raíz49 y CG
Raíz22
OR, rápida activación29
DA tipo R
IR-ID
IR/OR-DV
DA tipo S
IR-HP
En CG permite el eflujo de aniones que conlleva al cierre de estomas
ND
ND
(-) PA50
(-) PA50
(+) H2O251
ND
H+-ATPasa-MP
AHA MP Proporciona la fuerza motriz para la realización de varios procesos fisiológicos
(-) H2O252,
(+)Spm53,54
V-ATPasa
vacuola Proporciona fuerza motriz
(-) ERO55, (-) Put o Spd56 o (+) PA57, 58,59
CG: células guarda; DA: despolarización; HP: hiperpolarización; IR: rectificador entrante; WIR: débil rectificador entrante; IV: independiente de voltaje; DV: dependiente de voltaje; P: poro; ND: no
determinado; AC-DA: canal aniónico activado por despolarización; IRAC: canal aniónico rectificador
41
entrante; QUAC: conductancia aniónica activado rápidamente; SLAC: conductancia aniónica activado lentamente; BCC1: Canal de Ca2+ de Bryonia dioica; (+): activado; (-): inhibido.
Szyroki et al, 20011; Lagarde et al., 19962; Dennison et al., 20013; Marten et al., 19994; Dietrich et al., 20015; Anderson et al., 19926; Köhler et al., 20037; Zhang et al., 2001b8; Torsethaugen et al., 19999; Liu, 200010; Pilot et al., 200111; Mäser et al., 200112; Hosy et al., 200313; Gaymard al., 199814; Czempinski et al., 200215; Zhang et al. 200016, 200217, 200418; White, 200019; Wang et al. 200620; Véry, 199821; Shabala et al., 200622; Demidchik et al. 200723; Gelli y Blumwald, 199724; Hamilton et al., 200025; Pei et al., 200026; Véry y Davies, 200027; Kiegle et al., 200028; Demidchik et al., 2002a29, 200330; Foreman et al., 200331; Coelho et al., 200232; White y Tester, 199233; Peiter et al., 200534; Pottosin et al., 200935; Brüggemann et al., 199836, 199937; Dobrovinskaya et al., 1999a38,b39; Leng et al., 200240; Demidchik et al., 2002b41; Maathuis y Sanders, 200142; Voelker et al., 200643; Bihler et al., 200544; Hamamoto et al., 200845; Klüsener, 199746; Demidchik y Tester, 200247; Schroeder y Keller, 199248; White y Davenport, 200249; Zepeda-Jazo, 2006 50; Trouverie et al., 200851; Lie et al., 200452; Garufi et al., 200753; Roy et al., 200554; Feng y Forgac, 199455; Tang y Newton, 200556; Liu et al., 200657; Zhao et al., 200458; Zhao y Qin, 200459; Shabala, 200760. 4.2 H+-ATPasa de la Membrana Plasmática
4.2.1 Características de la H+-ATPasa de la Membrana Plasmática
Recordando que en células vegetales no existe la bomba Na+/K+ de células animales, la H+-
ATPasa de la MP o plasmalema es la mayor fuente de energía para estas células.
La H+-ATPasa-MP es una enzima electrogénica, expulsa 1 protón por cada ATP hidrolizado,
su activación expulsando protones sin ninguna carga entrante que lo compense provoca una
hiperpolarización de la MP de entre -160 a -250 mV según la especie, así como la
acidificación del apoplasto. Con el gradiente creado por esta bomba se proporciona la fuerza
motriz para el transporte de nutrientes y la salida de iones de la célula ya que se encuentra
acoplada a cotransportadores de sucrosa, aminoácidos y nitratos dependientes de H+ (Sussman,
1994; Palmgren, 1998), carga floemática (Zhao et al., 2000), sistemas de crecimiento en ápice
(Obermeyer, 1992), turgor, tamaño celular y apertura de estomas (Schulz-Lessdorf et al.,
1994), movimiento de las plantas, proporciona tolerancia ante estrés salino (Roldán et al.,
1991, Fukuhara et al, 1996), regula el pH intracelular (Espen et al., 1995), ayuda al
crecimiento acido, distribuye el Na+ y K+ en ambos lados de la MP (Fig. 11), etc.
Esta “fuente de poder” está sujeta a modulación por varios factores ambientales, como,
toxinas, luz, nutrientes minerales (Morsomme y Boutry, 2000), ERO (Feng y Forgac, 1994) y
PA (Garufi et al., 2007; Tang y Newton, 2005; Liu et al., 2006; Zhao et al., 2004).
La H+-ATPasa-MP pertenece a la familia tipo P de ATPasas que se caracterizan por formar un
intermediario fosforilado (por eso su clasificación de tipo P) y son exclusivas de plantas y
42
hongos. En plantas se encuentra en todos los tipos celulares, pero en diferentes
concentraciones (Palmgren, 2001). El peso molecular de la bomba como monómero es ~100
kDa. Está formado por 10-12 hélices transmembranales.
La H+-ATPasa-MP tiene 5 dominios (Fig. 13), los cuales consisten en:
A: dominio actuador, consiste en el segmento N terminal y una asa pequeña,
M: segmento transmembranal,
N: dominio de unión al nucleótido,
P: dominio de fosforilación, el cual contiene el residuo Asp fosforilado catalítico,
R: segmento C terminal que actúa como dominio autoinhibitorio.
Figura 13. Dominios de la bomba H+-ATPasa de la membrana plasmática.
El dominio R en el estado inhibido se encuentra unido al dominio N (Morsomme y Boutry,
2000; Duby y Boutry, 2008), cuando se fosforila se entra al estado activado E1 donde el
dominio R se despega del N, permitiendo al protón accesar al sitio de ligadura del dominio M.
Asimismo, en esta conformación, el ATP tiene acceso al dominio N y se da la fosforilación en
el dominio P. El protón ligado provoca un cambio conformacional que es transmitido a través
de M4 y M5 a los dominios A y P que se reorientan y se reduce la afinidad de los protones en
los sitios de ligadura en el dominio M transmembranal, por lo que los protones son liberados
hacia el exterior. Luego, la enzima retorna al estado E1, previo paso por el E2 desfosforilado,
y comienza un nuevo ciclo de bombeo.
CAPÍTULO 5. ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO COMO REGULADORAS
DEL TRANSPORTE IÓNICO ANTE ESTRÉS SALINO
43
5.1 Regulación de Canales Iónicos de la Membrana Plasmática por Especies Reactivas de
Oxigeno
Figura 14. Especies reactivas de oxigeno como reguladoras del transporte iónico en plantas.
5.1.1 Canales NSCC
Rentel y Knight (2004), observaron el efecto de H2O2 en la célula por luminometría,
concluyendo que la adición de 1mM de H2O2 provoca un aumento de 0.05 a 0.43 µM de Ca2+.
44
Utilizando técnicas electrofisiológicas (patch-clamp) varios investigadores han estudiado el
efecto de H2O2 y HO· en las células y han observado un aumento en la concentración
citoplasmática de Na+, Ca2+ y una salida de K+, por lo que podría tratarse de canales de K+ o
NSCC. Para discernir el canal responsable, podemos hacer uso de herramientas
farmacológicas, adicionando bloqueadores del canal NSCC (Zn2+, La3+, Gd3+, quinidina y
modificadores del residuo histidina) o del canal de K+ (TEA+), comparar las características
electrofisiológicas, corriente específica y selectividad iónica.
Al observar que el canal no es bloqueado por TEA+ y comparando las características
electrofisiológicas se piensa que los responsables de los flujos anteriores, correspondían a al
menos dos canales catiónicos no selectivos (NSCC) activados por ERO (VIC y HACC) (Fig.
14). Estos canales no discriminan entre los diferentes cationes, pero no permiten el paso de
aniones.
• Los NSCC activados por HO· (NSCC-HO·) encontrados en todos los tipos de células
de raíz analizados, que nosotros llamamos NSCC independiente de voltaje (VIC), por
que se activa tanto a potenciales despolarizantes como hiperpolarizantes (Demidchik et
al., 2003). Este canal permite la masiva entrada de Na+ y Ca2+ ante salinidad
(Amtmann y Sanders, 1999; Demidchik y Tester, 2002) y la pérdida de K+ (Cuin y
Shabala, 2007). En varios estudios en crecimiento de raíz la activación del canal VIC-
HO· varía según el estado de desarrollo, disminuyendo desde la epidermis al periciclo,
y desde la zona de elongación a la epidermis madura. Este canal permite pasar el Ca2+
en mayor medida en la zona de elongación, ya que este ion es necesario para el
crecimiento y elongación de la raíz (Demidchik et al., 2003). • Los NSCC activados por HO· son encontrados en mayor medida en la zona de
elongación de la raíz y se activa solo a potenciales hiperpolarizantes, por lo que se
denomina HACC-HO· (Foreman et al., 2003), este canal permite la entrada de Na+ y
Ca2+, pero no la salida de K+.
• Los NSCC activados por H2O2 (HACC-H2O2), localizados mayormente en la zona
madura de la raíz (Pei et al., 2000; Demidchik et al., 2002, 2007; Köhler et al., 2003).
Estos canales no son inhibidos por Ba2+ sino que lo conduce, indicando que no se trata
de un canal de K+. La corriente generada con Ba2+ fue mayor que con Ca2+, esto es
típico en los canales de Ca2+ regulados por voltaje de células animales y de HACC
45
vegetales (White, 2000). El canal es muy poco permeable al Zn2+ el cual puede actuar
como bloqueador del canal (Demidchik et al., 2007).
Todos estos NSCC-ERO permiten el influjo de Ca2+ que es un nutriente esencial para las
plantas (Demidchik et al., 2002, 2007; Véry y Davies, 2000; Kiegle et al., 2000), esto es
importante ya que en las plantas no se han encontrado canales selectivos a Ca2+ (Bothwell y
Ng, 2005). Los NSCC-ERO también regulan la apertura de estomas, expansión celular,
crecimiento y nutrición de la raíz (Coelho et al., 2002; Foreman et al., 2003; Kwak et al.,
2003; Murata et al., 2001; Pei et al., 2000).
La señal de ABA o la fosforilación de proteínas activan a HACC y se podría pensar que H2O2
al activar los mismos canales, participan como segundos mensajeros para que se dé la
señalización por ABA (Hamilton et al., 2000).
El pretratamiento con DEPC (dietilpirocarbonato) un agente alquilante del residuo histidina,
disminuye de 4 a 6 veces la corriente los NSCC, sugiriendo la existencia de un grupo(s)
histidil en la cara externa del canal, el cual es importante para el funcionamiento de NSCC.
Por lo que se puede esperar que los ERO actúan a nivel de los residuos de histidina
(Demidchik et al., 2002).
5.1.2 Canales de K+ (KIR)
No es sorprendente que los canales de K+ en las células guarda sean sensibles a ERO porque,
como en varias proteínas, parece que ellas conservan aminoácidos reactivos.
KAT pertenece a la familia de canales de K+ tipo Shaker, los cuales conservan una cisteína en
una posición particular en el segmento S6 y una histidina en otra subunidad, por lo que el
H2O2 puede crear puentes disulfuro en este canal (Anderson et al., 1992) e inhibir su actividad
(Fig. 13). La señal de ABA y el ozono (O3), también inducen la inhibición de canales KIR
(Zhang et al., 2001b; Köhler et al., 2003; Torsethaugen et al., 1999) interrumpiendo la apertura
de estomas (Torsethaugen et al., 1999).
Los canales de K+ son 100 veces más sensibles a H2O2 comparados con los canales
permeables a Ca2+ (Köhler et al., 2003), sugiriendo que el H2O2 actúa de modo diferente.
Varios estudios sugieren que ABI1 y proteínas fosfatasa (PP2C y PP2B) participan en la
regulación de los canales de K+, estas proteínas son escenciales intermediarios en la ruta de
46
señalización de cierre de estomas por ABA (Merlot et al., 2001). ABI1, PP2C, PP2B, CaM,
PTP y una calcineurina bovina son inhibidos por H2O2. En el caso de PTP y PP2C, un residuo
de cisteína conservado puede sufrir una oxidación (Meinhard y Grill, 2002), en la calcineurina
puede formarse puentes disulfuro (Sommer et al., 2002), la inhibición de esta fosfatasa
dependiente de Ca2+ y moduladora de los canales KIR, puede ser la causa de que H2O2 inhiba a
los canales KIR activados por Ca2+ (Luan et al., 1993).
Antes y después de tratar con O3 a los protoplastos de células guarda V. faba, se observo que
la corriente de KOR es reducida solo un poco, pero el O3 si causa una inhibición significativa
en los canales KIR (Fig. 14). Esta inhibición del canal por O3 no había sido demostrada
anteriormente para ningún sistema biológico. Con esto se asume que el O3 no solo promueve
el cierre de estomas, como ya se había asumido, sino que el O3 es un potente inhibidor de la
apertura estomática (Torsethaugen et al. 1999).
Un posible mecanismo para el efecto de O3 observado en los canales de K+ es la directa
oxidación de los aminoácidos del canal (Torsethaugen et al. 1999).
5.1.3 Canales de K+ (KOR)
Mediante la técnica no invasiva (MIFE) se vio que ante salinidad se da un eflujo de K+ al
medir la corriente específica y al compararla con la corriente medida en patch-clamp se
observo que se trata del mismo canal, y al observar sus características electrofisiológicas y su
sensibilidad a TEA+, se concluyo que se trata de un canal KOR (Chen et al., 2007).
Köhler et al., (2003) y Zhang et al., (2001b) probaron que H2O2 suprime al canal GORK (Fig.
14), esto es sorprendente ya H2O2 induce al cierre de estomas y por lo tanto, se esperaría que
se estimulara la perdida de K+ desde las células. Sin embargo, se han reportado otras vías para
el eflujo de K+ y su respuesta ante el H2O2 no se conoce.
5.2 Canales Iónicos del Tonoplasto Regulados por Especies Reactivas de Oxigeno
5.2.1 Canales SV
47
Considerando los cationes fisiológicos más abundantes, el canal SV (canal vacuolar lento)
puede mediar el intercambio pasivo entre la vacuola y el citosol de Na+, K+, Mg2+, Ca2+ y
NH4+, sin embargo aniones como el Cl- casi no permean, esto es porque la superficie del poro
del canal SV es negativa y esto contribuye probablemente a mecanismos de selectividad de la
carga, atrayendo cationes y rechazando aniones (Pottosin et al., 2001). Este canal es el más
abundante y uno de los más grandes en el tonoplasto y se ha encontrado en todos los tejidos y
de todas las plantas probadas (Pottosin y Schönknecht, 2007).
Factores citosólicos que afectan positiva o negativamente a la actividad del canal SV son Ca2+
> 1µM (Hedrich y Neher, 1987), proteínas que fosforilan al canal (Allen y Sanders, 1995), pH
(Schulz-Lessdorf et al., 1996), proteínas 14-3-3 (Van Der Wijngaard et al., 2001), H2O2
(Pottosin et al., 2009), metales pesados y PAs (Dobrovinskaya et al., 1999a,b).
La aplicación exógena de H2O2 inhiben al canal SV, esta inhibición en condiciones de
salinidad es benéfica para que el Na+ siga compartimentalizado en la vacuola, ya que el canal
SV permite la salida de Na+ al citoplasma (Fig. 14) (Pottosin et al., 2009). Se propone que
H2O2, debido a sus efectos oxidantes en CaM y calcineurina, tengan impacto en la actividad
del canal SV (Scholz et al., 2005).
5.3 Otros Canales Iónicos Intracelulares Regulados por Especies Reactivas de Oxigeno
5.3.1 Canales BCC1
Aplicando H2O2 (>mM) desde el compartimento trans (lado citoplasmático del canal) se
muestra un efecto inhibitorio para el canal de Ca2+ del RE (BCC1) (Fig. 14), cerrando casi por
completo al canal. No obstante, la aplicación de H2O2 en el compartimento cis no mostró
ningún efecto (Klüsener, 1997). Aun no se sabe su implicación en la tolerancia ante estrés
salino.
5.4 Bombas de Protones Reguladas por Especies Reactivas de Oxigeno
5.4.1 H+-ATPasa de la Membrana Plasmática
48
Ante salinidad se reporta una inhibición de la H+-ATPasa-MP, tal vez por el aumento de
Ca2+cit y/o por las ERO (Fig. 13). Las ERO oxidan los grupos tiol de la bomba inactivándola
(Zhao y Blumwald, 1998), causando una acidificación en el citosol y una alcalinización en el
apoplasto. Esto muestra que el H2O2 imita al efecto de ABA en la inhibición del bombeo de
protones, sugiriendo que H2O2 actúa como un intermediario potencial de la señalización por
ABA (Trouverie et al., 2008).
5.4.2 Ca2+-ATPasa de la Membrana Plasmática
Se ha visto que el H2O2 provoca la oxidación de metionina en calmodulina, inhibiendo la
activación dependiente de CaM de la Ca2+-ATPasa de la MP (Gao et al., 2001; Yao et al.,
1996).
CAPÍTULO 6. Poliaminas como reguladoras del transporte iónico ante estrés salino
6.1 Regulación de Canales Iónicos de la Membrana Plasmática por Poliaminas
6.1.1 Canales NSCC tipo VIC
Los canales NSCC tipo VIC, son susceptibles a las PAs. La aplicación externa de 1 mM Put o
Spd en mesófilo y de 1 mM Spd en células epidermales de la raíz inhiben las corrientes
entrantes (Na+) y salientes (K+) mediadas por NSCC (Fig. 15) (Shabala et al., 2007). En
experimentos de corriente con mesófilo se propuso, basándose en la cinética lenta del efecto
de PAs, que las PAs pueden actuar desde el lado intracelular y/o que sus efectos en NSCC son
indirectos (Shabala et al., 2007).
6.1.2 Canales de K+ (KIR)
Todas las PAs (Cad, Put, Spd y Spm) inhiben fuertemente la apertura e inducen el cierre de
estomas (Liu, 2000). Ante la salinidad se da el estrés hídrico y se necesita el cierre de estomas
en las células guarda, para que no se pierda más agua y la planta no muera marchitada.
49
El canal KAT, un canal tipo Shaker, que tiene características de rectificación entrante, situado
en la MP de las células guarda permite la entrada de K+, esto ayuda a la apertura de estomas.
Liu et al. (2000) encontraron que 1 mM Spm inhibe a KAT (Fig. 15) y que la inhibición es
mayor por PAs con mayor carga: Spm4+ > Spd3+ > Put2+, esta misma tendencia fue observada
en células del parénquima del xilema de la raíz (Zhao et al., 2007). Esta inhibición tiene un
posible beneficio para situaciones de estrés, como en sequía (Schroeder et al., 2001).
Figura 15. Poliaminas como reguladoras del transporte iónico en plantas.
50
El contenido de PIP2 y Ca2+ intracelular, actúan como cofactores para la activación de los
canales de K+ tipo Shaker. Spm y Spd estimulan la sobreproducción de PIP2 vía actividad
lípido- kinasa (Dureja-Munjal, 1992), aunque en algunas preparaciones la Spm fue capaz de
estimular la actividad de la PLC, aumentando el consumo de PIP2 y produciendo IP3, el cual
puede provocar la liberación de Ca2+ intracelular (Echevarría-Machado et al., 2002; 2005).
Los canales KIR y KOR son sensibles a las proteínas 14-3-3 (Van den Wijngaard et al., 2005).
Se sabe que las PAs pueden interactuar con proteínas 14-3-3 y de esta manera podrían
modular su unión con varias moléculas blanco (Athwall y Huber, 2002).
6.1.3 Canales de K+ (KOR)
Liu et al. (2000) menciono que las PAs podían inhibir a KOR y a los canales aniónicos, pero
no pudo demostrarlo. Datos preliminares obtenidos por Zepeda-Jazo (2006) muestran una
substancial inhibición de canales KOR (KORC y NORC) por 1 mM Spm en protoplastos
radiculares de cebada (Fig. 15).
Como ya se ha mencionado, la entrada de Na+ por VIC hace que se despolarice la MP, y la
despolarización activan canales KOR. Las PAs al inhibir los canales VIC, inhiben la entrada
de Na+, no habiendo despolarización, ni activación de los canales KOR, de esta forma las PAs
pueden prevenir la salida de K+ y ayudar a la homeostasis Na+/K+.
Contrariamente, Zhao et al. (2007) demostraron que Spd aumentaba la salida de K+.
6.1.4 Canales Aniónicos
Para el balance eléctrico y evaluación del componente osmótico del estrés salino es necesario
tomar en cuenta las corrientes aniónicas, estas en conjunto con los canales catiónicos pueden
mediar una perdida neutra y masiva de solutos intracelulares, K+ + aniones. Zepeda-Jazo
(2006) encontró que en los protoplastos de cebada se expresaba alguna corriente aniónica en
acople con una corriente catiónica, por ejemplo KORC+E-QUAC o NORC+E-IRAC, lo que
mecánicamente permite la perdida de K+ y la toma de Cl- durante una despolarización inducida
por NaCl.
51
Según el mismo autor, la adición de 1 mM Spm4+ en los canales anteriores induce la inhibición
de la corriente mediada por aniones mayormente que la mediada por cationes (Fig. 15).
6.2 Canales Iónicos del Tonoplasto Regulados por Poliaminas
6.2.1 Canal SV
Figura 16. Bloqueo no monotónico del canal vacuolar SV por espermina citosólica. (1) A potencial negativo
(citosol menos vacuola) la afinidad de unión de Spm con el poro del canal SV es baja y el canal no se bloquea la
mayoría del tiempo, con la corriente promedio cerca del control (la corriente relativa es cercana a 1). (2)
aplicando potenciales positivos desde el lado citosólico se empuja a Spm a que entre al poro, aumentando la
potencia del bloqueo. (3) A potenciales más positivos Spm es forzada a atravesar el poro, sin bloquear el canal.
Experimentos posteriores con diferentes bloqueadores y cationes permeables dan una aproximación del calibre
del canal SV que es ~0.7 nm. Esto significa que el canal SV es capaz de transportar PAs en su configuración
extendida en y desde la vacuola, mientras que la velocidad de transporte es lenta comparada con la mayoría de los
cationes permeables debido a que las PAs se unen fuertemente con el poro del canal (Zepeda-Jazo et al., 2008).
Las PAs actúan como bloqueadoras de poro del canal SV (Fig. 15 y 16), compitiendo con el
transporte de K+. Este bloqueo es dependiente de voltaje y del lado de aplicación de las PAs.
Las constantes de disociación (Kd) fueron 150-300 µM, 30-70 µM y 2-10 mM para Spm, Spd
52
y Put respectivamente (Dobrovinskaya et al., 1999a,b). La inhibición de cualquier canal
vacuolar es benéfico para la planta en condiciones de salinidad.
6.2.2 Canal FV
El canal FV (canal vacuolar rápido) es modulado por Ca2+ vacuolar y es una ruta que permite
el libre paso de cationes monovalentes desde el citosol a la vacuola, como el Na+ en el caso de
la salinidad (Brüggemann et al., 1999). El canal FV es inhibido por PAs (Fig. 15) de manera
independiente del voltaje probado en vacuolas de raíz de betabel y mesófilo de cebada. Desde
el lado citosólico, las PAs con mayor carga inhiben con más potencia al canal Spm4+ > Spd3+
>> Put2+. La Kd para Spm fue de 3-10 µM y para Spd 100 µM, lo que implica que el canal FV
es inhibido fuertemente por estas PA en cualquier condición fisiológica, ya que esa
concentración micromolar es normal para estas PAs. Por el contrario la Kd para Put fue de 5
mM, que es la cantidad máxima encontrada para esta diamina en plantas (Dobrovinskaya et
al., 1999b; Brüggemann et al., 1998).
6.2.3 Canal VK
Los canales SV y FV no discriminan bien entre K+ y Na+, el único que es selectivo a K+ es el
canal VK que se encuentra en gran medida en la membrana vacuolar de células guarda (Allen
et al., 1998).
El canal VK de tabaco NtTPK1 fue parcialmente inhibido por Spm y Spd (Fig. 15), con una
Kd de 1-2 mM, mientras que 0.5 mM Put no provoco ningún cambio en la conductancia de
VK (Hamamoto et al., 2008).
El canal VK permite tanto la salida, como la entrada de K+, el cual ante salinidad se encuentra
en el citosol en menor cantidad de lo normal, así las PAs al inhibir al canal VK no permite la
compartimentalización en la vacuola de K+ necesario más en el citosol.
6.3 Bombas de Protones Reguladas por Poliaminas
6.3.1 H+-ATPasa de la Membrana Plasmática
53
La Spm activa a la H+-ATPasa-MP y se ha probado que un aumento en la actividad de la
bomba disminuye la fuga de K+ mediada por NaCl debido a un mejor control del potencial de
membrana (Roy et al., 2005; Garufi et al., 2007; Chen et al., 2007). El gradiente de protones
generado por la bomba ayuda a la expulsión del Na+ por el antitransportador Na+/H+ de la MP.
6.3.1.1 Regulación de la H+-ATPasa-MP por proteínas 14-3-3
Las proteínas 14-3-3 son llamadas así por su patrón electroforético y cromatográfico
analizado. Hay siete genes que codifican para estas proteínas en la mayoría de los mamíferos y
de 13-15 en las plantas superiores, estas proteínas aparecen en su mayoría como dímeros. Los
eucariontes pueden tolerar la pérdida de una isoforma de 14-3-3 si múltiples isoformas están
presentes, sin embargo, la delección de todas las 14-3-3 en levadura, resulta en la muerte. Las
proteínas 14-3-3 contienen un número de dominios de modificación comunes, incluyen
regiones para la interacción de cationes divalentes, fosforilación y acetilación, ruptura
proteolítica, entre otros.
En plantas, las proteínas 14-3-3 inhiben o activan a sus proteínas blanco, inhiben a la nitrato
reductasa y activan a la sucrosa fosfato sintetasa, glutamina sintetasa, pero la interacción
mejor estudiada en la MP es con la H+-ATPasa.
La H+-ATPasa-MP casi siempre se encuentra como dímero y en el estado inactivo, los
dominios C terminal atraviesan las bombas antiparalelamente bloqueando la entrada de
protones y de ATP. La activación de la bomba por las proteínas 14-3-3 normalmente requiere
la fosforilación del residuo treonina 947 del modo III (Tyr 946-Thr-Val) del C-terminal
(Fuglsang et al., 1999, 2003), regulado por la PKA (Sussman, 1994) y esta fosforilación
permite la unión de 14-3-3, después la enzima oligomeriza y se convierte de dímero a
hexámero, que es caracterizado por ser una enzima mucho más activa. El complejo final es un
dodecamero, con tres dímeros de 14-3-3 localizados encima del hexámero de bombas, las 14-
3-3 coordinan a seis dominios autoinhibitorios constituyendo una enzima activa (Duby y
Boutry, 2008; Ottmann et al., 2007; Maudoux et al., 2000; Oecking et al., 1997; Gong et al.,
2006; Kanczewska et al., 2005).
54
El Mg2+ se requiere para la hidrolisis del ATP de la bomba y se sugiere que se coordina con el
Asp588 y Asp592 (Axelsen y Palmgren, 1998) entre los dominios N y P.
Seguida de la fosforilación de la bomba, esta tiene mayor afinidad por las proteínas 14-3-3.
Sin embargo, las PAs pueden asociarse fuertemente a las 14-3-3 y este complejo a la bomba
sin fosforilación y sin cationes divalentes (Fig. 17) (Oecking, 1997), aunque con Mg2+ y Spm
la asociación es aditiva (Garufi et al., 2007). El asa 8 (residuos 208-219) del C-terminal de la
proteína 14-3-3 forma un sitio de unión para policationes, que contiene cinco residuos ácidos,
así como siete residuos con oxigeno que pueden participar en la coordinación de cationes,
donde los sitios de unión para Mg2+ y PAs es idéntico o se sobrelapa (Athwall y Huber, 2002).
6.3.1.2 Regulación de la H+-ATPasa-MP por Poliaminas y Proteínas 14-3-3
Garufi et al. (2007) reportaron que solo Spm y no Spd o Put afectan la actividad ATPasa de la
bomba, con una estimulación media máxima (S50) de hidrólisis de ATP con 70µM Spm,
mientras que Reggiani et al. mostraron que 3-5 mM Put fue igualmente eficiente.
La concentración µM de Spm sugiere una relevancia fisiológica e indica que al menos dos
aminas primarias y una secundaria se requieren para una eficiente interacción. El
requerimiento de grupos amino cargados sugiere que hay interacciones electrostáticas y
formación de puentes de hidrogeno entre las PAs y las proteínas 14-3-3 (Athwall y Huber,
2002).
El efecto de Spm en la bomba es análogo al efecto que produce fusicoccina (FC), una toxina
del hongo Fusicoccum amygdale, el cual se une a proteínas 14-3-3 e induce una activación
irreversible de la bomba, abriendo el estoma y permitiendo la entrada del hongo y por
consiguiente la infección de la planta (Fuglsang et al., 1999).
Se ha propuesto una relación 1:1 entre la hidrólisis del ATP y el transporte de H+, pero cuando
se elimina por proteólisis el C-terminal de la bomba, se ha visto que el bombeo de H+ es
estimulado en mayor grado que la hidrólisis del ATP. Las PAs mediante la unión con
proteínas 14-3-3 permite el aumento en la hidrólisis del ATP, pero no se ha demostrado si
aumentan proporcionalmente el bombeo de H+.
55
Figura 17. Activación de las H+-ATPasa-MP por espermina y proteínas 14-3-3. Unión de espermina a la proteína
dímerica 14-3-3, este complejo interacciona con el modo III del C-terminal de una H+-ATPasa-MP, esto resulta
en la abolición de los contactos intermoleculares entre los C-terminales del dímero de bombas. Al liberarse las C-
terminales, queda libre el paso para los protones en el dominio M (E1) y para el ATP que provoca la fosforilación
en el dominio P (E1-P). Después de la fosforilación se entra al estado E2-P y el sitio de los protones es accesible
al lado del apoplasto, en esta conformación no se puede dar la fosforilación y el protón pierde afinidad a su sitio
de unión, por lo que los protones son expulsados al apoplasto. La hidrólisis del residuo aspartato fosforilado en el
sitio P de la bomba, induce al estado E2 y la proteína está lista para un nuevo ciclo de bombeo (Zepeda-Jazo et
al., 2008).
6.3.2 H+-ATPasa del Tonoplasto
Las PAs al estimular la actividad fosfohidrolítica de las bombas H+-ATPasa y H+-PPasa del
tonoplasto, generan el gradiente de protones que sirve como energía necesaria para la
compartimentalización del Na+ en la vacuola vía el antiportador NHX (Na+/H+) del tonoplasto,
56
ayudando así las PAs a la tolerancia al estrés salino (Liu et al., 2006; Zhao et al., 2004; Zhao y
Qin, 2004). Sin embargo, Tang y Newton (2005) reportaron que la actividad de la V-ATPasa
isolada de la fracción microsomal de Pinus virgina fue inhibida por PAs in vivo. Esto puede
ser debido a que los experimentos fueron diferentes tanto en materiales y condiciones.
CONCLUSIÓN
Hay un universo bajo nuestros pies, el suelo alberga varios microorganismos y nutrientes
necesarios para que las plantas vivan, pero la erosión y la mala actividad humana está
salinizándolo, afectando el crecimiento y desarrollo de las plantas y la productividad en el
caso de los cultivos agrícolas. La salinidad provoca estrés iónico, osmótico-hídrico,
nutrimental y oxidativo en plantas.
A nivel celular ante NaCl se provoca una masiva entrada de Na+ y Ca2+ y una salida de K+. A
nivel de la MP los principales responsables del masivo influjo de Na+ y Ca2+ a la célula son los
NSCC, que no discrimina entre Na+, K+ y Ca2+. Los NSCC y KOR median el eflujo de K+. La
alta [Ca2+]cit produce estrés oxidativo al activar a la NADH oxidasa, fuente para la producción
de ERO en el apoplasto (O2·-, H2O2 y HO·). El HO· pueden activar al menos dos tipos de
NSCC en la MP, aunque en altas concentraciones puede inducir al estrés oxidativo y a la
peroxidación lipídica, para finalmente provocar la muerte celular. Los cloroplastos,
mitocondrias y peroxisomas son organelos que ante salinidad también se ven afectados y
causan la sobreproducción de ERO en el citoplasma.
La homeostasis K+/Na+ citosólica es crucial para el metabolismo celular y es considerada un
componente clave de la tolerancia a la salinidad en las plantas, los mecanismos llevados a
cabo para la resistencia ante NaCl se enfocan en disminuir la [Na+]cit inhibiendo su entrada al
citoplasma, promoviendo su expulsión al apoplasto y su compartimentalización en la vacuola,
así como en aumentar la [K+]cit.
Una de las primeras respuestas fisiológicas en las plantas ante la pérdida de la turgencia, es el
aumento en la síntesis y redistribución de la fitohormona, acido abscísico (ABA). El modelo
celular más estudiado para la señalización por ABA es el movimiento del estoma, flanqueado
por dos células guarda. Durante la transpiración, donde los estomas están abiertos, se permite
57
la perdida de ~95% de agua de las células guarda y la entrada de CO2 para la fotosíntesis. Se
ha propuesto que el Ca2+ y el H2O2 citoplasmáticos son inducidos por la señal de ABA y que
participan como molécula de señalización induciendo el eflujo sostenido de aniones y K+
necesarios para el cierre estomático.
Como vimos anteriormente los canales de K+ y los NSCC son esenciales en la respuesta de
plantas ante el estrés salino. En células animales, las PAs naturales que son policationes a pH
fisiológico, modulan casi todos los tipos de canales catiónicos, incluso los canales de K+. Ante
salinidad se aumentan las concentraciones de PAs libres (Put2+, Spd3+ y Spm4+) y ayudan a la
resistencia de la planta, aunque los mecanismos precisos aun están desconocidos. Las hipótesis
que existen son que las PAs estabilizan todas las superficies polianionicas (membranas, ácidos
nucleicos) y son atrapadoras de las ERO. Aun menos se sabe acerca de la modulación del
transporte iónico en plantas por PAs. Por lo que nos enfocamos en investigar como las ERO y
PAs, modulan el transporte iónico y su impacto sobre la tolerancia a la salinidad.
Los resultados fragmentarios sobre la modulación de PAs en el transporte iónico en plantas
superiores, son los siguientes:
En la vacuola las PAs a concentraciones bajas (µM) inhiben directamente a los canales NSCC
(SV y FV) y casi no afectan a los canales VK, ayudando así a mantener la
compartimentalización del Na+. En la MP el efecto de PAs sobre los transportadores iónicos
necesita mayores concentraciones de PAs y parece ser más indirecto, mediado por proteínas
14-3-3, fosfatasas, fosfoinosítidos, GMPc o CaM. Las PAs inhiben a un tipo de NSCC
disminuyendo la [Na+]cit y [Ca2+]cit, la disminución de en la concentración de estos cationes
impide la despolarización de la membrana, necesaria para la activación de canales KOR y
NSCC-DA. Spm activa a las H+-ATPasas de la MP y vacuolar, las cuales generan el gradiente
de protones, que sirve como fuente de energía para el exporte de Na+ por el antiportador
Na+/H+ de la MP y para la compartimentalización del Na+ en la vacuola por el antiportador
Na+/H+ del tonoplasto. Las PAs inhiben la apertura de estomas, inhibiendo a los canales KIR,
aliviando el estrés hídrico provocado por el estrés salino. Aunque uno de los metabolitos en la
degradación de las PAs es el H2O2, parece que prevalece su carácter antioxidante.
Otra característica común en condiciones de salinidad en la planta es la sobreproducción de
ERO. El H2O2 inhibe al canal SV. Las ERO activando a NSCC en raíz median la entrada de
Ca2+ esencial para el crecimiento y elongación celular que ante salinidad se ve afectado. El
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H2O2 actúa como segundo mensajero en la vía de señalización por ABA para el cierre de
estomas, activando a los NSCC que median la entrada de Ca2+. Las ERO también pueden
estabilizar el RNAm del antiportador Na+/H+ de la MP.
A pesar de la considerable información que se ha venido acumulando en los últimos años
sobre el efecto de PAs y ERO aún se desconocen y hay controversias en los mecanismos de
acción y sobre su impacto en el transporte y homeostasis iónica.
PERSPECTIVAS
No se sabe con certeza si las ERO participan como moléculas de señalización y si
efectivamente brindan tolerancia a la salinidad. Los datos sugieren que los efectos de ERO y
PAs sobre los canales iónicos de la MP dependen del tipo celular. Para ningún modelo celular
se ha probado la modulación de PAs y ERO en todo el repertorio de canales existentes, con
esto se conseguiría entender las características integrales, como potencial de membrana,
capacidad y selectividad del transporte membranal y las relaciones iónicas intracelulares. No
se han hecho trabajos para investigar los efectos simultáneos de PAs y ERO, en particular los
efectos de PAs sobre los NSCC activados por ERO. Estos canales solo se han caracterizado
por sus características electrofisiológicas y por el uso de farmacología, pero hasta ahora no se
conocen bloqueadores específicos para NSCC. Pero aun no se han descubierto los genes que
los codifican, pese que los posibles candidatos pueden encontrarse dentro de las familias GluR
y CNG. La identificación de productos de estos genes sería crucial para corroborar los
mecanismos que hasta ahora se han planteado con los diferentes tipos de NSCC-MP ante
estrés salino. El Ca2+ vimos que ayuda a la expresión de moléculas antioxidantes vía la
cascada de las MAPK, pero las ERO al activar a NSCC median más entrada de Ca2+ pudiendo
causar la muerte celular. Las bases moleculares y fisiológicas por las cuales las células eligen
una u otra alternativa aun no se conocen.
Hasta ahora tampoco se han identificado transportadores para PAs en plantas, y poco se sabe
acerca de la distribución de éstas moléculas ente los diferentes compartimentos celulares y
tejidos de la planta, ni el cambio en la distribución ante un estado alterado de la planta. Estos
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son datos necesarios para tener un exacto control sobre los niveles de PAs en plantas no-
modificadas y transgénicas, diseñadas para resistir el estrés.
Siendo la vacuola, el organelo que ocupa mas lugar en las células vegetales, falta indagar
acerca de sus antioxidantes y sistemas del transporte iónico y de PAs, podríamos llevarnos
grandes sorpresas.
Ante estrés aumentan los niveles de varias moléculas, este cambio se debe a la activación de
varios genes que responden al estrés, RD (responde a la deshidratación), ABRE (elementos
responsivos de ABA), COR (responsivo al frío), LEA (embriogénesis tardía abundante) y a los
responsables del metabolismo de las PAs y AJ, así como se incrementan los niveles de ERO,
fosfoinosítidos, GMPc, entre otros. Para que sucedan tales respuestas al estrés, es necesaria la
señal del Ca2+ y/o la sobreregulación desde el núcleo vía MAPK, indicando la presencia de
entrecruzamientos entre rutas de señalización. Pero aun no se ha modelado tal ruta y no se ha
demostrado si las halófitas y las glicófitas siguen la misma ruta, o si hay diferencias
cualitativas o cuantitativas entre cada especie.
La disponibilidad del genoma completo de otras especies aparte de A. thaliana y Oryza sativa,
así como la post-genómica (saber el papel de cada gen) respondería muchas de nuestras dudas.
El Proyecto Arabidopsis 2010 pretende, que para el siguiente año, se conozca la función de los
25,900 genes identificados en la planta. Por el momento se ha experimentado sólo con 1,000
de ellos, y se sabe aproximadamente para qué pueden servir unos 14,000. Estamos a punto de
vivir en un nuevo mundo a la vez apasionante y aterrador, donde por la búsqueda necesaria de
plantas agroalimentarias mas nutritivas y de mayor rendimiento, estallaremos otra revolución
verde, pero ahora con tecnología transgénica.
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80
Universidad de Colima
Facultad de Medicina Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
MODULACIÓN DEL TRANSPORTE IÓNICO POR POLIAMINAS Y
ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO Y SU POSIBLE IMPACTO EN
LA RESPUESTA DE PLANTAS AL ESTRÉS SALINO
Tesis que para obtener el grado de Maestra en Ciencias Fisiológicas con
especialidad en Farmacología
Presenta
Ana María Velarde Buendía
Director de Tesis
Dr. Igor Pottosin
Colima, Col., Agosto de 2009
81
DEDICATORIA
A mi mamá y mi papá
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Igor Pottosin, que sin él no habría podido llevar a cabo este trabajo.
Al apoyo brindado por CONACYT porque me ha ayudado a avanzar en mi
formación profesional y en la realización de este trabajo.
82
ABREVIATURAS
ABA
Apo
Cit
ERO
HACC
H2O2
HO·
KIR
KOR
MAPK
MP
NOX
NSCC 1O2
O2·–
PA
PC
PCD
Put
RE
Spd
Spm
Ψ
Ácido abscísico
Apoplasto
Citoplasma
Especies reactivas de oxígeno
Canal de Ca2+ activado por hiperpolarización
Peróxido de hidrógeno
Radical hidroxilo
Canal de K+ rectificador entrante
Canal de K+ rectificador saliente
Proteínas quinasa activadas por mitógeno
Membrana plasmática
NADPH oxidasa
Canal catiónico no selectivo
Singlete de oxigeno
Radical superóxido
Poliaminas
Pared celular
Muerte celular programada
Putrescina
Retículo endoplásmico
Espermidina
Espermina
Potencial
83
ÍNDICE PÁGINA
RESUMEN……………………………………………………………………………………..1
ABSTRACT……………………………………………………………………………………1
INTRODUCCIÓN …………………………………………………………………………….2
CAPÍTULO 1. ESTRÉS SALINO
1.1 Problema de salinidad en suelos para agricultura…………………………………4
1.2 La salinidad produce estrés iónico, osmótico, hídrico, nutrimental y oxidativo en
11 1plantas……………………………………………………………………………..5
1.3 Estrés iónico………………………………………………………………………..5
1.3.1 Mecanismos de transporte iónico durante el estrés………………..6
1.3.2 Elementos celulares y iónicos que inducen tolerancia ante estrés
333333salino………………………………………………………………8
1.4 Estrés osmótico e hídrico………………………………………………………...10
1.4.1 Señalización mediada por ABA y especies reactivas de oxigeno.11
1.5 Estrés nutrimental.……………… ………………………………………………14
CAPITULO 2 . ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO
2.1 Particularidades de las especies reactivas de oxigeno…………………………...15
2.2 Antioxidantes…………………………………………………………………….19
2.3 Fuentes fisiológicas de especies reactivas de oxigeno y su remoción mediante
nnnnmoléculas antioxidantes………………………………………………………….21
2.3.1
Cloroplasto………………………………………………….......................21
2.3.2
Mitocondria………………………………………………………………23
2.3.2.1 Ciclo ascorbato-
glutatión………………………………….………24
84
2.3.3...Peroxisoma…………………………………………………..………….
.25 ` ` 2.3.4 Apoplasto y
citoplasma………………..……………………………...…..26
2.4 Evaluación de las especies reactivas de oxigeno………………………………...27
2.5 Papel fisiológico de las especies reactivas de oxigeno…………………………...28
2.6 Estrés oxidativo……………………………………………………………..……29
2.6.1 Peroxidación lipídica……………………………………………..29
2.6.2 Daño oxidativo a proteínas……………………………………….31
CAPÍTULO 3. POLIAMINAS Y ESTRÉS SALINO
3.1 Propiedades químicas y funciones fisiológicas de las poliaminas……………….32
3.2 Biosíntesis y degradación de las poliaminas……………………………………..33
3.3 Impacto de poliaminas sobre la resistencia de plantas ante salinidad…………...34
CAPÍTULO 4. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL TRANSPORTE IÓNICO EN
PLANTAS
4.1 Sistemas de transporte iónico……….……………………………………………36
4.2 H+-ATPasa de la membrana plasmática…………………………………………41
4.2.1 Características de la H+-ATPasa de la membrana plasmática……41
CAPÍTULO 5. ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO COMO REGULADORAS
DEL TRANSPORTE IÓNICO ANTE ESTRÉS SALINO
5.1 Regulación de canales iónicos de la membrana plasmática por especies reactivas
6666de oxigeno………………………………………………………………………..43
5.1.1 Canales NSCC……………………………………………………43
5.1.2 Canales de K+ (KIR)…….…… ………………………………….45
5.1.3 Canales de K+ (KOR)……… …………………………………….46
85
5.2 Canales iónicos del tonoplasto regulados por especies reactivas de oxigeno……46
5.2.1 Canales SV…………………………………………………..……46
5.3 Otros canales iónicos intracelulares regulados por especies reactivas de
3333oxigeno…...………………………………………………………………………47
5.3.1 Canales BCC1…………………………………………………….47
5.4 Bombas de protones regulados por especies reactivas de oxigeno………………47
5.4.1 H+-ATPasa de la membrana plasmática………………………….47
5.4.2 Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática………………………...48
CAPÍTULO 6. POLIAMINAS COMO REGULADORAS DEL TRANSPO RTE IÓNICO
ANTE ESTRÉS SALINO
6.1 Regulación de canales iónicos de la membrana plasmática por poliaminas……..48
6.1.1 Canales NSCC tipo VIC………………………………………….48
6.1.2 Canales de K+ (KIR)……………………………………...………48
6.1.3 Canales de K+ (KOR)……………………………………………..50
6.1.4 Canales aniónicos………………………………………………...50
6.2 Canales iónicos del tonoplasto regulados por poliaminas……………………….51
6.2.1 Canales SV…………………………………………………..……51
6.2.2 Canales FV………………………………………………………..52
6.2.3 Canales VK………………………………………………………52
6.3 Bombas de protones regulados por poliaminas…………………….....................52
6.3.1 H+-ATPasa de la membrana plasmática…………………………52
6.3.1.1 Regulación de la H+-ATPasa-MP por proteínas 14-3-3……53
6.3.1.2 Regulación de la H+-ATPasa-MP por poliaminas y proteínas
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 14-3-3………………………………………………………..54
6.3.2 H+-ATPasa del tonoplasto…………………………...……….….55
CONCLUSIÓN………………………………………………………………………………56
PERSPECTIVAS…………………………………………………………………………….58
BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………………...…...60
86
LISTA DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1 Particularidades de las especies reactivas de oxigeno……………………………...17
Tabla 2 Tiempo de vida media y origen de las especies reactivas de oxigeno……………...18
Tabla 3 Particularidades y localización de los agentes antioxidantes (ácido ascórbico,
666666666AOX, APX, carotenoide, CAT, DHAR, Fd, GPX, GR, MDAR, PrxR, PX, SOD,
222222222Trx y α-tocoferol)………………………………………………………………….19
Tabla 4 Poliaminas y especies reactivas de oxigeno como reguladoras del transporte iónico -------------en plantas…………………………………………………………………………..38
LISTA DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1 Modelo que explica los efectos iónicos y celulares implicados en el estrés salino en
66666666 las plantas, así como los mecanismos que median la tolerancia…………………...7
Figura 2 Modelo de la señalización mediada por ABA y especies reactivas de oxigeno ante
66666666 6estrés por deshidratación causado por la salinidad y los mecanismos de defensa
66666666 6activados en la célula…………………….……………………………………….13
Figura 3 Generación de diferentes especies reactivas de oxigeno (ERO).…………………16
Figura 4 Fotosíntesis con la concomitante generación de ERO y la participación de sus
666666666 antioxidantes…………………………………………………………………...…22
Figura 5 Cadena de transporte electrónico en la respiración mitocondrial como la responsable
000000000 en la generación de ERO y la participación de sus antioxidantes…………...……23
Figura 6 Producción de ERO en los peroxisomas y su remoción…..………………………25
Figura 7 Diagrama esquemático de la NADH oxidasa vegetal…………………………….26
Figura 8 Pasos de la peroxidación lipídica…………………………………………………30
Figura 9 Modificación de proteínas por ERO, peroxidación lipídica y reparación por
333333333 antioxidantes………………………………………………………………..……31
Figura 10 Biosíntesis y degradación de poliaminas………………………………….…..…33
Figura 11 Transporte de Na+ a través de la membrana plasmática…………………………..36
87
Figura 12 Transporte de Na+ a través del tonoplasto……………………………………...…37
Figura 13 Dominios de la bomba H+-ATPasa de la membrana plasmática………………….42
Figura 14 Especies reactivas de oxigeno como reguladoras del transporte iónico en plantas.43
Figura 15 Poliaminas como reguladoras del transporte iónico en plantas…………………...49
Figura 16 Bloqueo no monotónico del canal vacuolar SV por espermina citosólica……..…52
Figura 17 Activación de las H+-ATPasa-MP por espermina y proteínas 14-3-3…………….54