INSTITUTO TECNOLOGICO DE ORIZABALABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA No. 10 FERMENTACIÓN ACÉTICA

I OBJETIVO

A partir del producto obtenido en la fermentación alcohólica, el alumno trabajará con organismos del género Acetobacter y Gluconobacterpara llevar a cabo la fermentación acética y obtener vinagre como producto principal.

II FUNDAMENTOLa producción de vinagre implica una fermentación anaeróbica inicial para convertir los carbohidratos a alcohol por Saccharomyces cerevisiae, seguida por una transformación oxidativa secundaria del alcohol a ácido acético por acetobacter y gluconobacter.Puede definirse al vinagre como el condimento hecho a partir de sustancias azucaradaso feculentas, por fermentación de azúcar, seguida de la acética. La palabra vinagre deriva del francés vinagre, que literalmente significa vino agrio. La composición del vinagre depende en parte de la naturaleza de la materia prima fermentada y también de las condiciones de fabricación, conservación y maduración. Ninguna de las dos etapas es completa , por lo que de la primera escapan pequeñas cantidades de azúcar y de la segunda, pequeñas cantidades de etanol. Las bacterias del ácido acético, aerobias, son un grupo interesante de eubacteria anaeobia acetogénica. Las bacterias aerobias del ácido acético difieren de la mayor parte de aerobios en que no oxidan por completo sus fuentes de energía hasta CO2 y agua

Generación de ATP O2

NAD+ NADH NAD + NADH

CH3CH2OH → CH3COH → CH3COOH Etanol Acetaldehido Ácido acético

Fig. 11.1 Oxidación de etano a ácido cítrico

Así cuando se les proporciona alcohol etílico, lo oxidan solamente hasta ácido acético el cual se acumula en el medio. Las bacterias del ácido acético son

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bastante tolerantes a los ácidos y no se mueren por la acidez que producen. Hay una gran demanda de oxígeno durante el crecimiento y el problema principal en la producción de vinagre es asegurar una aireación.

Se puede usar una gran variedad de materias primas como fuentes de carbohidratos pueden ser de frutas como uvas, naranjas, manzanas, peras, vegetales como patatas, cereales como: cebada, centeno, trigo, maíz, jarabe de glucosa de almidón sacarificado, sacarosa de niveles diferentes de pureza, jarabe de caña de azúcar con dos terceras partes de sacarosa convertida en azúcar invertido, melazas de azúcar de caña, melazas de azúcar de remolacha, miel de abejas y jarabe maple.

La manufactura del vinagre requiere de dos procesos de fermentación .El primero transforma el azúcar en alcohol por levaduras y el segundo cuando del líquido que contienen el alcohol se acidifica, debido a que las bacterias oxidan el alcohol, convirtiéndolo en ácido acético . Ninguna de las dos etapas es completa, por lo que de la primera escapan pequeñas cantidades de azúcar y de la segunda, cantidades de etanol

La formación de ácido acético resulta de la oxidación del alcohol por la bacteria del vinagre en presencia del oxígeno del aire. La bacteria acetobacter aceti a diferencia de las levaduras productoras de alcohol, requiere un suministro generoso de oxígeno para su crecimiento y actividad. El cambio que ocurre es descrito generalmente por la ecuación:

C 2 H 5 0H + O 2 + Acetobacter aceti = Ácido acético + agua

El número de bacterias acéticas usualmente presente en el jugo fermentado es pequeño, y a menudo son del tipo indeseable o inactivo. Por lo tanto debe ser añadido un iniciador adecuado para suministrar la clase apropiada de bacterias y producir las condiciones favorables para su crecimiento y actividad. El mejor medio para prevenir el crecimiento de organismos indeseables es añadir vinagre fuerte, no pasteurizado al jugo fermentado después que se ha complementado la fermentación alcohólica.

La bacteria del vinagre crece en el líquido y en la superficie expuesta al aire. Ellas puede formar una película lisa, grisácea, brillante, gelatinosa. La película no siempre se forma, algunas clases de organismos crecen solamente en el líquido y no en la superficie. La rapidez de transformación de alcohol a ácido acético depende de la actividad del organismo, la cantidad de alcohol presente, la temperatura y la cantidad de superficie expuesta por unidad de volumen.

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En el vinagre se encuentran también otros constituyentes menores del jugo de la fruta o el líquido fermentado, así como también productos de las reacciones secundarias. Algunas de estas sustancias son: Ácidos distintos del acético, azúcares, cenizas, P2O5, etc. Además del ácido acético, el vinagre contiene ácido málico, fórmico y tartárico principalmente. Los constituyentes minerales no se pierden a causa de las fermentaciones.

Para todos los tipos de vinagre se requiere un 4% de ácido acético. El límite mínimo de sólidos permitidos legalmente en vinagre es de 1.6%. en la moderna fabricación de vinagre hay que considerar especialmente los siguientes factores: Selección del microorganismo Naturaleza de la materia prima Concentración de esta, así como del vinagre añadido al principio para

acidificarlo Cantidad de oxígeno suministrado. Naturaleza del medio de fermentación Temperatura, etc.

Teóricamente, la fermentación de levadura produce una cantidad de alcohol igual a la mitad de la cantidad de azúcar fermentada. De la misma manera, la conversión teórica del alcohol en ácido acético deberá rendir menor cantidad de ácido acético que la cantidad de alcohol del sustrato. Parte del alcohol es utilizado por la bacteria y otra parte se pierde por evaporación. Puesto que la conversión de etanol a ácido acético no es más que un proceso de oxidación o bien una deshidrogenación en la que el oxígeno actúa como aceptor de hidrógeno, el éxito de la fermentación dependerá en gran parte de la presencia de cantidades suficientes de oxígeno.

El grupo de bacterias acéticas se caracteriza por el intervalo tan limitado de temperaturas en que actúan. Para temperaturas debajo de 12 a 15 °C se desarrollan lentamente y las células son cortas pero extraordinariamente anchas. De 15 a34 °C parecen desarrollarse en lo que podríamos llamar normal creciendo rápidamente y desplegando cadenas de células de distintos números de unidades. A temperaturas mayores se han observado unos filamentos largos como hebras. En general la temperatura exacta depende tanto del organismo como del tipo de proceso.

Antes de envasar el vinagre debe permitirse que se verifique completamente la fermentación para que tenga máxima fuerza. Durante la maduración se mejora el aroma y la limpidez especialmente en los vinagres hechos de vino. Aunque algunos vinagres pueden envasarse sin tratamientos, la mayor parte requieren una clarificación previa.

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GENERALIDADES:

La fermentación acética es la fermentación bacteriana por Acetobacter, un género de bacterias aeróbicas, que transforma el alcohol etílico en ácido acético, la sustancia característica del vinagre. []La fermentación acética del vino proporciona el vinagre debido a un exceso de oxígeno y es uno de los fallos del vino, un proceso que degrada sus cualidades. La fermentación acética es un área de estudio dentro de la cimología.

Aunque es una fermentación en el sentido original de la palabra, un proceso que partiendo de un azúcar produce ácidos, gases o alcohol, se aparta de la regla en que es un proceso aerobio, es decir, que requiere oxigeno.

Estrictamente hablando la fermentación acética no es una fermentación, sino que metabólicamente es una oxidación y las fermentaciones, tanto la alcohólica como la láctica, se caracterizan por llevarse a cabo en condiciones de anabolia o al menos de baja presión parcial de oxígeno.

El sustrato de la fermentación acética es el alcohol etílico, presente en el vino o la sidra. Sin embargo, también se encuentra de forma natural en frutas y flores, que emplean la volatilidad de este compuesto para atraer a sus polinizadores o dispersores del fruto. La transformación del alcohol etílico en ácido acético se lleva a cabo en la bacteria mediante una cadena de 3 enzimas. Estequiometricamente hablando estas bacterias son capaces de producir un mol de ácido acético por cada mol de etanol presente en el medio, por lo que su eficiencia es enorme.

El primer enzima, llamado alcohol deshidrogenasa tiene como sustrato el alcohol etílico y lo transforma en acetaldehido. Durante este paso del metabolismo del etanol se elimina un hidrógeno del etanol que pasa a reducir al NAD, una molécula de almacenamiento de energía. De esta manera el alcohol, al perder un hidrógeno se oxida, es decir, el balance oxígeno/ hidrógeno de la molécula tiende al oxígeno. En este proceso el NAD queda reducido a NADH. Este paso supone una “vuelta atrás” pues el paso de acetaldehído a etanol forma parte de la fermentación etílica que llevan a cabo otras bacterias.

En el segundo paso del metabolismo el acetaldehido es hidratado. Para ello la bacteria emplea una molécula de agua H2O. Convirtiendo el acetaldehido en acetaldehído hidrato.

Finalmente el tercer paso para la obtención de ácido acético es una segunda oxidación ésta se lleva a cabo mediante la enzima acetaldehído deshidrogenasa que libera otra molécula de hidrógeno que será captada por otro NAD y producirá una molécula de ácido acético.

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El oxígeno, que hemos dicho que era esencial para que las bacterias llevaran a cabo la fermentación del etanol. Las moléculas de NADH que se han formado en el primer y tercer paso de este proceso irán a la respiración celular, que es necesaria para el crecimiento de la célula. Para la degradación de estas moléculas, para obtener la energía que almacenan, la bacteria las oxidará, mediante el uso del oxígeno. Sin el oxígeno las moléculas quedarían en su forma reducida NADH y la transformación del etanol no podría llevarse a cabo. Puedes leer más sobre las reacciones REDOX, que es como se denominan las reacciones de reducción y oxidación.

III MATERIALES Y MÉTODO

MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOSFermentador Agua destiladaMatraces Erlenmeyer FenolftaleínaProbeta NaOH 0.1 NAreómetro universal Fehling A y BPotenciómetro Fermentación alcohólica

1V DESARROLLO EXPERIMENTAL

TÉCNICA

1 Verter aproximadamente de 100 a 200 ml de un vino comercial en un recipiente de superficie amplia y dejarlos a la interperie para que se desarrollen colonias de acetobacter en la superficie (nata blanca de la superficie).

2 El acetobacter obtenido del medio ambiente lo propagamos en tubos de ensaye con jugo estéril, o bien con jugo obtenido de la fermentación alcohólica.

3 Dejar en incubación de 24 a 48 horas en la estufa de cultivo o a temperatura ambiente.

4 Hacer un frotis y observar al microscopio para comprobar la presencia de bacterias acetobacter.

5 Con el microorganismo aislado y propagado se inocula al fermentador , que ya contiene el mosto. Airear y homogenizar .

6 Realizar determinaciones cada 12 horas de :Temperatura y pH, acidez total, grado alcohólico, densidad .

7 Dar por concluida la fermentación acética cuando el ácido acético presente un valor de 3 a 4 %

8 Envasar y etiquetar.

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Nota. Si se trabaja con melaza se efectúa una destilación para hacer la prueba de grado alcohólico (alcoholímetro). Los grados G.L disminuyen conforme avanza el proceso. físicamente el olor a alcohol desaparece gradualmente para dar olor al vinagre. Al determinar la densidad, se puede estimar la cantidad de alcohol que se ha consumido. La densidad se calcula pesando un volumen de muestra medido con exactitud (matraz aforado, empleando la formula d = m/ v. La masa de la alícuota es la diferencia del matraz aforado con muestra menos la tara del mismo. Con el valor obtenido se va a las tablas.

DATOS Y CÁLCULOSFERMENTACIÓN ACÉTICAFECHA HORA p H TEMP. ACIDEZ

TOTAL

09-11-15 mañana 4 26 5

09-11-15 Tarde 4 25 5

10-11-15 mañana 4 26 4.4

10-11-15 Tarde 4 25 4.4

11-11-15 mañana 4 25 4.3

12-11-15 mañana 3.5 26 4.3

13-11-15 mañana 3.5 26 4.6

13-11-15 Tarde 3.4 25 4.4

14-11-15 Mañana 3.3 24 4.8

16-11-15 Mañana 3.3 26 4.8

16-11-15 Tarde 3.1 26 5.1

17-11-15 Mañana 3.1 24 5.3

18-11-15 Mañana 3.1 26 5.7

18-11-15 tarde 3.0 25 6.3

19-11-15 mañana 3.0 26 6.5

20-11-15 Mañana 3.0 26 6.9

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21-11-15 Mañana 3.0 25 7.3

23-11-15 Mañana 2.9 24 7.5

24-11-15 Mañana 2.9 26 7.7

24-11-15 Tarde 2.7 26 8.1

25-11-15 Mañana 2.7 25 8.5

25-11-15 Mañana 2.7 26 9.3

26-11-15 Mañana 2.7 24 9.7

26-11-15 Tarde 2.5 26 10.2

27-11-15 Mañana 2.4 24 10.5

27-11-15 Tarde 2.4 25 11

% Azúcares c/ glucosa = Cte. De azúcar utilizado en la titulación (glucosa) p (ml gastados) (Factor de Fehling)

Cte de azúcar = 0.05753Factor Fehling = 0.6392P = 1.030

% de Acidez = ml de NaOH (meq ácido) (100) ml de muestrameq. = 0.060

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425260

0.51

1.52

2.53

3.54

4.5

ph del vinagre

Series1

Axis Title

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2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.20

5

10

15

acidez vs ph

ph

acid

es

V CUESTIONARIO

1. Cual es el fundamento de la producción del vinagre?La producción de alcohol y vinagre se realiza mediante técnicas biotecnológicas que han sido utilizadas por la humanidad desde hace más de 6 .000 años. La producción de vinagre representa un procedimiento biotecnológico moderno en el que el elemento principal es la construcción de un fermentador o biorreactor que trabaja alimentando vino de forma continua. En el proceso intervienen bacterias, fundamentalmente del género Acetobacter, las cuales llevan a cabo la oxidación del etanol a ácido acético.

2. Como se puede definir el vinagre y de que depende su composición .El vinagre se define como el líquido apto para el consumo obtenido por doble fermentación. La variedad de materias primas para la obtención de vinagres es muy amplia, desde subproductos o excedentes agrícolas hasta sustratos de gran calidad para los vinagres más exclusivos y apreciados como el vinagre de Jerez. Esta norma de calidad define hasta diez tipos de vinagres, entre los que se incluyen, el vinagre de vino, frutas, sidra, alcohol, cereales, malta, malta destilado, balsámico (con adición de mosto de uva), balsámico de sidra y un apartado de otros vinagres en el que cabe cualquier otro sustrato de origen agrícola como puede ser la miel o el arroz. Sin duda, el vinagre de vino es el más característico en los países mediterráneos, aunque las nuevas tendencias gastronómicas han tendido a ampliar considerablemente la oferta en los últimos años.

3. Cual sería la ecuación de la oxidacción de etanol a acido-acético.

4. En que se basa el método sumergido para la producción del vinagreLas ventajas de la obtención de vinagre en acetificadores sin relleno, en cultivo sumergido, son muchas. Son más altos los rendimientos de la transformación del alcohol en acético (hasta el 94 %), mayor la velocidad a que se desarrolla el proceso (25-30 horas) así como la uniformidad del producto y sobre todo, se puede lograr la acetificación de iguales volúmenes de alcohol en mucho menor volumen de instalación, con el consiguiente ahorro de espacio, pudiendo trabajar con dispositivos automáticos que no sólo regulen el control de la temperatura y de la aireación, sino también los ciclos de carga y descarga.

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5. Que relación presenta la proporción de alcohol a ácido acético

El vinagre contiene una concentración que va del 3% al 5% de ácido acético

VI DIUJOS Y ESQUEMAS

VIII CONCLUSIONES:

IX BIBLIOGRAFÍA

Atlas Ronald M Microbiología , 1990, Editorial Continental .S. A. de C.V. MéxicoBadui Dergal Salvador Química de los Alimentos ,1997 Editorial. Alambra Mexicana , México D.FFellows P Tecnología del Procesado de los Alimentos ,1994 Editorial Acribia S.A Zaragoza EspañaFox A.Brian Nutrición y Salud, 2002 Editorial Limusa México D.FHelen CharleyTecnología de los alimentos , 1995 Editorial Limusa, México D:F:Holdsworth,S.D. Conservas de frutas y Hortalizas Editorial Acribia , S.A.Desrosier , Norma W. Conservación de los alimentos , 1991 Editorial CECSA. México D:F.Potterr Norman La ciencia de los alimentos , 1997 Editorial Edutex, S.A