Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287)

Název ústavu: Ústav hygieny a technologie mléka

Název předmětu: H2HM1 Technologie mléka a mléčných výrobků

Ročník a fakulta: 2. ročník NaMSP; Fakulta veterinární hygieny a ekologie

Číslo a název inovovaného cvičení: Využití luminometrické metody při stanovení

účinnosti sanitace v mlékárenských provozech

zdroj: 1766.cz.all.biz

ATP – bioluminiscenční metoda – teoretická část1. Úvod

BioluminiscenceBioluminiscence je emise světla u živých organismů, je výsledkem specifických biochemických reakcí. Organické a/nebo anorganické látky, které mají schopnost přeměnit absorbovanou energii ve světlo, se označují luminiscenční látky (luminofory). Bioluminiscence se vyskytuje u mnoha organismů (bakterie, houby, prvoci, láčkovci, kroužkovci, měkkýši, členovci).

Charakteristické rysy bioluminiscenčních reakcíSpolečným znakem všech bioluminiscenčních systémů je, že světlo je produkováno jako vedlejší produkt luciferázou katalyzované reakce, ve které dochází k oxidaci substrátů nazývaných luciferiny v přítomnosti kyslíku. Struktura a vlastnosti luciferázy a luciferinů se liší u jednotlivých organismů. Reakce probíhají pouze v přítomnosti kyslíku a vždy je nutná přítomnost 2 látek: luciferázy a luciferinu, dále ATP a hořečnatých iontů. Pod pojmem luciferin jsou zahrnuty látky, které mohou být substrátem pro enzym luciferázu a produkují světlo např. alkoholy, flaviny, benzothiazoly, aldehydy. Luciferiny se vyskytují v buňkách nebo v mezibuněčných prostorech některých živočichů. Při oxidaci luciferázou se uvolňuje

1

tepelné záření. Enzym luciferáza katalyzuje oxidaci specifického substrátu kyslíkem za spolupůsobení ATP a hořečnatých iontů. Oxidací se dostává molekula do excitovaného stavu, při návratu do stavu s nižší energií se uvolňuje energie ve formě světla. Pojem luciferáza je opět souhrnný název pro enzymy umožňující vznik bioluminiscence. ATP se vyskytuje ve všech organismech, je důležitým zdrojem energie pro živé buňky.

luciferin + O2 oxyluciferin + CO2 + světlo

Bioluminiscence nachází uplatnění v lékařství, v kosmickém výzkumu, v oblasti základního biologického výzkumu.

2. Využití ATP – bioluminiscenční metody v potravinářském průmyslu

V potravinářském průmyslu je při výrobě potravin monitorování hygieny v celém potravinářském závodě absolutní nutností. Pro výrobce potravin je nezbytné provádět pravidelné povinné kontroly a uchovávat záznamy o kontrolách. V současnosti se nabízejí stále nové metody, kterými je možné rychle detekovat a monitorovat hygienu technologických procesů a čistotu výrobních prostor a zařízení (účinnost sanitace).

Uplatnění bioluminiscenční metody při kontrole hygieny v potravinářských závodech je založené na měření množství ATP nacházejícího se ve všech živých buňkách nebo v jejich částech a v mikroorganismech, ve kterých slouží jako zdroj energie. Množství světla uvolněné při bioluminiscenční reakci ATP (adenosintrifosfátu) se specifickými chemickými látkami je přímo úměrné množství ATP:

Mg+

luciferin + luciferáza + ATP → (luciferin-luciferáza-AMP) + pyrofosforečnan O2

(luciferin-luciferáza-AMP) → oxyluciferin + luciferáza + CO2 + AMP + světlo

Látky luciferin a enzym luciferáza použité v testu byly izolovány ze světlušek. Průběh reakce je velmi rychlý (několik sekund), množství vzniklého světla je možné objektivně kvantifikovat s pomocí citlivého přístroje – luminometru, který je schopný zachytit a změřit i velmi malé množství vznikajícího světla. Intenzita emitovaného světla se stanovuje v komoře luminometru a vyjadřuje se v relativních světelných jednotkách – RLU. RLU je přímo závislé na množství ATP ve vzorku, a tím přímo závisí na množství biologické kontaminace ve vzorku.

ATP test je třeba chápat jako TEST ZNEČIŠTĚNÍ, protože detekuje nejen mikrobiální znečištění, ale i přítomnost organické hmoty, která slouží jako substrát pro zachycení mikroorganismů, je živnou půdou pro jejich růst a zároveň i jejich ochrana před působením desinfekčních prostředků. Veškerá organická hmota (živá nebo původně živá) obsahuje ATP, a to včetně potravin, bakterií, plísní a dalších organismů. ATP test ideální metodou kontroly úspěšnosti čisticích procesů.

2

Na základě dosažených výsledků je možné ihned vyhodnotit odebraný vzorek. Velkou výhodou metody je vysoká citlivost, nezávislost na zkušenostech personálu a reprodukovatelné výsledky do 2 minut.

Výhody ATP bioluminiscenční metody:

1. Proaktivní monitorizace v reálném časeReakce mezi luciferázou a ATP je okamžitá a odečtení hodnot je otázkou několika vteřin. Tato skutečnost umožňuje provést okamžitě opravná opatření.2. SpolehlivostSystém identifikuje přítomnost biologických látek (například zbytků potravy nebo tělesnýchvýměšků) stejně jako zbytků mikrobiálních - i když nejsou na pohled viditelné. Výsledky jsouspolehlivé a poskytují objektivní hodnocení čistících metod.3. Přímé a nepřímé hodnocení rizikaVzhledem k tomu, že zkouška zjišťuje všechen přítomný biologický materiál, může prokázatnejen mikroorganizmy, ale i potencinálně rizikové oblasti, v nichž potraviny a jiné biologické zbytky mohou být zdrojem výživy mikrobů.4. Snadné použitíSystém může být snadno zařazen do denních čistících režimů.5. Jednoduché vyhodnocováníVýsledky jsou sdělovány v relativních světelných jednotkách (RLU), které mají přímý vztahk hygienickému stavu zařízení nebo pracovních povrchů. Dosažené výsledky mohou býtpřímo srovnány s předem stanovenými mezními hodnotami dostatečný- nedostatečný. Čím jehodnota RLU nižší, tím je povrch čistší.

ATP – bioluminiscenční metoda – návod do praktického cvičeníMetoda slouží k monitorování hygienické úrovně, poskytuje informace o tom, zda byl povrch vyčištěn dostatečně, nebo zda nejsou vzorky kontaminovány biologickými látkami. Metodu je možné implementovat jako rychlý hygienický monitoring podle požadavků různých průmyslových odvětví.

Principem hygienického monitorovacího systému 3M Clean-Trace je měření adenosin trifosfátu (ATP) – molekula energie přítomná v buňkách všech živočichů, rostlin, bakterií, kvasinek a plísní. Potravinové zbytky jsou rovněž bohaté na ATP a poskytují výživu k růstu mikroorganismů. Testovací zkoušky 3M jsou snadno použitelné; jednoduše odeberte vzorek, aktivujte test sloučením ATP vzorku s luciferázou, potom měřte luminometrem množství světla vyzařovaného směsí luciferázy se vzorkem - výsledkem je odhad úrovně biologického materiálu přítomného ve vzorku.

1. Popis přístrojeLuminometr 3M Clean-Trace je lehký, plně přenosný přístroj s alfanumerickým LCD displejem. Je určen k použití ve výrobě a laboratořích a lze jej dodat s přepravním pouzdrem. Je vybaven samostatnou vnitřní lithiovou baterií, sloužící k uchování informací v paměti přístroje - např. schémat testování vzorků, testovacích bodů, dat a kalibračních parametrů.  

3

Účel každého funkčního tlačítka se mění podle aktuální nabídky zobrazené na obrazovce. Jakmile zvolíte konkrétní nabídku, nová funkce tlačítek bude zobrazena ve spodní části obrazovky přímo nad příslušným tlačítkem.  

2. Zapnutí přístrojePřed zapnutím přístroje zajistěte, aby v komoře nezbyl žádný vzorek z předchozího testu. Hlavním vypínačem je červené tlačítko na přístroji. Stisknutím a přidržením luminometr spustíte. Novým stisknutím a přidržením luminometr vypnete. Po zapnutí luminometr absolvuje řadu autodiagnostických testů – úvodní změření pozadí přístroje a kontrolu kalibrace. Zobrazí přitom následující obrazovky.

Spouštění a autotest systému.

Přístroj poté bude inicializován a objeví se následující obrazovka:

4

V této chvíli lze funkci luminometru pozastavit k zaznamenání verze hardwaru a softwaru (při diagnostice poruchy). Stiskem libovolného tlačítka při zobrazení této obrazovky lze přístroj zastavit.

Čísla verzí jsou zobrazena ve spodní části obrazovky. Stiskem libovolného tlačítka můžete luminometr nechat pokračovat.

Luminometr následně provede úvodní měření pozadí a kontrolu kalibrace.

Pokud bude výsledek - pozadí přístroje a kalibrace - v povoleném rozmezí, přístroj zobrazí obrazovku napravo.

Pokud úvodní měření pozadí selže, prostudujte si pokyny k řešení potíží v bodu 9 této příručky. Stisknutím tlačítka OK zobrazíte hlavní nabídku systému.

5

Pomocí analytického softwaru 3M Clean-Trace lze nastavit heslo přístroje, aby luminometr nemohly používat neoprávněné osoby. Pokud bylo heslo nastaveno, přístroj si před měřením pozadí vyžádá číselné heslo dle předchozího obrázku.

Poté se zobrazí výzva k zadání čtyřmístného čísla hesla. Navigačními tlačítky zvolte číslice a stiskem Select je potvrďte.

Zadané číslice se zobrazují jako hvězdičky.

Pokračujte, dokud nebudou zadány všechny číslice, a poté stiskněte Select. Přístroj poté proveďte úvodní měření pozadí a poté zobrazí hlavní nabídku (Main Menu).

3. Nastavení režimu měření Luminometr 3M Clean-Trace nabízí tři metody měření vzorku.

Režim MEASURE SAMPLE (Měření vzorků) umožňuje provést libovolný počet měření, ale neukládá data k pozdějšímu použití. Pokud s luminometrem používáte i tiskárnu 3M™ Clean-Trace™, výsledky lze tisknout, dokud je luminometr umístěn v dokovací stanici a připojen k tiskárně. K použití tohoto režimu není nutné mít v PC instalován analytický software 3M Clean-Trace.

PROGRAM MODE (Programový režim) umožňuje ukládat data v luminometru a poté je přenést do počítače. K použití tohoto režimu musí být v počítači instalován analytický software 3M Clean-Trace.

Režim UNPLANNED MODE (Neplánované měření) umožňuje ukládat výsledky dodatečných, nových nebo jiných testů, které nebyly obsaženy v žádném vzorkovém schématu. K použití tohoto režimu musí být v počítači instalován analytický software 3M Clean-Trace.

6

4. Měření v režimu „measure sample”Zapněte luminometr. Po inicializaci se zobrazí hlavní nabídka (Main Menu):

Kurzor bude ukazovat na volbu MEASURE SAMPLE.

5. Odběr vzorkuClean Trace Rapid Cleanliness Test, total ATP

Stěrovky Clean Trace (UXL 100) jsou předvlhčené, určené k rychlému zjišťování úrovně vyčištění povrchů a nástrojů. Provedení testu je velice jednoduché, po dokončení stěru se pero aktivuje zamáčknutím a krátkým protřepáním. Poté se vloží do přístroje.

7

Doba testu (stěr, aktivace, změření) 40 sekundMaximální doba mezi odběrem vzorku (stěrem) a změřením

Až 4 hodiny

Potřebný materiál 1 stěrovkaPředvlhčená vatička stěru ANOPřímé měření stěrového pera ANODélka stěrového pera 115 mmŽivotnost Min. 6 měsíců (v lednici)

7 dní (při pokojové teplotě)Citlivost stěrů 1 – 2 fmolOpakovatelnost % CV 10,4 Sanitační prostředky Při normálních koncentracích nesnižují

citlivost

Postup:1. Vyjměte stěrovku z ochranné tuby.2. Otáčením stěrovky odeberte stěr z plochy 10 cm2.

3. Po odběru stěru vraťte stěrovku do ochranné tuby, ponechejte v tubě, dokud se neuskuteční měření na přístroji.4. Měření se musí provést do 4 hodin od odebrání stěru.5. Stěrovka se nesmí aktivovat – až před měřením.6. Před začátkem měření zkontrolujte pozadí přístroje. 7. Při vyšším pozadí zkontrolujte měřící komoru přístroje.8. Aktivujte Cleantrace stěrovku stlačením modrého uzávěru stěrovky. 9. Obsah stěrovky protřepejte po dobu asi 5 sekund.10. Stěrovku vložte do komory přístroje.

6. Měření vzorků Založte test do luminometru 3M Clean-Trace  Vložení testu  Otevřete dvířka

Otevřete kryt vzorkové komory posunutím pojistky vlevo. Pružina krytu povolí.  

8

Vložte testovací systém do komory. Přiklopte kryt zpět na přístroj a zatlačte, až zapadne.  

K měření vzorku stiskněte tlačítko Select. Na obrazovce se zobrazí slovo MEASURING a po pěti sekundách se objeví řada bloků, které postupně mizí, jak systém odpočítává čas. 

Na obrazovce se poté zobrazí výsledek v relativních světelných jednotkách (RLU).

K měření dalšího vzorku vytáhněte předchozí test, založte nový a stiskněte tlačítko Measure.

Jakmile jsou všechna měření dokončena, stiskněte tlačítko Back a vraťte se zpět do hlavní nabídky (Main Menu).  

Pokud je intenzita světla v komoře vyšší než rozsah přístroje, přístroj zobrazí zprávu Overload (Přetížení).

9

Pokračujte stiskem libovolného tlačítka.

K přetížení dochází, pokud nárůst RLU překročí továrně nastavenou mez. K náhodnému přetížení může například dojít, pokud při měření zůstane otevřená vzorková komora. V případě přetížení zjistěte příčinu a opakujte měření.  

7. Hodnocení výsledků

Konkrétní limitní hodnota pro ATP monitoring musí být stanovena pro každý provoz a odběrové místo individuálně vícenásobným měřením za dodržení standardního sanitačního postupu, teprve pak může být tato metoda doporučena jako vhodný nástroj pro monitorování hygieny. Výrobce uvádí orientační údaje hodnot relativních luminometrických jednotek (RLU), např. vyčištěná nerezová plocha řádově desítky jednotek, do 100 - 150 jednotek, v závislosti od prostředí. Při výskytu biofilmů můžeme stanovit i tisíce jednotek.

Praktické příklady:

Výrobna těstovin

Doporučené limity: Vyhovující: < 200Hraniční (mezní)201-399Nevyhovující: > 400

Výrobna masných výrobků

Doporučené limity:Vyhovující: < 500Hraniční (mezní): 501-909Nevyhovující: > 1 000

JatkaDoporučené limity:Vvhovující : < 1 000Hraniční (mezní): 1 001 – 1999Nevyhovující: > 1 000

Různá testovací místa mohou vykazovat odlišné hodnoty RLU. Tuto skutečnost je třeba vzít v úvahu při stanovování hodnot stupnice dostatečný-nedostatečný.Úroveň dosažitelné čistoty je určována mnoha faktory:

- stáří povrchu, - stupeň a druh zabarvení, poškození povrchu poškrabáním nebo korozí,- druh znečištění,- druh organické látky, která přichází do styku s povrchem,- druh čistícího prostředku, - navíc samotný proces čištění ovlivňuje jeho efektivitu.

10

8. Použitá literatura

Lopašovský, Ľ., Pavličová S, Šiška B. Použitie bioluminiscenčnej metódy pri monitorovaní hygieny prostredia vybraných potravinárskych prevádzok. In Rizikové faktory potravového reťazca. Nitra : Slovenská poľnohospodárska univerzita, 2006, s. 210-213.

Kunová G., Pechačová M., Peroutková J., Roubal P., Jaglič Z., Pazlarová J. Kontrola a monitorování úrovně a účinnosti sanitace v mlékárenských provozech. Mlékařské listy, 116, 2009, s. 18-23.

Močubová, D. Bioluminiscenční organismy. Bakalářská práce, Brno: MU, 2006, 46 s.

3M Essential Reading, 3M TM Clean-Trace NG Luminometer and Docking Station, General Safety Advice dokument – Návod výrobce.

MVDr. Pavlína Navrátilová, Ph.D.doc. MVDr. Bohumíra Janštová, Ph.D.Ing. Hana Přidalová, Ph.D.

11